JP2021523127A - 限られたｔ細胞炎症反応で標的抗体産生を促進する人工的な無差別ｔヘルパー細胞エピトープ - Google Patents

Abstract

本発明は、標的抗原性部位の最適な免疫原性を提供するように設計された新規の異種無差別かつ人工のＴヘルパー細胞エピトープ（Ｔｈエピトープ）に関する。開示されたＴｈエピトープは、ペプチド免疫原構築物中のＢ細胞エピトープに共有結合した場合、標的抗原性部位のＢ細胞エピトープに対する強力な抗体応答を誘発する。Ｔｈエピトープは、それ自体で免疫サイレントであり、すなわち、ペプチド免疫原構築物によって生成される抗体のうち、もしあってもごくわずかしかＴｈエピトープに向けられないため、標的抗原性部位に向けられる非常に集中した免疫応答が可能になる。異種の無差別Ｔｈエピトープは、投与後に炎症性の抗自己細胞性免疫応答を生成しない、効果的かつ安全なペプチド免疫原を提供する。
【選択図】図１

Description

本開示は、本出願は、２０１８年５月４日に出願された米国仮出願番号62/667,123号の利益を主張するＰＣＴ国際出願であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

免疫応答には、抗原提示細胞とヘルパーＴ細胞との間の協調的相互作用が必要である。効果的な抗体反応を引き出すには、抗原提示細胞が対象の免疫原の標的抗原性部位を認識すること、及びＴヘルパー細胞がＴヘルパー細胞エピトープを認識することが必要である。一般に、対象の免疫原のＴヘルパーエピトープは、そのＢ細胞エピトープ（複数可）とは異なる。Ｂ細胞エピトープは、Ｂ細胞によって認識される所望の標的上の部位であり、その結果、所望の標的部位に対する抗体が産生される。標的の自然な立体配座は、抗体が直接結合する部位を決定する。Ｔｈ細胞応答の誘発には、標的タンパク質のプロセシングされたペプチドフラグメントと関連するクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）との間で形成される抗原提示細胞の膜上の複合体を認識するＴｈ細胞受容体が必要である。したがって、Ｔｈ細胞応答には標的タンパク質のペプチドプロセシング及び三方向認識が必要である。１）重要なＭＨＣクラスＩＩ接触残基は、異なるＭＨＣ結合ペプチド（Ｔｈエピトープ）内にさまざまに配置されており、２）異なるＭＨＣ結合ペプチドは可変長であり、異なるアミノ酸配列を持っており、３）ＭＨＣクラスＩＩ分子は、宿主の遺伝的構成に応じて非常に多様になる可能性があるので、３つの部分からなる複合体を定義することは困難である。特定のＴｈエピトープに対する免疫応答性は、宿主のＭＨＣ遺伝子によって部分的に決定され、Ｔｈエピトープの反応性は集団の個体間で異なる。無差別なＴｈエピトープ、すなわち、単一の種内の種間及び個体間で反応性のあるＴｈエピトープを特定することは困難である。

抗原プロセシング細胞による適切なペプチドプロセシング、遺伝的に決定されたクラスＩＩ ＭＨＣ分子によるペプチドの提示、Ｔｈ細胞上の受容体によるＭＨＣ分子またはペプチド複合体の認識など、Ｔ細胞認識の各構成要素ステップには複数の要因が必要である。幅広い応答性を提供するための無差別Ｔｈエピトープ認識の要件を決定するのは難しい場合がある。

抗体の誘導のために、免疫原はＢ細胞決定基とＴｈ細胞決定基（複数可）の両方を含まなければならないことは明らかである。一般に、標的の免疫原性を高めるために、Ｔｈ応答は標的を担体タンパク質に結合することによって提供される。この手法の欠点は多くある。以下の理由により、明確で安全かつ効果的なペプチド−担体タンパク質コンジュゲートを製造することは困難である。

ａ．化学的カップリングは、サイズと組成の不均一性を導入するランダム反応であり、例えば、グルタタールアルデヒドとの結合である（Borras-Cuesta et al., Eur J Immunol, 1987; 17: 1213-1215）。

ｂ．担体タンパク質は、アレルギー反応及び自己免疫反応などの望ましくない免疫応答の可能性を誘導する（Bixler et al., WO 89/06974）。

ｃ．大きなペプチド担体タンパク質は、標的部位ではなく、主に担体タンパク質に誤って向けられた無関係な免疫応答を誘発する（Cease et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1987; 84: 4249-4253）。そして。

ｄ．担体タンパク質はまた、同じ担体タンパク質を含む免疫原で以前に免疫された宿主においてエピトープ抑制の可能性を導入する。引き続いて、同じ担体タンパク質が異なるハプテンに結合している別の免疫原で宿主を免疫すると、結果として生じる免疫応答は、担体タンパク質では増強されるが、ハプテンでは阻害される（Schutze et al., J Immunol, 1985; 135: 2319-2322）。

上記のリスクを回避するために、従来の担体タンパク質を使用せずにＴ細胞の補助を引き出すことが望ましい。

参照による組み込み
本出願で引用された各特許、刊行物、及び非特許文献は、あたかもそれぞれが参照により個別に組み込まれたかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

図１：正常なドナーのナイーブ末梢血単核細胞における無差別及び人工のＴｈペプチド応答性Ｔ細胞の検出。

本開示は、治療効果のために機能的な部位特異的抗体応答を刺激し得るペプチド免疫原を産生するために使用され得る無差別な人工Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープを提供する。開示された人工Ｔｈエピトープは、任意選択のスペーサーを介して、合成ペプチドＢ細胞エピトープ（「標的抗原性部位」）に連結されて、免疫原性ペプチドを生成し得る。免疫原性ペプチドはまた、一般的な免疫刺激配列を含む他の構成要素も含み得る。

人工Ｔｈエピトープは、強力なＴヘルパー細胞性免疫応答を誘導する能力をペプチド免疫原に付与し、「標的抗原性部位」に対する高レベルの抗体を産生する。本発明はさらに、確立されたペプチド免疫原における担体タンパク質及び病原体由来Ｔヘルパー細胞部位の、それらの免疫原性を改善するために特別に設計された人工Ｔｈエピトープによる有利な置換を提供する。本発明の人工Ｔｈエピトープを有する短いペプチド免疫原は、著しい炎症反応を引き起こすことなく、特定の標的抗原性部位Ｂ細胞エピトープを標的とする高レベルの抗体を誘発する。

