JP2010504094A - 抗肥満用免疫原性ハイブリッドポリペプチド及びこれを含む抗肥満ワクチン組成物(Anti−ObeseImmunogenicHybridPolypeptidesAndAnti−ObeseVaccineCompositionComprisingTheSame) - Google Patents
抗肥満用免疫原性ハイブリッドポリペプチド及びこれを含む抗肥満ワクチン組成物(Anti−ObeseImmunogenicHybridPolypeptidesAndAnti−ObeseVaccineCompositionComprisingTheSame) Download PDFInfo
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Abstract
Description
2種以上が互いに連結されたハイブリットポリペプチドを意味する。ポリペプチドを構成する各々のペプチド配列は上記したようなエピトープに該当するアミノ酸配列を含み、それに隣接に配置された配列を含むこともある。これらのペプチドはLーアミノ酸、Dーアミノ酸または2種の相違な配置のアミノ酸の多様な構成ができる。
DNAミニプレプキット(Miniprep kit)とゲルでDNAを抽出するため使用されたキットはヌクレオジュン製品を、細胞培養に必要なバクト−トリプトン(Bacto-trypton)、バクト−酵素抽出物(Bacto-yeast extract)、細菌培養基(Agar)等はDifco社(Detroit、MI)製品を、制限酵素はタカラ製品を、T4DNAリガーゼはNEB製品を使用した。使用ベクターは、ブルースクリプトIISK(Stratagene社)、PCR2.1(インビトロジェン、カールスバッド、CA)、pQE30(キアゲン社)を、菌種はイー・コライJM109及びM15(キアゲン社)を使用した。
2−1.マウスの肝組織から全体RNAの分離
全体RNAの分離は、トリゾール(インビトロジェン)を使用して分離し、RNA分離に使用された全ての溶液は0.1%のジエチルピロカーボネート処理したウォーター(DEPC−dH2O)で処理しRNase活性を阻害した。マウスから分離した肝組織50mg当りトリゾール2mlを加え、均質化し粉砕した。氷で20分間反応させた後、粉砕物を4℃、14000rpmの速度で15分間遠心分離した。たんぱく質を除外するように注意しながら新しいチューブに上層液だけを移した後、200μlのクロロホルム(Merck)を入れて30秒間ボルテックスした。氷で20分間反応させた後、混合物を4℃、14000rpmの速度で15分間遠心分離した。新しいチューブに上層液だけを移し、同量のフェノール−クロロホルム、0.2Mアセト酸ナトリウム(pH5.2)を入れて5秒間ボルテックスした。氷で20分間反応させた後、混合物を4℃、14000rpmの速度で15分間遠心分離した。上層液と同一量のイソプロパノール(Merck)を加え混ぜ、−70℃で1時間保存した後、4℃、14000rpmの速度で10分間遠心分離し、全体RNAペリット(Pellet)を確認できた。RNAペリットを1mlの75%エタノールで洗って乾燥させ、DEPC−dH20で再均質化させた後、−70℃で保存した。RNA濃度はGenequantII(ファルマシア バイオテック)で測定し、分離したRNAは1%アガロースゲル(0.5TAE)で1μlを電気泳動して確認した。
cDNA合成はcDNA サイクルTMキット(インビトロジェン)を使用した。PCRチューブに上記で得たRNAを400ng入れ反応溶液の体積が11.5μlになるようにDEPC−dH20を入れた。オリゴdTプライマー1μlを入れ十分に混ぜて65℃のウォーターバスで10分間、室温で2分間反応させた。これに、RNase反応抑制剤1.0μl、5X RTバッファ4.0μl、100mM dNTPs1.0μl、80mMピロリン酸ナトリニウム(Sodium Pyrophosphate)1.0μl、AMV逆転写酵素0.5μlを加え、軽く叩いて混ぜた後、42℃のウォーターバスで1時間、95℃で2分間反応させた後、素早く氷で保存した。