JP5160545B2 - 特にワクチンに適用される外来分子の提示のための分割コア粒子およびそれらの産生方法 - Google Patents
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Description
(i) 従来の一続きのコアタンパク質においては、サイズ上および/または構造上の原因によってほとんどまたは全く提示できない外来分子を提示すること;
(ii) ヘテロダイマー性の外来タンパク質を提示すること;
(iii) 所望のパートナー分子との相互作用を実質的に促進するような、柔軟かつ十分に接触可能な状態で相互作用性の外来分子を提示すること;および
(iv) 従来の一続きのコアシステムには存在せず、本分割コアシステムには存在する、新たに表面に露出したN末端およびC末端を介して、さらなる外来分子を提示すること
が可能となる。
(i)外来タンパク質は、そのN末端とC末端が、コアタンパク質の結合点(N末端コア部分(つまりおよそ1位〜およそ78位までのコアアミノ酸(コアN))のC末端;C末端コア部分(つまりおよそ80位〜149位または183位までのコアアミノ酸(コアC))のN末端)の空間配置に適合するような3次元構造でなければならない。
(ii)外来タンパク質自体がホモメリックな相互作用をしてダイマー、トリマー等を形成する場合、このホモオリゴマーの構造も、同様に2つのコアタンパク質部分の構造と適合しなければならない。
(i)c/e1エピトープは粒子表面に存在するため、新たなN末端およびC末端が、この粒子表面で形成される。これによりさらなる誘導(派生)が可能になる。例えば、コアN断片に外来分子Xを融合し、コアC断片に外来分子Yを融合できる。これは、ヘテロダイマー性の外来分子の提示に適用可能である。しかし、ここで、融合によって付加されたこの2つの部分によって立体障害が起こらないよう考慮する必要がある。
(ii)粒子表面のN末端とC末端のいずれに結合するかによって、挿入された外来配列の特定のサブ領域(例えば、特に重要なエピトープ)が、粒子表面に近い位置、および粒子表面から離れた位置のいずれかに配向される。一例としては、ボレリア・ブルグドルフェリのOspAの「LA2エピトープ」が挙げられ、これはC末端領域に位置することが分かっている。このエピトープを認識する抗体は、中和作用を有する。
TEVプロテアーゼ認識配列が挿入された野生型コアタンパク質
野生型コアタンパク質(1−149)(アミノ酸P79およびA80がGGGGT−ENLYFQGT−GGGGで置換されたコアタンパク質。残基Gは、プロテアーゼが認識配列に接触しやすいように付加されたリンカーである)のc/e1エピトープにタバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ認識配列を導入した。組換え発現されたタンパク質は粒子を形成した。このタンパク質をTEVプロテアーゼとともにインキュベートし、SDS PAGEで切断反応が成功したかどうかを確認した。次いで、プロテアーゼ分解物をショ糖密度勾配遠心法により沈殿させた。ほぼ同じサイズの断片が2つ生成されたことから、予想された位置でほぼ完全に切断が起こったことが示された。このタンパク質は、切断されているにもかかわらず、切断されていない野生型コアタンパク質(1−149)とほぼ同じ濃度勾配位置で沈殿した。全長コアタンパク質(1−183)に基づいた融合タンパク質でも、同様の結果が得られた。
比較的大きな外来配列が挿入されたコアタンパク質変異体
やや大きな断片が挿入された融合タンパク質の例としては、人工ペプチド配列「ACID」のための配列(65個のアミノ酸からなる、グリシンに富んだリンカーに挟まれた配列)を、c/e1エピトープに挿入した例が挙げられる。この「ACID」は、その相補的なペプチドである「BASE」と相互作用することが可能である。(O’Shea et al., Curr. Biol. (1993), 656−667)。そこで、コアタンパク質の下流に、TEVプロテアーゼ認識配列GGGGSGGGVEDGGGGSGGGGT−AQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQTG−ENLYFQGTGGGGを挿入した。