本発明の人工Ｔｈエピトープは、標的抗原性部位に、そして任意選択で免疫刺激配列に連結され得る。本発明の免疫原性ペプチドは、以下の式で表され得る：
（Ａ）_ｎ−（標的抗原性部位）−（Ｂ）_ｏ−（Ｔｈ）_ｍ−Ｘ
または
（Ａ）_ｎ−（Ｂ）_ｏ−（Ｔｈ）_ｍ−（Ｂ）_ｏ−（標的抗原性部位）−Ｘ
または
（Ａ）_ｎ−（Ｔｈ）_ｍ−（Ｂ）_ｏ−（標的抗原性部位）−Ｘ
または
（標的抗原性部位）−（Ｂ）_ｏ−（Ｔｈ）_ｍ−（Ａ）_ｎ−Ｘ
または
（Ｔｈ）_ｍ−（Ｂ）_ｏ−（標的抗原性部位）−（Ａ）_ｎ−Ｘ
ここで：
各Ａは独立して、アミノ酸であり；
各Ｂは独立してアミノ酸、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＯ−、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＯ（εＮ）Ｌｙｓ−、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２Ｓ−スクシンイミジル（εＮ）Ｌｙｓ−、または−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２Ｓ−（スクシンイミジル）−であり；
各Ｔｈは独立して人工Ｔｈ細胞エピトープ、その類縁体またはセグメントであり、
標的抗原性部位は、Ｂ細胞エピトープ、そのペプチドハプテン、または免疫学的に反応性の類縁体であり、
Ｘは、アミノ酸、α−ＣＯＯＨ、または−ＣＯＮＨ_２であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍは、１、２、３、または４であり；かつ
ｏは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。

標的抗原性部位としてのペプチドハプテンの例は、ベータアミロイド（Ａβ）タンパク質のアミノ酸_１−１４（Ａβ_１−１４）である（配列番号５６）。

本発明の組成物は、免疫された宿主において、所望の標的抗原性部位に対する抗体応答を誘発し得るペプチドを含む。標的抗原性部位は、病原性生物、通常は免疫サイレント自己抗原及び腫瘍関連標的に由来し得る。

したがって、本発明の組成物は、多くの多様な医学的及び獣医学的用途において有用である。これらとしては、感染症からの防御免疫を提供するワクチン、正常な生理学的プロセスの機能不全から生じる障害の治療のための免疫療法、がんの治療のための免疫療法、及び正常な生理学的プロセスに望ましく介入して改変する薬剤が挙げられる。

本発明のＴｈエピトープに共有結合し得るいくつかの標的抗原としては、以下の部分：いくつか例を挙げれば、アルツハイマー病の治療のためのベータアミロイド（Ａβ）、パーキンソン病の治療のためのアルファシヌクレイン（α−Ｓｙｎ）、アレルギー性疾患の治療のための膜結合ＩｇＥ（またはＩｇＥ ＥＭＰＤ）の細胞外膜近位ドメイン、アルツハイマー病を含むタウオパチーの治療のためのタウ、及びアトピー性皮膚炎の治療のためのインターロイキン−３１（ＩＬ−３１）が挙げられる。さらに具体的には、Ａβ_１−１４（米国特許第9,102,752号に記載）、α−Ｓｙｎ_{１２６−１３５}（米国仮出願第62/521,287号に記載）、ＩｇＥ ＥＭＰＤ_１−３９（国際ＰＣＴ出願第PCT/US2017/069174号に記載）、Ｔａｕ_{３７９−４０８}（米国仮出願第62/578,124号に記載）、及びＩＬ−３１_{９７−１４４}（米国仮出願第62/597,130号に記載）である。

いくつかの実施形態では、本発明は、ペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含む状態を治療する方法を提供し、このペプチドは、Ｔヘルパー細胞エピトープ及び抗原提示エピトープを含み、このペプチドは、陽性対照の免疫原性炎症反応よりも少なくとも約３倍低い、免疫原性炎症応答を生成する。

発明の詳細な説明

本開示は、治療効果のために機能的な部位特異的抗体応答を刺激し得るペプチド免疫原を産生するために使用され得る無差別な人工Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープを提供する。開示された人工Ｔｈエピトープは、任意選択のスペーサーを介して、合成ペプチドＢ細胞エピトープ（「標的抗原性部位」）に連結されて、免疫原性ペプチドを生成し得る。

人工Ｔｈエピトープは、ペプチド免疫原に強力なＴヘルパー細胞性免疫応答を誘導する能力を付与し、「標的抗原性部位」に対する高レベルの抗体を産生する。本発明はさらに、確立されたペプチド免疫原における担体タンパク質及び病原体由来Ｔヘルパー細胞部位の、それらの免疫原性を改善するために特別に設計された人工Ｔｈエピトープによる、有利な置換を提供する。本発明の人工Ｔｈエピトープを有する短いペプチド免疫原は、著しい炎症反応を引き起こすことなく、特定の標的抗原性部位Ｂ細胞エピトープを標的とする高レベルの抗体を誘発する。

本開示のペプチド免疫原は、所望の標的抗原性部位に対して免疫化された宿主において抗体応答を誘発し得る。いくつかの実施形態では、この抗原性部位は、病原性生物（例えば、ＦＭＤＶ ＶＰ１、ＰＲＲＳＶ ＧＰ５など）から取られる。いくつかの実施形態では、抗原性部位は、通常は免疫サイレントな自己抗原または腫瘍関連標的（例えば、Ａβ、タウ（Ｔａｕ）、アルファシヌクレイン、ＩｇＥ ＥＭＰＤ、ＩＬ−３１など）から取られる。

本開示は、特定のタンパク質を標的とする抗体を誘発するペプチド免疫原を提供するために使用され得る人工Ｔｈエピトープを記載している。標的抗原性部位は、任意の標的ペプチドまたはタンパク質由来の任意のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示は、アミロイドβ（Ａβ）、口蹄疫（ＦＭＤ）キャプシドタンパク質、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）由来の糖タンパク質、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、及び任意の他のペプチドまたはタンパク質配列を標的とする抗体を誘発するペプチド免疫原を提供するために使用され得る人工Ｔｈエピトープを記載する。

本発明のペプチドは、医学的及び獣医学的用途において有用であり得る。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、感染症または神経変性疾患からの防御免疫を提供するためのワクチンとして、正常な生理学的プロセスの機能不全に起因する障害を治療するためのワクチンとして、がんを治療するための免疫療法として、及び正常な生理学的プロセスに介入する薬剤として使用され得る。