0.5MEDTA(pH8.0)1.0μl、フェノール−クロロホルム20μlを入れてボルテックスした後、4℃、14000rpmの速度で15分間遠心分離した。上層液を新しいチューブへ移し、アンモニウムアセテート22μl、75%エタノール88μlを入れてボルテックスした後、−70℃で一晩保存した。4℃、14000rpmの速度で15分間遠心分離した後、上層液を捨て、ペリットを20μlの3次蒸留水で再懸濁(Resuspension)させ、1%のアガロースゲル(0.5%YAEバッハァ)で電気泳動して確認した。
本実験に使用された全てのPCRは、DNAサーマル サイクラー480を使用した。マウスアポリポたんぱく質CIIのリパーゼ activating リージョンを含む99個の遺伝子を増幅するためApoCII−センスプライマー(5’tc aga GTC GAC gat gag aaa ctc agg gac 3’)とApoCII−アンチセンスプライマー(5’tat AAg CTT ggg ctt gcc tgg cag cag cta c 3’)を使用してPCRを遂行した。まず、PCRチューブにApoCII−センスプライマーとApoCII−アンチセンスプライマー(2pmol/μl)を各々1μlずつ入れ、2.2.1.2で作ったcDNAを2μl入れた。10Xバッハァ5μl、dNTP8μl、TaqDNA重合酵素(タカラ社)1μlを入れ、最終体積が50μlになるように準備した。PCR条件は94℃で5分反応させた後、98℃で30秒、56℃で30秒、72℃で30秒を1セットとして30回反復反応させた後、72℃で5分反応させ氷で保存した。1.5%アガロース(0.5%TAEバッハァ)で1μlを電気泳動して確認した(図1b)。
ApoCII断片を得るためApoCIIPCR断片は、ApoCIISalIとHindIIIとこの断片を挿入するためのpQE30ベクターもSalIとHindIII制限酵素を用いて切り出した。
3−1.狂犬病ウイルス(Rabies virus)ストレーンERAから遺伝子RNAの分離
全体のRNA分離は、トリゾール(インビトロジェン)を使用して分離し、RNA分離に使用された全ての溶液は0.1%ジエチル ピロカーボネート処理したウォータ(DEPC−dH2O)で処理してRNase活性を阻害した。狂犬病予防ワクチンに入っている狂犬病ウイルスからトータルRNAを分離するため、まずワクチン1.2mlに2.5MNaClを含む20%(W/V)ポリエチレングリコール−8000溶液を200μl加え1時間氷で放置した後、14000rpm、4℃で10分間遠心分離した。このようにして得られたウイルスペリットに、トリゾール1mlを加えピペット(Pipetting)して十分に混ぜた。氷で20分間反応させた後、粉砕物を4℃、14000rpmの速度で15分間遠心分離した。たんぱく質を除外するように注意しながら、新しいチューブに上層液だけを移した後、200μlのクロロホルムを入れ30秒間ボルテックスした。氷で20分間反応させた後、混合物を4℃、14000rpmの速度で15分間遠心分離した。新しいチューブに上層液だけを移し、同量のフェノール−クロロホルム、0.2Mアセト酸ナトリウム(pH5.2)を入れて5秒間ボルテックスした。氷で20分間反応させた後、混合物を4℃、14000rpmの速度で15分間遠心分離した。上層液と同一量のイソプロパノール(Merck)を添加して混ぜ、−70℃で1時間保存した後、4℃、14000rpmの速度で10分間遠心分離し、全体のRNAペリットを確認できた。RNAペリットを1mlの75%エタノールで洗って乾燥させ、DEPC−dH2Oで再均質化させた後、−70℃で保存した。RNA濃度はGenequantII(ファルマシア バイオテック)で測定し、分離したRNAは1%アガロースゲル(0.5%TAE)で1μlを電気泳動して確認した。