別の実施例として、ボレリア・ブルグドルフェリOspAタンパク質の18位〜273位のアミノ酸配列を含有するコアタンパク質を用いた上記と同様の実験を示す。これに対応するTEV切断部位のないコアタンパク質については、Nassalらによる2005年の論文に記載がある。このタンパク質では、規則的な粒子を形成したのはごく一部にすぎなかった。この結果は、ショ糖密度勾配遠心法で広い分布が見られたことからも明らかだった。このような切断されないワクチンは、限られた程度でしか用いることができない。さらに、調製物の少なくとも一部をCLPとして得るためには、非常に長いリンカー配列を付加することが必要であり、その上、このリンカー配列は内因性の望ましくない抗原性を有する可能性があるため、このような切断されないワクチンを医学的にヒトに適用するのは困難であった。
(i) TEVプロテアーゼ(または他のプロテアーゼ)によるさらなる切断工程が不要となり、手法が簡略化されること。
(ii) 特定のプロテアーゼ認識配列ペプチドを融合タンパク質に付加する必要がなくなること。
(iii) OspAのような立体構造上好ましくない外来タンパク質が挿入された融合タンパク質を部分的にでも粒子形成させるには、非常に長いリンカー配列が必要であったが、外来タンパク質がコアキャリアタンパク質と両末端で結合する必要がなくなることにより立体障害が回避され、長いリンカーが不要になること。
コアN断片とコアC断片をほぼ等モル発現するための発現コンストラクト
当然のことながら、一続きのペプチド鎖は、後の切断により生じる2つの切断産物を等モル量含んでいる。したがって、2つの部分を別々に発現させる場合も同様に、2つの部分をほぼ等モル量生成することによって効率的に結合させるのがよい。第1の実験において、キャリアタンパク質の2つの部分を発現させるために、互換性のある2つの別個のプラスミドを使用したが、並みの成功確率しか得られなかった。
プロモーター、例えばT7RNAポリメラーゼのプロモーターによって、バイシストロン性mRNAの転写が起こる(効率的に転写を終了させるために、3’末端にターミネーター配列を挿入してもよい)。第1のシストロンは、HBVコアタンパク質の1位〜79位のアミノ酸配列をコードする。上流のリボソーム結合部位(RBS1)によって、翻訳が開始される(大小それぞれのリボソームサブユニットを卵形で表示)。終止コドンは、P79を表すコドンの3’末端の下流に位置する。コアC断片の翻訳を開始するための、もう一つのRBS(RBS2)が、第2のシストロンの5’末端に位置する。この断片自体も開始コドン(ATG)を有する。この例に示すように、コアC配列はAla80から始まり、140位、好ましくは149位、または本来の末端に相当する183位のアミノ酸まで伸長されていてもよい。140位より下流、好ましくは149位より下流のアミノ酸配列を、外来配列で置換してもよい。
このコンストラクトは、第1のシストロンの上流にRBSを1つだけ含有している。例に示すように、コアNの終止コドン(TGA)と重複するコアCの人工的な開始コドン(ATG)により、翻訳が再開され、コアC断片が翻訳される。この例では、コアC配列はSer81から始まる。
(i) コアN断片の終点が、およそ72位〜74位のアミノ酸、特にGly73に位置する場合、および
(ii) コアC断片の開始点が、およそ78位〜86位(場合により94位グリシンまで可能)のアミノ酸に位置する場合では、ここで選択した条件(コアNの終点がP79、コアCの開始点がS81、上流に開始コドンATGが位置する)を用いた場合と実質的に同じ結果を得ることができる。
(ii)2つの独立した発現カセットを含むプラスミドのトランスフェクション、および
(iii)機能的にバイシストロン性のmRNAを有するプラスミドのトランスフェクション(例えば、第2の遺伝子は上流の内部リボソーム導入部位(IRES)によって発現される)
によって、真核生物においてコアNおよびコアCをほぼ同等に発現させることができる。
また、
(iv) タイプ2ベクター様の終止/開始配列構造も、真核生物において機能し得る。
別々に発現した野生型コアN断片およびコアC断片による完全なCLPの産生