ペプチド免疫原
本明細書で使用される「ペプチド免疫原」という用語は、単一のより大きなペプチドを形成するように従来のペプチド結合を介して、またはチオエステルなどの他の形態の共有結合を介して、標的抗原性部位に共有結合したＴｈエピトープを含む分子を指す。

本開示は、ペプチド免疫原及びペプチド免疫原を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドは、人工異種Ｔｈエピトープ、Ｂ細胞エピトープを含む標的抗原性部位、及び任意選択の異種スペーサーを含む。

ペプチド免疫原に人工Ｔｈエピトープが存在すると、強力なＴｈ細胞性免疫応答を誘発し得る。いくつかの実施形態では、免疫原性ペプチドにおける人工的な異種Ｔｈエピトープの存在は、標的抗原性部位に向けられた高レベルの抗体を産生し得る。いくつかの実施形態では、本開示は、免疫原性を改善するように設計された人工異種Ｔｈ細胞エピトープによる、確立されたペプチド免疫原における担体タンパク質及び病原体由来Ｔｈ細胞部位の有利な置換を記載する。いくつかの実施形態では、人工Ｔｈエピトープを有するペプチド免疫原は、Ｂ細胞エピトープ（例えば、Ａβ、タウ、アルファシヌクレイン、ＩｇＥ ＥＭＰＤ、ＩＬ−３１など）を標的とする高レベルの抗体産生を誘発し得る。

いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性ペプチドは、以下の式によって表され得、
（Ａ）_ｎ−（標的抗原性部位）−（Ｂ）_ｏ−（Ｔｈ）_ｍ−Ｘ
または
（Ａ）_ｎ−（Ｂ）_ｏ−（Ｔｈ）_ｍ−（Ｂ）_ｏ−（標的抗原性部位）−Ｘ
または
（Ａ）_ｎ−（Ｔｈ）_ｍ−（Ｂ）_ｏ−（標的抗原性部位）−Ｘ
または
（標的抗原性部位）−（Ｂ）_ｏ−（Ｔｈ）_ｍ−（Ａ）_ｎ−Ｘ
または
（Ｔｈ）_ｍ−（Ｂ）_ｏ−（標的抗原性部位）−（Ａ）_ｎ−Ｘ
式中：
各Ａは独立してアミノ酸であり、
各Ｂは独立してアミノ酸、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＯ−、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＯ（εＮ）Ｌｙｓ−、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２Ｓ−スクシンイミジル（εＮ）Ｌｙｓ−、または−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２Ｓ−（スクシンイミジル）−であり、
各Ｔｈは独立して人工Ｔｈ細胞エピトープ、その類縁体またはセグメントであり、
標的抗原性部位は、Ｂ細胞エピトープ、そのペプチドハプテン、または免疫学的に反応性の類縁体であり、
Ｘは、アミノ酸、α−ＣＯＯＨ、または−ＣＯＮＨ_２であり、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；
ｍは、１、２、３、または４であり；かつ
ｏは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。

本開示のペプチド免疫原は、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、または約１００アミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチド免疫原は、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、または約８０アミノ酸残基を含み得る。

Ａ−アミノ酸
本開示の免疫原性ペプチド中の各Ａは、独立して、異種アミノ酸配列である。

本明細書で使用される「異種」という用語は、標的抗原性部位（Ｂ細胞エピトープ）の野生型アミノ酸配列の一部でもなく、またはそれと相同でもないアミノ酸配列を指す。したがって、Ａの異種アミノ酸配列は、標的抗原性部位のタンパク質またはペプチドには天然には見られないアミノ酸配列を含む。構成要素Ａの配列は、標的抗原性部位と異種であるため、構成要素Ａが標的抗原性部位に共有結合している場合、標的抗原性部位の天然アミノ酸配列は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれの方向にも伸長されない。

いくつかの実施形態では、各Ａは、独立して、非天然または天然に存在するアミノ酸である。

天然に存在するアミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンが挙げられる。

天然に存在しないアミノ酸としては、限定するものではないが、ε−Ｎリジン、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリン、アミノ安息香酸、６−アミノカプロン酸（Ａｃａ；６−アミノヘキサン酸）、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、３−ニトロチロシン、ピログルタミン酸などが挙げられる。

いくつかの実施形態では、ｎは１より大きく、各Ａは独立して同じアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ｎは１より大きく、各Ａは独立して異なるアミノ酸である。

Ｂ−任意選択の異種スペーサー
本開示の免疫原性ペプチドの各Ｂは、任意の異種スペーサーである。

上記のように、「異種」という用語は、標的抗原性部位（Ｂ細胞エピトープ）の野生型アミノ酸配列の一部ではない、または相同ではないアミノ酸を指す。したがって、スペーサーがアミノ酸である場合、スペーサーは、標的抗原性部位のタンパク質またはペプチドに天然には見られないアミノ酸配列を含む。構成要素Ｂの配列は、標的抗原性部位と異種であるため、構成要素Ｂが標的抗原性部位に共有結合している場合、標的抗原性部位の天然アミノ酸配列は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれの方向にも伸長されない。

構成要素Ｂの任意選択の異種スペーサーは、独立してアミノ酸、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＯ−、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＯ（εＮ）Ｌｙｓ−、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２Ｓ−スクシンイミジル（εＮ）Ｌｙｓ−、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２Ｓ−（スクシンイミジル）−、及び／または任意のそれらの組み合わせである。このスペーサーは、構成要素Ａについて上で説明したように、１つ以上の天然または非天然に存在するアミノ酸残基を含んでもよい。

このスペーサーは、Ｔｈエピトープと標的抗原性部位の分離を増強するための可塑性ヒンジスペーサーであってもよい。いくつかの実施形態では、可塑性ヒンジ配列は、プロリンに富んでいる場合もある。特定の実施形態では、可塑性ヒンジは、免疫グロブリン重鎖に見られる可塑性ヒンジ領域からモデル化された配列Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（配列番号５５）を有する。その中のＸａａは、任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、Ｘａａはアスパラギン酸である。いくつかの実施形態では、スペーサーによって提供される立体配座分離は、提示されたペプチド免疫原と適切なＴｈ細胞及びＢ細胞との間のより効率的な相互作用を可能にし得る。Ｔｈエピトープに対する免疫応答を増強して、免疫反応性を改善してもよい。

