TW202311281A - 一種自組裝蛋白質奈米粒子及其應用 - Google Patents

一種自組裝蛋白質奈米粒子及其應用 Download PDF

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自組裝蛋白質奈米粒子 (SAPN) 是極好的抗原，因為它能夠同時向 B 細胞呈現多個表位，並產生比單個表位更強的 B 細胞受體訊息傳遞。大部分SAPN來源於病毒或細菌噬菌體的殼蛋白，其粒子穩定性低，存在針對殼蛋白的抗體，結構不耐受目標肽插入。在本發明中，我們使用具熱穩定性且可耐受目標肽插入的非病毒蛋白創建了SAPN。該 SAPN 的組裝單體是兩個模組之間的融合蛋白：首先，由 A 型流感病毒 M2 蛋白修飾的兩親性螺旋肽組成的聚合模組，以及由超摺疊綠色螢光蛋白(sfGFP)組成的目標肽呈現模組, 在 sfGFP 的特定環上具有目標肽插入位點。該粒子能夠通過基因重組插入目標肽，並將目標肽呈現到奈米粒子表面，從而在不使用佐劑的情況下刺激產生針對目標肽的高親和力抗體。

Description

一種自組裝蛋白質奈米粒子及其應用
本發明涉及一種新型無疏水性區域的自組裝蛋白質奈米粒子以及利用此奈米粒子來製備高親和力及特異性抗體的方法.
文獻報導的自組裝蛋白質奈米粒子大多來源於病毒或細菌噬菌體的殼蛋白。這些 自組裝蛋白質奈米粒子 組成蛋白包括 HBV 表面抗原 (HBsAg)、人乳頭瘤病毒 L1 主要殼蛋白 (HPV L1)、不動桿菌噬菌體的殼蛋白 (AP205) 和 HBV 的核心抗原 (HBcAg)。 自組裝蛋白質奈米粒子的兩個結構特徵，分子特異性和多價性，使其成為合適的疫苗佐劑和載體。自組裝蛋白質奈米粒子上的高抗原密度和結構有序的抗原排列類似於病原體的識別模式，因此促進了抗原與 BCR 的交聯。這種多價相互作用是激發有效免疫反應的關鍵步驟，也是次單位疫苗免疫原性較弱的解決方案。事實上，除了 CD8+ T 細胞介導的保護之外，自組裝蛋白質奈米粒子還引起高效價的高親和力中和 IgG。它們不僅觸發補體激活，還有助於創造促進疫苗與 APC 相互作用的微環境。因此，自組裝蛋白質奈米粒子已用於預防性和免疫治療性疫苗。抗原在自組裝蛋白上的結合以及隨後嵌合自組裝蛋白質奈米粒子 的產生是通過直接自組裝過程或抗原與奈米粒子的共價化學鍵合來完成的。
研究最多的自組裝蛋白質奈米粒子之一是基於B型肝炎病毒 (HBcAg) 的核心抗原所組成的自組裝蛋白質奈米粒子。 HBcAg 單體包含一個組裝結構域 (1–149 aa) 和一個 C 端結構域 (CTD)，用於結合核酸。組裝結構域由 5 個 alpha 螺旋和主要免疫顯性區 (MIR) 組成，位於螺旋 3 和螺旋 4 之間，用作外源肽的插入位點。 HBcAg 單體結合成二聚體並在微生物蛋白質表達過程中通過二聚體間接觸產生自發組裝。 HBcAg 在人類疫苗設計中的應用面臨兩個挑戰。首先，這種自組裝蛋白質奈米粒子是基於人類病原體，因此由於既存抗體，它對全球 4.5 億慢性B型肝炎帶原者無效，並且對那些已經接觸過病毒的人可能效果較差。其次，插入核心抗原的許多外源表位破壞了 HBcAg 粒子的自組裝特性。這兩個問題使得開發一種可以解決這兩個問題的自組裝蛋白質奈米粒子更顯重要。
螢光蛋白是一個具有相似 3D 結構和功能的蛋白質家族。目前已經在珊瑚、海葵、節肢動物、橈足類和文昌魚類的各種物種中分離出螢光蛋白同源物。來自不同物種的螢光蛋白具有相似的 3D 結構，但初級蛋白質序列的相似性較低。螢光蛋白家族共享一個 beta桶結構(beta barrel structure)，由 11 個beta摺板和一個貫穿桶狀結構含有發色團的 alpha 螺旋組成。每個beta摺板通過一個環連接到下一個beta摺板，特定環對肽插入的耐受性更強，而不會影響結構完整性及其產生螢光的功能。螢光蛋白具有高度熱穩定性和快速摺疊性，可以輕鬆與另一種蛋白質融合，而不會破壞兩種蛋白質的結構。螢光蛋白已應用於多個領域，例如在細胞生物學研究中，當與目標蛋白融合時，可作為標誌物，在螢光顯微鏡下監測目標蛋白的定位；在生化研究通過兩個相容的螢光蛋白對（個別融合到一個目標蛋白）之間的能量轉移來標記兩種蛋白質之間的密切相互作用。螢光蛋白的穩定性及其對肽插入的耐受性可以通過直接進化過程來提高，該過程結合了螢光蛋白編碼區的隨機誘變，通過 DNA 改組和篩選在結構破壞者存在的情況下正確摺疊的殖株。結構破壞者可以是插入在 beta 摺板 8 和 9 之間的任一肽序列。通過這個過程，所有物種的螢光蛋白都可能被修改為超摺疊型。順天堂大學的 Kobayashi 博士已經證明，可以將功能性肽插入超摺疊綠色螢光蛋白(sfGFP) 的 beta 摺板 8 和 9 之間的環中，而不會破壞用作純化串聯親和標籤的結構完整性。親和標籤中包含的肽之一包括鏈黴親和素結合肽（序列：MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP），這是一種 38 個氨基酸的肽，可與鏈黴親和素以高特異性和親和力相互作用。芝加哥大學的 Pavoor 博士描述了通過在綠色螢光蛋白(GFP) 中兩個鄰近環中插入隨機肽序列來建構出基於綠色螢光蛋白的抗體庫。當該抗體庫以目標蛋白進行篩選時，可以篩選出具有奈米莫耳(10 -9M)親和力的螢光蛋白抗體。
蛋白質聚集是一種生物學現象，其中本質上無序的蛋白質或錯誤摺疊的蛋白質通過疏水性作用相互作用。 合成後，蛋白質通常摺疊成特定的三級結構，這是對熱力學最有利的：它們的天然狀態。 這種摺疊過程是由疏水性作用驅動的：蛋白質的疏水部分通過埋入蛋白質內部來保護自己免受細胞內親水環境的影響。 因此，蛋白質的外部通常是親水的，而內部通常是疏水的。 蛋白質表面存在疏水性區域會增加通過與另一個蛋白質的疏水性區域相互作用形成蛋白質聚集的機會。 長時間的蛋白質聚集導致蛋白質沉澱和去活。
兩親性螺旋肽(amphipathic helical peptide, AH)是介導蛋白質與脂質膜相互作用的結構模體。 這些相互作用可以分為幾個功能：首先，介導外周膜蛋白的膜定位； 第二，部分細菌毒素通過兩親性螺旋肽破壞膜的完整性； 第三，為病毒出芽創造膜彎曲。 已知來自 A 型流感病毒 M2 蛋白的兩親性螺旋肽(M2AH)介導病毒出芽和 M2 質子通道的膜錨定。 A型流感病毒的M2AH位於M2蛋白的第44至62位氨基酸之間，而不同A型流感病毒株之間的M2AH存在一定差異,但都有相似功能。 當 M2AH 嵌入到含有膽固醇的磷脂膜中時，M2AH 介導膜彎曲並造成病毒出芽。
為了表現可作為藥物使用或生物醫學研究的重組蛋白，目前已經開發了各種重組蛋白表達系統。 從最簡單但高產量的細菌表達系統到最複雜但最精細的哺乳動物細胞表達系統，不同的表達系統在翻譯後修飾方面各有獨特的優點。 無細胞蛋白質表現系統，如小麥胚芽提取物、兔網狀紅血球裂解物或大腸桿菌提取物系統，為生物醫學研究人員提供了一種有用的工具，可進行高通量功能基因組和蛋白質組學的研究。
本專利說明書描述了可用於產生具有多種功能的自組裝蛋白質奈米粒子的新型試劑，其功能包括當目標肽通過基因重組插入該奈米粒子時可刺激針對目標肽的長持續時間抗體反應。該試劑由兩部分組成，一個聚合模組:包含一個來源於甲型流感病毒M2蛋白的兩親性螺旋肽和兩個穩定蛋白奈米粒子的點突變；其次，一個目標肽呈現模組:包含一個超摺疊綠色螢光蛋白 (sfGFP)，以及一個位於 sfGFP 的beta 摺板 8 和 9 之間的目標肽插入位點。 8xHis 序列可位於插入位點中以用於蛋白質純化。該試劑在各個領域的應用始於合成包含目標肽編碼序列的小基因。然後將該基因通過基因重組插入到目標肽插入位點，創建蛋白表現質體。將該質體轉型到表達蛋白質的大腸桿菌菌株中並培養用於蛋白質誘導。表現的重組蛋白將在轉譯後自發組裝成奈米粒子，並可使用 Ni-NTA 樹脂或其他方法進行純化。純化後的蛋白質可用於不同的應用，例如：免疫動物以產生高親和力抗體或直接作為傳染病疫苗。