cDNA合成はcDNAサイクルTMキット(インビトロジェン)を使用した。PCRチューブに、上記で得たRNAを400ng入れ、反応溶液の体積が11.5μlになるようにDEPCーdH2Oを入れる。ランダムな六量体約1μlを入り十分に混ぜて、65℃のウォーターバスで10分間、室温で2分間反応させた。ここに、RNase阻害剤1.0μl 、5X RTバッファ4.0μl、100mM dNTPs 1.0μl、80mMのピロリン酸ナトリウム1.0μl、AMV逆転写酵素0.5μlを加え軽く叩いて混ぜた後、42℃のウォーターバスで1時間、95℃で2分間反応させて、素早く氷に保管した。0.5M EDTA(pH8.0)1.0μl、フェノール-クルロロポム20μlを入れてボルテックス(vortex)した後、4℃、14000rpmの速度で15分間遠心分離した。上層液を新しいチューブに移し、酢酸アンモニウム(ammonium acetate)22μl、75%のエチルアルコール88μlを入れてボルテックスした後、-70℃で夜通し保管した。4℃、14000rpmの速度で15分間遠心分離した後、上層液を捨て、ペリットを20μlの3次蒸溜水で再懸濁させ、1%アガロースゲル(0.5%TAE バッファ)で電気泳動で確認した。
狂犬病ウイルス(Rabies virus)ストレーンERAの核たんぱく質遺伝子の中、T細胞エピトゥプに明らかになった(2)174個の遺伝子を増幅するためにより、RVNP-センスプライマー(5’-ATA CTC GAG GAC GTA GCA CTG GCA GAT G-3’)とRVNP-アンチセンスプライマー(5’-ATA CTC GAG GTT TGG ACG GGC ATG ACG-3’)を使用してPCRを遂行した。まず、PCRのチューブにRVNP-センスプライマーとRVNP-アンチセンスプライマー(2pmol/μl)を各々1μlずつ入れ、2.2.2.2で作ったcDNAを2μlを入れた。10Xのバッファ5μl、dNTP 8μl、タク(Taq)DNA 重合酵素(タカラ) 1μlを入れ、最終体積が50μlになるように準備した。PCRの条件は94℃で5分間反応した後、98℃で30秒、54℃で30秒、72℃で30秒を1セットにして30回反復反応させた後、72℃で5分間反応させ氷に保管した。1.5%アガロースゲル(0.5%TAE バッファ)で1μl電気泳動で確認した。
R断片を得るために、RVNP PCR断片はXhoIで、この断片を挿入するためのApoCII/pQE30ベクターはXhoIとSalI制限酵素を用いて切り出した。線形化されたApoCII/pQE30とR断片をT4DNAリガーゼを用いて、16℃で夜通し結合させた。JM109イー.コライ(E. coli)ストレーン(strain)に形質変換させた後、プラスミドを分離してSalIとHindIIIで切断して、断片が正しい方向に挿入されたことを確認した。
韓国特許登録番号第10ー0639397号で開始したようなpQE30に入っているB4断片をXhoIで切断し得た。RCIIの断片が挿入されているpQE30ベクターをXhoIで切断した後、上記で得たB4断片とT4DNA重合酵素で16℃に夜通し結合させて、B4RCII/pQE30(B4RCII)を得た。固定された(anchoring)B4RCIIの塩基配列を確認するために、(株)コスモジンテクにDNA配列をプラスミド濃度300〜500ng/μlで依頼した。また、B4RCII/pQE30ベクターに形質変換させたイー・コルライJM109からプラスミドを分離してSalIで切断し、断片が正しい方向に挿入されたことを確認した(図2b)。B4RCIIのアミノ酸配列は配列番号9で示した。
韓国特許登録番号第10ー0472841号で開始したBX2/pQE30(pB2)ベクターをXhoIとSalI制限酵素を用いて切り出し、線形化されたBX2/pQE30と実施例3で得たR断片をT4DNAリガーゼを用いて、16℃で夜通し結合させてRBX2/pQE30(pRB2)を得た。
