CN101541828A - 用于呈递外来分子、尤其用于疫苗的分拆式核心颗粒及其生产方法 - Google Patents

Abstract

公开了分拆式核心载体物质，作为分开的多肽，其具有乙肝病毒核心蛋白的核心N结构域和核心C结构域及至少一种要针对它诱导免疫应答的外来分子。依照本发明，所述外来分子，尤其是异源外来氨基酸序列，融合至所述核心N结构域的C末端或所述核心C结构域的N末端，而且所述核心蛋白能形成衣壳样颗粒。本发明还涉及相关生产方法。

Description

用于呈递外来分子、尤其用于疫苗的分拆式核心颗粒及其生产方法

本发明涉及基于乙肝病毒核心抗原的新载体，其可用于疫苗，但也可用于其它分子。在肝炎病毒核心抗原中掺入了外来氨基酸序列，所述外来氨基酸序列可以来自病原体。所述疫苗旨在能够生成针对这些蛋白质序列的抗体，优选保护性抗体或中和性抗体。本发明的颗粒(particle)还可以刺激细胞免疫应答(T细胞)。乙肝核心蛋白具有能够形成衣壳样颗粒的多拷贝的特性。这些衣壳样颗粒(capsid-like particle，CLP)特别适合于生产疫苗，因为它们刺激免疫系统，并由此增加抗体生成。“疫苗”在本申请中优选指可引发体液和细胞免疫应答的载体系统。

乙肝病毒衣壳是二十面体对称的纳米颗粒(直径约30nm)，由180或240个拷贝的病毒核心蛋白组成。核心蛋白称作HBcAg。它们可充当外来分子的微粒载体，而且优选作为免疫增强性抗原载体应用于疫苗。对核心蛋白的合适修饰使得外来分子能够呈递在所述颗粒表面上(内部也有，如果需要的话)。通过将外来分子连接至核心蛋白氨基酸序列中央(大约第73-94位氨基酸的区域)的氨基酸残基(其包括免疫显性B细胞表位“c/el”且在3D结构中在颗粒表面上具有最高暴露)，使表面暴露得到优化。

WO 01/77158描述了乙肝核心抗原融合蛋白，其中优选将异源表位插入在第61位与第90位之间。US 2003/0198649描述了乙肝病毒核心抗原颗粒，其中经配体结构将免疫原连接至乙肝病毒(HBV)核心蛋白。Kratz等[PNAS(1999)，1915-1920]描述了在HBV核心蛋白表面上呈递绿色荧光蛋白(GFP)。在这里，核心蛋白的第79和80位氨基酸用238个氨基酸的GFP序列替换。

Nassal等[Eur.J.Immunol.(2005)，pp.655-665]描述了完整布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)OspA蛋白与乙肝病毒衣壳蛋白的融合产物。在这里，第79和80位氨基酸同样用OspA的第18-273位氨基酸替换，但是在核心蛋白与OspA之间掺入了接头序列。Skamel等(Journal of Biological Chemistry，2006.pp.17474-17481)描述了借助乙肝病毒衣壳样颗粒呈递完整的布氏疏螺旋体OspC蛋白。然而，已经发现本领域现有技术中公开的技术方案的改良核心蛋白不再具有以期望方式形成衣壳样颗粒(CLP)的趋势，且因此不再令人满意地刺激免疫应答。

这意味着，将基于肽或蛋白质的外来分子通过遗传操作插入核心蛋白后，外来序列连接至核心蛋白的N和C两个末端。现在已经发现，这种双侧连接大大限制了合适的外来序列的类型和选择范围。

本文所述分拆式核心(split-core)系统消除了这些限制，其生成核心蛋白的两个分开的部分，这两部分令人惊讶地自发组合并以与蛋白质连续链相似的方式形成衣壳颗粒。外来分子可以融合至N端片段(“核心N”)或C端片段(“核心C”)，并因此仅经一个末端连接至载体蛋白。结果是，双侧连接在将外来序列插入核心蛋白连续肽链方面的结构限制基本上被消除。

因此，本发明的分拆式核心系统容许：

(i)呈递外来分子，由于其大小和/或结构，所述外来分子只是非常差的呈递在常规连续式核心蛋白背景中或根本不呈递；

(ii)呈递异二聚体外来蛋白质；

(iii)以柔性的、易于接近的方式呈递相互作用性外来分子，所述方式大大促进与目标配偶分子的相互作用；

(iv)经分拆式核心系统中存在的但常规连续式核心系统中不存在的另外的表面暴露的N和C末端呈递别的外来分子。

乙肝病毒(HBV)是包膜病毒。内部核衣壳也称作核心颗粒(“核心”)，在血清学上定义为乙肝核心抗原(HBcAg)。核心由180或240个拷贝的183-185个氨基酸(取决于HBV亚型)的核心蛋白组成。核心蛋白可以异源表达(在细菌、酵母、真核细胞中)，自发形成“衣壳样颗粒”(CLP)。后者没有传染性，因为它们不含病毒基因组，也不含外部包膜。也可以自关系更密切的哺乳类(例如旱獭、黄鼠等)HBV和关系更疏远的鸟类(例如鸭、苍鹭等)HBV获得此类CLP。依照本发明原则上有可能采用任何HBV序列，但是优选能够感染人类的HBV的序列。

HBV核心蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列已经公开[Galibert等，Nature(1979)，pp.646-650；Nassal，Gene(1988)，pp.279-294；或WO 01/77158]，可以参考这些出版物。优选采用ayw亚型的核心蛋白序列，但是也有可能同样使用变体，HBV序列的修饰形式，诸如其它哺乳类HBV或鸟类HBV的序列。这些序列存储在公众可利用的基因库中。

除了人类致病性乙肝病毒(狭义的HBV)之外，有许多相关的、动物特异性的乙肝病毒，例如北美旱獭(动物学名称为Marmota monax)HBV(旱獭乙肝病毒＝WHV)、加州黄鼠(动物学名称为Spermophilus beecheyi)HBV(黄鼠乙肝病毒＝GSHV)等。

这些病毒具有与人类HBV相似的遗传结构，但是在它们的核苷酸序列及由此它们蛋白质的氨基酸序列中具有截然不同的差异。

人类HBV核心作为疫苗载体的用途受到两项可能的限制：

1.患有慢性HBV感染的受试者部分地耐受HBV抗原(这种免疫应答缺乏是感染持续的原因之一)。核心还起T细胞依赖性抗原的作用。核心蛋白序列中的T细胞表位因此与基于HBV核心CLP的疫苗的强免疫原性有关。这可能对临床感染HBV的个体不会有影响，因为他们对HBV核心有T细胞耐受。然而，对WHV和其它动物HBV无此耐受(Billaud JN.等，Advantages to the useof rodent hepadnavirus core proteins as vaccine platforms.vaccine.2007 Feb 19；25(9)：1593-606)。使用动物HBV核心蛋白作为载体对于要接种疫苗的潜在受试者的这一特殊人群可能因此是有利的。

2.由于其格外强的免疫原性，核心在急性或慢性感染HBV的所有受试者中引发抗核心的强B细胞应答(抗HBcAg)；治愈的感染的额外特征在于针对HBV包膜蛋白的抗体(抗HBsAg)的出现。当前针对HBV感染的预防性疫苗都只基于HBV包膜蛋白(HBsAg)。成功的疫苗接种因此引起抗HBsAg出现，就像已经战胜的感染那样。受试者是经感染还是HBsAg疫苗接种而具有了获得性抗HBsAg在有些情况中是诊断上感兴趣的，而且可以通过检测只在感染后出现的抗HBcAg来确定。

在针对所插入的外来蛋白质的预期应答之外，基于人类HBV核心的疫苗还会引发某些抗核心(抗HBcAg)的应答。因同时存在抗HBsAg，这会使得HBV感染与HBsAg疫苗接种之间的区分更加困难。

分拆式核心系统使得抗HBcAg的生成最小化，因为主要表位，即c/el，已经在物理上分开且因此不再被大多数抗HBcAg抗体识别。然而，存在针对核心蛋白其它序列区域的残余抗HBcAg应答。可以通过使用非人类HBV核心蛋白，优选WHV核心蛋白作为载体基础来预防或进一步降低这种应答。

本发明分拆式核心载体系统的基本成分首先是乙肝病毒核心蛋白，其次是要引发针对性免疫应答的外来分子。

核心蛋白在其最广泛的实施方案中衍生自任何乙肝病毒。已知多种乙肝病毒。优选依照本发明采用那些衍生自已经自哺乳类分离且对这些哺乳类特异性的乙肝病毒的序列。特别优选采用人类HBV。但除此之外，也有可能提供核心蛋白序列的乙肝病毒源自其它动物，例如鸟类诸如鸭或苍鹭。

另一成分，即要引发针对性免疫应答的外来分子，原则上可以是任何分子。优选蛋白质序列，特别优选那些在病原体表面上找到的且与免疫系统接触的蛋白质序列。如果免疫系统能够生成针对此类病原体表面结构的抗体，那么病原体在接触接种疫苗的患者的免疫系统的各个成分后被灭活，而致病性侵略者通常被毁灭。

数据库中可得的旱獭乙肝病毒(WHV)序列与HBV(ayw亚型)核心蛋白氨基酸的比较发现了约60％的同一性。序列差异在第66与94位氨基酸之间的区域特别突出，此序列包括c/el表位及本发明HBV分拆式核心系统中核心蛋白N端区与C端区之间的拆分点。在一个特别优选的实施方案中，此拆分点在第79与81位氨基酸之间。

