KR100970178B1 - 항비만용 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 항비만 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 N 말단으로부터 순차적으로 아포지단백질 B-100(Apolipoprotein B-100)의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드; 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프 또는 B형 간염 바이러스 표면항원 헬퍼 T 세포 에피토프; 및 마우스 아포지단백질 CⅡ의 C-말단 펩타이드 절편 또는 아포지단백질 B-100의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드가 융합된 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드, 및 상기 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하여 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

항비만용 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드 및 이를 포함하는 항비만 백신 조성물{Anti-obese immunogenic hybrid polypeptides and anti-obese vaccine composition comprising the same}

본 발명은 N 말단으로부터 순차적으로 아포지단백질 B-100(Apolipoprotein B-100)의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드; 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프 또는 B형 간염 바이러스 표면항원 헬퍼 T 세포 에피토프; 및 마우스 아포지단백질 CⅡ의 C-말단 펩타이드 절편 또는 아포지단백질 B-100의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드가 융합된 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하여 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

최근 서구적 식생활의 영향으로 비만에 의한 대사성 질환인 당뇨병, 동맥경화증 및 관상동맥질환(coronary atherosclerotic disease: CAD)이 점차적으로 증가추세에 있으며, 이는 사람뿐만 아니라 개나 고양이와 같은 애완동물 또는 가축의 경우에도 마찬가지이다. 이러한 질환의 원인이 되는 혈청 지질로는 콜레스테롤(cholesterol), 트리글리세라이드(triglyceride: TG), 유리 지방산(free fatty acid) 및 포스포리피드(phospholipid) 등이 있으며, 이들 혈청지질은 아포지단백질(apolipoprotein)과 함께 지단백질(lipoprotein)을 형성하여 혈액순환을 통해 운반되고 있다. 그 중에서 VLDL(very low density lipoprotein) 및 LDL(low density lipoprotein)은 주로 TG 및 콜레스테롤의 운반을 담당하고 있으며 LDL-콜레스테롤 수치의 변화는 위와 같은 질병의 예후를 나타내는 척도가 된다.

지질 대사와 관련된 성인병의 주요 인자인 LDL-콜레스테롤은 각 조직의 세포막의 LDL 수용체에 결합하여 조직 내에 저장, 활용되거나 청소세포(스카벤져 탐식세포)에 포획되어진 후 가수분해되어 유리 콜레스테롤 형태로 아포지단백질과 함께 HDL로 전달되어 간에서 재활용되거나 담즙산 형태로 처리되어 배설되는 경로가 밝혀져 있다. 이 과정에서 아포지단백질은 지단백의 구조적 항상성을 유지하고, 지방질 분해효소의 보조인자기능 및 세포막 상의 특정 수용체와 결합하는 매우 중요한 기능을 수행하고 있다.

아포지단백질 B-100(Apolipoprotein B-100: Apo B-100)은 이러한 저밀도 지단백질(LDL)의 주된 단백질 성분이며 또한 IDL(intermediate density lipoprotein ), VLDL에 존재하고 있기 때문에, 혈중에 있는 항체가 아포지단백질 B-100을 인식하도록 유도한다면 식세포에 의한 LDL-소거(clearance)가 용이하게 일어날 수 있을 것이다. 이와 같은 근거로 최근 백신을 이용하여 LDL-콜레스테롤의 수치를 낮추고 동맥경화를 감소시키기 위한 연구가 시도되고 있다. 이와 같은 항-콜레스테롤 백신 요법에 의해 유도된 항체는 IgM 타입으로 VLDL, IDL 및 LDL과 결합하는 것으로 보여지며, 이것을 통해서 고콜레스테롤 및 아테롬성 동맥경화증에 대한 예방 및 치료용 백신의 가능성이 제시되고 있다(Bailey, et al., Cholesterol vaccines. Science 264, 1067-1068, 1994; Palinski W., et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 821-5, 1995; Wu R. de Faire U., et al., Hypertension. 33, 53-9, 1999). 또한, 아포지단백질 B-100은 4560개의 아미노산 잔기(24개의 시그널 펩타이드를 포함하여)로 구성된 거대한 단백질 분자로, 분자량은 500 kDa을 초과한다(Elovson J., et al., Biochemistry, 24: 1569-1578, 1985). 아포지단백질 B-100은 주로 간에서 분비되고 양친매성을 가지는 분자이기 때문에 지단백질의 리피드와 상호작용할 수도 있고 수용액의 환경과도 상호작용이 가능하다(Segrest J. P., et al., Adv. Protein Chem., 45: 303-369, 1994). 아포지단백질 B-100은 LDL 입자의 크기와 구조를 안정화시키는 역할과 수용기와의 결합을 통하여 혈장 내 LDL-콜레스레롤의 항상성을 조절하는 중요한 역할을 한다(Brown MS., et al., Science, 232 : 34-47, 1986).

본원 발명자에 의해 출원된 한국 특허 등록번호 제10-0639397호는 아포지단백질 B-100의 에피토프에 대한 모조 펩타이드(mimetic peptide)가 항비만 효과를 가지며, 이를 헬퍼 T 세포 에피토프와 융합시킨 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드(B4T) 및 이를 포함하는 조성물이 비만을 예방 또는 치료하는데 효과적임을 개시하고 있다. 그러나 상기 출원에서는 단지 아포지단백질 B-100의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드 및 이와 결합된 헬퍼 T 세포 에피토프의 융합 폴리펩티드가 사람에게 있어서 비만을 예방 또는 치료하는데 효과적이라고 개시하였을 뿐, 사람 외의 동물의 경우는 사람과는 다른 면역관련 물질 및 대사 작용으로 인해 동일한 효과를 기대할 수는 없다. 또한, 상기 등록된 융합 폴리펩타이드는 단백질의 구조(folding)가 다소 불안정하여 한 그룹 내에서 동일하게 면역화되더라도 개체에 따라 항체 유도 반응의 편차가 큰 문제가 있다.

한편, 합텐의 면역원성을 높이기 위하여 매체 단백질과 융합시키려는 시도가 많이 있었지만 일률적인 상승효과를 얻을 수는 없었다. 특히 본 발명에서와 같은 B 세포 에피토프와 T 세포 에피토프의 선형 연결시, 이들의 방향성, 각각의 에피토프의 종류 등에 의해 오히려 면역원성이 소실되는 경우도 있었으며(Francis, M. J. et al., Nature 330: 168-170, 1987), 링커의 존재로 인하여 항원성이 감소하는 경우도 발생하였다(Partidos, C. et al., Mol. Immunol. 29:651-658, 1992). 이와 같이, 펩타이드 백신 디자인에는 일관적으로 적용할 수 있는 양태가 존재하지 않으며, 디자인된 백신의 효능 또한 예측할 수 없다. 동일한 이유로, 소수성이 매우 강한 아포지단백질 B-100의 에피토프에 대한 모조 펩타이드를, 이종 펩타이드인 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프 또는 B형 간염 바이러스 표면항원 헬퍼 T 세포 에피토프, 또는 아포지단백질 CⅡ와 융합시킬 경우, 오히려 항원성을 나타내는 부위를 분자 내부로 몰입시켜 항체 유도능이 저하될 가능성도 배제할 수 없다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자는 사람뿐만 아니라 개나 소 등의 가축을 포함하는 동물에도 적용 가능하며, 개체 간에 균일한 항체반응을 유도할 수 있는 안정적인 항비만 백신을 제공하기 위해 다양한 시도를 하였으며, 그 결과, N 말단으로부터 순차적으로 아포지단백질 B-100의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드의 사량체(B4)에 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프(R) 또는 B형 간염 바이러스 표면항원 헬퍼 T 세포 에피토프(T), 및 아포지단백질 CⅡ의 C-말단 펩티드 절편(CⅡ) 또는 아포지단백질 B-100의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드의 이량체(B2)를 융합시킨 융합 폴리펩타이드가 우수한 면역증강 효과를 나타내어 사람뿐만 아니라 동물에서도 비만의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 N 말단으로부터 순차적으로 아포지단백질 B-100의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드; 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프 또는 B형 간염 바이러스 표면항원 헬퍼 T 세포 에피토프; 및 마우스 아포지단백질 CⅡ의 C-말단 펩타이드 또는 아포지단백질 B-100의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드가 융합된 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하여 상기 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 N 말단으로부터 순차적으로 아포지단백질 B-100의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드; 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프 또는 B형 간염 바이러스 표면항원 헬퍼 T 세포 에피토프; 및 마우스 아포지단백질 CⅡ의 C-말단 펩타이드 절편 또는 아포지단백질 B-100의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드가 융합된 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 “에피토프의 모조 펩타이드(mimetic peptide of epitope)”는 에피토프의 최소 부분을 모방하는 펩타이드로, 항체에 의해 인식될 수 있도록 천연 에피토프와 충분히 유사하거나 천연 에피토프와 교차 반응하는 항체를 증가 시킬 수 있는 에피토프를 의미하며, 미모토프(mimotope)라고도 한다. 이러한 모조 펩타이드는 생체 내에서 비자기(non-self)로 인지되어 면역반응에서 자기 내성(self tolerance)의 문제를 극복할 수 있다는 장점이 있다. 상기한 "아포지단백질 B-100의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드"는 아포지단백질 B-100과 특이적으로 결합하는 항체에 의해 인식되는 것으로서, 아포지단백질 B-100과 특이적으로 결합하는 항체는 아포지단백질 B-100을 특이적으로 인식하여 결합하는 다클론 항체와 단클론 항체를 포함하며 이들의 단편, 예를 들어 Fc, Fab, F(ab’)₂ , scFv 등도 포함한다. 이 중 바람직하게는 단클론 항체가 사용될 수 있으며, 보다 바람직하게는 Mab B9 및 B23 이 사용된다.