ｏ＞１の場合、各Ｂは独立して同じまたは異なる。いくつかの実施形態では、Ｂは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（配列番号５５）、εＮＬｙｓ、εＮＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号５３）、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＯ−、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＯ（εＮＬｙｓ）−、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２Ｓ−スクシンイミジル−εＮＬｙｓ−、または−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２Ｓ−（スクシンイミジル）−、及び／または任意のそれらの組み合わせである。

例示的な異種スペーサーを表２に示す。

標的抗原性部位
本開示は、特定のタンパク質を標的とする抗体を誘発するペプチド免疫原を提供するために使用され得る人工Ｔｈエピトープを記載している。標的抗原性部位は、外来または自己ペプチドまたはタンパク質を含む、任意の標的ペプチドまたはタンパク質由来の任意のアミノ酸配列を含んでもよい。

いくつかの実施形態では、本開示は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）を標的とする抗体を誘発するペプチド免疫原を提供するために使用し得る人工Ｔｈエピトープを記載する（例えば、米国特許第6,025,468号、第6,228,987号、第6,559,282号、及び米国特許出願公開番号2017/0216418）；アミロイドβ（Ａβ）（例えば、米国特許第6,906,169号、第7,951,909号、第8,232,373号、及び第9,102,752号）；口蹄疫キャプシドタンパク質（例えば、米国特許第6,048,538号、第6,107,021号、及び米国公開第2015/0306203号）；ＨＩＶ感染の予防及び治療のためのＨＩＶビリオンエピトープ（例えば、米国特許第5,912,176号、第5,961,976号、及び第6,090,388号）；２型ブタサーコウイルス（ＰＣＶ２）由来のキャプシドタンパク質（例えば、米国公開番号2013/0236487）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）由来の糖タンパク質（例えば、米国公開番号2014/0335118）、ＩｇＥ（例えば、米国公開番号7648701号及び同第6811782号）、アルファ−シヌクレイン（α−Ｓｙｎ）（米国仮出願番号62/521,287）、膜結合型ＩｇＥ（またはＩｇＥ ＥＭＰＤ）の細胞外膜近位ドメイン（国際ＰＣＴ出願番号PCT/US2017/069174）、タウ（Ｔａｕ）（米国仮出願第62/578,124号）、及びインターロイキン−３１（ＩＬ−３１）（米国仮出願第62/597,130号）、マラリア予防のためのプラスモジウムのＣＳ抗原；動脈硬化症の予防及び治療のためのＣＥＴＰ；ならびに任意の他のペプチドまたはタンパク質配列。全ての特許及び特許刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

例示的な標的抗原性部位を表３に示す。

Ｔｈ−Ｔヘルパーエピトープ
ペプチド免疫原構築物のＴｈエピトープは、標的抗原性部位の免疫原性を高め、合理的な設計により、最適化された標的Ｂ細胞エピトープに対する特定の高力価抗体の産生を促進する。

いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは、異種配列である。上記のように、「異種」という用語は、標的抗原性部位の野生型配列の一部でもなく、それと相同でもないアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を指す。したがって、異種Ｔｈエピトープは、標的抗原性部位に天然には見られないアミノ酸配列に由来するＴｈエピトープである。Ｔｈエピトープは、標的抗原性部位に対して異種であるので、異種Ｔｈエピトープが標的抗原性部位に共有結合している場合、標的抗原性部位の天然アミノ酸配列は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれの方向にも伸長されない。

Ｔｈエピトープは、任意の種（例えば、ヒト、ブタ、ウシ、イヌ、ラット、マウス、モルモットなど）に由来するアミノ酸配列を有し得る。Ｔｈエピトープは、複数の種のＭＨＣクラスＩＩ分子への無差別結合モチーフも有してもよい。特定の実施形態では、Ｔｈエピトープは、免疫応答の開始及び調節をもたらすＴヘルパー細胞の最大の活性化を可能にするために、複数の無差別ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフを含む。Ｔｈエピトープは、それ自体で免疫サイレントであることが好ましく、すなわち、ペプチド免疫原構築物によって生成される抗体のうち、あってもごくわずかしかＴｈエピトープに向けられないため、標的抗原性部位に向けられる非常に集中した免疫応答が可能になる。

エピトープのサイズは、約１５〜約５０アミノ酸残基の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０のアミノ酸残基を有し得る。Ｔｈエピトープは、共通の構造的特徴及び特定のランドマーク配列を共有し得る。いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは、両親媒性ヘリックス、すなわち、疎水性アミノ酸残基がヘリックスの１つの面を支配し、かつ荷電及び極性残基が周囲の面を支配するアルファヘリックス構造を有する。

WO1999/066957のＴｈエピトープ及び開示、ならびに対応する米国特許第6,713,301号は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

無差別なＴｈ決定基は、免疫原性の低いペプチドを増強するのに効果的であり得る。十分に設計された無差別Ｔｈ／Ｂ細胞エピトープキメラペプチドは、遺伝的に多様な集団のほとんどのメンバーのＢ細胞部位を標的とする抗体応答で、Ｔｈ応答を誘発し得る。いくつかの実施形態では、Ｔｈ細胞は、ペプチド担体を十分に特徴付けられた無差別Ｔｈ決定基に共有結合させることによって、標的抗原ペプチドに供給され得る。

無差別Ｔｈエピトープには、追加の一次アミノ酸パターンを含み得る。いくつかの実施形態では、無差別Ｔｈエピトープは、ロスバード（Ｒｏｔｈｂａｒｄ）配列を含み得、ここで、無差別Ｔｈエピトープは、荷電残基（例えば、−Ｇｌｙ−）、続いて２から３つの疎水性残基、続いて荷電または極性残基（Rothbard and Taylor, EMBO J, 1988; 7: 93-101）を含む。無差別Ｔｈエピトープは、１、４、５、及び８の規則に従い得、ここでは正に帯電した残基の後に、同じ面に配置された位置１、４、５及び８を有する両親媒性ヘリックスと一致する４、５、及び８番目の位置に疎水性残基が続く。いくつかの実施形態では、疎水性及び荷電及び極性アミノ酸の１、４、５、８パターンは、単一のＴｈエピトープ内で繰り返され得る。いくつかの実施形態では、無差別Ｔ細胞エピトープは、ロスバード配列または１、４、５、８の規則に従うエピトープのうちの少なくとも１つを含み得る。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは、２つ以上のロスバード配列を含む。