本发明的WHV分拆式核心载体系统如下制备，在核酸水平拆分WHV核心蛋白第79位(编码氨基酸Glu)与第80位(编码氨基酸谷氨酰胺)之间的序列。在核苷酸水平，将编码BamHI切割位点的序列添加至WHV N端核心蛋白区段(缩写为W核心N)的羧基末端。其下游继以第二核糖体结合位点和Ndel限制性内切核酸酶切割位点，后者与WHV核心C(W核心C)区段的起始密码子交叠。这种排列与相应HBV分拆式核心构建体中的优选排列相同。这使得插入序列能够借助BamHI-NdeI消化直接自一个系统转移至另一系统。在本文所述情况中，W核心N包含保守替代，即E79D，及作为C末端氨基酸的额外的P，这是引入BamHI切割位点所致。这对形成颗粒的能力没有不利影响，而且C末端脯氨酸由于其蛋白酶抗性而提高了该分拆蛋白质的稳定性。与HBV分拆核心一样，W核心C包含额外的起始甲硫氨酸，在这种情况中在Q80(HBV中的S81)上游。这种WHV分拆式核心构建体等同地形成颗粒，就像相应的HBV分拆式核心构建体一样。

在本发明的又一个实施方案中，核心蛋白的C端区和N端区可源自不同的乙肝病毒。在这种情况中，本发明的杂合分拆式核心载体系统基本上具有三种成分，来自乙肝病毒，例如人类乙肝病毒的核心蛋白N端区，要引发针对性免疫应答的外来分子，和源自另一乙肝病毒，例如WHV的核心蛋白C端区。这样的杂合分拆式核心构建体也能没有任何问题地形成颗粒。由于来自不同乙肝病毒的核心蛋白氨基酸序列是不同的，所以B和T细胞表位也是不同的。杂合分拆式核心系统因此可特异性地影响针对微粒载体的免疫应答。

本发明优选的杂合分拆式核心载体系统如下制备，在核酸水平拆分WHV核心蛋白在第79位(编码氨基酸Glu)与第80位(编码氨基酸谷氨酰胺)之间的序列。在核苷酸水平，将编码BamHI切割位点的序列添加至WHV的N端核心蛋白区段(缩写为W核心N)的羧基末端。其下游继以第二核糖体结合位点和Nde1限制性内切核酸酶切割位点，后者与WHV核心C(W核心C)区段的起始密码子交叠。这种排列与相应HBV分拆式核心构建体中的优选排列相同。这使得插入序列能够借助BamHI-NdeI消化直接自一个系统转移至另一系统。在本文所述情况中，W核心N包含保守替代，即E79D，及作为C末端氨基酸的额外的P，这是引入BamHI切割位点所致。这对形成颗粒的能力没有不利影响，而且C末端脯氨酸由于其蛋白酶抗性而提高了该分拆蛋白质的稳定性。与HBV分拆核心一样，W核心C包含额外的起始甲硫氨酸，在这种情况中在Q80(HBV中的S81)上游。这种构建体能够没有问题地形成颗粒。

天然HBcAg以及重组HBV CLP是高度免疫原性的(T细胞非依赖性抗原和T细胞依赖性抗原)。核心颗粒的对称的、多聚体微粒结构在这里是至关重要的。所述结构可以通过常规负染色电子显微术(conventional negative stainelectromicroscopy)和冷冻电子显微术(cryo electron microscopy)来描绘。可以通过生化方法来检测微粒性质，即通过在蔗糖梯度中沉降(沉降系数为60-80S，取决于变量(variant)；供比较用：可溶性单体蛋白质约为1-5S；真核核糖体亚基为40S+60S)。另外，颗粒在琼脂糖凝胶中进行非变性凝胶电泳具有截然不同的迁移行为，这与非颗粒形式不同。这使得有可能确定CLP是否能形成或者蛋白质是否可以在没有CLP结构的情况中存在。

HBV核心蛋白具有183或185个氨基酸(WHV蛋白质具有187个氨基酸)，由两个结构域组成：大约前140个氨基酸对于CLP装配是必要且足够的(装配结构域)；C端区富含碱性氨基酸且结合核酸。C末端截短的核心蛋白变体(第1-149位氨基酸)在原始大肠杆菌表达系统中的表达大大优于全长蛋白质。核心蛋白1-149的CLP，即不含核酸结合结构域，因此被用于中分辨和高分辨电镜(EM)结构研究。如此，有可能确定CLP和蛋白质的晶体结构。正如生化方法已经预测的，核心蛋白形成非常稳定的、对称的二聚体，它们装配产生包含90或120个二聚体的CLP。

核心颗粒具有显著的刺突；每个二聚体形成一个刺突，其结构由一束4个螺旋组成，每个单体在氨基酸序列中央贡献两个长a螺旋。刺突尖端包含第74-85位氨基酸的区域中的氨基酸(aa)。该区域还携带HBcAg的免疫显性B细胞表位(c/el表位)，而且它特别高的免疫原性可以用这些残基的表面暴露来解释。

图1示意性地描绘了核心蛋白结构。HBV核心蛋白的一级序列描绘在图1左手侧。完整蛋白质由183个氨基酸组成(在有些HBV亚型中是185个氨基酸)；只有N端大约140个氨基酸是CLP形成所需要的(装配结构域)；优选的C末端氨基酸位置是149；可以将His标签融合至此位置和融合至任何下游氨基酸，直至第183位氨基酸，不会扰乱CLP。c/el表位位于第78-83位氨基酸区域内，且形成中央α螺旋之间环的一部分(左下部)。螺旋自身可以被截短，可能核心N中直至Gly73位置的氨基酸残基和核心C中自氨基酸Gly94开始向前进的残基是最低限度必需的。图1右手侧描绘了核心蛋白二聚体的示意图。只显示了每个单体的两个中央螺旋。c/el表位位于颗粒表面上。

为了成功形成颗粒，核心氨基酸序列必需包括至少第140位，优选至少第149位，但是也可以进一步延伸直至C末端第183或185位氨基酸，这取决于HBV亚型。第140位尤其第149位下游的氨基酸序列可以用外来序列替换，所述外来序列因而通常位于CLP内部。基本上不生成针对此类外来氨基酸的抗体，然而它们可实施其它功能。

由于HBcAg格外高的免疫原性，重组HBV CLP用作外来抗原的免疫原性增强性载体是有吸引力的。

备选技术方案是将外来分子化学偶联至预先形成的CLP。本发明提供了外来氨基酸序列与核心蛋白的遗传融合物。这里基于依赖经验的试验并且甚至在解析出X射线结晶学结构之前就证明，c/el表位区域最适合于诱导有力的B细胞应答。现在基于所述X射线结晶学结构已清楚，此类融合物代表了位于多个中央螺旋之间的环中的插入。由于此环本身不具有任何结构性功能，所以核心蛋白的3D结构至少原则上可以在外来序列插入后得以保持。依所插入的外来序列的不同，那些融合蛋白中有些可继续形成规则的CLP，尽管这并非总能得到保证，因为外来氨基酸序列可能对形成融合蛋白结构有不利影响。微粒结构对于高免疫原性是至关重要的。

先前已经将多种外来序列插入核心蛋白，而且在有些情况中已经通过实验检测到升高的免疫原性[Ulrich等，Adv.Virus Res.(1998)，pp.141-182]。然而，由于插入较长外来序列(超过大约40个氨基酸)的许多尝试失败了(不再形成颗粒)，所以假设对接受外来序列的能力有天然限制，为高至40个氨基酸，在特殊情况中高至120个氨基酸。

我们发现，只有在满足如下至少两条基本标准后，融合在核心蛋白C末端和N末端的外来氨基酸序列才形成颗粒：

(i)外来蛋白质的3D结构必须是这样的，即其N末端和C末端与核心蛋白中连接点(N端核心模块(moiety)的C末端，即大约第1位至大约第78位的核心氨基酸[核心N]；C端核心模块的N末端，即大约第80位至第149或183位的核心氨基酸[核心C])的空间位置相吻合；

(ii)如果外来蛋白质自身构成同聚体相互作用(二聚体、三聚体等)，那么这些同寡聚体的结构同样必须与所述两个核心蛋白模块的结构相吻合。

外来蛋白质如果其N和C末端在天然3D结构中密切接近，它们将非常适合于在先前公开的融合蛋白中呈递。GFP达到了这两项要求，但是许多其它蛋白质不然；后者的一个例子是莱姆病病原体布氏疏螺旋体的外表面蛋白A(OspA)，其N和C末端在长3D结构的对立侧上。

OspA或其它具有类似不利结构的蛋白质的插入导致融合蛋白中的张力。要么，外来蛋白质保持正确折叠并阻止两个核心蛋白模块彼此靠近，如此阻止它们折叠及后续二聚化和颗粒形成；要么，核心蛋白模块的折叠削弱外来蛋白质的折叠，其要么不再保持天然性质(＞抗原性改变)要么(如果大量错误折叠的话)导致聚集。

就OspA而言，通过利用非常长的接头序列，仅能部分地回避这个问题。这些接头序列产生了潜在的问题，尤其对于疫苗应用而言，即它们自身可具有不想要的抗原性，可能导致有害的交叉反应，例如与内源抗原的交叉反应。此外，相应的蛋白质制备物只具有非常受限的形成规则CLP的能力。