韓国特許登録番号第10-0472841号で開始したBX2/pQE30(pB2)ベクターをSalIとXhoIの制限酵素を用いて切り出し、線形化されたBX2/pQE30を得て、韓国特許登録番号第10-0639397号で開始したPCR2.1ベクターをSalIの制限酵素を用いて切り出し、T断片を得る。上記の線形化されたBX2/pQE30とT断片をT4DNAリガーゼを用いて16℃で、夜通し結合させてTBX2/pQE30(pTB2)を得る。
ペプチドの発現に使用した宿主細胞はM15として、アンピシリンとカナマイシンが含有されたLB培地に塗抹してコロニを得た後、Amp(50μg/ml)とKan(50μg/ml)が含有されたLB培地10mlで夜通し培養した。時間変化に伴うたんぱく質の流入を調べてみるために、夜通し培養した培養液の中1mlを新鮮なLB培地50mlに注入した。本培養液を600nmで吸光度が0.4乃至0.5になるまで37℃で1時間30分間揺すりながら培養した後、最終1mMの濃度になるようにIPTGを加えて5時間培養を続け、毎1時間ごとに1mlずつ分取った。IPTGを加える前に1mlを予め取り非誘導対照群で使用した。各々の培養液は14000rpmで1分間遠心分離してペリットを得た後、2X SDSサンプル バッファ30μlに溶かしてSDSーPAGEの時サンプルで使用した。そのようにして、計算されたたんぱく質の大きさは、各々B4RCIIは22kDa、B4RB2は21kDa、B4TB2は20kDaで、時間帯別にサンプルを取りSDS-PAGEを通じて発現されることを確認した結果を図9(a)、(b)、(c)に示した。
SDS-PAGEで大きさの分析を通じてB4RCII、B4RB2及びB4TB2を確認したが、正確なたんぱく質が発現されるのを確認するために、B4RCII、B4RB2及びB4TB2を認識することができる2種類の抗体を用いて、ウェスタンブロッティングを遂行した。ウェスタンブロッティングの対照群ではM15にクローニングされないpQE30ベクターを形質転換させて使用した。サンプルはIPTGに誘導する前のものと誘導後4時間のものにした。
実施例5の方法のように、誘導された細胞を4℃、9000rpmで30分間遠心分離した後、得られたペリットを、しばらく-20で凍らせて氷で溶かした後、超音波分解緩衝液をペリットの1gに対して5mlの割合で入れて再懸濁した。細胞を溶解させるために30秒ずつ15サイクル(サイクルの間に1分間休止)で超音波破砕した。4℃、9000rpmで30分間遠心分離して上層液を分離し、可溶性たんぱく質が入っている加工されなかったものを抽出物Aで、残っているペリットは不溶性たんぱく質が入っている加工されなかったものを抽出物Bで使用した。各々サンプルに2XSDSサンプル緩衝液を混ぜ、95で5分間沸かした後SDS-PAGEを遂行した(図10)。
ソニケーション(sonication)バッファは5mMイミダゾール、0.5MNaCl、20mMトリス-Cl、pH7.9、結合バッファは5mMイミダゾール、0.5M NaCl、20mMトリス-Cl、8Mウレア、pH7.9、ウオッシング(washing) バッファは50mMイミダゾール、0.5MNaCl、20mM トリス-Cl、8M ウレア 、pH7.9、イルーション(elution)バッファは400mMイミダゾール、0.5M NaCl、20mM トリス-Cl、8Mウレア、pH7.9にした。
ペプチドを精製するために、ヒスチジンタグ(tag)たんぱく質用のNi-NTA樹脂(Novagen)を使用した。この樹脂は樹脂に結合されているNi+とN-末端にヒスチジンヘキサマー(ヒスチジン六量体)融合たんぱく質が相互作用する性質を用いることで、親和力を用いた親和性クロマトグラフィーの一つの方法である。LB培地10mlを夜通し培養した培養液を500mlのLB培地に全量注射し、600nmで吸光度が0.4乃至0.5になるまで37℃で培養した。IPTGを1mM加えて4時間培養した後、4℃、9000rpmで30分間遠心分離して、細胞ペリットを得て-20℃に置いた。氷で溶かしたペリットに超音波粉砕緩衝液を湿潤細胞と5ml/gの割合で入れ再懸濁させて、超音波粉砕を遂行した。実施例5のような方法で超音波粉砕をして細胞を溶解させ、4℃、9000rpmで30分間遠心分離してペリットを得る。残っていた上層液の体積と同一な結合緩衝液をペリットに入れた後再懸濁させ、細胞残骸を除去するために超音波粉砕を3サイクル遂行した。これをまた4℃、9000rpmで30分間遠心分離して得た上層額を精製用サンプルに使った。