病原体に由来する無差別Ｔｈエピトープとしては、限定するものではないが、Ｂ型肝炎表面Ｔｈ細胞エピトープ（ＨＢｓＡｇ Ｔｈ）、Ｂ型肝炎コア抗原Ｔｈ細胞エピトープ（ＨＢｃ Ｔｈ）、百日咳毒素Ｔｈ細胞エピトープ（ＰＴ Ｔｈ）、破傷風毒素Ｔｈ細胞エピトープ（ＴＴ Ｔｈ）、麻疹ウイルスＦタンパク質Ｔｈ細胞エピトープ（ＭＶＦ Ｔｈ）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）主要外膜タンパク質Ｔｈ細胞エピトープ（ＣＴ Ｔｈ）、ジフテリア毒素Ｔｈ細胞エピトープ（ＤＴ Ｔｈ）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）スポロゾイト周囲（circumsporozoite）Ｔｈ細胞エピトープ（ＰＦ Ｔｈ）、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）トリオースリン酸イソメラーゼＴｈ細胞エピトープ（ＳＭ Ｔｈ）、及びEscherichia coli ＴｒａＴ Ｔｈ細胞エピトープ（ＴｒａＴ Ｔｈ）、破傷風菌（Clostridium tetani）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、コレラ毒素（Cholera Toxin）、インフルエンザ（Influenza）ＭＰ１、インフルエンザＮＳＰ１、エプスタイン・バー（Epstein Barr）ウイルス（ＥＢＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）。本開示で使用されるＴｈエピトープの例を、表１に示す。

いくつかの実施形態では、本開示のＴｈエピトープは、類似のアミノ酸配列を含むペプチドの混合物を含むコンビナトリアルＴｈエピトープであってもよい。コンビナトリアル人工Ｔｈエピトープとも呼ばれる、構造化合成抗原ライブラリー（ＳＳＡＬ）は、特定の位置に置換がある不変残基の構造フレームワークの周りに組織化されたアミノ酸配列を有する多数のＴｈエピトープを含む。ＳＳＡＬエピトープの配列は、比較的不変の残基を保持し、他の残基を変化させて、多様なＭＨＣ制限要素の認識を提供することによって決定される。ＳＳＡＬエピトープの配列は、無差別Ｔｈの一次アミノ酸配列を整列させること、骨格フレームワークとしてＴｈペプチドの固有の構造を担う残基を選択及び保持すること、ならびに公知のＭＨＣ制限要素に従って残りの残基を変化させることによって決定され得る。ＭＨＣ制限要素の好ましいアミノ酸を有する不変及び可変位置を使用して、ＴｈエピトープのＳＳＡＬを設計するために使用し得るＭＨＣ結合モチーフを得ることが可能である。

コンビナトリアル配列として提示される異種Ｔｈエピトープペプチドは、その特定のペプチドの相同体の可変残基に基づいて、ペプチドフレームワーク内の特定の位置に表されるアミノ酸残基の混合物を含む。いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープライブラリー配列は、無差別なＴｈエピトープの構造モチーフを維持し、より広範囲のハプロタイプに対する反応性に対応するように設計されている。いくつかの実施形態では、ＳＳＡＬのメンバーは、麻疹ウイルスのＦタンパク質から取られた無差別エピトープ（例えば、配列番号１〜５）をモデルにした縮重ＴｈエピトープＳＳＡＬ１ Ｔｈ１であり得る。他の実施形態では、ＳＳＡＬのメンバーは、ＨＢｓＡｇ１から取られた無差別エピトープ（例えば、配列番号１９〜２４）をモデルとした縮重ＴｈエピトープＳＳＡＬ２ Ｔｈ２であり得る。

合成後にコンビナトリアル人工Ｔｈエピトープ（またはＳＳＡＬ）の混合物に存在するペプチドの総数は、各可変位置で利用可能な任意選択の数を掛け合わせることによって計算され得る。例えば、配列番号１６は、５つの可変位置を含み、各可変位置には２つの異なる残基のオプションがあるので（つまり、２ｘ２ｘ２ｘ２ｘ２＝２^５＝３２）、３２の異なるペプチドの組み合わせに相当する。同様に、配列番号５は、５２４，２８８個の異なるペプチドの組み合わせに相当する（すなわち、２ｘ４ｘ２ｘ４ｘ２ｘ４ｘ４ｘ４ｘ２ｘ４ｘ２ｘ４＝２^５ｘ４^７＝５２４，２８８）。コンビナトリアル人工Ｔｈエピトープ配列には、（ａ）可変配列に含まれる全てのペプチドの混合物、及び（ｂ）組み合わせ内に単一配列を含む各々の個々のペプチド、が含まれる。

いくつかの実施形態では、荷電残基ＧｌｕまたはＡｓｐを位置１に付加して、Ｔｈの疎水性面を取り巻く電荷を増加し得る。いくつかの実施形態では、両親媒性ヘリックスの疎水性面は、２、５、８、９、１０、１３及び１６の疎水性残基によって維持され得る。いくつかの実施形態では、２、５、８、９、１０、及び１３のアミノ酸残基は、広範囲のＭＨＣ制限要素に結合する能力を備えたファサード（ｆａｃａｄｅ）を提供するために変更してもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸残基の変動は、人工Ｔｈエピトープの免疫応答性の範囲を拡大し得る。

人工Ｔｈエピトープは、既知の無差別Ｔｈエピトープの全ての特性及び特徴を組み込み得る。いくつかの実施形態では、人工Ｔｈエピトープは、ＳＳＡＬのメンバーである。いくつかの実施形態では、人工Ｔｈ部位を、自己抗原及び外来抗原から取られたペプチド配列と組み合わせて、部位特異的標的に対する増強された抗体応答を提供し得る。いくつかの実施形態では、人工Ｔｈエピトープ免疫原は、効果的かつ安全な抗体応答を提供し得、高い免疫効力を示し得、そして広い反応性応答性を示し得る。

理想化された人工Ｔｈエピトープも提供される。これらの理想化された人工Ｔｈエピトープは、ＷＯ９５／１１９９８に開示されている２つの公知の天然Ｔｈエピトープ及びＳＳＡＬペプチドプロトタイプをモデルにしている。ＳＳＡＬＳは、遺伝的に多様な集団のメンバー間で幅広い免疫応答を誘発することを目的としたコンビナトリアルＭＨＣ分子結合モチーフ（Meister et al., 1995）を組み込んでいる。ＳＳＡＬペプチドのプロトタイプは、複数のＭＨＣ結合モチーフを導入することによって変更された、麻疹ウイルス及びＢ型肝炎ウイルス抗原のＴｈエピトープに基づいて設計された。他のＴｈエピトープの設計は、複数のＭＨＣ結合モチーフを単純化、追加、及び／または変更して、一連の新規な人工Ｔｈエピトープを生成することにより、他の公知のＴｈエピトープをモデルとした。無差別な人工Ｔｈ部位は、さまざまな標的抗原性部位を保有する合成ペプチド免疫原に組み込まれた。得られたキメラペプチドは、標的抗原性部位に対する効果的な抗体応答を刺激し得た。