另外，由于核心蛋白载体的二聚体结构和载体颗粒的几何学限制性表面(CLP的“球体表面”上的可用空间受到限制)，总体位阻(general sterichindrance)对于非常大的外来蛋白质或大大偏离球状结构的外来蛋白质可能是问题。外来蛋白质的最大尺寸取决于数个因素。本发明的方法在呈递大约320个氨基酸的外来蛋白质(CSP)中获得了成功。

本发明因此涉及分拆式核心疫苗，其具有分开的多肽，它们是：乙肝病毒核心蛋白的核心N结构域和核心C结构域，及至少一种要引发体液和(适当时)细胞免疫应答的外来氨基酸序列，所述外来氨基酸序列融合至所述核心N结构域的C末端或所述核心C结构域的N末端，且所述核心蛋白能够结合衣壳样颗粒。优选引发中和性抗体的载体系统。

在c/el表位处，即大约在第73与94位氨基酸之间中断即拆分本发明分拆式核心疫苗中的核心蛋白是至关重要的。然后可以将外来氨基酸序列融合至核心N区的C末端。在这种情况中，核心C部分的N末端以核心N蛋白被拆分处的氨基酸为起点。也可以删除部分c/el表位，即自第73与94位氨基酸之间的区域中去除一个或多个氨基酸。或者，可以将要生成针对性抗体的外来氨基酸序列融合至核心C区的N末端。在这种情况中，核心N的C端区以核心蛋白被中断处的氨基酸为终点。分拆式核心疫苗必须保留的基本效应是，携带其所融合的外来氨基酸序列的分拆式核心疫苗颗粒能够形成核心衣壳样颗粒。这在蔗糖梯度或天然琼脂糖凝胶电泳中检验。也可借助电子显微镜进行检验。

要生成针对性抗体的外来氨基酸序列优选源自微生物表面结构的序列。此类微生物通常在人类中引起疾病。如果可生成针对这些结构的中和性抗体，那么这导致免疫防御能够快速清除入侵的微生物。已开发相当先进的疫苗的细菌有布氏疏螺旋体，莱姆病病原体。在本发明范围内优选采用的外来氨基酸序列是布氏疏螺旋体表面蛋白OspA和OspC。然而，外来氨基酸序列也可以是其它源自致病性生物体的序列。这些致病性生物体的例子有疟疾病原体，镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)。

其它可生成抗体的外来氨基酸序列有源自病毒的序列。优选采用那些源自接触宿主生物体免疫系统的病毒的蛋白质的氨基酸序列。所述蛋白质主要是表面蛋白，因为它们通常首先接触宿主生物体的免疫系统。但也可以是在病毒生命周期过程中所释放的蛋白质。依病毒类型的不同，它们可以是例如病毒核心蛋白或核衣壳蛋白。

然而，例如，本发明的分拆式核心疫苗不仅可用于生成针对外源氨基酸序列的抗体，而且可用于生成针对不想要的内源结构诸如肿瘤标志的抗体。肿瘤细胞往往表达与健康细胞不同的表面标志。如此，如果在分拆式核心疫苗中呈递此类内源氨基酸序列，可引发免疫应答，致使身体越来越多地生成抗所述肿瘤细胞的抗体。这些抗体使得免疫防御能够容易地识别并最终清除肿瘤细胞。然而，本发明的载体系统还可以诱导细胞免疫应答，这可以改进功效。

本申请还涉及制备针对异源蛋白质序列的疫苗的方法。分拆式核心疫苗由乙肝病毒核心抗原的两个部分组成，其中或是异源蛋白质序列融合至核心N区或是核心C蛋白融合至异源蛋白质序列的C末端。氨基酸链中两个结构域彼此拆分的位置位于第73位与第94位之间。此氨基酸区域中呈递c/el表位的氨基酸可以被删除。

本发明的方法原则上可以以两种不同方式来实施。如果分拆式核心抗原的两个部分只是作为单一多肽链来表达，那么依照本发明在期望的位置插入蛋白酶的识别序列。这使得所表达的多肽能够被蛋白酶切割成两个限定的部分。在这个实施方案中，也可以共表达在期望切割位点进行切割的蛋白酶。编码它的基因序列可以位于同一载体上或位于分开的载体上。

然而，在另一个优选的实施方案中，上文所述两条多肽使用一种特殊的载体来表达。优选采用“双顺反子”载体。这意味着分拆式核心疫苗的一个部分作为多肽链表达，而终止密码子位于C末端。然而，其后不久，核糖体可再次附着并表达第二多肽。这确保了分拆式核心疫苗的两个部分以大致相等的量生成，而且不需要当心宿主生物体不会丢失任一载体，否则会导致只有分拆式核心疫苗的一个部分仍得以提供。

表述“融合蛋白”或“融合至”意味着两个不同蛋白质或多肽经肽键彼此相连接。通过表达连续相连的编码它们的核酸序列来生成此类融合蛋白。

本发明发现，将插入的外来蛋白质连接在N和C两个末端，是HBV-CLP载体系统更广泛应用(尤其作为疫苗载体，一般用于呈递外来分子)时主要的蛋白质化学问题。如果能将两个共价键(位于插入物N端一侧或C端一侧)中的任一个去除但仍然因为拆分开的核心蛋白模块(分拆式核心)找到彼此并正确折叠而形成颗粒，则可以大大增加插入的外来蛋白质的数目和类型。这是本发明的一个关键方面。

图2示意性地描绘了具有不良3D结构的外来蛋白质(例如OspA)的插入可阻止核心蛋白载体形成有利于颗粒形成能力的结构(上图；另一种情况是，核心蛋白载体正确3D结构的形成可阻止外来蛋白质形成天然3D结构(下图)。这会对目标抗体的结合产生不利的影响。如果外来蛋白质插入物与载体之间的两个共价连接(在插入物的C末端或N末端一侧上)中任一个被去除(箭头)，那么这个空间问题就消除了。实现这一目的的一种方式是随后切割连续的融合蛋白，这需要额外插入特异性蛋白酶的切割位点。因此优选从一开始就作为两个分开的实体来表达两个片段。

依照本发明的技术方案具有进一步的结果：

(i)由于c/el表位位于颗粒表面上，新的N和C末端在此表面上形成，其可以进一步衍生化。例如，可以将外来分子X融合至核心N片段，而将外来分子Y融合至核心C片段。一种可能的应用是呈递异二聚体外来分子。然而，在这里必须考虑通过融合附着的两个部分不能有任何位阻。

(ii)所插入的外来序列的具体亚区，例如特别重要的表位，可以面向或背向颗粒表面，这取决于经N末端还是C末端连接。一个例子是布氏疏螺旋体OspA的“LA2表位”，已经发现它位于C端区域内。识别此表位的抗体具有中和作用。

在插入的外来序列上呈递另外的相互作用表面也是重要的(例如附着第三分子)。由于能够相互作用的外来序列只有一侧被连接，所以它不会被强加人工3D结构；相反，根据类型的不同，它具有柔性(flexible)或者能形成它正确的3D结构且没有干扰。这大大有助于与相互作用配偶的相互作用。

本发明还涉及药物，特别是疫苗，其包含基于分拆式核心系统的衣壳样颗粒。

本发明的药物包括本发明的衣壳样颗粒，而且它们优选积极地影响免疫系统。通常，本发明的分拆式核心载体系统对免疫系统呈递外来氨基酸序列，免疫系统针对该序列生成抗体，优选中和性抗体。然后这些抗体决定性地参与控制已经侵入身体的微生物或病毒，或者它们帮助特异性地破坏不想要的肿瘤细胞。

在又一个实施方案中，可以采用本发明的分拆式核心载体系统作为诊断和/或分析工具(means)。实施例12和13更详细地例示了此类应用。借助此类工具，可以制备例如可及的(assessible)、自发荧光的(self-fluorescent)、抗体结合颗粒，它们结合抗原且使之可通过荧光来显现。在又一个实施方案中，本发明的分拆式核心载体系统可包含特异性结合确定的金属离子/镧系元素的肽序列。如果将此类肽掺入分拆式核心系统，那么所提供的颗粒每一个都包含多个属于此类的受体原子/离子，它们更容易检测。

实施例1：野生型核心蛋白插入有TEV蛋白酶识别序列

将烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus，TEV)蛋白酶的识别序列引入野生型(wt)核心蛋白1-149的c/el表位(将氨基酸P79+A80替换为GGGGT-ENLYFQGT-GGGG；G残基作为接头来确保识别序列被蛋白酶接近)。重组表达的蛋白质形成颗粒。将它们与TEV蛋白酶一起温育，并通过SDS-PAGE检查切割反应是否成功。然后将蛋白酶消化混合物通过蔗糖梯度沉降。在期望的位置发生了事实上完全的切割，因为生成了几乎同等大小的两个片段。尽管发生了切割，但是蛋白质在梯度中沉积到了与未切割的wt核心蛋白1-149大致相同的位置。使用基于全长核心蛋白1-183的融合蛋白得到了可比的结果。

实施例2：核心蛋白变体插入有较大外来序列

作为具有中等大插入物的融合蛋白的实例，将能与互补肽“BASE”相互作用的人工肽“ACID”(侧翼为富含Gly的接头；总共65个氨基酸)的序列插入c/el表位[O’Shea等，Curr.Biol.(1993)，656-667]；在其下游插入TEV-蛋白酶识别序列GGGGSGGGVEDGGGGSGGGGT-AQLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQTG-ENLYFQGTGGGG。

该融合蛋白形成CLP。将它们分离并如上所述与TEV蛋白酶一起温育。这里同样发生特异性切割，但是颗粒保持完整。在这种情况中，TEV切割片段具有不同大小，因此可以在SDS凝胶中直接区分开。尽管发生了切割，但是片段共沉降到CLP特异性梯度级分中。