タイプ1(図3)の発現ベクターを用いて、野生型コアタンパク質の2つの部分を大腸菌BL21細胞で発現させた。野生型コアタンパク質としては、1位〜149位のアミノ酸配列に基づくコアタンパク質、または1位〜183位のアミノ酸配列に基づくコアタンパク質を用いた。予想された2つの断片が産生され、会合して完全なCLPが得られた。このことは、ショ糖密度勾配遠心法および非変性アガロースゲル電気泳動法を用いて確認された。C末端にHis6タグが付加された1位〜183位の一続きのアミノ酸鎖で構成される粒子と、これに対応する分割コアシステムで構成される粒子とを電子顕微鏡を用いて比較(ネガティブ染色)して、CLPの形成を直接確認した。この解決手段では、両者に差は見られなかった。
野生型コアC断片と、外来タンパク質が融合したコアN断片とを別々に発現させ完全なCLPを産生する、あるいは野生型コアN断片と、外来タンパク質が融合したコアC断片とを別々に発現させ完全なCLPを産生する。
分割コアシステムが、CLPの形成および外来タンパク質の提示に原則として好適であることを実証するために、モデル外来タンパク質としてコアNまたはコアCに融合したGFPを用いた。コアNコンストラクトに、タイプ1(第2のRBSを有する)ベクターまたはタイプ2(終止/開始)ベクターを用いた。生成物をショ糖密度勾配遠心法で沈殿させたところ、すべてのコンストラクトで粒子が形成され、緑色蛍光タンパク質が発現された。
(i) 分割コアシステムにおいて、約240個のアミノ酸からなる外来タンパク質(本実施例においてはGFP)は、CLPの形成を妨げずにコアNにもコアCにも融合できる。
(ii) タイプ1およびタイプ2の分割コアベクターはいずれも、融合によって外来配列が付加されたコアNおよびコアCの共発現に適している。
分割コアシステムを用いた、CLPによる医学的に重要な外来タンパク質の提示(これは、従来の方法では不可能、または非常に限定的であった)
ボレリア・ブルグドルフェリのOspA
冒頭で説明したように、挿入された外来タンパク質が両末端を介してキャリアタンパク質と結合することは従来のシステムでは必要であるが、このことによって、大幅に位相幾何学的な制限が課せられる。GFPとは異なり、OspAは、自然な状態ではキャリアタンパク質の構造に「適合」しない。したがって、分割コアシステムにおいて、OspAを不都合な構造を有する外来タンパク質の好例として用い、コアNまたはコアCと融合させた。濃度勾配において広い分布を示した前述の一続きのコンストラクト(Nassalら、2005年の論文に記載)とは対照的に、いずれの融合タンパク質も、粒子特有の画分に明確に蓄積した。電子顕微鏡検査法で分析したところ、従来の一続きのコンストラクトと比較して、コアNとOspAの融合、およびコアCとOspAの融合のいずれの場合も、CLPの形成効率が大幅に改善されることが示された。
(i) 従来の一続きのコアシステムではCLPの形成の妨げになる構造を持つ外来タンパク質でも、分割コアシステムによって、CLPとして提示することができる。
(ii) 分割コアシステムは、外来タンパク質をコアNおよびコアCのいずれに融合しても、CLPを効率的に形成できる。
マラリア病原体である熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質
ワクチンへの応用を考慮すると、別の非常に重要な病原性タンパク質として、マラリア病原体である熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質(CSP)が挙げられる。CSP(本明細書で用いられるCSPは、全長319個のアミノ酸からなる)は、約110個のアミノ酸からなる、テトラペプチドNANPモチーフとNVDPモチーフの繰り返し構造を含有している。CSPの構造はまだ知られていない。配列相同性から、トロンボスポンジン−1の繰り返し構造と同様に、4つのシステイン残基を含む約50個のアミノ酸からなるC末端ドメインは折りたたまれている可能性が高い。この繰り返し構造は免疫原性を有するが、他のCSPの領域も、恐らく重要なエピトープを含有している。従来の一続きのコアシステムでは、CLPの状態で全長CSPを調製することは不可能であったが、分割コアシステムでは、非常に容易に達成できた。現在のところ、明確なデータが得られているのは、コアNとCSPを融合した場合である。コアCが、149位までのアミノ酸からなるコンストラクト、および183位までのアミノ酸からなるコンストラクトのいずれであっても、コアCと共発現させることによって、効率的に粒子構造が形成される。