應當理解，本發明不限於特定的設備或方法，其當然可以變化。 還應理解，本文中使用的術語僅用於描述特定實施例的目的，並不旨在進行限制。 在本說明書和所附權利要求書中使用的單數形式“a”、“an”和“the”包括所指對象的單數和複數，除非內容另有明確規定。 此外，在本申請中，“可以”一詞是在允許的意義上使用（即，有潛力，能夠），而不是在強制性意義上（即，必須）。 術語“包括”及其派生詞的意思是“包括但不限於”。 術語“耦合”是指直接或間接連接。 術語“目標肽”是指用作抗原、診斷探針或蛋白質結合肽的肽序列。
我們的發明包括一種可聚合成自組裝蛋白質奈米粒子 (SAPN) 的重組蛋白，該粒子可以通過基因重組將目標肽結合到粒子表面。 在一個優選的實施方案中，重組蛋白由兩部分組成：聚合模組由A型流感病毒M2蛋白的兩親性螺旋肽變異株組成； 目標肽呈現模組由超摺疊綠色螢光蛋白(sfGFP) 和插入到sfGFP beta 摺板 8 和 9 之間的環中的目標肽插入位點組成。 該目標肽插入位點可含有8xHis 標記和目標肽（圖 1，序列 1） .
在另一個實施方案中，目標肽呈現模組中的sfGFP可以被超摺疊mCherry(sfmCherry)或熱綠蛋白(Thermal Green Protein, TGP)替代。
在另一個實施方案中，目標肽呈現模組的sfGFP可以被另一種螢光蛋白替代, 其特徵為其蛋白結構是由11個beta摺板和1個alpha螺旋所組成的beta桶結構，同時蛋白被光子激發時可發出螢光。
在另一個實施方案中，聚合模組可以融合到目標肽呈現模組的C端。
在另一個實施例中，聚合模組可以包含A型流感病毒M2蛋白的氨基酸位置44至氨基酸位置62的肽序列。
在另一個實施方案中，聚合模組中的LYRRLE肽(序列號7)可以被含有DRLFFKCLYRRLDYGLKRG序列(序列號11)的肽替代。
在另一個實施方案中，聚合模組中的LYRRLE肽(序列號7)可以被含有DRLFFKCIYRRLEYGLKRG序列(序列號8)的肽替代。
在另一個實施方案中，聚合模組中的LYRRLE肽(序列號7)可以被含有DRLFFKCIYRRLDYGLKRG序列(序列號9)的肽替代。
在另一個實施方案中，聚合模組可以包含具有LFFKCLYRRLEYGL序列(序列12)的肽。
在另一個實施方案中，目標肽可以是調節腫瘤生長的腫瘤抗原。與腫瘤抗原結合的自組裝蛋白質奈米粒子可通過免疫宿主而用作抗腫瘤的治療性疫苗。
在另一個實施方案中，目標肽可以是介導感染過程的傳染性病原體的蛋白質。
在另一個實施方案中，目標肽可以是人類細胞上的病毒受體。
在另一個實施方案中，目標肽可以是腫瘤結合肽，當自組裝蛋白質奈米粒子被注射到宿主中時，其能夠將螢光SAPN濃縮到腫瘤部位。
在另一個實施方案中，目標肽可以是鏈黴親和素結合肽，其使基於LYRRLE-sfGFP的自組裝蛋白質奈米粒子能夠與大的生物素化蛋白質交聯。
在另一個實施方案中，可以通過在重組蛋白的N端添加6His標記來增強基於LYRRLE-sfGFP的自組裝蛋白質奈米粒子的穩定性；6His標記也可以加到重組蛋白的 C 端。
在另一個實施方案中，可以通過添加二糖如海藻糖或蔗糖來增強基於LYRRLE-sfGFP的自組裝蛋白質奈米粒子的穩定性。
在另一個實施方案中，可以將訊息肽連接到基於LYRRLE-sfGFP的重組蛋白N端以促進自組裝蛋白質奈米粒子輸出到大腸桿菌的周質空間中或是進入細胞分泌路徑(secretory pathway)。這些肽包含來自麥芽糖結合蛋白 (MBP)、beta-內酰胺酶、Cry1Ia 毒素、PelB、HlyA、GeneIII 的訊息肽。
在另一個最佳的實施方案中，揭露一種刺激高親和力抗體產生的方法。第一個步驟是通過使用化學合成或PCR合成編碼目標肽的基因。第二個步驟是通過基因重組技術將該基因克隆到目標肽插入位點，產生一個蛋白質表現質體。第三個步驟是將得到的蛋白質表現質體轉形到蛋白質表現大腸桿菌菌株中，如 ClearColi BL21(DE3)，然後在低溫 (20 oC) 培養箱中使用 IPTG誘導蛋白質表現，以增強蛋白質摺疊完整性和產量。第四個步驟是利用不同方法進行重組蛋白純化。例如通過超音波裝置 (Misonix sonicator 3000) 將細菌均質化後，將含有細菌裂解物的重組蛋白在 SS34 轉子中在 Sorvall RC6 離心機中以 10,000 rpm 離心 10 分鐘以去除細胞碎片。然後通過與 Ni-NTA 樹脂結合來純化重組蛋白，並用含有 500 mM 咪唑的洗脫緩衝液洗脫。按照上述程序表達和純化的重組蛋白無需進一步處理即可自發形成奈米粒子，並可在洗脫緩衝液（20 mM NaPO4、300mM NaCl、500 mM 咪唑 pH 8.0）中於 4℃保存數月。第五個步驟是將純化的自組裝蛋白質奈米粒子置換到生理緩衝溶液後，不加佐劑直接進行免疫接種。詳細步驟是使用脫鹽管柱（GE illustra NAP-5）將蛋白質置換到 1/2xGF 緩衝液中，pH 範圍在 7.0 和 8.0 之間。蛋白可以不加佐劑直接注射到小鼠後肢進行免疫，免疫後2週或更晚採血進行ELISA測定。
在另一個實施方案中，該自組裝蛋白質奈米粒子還可用於免疫小鼠以外的動物，例如魚、兔、雞、犬、貓、豬、牛、馬和人。
在另一個實施方案中，自組裝蛋白質奈米粒子也可以在其他非細菌表現系統中表現，例如酵母、昆蟲細胞、植物和哺乳動物細胞系統。
在另一個實施方案中，可以在無細胞蛋白質表達系統中表現基於LYRRLE-sfGFP的重組蛋白以產生大量的自組裝蛋白質奈米粒子克隆，每個克隆都包含不同的目標肽。
在另一個實施方案中，基於LYRRLE-sfGFP的自組裝蛋白質奈米粒子可以與佐劑混合以在免疫時增強目標肽的抗原性。
在另一個實施方案中，聚合模組可以與另一種蛋白質直接融合形成具有新功能的全新自組裝蛋白質奈米粒子。例如，LYRRLE 肽可以與單鏈抗體(single chain variable fragment, scFv) 融合，驅動基於單鏈抗體的自組裝蛋白質奈米粒子的形成，該自組裝蛋白質奈米粒子能夠同時結合多個單鏈抗體以獲得更高的親和力。
在另一個實施方案中，聚合模組可以直接與螢光蛋白抗體融合以形成帶有多個螢光蛋白抗體的自組裝蛋白質奈米粒子。此自組裝蛋白質奈米粒子可作為體內或體外診斷試劑。 實施例
包括以下實施例以說明本發明的優選實施方案。 本領域技術人員應當理解，以下實施例中公開的技術代表了發明人所開發，在本發明的實踐中發揮良好作用的技術，因此可以認為這些技術構成了其發明實施的最佳模式。 然而，熟悉本領域之技術人員根據本公開內容應當理解，在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，可以對所公開的具體實施例進行許多改變並且仍然獲得相近或相似的結果。 實施例 1
AH3與GFP的融合能夠形成自組裝蛋白質奈米粒子並刺激長期免疫反應。