此实施例证明了，由插入有65个氨基酸的肽(接头+ACID+TEV切割位点)的核心蛋白构成的CLP也可以被特异性切割，同时仍然保留微粒结构。

实施例3

所示另一个实施例是使用包含布氏疏螺旋体OspA蛋白氨基酸序列18-273的核心蛋白的相应实验。不含TEV切割位点的相应蛋白质记载于Nassal等，2005；它只有一部分形成规则颗粒，可在蔗糖梯度的宽范围分布中观察到这些特点。因此，这类未切割的疫苗应用范围有限。此外，这种未切割的疫苗不可应用于人类/医疗，因为为了获得至少一小部分在CLP形式中的制备物需要非常长的额外接头序列，这种序列有其内在的、不想要的抗原潜力。

引入TEV切割位点后，将融合蛋白如实施例2所述用TEV蛋白酶处理，然后在蔗糖梯度中沉降。这里同样发生了特异性切割，然而它是不完全的(大概是由于OspA的位阻所致TEV切割位点可及性较差)；借助特异性识别N端或C端核心模块的单克隆抗体对所述片段分类；结果发现，核心N抗体与未切割的融合蛋白和N端切割片段相互作用。受到部分切割的物质仍然展现颗粒的典型迁移行为。这些数据指明，通过打开所插入的外来蛋白质与核心载体之间两处连接之任一显著改善了颗粒形成。

此实施例证明了，具有大的外来蛋白质插入序列(255个氨基酸的OspA+接头+TEV切割位点)的核心融合蛋白可以被特异性切割(尽管效率较低)。虽然先前描述的连续式核心OspA融合蛋白在梯度中分布范围宽(Nassal等，2005)，被(部分)切割的融合蛋白明显集中在颗粒的典型梯度级分中。这表明，切割改善了颗粒形成效率。

另一项实验证明，共表达(来自相容质粒)的TEV蛋白酶切割携带TEV切割位点的核心融合蛋白，有时比后续体外切割有可能实现的效率更高。对于早就在细菌中遭到切割的融合蛋白，经蔗糖梯度沉降也检测到颗粒形成。

实施例1-3证明了预先形成的CLP在c/el表位区域中的切割后保持完整。这也许可以在结构上用形成刺突的螺旋之间的连接环本身不对结构起作用的事实来解释，但是不能以这种方式预期。这导致了更优选的实施方案，其中不对蛋白质连续链进行后续切割，而是将核心N和核心C部分作为分开的蛋白质片段直接表达，在此过程中它们显然自发地来到一起并形成颗粒。这样的方法具有至少三项实质性优点：

(i)简便：使用TEV(或另一种)蛋白酶进行额外切割的步骤不再必需；

(ii)融合蛋白中不额外需要特异性蛋白酶识别的肽序列；

(iii)利用空间结构不良、需要非常长的接头序列的外来蛋白质(诸如OspA)也能形成颗粒，即使只是部分地形成颗粒；因为如果消除了空间位阻，则不再需要与核心载体蛋白质的双侧进行连接，这样可以消除不良空间结构的不利影响。

第(ii)和(iii)点对于疫苗应用特别重要，因为任何额外序列都有可能导致不可预测的免疫学后果(由于额外序列所导致的新表位，有可能与内源表位交叉反应)。

实施例4：用于大致等摩尔地表达核心N片段和核心C片段的表达构建体

连续肽链不可避免地包含等摩尔量的稍后切割产物。因此，分开表达时，这两个部分同样应当以大致等摩尔的量生成以实现有效装配。在第一个实验中，采用分开的两个相容质粒来表达载体蛋白质的两个部分，但是只获得了中等的成功。

在一个优选的实施方案中，采用双顺反子载体，这种载体还另外具有可以不必用另一种抗生素进行选择(用于维持同样必需的第二质粒)的优点。

1型构建体在公用启动子(在这里是T7噬菌体RNA聚合酶启动子)的下游包括两个表达盒，每一个都具有上游核糖体结合位点(RBS；Shine-Dalgarno序列)。在这里提供的载体中，核心N片段的翻译被脯氨酸79(P79)下游的人工密码子终止，而在丝氨酸81(S81)上游的人工起始密码子使得第二片段的翻译能够启动。这类操纵子结构常常见于细菌(“多顺反子mRNA”；核糖体可以相对独立地结合mRNA上的每个RBS并启动位于3’的基因的翻译)。在所提供的构建体中，第二个RBS是第一个RBS的真实拷贝，其衍生自最初的pET载体；其它RBS序列当然也是可能的。第二个顺反子的ATG起始密码子是以便于克隆外来序列的Nde切割位点(CATATG)的一部分。

2型构建体(“终止/起始”)不包含分开的第二RBS；而是，下游基因的起始密码子(NNA TGA)与上游基因的终止密码子(NNN TGA)在移位1位的读码框中交叠。在这种情况中，核糖体可读取第一基因，然后直接在第二基因的ATG处再次起始；这样的排列使得两个基因能够共表达；类似的终止-起始排列可见于一些细菌噬菌体。所述排列也出现在一些真核非LTR反转录转座子(ORF1/ORF2连接)中。基于已知序列，例如大肠杆菌Trp操纵子中的序列，毗邻或交叠的终止/起始密码子的其它组合(例如TAATG、TGATG等)应当是同等地合适的。

图3示意性地描绘了优选的表达载体。

上图：1型构建体。启动子，例如T7RNA聚合酶的启动子，导致双顺反子mRNA的转录(可以在3’插入终止子序列以实现有效终止)。第一个顺反子编码HBV核心蛋白氨基酸序列1-79。上游核糖体结合位点(RBS1)使得翻译能够起始(小和大核糖体亚基描绘为卵形)。终止密码子位于P79密码子3’末端的下游。用于核心C片段的翻译起始的另一个RBS(RBS2)位于第二个顺反子的5’末端。该片段额外具有它自己的起始密码子(ATG)。在所示实施例中，核心C序列以Ala80起始且可延伸至第140位氨基酸，优选延伸至第149位，或者延伸至第183位真正的末端。自第140位，优选自第149位向前的氨基酸序列也可以用外来序列替换。

下图：2型构建体。它们只在第一个顺反子上游包含单一RBS。通过再次起始来实施核心C片段的翻译，其中核心C的人工起始密码子(ATG)与核心N的终止密码子(TGA)交叠，如所示的。在该实施例中，核心C序列以Ser81起始。

核心蛋白的第77、78和79位氨基酸是谷氨酸(E；密码子：GAA、GAG)、天冬氨酸(D；密码子：GAC或GAT)、第79位氨基酸脯氨酸(P；密码子：CCN)。在所提供的1型构建体中，为氨基酸序列EDP选择核苷酸序列GAG GAT CCN，其生成BamHI切割位点(GGATCC)；此唯一的BamHI切割位点使得简单地克隆不同的编码核心N和C的DNA片段成为可能。脯氨酸密码子CCN中的核苷酸N没有限定；终止密码子可以是TAA、TAG或TGA。

2型构建体中第一个基因末端的上游序列是G GAT CCa TGA。此序列也包含用于克隆不同的编码核心N或C的DNA片段的BamHI切割位点(标有下划线)。所提供的2型构建体中的P79必须具有密码子CCa，而且终止密码子必须是TGA(＞CCa TGa)，才能生成交叠的ATG起始密码子供第二个基因所用。第二个基因中ATG起始密码子之后第一个氨基酸的密码子必须以A起始。二选一的终止/起始核苷酸序列会是TGA TG或TAA TG，正如大肠杆菌TrpE与TrpD或者TrpB与TrpA之间的Trp操纵子中那样[Das和Yanofsky(1989)，Nucl.Acids Res.，pp.9333-9340；Oppenheim和Yanofsky(1980)，Genetics，pp.785-795]。

所提供的载体(pET28a2-xxx)的主链是基于商品化载体pET-28，然而，其中卡那霉素抗性基因已经用氨苄青霉素抗性基因替换。然而当然也可应用其它载体主链(不同的复制起点、不同的抗性基因、不同的启动子、不同的RBS)。核心N和核心C的基因的双顺反子排列，无论是采取两个分开的RBS的方式或是终止/起始排列的方式，都是至关重要的。在我们自己的实验中，从1型构建体和2型构建体都可表达多种分拆式核心蛋白，但是从2型(终止/起始)构建体成功表达的情况较少。另外，2型构建体中序列变异的可能性更小(见上文)。因此1型构建体应用更广。

所选择的核心N模块C末端氨基酸是P79，因为脯氨酸尤其对蛋白酶有抗性，因此片段被降解的可能性被最小化。由于已知的3D结构和已记载的此中央区域删除变体，因此可以假设：

(i)核心N片段的末端可以位于大约第72-74位氨基酸的区域内，特别是Gly73，

(ii)核心C片段的起点可以位于大约第78-86位氨基酸的区域内，可能在Gly94上游，这与使用本文所选界限(核心N在P79终止，核心C在S81起始，其上游起点为ATG)得到的结果没有实质性不同。

由于不同的转录和翻译机制，所描述的构建体不能以这种方式应用于在真核细胞中表达；必须使用真核启动子而非原核启动子(例如CMV-IE等等)，且在读框终点的下游必须引入多腺苷酸化信号(例如来自SV40病毒的等等)。