본 발명에서 아포지단백질 B-100의 에피토프의 모조 펩타이드는 서열번호 1, 2 및 3 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명자는 한국 특허 등록번호 제10-0639397호에서 개시한 바와 같이 파아지 디스플레이드 펩타이드 라이브러리(phage displayed peptide library)로부터 바이오패닝(biopanning)에 의해 아포지단백질 B-100에 대한 단클론 항체 Mab B9 또는 Mab B23에 의해 인식될 수 있는 모조 펩타이드(서열번호 1, 2 및 3)를 밝혀내었다. 상기한 서열번호 1, 2 및 3 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 아포지단백질 B-100의 에피토프의 모조 펩타이드는 상기한 서열번호의 아미노산 서열 1개로 이루어진 단량체 형태일 수도 있으나 면역원성을 더욱 증강시키기 위해 상기한 서열번호의 아미노산 서열이 2개 이상, 바람직하게는 3 내지 8개, 보다 바람직하게는 3 내지 6개가 연결된 다량체 형태를 취할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 4개가 연결된 사량체(서열번호 4)를 사용할 수 있다. 다량체의 형태를 취하는 경우, 단량체를 형성하는 아미노산 서열은 직접적으로나 또는 링커를 통해 공유결합으로 연결될 수 있다. 링커를 통해 연결되는 경우 아미노산 예를 들어, 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산을 1개 내지 5개씩 사용하여 연결시킬 수 있으며 사용될 수 있는 바람직한 아미노산으로는 발린, 루이신, 아스파르트산, 글리신, 알라닌, 프롤린을 예시할 수 있다. 보다 바람직하게는 유전자 조작의 용이성을 고려하여 발린, 루이신, 아스파르트산등 중에서 선택된 2개의 아미노산을 연결하여 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기한 서열번호 1, 2 및 3중에서 선택된 아미노산 서열이 상기한 링커를 통해 2개 이상 연결된 모조 펩타이드가 사용된다.

본 발명에서 사용되는 용어 “T 세포 에피토프”는 적당한 효율로 MHC 클래스Ⅱ 분자에 결합할 수 있고 T 세포를 자극하거나 또한 MHC 클래스Ⅱ와 복합체로 T 세포와 결합할 수 있는 아미노산 서열을 의미한다. 이는 T 세포 상에 존재하는 특정 수용체에 의해 인식되고 B 세포가 항체 생산 세포로 분화하는데 요구하는 신호를 제공하는 역할도 하고 세포 독성 T 세포(CTL)를 유도하여 표적 세포의 용균을 유도하기도 한다. 본 발명의 목적상, 상기 인식부위로는 헬퍼 T 세포 에피토프가 바람직하게 사용되며, 본원 발명의 경우 특히 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프 또는 B형 간염 바이러스 표면항원 헬퍼 T 세포 에피토프를 사용하는 경우 효과가 좋음을 발견하였다.

광견병 바이러스(Rabies virus) 는 개, 고양이와 같은 애완용 동물뿐만 아니라 가축, 들짐승에도 전염되는 질병으로 수의학적으로 필수적으로 백신 접종이 실행되는 대상이다. 따라서 본 발명에서는 광견병 바이러스 리보뉴클레오단백질 (ribonucleoprotein) 유전자(NCBI gene ID; AF406695)로부터의 유전자 조작에 의해 숙주의 헬퍼 T 세포 에피토프를 포함하는 58개 아미노산의 펩타이드 단편(R)을 도입하였으며 그 아미노산 서열을 서열번호 6으로 나타내었다 (Ertl, H.C.J., et al., Journal of Virology, 63(7), 2885-2892, 1989).

B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV) 유전자의 크기는 3.2 kb로서, 크게 네가지의 중요한 단백질에 대한 정보를 가지고 있으며, S 유전자(표면항원 단백질), C 유전자(코어 단백질), P 유전자(DNA 중합효소) 및 X 유전자로 구성되어 있다. 이중 S 유전자의 경우 HBsAg을 코딩하고 있는 S 영역과 preS 영역으로 나눌 수 있다. preS 영역은 HBV의 균주에 따라서 108 또는 119개의 아미노산를 코딩하고 있는 preS1과 서브타입에 관계없이 55개의 아미노산 잔기로 이루어진 preS2로 나누어진다. HBV preS2 단백질은 체내 면역반응과정에서 헬퍼 T 세포를 활성화시키며 이것은 HBV에 대한 항체 형성을 촉진시킬 수 있다. 본 발명에서 사용한 HBV 헬퍼 T 세포 에피토프에 대한 아미노산 서열을 서열번호 7로 나타내었다

또한, 본 발명의 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드는 C 말단에 마우스 아포지단백질 CⅡ의 C-말단 펩타이드 절편 또는 아포지단백질 B-100의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드를 포함한다.

마우스 아포지단백질 CⅡ는 소장과 간에서 주로 생성되는 분자량 8,800Da, 79 아미노산 펩타이드(Hoffer, M.J., et al., Genomics 17(1), 45-51, 1993)로서 카일로마이크론(chylomicron), VLDL 및 HDL에 존재하며, 아포지단백질 리파아제(LPL)가 효소 활성을 나타내기 위한 필수적 보조인자(essential cofactor)의 기능을 나타낸다(Storjohann, R., et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1486, p253~264, 2000). 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아포지단백질 CⅡ의 LPL 활성을 조절하는 C-말단의 33개 아미노산으로 구성되는 펩타이드를 마우스의 아포지단백질 CⅡ 유전자(NCBI gene ID; NM009695)로부터 클로닝하였으며, 이를 서열번호 8 로 표시하였다.

본 발명의 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드의 C 말단에 결합하는 아포지단백질 B-100의 에피토프의 모조 펩타이드는 상기한 서열번호 1, 2 및 3 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 상기한 서열번호 1, 2 및 3 중에서 선택된 아미노산 서열을 가지는 아포지단백질 B-100의 에피토프의 모조 펩타이드는 상기한 서열번호의 아미노산 서열 1개로 이루어진 단량체 형태일 수도 있으나 면역원성을 더욱 증강시키기 위해 상기한 서열번호의 아미노산 서열이 2 내지 4개가 연결된 다량체 형태를 취할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 2개가 연결된 이량체를 사용할 수 있다. 다량체의 형태를 취하는 경우, 단량체를 형성하는 아미노산 서열은 직접적으로나 또는 링커를 통해 공유결합으로 연결될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “면역원성”이란 세포성 면역 및 체액성 면역 반응 모두를 유도하여 이물질에 대해 대처하는 능력을 말하며, 이러한 면역반응을 유도하는 물질을 면역원이라 한다. 본 발명은 면역원성 물질로서 아포지단백질 B-100의 B 세포 에피토프, 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프 또는 B형 간염 바이러스 표면항원 헬퍼 T 세포 에피토프, 및 아포지단백질 CⅡ의 C-말단 펩타이드 절편으로 이루어진 융합 폴리펩타이드를 사용한다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드의 경우와 같이, B세포의 에피토프와 T세포의 에피토프 부분이 융합되어 면역원성 물질로 사용되는 경우, T 세포 에피토프가 폴리펩타이드 접힘(folding) 구조의 안쪽에, B 세포 에피토프가 바깥쪽에 위치하여야 효율적인 면역 반응이 유도될 수 있다는 것이 공지된 사실인바 (Partidos C, et al., Eur J Immunol., 22(10):2675-80, 1992), 본원 발명자들은 아포지단백질 B-100의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드와 T 세포 에피토프만을 연결시킨 기존의 B4T 융합 폴리펩타이드의 구성에 추가하여, T 세포 에피토프의 C 말단에 아포지단백질 CⅡ의 절편 또는 아포지단백질 B-100의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드를 추가 연결시켰으며, 그 결과 본 발명에 따른 융합 폴리펩타이드는 T 세포 에피토프가 B세포 에피토프에 의해 둘러싸여 바깥 노출되는 부분이 최소화되어 융합 폴리펩타이드의 단백질 접힘(folding)구조가 더욱 안정화될뿐 아니라 보다 균일한 항체반응을 유도할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 사용되는 용어 “폴리펩타이드”는 2개 이상의 아미노산을 포함하는 잔기가 공유 펩타이드 결합에 의해 결합된 모든 길이의 아미노산 쇄를 포함하는 용어로서 디펩타이드, 트리펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드 등이 이에 포함되며, 특히 본 발명에서는 수개 내지 수십개의 아미노산이 공유 결합된 펩타이드 2종 이상이 서로 연결된 하이브리드 폴리펩타이드를 의미한다. 폴리펩타이드를 구성하는 각각의 펩타이드 서열은 상기한 바와 같은 에피토프에 해당하는 아미노산 서열을 포함하며 그에 인접하게 배치된 서열도 함께 포함할 수 있다. 이들 펩타이드는 L-아미노산, D-아미노산, 또는 두가지 상이한 배치의 아미노산의 다양한 조합을 취할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "하이브리드 폴리펩타이드"는 일반적으로 기원이 다른 이종 펩타이드가 연결된 형태의 펩타이드를 일컬으며, 본 발명에서는 B 세포 에피토프에, 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프(R) 또는 B형 간염 바이러스 표면항원 헬퍼 T 세포 에피토프(T), 및 아포지단백질 CⅡ의 C-말단 펩티드 절편(CⅡ) 또는 아포지단백질 B-100의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드를 연결한 형태의 펩타이드를 의미한다.