AH3是源自A型流感病毒的M2蛋白的兩親性螺旋肽。 綠色螢光蛋白(GFP) 從表現增強型綠色螢光蛋白的 pEGFP-C1 載體克隆而來。與 His-GFP 相比，AH3-GFP 可形成更高階的蛋白質結構，其分子量大於 1000 kDa，如在不同截留分子量的尺寸排阻膜中離心 AH3-GFP 蛋白質溶液所示（圖 2A）。在透射式電子顯微鏡下檢查時，AH3-GFP 可形成棒狀結構（圖 2B）。以上數據顯示AH3-GFP會形成大於 1000 kDa 的聚合物。當 AH3-GFP 重組蛋白用於接種小鼠時，它所誘導的抗 GFP 抗體反應持續了 6 個月（圖 2C）。 AH3-GFP 聚合物的結構是將AH3肽中的alpha-螺旋結構，通過蛋白質建模軟體來預測的。蛋白質建模的預測結構顯示AH3-GFP重組蛋白以 AH3 肽作為聚合中心形成四聚體，然後 AH3-GFP 四聚體以十字形堆疊在另一個四聚體頂部，並形成棒狀結構（圖 2D）。每個預測的四聚體都包含一個可驅動聚合過程的疏水性區域。如圖 3 所示，AH3-sfGFP-2xhM2e 蛋白與細菌膜相互作用並與細菌膜共沉澱。在蛋白質模型引導設計出變異株後，將 AH3 肽序列的變異株引入 AH3-sfGFP-2xhM2e 融合蛋白，並成功利用蔗糖梯度溶液分析來檢測 帶有AH3 變異株奈米粒子的細菌裂解物來驗證是否可通過肽序列點突變去除疏水性區域。結果顯示 AH3 變異株中LYRRLE（序列號 7）、RRLD（序列號 9）和 RRLE（序列號 8）減少了細菌膜共沉澱，這表明這些變異株去除了疏水性區域。圖 3C 中的數據表明，用谷氨酸 (E) 或天冬氨酸 (D) 替換第 13 位賴氨酸對於去除疏水性區域很重要，並且可能有助於粒子穩定性。其中一株 AH3 變異株 LYRRLE 在 TEM 下仍保持棒狀結構（圖 3D）。 實施例 2
評估基於 LYRRLE-sfGFP 的自組裝蛋白質奈米粒子的熱穩定性。
已知螢光蛋白可耐受高達 75°C 的高溫，超摺疊 GFP (sfGFP)甚至可耐受達到 85°C，而不會失去螢光(表示失去原有結構)。在高溫儲存期間保持活性的能力將使開發出的疫苗能夠到達疫苗冷鏈以外的偏遠地區。首先在生理緩衝液中評估從自組裝蛋白質奈米粒子去除疏水區域的 LYRRLE 變異株的穩定性。將 AH3-sfGFP-2xhM2e 和 LYRRLE-sfGFP-2xhM2e 置換到生理緩衝液（10 mM NaPO4、150mM NaCl，pH 7.4）中並調整至 1 mg/ml，然後在室溫（25℃）中儲存 20 天。在第 10 天，AH3-sfGFP-2xhM2e 溶液變得混濁，但 LYRRLE-sfGFP-2xhM2e 沒有。在第 20 天，在微量離心機中以 14.5krpm 離心 5 分鐘去除已沉澱的蛋白質。將上清液以SDS-PAGE 分析蛋白質完整性。結果大部分的AH3-GFP-2xhM2e都降解成較小的片段, 而大部分的LYRRLE-sfGFP-2xhM2e仍然維持原分子量。這顯示 I8L 和 K13E 的突變穩定了基於 AH3-sfGFP 的自組裝蛋白質奈米粒子（圖 4A）。為了測試基於 LYRRLE-sfGFP 的 SAPN 在儲存過程中是否能夠承受高溫，將 LYRRLE-sfGFP-2xhM2e 置換在生理緩衝液中，並在4 oC 或 37 oC儲存 4 個月。然後將蛋白質用於小鼠免疫以測試該蛋白質的抗原熱穩定性。將小鼠分為三組， 4 oC 或 37 oC中儲存 4 個月或新鮮製備的蛋白質，每組用 20微克 蛋白質免疫一次。免疫後14天收集血清並用ELISA檢測抗-hM2e肽IgG效價。結果顯示，與新鮮製備的蛋白質相比，LYRRLE-sfGFP-2xhM2e 蛋白在4 oC 或 37 oC下儲存 4 個月都會使抗原活性降低 4 倍（圖 4B），但是兩者之間沒有差異。所以高溫儲存對基於 LYRRLE-sfGFP 的 SAPN 活性沒有影響。 實施例 3
呈現廣譜流感疫苗表位 hM2e 的基於 LYRRLE-sfGFP 的自組裝蛋白質奈米粒子的構建、表達和免疫。
合成含有2 個A 型流感病毒株 PR8 的 M2 胞外區域 (hM2e) 的基因，並以基因重組方式插入可表現 LYRRLE-sfGFP 重組蛋白的質體目標肽插入位點中。將含有可表現正確重組蛋白的質體 (LYRRLE-sfGFP-2xhM2e) 轉型到 ClearColi BL21(DE3) 勝任細胞中，並接種到含有 50微克/ml 卡那黴素(Kanamycin)的平板上。平板在 37℃培養箱中培養 2 天。第三天早上，從平板上刮下菌落並加到含有 50　微克 /ml 卡那黴素的 LB培養液中。然後將含菌培養液在 37 oC 的培養箱中搖晃直到 O.D. 600 達到 0.5-0.7，然後將培養瓶從培養箱中取出，將其放在冰上冷卻。加入 0.2 mM IPTG 後，將培養瓶置於 20 oC 的培養箱中誘導蛋白質表現16 小時。使用RC6離心機在SLA1500轉子中以5000rpm離心10分鐘來收集細菌。然後將細菌重新懸浮在裂解緩衝液（20 mM NaPO4、300 mM NaCl、10 mM 咪唑，pH 8.0）中，並使用超音波破碎儀（Misonix sonicator 3000）在冰浴中以 10 秒開啟/20 秒關閉循環進行超音波處理 5 分鐘。使用 Sorval SS34 轉子在 4 oC 下以 10000 rpm 離心 10 分鐘去除不溶性細胞碎片。然後按照用戶手冊中的說明，將含有目標蛋白質的上清液以Ni-NTA樹脂純化。使用洗脫緩衝液（20 mM NaPO4、300 mM NaCl、500 mM 咪唑，pH 8.0）洗脫結合的蛋白質。洗脫的蛋白質可在洗脫緩衝液中,以 4 oC 保存較長時間。進行小鼠免疫之前，使用 Sephadex 25 管柱（GE illustra NAP5）將蛋白質置換到 1/2xGF 緩衝液（10 mM NaPO4、150 mM NaCl、pH 7.4）中。免疫是通過將 20 微克 AH3-sfGFP-2xhM2e 或 LYRRLE-sfGFP-2xhM2e重組蛋白注射到小鼠的後肢肌肉。單次接種後，在第 15 天、第 50 天、第 90 天和第 202 天通過面部靜脈出血後收集血清用於 ELISA 分析以確定抗 hM2e IgG 抗體效價（圖 5）。結果顯示使用 LYRRLE-sfGFP-2xhM2e 蛋白免疫小鼠後，5 隻小鼠中有 4 隻小鼠的抗 hM2e IgG 效價的可維持長達六個月(圖5C)，但是當使用 AH3-sfGFP-2xM2e 蛋白免疫小鼠時，5 隻小鼠中只有 1 隻小鼠有持久的抗 hM2e IgG 抗體效價(圖5B)。 實施例 4
檢測LYRRLE-sfGFP  蛋白免疫的小鼠的血清檢測和區分兩種 M2e 肽變異株。
三種蛋白質，His-sfGFP (lane 1)、LYRRLE-sfGFP-2xhM2e (lane 2) 和 LYRRLE-sfGFP-2xM2e (lane 3) 分別加10 ng蛋白以 SDS-PAGE分離並印跡到 PVDF 膜上。然後用血清 VP-10（用含有M2e的SAPN免疫兩次後的血清）或#830（用含有hM2e 的SAPN免疫兩次後的血清）血清作為1級抗體, 並通過 ECL 試劑檢測抗原蛋白。結果顯示血清 VP-10 或 #830 僅檢測具有相同抗原肽序列的蛋白質。hM2e (SLLTEVETPIRNEWGSRSNGSSD 23 a.a.) 和 M2e (SLLTEVETPTRSEWESRSSDSSD 23 a.a.) 之間有五個氨基酸差異（圖 6A）。 #830 可以在 1:5000 稀釋後檢測 10ng 抗原蛋白。血清#830 還對 hM2e 肽具有高親和力，它可以檢測 WB 中低至 1ng 的重組蛋白（圖 6B）。 實施例 5
LYRRLE-sfGFP-CMTR2 SAPN的構建、純化和免疫。