外来タンパク質用キャリアとしての分割コアCLPは、外来タンパク質に対するB細胞応答性を増強する。
マウスを用いた免疫原性実験で、分割コアシステムによる5つのコア−OspAコンストラクトを、コアと融合していない、脂質付加されたOspA(LipOspA)と比較した。市販のLymerix(ライム病ワクチン)は、脂質付加されたOspAに基づいており、したがって、これがライム病ワクチンの現在の「ゴールドスタンダード」である。LipOspA(トリス−パルミトイル−システイン−(Pam3−Cys))は比較的高い免疫原性を示すが、そのために脂質部分は不可欠である。脂質付加されていないOspAは、非常に弱い免疫原性しか示さない(Nassalら、2005年参照)。コア−OspAコンストラクトのうち3つは、全長OspA(アミノ酸18位〜273位)を含有している。また、残りの2つは、切断型OspA(アミノ酸185位〜273位)を含有している。
グループ1:LipOspA
グループ2:コアNに融合した全長OspA(アミノ酸18位〜273位)とコアアミノ酸81位〜183位のコアC
グループ3:コアNに融合した全長OspA(アミノ酸18位〜273位)とコアアミノ酸81位〜149位のコアC
グループ4:コアNに融合した切断型OspA(アミノ酸185位〜273位)とコアアミノ酸81位〜183位のコアC
グループ5:コアNに融合した切断型OspA(アミノ酸185位〜273位)とコアアミノ酸81位〜149位のコアC
グループ6:コア183のコアCに融合した全長OspA(アミノ酸18位〜273位)とアミノ酸1位〜79位のコアN
コアNまたはコアCと融合することによって、外来タンパク質に対する領域特異的な抗体を特異的に誘導する。
GFPとは異なり、N末端とC末端が互いに近接していないタンパク質は、コアNに融合する場合と、コアCに融合する場合とでは粒子表面における配向性が異なる(コアN:外来タンパク質のC末端が外向きになる;コアC:外来タンパク質のN末端が外向きになる)。このようなタンパク質をB細胞ワクチンとして用いた場合、それぞれ溶媒中で最も遠くに突き出たタンパク部分が、最も強力な抗体産生応答を誘発すると予想される。したがって、外来タンパク質をコアN(外来タンパク質のC末端側が外向き)またはコアC(外来タンパク質のN末端側が外向き)と融合させることによって、異なる領域特異的抗体を誘導できる。
ワクチン応用以外の意義を有する融合
このようなキャリアプラットフォームは、ペプチドおよび本明細書においては特にタンパク質や抗原ワクチンのために用いる、免疫増強作用を有する粒子状キャリアとして、直接的な意義があるものだが、それ以外にも様々な応用が考えられる。いずれの場合も、提示される多数の分子(180または240)は、互いに対称的に近接して配置される。前記分子が相互作用可能な外来分子(ワクチンは抗体と相互作用する特例である)である場合、この外来分子の複数のコピーを有する粒子は、モノマーの外来分子と比較して、大幅に親和性が増大する(免疫診断学の分野における、天然IgMペンタマーやMHCテトラマーを参照)。このような相互作用可能な外来分子は、相互作用パートナーと反応できるようにCLP表面上で接触可能な状態でなければならない。従来の一続きのシステムと比較して、分割コアシステムでは、これが実質的に促進される。
His6タグは、Gly2リンカーを介してコアNに融合し、Ni2+NTAアガロースと結合する粒子を形成する。一続きのシステムの場合とは異なって、Hisタグには自由に接触できる。一続きのコアシステムのc/e1へ類似の配列(His7)を挿入しても、立体構造上、His6タグ残基への接触が可能でないため、タンパク質はほとんど産生されない。