바람직한 한 양태에서, 본 발명에 따른 하이브리드 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 4개가 연결된 폴리펩타이드(B4), 상기 펩타이드의 C 말단에 연결된 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프(R), 및 상기 헬퍼 T 세포 에피토프의 C 말단에 연결된 마우스 아포지단백질 CⅡ의 C-말단 펩타이드 절편(CⅡ)이 융합된 폴리펩타이드(B4RCⅡ)를 의미한다(서열번호 9). 또 다른 양태에서는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 4개가 연결된 폴리펩타이드(B4), 상기 펩타이드의 C 말단에 연결된 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프(R), 및 상기 헬퍼 T 세포 에피토프의 C 말단에 연결된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 2개가 연결된 폴리펩타이드(B2)가 융합된 폴리펩타이드(B4RB2)를 의미한다(서열번호 10). 또 다른 양태에서는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 4개가 연결된 폴리펩타이드(B4), 상기 펩타이드의 C 말단에 연결된 B형 간염 바이러스 표면항원 헬퍼 T 세포 에피토프(T), 및 상기 헬퍼 T 세포 에피토프의 C 말단에 연결된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 2개가 연결된 폴리펩타이드(B2)가 융합된 폴리펩타이드(B4TB2)를 의미한다(서열번호 11).

본 발명의 하이브리드 폴리펩타이드는 전적으로 상기한 바와 같은 B 세포 에피토프, 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프 또는 B형 간염 바이러스 표면항원 헬퍼 T 세포 에피토프, 아포지단백질 CⅡ의 C-말단 펩타이드 절편, 및 임의로 이의 인접 서열을 포함한 항원성 부분으로만 이루어질 수도 있으며 부가 서열도 포함할 수 있다. 그러나, 이런 부가 서열은 전체 면역원성(immunogenicity)을 감소시키지 않는 것이 바람직하다. 이러한 부가 서열로는 링커 서열을 예로 들 수 있다. 링커를 통해 연결되는 경우 이에 의한 면역반응 유도에 불리한 영향을 끼치지 않도록 선정되어야 한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 포함하는 재조합 벡터, 그리고 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포 및 상기 숙주세포를 배양하여 상기 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 하이브리드 폴리펩타이드는 각각의 파트너가 결정된 후 화학적으로 합성하거나 또는 유전자 재조합 방법으로 발현 및 정제하여 수득할 수 있다. 구체적으로, 유전자 재조합 방법으로 본 발명의 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드를 생산하는 과정은 다음 단계들을 포함한다:

첫째, 하이브리드 펩타이드를 코딩하는 유전자를 벡터에 삽입하여 재조합 벡터를 제조하는 단계이다. 외래 유전자를 삽입하기 위한 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. 클로닝 벡터는 복제기점, 예를 들어 플라스미드, 파지 또는 코스미드의 복제 기점을 포함하며, 다른 DNA 절편이 부착되어 부착된 절편이 복제될 수 있는‘레플리콘'이다. 발현 벡터는 단백질을 합성하는데 사용되도록 개발되었다. 재조합 벡터는 통상 외래 DNA의 단편이 삽입된 캐리어로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 본원에서 “외래 DNA”란 외래종으로부터 기원되는 DNA를 의미하거나, 동일한 종으로부터 기원되는 경우에는 본래의 형태로부터 실질적으로 변형된 형태를 의미한다. 또한, 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 비변화된 DNA 서열도 포함한다. 이 경우 외래 유전자는 전사될 특정 목적 핵산으로 폴리펩타이드를 암호한다. 재조합 벡터는 숙주 세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 상기 재조합 벡터는 개체의 세포 내에서 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물로서, 이러한 유전자 작제물을 제조하기 위해 표준 재조합 DNA 기술을 이용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 목적하는 유전자를 발현하고, 목적하는 단백질을 생산하는 기능을 하면 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다. 재조합 벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자, 종결코돈 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩타이드를 코드하는 DNA, 인핸서 서열, 목적하는 유전자의 5’측 및 3’측의 비해독영역, 선별 마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다.

*둘째, 상기 재조합 벡터를 사용해서 숙주세포를 형질전환시킨 후 배양하는 단계이다. 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법으로는 문헌(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(2판), Cold Spring Harbor Laboratory, 1. 74, 1989)에 기재된 인산칼슘법 또는 염화캄슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), PEG 등의 화학적 처리 방법, 유전자총(gene gun) 등을 이용하는 방법 등이 있다. 상기 재조합 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양하면 유용한 단백질을 대량으로 제조, 분리 가능하다. 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절하여야 한다. 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주 세포는 원핵 세포와 진핵 세포 모두를 포함하며, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 세균, 예를 들어 에쉐리키아, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10 등의 동물 세포 등이 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다. 바람직하게는 이. 콜라이가 사용될 수 있다.

셋째, 하이브리드 펩타이드의 발현을 유도, 축적하는 단계이다. 본 발명에서는 유도인자 IPTG를 사용하여 펩타이드 발현을 유도하였고, 유도시간은 단백질의 양을 최대화되게 조절하였다.

마지막으로, 하이브리드 펩타이드를 분리, 정제하는 단계이다. 일반적으로 재조합적으로 생산된 펩타이드는 배지 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있다. 막 결합형인 경우, 적합한 계면활성제 용액(예, 트리톤-X 100)을 사용하거나 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 유리될 수 있다. 하이브리드 펩타이드 발현에 사용된 세포는 동결-해동 반복, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리. 정제 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990). 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교화크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 면역흡착 친화력 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC), 등전성 포커스 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

본 발명자는 바람직한 실시 일례로서, B 세포 에피토프를 가지고 있지만 이 자체로는 T 세포 에피토프 부분이 결여되어 있는 항비만 기능적 펩타이드인 아포지단백질 B-100 모조 펩타이드의 4량체 형태인 B4의 C 말단 부분과 T 세포 에피토프를 가지고 있는 광견병 바이러스의 뉴클레오단백질 유전자의 일부(R 단편) 및 마우스 아포지단백질 유전자의 일부(CⅡ 단편)을 연결하여 B4RCⅡ 유전자 단편을 제작하였다(도 3). B4 단편은 한국 특허 등록번호 제10-0639397호에서 개시한 B4 단편을 사용하였으며, 아포지단백질 CⅡ와 RVNP(Rabbis Virus 의 단백질 중 헬퍼 T세포의 에피토프가 존재하는 핵단백질 부분)는 RT-PCR 법에 의해 각각의 유전자를 얻었다. B4RCⅡ의 발현을 위해서는 pQE30 플라스미드를 사용하였는데, 이는 벡터 자체 내에 있는 시작 코돈으로부터 단백질 발현이 시작되고, 정제를 편리하게 하기 위해 히스티딘 6 개도 같이 발현이 되며 엔테로키나아제 부위도 발현된다. 이렇게 발현되는 단백질은, 아미노산의 분자량으로 계산된 크기가 약 21KDa이며, SDS-PAGE로 계산된 크기는 약 22KDa 이었다. 시간대 별로 샘플을 얻어 SDS-PAGE를 통해서 발현이 되는 것을 확인을 하였다(도 9).

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 백신 조성물에 관한 것이다.

전술한 바와 같이, 펩타이드 백신 디자인에 일관적으로 적용할 수 있는 양태가 존재하지 않으며 디자인된 백신의 효능 또한 예측할 수 없다. 동일한 이유로 소수성이 매우 강한 PB14 펩타이드를 이종 펩타이드인 T 세포 에피토프와 융합시킬 경우 오히려 항원성을 나타내는 부위를 분자 내부로 몰입시켜 항체 유도능이 저하될 가능성도 배제할 수 없다. 이와 같이 그 결과를 유추하기 어려운 상황에서, 본 발명자들은 N 말단으로부터 순차적으로 아포지단백질 B-100의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드에 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프 또는 B형 간염 바이러스 표면항원 헬퍼 T 세포 에피토프, 및 아포지단백질 CⅡ의 C-말단 펩티드 절편 또는 아포지단백질 B-100의 B 세포 에피토프의 모조 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 설계하고, 항비만에 대한 이들의 면역원성을 입증하였다.