合成含有2個串聯拷貝的CMTR2(Cap Methyltransferase 2)肽(a.a 233-253)的基因(序列10)被合成並通過基因重組插入到LYRRLE-sfGFP重組蛋白表達質體的目標肽插入位點中。將構建好的質體LYRRLE-sfGFP-CMTR2轉型到ClearColi BL21(DE3)勝任細胞中並接種於卡那黴素平板上。純化的LYRRLE-sfGFP-CMTR2重組蛋白在間隔 14 天以 40 微克 連續免疫 4 次後，從小鼠面部靜脈採集的血液中製備血清，用於蛋白質印跡分析。 A) 用於蛋白質印跡免疫反應的抗原蛋白包括 His-sfGFP（lane 1）、LYRRLE-sfGFP-2xhM2e（lane 2）、LYRRLE-sfGFP-CMTR2（lane 3）、LYRRLE-sfGFP-CMTR2-6（lane 4）、LYRRLE -sfGFP-CMTR2-B（lane 5）、LYRRLE-sfGFP-Notch3-1（lane 6）、LYRRLE-sfGFP-Notch3-3（lane 7）。 B) 用於蛋白質印跡免疫反應的蛋白混合物包含圖7A所示的7種蛋白質，每種蛋白1ng混合，並通過 SDS-PAGE 分離並印跡到 PVDF 膜上，並用以LYRRLE-sfGFP-CMTR2 免疫小鼠4次後取得的 5 份小鼠血清進行檢測。結果顯示來自被 LYRRLE-sfGFP-CMTR2 免疫的小鼠的血清僅能檢測到有插入相對應目標肽的抗原蛋白，但不會檢測到共享相同的 LYRRLE-sfGFP 序列其他蛋白質（圖 7）。 例 6
使用親和樹脂從免疫血清中去除抗 His-sfGFP IgG。
首先表現並使用Ni-NTA樹脂純化沒有聚合模組或目標肽的重組蛋白sfGFP-8His。將洗脫的重組蛋白濃度調節至 4 mg/ml，然後將 2ml sfGFP-8His 蛋白質首先置換到偶聯緩衝液（0.6M 檸檬酸鹽，0.1M MOPS pH 7.5）中，然後直接與 0.5 公克活化親和樹脂（Pierce Ultralink Biosupport）混合進行交聯。將交聯反應混合物從頂部到底部以20rpm連續旋轉 1 小時，然後離心去除游離蛋白質。未反應的交聯劑用5ml 3M乙醇胺旋轉3小時進行淬滅(quench)。然後將 His-sfGFP 蛋白包被的親和樹脂加載到空管柱中，用 10 個膠體體積的 1M NaCl 和 10 個膠體體積的無菌 Milli-Q 水洗滌，以去除非共價連接的 His-sfGFP 蛋白。按照本實驗步驟製備的親和樹脂可儲存在20% 乙醇中進行4 oC冷藏。為了測試 His-sfGFP 樹脂去除抗sfGFP IgG 和抗His IgG 的能力，首先將經過 LYRRLE-sfGFP-2xhM2e 抗原免疫兩次的小鼠的 10 微升血清在 ELISA 封阻緩衝液（1% BSA, 10mM NaPO4, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20 pH7.5 ）中稀釋 20 倍，然後通過含有 50 微升或 100 微升親和樹脂的小管柱 3 次。然後將吸附過的血清稀釋液用於包覆 hM2e 肽或 sfGFP-8His 蛋白的 ELISA。結果顯示使用最終稀釋倍數400倍的血清的OD450結果。它表明 sfGFP 親和樹脂可以有選擇性的去除抗 sfGFP IgG及抗His IgG但不能去除抗 hM2e IgG（圖 8）。
鑑於此描述，本發明的各個方面的進一步修改和替代實施例對於本領域技術人員來說將是顯而易見的。 因此，該描述僅可解釋為說明性的並且是為了教導本領域技術人員實施本發明的一般方式。 應當理解，本文所示和描述的本發明的形式將被視為實施例的示例。在此說明和描述的那些元件和材料可以代替，部件和過程可以顛倒，並且本發明的某些特徵可以獨立使用，因此對於熟悉本領域的技術人員，經過對本發明的所有這些描述，本發明的描述之後將是顯而易見的。 在不脫離如以下權利要求項中描述的本發明的精神和範圍的情況下，可以對這裡描述的元素進行改變。
受益於以下實施例的詳細描述和參考附圖，本發明的優點對於本領域技術人員將變得顯而易見，其中：
圖1.描繪了本發明中所提及的自組裝重組蛋白的一級結構。 該重組蛋白包含兩模組，聚合模組和目標肽呈現模組。 聚合模組包含一個兩親性螺旋肽 (LYRRLE)，其肽序列為 MDRLFFKCLYRRLEYGLKRG。 目標肽呈現模組包含一個 sfGFP，目標肽插入位點位於beta摺板 8 和 9 之間。用於重組蛋白純化的 8xHis 序列可能位於目標肽插入位點內或其他位點。
圖 2.描繪了 AH3-GFP 介導的自組裝蛋白質奈米粒子的分析結果。 A) 當 GFP 與 AH3 肽融合時，可形成更高階的蛋白質結構。該 GFP 源自 pEGFP-C1 質體，其主要序列為增強型 GFP (EGFP)。 His-GFP 或 AH3-GFP 的蛋白質製劑在截留分子量 (MWCO) 為 100 kDa、300 kDa 和 1000 kDa 的尺寸排阻膜(size exclusive membrane)上離心。通過 SDS-PAGE 分析通過膜的蛋白質以與輸入蛋白質進行比較。 B) 顯示了 AH3-GFP 的透射電子顯微鏡圖像。比例尺為 100 nm。 AH3-GFP蛋白複合物經磷鎢酸負染色後的TEM圖像。圖像是使用 Tecnai G2 Spirit Twin 拍攝的。 C) 用不含脫氧膽酸鹽 (DOC) 的 His-GFP 和 AH3-GFP 蛋白對小鼠進行一次免疫，持續 6 個月。而與脫氧膽酸鹽混合的蛋白質僅觀察一個月時間。通過ELISA分析收集的血清以鑑定抗GFP IgG幾何平均效價(Geometric Mean Titer, GMT)。 D) 根據 TEM 圖像所構建之 AH3-GFP 聚合物結構模型。
圖 3. 描繪了AH3 變異株以及能夠形成無疏水性區域 自組裝蛋白質奈米粒子 的 AH3 變異株的分析結果。 A) 通過蛋白質結構模型引導設計的 AH3 變異株列表。 AH3-sfGFP-2xhM2e 中從 AH3 改變的氨基酸標有下劃線。 B) 評估使用蔗糖梯度溶液來識別由 AH3 變異株形成的無疏水性區域 自組裝蛋白質奈米粒子 的適用性。在 13 毫升容量的聚丙烯管（Beckman cat# 14287）中，底部首先用 1 毫升 85% (w/v) 蔗糖溶液，上面加上 2 毫升 45% (w/v) 蔗糖溶液，最後是 7 毫升 15 % (w/v) 蔗糖溶液。蘇丹 III 溶液以異丙醇製備為 0.5%。管 1 是一個控制組，含有蔗糖梯度溶液及蘇丹III溶液，但不添加細菌裂解液。管2是含有細菌裂解液和蘇丹III溶液混合後加在蔗糖梯度溶液上的離心管。細菌裂解液是通過在 Sorvall 6C 的 SS34 轉子中以 10K rpm 將超音波裂解處理後的細菌細胞離心 10 分鐘來製備。將離心管在 SW41Ti 轉子中以 35K rpm 離心 2 小時。離心後，管 1的 蘇丹 III 染料直接沉降到位於 45% 和 85% 蔗糖溶液之間的交界處，但在管 2 中，蘇丹 III 染料停在 15% 和 45% 蔗糖溶液的交界處。該數據顯示當添加細菌裂解液時，疏水性蘇丹 III 染料和細菌膜相結合後會在 15% 至 45% 的蔗糖溶液相鄰處積聚。 C) 使用相同的蔗糖梯度溶液，將含有不同 AH3 變異株重組蛋白的 1 毫升細菌裂解液加在蔗糖梯度溶液的頂部，並在 SW41Ti 轉子中以 35K rpm 的速度離心 2 小時，然後對離心管照射 450nm 波長光進行成像以觀察自組裝蛋白質奈米粒子之分佈。 AH3變異株的排列：管1，AH3（序列3）；管 2，LY（序列 4）；管 3，LYRLLK（序列 5）；管 4，LYRLLE（序列 6）；管 5，LYRRLE（序列 7）；管 6，RRLE（序列 8）；管 7，RRLD（序列 9）。結果顯示由 LYRRLE、RRLE 和 RRLD 變異株形成的 SAPN 仍然形成 SAPN 並沉降到 45% 和 85% 蔗糖級分之間的交界處。與細菌膜共沉澱的蛋白質較少。但大部分由AH3、LY、LYRLLK或LYRLLE變異株形成的SAPN與細菌膜共沉澱，沒有一個達到45%-85%的交界處。 D) 顯示了LYRRLE-sfGFP-2xhM2e變異株組成的SAPN TEM 圖像。比例尺為 50 nm。這些結果表明 LYRRLE、RRLE 和 RRLD 變異株能夠形成不含疏水性斑塊的 自組裝蛋白質奈米粒子。