可以如下在真核生物中实现大致同等的核心N和核心C表达：

(i)共转染两种质粒(一种用于核心N，一种用于核心C)；

(ii)转染具有两个独立表达盒的一种质粒；

(iii)转染具有功能性双顺反子mRNA的一种质粒；例如，可以利用上游的内部核糖体进入位点(IRES)来表达第二基因；

(iv)2型载体样终止/起始排列在真核生物中可能也是有功能的。

实施例5：wt核心N和核心C片段的分开表达生成完整CLP

借助基于类型1的表达载体(图3)，在大肠杆菌BL21细胞中分两部分表达了野生型核心蛋白，在一种情况中基于第1-149位氨基酸，在另一种情况中基于第1-183位氨基酸。生成了两种预期的片段，并装配成了完整CLP。这用蔗糖梯度和天然琼脂糖凝胶电泳检测。CLP的形成是通过由第1-183位氨基酸的连续链构成且具有C末端His6标签的颗粒与由相应的分拆式核心系统构成的颗粒经电子显微镜比较(负染色)直接检测到的。在此解析度未检测到差异。

wt-HBV CLP活性很高且对摩尔浓度的尿素有抗性；由C端截短的核心蛋白1-149构成的CLP可以被3-5M尿素解离成二聚体，并在体外通过改变缓冲条件(去除尿素，中性pH，提高盐浓度)重新结合成CLP。一项关于由分拆式核心构成的CLP稳定性的比较研究证明了分拆式核心CLP具有同样高的稳定性。这指明了核心N和核心C模块对彼此的高亲和力，而且对于作为外来分子的载体系统的用途是重要的。

实施例6：外来蛋白质-核心N融合体和wt核心C片段及反之的分开表达生成完整CLP

使用融合至核心N或核心C的GFP作为模型来证明分拆式核心系统原则上适合于CLP形成和外来蛋白质呈递；核心N构建体利用1型(第二RBS)或2型(终止/起始)载体。所有构建体导致绿色荧光蛋白的表达，根据蔗糖梯度中的沉降，其形成颗粒。

为了进一步证明特定核心N和核心C片段的物理结合，将梯度级分的等分试样在天然琼脂糖凝胶中进行电泳。在这种情况中，颗粒保持完整，正如GFP生色团那样。核心N上有GFP和核心C上有GFP的级分都生成明显(distinct)的绿色荧光条带；未装配的GFP融合蛋白保留在上部梯度级分中并展示出不同的迁移行为和更分散的分布(在凝胶中扩散更快速，因为其结构大大小于由180或240个亚基构成的颗粒)。对于核心N上有GFP和核心C上有GFP这两种情况，通过抗核心C抗体在绿色荧光(即含GFP的)条带中还检测到核心C。

此实施例证明了两件事，即

(i)在分拆式核心系统中，可以将大约240个氨基酸的外来蛋白质(在这种情况中是GFP)融合至核心N和核心C，不会干扰CLP形成。

(ii)1型和2型分拆式核心载体都适合于使核心N和核心C与通过融合附着于它们的外来序列共表达。

实施例7：在分拆式核心系统中经CLP呈递医学上重要的外来蛋白质，这是通过常规手段不可能实现或者只是在很有限的程度有可能实现的

布氏疏螺旋体OspA

正如开始时所解释的，先前的系统要求使所插入的外来蛋白质双侧都与载体蛋白质连接，这导致极大的拓扑学限制。与GFP相反，OspA没有天然的“吻合结构(fit)”。因此，将OspA优先用作分拆式核心系统中具有不良结构的外来蛋白质，并将其融合至核心N或核心C。与在梯度中具有广泛分布的早期连续式构建体[记载于Nassal等，2005]不同，两种融合蛋白都明显(distinctly)集中在颗粒的典型级分中。对于OspA融合至核心N和OspA融合至核心C二者，通过电子显微术进行的分析证明了与老式的连续式构建体相比，CLP形成效率有显著改善。

此实施例证明了：

(i)分外来蛋白质的结构在常规的连续式核心系统中干扰CLP的形成时，这种外来蛋白质可在拆式核心系统中作为CLP呈递；

(ii)分拆式核心系统通过将外来蛋白质融合至核心N和核心C使得CLP能够有效形成。

类似的，也可在本发明分拆式核心系统中成功呈递布氏疏螺旋体OspC。

实施例8：疟疾病原体镰状疟原虫的环子孢子蛋白

就疫苗而言高度重要的另一种致病性蛋白质是疟疾病原体镰状疟原虫的环子孢子蛋白(CSP)。CSP(本文中使用的形式：总长319个氨基酸)包含四肽基序NANP/NVDP的大约110个氨基酸的重复序列。CSP的结构未知；具有4个Cys残基的大约50个氨基酸的C端结构域大概(基于序列同源性)进行与血小板反应蛋白(thrombospondin)1型重复序列相似的折叠。尽管该重复序列具有免疫原性，但是其它CSP区域可能也包含重要表位。至今不可能使用常规的连续式核心系统来制备CLP形式的全长CSP，然而这使用分拆式核心系统很容易实现。对于将CSP融合至核心N；与核心C(作为149和183构建体)共表达而有效生成微粒结构，，目前都已有明确的数据。

在连续式或分拆式核心系统的每种情况中，制备了一系列只包含重复序列或包含截短型CSP但不含Cys富集区的构建体(基于核心1-149和1-183)；另外，将完整CSP融合至核心N。用CLP制备物在小鼠中进行比较性免疫原性研究，但尚未得出结论。迄今为止得到的数据表明，在分拆式核心系统中制备的疫苗具有卓越的特性。这可归功于完整CSP只有在应用本发明的载体系统的时候能够形成CLP的事实。相反，其它系统不生成任何CLP。结果是，借助本发明的载体系统制备的CSP疫苗应当具有卓越的免疫原性，特别是诱导中和性抗体。

实施例9：分拆式核心CLP作为外来蛋白质的载体增强针对外来蛋白质的B细胞应答

在小鼠免疫原性研究中，比较了分拆式核心系统的5种核心-OspA构建体与未融合至核心的脂化OspA(LipOspA)；商品化的Lymerix疫苗就基于此且因此是莱姆病疫苗目前的“黄金标准”。LipOspA(顺式-棕榈酰-半胱氨酸-(Pam3-Cys))中的脂质模块是其相对较高免疫原性所必需的，未脂化的OspA只具有非常微弱的免疫原性(Nassal等，2005)。所述核心-OspA构建体有三种包含全长OspA(第18-273位氨基酸)，另外两种包含截短的OspA(自第185位氨基酸至第273位氨基酸)。

为此目的，在每种情况中，给6组、每组5只BALB/c小鼠免疫4次(第0，14，29，49天)，每次10μg抗原：

第1组：LipOspA

第2组：全长OspA(aa 18-273)在核心N上，核心C为核心aa81-183

第3组：全长OspA(aa 18-273)在核心N上，核心C为核心aa 81-149

第4组：截短OspA(aa 185-273)在核心N上，核心C为核心aa 81-183

第5组：截短OspA(aa 185-273)在核心N上，核心C为核心aa 81-149

第6组：全长OspA(aa 18-273)连接至核心C的aa183，核心N为aa 1-79。

如下测定所诱导的抗体，在第-1天(即第一次免疫前1天；＝免疫前血清)及第8，26，36和57天采集血液。借助ELISA测定以下各项：OspA特异性抗体生成的动力学；LA2等同抗体的具体比例，LA2是已知的单克隆中和抗体，它识别OspA第185位氨基酸下游的不连续氨基酸序列的复杂构象表位。

此实验的结果详细描绘于图4。

图4A描绘了总抗OspA抗体的诱导动力学(单位为μg特异性抗体(Ab)每ml血清)。用全长OspA分拆式核心构建体免疫的小鼠的血清甚至在第2次免疫后都含有可检测到的、与LipOspA所致滴度相当的抗OspA滴度。在第3次和第4次免疫后，用分拆式核心全长OspA免疫的小鼠中的抗OspA滴度显著超过用LipOspA免疫的小鼠的抗OspA滴度；用融合至核心C的OspA18-273免疫后的滴度特别高(第6组)。截短的OspA185-273在核心149背景(第5组)和在核心183背景(第4组)中只引发非常低的OspA特异性应答。

图4B直接比较了总抗OspA抗体滴度与针对OspA C端区中已知中和性LA2表位的抗体的滴度。全长OspA-核心N融合体在核心149背景和在核心183背景(分别为第2组和第3组)中诱导出比LipOspA高的抗LA2等同抗体滴度，全长OspA-核心C融合体的滴度低很多。持续研究特定中和抗体的含量(抗布氏疏螺旋体攻击的保护作用)。

此实施例证明，分拆式核心CLP针对所呈递的全长OspA外来蛋白质诱导出特异性抗体，滴度比已有脂化LipOspA(其中脂质模块为免疫原性所必需)的高。OspA-核心N免疫后的LA2等同抗体比例(大约30％)与OspA-核心C免疫后的LA2等同抗体比例(＜5％)不同表明，连接的类型影响所生成的抗体的类型；这方面可参见实施例10。

实施例10：核心N融合体或核心C融合体特异性诱导抗外来蛋白质的区域-特异性抗体

有些蛋白质不像GFP那样其N和C末端彼此紧密接近，这样的蛋白质与核心N融合所得颗粒表面的取向不同于与核心C融合所得颗粒的取向(核心N：外来蛋白质的C末端“在外”；核心C：外来蛋白质的N末端“在外”)。在用作B细胞疫苗时，那些在每种情况中向最远处延伸直到溶剂中的蛋白质模块预期可引发最强的抗体应答。因此，可以通过将外来蛋白质融合至核心N(外来蛋白质的C端一侧“在外”)或核心C(外来蛋白质的N端一侧“在外”)来诱导不同的区域特异性抗体。