본 발명에 따른 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드를 상기한 바와 같이 유전자 재조합 방법에 따라 발현 및 정제하여 마우스에 접종한 후, 동물 개체의 (a) 체중 증가 추이 관찰, (b) 혈청내 항체역가 관찰 및 (c) 혈청내 지질 함량의 변화를 통해 면역반응 효과를 검정하고 항원의 우수한 형태를 입증하였다. 그 결과, 하이브리드 폴리펩타이드(B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2)로 백신화된 그룹이 대조군 그룹에 비해 체중 증가가 억제되고 모조 펩타이드에 대한 항체 역가가 높고 잔존 기간이 길며 TG 및 LDL-콜레스테롤 수치도 낮아진다는 것을 확인하였다.

구체적으로, 항원 주사에 따른 체중의 변화를 6주령 ICR 마우스에 정제한 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2를 복강에 50 ㎍/ 150 ㎕로 2주 간격 3회 주사한 후 체중의 변화를 체중 증가 그래프로 확인을 하였다(도 11). 1차 부스팅 이후 고지방식을 먹여 DIO (diet induced obesity)를 유도하였다. 일차 주사와 부스팅때까지는 각 그룹별 신체 질량은 22 내지 23 g으로 비슷하였지만 DIO를 시작한 이후 대조군(비만, Obesity)은 급격히 체중이 증가한 반면 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2를 주사한 그룹은 경미한 체중증가를 보였다. 14주령 (첫번째 주사로부터 8주 경과) 일때 대조군과 B4RB2를 주사한 그룹의 체중의 차이는 약 8g의 차이가 나타났다. 이는 최초주사(primary)에 의해 미약한 면역반응이 2차 주사에 의해 부스팅된 후 증강된 면역응답 반응에 의해 체중증가가 억제됨을 시사하는 것이다. 그리고 3차 주사후의 체중 증가의 편차는 예상하였던 대로 유지되고 있음을 알 수 있었다.

또한 백신 처리된 그룹에서 ICR 마우스의 항체 역가는 7, 10, 12, 14, 16, 18주령에서 간접적 ELISA 분석하였다(도 12). 또한, 혈청내 지질 수준은 백신 처리된 그룹이 백신 처리하지 않은 대조군(비만) 그룹보다 전체적으로 총 콜레스테롤(TC), 중성지방(TG), HDL 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤 수치가 낮게 나타났다(도 13).

상기 결과들로부터 본 발명에 따른 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2 융합 폴리펩타이드는 효과적인 항비만용 백신으로 사용될 수 있음을 알 수 있다. 이들 융합 폴리펩타이드는 기존의 B4T 융합 폴리펩타이드에 비해 더욱 균일하고 안정적인 면역반응을 유도함으로써, 효과적인 항비만용 백신 조성물을 구성할 수 있다.

본 발명의 항비만 백신은 항원, 약제학적 허용가능한 담체, 적절한 보조제, 기타 통상적인 물질들로 구성되고 면역학적 효과량으로 투여한다. 본 발명에서 "면역학적 효과량" 이란 비만 치료 및 예방효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며 면역반응의 발생을 검사하기 위하여 당업자가 공지의 방법을 이용하여 이를 결정할 수 있다. 또한, 투여형태 및 경로, 수용자의 연령, 건강 및 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 및 치료 횟수에 따라 변화될 수 있다. 담체는 당 분야에 공지의 것으로 안정화제, 희석제 및 완충액을 포함한다. 적절한 안정화제는 솔비톨, 락토즈, 만니톨, 전분, 당, 덱스트란 및 포도당 같은 탄수화물; 알부민 또는 카제인 같은 단백질 등을 포함한다. 적절한 희석제에는 염, Hanks 균형 염 및 링거액 등을 포함한다. 적절한 완충액에는 알칼리 금속 인산염, 알칼리 금속 탄산염 및 알칼리 토금속 탄산염 등을 포함한다. 또한 백신에는 면역반응을 개선 또는 강화시키기 위하여 하나 이상의 보조제 등을 포함한다. 적절한 보조제에는 펩타이드; 알루미늄 하이드록시드; 알루미늄 포스페이트; 알루미늄 옥시드; Marcol 52 같은 미네랄 오일 또는 식물성 오일 및 하나 이상의 유화제로 구성된 조성물 또는 리졸세시틴, 다가 양이온, 다가 음이온 같은 표면 활성물질 등이 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 백신 조성물은 공지의 투여 경로를 통하여 투여된다. 이와 같은 방법에는 경구, 경피, 근육, 복막, 정맥, 피하, 비강 경로를 이용할 수 있지만 이에 국한되지는 않는다. 또한 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드를 포함하는 백신 조성물은 사람뿐만 아니라 개나 소, 고양이 등의 가축을 포함하는 동물에도 적용 가능하며, 개체 간에 균일한 항체반응을 유도할 수 있는 안정적인 백신으로서, 사람 및 동물의 비만 예방 및 치료에도 효과적이다.

도 1의 (a)는 아포지단백질 CII 유전자의 PCR 산물을 전기영동한 사진이다(레인 1: 25/100 bp 혼합 DNA Ladder, 레인 2 : PCR 산물, 2ul/well load. 2% 아가로스 겔, TBE 버퍼 시스템).
도 1의 (b)는 재조합 ApoCII/pQE30 벡터로 형질전환된 이.콜라이 JM109에서 단편의 삽입 여부를 확인한 전기영동 사진이다.
도 2의 (a)는 RVNP 유전자의 PCR 산물을 전기영동한 사진이다(레인 1 : 100bp ladder (Bioneer), 레인 2 : PCR 산물, 2ul/well load. 2% 아가로스 겔, TBE 버퍼 시스템).
도 2의 (b)는 B4RCII/pQE30 벡터로 형질전환시킨 이.콜라이 JM109로부터 플라스미드를 분리하여 SalI으로 잘라 단편이 올바른 방향으로 삽입되었음을 확인한 결과이다.
도 2의 (c)는 B4RB2/pQE30 벡터로 형진전환시킨 이.콜라이 JM109로부터 플라스미드를 분리하여 SalI으로 잘라 단편이 올바른 방향으로 삽입되었음을 확인한 결과이다.
도 2의 (d)는 B4TB2/pQE30 벡터로 형진전환시킨 이.콜라이 JM109로부터 플라스미드를 분리하여 SalI과 HindII로 잘라 단편이 올바른 방향으로 삽입되었음을 확인한 결과이다.
도 3은 B4RCII 융합 폴리펩티드를 발현하는 재조합 발현 벡터의 제조 과정을 나타내는 개략도이다.
도 4는 B4RB2 융합 폴리펩티드를 발현하는 재조합 발현 벡터의 제조 과정을 나타내는 개략도이다.
도 5는 B4TB2 융합 폴리펩티드를 발현하는 재조합 발현 벡터의 제조 과정을 나타내는 개략도이다.
도 6은 pB4RCII 의 유전자및 단백질 서열을 DNA 시퀀싱을 통해 확인한 결과이다.
도 7은 pB4RB2 의 유전자및 단백질 서열을 DNA 시퀀싱을 통해 확인한 결과이다.
도 8은 pB4TB2 의 유전자및 단백질 서열을 DNA 시퀀싱을 통해 확인한 결과이다.
도 9의 (a)는 형질전환된 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) M15/pB4RCⅡ를 IPTG로 B4RCⅡ의 발현을 유도한 후 시간에 따라 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이다(레인 M : 단백질 크기 마커(NEB), 레인 1 : IPTG-유도되지 않은 이.콜라이 M15, 레인 2 내지 5 : IPTG-유도 1 내지 4 시간 후의 이.콜라이 M15/pB4RCⅡ. pB4TB2
도 9의 (b)는 형질전환된 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) M15/pB4RB2를 IPTG로 B4RB2의 발현을 유도한 후 시간에 따라 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이다(레인 M : 단백질 크기 마커(NEB), 레인 1 : IPTG-유도되지 않은 이.콜라이 M15, 레인 2 내지 5 : IPTG-유도 1 내지 4 시간 후의 이.콜라이 M15/pB4RB2.
도 9의 (c)는 형질전환된 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) M15/pB4TB2를 IPTG로 B4RB2의 발현을 유도한 후 시간에 따라 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 것이다(레인 M : 단백질 크기 마커(NEB), 레인 1 : IPTG-유도되지 않은 이.콜라이 M15, 레인 2 내지 3 : IPTG-유도 3 내지 5 시간 이후의 이.콜라이 M15/pB4TB2, 레인 4 : total soluble protein, 레인 5 : total solublized protein by 8M 요소).
도 9의 (d)는 토끼(Rabbit) 항-PB14 다클론 항체를 이용한 B4RCⅡ의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이다.
도 10의 (a)는 레진에 결합된 B4RCⅡ를 용출하기 위해 이미다졸 선형 농도 구배를 정제그래프로 나타낸 것이고, 도 6의 (b)는 SDS-PAGE로 나타낸 것이다(M1: NEB prestained 마커, 레인 1 : no induction cell crude extract, 레인 2 : 4hr induction cell crude extract, 레인 3 : total soluble protein, 레인 4 : total solublized protein by 8M 요소(레진 결합 전), 레인 5 : flow-through, 레인 6 : wash fraction (50mM 이미다졸), 레인 7 : 용출 조각(500mM 이미다졸). 웰 당 각 분획 7.5ul 씩을 로딩함.
도 10의 (c)는 레진에 결합된 B4RB2를 용출하기 위해 이미다졸 선형 농도 구배를 정제그래프로 나타낸 것이고, 도 10의 (d)는 SDS-PAGE로 나타낸 것이다(1: Elpis prestained protein 마커, 레인 2 : total soluble protein, 레인 3 : total solublized protein by 8M 요소(레진 결합 전), 레인 4 : flow-through, 레인 6: 용출 조각(500mM 이미다졸). 웰 당 각 분획 3 ul 씩을 로딩함.
도 10의 (e)는 레진에 결합된 B4TB2를 용출하기 위해 이미다졸 선형 농도 구배를 정제그래프로 나타낸 것이고, 도 10의 (f)는 SDS-PAGE로 나타낸 것이다(1: Elpis prestained protein 마커, 레인 2 : total soluble protein, 레인 3 : total solublized protein by 8M 요소(레진 결합 전), 레인 4 : flow-through, 레인 5 : wash fraction (50mM 이미다졸), 레인 6 : 용출 조각(500mM 이미다졸)-1, 레인 7 : 용출 조각(500mM 이미다졸)-2. 웰 당 각 분획 7.5 ul 씩을 로딩함.
도 11은 B4RCII, B4RB2 및 B4TB2를 주사했을 때 C57BL/6 마우스 그룹의 체중 증가를 비교한 그래프이다. 파란 화살표는 DIO의 시작점을, 빨간 화살표는 백신 처리하는 시점을 나타낸다.
도 12는 B4RCII, B4RB2 및 B4TB2의 접종에 따른 항 B14 특이적 항체 농도의 변화를 나타낸다.
도 13은 백신의 3차 부스팅한 지 일주일 후 (16주령) 얻은 혈청 내 지방 성분의 농도를 나타낸다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 이는 단지 예시하기 위한 것으로서 하기 실시예에 의해서 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험재료 및 실험동물의 준비