表１に「ＳＳＡＬ１ＴＨ１」として示されているプロトタイプの人工ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープ、４つのペプチドの混合物（配列番号１〜４）は、麻疹ウイルスのＦタンパク質の無差別Ｔｈエピトープからモデル化された理想的なＴｈエピトープである（Ｐａｒｔｉｄｏｓ ｅｔ ａｌ．１９９１）。表１に「ＭＶＦ Ｔｈ（ＵＢＩＴｈ（登録商標）５）」（配列番号６）として示されているモデルＴｈエピトープは、麻疹ウイルスＦタンパク質の残基２８８−３０２に対応する。ＭＶＦ Ｔｈ（配列番号６）は、１位に荷電残基Ｇｌｕ／Ａｓｐを付加して、エピトープの疎水性面を取り巻く電荷を増大させることによって；位置４、６、１２、及び１４に荷電残基またはＧｌｙを追加または保持することによって；ならびに「ロスバード規則」に従って、位置７及び１１に荷電残基またはＧｌｙを追加または保持することによって、ＳＳＡＬ１ Ｔｈ１プロトタイプ（配列番号１〜４）に対して修飾された。Ｔｈエピトープの疎水性面は、位置２、５、８、９、１０、１３、及び１６に残基を含む。無差別エピトープと一般的に会合する疎水性残基をこれらの位置で置換して、コンビナトリアルＴｈＳＳＡＬエピトープ、ＳＳＡＬ１ Ｔｈ１（配列番号１〜４）を得た。プロトタイプＳＳＡＬ１ Ｔｈ１（配列番号１〜４）の別の重要な特徴は、ＭＨＣ結合モチーフを模倣するために、位置１及び４が位置９の両側のパリンドロームとして不完全に繰り返されるということである。ＳＳＡＬ１ Ｔｈ１のこの「１、４、９」パリンドロームパターンは、元のＭｖＦモデルＴｈ（配列番号６）の配列をより厳密に反映するように、配列番号２（表１）でさらに変更された。

コンビナトリアル人工Ｔｈエピトープを単純化して、一連の単一配列エピトープを提供してもよい。例えば、配列番号５のコンビナトリアル配列は、配列番号１〜４によって表される単一配列Ｔｈエピトープに単純化され得る。これらの単一配列のＴｈエピトープは、標的抗原性部位に結合して、免疫原性を高め得る。

いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープの免疫原性は、Ｎ末端を非極性及び極性非荷電アミノ酸、例えば、Ｉｌｅ及びＳｅｒで延長すること、ならびにＣ末端を荷電及び疎水性アミノ酸、例えば、Ｌｙｓ及びＰｈｅで延長することによって改善され得る。さらに、Ｔｈエピトープへのリジン残基または複数のリジン残基（例えば、ＫＫＫ）の付加は、ペプチドの水への溶解度を改善し得る。さらなる改変には、一般的なＭＨＣ結合モチーフＡｘＴｘＩＬによるＣ末端の置換が含まれていた（Meister et al, 1995）。

人工Ｔｈエピトープは、公知の天然ＴｈエピトープまたはＳＳＡＬペプチドプロトタイプであり得る。いくつかの実施形態では、ＳＳＡＬ由来のＴｈエピトープは、遺伝的に多様な集団のメンバーの間で広範な免疫応答を誘発することを目的としたコンビナトリアルＭＨＣ分子結合モチーフを組み込み得る。いくつかの実施形態では、ＳＳＡＬペプチドプロトタイプは、複数のＭＨＣ結合モチーフを導入することによって改変された、麻疹ウイルス及びＢ型肝炎ウイルス抗原のＴｈエピトープに基づいて設計され得る。いくつかの実施形態では、人工Ｔｈエピトープは、複数のＭＨＣ結合モチーフを単純化、追加、または及び／または改変して、一連の新規な人工Ｔｈエピトープを生成してもよい。いくつかの実施形態では、新たに適合された無差別人工Ｔｈ部位は、様々な標的抗原性部位を保有する合成ペプチド免疫原に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、得られるキメラペプチドは、標的抗原性部位に対する効果的な抗体応答を刺激し得る。

本開示の人工Ｔｈエピトープは、クラスＩＩ ＭＨＣ分子結合部位を含む天然または非天然アミノ酸の連続配列であり得る。いくつかの実施形態では、人工Ｔｈエピトープは、標的抗原性部位に対する抗体応答を増強または刺激し得る。いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは、連続的または不連続的なアミノ酸セグメントからなってもよい。いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープの全てのアミノ酸がＭＨＣ認識に関与しているわけではない。いくつかの実施形態では、本発明のＴｈエピトープは、免疫増強相同体、交差反応性相同体、及びそれらのセグメントなどの免疫学的に機能的な相同体を含んでもよい。いくつかの実施形態では、機能的Ｔｈ相同体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失、及び挿入をさらに含み得、そしてＴｈエピトープのＴｈ刺激機能を提供し得る。

エピトープは標的部位に直接付着されてもよい。いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは、任意の異種スペーサー、例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙまたは（ε−Ｎ）Ｌｙｓなどのペプチドスペーサーを通じて標的部位に付着され得る。スペーサーは、ＴｈエピトープをＢ細胞エピトープから物理的に分離し、Ｔｈエピトープまたは機能的相同体と標的抗原性部位との結合によって作成された任意の人工二次構造の形成を破壊し得、それによってＴｈ及び／またはＢ細胞応答との干渉を排除する。

Ｔｈエピトープは、表１に示されるように、理想化された人工Ｔｈエピトープ及びコンビナトリアルの理想化された人工Ｔｈエピトープを含む。いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは、配列番号１〜５２の無差別Ｔｈ細胞エピトープ、その任意の相同体、及び／またはその任意の免疫学的類縁体である。Ｔｈエピトープには、Ｔｈエピトープの免疫学的類縁体も含まれる。免疫学的Ｔｈ類縁体としては、免疫増強類縁体、交差反応性類縁体、及び標的抗原性部位に対する免疫応答を増強または刺激するのに十分な任意のこれらのＴｈエピトープのセグメントが挙げられる。