圖 4. 描繪了 LYRRLE-sfGFP-2xhM2e 自組裝蛋白質奈米粒子 的熱穩定性。 A) 將LYRRLE-sfGFP-2xhM2e 和 AH3-sfGFP-2xhM2e 以脫鹽樹脂管置換到 1/2xGF 緩衝液中，並在室溫下保存 20 天。然後將蛋白質溶液以 14.5K rpm 離心 5 分鐘來移除已沉澱的蛋白。 存留在溶液中的蛋白質通過 SDS-PAGE 電泳，並以考馬斯藍染色後進行分析。 B) LYRRLE-sfGFP-2xhM2e 首先置換到 1/2xGF 緩衝液中，並在 4 oC 或 37 oC 中保存 4 個月。 三組小鼠分別用三種溫度處理後 的LYRRLE-sfGFP-2xhM2e 免疫一次，每隻小鼠20 微克：新鮮製備的蛋白質 (1w)，4 oC 保存 4 個月 (4-4m) 或 37 oC 4 個月 (37-4m)。 在接種後第 14 天收集血清，然後分析抗 hM2e IgG 幾何平均效價 (GMT)。 結果顯示 4 oC 和 37 oC 存儲之間沒有區別。 這些結果支持了基於 LYRRLE-sfGFP 的自組裝蛋白質奈米粒子在高溫儲存中的穩定性和活性。 (N=5)
圖 5. 描繪了無疏水性區域自組裝蛋白質奈米粒子產生的長期免疫反應。 將純化的 AH3-sfGFP-2xhM2e 和 LYRRLE-sfGFP-2xhM2e 重組蛋白置換到 1/2xGF 緩衝液（10 mM NaPO4、150 mM NaCl、pH 7.4）中，然後以每隻 20微克 的劑量免疫小鼠。 對照小鼠用 1/2xGF 緩衝液 (PBS) 免疫。 在第 14、50、90 和 200 天通過面部靜脈穿刺收集血液，製備血清後以 100 倍稀釋測試血清的抗 hM2e IgG 效價。圖表顯示在 A) PBS、B) AH3-sfGFP-2xhM2e 或 C) LYRRLE-sfGFP -2xhM2e 組中全部5 隻小鼠的OD 450 讀數。 結果表明，用 LYRRLE 變異株 自組裝蛋白質奈米粒子 免疫的小鼠中，五分之四具有持久的抗體反應。而用原始AH3 的 自組裝蛋白質奈米粒子 免疫的五隻小鼠中只有五分之一具有持久的抗體反應。
圖 6. 描述了使用基於 LYRRLE-sfGFP 的 自組裝蛋白質奈米粒子 可生成高親和力抗體。重組蛋白 LYRRLE-sfGFP-2xhM2e 使用 Ni-NTA 樹脂表達和純化，並置換至 1/2xGF 緩衝液。使用肌肉注射以 20 微克 蛋白質對小鼠進行兩次免疫，間隔 14 天。在免疫後第 90 天收集血清 (#830)，通過蛋白質印跡 (WB) 偵測免疫重組蛋白。 A) 三種不同的蛋白質在 WB 中用作受質，1) His-sfGFP：帶有插入位點和 N 端 His 標籤，但沒有 AH3 肽，2) LYRRLE-sfGFP-2xhM2e，3) LYRRLE-sfGFP-2xM2e，具有和樣品2不同的 M2e 序列。對照抗體是從 Sigma (Sigma, cat# 70796-m) 購買的抗 His mAb。 VP-10 是從用 AH3-sfGFP-2xM2e 蛋白免疫的小鼠收集的血清。 B) 測試抗體 #830 對不同量的免疫抗原 (LYRRLE-sfGFP-2xhM2e) 的親和力：10 ng、5 ng、2 ng、1 ng 和 0.2 ng。對照抗體是來自 Sigma 的抗 His mAb。結果表明，LYRRLE-sfGFP-2xhM2e免疫激活了具有高親和力和高特異性的抗體。
圖 7. 描繪了使用基於 LYRRLE-sfGFP 的自組裝蛋白質奈米粒子生成抗CMTR2 肽抗體。選擇來自小鼠 CMTR2 ORF 的肽序列進行基因合成，並通過基因重組插入 LYRRLE-sfGFP 以生成 LYRRLE-sfGFP-CMTR2。表現並純化重組蛋白後，在沒有添加佐劑的情況下用於小鼠免疫。在經過 4 次免疫接種後，從小鼠身上收集血清並以 1:1000 稀釋用於蛋白質印跡分析，以檢測 1ng 的重組蛋白。 A) 顯示作為受質的7種重組蛋白質的 SDS-PAGE染色結果。除了His-sfGFP, 其他6種重組蛋白都使用相同的 LYRRLE-sfGFP 平台。His-sfGFP（lane 1）、LYRRLE-sfGFP-2xhM2e（lane 2） LYRRLE-sfGFP-CMTR2（lane 3）、LYRRLE-sfGFP-CMTR2-6（lane 4）、LYRRLE-sfGFP-CMTR2-B（lane 5） , LYRRLE-sfGFP-Notch3-1 (lane 6), LYRRLE-sfGFP-Notch3-3 (lane7)。 B) 混合 A 組中列出的重組蛋白並調整至各 1 ng，經過SDS-PAGE後，用於蛋白質印跡分析。使用接種LYRRLE-sfGFP-CMTR2 重組蛋白4次後的小鼠血清稀釋1000倍後進行檢測， H代表來自Sigma的抗His mAb。數據顯示來自所有五隻小鼠 (66-70) 的血清，都能夠有效的在7種重組蛋白中偵測到含有CMTR2 肽的重組蛋白。
圖 8. 描述了以親和樹脂移除抗 His 和 抗sfGFP 抗體。 從用 LYRRLE-sfGFP-2xhM2e 免疫兩次的小鼠身上收集的血清樣品用於抗體移除效率測試。 10 微升血清首先以 ELISA 阻斷緩衝液（10 mM NaPO4、150 mM NaCl、0.05% Tween 20、1% BSA pH 7.4）稀釋 20 倍，然後通過 50 微升或 100 微升親和樹脂。親和樹脂上含有 2 mg/ml 的His-sfGFP 重組蛋白。 然後通過ELISA分析，以檢測A)抗His-sfGFP IgG和B)抗hM2e IgG。 結果顯示50 微升His-sfGFP親和樹脂能夠去除高達90％的抗sfGFP IgG，而100 微升His-sfGFP親和樹脂可去除高達98％的抗sfGFP IgG。 但His-sfGFP親和樹脂對抗hM2e IgG效價影響不大。
雖然本發明可以有各種修改和替代形式，但其特定實施例在附圖中以示例的方式示出並且將在本文中詳細描述。 附圖可能不是按比例繪製的。 應當理解的是，附圖及其詳細描述並非旨在將本發明限制於所公開的特定形式，而是相反，其目的在於涵蓋落入精神和範圍內的所有修改、等同物和替代方案。 如所附權利要求書所定義的本發明。
 
[序列表]
                                   SEQUENCE LISTING
          <![CDATA[<110>  Kan, Ming-Chung]]>
          <![CDATA[<120>  A self-assembled protein nanoparticle and its applications ]]>
                 thereof
          <![CDATA[<130>  A]]>
          <![CDATA[<140>  US 63/077769]]>
          <![CDATA[<141>  2020-09-14]]>
          <![CDATA[<160>  12    ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