ビオチンアクセプター(BA23)は、13個のアミノ酸(GLNDIFEAQKIEWH)からなる人工ペプチドで、大腸菌ビオチンリガーゼであるBirAによりビオチン化される。効率的なビオチン化を行うには、ビオチンアクセプターに対して自由に接触できることが必要である。分割コアシステムでは自由に接触することができるが、一続きのコアシステムでは接触できない、または限られた程度でしか接触できない。分割コア−BA融合タンパク質は、CLPを形成し、大腸菌体内でビオチン化される。このCLPに提示されたビオチンに、アビジン/ストレプトアビジンまたはそれらの複合体が結合できる。
黄色ブドウ球菌プロテインAは、免疫グロブリンと高い親和性で結合する(免疫沈降で「プロテインAセファロース」として利用されている)。プロテインAは、構造上類似した5つのIg結合ドメインで構成される。Z33は、このようなドメインの一つで、そのアミノ酸配列(全長33個のアミノ酸)は修飾されているが、Igへの高い親和性を維持している(Kd 40nm)。種々のIgと結合するには、構造的な柔軟性も必要だが、さらに接触可能でなければならない。長いリンカー配列を介して、Z33配列をコアNに融合した。
GGGGSGGGVEDGGGGSGGGGT−FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNAKIKSIREDP
一続きのコアシステムに挿入されたACIDペプチドは、相補的BASEペプチド(「ベルクロペプチド」)とコイルドコイル構造を形成して、相補的BASEペプチドと相互作用し(O’Sheaら、1993年)、元のコア構造は大幅に変化し崩壊する。これは、ACIDペプチド自体が、コア構造にいかなる応力もかけないように柔軟な構造をとることが原因である。BASEペプチドを添加すると、ACID配列と相互作用し、その結果、2つのペプチド配列がらせん状の強固なコイルドコイル構造をとる。ACID配列が両末端を介して結合しているため、張力が発生する。片側のみ固定されたACIDペプチドは、BASEペプチド、または別のパートナーに融合したBASEペプチドを添加すると、張力を生じることなくこれらのペプチドと相互作用できるだろう。従来の一続きのコアシステムでも、TEVプロテアーゼでコアキャリアとのC末端連結部分を切断すると、ACID融合タンパク質の粒子構造は、完全な状態で維持される。
先の実施例はいずれも、1つの外来配列をコアNまたはコアCに融合したものである。理論的には、2つの異なる外来分子をそれぞれコアNとコアCに同時に融合させることも可能である。この例としては、2つのサブユニットからなるヘテロダイマー性の外来タンパク質が考えられる。モデルタンパク質として、2つの部分に分けられたGFPを使用した。第1のセグメントは、11本のGFPβ鎖のうち最初の10本を含みコアNと融合しており、第2のセグメントは11番目のGFPβ鎖を含みコアCと融合している。タイプ1ベクターを用いて共発現させることによって、緑色蛍光性のCLPが形成された。このようにして、コアNおよびコアCドメインが会合し、会合可能なCLP構造が得られた。GFPの2つの部分は互いに補いあって正しい3次元構造をとり、GFP発色団を形成した。
表面にプロテインGのGB1ドメインを提示する分割コアCLP
別の具体例は、連鎖球菌属の免疫グロブリン結合タンパク質「プロテインG」に存在する「GB1」ドメインのHBV分割コアシステムへの導入である。プロテインGは、プロテインAと機能的に関連している。プロテインGも、複数の類似したドメインから構成される。プロテインAと同様に、プロテインGは免疫グロブリンと結合するが、IgGの種起源およびサブタイプに関してプロテインAとは異なる特異性を有する。プロテインGとプロテインAは、このように相補的な機能を持つため、それぞれ異なる種類の免疫グロブリンと結合することを利用して免疫学的な検出試薬として市販されている。プロテインAと同様に、プロテインG、およびプロテインG由来のGB1ドメインもまた、抗体の定常(Fc)領域に結合する。一方、抗体の可変領域である抗原認識領域は、抗原と結合できるように接触しやすい状態を保っている。このようにして、多くの異なる抗体を結合させることが可能である。
coreD78−GGGGSGGGGTQ−YKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEdP
相互作用可能な外来分子を提示し、自己蛍光性のGFPおよびGFP変異体を含有している分割コアCLP
実施例11e)では、ワクチン応用以外の意義を有する融合を例示するために、GFP分子を用いた。このGFP分子は2つの部分(GFPβ1−10およびGFPβ11)に分かれ、GFPβ1−10がコアNに、GFPβ11がコアCに融合した状態で互いに結合して天然のGFP構造(緑色蛍光性)をとり、CLPを形成した。
GFPβ1−10はコアNと融合し、GFPβ11はコアCと融合している。GFPβ11により、新たにN末端が生じるので、このN末端に別のドメイン(本図ではGB1)を融合することができる。
B. 上述の通り、コアNがコアCと相互作用し(CLPの形成)、GFPβ1−10がGFPβ11と相互作用する(GFP発色団の形成)ことによって、自己蛍光性のCLPが生じる。しかも、このCLPは、GB1を接触可能な状態でCLP表面に提示している。
C. 様々な抗体が、Fc領域を介してGB1ドメインと結合することができる。
D. 抗体はそれぞれ異なる可変領域を介して、特異的抗原と相互作用することができる。
このように、分割コアGFP−GB1 CLPは、間接蛍光抗体法で通常用いられる蛍光標識二次抗体の代わりになり得る。図7は、チューブリンの蛍光標識への応用を、2つの異なる細胞を用いて示したものである。抗体が抗原と結合することを利用して、他へ応用することも同様に可能である。
上記の結果は、2つの部分からなるGFPが付加された分割コアCLP上に、さらに付加した外来ドメイン(GB1)を機能的な状態(つまり、特定のリガンドであるIgGと相互作用することができる状態)で提示できることを示す。しかし、60個未満のアミノ酸からなるGB1は、比較的小さなドメインである。この手法を一般化できることを確認するために、GB1をヒトHBV(HBV)、アヒルHBV(DHBV)またはアオサギHBV(HHBV)に存在するエンベロープタンパク質のpreSドメインで置換した同様のコンストラクトをそれぞれ調製した。このドメインは、それぞれのウイルスが天然標的細胞(つまり対応する宿主動物の肝細胞)に特異的に結合するのを媒介する。HBVでは108個のアミノ酸、DHBVおよびHHBVでは約160個のアミノ酸からなるpreSドメインは、GB1より明らかに大きく、さらに、それらの配列は互いに異なり、またGB1とも異なる。GB1と同様に、3つのドメインをそれぞれ分割コア−GFP融合タンパク質に挿入した(図7参照;GB1を対応するpreSドメインで置き換える)。ショ糖密度勾配遠心法による沈殿、非変性アガロースゲル電気泳動の泳動挙動、および電子顕微鏡検査法で確認したところ、3つの分割コア−GFP融合タンパク質はすべて効率的にCLPを形成していた。各CLPは、特有のGFP蛍光を示した(つまり、GFP部分同士が結合して、GFPの正しい3次元構造をとっていた)。さらに、HBV−preS CLPおよびDHBV−preS CLPは、HBV preSおよびDHBV preSに対するモノクローナル抗体と反応した。アオサギHBV preSに対するモノクローナル抗体は現在入手できない。
OspAがコアNに融合した分割コアOspA CLPによって誘導されるOspAに対する防御抗体は、LipOspAで誘導される場合より高い抗体価を示し、OspAがコアCに融合した分割コアOspA CLPで誘導される場合の抗体価は低い。
図5に示すように、外来タンパク質をコアNとコアCのいずれに結合させるかによって、提示される外来タンパク質の配向性に狙い通りに影響を与えることができる。したがって、OspAの場合には、モノクローナル抗体LA−2が認識する公知のC末端中和エピトープ(コアNに融合する場合)、およびいかなる公知の中和エピトープも含まないN末端OspA領域(コアCに融合する場合)のいずれかが、特に良好に提示される。図4に示すように、いずれの分割コア−OspA CLP(グループ2はコアNに融合したOspA、グループ6はコアCに融合したOspA)も、OspAに対する総抗体価を示した。しかし、LA−2と同等の抗体の割合は、構造から予想された通り、コアNに融合した場合の方が実質的に高い。
マラリア病原体である熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲タンパク質(CSP)