Ｔｈエピトープペプチドの機能的免疫学的類縁体もまた有効であり、本発明の一部として含まれる。機能的免疫学的Ｔｈ類縁体は、ＴｈエピトープのＴｈ刺激機能を本質的に改変しない、Ｔｈエピトープにおける１〜約５個のアミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失及び挿入を含み得る。保存的置換、付加、及び挿入は、標的抗原性部位について上記したように、天然または非天然アミノ酸を用いて達成され得る。表１は、Ｔｈエピトープペプチドの機能的類縁体の別のバリエーションを特定している。特に、ＭｖＦ１及びＭｖＦ２ Ｔｈの配列番号６及び７は、欠失（配列番号６及び７）またはそれぞれＮ末端及びＣ末端に２つのアミノ酸を含めること（配列番号１６及び１７）によってアミノ酸フレームが異なるという点で、ＭｖＦ４及びＭｖＦ５の配列番号１６及び１７の機能的類縁体である。これらの２つの一連の類縁体配列の間の相違は、これらの配列に含まれるＴｈエピトープの機能に影響を与えない。したがって、機能的な免疫学的Ｔｈ類縁体には、麻疹ウイルス融合タンパク質ＭｖＦ１−４ Ｔｈ（配列番号６−１８）及び肝炎表面タンパク質ＨＢｓＡｇ １−３ Ｔｈ（配列番号１９−３１）に由来するＴｈエピトープのいくつかのバージョンが含まれる。

ペプチド免疫原構築物のＴｈエピトープは、標的抗原性部位のＮ末端またはＣ末端のいずれかで共有結合して、キメラＴｈ／Ｂ細胞部位ペプチド免疫原を生成し得る。いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは、化学的カップリングを介して、または直接合成を介して、標的抗原性部位に共有結合され得る。いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは、標的抗原性部位のＮ末端に共有結合されている。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは、標的抗原性部位のＣ末端に共有結合されている。特定の実施形態では、２つ以上のＴｈエピトープが標的抗原性部位に共有結合されている。２つ以上のＴｈエピトープが標的抗原性部位に連結されている場合、各Ｔｈエピトープは同じアミノ酸配列を有しても、または異なるアミノ酸配列を有してもよい。さらに、２つ以上のＴｈエピトープが標的抗原性部位に連結されている場合、Ｔｈエピトープは任意の順序で配置されてもよい。例えば、Ｔｈエピトープは、標的抗原性部位のＮ末端に連続的に連結されてもよいし、もしくは標的抗原性部位のＣ末端に連続的に連結されてもよく、または別のＴｈエピトープが標的抗原性部位のＣ末端に共有結合したままで、Ｔｈエピトープが、標的抗原性部位のＮ末端に共有結合されてもよい。標的抗原性部位に関連するＴｈエピトープの配置に制限はない。

いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは、標的抗原性部位に直接共有結合されている。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは、以下でさらに詳細に説明される異種スペーサーを通じて標的抗原性部位に共有結合されている。

合成の方法
本開示のペプチド免疫原は、化学的方法を使用して合成してもよい。いくつかの実施形態では、本開示のペプチド免疫原は、固相ペプチド合成を使用して合成してもよい。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、α−ＮＨ_２または側鎖アミノ酸を保護するためにｔ−ＢｏｃまたはＦｍｏｃを使用する自動メリフィールド固相ペプチド合成を使用して合成される。

コンビナトリアル配列として提示された異種Ｔｈエピトープペプチドは、その特定のペプチドの相同体の可変残基に基づいて、ペプチドフレームワーク内の特定の位置に表されるアミノ酸残基の混合物を含む。コンビナトリアルペプチドのアセンブリは、合成プロセス中の指定された位置に、特定の１つのアミノ酸ではなく、指定された保護されたアミノ酸の混合物を追加することにより、１つのプロセスで合成され得る。このようなコンビナトリアル異種Ｔｈエピトープペプチドアセンブリは、多様な遺伝的背景を有する動物に幅広いＴｈエピトープカバレッジを可能にし得る。異種Ｔｈエピトープペプチドの代表的なコンビナトリアル配列には、表１に示される配列番号５、１０、１３、１６、２４、及び２７が含まれる。本発明のＴｈエピトープペプチドは、遺伝的に多様な集団由来の動物及び患者に幅広い反応性及び免疫原性を提供する。

興味深いことに、Ｔｈエピトープ、Ｂ細胞エピトープ、及び／またはＴｈエピトープ及びＢ細胞エピトープを含むペプチド免疫原構築物の合成中に導入され得る不整合及び／またはエラーは、ほとんどの場合、治療された動物において、望ましい免疫応答を妨害することも、妨げることもない。実際、ペプチド合成中に導入され得る不整合／エラーは、標的ペプチド合成とともに複数のペプチド類縁体を生成する。これらの類縁体としては、アミノ酸の挿入、欠失、置換、及び早期終了が挙げられ得る。上記のように、そのようなペプチド類縁体は、免疫診断の目的で固相抗原として、またはワクチン接種の目的で免疫原としてのいずれかで、免疫学的用途で使用される場合、抗原性及び免疫原性への寄与因子としてペプチド調製物に適している。

Ｔｈエピトープを含むペプチド免疫原構築物は、標的抗原性部位と並行して、単一の固相ペプチド合成で同時に生成される。Ｔｈエピトープにはまた、Ｔｈエピトープの免疫学的類縁体も含まれる。免疫学的Ｔｈ類縁体としては、免疫増強類縁体、交差反応性類縁体、及び標的抗原性部位に対する免疫応答を増強または刺激するのに十分なこれらのＴｈエピトープのいずれかのセグメントが挙げられる。

所望のペプチド免疫原の完全なアセンブリ後、固相樹脂を処理して、樹脂からペプチドを切断し、アミノ酸側鎖上の官能基を除去し得る。遊離ペプチドを、ＨＰＬＣで精製し、生化学的に特徴付けし得る。いくつかの実施形態では、遊離ペプチドは、アミノ酸分析を使用して生化学的に特徴付けられる。いくつかの実施形態では、遊離ペプチドは、ペプチド配列を使用して特徴付けられる。いくつかの実施形態では、遊離ペプチドは、質量分析を使用して特徴付けられる。