DNA 미니프렙 키트(miniprep kit)와 겔에서 DNA를 추출하기 위하여 사용된 키트는 Nucleogen 제품을, 세포배양에 필요한 박토-트립톤(bacto-trypton), 박토-효소 추출물(bacto-yeast extract), 아가(agar) 등은 Difco사(Detroti, MI) 제품을, 제한효소는 Takara 제품을, T4 DNA 리가제는 NEB 제품을 사용하였다. 사용 벡터는 pBluescript Ⅱ SK(Stratagene사), pQE30(Qiagen사)를, 사용된 균주는 이. 콜라이 JM109 및 M15(Qiagen사)를 사용하였다.

단백질 생성을 유도하기 위한 IPTG는 Sigma사의 것을, 발현된 단백질을 정제하기 위하여 사용된 Ni-NTA 레진은 Amersham 제품을 사용하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏팅, ECL 등에 사용된 예비염색된 마커(prestained marker)로는 NEB사 제품을 사용하였다. 단백질을 변성 상태로 만들기 위해 사용된 요소는 Duchefa 제품을 사용하였으며, 정제를 할 때 사용한 이미다졸은 USB 제품을 사용하였다. 투석에 사용된 막은 MWCO 3,500 Spectrum 제품을, 단백질 응집 방지를 위해 사용된 시약은 CHAPS이며 Amresco 제품을 사용하였다. ELISA에 사용된 항체는 HRP 결합된 항-흰쥐 IgG로서 Sigma 제품을 사용했다. 웨스턴 블랏과 ECL에 사용된 기질 용액으로 ECL+plus 웨스턴 블랏 검출 시약은 Amersham 제품을 사용하였다. 보조제는 프로인트 애쥬번트 (Freund adjuvant; Sigma사)와 수산화알루미늄(aluminum hydroxide; Reheis사)을 사용하였다. 단백질 정량은 BCA 단백질 검사법(Pierce)을 사용하였다.

ICR mouse는 (주)중앙실험동물에서 구입하였으며, 6주령 이상의 암컷을 사용하였다. ICR 마우스는 부스팅때까지는 normal diet를 ((주) 샘타코 제품, 성분 : 천연 단백질 18% 이상, 조지방 5.3%, 조섬유 : 4.5%, 회분 : 8.0%)로 사육하였고, 그 이후는 고지방식(60%kCal fat, D12492, Research Diets Inc., New Brunswick, NJ)으로 사육하였다.

실시예 2: 마우스 ApoCⅡ 유전자 클로닝

2-1. 쥐 간 조직으로부터 전체 RNA의 분리

전체 RNA의 분리는 TRIzol(Invitirogen)을 사용하여 분리하였고, 모든 용액은 0.1% diethyl pirocarbonate-treated water (DEPC-dH2O)를 처리하여 RNase 활성을 저해하였다. 마우스로부터 분리한 간 조직 50mg 당 TRIzol 2 ㎖을 가하고 균질화하여 분쇄하였다. 얼음에서 20분간 반응한 후, 분쇄물을 4℃, 14,000 r.p.m.의 속도로 15분간 원심분리 하였다. 새 튜브에 단백질이 딸려 오지 않도록 주의하여 상층액만을 옮긴 후, 200 ㎕의 클로로폼(Merck)을 넣어 30초간 vortex하였다. 얼음에서 20분간 반응한 후, 혼합물을 4℃, 14,000 r.p.m.의 속도로 15분간 원심분리 하였다. 새 튜브에 상층액만을 옮기고 동량의 페놀/클로로폼, 0.2 M 아세트산 나트륨(pH5.2)를 넣어서 5초 동안 vortex하였다. 얼음에서 20분간 반응한 후, 혼합물을 4℃, 14,000 r.p.m.의 속도로 15분간 원심분리 하였다. 상층액과 동일 양의 이소프로판올(Merck)을 첨가하여 섞고, -70℃에서 1시간 보관한 후, 4℃, 14,000 r.p.m.의 속도로 10분간 원심분리 하여 전체 RNA 펠렛(pellet)을 확인할 수 있었다. RNA 펠렛을 1 ㎖의 75% 에탄올로 씻어준 후 건조시키고, DEPC-dH20로 재균질화 시킨 뒤 -70℃에서 보관하였다. RNA 농도는 Genequant II (Pharmarcia biotech)로 측정하였고, 분리한 RNA는 1% 아가로스 겔(0.5% TAE)에 1 ㎕를 전개해서 확인하였다.

2-2. 전체 RNA를 이용한 cDNA 합성

cDNA 합성은 cDNA cycleTM Kit(Invitrogen)를 사용하였다. PCR튜브에 위에서 얻은 RNA를 400 ng 넣고 반응 용액의 부피가 11.5 ㎕이 되도록 DEPC-dH2O를 넣었다. 올리고 dT 프라이머 1 ㎕를 넣고 잘 섞어 65℃ water bath에서 10 분간, 상온에서 2분간 반응시켰다. 여기에 RNase 반응억제제 1.0 ㎕, 5X RT 버퍼 4.0 ㎕, 100 mM dNTPs 1.0 ㎕, 80 mM 소디움 피로포스페이트(sodium pyrophosphate) 1.0 ㎕, AMV 역전사효소 0.5 ㎕를 가하고 가볍게 두드려 섞은 후, 42℃ water bath에서 1시간, 95℃, 2분간 반응시킨 후, 빨리 얼음에 보관하였다. 0.5 M EDTA(pH 8.0) 1.0 ㎕, 페놀-클로로폼 20 ㎕를 넣고 vortex한 후, 4℃, 14,000 r.p.m.의속도로 15분간 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브로 옮겨, 암모늄 아세테이트 22 ㎕, 75% 에타놀 88 ㎕를 넣어 vortex한 후, -70℃에서 하룻밤(overnight) 보관하였다. 4℃, 14,000 r.p.m.의 속도로 15분간 원심분리한 후, 상층액을 버리고, 펠렛을 20 ㎕ 3차 증류수로 현탁(resuspension)시키고, 1% 아가로스 겔(0.5% TAE 버퍼)에 전개하여 확인하였다.

2-3. 마우스 아포지단백질 CⅡ의 C-말단 단편의 PCR

본 실험에 사용된 모든 PCR은 DNA Thermal cycler 480을 사용하였다. 마우스 아포리포프로테인 CⅡ의 lipase activating region을 포함한 99개 유전자를 증폭하기 위하여 apoCⅡ-센스 프라이머(5' tc aga GTC GAC gat gag aaa ctc agg gac 3')와 apoCⅡ-안티 센스 프라이머(5' tat AAG CTT ggg ctt gcc tgg cag cag cta c 3')를 사용해 PCR을 수행하였다. 먼저 PCR 튜브에 apoCII-센스 프라이머와 apoCII-안티센스 프라이머(2pmol/ul)를 각각 1ul씩 넣고, 2.2.1.2에서 만든 cDNA를 2ul를 넣었다. 10X buffer 5 ㎕, dNTP 8 ㎕, Taq DNA 중합효소(Takara) 1 ㎕를 넣어 최종부피가 50 ㎕가 되도록 준비하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분 반응 후, 98℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 30초를 1set으로 30회 반복 반응한 후, 72℃, 5분 반응하여 얼음에 보관하였다. 1.5% 아가로스(0.5% TAE 버퍼)에 1 ㎕ 전개하여 확인하였다(도 1b).