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          <![CDATA[<211>  279]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
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          <![CDATA[<223>  Artificial sequence]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Leu Tyr Arg Arg Leu Glu Tyr Gly 
          1               5                   10                  15      
          Leu Lys Arg Gly Gly Thr Thr Ser Asp Val Met Ser Lys Gly Glu Glu 
                      20                  25                  30          
          Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val 
                  35                  40                  45              
          Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr 
              50                  55                  60                  
          Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys 
                          85                  90                  95      
          Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser 
                      100                 105                 110         
          Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp 
                  115                 120                 125             
          Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr 
              130                 135                 140                 
          Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Phe Asn Ser His Asn Val 
                          165                 170                 175     
          Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys 
                      180                 185                 190         
          Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser His His His His His His His 
                  195                 200                 205             
          His Lys Leu Ser Glu Leu Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln 
              210                 215                 220                 
          Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg 
                          245                 250                 255     
          Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His 
                      260                 265                 270         
          Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 
                  275                 
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  328]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Recombinant protein with hM2e peptide]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Met Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Leu Tyr Arg Arg Leu Glu Tyr Gly 
          1               5                   10                  15      
          Leu Lys Arg Gly Gly Thr Thr Ser Asp Val Met Ser Lys Gly Glu Glu 
                      20                  25                  30          
          Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val 
                  35                  40                  45              
          Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr 
              50                  55                  60                  
          Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys 