B4RCIIはPBSで徐々に透析を遂行し、ウレアの濃度を下げても、たんぱく質の凝集による沈殿が発生しなかったので、この状態でたんぱく質の定量を遂行した。定量はBCAたんぱく質の定量法、UV吸収法を用いて実施した。BCAたんぱく質の定量法に使用した標準は2mg/mlのBSAを1000、500、250、 125、62.5μg/mlに順次に希釈して用いた。BCA分析は溶液A:溶液Bを50:1の割合で作り、サンプルと37℃で30分間反応させ562nmで吸光度を測定し、定量線を用いてたんぱく質の濃度を定量した。UV吸収法はB4RCIIの価は163で280nmでの吸光度を価に分けて濃度を決定した。
ICRマウスでの免役は対照群(DIOを誘導した肥満グループ)、対照群(DIOを誘導しない正常グループ)、B4RCIIで免役化したグループ、B4RB2で免役化したグループ及びB4TB2で免役化したグループ等、5つのグループに分け実行した。6週齢(week old)ICRのマウスに精製したB4RCII、B4RB2及びB4TB2を各々50μgを100μlで腹腔に注射した。注射は2週間ごとで3回実施した後、体重の変化を体重増加グラフで確認した。1次ブスティング以後、高脂肪食を食べさせてDIOを誘導した。1次のブスティングをした後、1週間目に、2次のブスティングした後、1週間目、3週間目、5週間目に尾で採血をした。
血清サンプルを用いて抗体力価を測定した。微細力価平板にB4を各ウェル(well)に100ngの濃度で100μlずつ入れた。そして、4℃で夜通し処理した後プロッキン溶液(PBS、0.5%カセイン、0.02%NaN3)を添加して、37℃で1時間に恒温処理した。洗浄緩衝液で3回洗い落として、実施例10の方法を通じて得た血清をPBSに1:1000~1:8000に希釈して100μlずつ使用し、37で1時間に恒温処理した。洗浄緩衝液で3回洗い落とした後、2次抗体ではゴート抗−マウスIgG-HRP結合抗体を1:1000で希釈して使用した。OPDで発色して、450nmの吸光度で測定した。
TGと総コレステロールの測定は発色試薬200μlに血清4μlを入れ、37℃で5分間恒温処理した後、各々505nm、500nmで吸光度を測定した。HDLの測定は血清と沈殿試薬を1:1に混ぜて室温で10分間放置した後、3000rpm以上記で10分間遠心分離して得た上層液を発色試薬200μlに4μlを入れ、37℃で5分間恒温処理した後、555nmで吸光度を測定した。LDLコレステロールの測定はEZ LDLコレステロール キット(シグマ社製品)を、LDLカリブレーターはRandox社製品を使用し、製造会社から提供されたプロトコルによりキット内の試薬1,150μlに血清4μlを入れて37で5分間反応させた後、試薬250μlを添加して、また37℃で5分間反応させた後、600nmで吸光度を測定した。各測定キットで得た吸光度と標準試液を比較して濃度を計算した。
Claims (22)
- 配列番号1、2及び3の中で選択されたアミノ酸配列を有するペプチドの単量体または多量体;ii)上記のペプチドの単量体または多量体のC-末端に連結された、狂犬病ウイルスヘルパーT細胞エピトープまたはB型肝炎ウイルス表面抗原ヘルパーT細胞エピトープ;iii)及び上記のヘルパーT細胞エピトープのC-末端に連結された、マウスのアポリポたんぱく質CIIのC-末端ペプチド断片また、配列番号1、2及び3の中で選択されたアミノ酸配列を有するペプチドの単量体または多量体が融合された免役原性ハイブリッドポリペプチド。
- 請求項1において、i)ペプチドの多量体は配列番号1、2及び3の中で選択されたアミノ酸配列を有するペプチドが2乃至8個連結されたものであるポリペプチド。