2-4. ApoCⅡ/pQE30의 제작

ApoCⅡ 단편을 얻기 위해서 apoCⅡ PCR 단편은 SalI과 HindIII를 그리고 이 단편을 삽입하기위한 pQE30 벡터도 또한 SalⅠ과 HindⅢ 제한효소를 이용하여 잘라내었다.

pQE30과 CⅡ 단편을 T4 DNA 리가아제를 이용하여 16℃에서 밤새 연결시켰다. 단백질을 발현하기 위하여 선택된 벡터 시스템은 pQE30 플라스미드 시스템으로 이 벡터는 발현시키고자 하는 단백질이 6X 히스티딘과 융합 단백질 형태로 발현되어 정제가 용이하도록 고안되었다. JM109 이.콜라이 strain에 형질전환시킨 후 플라스미드를 분리하여 SalⅠ과 HindⅢ로 잘라 단편이 삽입되었음을 확인하였다.

실시예 3. RCⅡ 인공유전자 작성

3-1. 광견병 바이러스(Rabies virus) strain ERA로부터의 유전자 RNA의 분리

전체 RNA의 분리는 TRIzol(Invitirogen)을 사용하여 분리하였고, 모든 용액은 0.1% diethyl pirocarbonate-treated water (DEPC-dH2O)를 처리하여 RNase 활성을 저해하였다. 광견병 예방백신에 들어있는 광견병 바이러스(Rabies virus)로부터 total RNA를 분리하기 위하여, 먼저 백신 1.2ml에 2.5 M NaCl을 포함하는 20%(W/V) 폴리에틸렌 글리콜-8000 용액을 200㎕ 가하고 1시간 동안 얼음에 방치한 다음 14,000 r.p.m., 4℃, 10분간 원심분리하였다. 이렇게 얻어진 바이러스 펠렛에 TRIzol 1 ㎖을 가하고 피펫(pipetting)하여 잘 풀어주었다. 얼음에서 20분간 반응한 후, 분쇄물을 4℃, 14,000 r.p.m.의 속도로 15분간 원심분리 하였다. 새 튜브에 단백질이 딸려 오지 않도록 주의하여 상층액만을 옮긴 후, 200 ㎕의 클로로폼을 넣어 30초간 vortex하였다. 얼음에서 20분간 반응한 후, 혼합물을 4℃, 14,000 r.p.m.의 속도로 15분간 원심분리 하였다. 새 튜브에 상층액만을 옮기고 동량의 페놀/클로로폼, 0.2 M 아세트산 나트륨(pH5.2)를 넣어서 5초 동안 vortex하였다. 얼음에서 20분간 반응한 후, 혼합물을 4℃, 14,000 r.p.m.의 속도로 15분간 원심분리 하였다. 상층액과 동일 양의 이소프로판올(Merck)을 첨가하여 섞고, -70℃에서 1시간 보관한 후, 4℃, 14,000 r.p.m.의 속도로 10분간 원심분리 하여 전체 RNA 펠렛을 확인할 수 있었다. RNA 펠렛을 1 ㎖의 75% 에탄올로 씻어준 후 건조시키고, DEPC-dH20로 재 균질화 시킨 뒤 -70℃에서 보관하였다. RNA 농도는 Genequant Ⅱ(Pharmarcia biotech)로 측정하였고, 분리한 RNA는 1% 아가로스 겔(0.5% TAE)에 1 ㎕를 전개해서 확인하였다.

3-2. Genomic RNA를 이용한 cDNA 합성

cDNA 합성은 cDNA 싸이클 TM Kit(Invitrogen)를 사용하였다. PCR튜브에 위에서 얻은 RNA를 400 ng 넣고 반응 용액의 부피가 11.5 ㎕이 되도록 DEPC-dH2O를 넣었다. Random hexamer 1 ㎕를 넣고 잘 섞어 65℃ water bath에서 10 분간, 상온에서 2분간 반응시켰다. 여기에 RNase 저해제 1.0 ㎕, 5X RT 버퍼 4.0 ㎕, 100 mM dNTPs 1.0 ㎕, 80 mM 피로인산 나트륨(sodium pyrophosphate) 1.0 ㎕, AMV 역전사효소 0.5 ㎕를 가하고 가볍게 두드려 섞은 후, 42℃ water bath에서 1시간, 95℃, 2분간 반응시킨 후, 빨리 얼음에 보관하였다. 0.5 M EDTA(pH 8.0) 1.0 ㎕, 페놀-클로로폼 20 ㎕를 넣고 vortex한 후, 4℃, 14,000 r.p.m.의 속도로 15분간 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브로 옮겨, 아세트산 암모늄(ammonium acetate) 22 ㎕, 75% 에탄올 88 ㎕를 넣어 vortex한 후, -70℃에서 밤새 보관하였다. 4℃, 14,000 r.p.m.의 속도로 15분간 원심분리한 후, 상층액을 버리고, 펠렛을 20 ㎕ 3차 증류수로 재현탁(resuspension) 시키고, 1% 아가로스 겔(0.5% TAE 버퍼)에 전개하여 확인하였다.

3-3. 광견병 바이러스(Rabies virus) strain ERA 핵단백질 유전자(nucleoprotein gene)의 PCR

광견병 바이러스(Rabies virus) strain ERA의 핵단백질 유전자(nucleoprotein gene) 중 T 세포 에피토프로 밝혀진(2) 174개 유전자를 증폭하기 위하여 RVNP-센스 프라이머(5'-ATA CTC GAG GAC GTA GCA CTG GCA GAT G-3')와 RVNP-안티센스 프라이머(5'-ATA CTC GAG GTT TGG ACG GGC ATG ACG-3')를 사용해 PCR을 수행하였다. 먼저 PCR 튜브에 RVNP-센스 프라이머와 RVNP-안티센스 프라이머(2pmol/ul)를 각각 1ul씩 넣고, 2.2.2.2에서 만든 cDNA를 2ul를 넣었다. 10X 버퍼 5 ㎕, dNTP 8 ㎕, Taq DNA 중합효소(Takara) 1 ㎕를 넣어 최종부피가 50 ㎕가 되도록 준비하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분 반응 후, 98℃에서 30초, 54℃에서 30초, 72℃에서 30초를 1set으로 30회 반복 반응한 후, 72℃, 5분 반응하여 얼음에 보관하였다. 1.5% 아가로스(0.5% TAE 버퍼)에 1 ㎕ 전개하여 확인하였다.

3-4. RCⅡ/pQE30의 제작

R 단편을 얻기 위해서, RVNP PCR 단편은 XhoI으로, 이 단편을 삽입하기 위한 ApoCII/pQE30 벡터는 XhoI과 SalⅠ제한효소를 이용하여 잘라내었다. Linearized ApoCII/pQE30과 R 단편을 T4 DNA 리가아제를 이용하여 16℃에서 밤새 결합시켰다. JM109 이.콜라이 strain에 형질전환시킨 후 플라스미드를 분리하여 SalI과 HindⅢ로 잘라 단편이 올바른 방향으로 삽입되었음을 확인하였다.

실시예 4. pB4RCⅡ 벡터 작성

한국 특허 등록번호 제10-0639397호에서 개시한 바와 같은 pQE30에 들어있는 B14 단편을 XhoⅠ으로 잘라서 얻었다. RCII 단편이 삽입되어 있는 pQE30 벡터를 XhoI으로 자른 후 위에서 얻은 B14 단편과 T4 DNA 중합효소로 16℃에서 밤새 결합시켜 BL4RCII/pQE30(pB4RCII)을 얻었다. 클로닝된 pB4RCII의 염기서열을 확인하기 위해 (주) 코스모진텍에 DNA 시퀀싱을 플라스미드 농도 300~500 ng/㎕로 의뢰를 하였다. 또한, BL4RCII/pQE30 벡터로 형진전환시킨 이.콜라이 JM109로부터 플라스미드를 분리하여 SalI으로 잘라 단편이 올바른 방향으로 삽입되었음을 확인하였다(도 2b). B4RCII의 아미노산 서열은 서열번호 9로 나타내었다.

실시예 5. pB4RB2 벡터 작성

한국 특허 등록번호 제10-0472841호에서 개시한 BX2/pQE30(pB2) 벡터를 SalⅠ과 XhoⅠ제한효소를 이용하여 잘라내었고, 선형화된 BX2/pQE30와 실시예 3에서 얻은 R 단편을 T4 DNA 리가아제를 이용하여 16℃에서 밤새 결합시켜 RBX2/pQE30(pRB2)을 얻었다.