                          85                  90                  95      
          Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser 
                      100                 105                 110         
          Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp 
                  115                 120                 125             
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              130                 135                 140                 
          Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly 
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          Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys 
                      180                 185                 190         
          Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser His His His His His His His 
                  195                 200                 205             
          His Lys Leu Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu 
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          Trp Gly Ser Arg Ser Asn Gly Ser Ser Asp Ser Ser Gly Gly Ser Leu 
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          Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser 
                          245                 250                 255     
          Asn Gly Ser Ser Asp Glu Leu Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr 
                      260                 265                 270         
          Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn 
                  275                 280                 285             
          His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Val Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys 
              290                 295                 300                 
          Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr 
          305                 310                 315                 320 
          His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 
                          325             
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Influenza A virus]]>
          <![CDATA[<300>]]>
          <![CDATA[<308>  Biorxiv/doi: https://doi.org/10.1101/2020.09.16.299149]]>
          <![CDATA[<309>  2020-09-18]]>
          <![CDATA[<313>  (1)..(19)]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Leu Lys Tyr Gly Leu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Arg Gly 
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  I8L mutant of AH3]]>
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          Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Leu Tyr Arg Arg Leu Lys Tyr Gly Leu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Arg Gly 
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Leu Tyr Arg Leu Leu Lys Tyr Gly Leu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Arg Gly 
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  I8L/R11L/K13E mutant of AH3]]>
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          <![CDATA[<400>  6]]>
          Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Leu Tyr Arg Leu Leu Lys Tyr Gly Leu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Arg Gly 