图5示意性地描绘了一种可能的方式来为具有延伸结构、且融合至核心N或核心C的外来蛋白质，诸如本文中的OspA，确定该分子的哪部分背离CLP表面最远。OspA中一个已经精确作图(mapped)的表位是C端区中的LA2，它由中和性单克隆抗体LA2识别。正如预期的，分拆式核心OspA CLP当其OspA与核心N融合(因此OspA C末端暴露)时诱导强烈的LA2等同应答，当其OspA与核心C融合时只诱导微弱的LA2等同应答。而针对OspA其它区域的应答得到增强。

OspA作为外来蛋白质，当其与核心N融合时，预计使C端OspA区中LA2表位处于易被接近的状态，当其与核心C融合时，预计使N端OspA区处于易被接近的状态，而这迄今尚未在免疫学上确认。上文所述数据令人印象深刻地证实了这一概念(对于OspA-核心C，抗总OspA滴度很高，但LA2等同抗体滴度低)。

分拆式核心系统因此对外来蛋白质与核心N的融合物和外来蛋白质对与核心C的融合物都具有较高的免疫增强活性。

所诱导的抗体的类型/区域特异性可以通过选择连接位点(核心N还是核心C)来控制。为了使疫苗接种结果最佳，可以采用分拆式核心疫苗混合物，其中异源外来氨基酸序列的一部分融合至核心N模块而其它部分融合至核心C模块，从而实现各个表位的最佳呈递。

实施例11：融合体除了疫苗应用之外的意义

除了直接作为肽、以及本文中尤其是蛋白质、抗原疫苗的免疫增强性微粒载体之外，这种载体平台还可以有多种其它用途。在每种情况中，使所呈递的大量(180或240个)分子彼此对称地接近。如果所述分子是能够进行相互作用的外来分子(疫苗是特例，其与抗体相互作用)，那么具有多拷贝外来分子的颗粒具有大大高于单体外来分子的亲合力(相比于天然IgM五聚体；还有免疫诊断学中的MHC四聚体)。此类能够进行相互作用的外来分子在CLP表面上必须是可接近的，从而能够与它们的相互作用配偶物发生相互作用。与常规的连续式系统相比，分拆式核心系统大大促进这方面。

多种模型外来序列在分拆式核心系统中表达，所分析的所有插入序列形成CLP。它们中的一些可直接检测其相互作用能力。

分拆式排列使CLP表面的新末端变得易于接近，以便于进一步衍化。图5描绘了一种分拆式核心二聚体，其中的ACID肽与核心N融合，所述肽可以与互补的BASE肽相互作用。融合有所述BASE肽的分子X结合ACID CLP。分拆式排列使ACID具有柔性(flexible)；插入连续式核心系统中的ACID能与BASE肽相互作用，但由于ACID与BASE肽形成刚性卷曲缠绕双螺旋[O’Shea等，1993]，这种核心载体的结构变得不稳定，CLP解体。而在分拆式排列中，CLP应该是保持稳定的。这种偶联可以扩展为：将另一种能够进行相互作用的分子A而不是ACID肽与核心N或核心C融合。然后相应的CLP可以与B，即A的特异性相互作用配偶物发生相互作用。此类相互作用配偶对有His6-Ni-NTa、生物素受体肽-链霉亲合素；Z33-免疫球蛋白。

下文更详细地解释了其它可能的偶联形式：

a)His6标签：

经Gly2接头融合至核心N；形成结合Ni2⁺NTA琼脂糖的颗粒。His标签是可自由接近的，与连续式系统相反。连续式核心系统的c/el中相当的插入物(His7)不生成任何显著量的蛋白质，因为His6标签残基在那里是空间上不可接近的。

b)生物素受体(BA)肽：

生物素受体(BA23)是13个氨基酸的人工肽(GLNDIFEAQKIEWH)，其被大肠杆菌生物素连接酶BirA生物素化。有效生物素化要求可自由接近，这可在分拆式核心系统中实现，但连续式核心系统中不行或程度有限。分拆式核心-BA融合蛋白形成CLP，并在大肠杆菌中生物素化。可以使亲合素/链霉亲合素或它们的偶联物与CLP所呈递的生物素结合。

c)蛋白A的Z33结构域

金黄色葡萄球菌蛋白A以高亲和力结合免疫球蛋白(“蛋白A sepharose”用于免疫沉淀)。蛋白A由5个结构相似的Ig结合结构域组成。Z33构成其中一个这样的结构域，但具有经过修饰的氨基酸序列；总长：33个氨基酸。Z33仍具有针对Ig的高亲和力(Kd 40nm)。对不同Ig的结合要求结构灵活性，以及可接近性。Z33序列经长接头序列融合至核心N：GGGGSGGGVEDGGGGSGGGGT-FNMQQQRRFYEALHDPNLNEEQRNAKIKSIREDP。

在分拆式核心系统中形成CLP。添加FITC标记的免疫球蛋白，再次沉淀后，在颗粒典型的梯度级分中检测到荧光。如果使用wt核心蛋白CLP而非Z33融合物，情况就不是这样。

d)ACID肽插入物

插入连续式核心系统中的ACID肽与互补的BASE肽(“肽Velcro”)通过形成卷曲缠绕而相互作用[O’Shea等，1993]，对核心结构有大量的修饰，直至其分解；这是由于ACID肽自身采取柔性结构引起的，所述柔性结构对核心结构不施加任何压力。添加BASE肽导致与ACID序列的相互作用，结果这两种肽序列都采取刚性螺旋卷曲缠绕构象。双侧都连接，导致张力。单侧固定的ACID肽应当能够在没有张力的情况中与所添加的BASE肽或融合至其它配偶体的BASE肽相互作用。在任何情况中，常规连续式核心系统中ACID融合蛋白的颗粒结构，在借助TEV蛋白酶切割核心载体的C端连接后，仍然保持相互作用。

可以给具有暴露的ACID序列的分拆式核心负载与互补BASE肽偶联的外来蛋白质。这是随后给分拆式核心CLP负载所选外来分子的数种可能性之一。

上文详述的偶联机制使CLP带有偶联体中的一方。而与偶联体中的另一方融合的蛋白质可以方便地与所述CLP偶联。这样就可以，例如，向免疫系统呈递非肽样的结构。

e)不同的外来分子同时地与核心N和核心C融合

在先前的实施例中，在每种情况中将一种外来序列融合至核心N或核心C。原则上，也可以将两种不同的外来分子同时地融合至核心N和核心C；例如，异二聚体外来蛋白质的两个亚基。所用模型是两部分式GFP(two-partGFP)，其第一个区段包含11条GFPβ链的前10条、并融合至核心N，其第二个区段包含第11条GFPβ链、并融合至核心C。从1型载体共表达，生成绿色荧光CLP。从而，核心N和核心C结构域装配，产生能够装配的CLP结构，而且GFP两部分彼此补充产生正确的3D结构，并形成GFP生色团。

此实施例证明，将不同的外来序列同时地融合至核心N和核心C，可以形成分拆式核心载体的有功能的结构，也可以形成与核心N和核心C融合的两种不同外来序列的有功能的结构。

实施例12：分拆式核心CLP在表面呈递蛋白G的GB1结构域

另一个具体的实施例涉及将链球菌免疫球蛋白结合蛋白“蛋白G”(其在功能上与蛋白A相关)的“GB1”结构域导入HBV分拆式核心系统。蛋白G同样由多个相似结构域组成。与蛋白A一样，蛋白G结合免疫球蛋白，但是在IgG物种起源和亚型方面具有不同的特异性。由于蛋白G和蛋白A的这种互补性，二者都有商品化试剂用于根据不同免疫球蛋白的结合进行免疫学检测。与蛋白A一样，蛋白G及自其衍生的GB1结构域也结合抗体的恒定区(Fc)，而抗体上识别抗原的可变区仍保持可被接近的状态，以供抗原结合。因此，可以结合多种不同的抗体。

在此实施例中，GB1结构域被导入分拆式核心系统，并证明：(i)形成了CLP，且(ii)这些CLP，而不是不含GB1的对照CLP，能结合不同抗体。

以与上文所述实施例类似的方式，通过遗传工程将GB1结构域融合至核心N或核心C，并分别与各自欠缺的核心C和核心N片段共表达。

具体的氨基酸序列对应于蛋白G前体蛋白的第229-284位氨基酸(SwissProt登录号；P06654)；3D结构是已知的(PDB登录号：1PGA；参考文献：Gallagher T，Alexander P，Bryan P，Gililand GL(1994)Two crystal structures ofthe B 1immunoglobulin-binding domain of streptococcal protein G andcomparison with NMR Biochemistry 33：4721-4729)。

核心D78-GGGGSGGGGTQ-YKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEdP

与核心N的连接借助G4SG4TQ接头；倒数第二个氨基酸K用D替换(序列中的小写字母)；下游的E残基是X射线结构中看得见的最后一个氨基酸；K→D替代使得能够在核苷酸水平引入BamHI切割位点(Gag gat cct TAG)；因此，后者位于与上文所述构建体同源的位置。