- 請求項2において、上記の多量体は配列番号1、2及び3の中で選択されたアミノ酸配列を有するペプチドが4個連結されたものであるポリペプチド。
- 請求項3において、上記の多量体は配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドが4個連結されたものであるポリペプチド。
- 請求項4において、上記の多量体は配列番号5のアミノ酸配列を有するものであるポリペプチド。
- 請求項1において、狂犬病ウイルスのヘルパーT細胞エピトープが配列番号6のアミノ酸配列を有するものであるポリペプチド。
- 請求項1において、B型肝炎ウイルスの表面抗原ヘルパーT細胞エピトープが配列番号7のアミノ酸配列を有するものであるポリペプチド。
- 請求項1において、マウスアポリポたんぱく質CIIのC-末端ペプチド断片が配列番号8のアミノ酸配列を有するものであるポリペプチド。
- 請求項1において、iii)ポリペプチドの多量体は配列番号1、2及び3の中で選択されたアミノ酸配列を有するペプチドが2乃至4個連結されたものであるポリペプチド。
- 請求項9において、上記の多量体は配列番号1、2及び3の中で選択されたアミノ酸配列を有するペプチドが2個連結されたものであるポリペプチド。
- 請求項10において、上記の多量体は配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドが2個連結されたものであるポリペプチド。
- 請求項1において、i)配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドが4個連結されたポリペプチド、ii)上記のポリペプチドのC-末端に連結された狂犬病ウイルス ヘルパーT細胞エピトープ、及びiii)上記のヘルパーT細胞エピトープのC-末端に連結された、マウスのアポリポたんぱく質CIIのC-末端ペプチド断片が融合された免役原性ハイブリッドポリペプチド。
- 請求項12において、配列番号9のアミノ酸配列を有する免役原性ハイブリッドポリペプチド。
- 請求項1において、i)配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドが4個連結されたポリペプチド、ii)上記のポリペプチドのC-末端に連結された狂犬病ウイルス ヘルパーT細胞エピトープ、及びiii)上記のヘルパーT細胞エピトープのC-末端に連結された、配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドが2個連結されたポリペプチドが融合された免役原性ハイブリッドポリペプチド。
- 請求項14において、配列番号10のアミノ酸配列を有する免役原性ハイブリッドポリペプチド。
- 請求項1において、i)配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドが4個連結されたポリペプチド、ii)上記のペプチドのC-末端に連結されたB型肝炎ウイルス表面抗原ヘルパーT細胞エピトープ;及びiii)上記のヘルパーT細胞エピトープのC-末端に連結された配列番号1のアミノ酸配列を有するペプチドが2個連結されたポリペプチドが融合された免役原性ハイブリッドポリペプチド。
- 請求項16において、配列番号11のアミノ酸配列を有する免役原性ハイブリッドポリペプチド。
- 請求項1乃至請求項17の中でいずれの1項において、免役原性ハイブリッドポリペプチドを含む肥満予防及び治療用ワクチン。
- 請求項1乃至請求項17の中でいずれの1項において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項19のポリヌクレオチドを含む再結合発現ベクター。
- 請求項20の再結合発現ベクターに形質変換された宿主細胞。
- 請求項20の再結合発現ベクターに形質変換された宿主細胞を培養し、請求項1のポリペプチドを製造する方法。
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