실시예 4에서 얻은 pB4RCII를 XhoⅠ제한효소로 잘라 B4 단편을 얻은 후, XhoⅠ로 자른 pTB2와 T4 DNA 리가아제를 이용하여 16℃에서 15시간 이상 반응시켜 B4RBX2/pQE30(pB4RB2)를 얻었다. B4RBX2/pQE30 벡터로 형진전환시킨 이.콜라이 JM109로부터 플라스미드를 분리하여 SalI으로 잘라 단편이 올바른 방향으로 삽입되었음을 확인하였다(도 2c). B4RB2의 아미노산 서열은 서열번호 10으로 나타내었다.

실시예 6. pB4TB2 벡터 작성

한국 특허 등록번호 제10-0472841호에서 개시한 BX2/pQE30(pB2) 벡터를 SalⅠ과 XhoⅠ제한효소를 이용하여 잘라내어 선형화된 BX2/pQE30을 얻었고, 한국 특허 등록번호 제10-0639397호에서 개시한 PCR 2.1 벡터를 SalI 제한효소를 이용하여 절단하여 얻은 T 단편을 얻었다. 상기 선형화된 BX2/pQE30와 T 단편을 T4 DNA 리가아제를 이용하여 16℃에서 밤새 결합시켜 TBX2/pQE30(pTB2)을 얻었다.

한국 특허 등록번호 제10-0639397호에서 개시한 pBluescript Ⅱ SK 를 SalI과 XhoⅠ 제한효소를 이용하여 절단하여 B4 단편을 얻었으며, SalⅠ으로 자른 pTB2와 B4 단편을 T4 DNA 리가아제를 이용하여 16℃에서 밤새 결합시켜 B4TBX2/pQE30(pB4TB2)을 얻었다. B4TB2/pQE30 벡터로 형진전환시킨 이.콜라이 JM109로부터 플라스미드를 분리하여 SalI과 HindⅡ로 잘라 단편이 올바른 방향으로 삽입되었음을 확인하였다(도 2d). B4TB2의 아미노산 서열은 서열번호 11로 나타내었다.

실시예 7. 재조합 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2의 발현

펩타이드 발현에 사용한 숙주 세포는 M15로써 암피실린(Ampicillin)와 카나마이신(Kanamycin)이 함유된 LB 플레이트에 도말(smearing)하여 콜로니를 얻은 다음 Amp (50 ㎍/㎖)과 Kan (50 ㎍/㎖)이 함유된 LB 배지 10 ㎖에서 밤새 배양하였다. 시간 변화에 따른 단백질의 유입(induction)을 알아보기 위하여 밤새 배양한 배양액 중 1 ㎖를 신선한 LB 배지에 50 ㎖에 주입(inoculation)했다. 본 배양액을 600 nm에서 흡광도가 0.4~0.5 될 때까지 37℃에서 1시간 30분 동안 흔들면서 배양(shaking incubation)한 후, IPTG를 최종 1 mM 농도가 되게 가하고 5시간 동안 배양을 계속하여 매 1시간 마다 1 ㎖씩 분취하였다. IPTG를 가하기 전에 1 ㎖를 미리 취하여 비유도 대조군으로 사용하였다. 각각의 배양액은 14,000 rpm에서 1분간 원심분리 하여 펠렛을 얻은 후 2X SDS 샘플 버퍼 30 ㎕에 녹여 SDS-PAGE시 샘플로 사용하였다. 이렇게 해서 계산된 단백질의 크기는 각각 B4RCⅡ는 22kDa, B4RB2는 21kDa, B4TB2는 20kDa이며, 시간대별로 샘플을 얻어 SDS-PAGE를 통해서 발현이 되는 것을 확인한 결과를 도 9(a)(b)(c)에 나타내었다.

실시예 8. 재조합 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2의 웨스턴 블랏

SDS-PAGE에서 크기 분석을 통해 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2를 확인하였지만, 정확한 단백질이 발현되는지 확인하기 위하여 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2를 인식할 수 있는 2가지 항체를 사용하여 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 웨스턴 블랏팅의 대조군으로는 M15에 클로닝되지 않은 pQE30 벡터를 형질전환시켜서 사용했다. 샘플은 IPTG로 유도하기 전과 유도 후 4시간 때의 것으로 하였다.

1차 항체는 래빗(rabbit) 항-PB14 다클론 항체를 PBS에 1:10000으로 희석하여 사용하였다. 1차 항체를 인식할 수 있는 2차 항체는 퍼옥시다제가 결합되어 있는 고트(goat) 항-래빗 IgG를 PBS에 1:10000으로 희석하여 사용하였다. 발색 반응은 ECL+Plus 웨스턴 블랏팅 키트를 사용하였으며 막을 카세트에 넣고 후지 의학(Fuji medical) X-선 필름을 넣은 후 10초 동안 노출하여 현상하였다. 도 9(d)에서 보이는 바와 같이 B4RCⅡ가 정확히 발현되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 9. 재조합 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2의 박테리아 세포 위치 확인

실시예 5 방법처럼 유도된 세포를 4℃, 9,000 rpm에서 30분간 원심분리를 한 후 얻어진 펠렛을 잠시 -20℃에 얼렸다가 얼음에서 녹인 후 초음파 분해 완충액을 펠렛 1 g에 대해 5 ㎖ 비율로 넣어 재현탁 하였다. 세포를 용해(lysis) 시키기 위하여 30초씩 15 사이클(사이클 사이에 1분간 휴지)로 초음파 파쇄하였다. 4℃, 9000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 상층액을 분리하여 가용성 단백질이 들어있는 가공되지 않은 추출물 A로, 남아있는 펠렛은 불용성의 단백질이 들어있는 가공되지 않은 추출물 B로 사용하였다. 각각의 샘플에 2X SDS 샘플 완충액을 섞어 95℃에서 5분간 끊인 후 SDS-PAGE를 수행하였다(도 10).

실시예 10. 재조합 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2의 정제용 완충용액의 제조

Sonication 버퍼는 5 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM 트리스-Cl, pH 7.9, 결합 버퍼는 5 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM 트리스-Cl, 8 M 우레아, pH 7.9, washing buffer는 50 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM 트리스-Cl,8 M 우레아, pH 7.9, elution buffer는 400 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM 트리스-Cl, 8 M 우레아, pH 7.9로 하였다.

실시예 11. 재조합 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2의 정제

펩타이드를 정제하기 위하여 히스티딘 태그(tag) 단백질용 Ni-NTA 레진 (Novagen)을 사용하였다. 이 레진은 레진에 결합되어 있는 Ni+과 N-말단에 히스티딘 헥사머 융합 단백질이 상호작용하는 성질을 이용하는 것으로 친화력을 이용한 친화성 크로마토그래피의 한 방법이다. LB 배지 10 ㎖을 하룻밤 배양한 배양액을 500 ㎖ LB 배지에 전량 접종하여, 600 nm에서 흡광도 0.4 내지 0.5가 될 때까지 37℃에서 배양했다. IPTG를 1 mM로 가하고 4시간 동안 배양한 후 9000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 세포 펠렛을 얻어 -20℃에서 두었다. 얼음에서 녹인 펠렛에 초음파 분쇄 완충액을 습윤 세포(wet cell)과 5 ㎖/g 비율로 넣어 재현탁시키고 초음파 분쇄를 수행하였다. 실시예 5와 같은 방법으로 초음파 분쇄를 하여 세포를 용해시키고, 4℃, 9000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 펠렛을 얻었다. 펠렛에 결합 완충액을 남아있던 상층액의 부피와 동일하게 넣은 후 재현탁시키고 세포 잔해를 제거하기 위해서 초음파 분쇄를 3 사이클 수행하였다. 이것을 다시 4℃, 9000 rpm에서 30분간 원심분리를 하여 얻은 상층액을 정제용 샘플로 사용하였다.

Ni-NTA 레진 충진 컬럼의 크기는 직경 1 ㎝, 높이 15 ㎝이며 레진은 2 ㎖, 유속(flow rate)은 2 ㎖/min로 하였다. 레진을 컬럼에 충진한 후 3 내지 5배 부피의 증류수로 세척하고 5배 부피의 1X 하전된 완충액(50mM NiSO4)를 흘려 주어 Ni2+를 결합한 후 결합 완충액으로 평형화하여 Ni-킬레이트화 친화성 수지를 제조하였다. 레진에 샘플 로딩을 2 사이클 수행하였다. 이렇게 해서 샘플 로딩이 완료되면 다시 결합 완충액으로 1.0 범위의 280 nm 흡광도에서 기저선에 도달할 때까지 흘렸다. 그 후 세척 완충액으로 10분 흘리고 평형화가 완료되면 용출 완충액을 흘리면서 용출되는 단백질을 튜브에 모았다. 정제된 단백질은 8 M 요소 상태이고 요소를 제거하기 위해 PBS를 사용하여 투석을 수행하였다. 단백질의 정확한 refolding을 위해 천천히 요소의 농도를 낮춰가며 수행하였다. 그 결과 도 6 (a, c, e)에 나타낸 바와 같이, 크로마토그래피 과정 중 280nm 흡광도를 그래프로 각각 나타내었으며, 도 10 (b), (d), (f)에 나타낸 바와 같이 단계별로 얻은 분획을 각각 SDS-PAGE로 확인하였다.