与在其它实施例中一样，有效形成了颗粒，而且这可以通过蔗糖梯度沉降、在天然琼脂糖凝胶中的迁移行为、以及电子显微显微镜检检测。

如下检测到了CLP携带的GB1结构域的相互作用能力，将颗粒与免疫球蛋白一起温育，然后在蔗糖梯度中再次沉降；在该过程中，抗体显然与颗粒共沉降。通过如下事实也检测到了IgG结合，即核心N-GB1片段在SDS凝胶电泳之后在Western印迹上与二抗偶联物直接相互作用。因此，甚至在融合至核心N的背景中，经过修饰的GB1也能有效复性并结合其配体，IgG。

为了证明与颗粒结合的GB1确实结合免疫球蛋白，将相应的蔗糖梯度级分的等分试样与5nm金标记的抗体一起温育，未结合的抗体通过在蔗糖梯度中再次沉降来清除，颗粒级分通过电子显微术来分析。电子致密的金颗粒指示，抗体与完整CLP结合。

实施例13：含自发荧光GFP和含GFP变体的分拆式核心CLP呈递能相互作用的外来分子

实施例11e)例示了融合物除疫苗应用之外的用途，其中GFP分子分成两部分(GFPβ1-10和GFPβ11)，当GFPβ1-10融合至核心N、GFPβ11融合至核心C时，这两部分结合，生成天然GFP结构(绿色荧光)，并形成CLP。

在此实施例中，将额外的外来序列融合至GFPβ11，即蛋白G的GB1结构域及人类HBV、鸭HBV和苍鹭HBV的表面蛋白的preS结构域。这只在下述情形中才有可能，即分拆式排列导致在GFPβ11上生成新的N末端，该末端因在分拆式核心CLP上的特定取向而背离CLP更朝向外表面。以与上文所述类似的方式，在编码分开的核心N和核心C片段的分拆式核心载体中，构建特定的表达质粒，在本例中，GFPβ1-10已连接至核心N，GFPβ11已连接至核心C。

根据先前的情报预计，GFPβ11区段的N末端将背离CLP表面而向外，因此另一外来结构域的存在原则上不会干扰核心N和核心C模块形成颗粒结构的能力，也不会干扰GFPβ1-10和GFPβ11模块形成天然GFP结构的能力。此实施例的结果见图7。此图的A-D部分描绘了以下内容：

A.融合蛋白两个部分的基本结构。GFPβ1-10融合至核心N，GFPβ11融合至核心C。因为GFPβ11提供了新的N末端，所以可以将另一结构域，即本文中的GB1融合至后者。

B.通过核心N与核心C相互作用(形成CLP)、以及GFPβ1-10与GFPβ11相互作用(形成GFP生色团)，生成自发荧光式CLP，如此前所示。但除此之外，它们还在表面呈递可被接近的GB1。

C.不同抗体可借其Fc区结合至GB1结构域。

D.抗体可借其不同的可变区与其特异性抗原相互作用。分拆式核心GFP-GB1 CLP因此可以在间接免疫荧光中代替常用的荧光标记第二抗体。

图7描绘了对两种不同细胞中的微管蛋白应用荧光标记。其它基于抗体结合抗原的应用同样是可行的。

依照在蔗糖梯度中的沉降和在天然琼脂糖凝胶中的迁移行为，确实有可能在大肠杆菌中共表达进一步修饰的片段，所述片段在大肠杆菌中形成CLP。另外，这些CLP展现出典型的GFP荧光，因此GFP模块也正确相遇。此实施例表明，GB1模块也在CLP表面正确折叠、并处于可被接近的状态。

自发荧光的、呈递GB1的CLP结合已与抗原结合的抗体的能力如下检测，使HeLa(人)或LMH(鸡)细胞通透，再与小鼠抗微管蛋白的第一抗体一起温育。在一种情况中，将细胞与化学荧光标记(Cy2)的第二抗体(山羊抗小鼠)或者与自发荧光的、呈递GB1的分拆式核心CLP一起常规温育，然后清洗；最后，通过荧光显微术观察细胞。

在这两种情况中，获得了可比的荧光图像(正如预期的，细胞质有染色，核没有)。如此，GB1结构域必然能够结合已结合至微管蛋白的抗微管蛋白第一抗体。

因此，可采用呈递GB1的自发荧光型分拆式核心CLP作为常规荧光标记的二抗偶联物的备选项来检测已结合抗原的第一抗体。这证明，GB1结构域仍然能够与IgG相互作用，它们因此必然是正确折叠的。此外还证明，自发荧光的、呈递GB1的CLP可作为通用检测试剂来用(与荧光标记的二抗相当)。

用GFP的颜色变体获得了类似的构建体，在这些构建体中，通过定向诱变将改变吸收和发射光谱的已知突变引入本发明的GFP构建体。具体而言，制备了黄色荧光蛋白(YFP)和蓝色荧光蛋白(CFP)变体。这两种变体都形成CLP，在每种情况中都展现出典型的吸收光谱。如此，有可能生成具有不同生色团特性的、呈递GB1的分拆式核心GFP CLP，其适用于多重免疫荧光应用。

分拆式核心系统容许制备在表面呈递能相互作用的其它外来分子的自发荧光CLP。这种外来分子如果是GB1，则仍然能够与免疫球蛋白特异性相互作用，甚至在免疫球蛋白结合至它们的靶抗原时也可以。结果是，除了疫苗应用之外，还可有一种新的应用，即借助自发荧光CLP，通过不同抗原的荧光进行直接检测。此类自发荧光的、能够相互作用的分拆式核心CLP特别适合于诊断和分析应用。

呈递除GB1以外的外来蛋白G结构域的自发荧光型分拆式核心CLP

上文结果指明，分拆式核心CLP除了包含作为两个部分的GFP，还可以呈递有功能的(即能够与特异性配体IgG相互作用)另一外来结构域GB 1。然而，少于60个氨基酸的GB1是相对较小的结构域，为了证明普遍性，制备了如下的同源构建体，其中GB1具有人类(HBV)、鸭(DHBV)和苍鹭(HHBV)HBV的大分子包膜蛋白的preS结构域。这些结构域介导相应病毒对它们的天然靶细胞即相应宿主物种的肝细胞的特异性结合。HBVpreS有大约108个氨基酸，DHBV和HHBV的preS有大约160个氨基酸，因此，这些preS结构域明显大于GB1，而且它们的序列不同于GB1但也彼此不同。

以与GB1相似的方式将这3种结构域插入分拆式核心-GFP融合蛋白(见图7；用相应的preS结构域替换GB1)。它们三个都有效形成CLP，这通过蔗糖梯度沉降、天然琼脂糖凝胶电泳上的迁移行为、以及通过电子显微术检测到；CLP展现出典型的GFP荧光(即GFP模块结合，产生正确的GFP 3D结构)；此外，HBV-preS和DHBV-preS CLP与抗HBV preS和DHBV preS的单克隆抗体相互作用；目前尚无针对苍鹭的相应抗体。

另一种应用包括，鉴定特定病毒的细胞受体。由于每个颗粒上的preS结构域数目较大(240个)，可以假设CLP对所述受体的亲合力大大提高，由此使得后者能够以稳定的方式结合并以这种方式得到鉴定。携带受体的细胞借助CLP的GFP荧光在荧光显微术或FACS中被鉴定；自此类细胞溶解的受体分子会与CLP一起温育，然后在后续的蔗糖梯度沉降中，应当在颗粒典型的梯度级分中积累。

实施例14：OspA连接在核心N上所得的分拆式核心OspA CLP比LipOspA生成更高的保护性抗OspA抗体滴度，OspA连接在核心C上所得的分拆式核心OspA CLP生成的滴度更低

如图5所示，所呈递的外来蛋白质的取向可以通过定点连接核心N或核心C来影响。就OspA而言，这导致单克隆抗体LA-2(已知是中和抗体)的C末端表位特别好地暴露(融合至核心N)，或不含任何已知的中和性表位的N末端OspA区特别好地暴露(融合至核心C)。如图4所示，这两种分拆式核心-OspACLP(其中：第2组是核心N融合，第6组是核心C融合)都生成总抗OspA抗体滴度，但是融合至核心N时的LA-2等同抗体的比例显著更高，正如根据结构预期的。

然而，本文数据是体外数据。为了在体内直接测定所诱导抗体的保护潜力，文献记录了特定免疫血清在已有小鼠模型中中和人工诱导的布氏疏螺旋体感染的能力(Nassal等，European.J.Immunol.2005；pp.655-665)。给SCID(重症联合免疫缺陷)小鼠腹膜内接种适当的免疫血清，2小时后进行皮下攻击，在每种情况中是每只小鼠10³个螺旋体。这通常在不受保护的小鼠中导致感染，表现为关节炎样症状，可以根据左和右胫骨跗骨关节中的症状进行半定量记录。只接受正常小鼠血清的一组3只小鼠充当阴性对照。接受纯化的中和性单克隆抗体LA2或被LipOspA诱导的抗体的各组每组6只小鼠充当阳性对照。测试组(同样是每组6只动物)接受用OspA在核心N上的分拆式核心OspA或OspA在核心C上的分拆式核心OspA生成的免疫血清。为了定量记录差异，实施被动免疫，首先是5μg，然后是1μg，接种的是LA2或等量的动物免疫血清，所述动物是接种LipOspA或接种OspA连接在核心N上形成的分拆式核心OspA的动物。结果描绘于图8。

由于用OspA连接在核心C上形成的分拆式核心OspA所生成的免疫血清中LA2等同抗体比例较低，故其用量等同于将OspA连接在核心N上形成的分拆式核心OspA，而不考虑LA2等同滴度。在第13，17，21，28，35，45和52天测定关节炎分数。第52天的结果总结于图8。