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  I8L/K13E mutant of AH3]]>
          <![CDATA[<300>]]>
          <![CDATA[<308>  Biorxiv/doi: https://doi.org/10.1101/2020.09.16.299149]]>
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          <![CDATA[<400>  7]]>
          Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Leu Tyr Arg Arg Leu Glu Tyr Gly Leu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Arg Gly 
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  K13E mutant of AH3]]>
          <![CDATA[<300>]]>
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          <![CDATA[<313>  (1)..(19)]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Leu Glu Tyr Gly Leu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Arg Gly 
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  K13D mutant of AH3]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Ile Tyr Arg Arg Leu Asp Tyr Gly Leu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Arg Gly 
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  207]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CMTR2 gene]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          aagcttggcg gcagcagcac cgcggatggc agctttgata gccagggcaa cccgggcgaa       60
          caggaagcgc tggtgagcag cctgcatggc ggcagcagca agcgcaagag cagcggcggc      120
          accgcggatg gcagctttga tagccagggc aacccgggcg aacaggaagc gctggtgagc      180
          agcctgcatg gcggcagcag cgagctc                                          207
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  I8L/K13D mutant of AH3]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Asp Arg Leu Phe Phe Lys Cys Leu Tyr Arg Arg Leu Asp Tyr Gly Leu 
          1               5                   10                  15      
          Lys Arg Gly 
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  Artificial Sequence]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Minimal peptide]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Leu Phe Phe Lys Cys Leu Tyr Arg Arg Leu Glu Tyr Gly Leu 
          1               5                   10
LYRRLE:DRLFFKCLYRRLEYGLKRG肽序列
sfGFP-N:超摺疊綠色螢光蛋白之N端序列
sfGFP-C:超摺疊綠色螢光蛋白之C端序列
8His:HHHHHHHH序列
Target peptide:目標肽

Claims (15)

  1. 一種自組裝重組蛋白，包含一個聚合模組和一個目標肽呈現模組；聚合模組通過基因重組與目標肽呈現模組融合；在宿主中進行蛋白表現時可以自行聚合成無疏水性區域的自組裝蛋白質奈米粒子。
  2. 如請求項1所述的聚合模組，其包含來自A型流感病毒的M2蛋白的氨基酸位置44至氨基酸位置62之間的蛋白序列。
  3. 如請求項1所述的聚合模組，其包含具有DRLFFKCLYRRLXYGLKRG序列的肽，其中X是包含麩胺酸(E)和天冬胺酸(D)的群組。
  4. 如請求項1所述的聚合模組，其包含具有DRLFFKCIYRRLXYGLKRG序列的肽，其中X是包含麩胺酸(E)和天冬胺酸(D)的群組。
  5. 如請求項1所述的目標肽呈現模組，其含有在beta摺板8和9之間具備目標肽插入位點的螢光蛋白。
  6. 如請求項5所述的螢光蛋白，其特徵包含(a)蛋白結構為由11個beta摺板和1個alpha螺旋所組成的beta桶結構，(b)其特性為在被光子激發時 可發出螢光。
  7. 如請求項5所述的螢光蛋白，包含超摺疊綠色螢光蛋白, 熱綠蛋白及超摺疊mCherry。
  8. 如請求項5所述的目標肽插入位點，包含8xHis標記和目標肽。
  9. 如請求項8所述的目標肽，包括抗原肽。
  10. 如請求項1所述的自組裝蛋白質奈米粒子，可作為疫苗使用。
  11. 一種製備高親和力抗體的方法，包括以下步驟； (a) 設計並合成編碼目標肽的基因； (b)通過基因重組將目標肽基因插入請求項1所述的自組裝重組蛋白的目標肽插入位點，製成重組蛋白表現質體； (c) 將重組蛋白表現質體轉型到蛋白表現宿主，表現和純化含有目標肽的自組裝蛋白質奈米粒子； (d) 使用這不含佐劑的自組裝蛋白質奈米粒子對動物進行免疫； (e) 通過採血收集抗體或製備針對目標肽的單株抗體。
  12. 如請求項11所述的蛋白表現宿主，包含細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、植物、哺乳動物細胞。
  13. 如請求項11所述的蛋白表現宿主，包含無細胞蛋白質表達系統。
  14. 一種自組裝肽，其蛋白質序列為DRLFFKCLYRRLXYGLKRG，其中X為包含麩胺酸(E)和天冬胺酸(D)的群組。
  15. 一種自組裝肽，其蛋白質序列為DRLFFKCIYRRLXYGLKRG，其中X為包含麩胺酸(E)和天冬胺酸(D)的群組。
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