分割コアシステムを用いた全長CSPは、従来の一続きのコアシステムを用いたCSPの免疫優性の繰り返し配列より、広範囲にわたって強力な免疫応答を誘導する。
3つのいずれの免疫抗原を用いた場合も、CSPに対して非常に強力な反応を示した。ただし、免疫抗原として全長CSPを用いた場合の反応は他よりさらに4倍高く(抗体価:繰り返し構造含有CSPと切断型CSPの1:3×105に対して、1:12×106)、これは、免疫血清を1200万倍希釈(!)しても、CSPタンパク質を認識できることを示す。
予想された通り、NANPペプチドに対する反応は、すべてのコンストラクトで類似している。繰り返し構造において頻度の低いNVDPペプチドに対する反応は、いずれの場合も同程度であるが、全長CSPのコンストラクトでは、初回免疫後(追加免疫なし)でも、明らかに他より高い(抗体価:他の1:5×103に対して1:2.5×104)。
短鎖CSPおよび全長CSPのみが、ペプチドCSP12(EEPSDKHIEQYLKKIQNSLS;分割コア全長コンストラクトの246位〜264位)およびCSP8(GNGIQVRIKPGSANKPKDELD;分割コア全長コンストラクトの274位〜294位)に対する応答を誘導する。一続きのコアシステムを用いた繰り返し構造のペプチドで免疫を行っても、該ペプチドにはCSP8およびCSP12の配列が存在しないため、対応する応答は見られないと考えられる。この結果は、とりわけ分割コアシステムを用いたときのみ全長CSPを産生できるという点で重要である。このように、分割コアシステムを用いることにより、ワクチン接種による防御作用に関わるエピトープを付加し取り扱うことができる。
分割コアシステムの短鎖CSPおよび全長CSPのいずれの場合も、コアキャリアに対する反応は、一続きのシステムの繰り返し構造ペプチドの場合に対して約1/25と非常に弱い(抗体価:一続きのシステムの1:3×106に対して、1:1.25×105)。また、外来タンパク質に対する所望の反応は、一続きのコアシステムの繰り返し構造ペプチドを用いた場合と比較して、少なくとも同程度(短鎖CSPを用いた場合)、あるいはより高い(全長CSPを用いた場合)。このため、挿入された外来配列に対する特異的免疫原性は、分割コアシステムにおいて切断型CSPを用いる方が、また特に全長CSPを用いる方が、実質的に高くなる。さらに、コアキャリアに対して強力な応答が生じると、抗HBsAg陽性者(感染者およびワクチン接種による抗HBsAg陽性者)の鑑別診断がより困難になる。したがって、コアキャリアに対する応答は低いことが望ましい。
特異的に免疫したマウスの脾細胞を、組換えHBcAgもしくは公知のT細胞ペプチド(HBc120−140)で、または組換えCSPもしくはCSPペプチドであるNANPおよびCSP8で刺激し、IL−2産生量を測定することによって、T細胞応答が誘導されるかどうかを確認した。いずれのコンストラクトで免疫した場合も、HBcAg、HBc120−140、組換えCSPおよびNANPにより活性可能なT細胞が出現した。しかし、分割コアシステムの全長CSPで免疫したマウスの脾細胞のみが、CSP8ペプチドの刺激によってIL−2を産生することができた。
Claims (19)
- B型肝炎ウイルスのコアタンパク質のコアNドメインおよびコアCドメインを別々のポリペプチドとして含み、さらに免疫応答を誘発する少なくとも1つの外来ペプチドまたはタンパク質配列を含む分割コアキャリアシステムであって、
前記外来ペプチドまたはタンパク質配列は、コアNドメインのC末端、またはコアCドメインのN末端に融合し、
前記コアタンパク質は、カプシド様粒子を形成することが可能で、
前記外来ペプチドまたはタンパク質配列はコアタンパク質の73位と94位の間に位置するコアタンパク質アミノ酸に融合していることを特徴とする分割コアキャリアシステム。 - B型肝炎ウイルスが、哺乳類特異的であることを特徴とする請求項1に記載の分割コアキャリアシステム。
- コアタンパク質が、ヒトB型肝炎ウイルスの配列を有することを特徴とする請求項2に記載の分割コアキャリアシステム。