正如预期的，所有接种正常小鼠血清的动物形成了关节炎。随剂量从5μg降至1μg，单克隆抗体LA-2所致保护作用从4/6动物降至1/6动物，LipOspA免疫血清保护了5/6动物。OspA-核心N分拆式核心OspA获得的免疫血清通过被动免疫保护了所有(6/6)动物免于感染，甚至在较低的剂量也是如此。OspA-核心C的保护活性明显较低(高剂量时为4/6动物，低剂量时为1/6动物)。

OspA-核心N分拆式核心-OspA CLP生成了高滴度的LA2等同抗体，它们在体内具有保护作用。保护潜力超过了被LipOspA诱导的抗体。OspA-核心C分拆式核心-OspA CLP诱导高的抗OspA抗体总滴度，但其中只有一小部分是LA-2等同抗体，且它们只具有较低的中和潜力。因此，将外来抗原融合至核心N引起的免疫应答水平明显不同于融合至核心C所引起的水平。

实施例15：疟疾病原体镰状疟原虫的环子孢子蛋白(CSP)

分拆式核心系统中的全长CSP，比常规连续式核心系统中的免疫显性CSP重复序列，诱导出更强且更广的免疫应答。

先前已经显示，长度为319个氨基酸的完整CSP只在能形成CLP的分拆式核心系统中表达；这在常规的连续式系统中是不可能的。尽管也有可能在常规的连续式系统中制备不含富含半胱氨酸的C端结构域的截短型式(下文中的短型CSP)，但是这种蛋白质在几天后有明显的沉淀趋势-这在分拆式核心系统中不会发生，因此证明后者具有卓越的蛋白质化学特性。

CSP的一个特点是，有四肽基序NANP和NVDP的多重重复(本文所用全长形式中有24个NANP和3个NVDP基序)；所述基序是已知的免疫原，而且已有文献记载了基于常规连续式核心系统的实验性疫苗。因此，进行一项免疫原性比较研究，包括制备相应的常规构建体，其中重复序列NANPNVDP(NANP)₃NVDP位于核心氨基酸D78和S81之间，并形成CLP，如预期的那样，因为插入物较小。在免疫原性研究中，使用所述构建体来比较全长CSP与C端截短的短型CSP。给每只小鼠免疫相同量的特定CLP(20μg/小鼠)；在2，4，6和8周后，通过ELISA测定所生成的抗体的量；继以加强免疫(与第一次类似)，并在加强免疫的2，4和6周后再次测定滴度。使用重组CSP(作为来自大肠杆菌的融合蛋白)、NANP和NVDP肽及重组HBcAg作为测试抗原，以测定针对载体的B细胞应答。将抗原固定在ELISA板上，然后使用2倍连续稀释的免疫血清进行测定。图9示出了产生高于背景的信号的最高可能稀释度。

这导致得出了以下结论：

a)针对重组CSP的B细胞应答

所有三种免疫原都导致极强的针对CSP的应答；然而，针对全长CSP的应答仍要高4倍(滴度：对于重复序列和截短型CSP分别为1∶12×10⁶对1∶3×10⁵)，意味着12×10⁶倍稀释(！)的免疫血清仍能够识别CSP蛋白。

b)针对NANP和NVDP重复肽的B细胞应答

对于所有构建体，正如预期的，针对NANP肽的应答是相似的。针对在重复序列中较不常见的NVDP肽的应答是相似的，但是全长CSP构建体的应答明显更高，甚至在第一次免疫后(未加强)时也是如此(滴度：1∶2.5×10⁴对1∶5×10³)。

c)针对重复序列中不存在的CSP序列的B细胞应答

只有短型CSP和全长CSP诱导了针对肽CSP12(EEPSDKHIEQYLKKIQNSLS；全长分拆式核心构建体中的第246-264位)和CSP8(GNGIQVRIKPGSANKPKDELD；全长分拆式核心构建体中的第274-294位)的应答。预期用连续式核心系统中的所述重复肽免疫后缺乏相应的应答，因为其中不存在CSP8和CSP12序列。该结果的重要性具体在于，只有在分拆式核心系统中能生成全长CSP；使用分拆式核心系统，才有可能触及对疫苗接种的保护作用有贡献的其它表位。

d)针对核心载体的B细胞应答

短型CSP和全长CSP在分拆式核心系统中都导致比连续式系统中的重复肽弱大约25倍的针对核心载体的应答(滴度1∶1.25×10⁵对3×10⁶)。由于针对外来蛋白质的所需应答至少像在连续式核心系统中使用重复肽一样高(短型CSP)或甚至更高(全长CSP)，在分拆式核心系统中使用截短的，特别是全长的CSP，使所插入的外来序列的特异性免疫原性大大改善。另外，针对核心载体的强应答使得抗HBsAg阳性个体(感染者、以及疫苗接种所致抗HBsAg阳性者)的差异诊断更加困难；因此希望抗核心载体的应答水平低。

e)分拆式核心系统中的全长CSP激活T细胞

对T细胞应答的诱导如下检测，即用重组HBcAg或已知的T细胞肽(HBc120-140)或者用重组CSP或CSP肽NANP和CSP8刺激经特异性免疫的脾细胞，然后测量IL-2生成。所有构建体引起T细胞出现，这种细胞可被HBcAg、HBc120-140、重组CSP和NANP活化。然而，只有被分拆式核心系统中的全长CSP免疫的小鼠的脾细胞能够接受CSP8肽的刺激而生成IL-2。

因此，全长CSP构建体在T细胞水平同样导致比连续的只有重复肽的构建体更宽范围的应答。

Claims (17)

1.分拆式核心载体系统，作为分开的多肽，其具有乙肝病毒核心蛋白的核心N结构域和核心C结构域及至少一种要引发针对性免疫应答的外来分子，所述外来分子融合至所述核心N结构域的C末端或所述核心C结构域的N末端，且所述核心蛋白能够结合衣壳样颗粒，且所述外来分子融合至位于所述核心蛋白第73位和第94位之间的核心蛋白氨基酸。

2.如权利要求1所述的分拆式核心载体系统，其特征在于所述乙肝病毒是哺乳动物特异性的。

3.如权利要求2所述的分拆式核心载体系统，其特征在于所述核心蛋白具有人类乙肝病毒的序列。

4.如权利要求2所述的分拆式核心载体系统，其特征在于所述核心蛋白具有WHV的氨基酸序列。

5.如权利要求1-4中任一项所述的分拆式核心载体系统，其特征在于所述外来分子是致病性细菌的蛋白质的氨基酸序列。

6.如权利要求1-4中任一项所述的分拆式核心载体系统，其特征在于所述外来分子是致病性真核生物的蛋白质的氨基酸序列，特别是疟疾病原体镰状疟原虫的蛋白质的氨基酸序列。

7.如权利要求1-4中任一项所述的分拆式核心载体系统，其特征在于所述外来分子是病毒蛋白质的氨基酸序列。

8.如权利要求1-4中任一项所述的分拆式核心载体系统，其特征在于所述外来分子是具有基于其自身致病性的潜力的蛋白质的氨基酸序列，特别是肿瘤标记蛋白的氨基酸序列。

9.如权利要求1-4中任一项所述的分拆式核心载体系统，其特征在于所述外来分子选自下组：

a)生物素受体肽的序列；

b)ACID肽的序列；

c)衍生自蛋白A的Z33结构域的序列；

d)蛋白G的GB1结构域的序列。

10.制备要诱导针对性免疫应答的外来分子，特别是外来蛋白质的载体的方法，所述载体首先具有乙肝病毒核心抗原的蛋白质序列，其次具有外来分子，特别是异源蛋白质序列，

其中所述外来分子，特别是所述异源蛋白质序列融合至乙肝核心区第73位下游或第94位上游的核心N结构域或核心C结构域，且

其中所述载体的多肽链在所述核心N结构域的下游或在所述核心C结构域的上游被中断，其特征在于

所述核心N结构域和所述外来分子，特别是所述异源蛋白质序列，或者

所述核心C结构域和所述外来分子，特别是所述异源蛋白质序列，分别作为融合蛋白进行表达，

或者在所述核心N与所述外来分子，特别是异源蛋白质序列之间，或者在所述外来分子，特别是异源蛋白质序列与所述核心C之间插入蛋白酶识别序列，且分拆式核心疫苗在表达后但在使用前被所述蛋白酶切割，且

形成衣壳样颗粒。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于所述异源蛋白质序列通过融合而附着在乙肝核心抗原第74位氨基酸下游或第85位氨基酸上游。

12.如权利要求10或11所述的方法，其特征在于所述异源外来蛋白质序列长度为至少40个氨基酸。

13.如权利要求10所述的方法，其特征在于所述异源外来蛋白质序列长度为至少120个氨基酸。

14.如权利要求9-12中任一项所述的方法，其特征在于借助双顺反子载体来表达两种分开的多肽，其中第一多肽包含核心N结构域，第二多肽包含核心C结构域，且所述异源蛋白质序列融合至所述核心N结构域的C末端或所述核心C结构域的N末端。

15.具有衣壳样颗粒的药物，其特征在于所述颗粒具有如权利要求1-8中任一项所述的分拆式核心载体系统。

16.如权利要求15所述的药物，其特征在于它是疫苗。

17.具有衣壳样颗粒的诊断剂，其特征在于所述颗粒具有如权利要求1-8中任一项所述的分拆式核心载体系统。

Images