실시예 12. 재조합 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2의 정량

B4RCII는 PBS로 천천히 투석을 수행하여 요소의 농도를 낮춰주더라도 단백질의 응집으로 인한 침전이 발생하지 않았으므로 이 상태에서 단백질 정량을 수행하였다. 정량은 BCA 단백질 정량법, UV 흡수법을 이용하여 실시하였다. BCA 단백질 정량법에 사용한 표준은 2 ㎎/㎖의 BSA를 1000, 500, 250, 125, 62.5 ㎍/㎖로 연차석 희석하여 이용하였다. BCA 분석은 용액 A : 용액 B를 50:1 비율로 만들었으며 샘플과 37℃에서 30분간 반응시키고 562 nm에서 흡광도를 측정하였으며 정량선을 이용하여 단백질의 농도를 정량하였다. UV 흡수법은 B4RCII의 ε값은 1.63이므로 A280nm에서의 흡광도를 ε값으로 나누어서 농도를 결정하였다.

실시예 13. ICR 마우스의 면역화(Immunization)

ICR 마우스에서 면역은 대조군(DIO를 유도한 비만 그룹), 대조군(DIO를 유도하지 않은 정상 그룹), B4RCⅡ로 면역화한 그룹, B4RB2로 면역화한 그룹 및 B4TB2로 면역화한 그룹 등 5 그룹으로 나누어서 실행하였다. 6주령 ICR 마우스에 정제한 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2를 각각 50 ㎍을 100 ㎕로 복강에 주사를 하였다. 주사는 2주 간격으로 3회 실시한 후 체중의 변화를 체중 증가 그래프로 확인하였다. 1차 부스팅 이후 고지방식을 먹여 DIO (diet induced obesity)를 유도하였다. 첫 번째 부스팅(boosting)한 후 1주째, 두번 째 부스팅한 후 1주째, 3주째 및 5주째에 꼬리에서 채혈을 하였다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 일차 주사와 부스팅때까지는 각 그룹별 신체 질량은 22 내지 23 g으로 비슷하였지만 DIO를 시작한 이후 대조군(비만)은 급격히 체중이 증가한 반면 B4RCⅡ, B4RB2 및 B4TB2를 주사한 그룹은 경미한 체중증가를 보였다. 14주령 (첫번째 주사로부터 8주 경과) 일때 대조군과 B4RB2를 주사한 그룹의 체중의 차이는 약 8g의 차이가 나타났다. 이는 최초주사(primary)에 의해 미약한 면역반응이 2차 주사에 의해 부스팅된 후 증강된 면역응답 반응에 의해 체중증가가 억제됨을 시사하는 것이다. 그리고 3차 주사후의 체중 증가의 편차는 예상하였던 대로 유지되고 있음을 알 수 있었다.

실시예 14. 간접적 ELISA를 이용한 각 펩타이드에 따른 항체 역가 측정

혈청 샘플을 이용하여 항체 역가를 측정하였다. 미세역가 평판에 PB14를 각 웰에 100 ng의 농도로 100 ㎕씩 넣었다. 그리고 4℃에서 밤새 처리한 후 블럿킹 용액(PBS, 0.5% 카세인, 0.02% NaN3)을 첨가하고 37℃에서 1시간동안 항온처리하였다. 세척 완충액으로 3번 씻어내고 실시예 10 방법을 통해서 얻은 혈청을 PBS에 1/1000-1/8000 배로 희석하여 100 ㎕씩 사용하였고 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세척 완충액으로 3번 씻어낸 후 2차 항체로는 고트 항-마우스 IgG-HRP 결합 항체를 1/1000배로 희석하여 사용하였다. OPD로 발색하여 450 nm에서 흡광도에서 측정하였다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, B4RB2 및 B4TB2로 면역화한 그룹은 14주령까지 항체 역가가 증가했다가 그 후 감소하였고, B4RCⅡ로 면역화한 그룹은 16주령까지 항체 역가가 증가했다가 그 후 감소함을 알 수 있었다. 세 그룹 모두 항체를 잘 유도하여 면역원성이 높음을 알 수 있었다.

실시예 15. 혈청 지질 함량의 측정

TG와 총 콜레스테롤의 측정은 발색시약 200 ㎕에 혈청 4 ㎕를 넣고 37℃에서 5분간 항온처리한 후 각각 505 nm, 500 nm 흡광도를 측정하였다. HDL의 측정은 혈청과 침전 시약을 1:1로 섞은 후 실온에서 10분간 방치한 후 3000 rpm 이상에서 10분간 원심 분리를 하여 얻은 상층액을 발색시약 200 ㎕에 4 ㎕를 넣고 37℃에서 5분간 항온처리한 후 555 nm에서 흡광도를 측정하였다. LDL 콜레스테롤의 측정은 EZ LDL 콜레스테롤 키트(Sigma 사 제품)를, LDL 캘리브레이터는 Randox사 제품을 사용하였으며, 제조사로부터 제공된 프로토콜에 따라 키트내의 시약 1 150 ul에 혈청 4 ㎕를 넣고 37℃에서 5분간 반응시킨 후 시약 250 ㎕를 첨가하여 다시 37℃에서 5분간 반응시킨 다음 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 측정 키트에서 얻은 흡광도와 표준시액을 비교하여 농도를 계산하였다.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 혈청 내 지질 수준은 백신 처리된 그룹이 백신 처리하지 않은 대조군(비만) 그룹보다 전체적으로 총 콜레스테롤(TC), 중성지방(TG), HDL 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤 수치가 낮게 나타났다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

1) 서열번호 1, 2 및 3 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 단량체 내지 사량체;
2) 상기 펩타이드의 C-말단에 연결된, 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프 또는 B형 간염 바이러스 표면항원 헬퍼 T 세포 에피토프; 및
3) 상기 헬퍼 T 세포 에피토프의 C-말단에 연결된, 마우스 아포지 단백질 CII의 C-말단 펩타이드 절편, 또는 서열번호 1, 2 및 3 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 단량체 또는 이량체가 융합된 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드.

제1항에 있어서, 상기 하이브리드 폴리펩타이드는,
1) 서열번호 1의 서열을 갖는 펩타이드 단량체 내지 삼량체;
2) 상기 펩타이드 단량체 내지 삼량체의 C-말단에 연결된, 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프 또는 B형 간염 바이러스 표면항원 헬퍼 T 세포 에피토프; 및
3) 상기 헬퍼 T 세포 에피토프의 C-말단에 연결된, 마우스 아포지 단백질 CII의 C-말단 펩타이드 절편, 또는 서열번호 1, 2 및 3 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 단량체 또는 이량체가 융합된 것인, 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드.

제1항에 있어서, 상기 하이브리드 폴리펩타이드는,
1) 서열번호 1의 서열을 갖는 펩타이드 사량체;
2) 상기 펩타이드 사량체의 C-말단에 연결된, 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프; 및
3) 상기 헬퍼 T 세포 에피토프의 C-말단에 연결된, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 단량체, 또는 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 단량체 또는 이량체가 융합된 것인, 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드.

제1항에 있어서, 상기 하이브리드 폴리펩타이드는,
1) 서열번호 1의 서열을 갖는 펩타이드 사량체;
2) 상기 펩타이드 사량체의 C-말단에 연결된, B형 간염 바이러스 표면항원 헬퍼 T 세포 에피토프; 및
3) 상기 헬퍼 T 세포 에피토프의 C-말단에 연결된, 마우스 아포지 단백질 CII의 C-말단 펩타이드 절편, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 단량체, 또는 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 단량체 또는 이량체가 융합된 것인, 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드.

제1항에 있어서, 상기 하이브리드 폴리펩타이드는,
1) 서열번호 2 또는 3의 서열을 갖는 펩타이드의 단량체 내지 사량체;
2) 상기 펩타이드 단량체 내지 사량체의 C-말단에 연결된, 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프 또는 B형 간염 바이러스 표면항원 헬퍼 T 세포 에피토프; 및
3) 상기 헬퍼 T 세포 에피토프의 C-말단에 연결된, 마우스 아포지 단백질 CII의 C-말단 펩타이드 절편, 또는 서열번호 1, 2 및 3 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 단량체 또는 이량체가 융합된 것인, 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드.

제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 사량체는 서열번호 5의 서열을 갖는 것인 폴리펩타이드.

제1항 내지 제3항, 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광견병 바이러스 헬퍼 T 세포 에피토프는 서열번호 6의 서열을 갖는 것인 폴리펩타이드.

제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B형 간염 바이러스 표면항원 헬퍼 T 세포 에피토프는 서열번호 7의 서열을 갖는 것인 폴리펩타이드.

제1항, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스 아포지단백질 CII의 C-말단 펩타이드 절편은 서열번호 8의 서열을 갖는 것인 폴리펩타이드.

제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 면역원성 하이브리드 폴리펩타이드를 포함하는 비만 예방 또는 치료용 백신.

제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.

제11항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 발현 벡터.

제12항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.

제12항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하여 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 제조하는 방법.

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