- コアタンパク質が、ヤマネズミB型肝炎ウイルス(WHV)のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項2に記載の分割コアキャリアシステム。
- 外来ペプチドまたはタンパク質配列が、病原性細菌のタンパク質のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の分割コアキャリアシステム。
- 外来ペプチドまたはタンパク質配列が、病原性真核生物のタンパク質のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の分割コアキャリアシステム。
- 病原性真核生物が、マラリア病原体である熱帯熱マラリア原虫であることを特徴とする請求項6に記載の分割コアキャリアシステム。
- 外来ペプチドまたはタンパク質配列が、ウイルスのタンパク質のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の分割コアキャリアシステム。
- 外来ペプチドまたはタンパク質配列が、病原性に基づく潜在的能力を有するタンパク質のアミノ酸配列であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の分割コアキャリアシステム。
- タンパク質が、腫瘍マーカータンパク質である請求項9に記載の分割コアキャリアシステム。
- 外来ペプチドまたはタンパク質配列が、
a) ビオチンアクセプターペプチド配列
b) ACIDペプチド配列
c) プロテインA由来のZ33ドメイン配列、および
d) プロテインGのGB1ドメイン配列
からなる群より選ばれることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の分割コアキャリアシステム。 - 免疫応答を誘発する外来ペプチドまたはタンパク質のためのキャリア作製方法であって、
前記キャリアは、第1にB型肝炎ウイルスのコア抗原のタンパク質配列を有し、第2に異種ペプチドまたはタンパク質配列を有し、
前記異種ペプチドまたはタンパク質配列は、B型肝炎コア領域の73位の下流、または94位の上流でコアNドメインまたはコアCドメインと融合し、
前記キャリアのポリペプチド鎖は、コアNドメインの下流、またはコアCドメインの上流で分断されており、
i)コアNドメインおよび異種ペプチドまたはタンパク質配列、またはコアCドメインおよび異種ペプチドまたはタンパク質配列を、それぞれ融合タンパク質として発現させるか、または、
ii)コアNと異種ペプチドまたはタンパク質配列との間に、またはコアCと異種ペプチドまたはタンパク質配列との間にプロテアーゼ認識配列を挿入して分割コアワクチンを発現させた後、使用前にプロテアーゼによって2つのポリペプチドに切断し、
その後続いてカプシド様粒子が形成されることを特徴とするキャリア作製方法。 - 融合によって、B型肝炎コア抗原の74位のアミノ酸の下流、または85位のアミノ酸の上流に異種ペプチドまたはタンパク質配列を付加することを特徴とする請求項12に記載の方法。
- 異種外来タンパク質配列が、少なくとも全長40個のアミノ酸からなることを特徴とする請求項12〜13のいずれかに記載の方法。
- 異種外来タンパク質配列が、少なくとも全長120個のアミノ酸からなることを特徴とする請求項12に記載の方法。
- バイシストロン性のベクターによって2つのポリペプチドを別々に発現し、第1のポリペプチドはコアNドメインを含み、第2のポリペプチドはコアCドメインを含み、異種ペプチドまたはタンパク質配列はコアNドメインのC末端またはコアCドメインのN末端に融合していることを特徴とする請求項12〜15のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれかに記載の分割コアキャリアシステムを有するカプシド様粒子を含む医薬。
- ワクチンであることを特徴とする請求項17に記載の医薬。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の分割コアキャリアシステムを有するカプシド様粒子を含む診断薬。
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