本発明のペプチド免疫原は、チオエーテル結合の形成を通じてハロアセチル化及びシステイン化（cysteinylated）ペプチドを使用して合成し得る。いくつかの実施形態では、システインは、Ｔｈ含有ペプチドのＣ末端に付加され得、そしてシステイン残基のチオール基は、Ｎ^αクロロアセチル修飾基またはリジン残基のマレイミド誘導体化α−もしくはε−ＮＨ_２基などの求電子性基への共有結合を形成するために使用され得る。得られた合成中間体は、標的抗原性部位ペプチドのＮ末端に結合され得る。

より長い合成ペプチドコンジュゲートは、核酸クローニング技術を使用して合成してもよい。いくつかの実施形態では、本発明のＴｈエピトープは、組換えＤＮＡ及びＲＮＡを発現することによって合成され得る。本発明のＴｈ／標的抗原性部位ペプチドを発現する遺伝子を構築するために、アミノ酸配列を、核酸配列に逆翻訳してもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、遺伝子が発現される生物のために最適化されたコドンを使用して、核酸配列に逆翻訳される。ペプチドをコードする遺伝子を作ってもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドをコードする遺伝子は、ペプチド及び必要な調節エレメントをコードする重複するオリゴヌクレオチドを合成することによって作製され得る。合成遺伝子を組み立てて、所望の発現ベクターに挿入してもよい。

本開示の合成核酸配列は、本発明のＴｈエピトープをコードする核酸配列、Ｔｈエピトープを含むペプチド、その免疫学的に機能的な相同体、及びペプチドの免疫原性を変化させない非コード配列またはコードされたＴｈエピトープの変化を特徴とする核酸構築物を含み得る。合成遺伝子を適切なクローニングベクターに挿入してもよく、組換え体を取得して特徴付けてもよい。次に、Ｔｈエピトープ及びそのＴｈエピトープを含むペプチドは、選択された発現系及び宿主に適切な条件下で発現され得る。Ｔｈエピトープまたはペプチドは、精製及び特徴付けされ得る。

医薬組成物
本開示はまた、本開示のペプチド免疫原を含む医薬組成物を記載する。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、ペプチド免疫原の投与のための薬学的に許容される送達システムとして使用され得る。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、免疫学的に有効な量の１つ以上のペプチド免疫原を含んでもよい。

本発明のペプチド免疫原は、免疫原性組成物として処方され得る。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバント、乳化剤、薬学的に許容される担体、またはワクチン組成物で慣用的に提供される他の構成要素を含んでもよい。本発明で使用できるアジュバントまたは乳化剤としては、ミョウバン、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、エマルシゲン（emulsigen）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、ＱＳ２１、及びＩＳＡ７２０、ＩＳＡ５１、ＩＳＡ３５、ＩＳＡ２０６、ならびにその他の有効なアジュバント及び乳化剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、即時放出のために処方され得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、徐放用に処方されてもよい。

医薬組成物に使用されるアジュバントとしては、油、アルミニウム塩、ビロソーム、リン酸アルミニウム（例えば、ＡＤＪＵ−ＰＨＯＳ（登録商標））、水酸化アルミニウム（例えば、ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、エマルシゲン（登録商標）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＱＳ２１、ＩＳＡ３５、ＩＳＡ２０６、ＩＳＡ５０Ｖ、ＩＳＡ５１、ＩＳＡ７２０、ならびに他のアジュバント及び乳化剤が挙げられ得る。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、モンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）（商標）ＩＳＡ５１（油中水型エマルジョンの製造のための植物油及びオレイン酸マンニドからなる油アジュバント組成物）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（別名：ポリソルベート８０またはポリオキシエチレン（２０））ソルビタンモノオレエート）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、及び／またはそれらの任意の組み合わせを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、アジュバントとしてエマルシゲンまたはエマルシゲンＤを有する水中油中水（すなわち、ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンである。

いくつかの実施形態では、組成物は、ワクチンとして使用するために処方される。ワクチン組成物は、皮下、経口、筋肉内、腹腔内、非経口、または経腸投与を含む任意の便利な経路で投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫原は、単回投与で投与される。いくつかの実施形態では、免疫原は、複数の用量にわたって投与される。

医薬組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかで、注射剤として調製され得る。タウペプチド免疫原構築物を含む液体ビヒクルもまた、注射前に調製され得る。医薬組成物は、任意の適切な適用様式、例えば、ｉ．ｄ．、ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、鼻腔内、経口、皮下などによって、及び任意の適切な送達デバイスで投与され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内投与のために処方される。経口及び鼻腔内適用を含む、他の投与様式に適した医薬組成物も調製され得る。

本発明の組成物は、有効量の１つ以上のペプチド免疫原及び薬学的に許容される担体を含んでもよい。いくつかの実施形態では、適切な単位剤形の組成物は、対象の体重１ｋｇあたり約０．５μｇ〜約１ｍｇのペプチド免疫原を含んでもよい。いくつかの実施形態では、適切な単位剤形の組成物は、対象の体重１ｋｇあたり約１０μｇ、約２０μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約５０μｇ、約６０μｇ、約７０μｇ、約８０μｇ、約９０μｇ、約１００μｇ、約２００μｇ、約３００μｇ、約４００μｇ、約５００μｇ、約６００μｇ、約７００μｇ、約８００μｇ、約９００μｇ、または約１０００μｇのペプチド免疫原を含み得る。いくつかの実施形態では、適切な剤形の組成物は、対象の体重１ｋｇあたり約１００μｇ、約１５０μｇ、約２００μｇ、約２５０μｇ、約３００μｇ、約３５０μｇ、約４００μｇ、約４５０μｇ、または約５００μｇのペプチド免疫原を含んでもよい。いくつかの実施形態では、適切な単位剤形の組成物は、対象の体重１ｋｇあたり約０．５μｇ〜約１ｍｇのペプチド免疫原を含んでもよい。いくつかの実施形態では、適切な単位剤形の組成物は、約１０μｇ、約２０μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約５０μｇ、約６０μｇ、約７０μｇ、約８０μｇ、約９０μｇ、約１００μｇ、約２００μｇ、約３００μｇ、約４００μｇ、約５００μｇ、約６００μｇ、約７００μｇ、約８００μｇ、約９００μｇ、または約１０００μｇのペプチド免疫原を含み得る。いくつかの実施形態では、適切な剤形の組成物は、約１００μｇ、約１５０μｇ、約２００μｇ、約２５０μｇ、約３００μｇ、約３５０μｇ、約４００μｇ、約４５０μｇ、または約５００μｇというペプチド免疫原を含んでもよい。

複数回投与で送達される場合、組成物は、投与ごとに適切な量に分割され得る。いくつかの実施形態では、用量は、約０．２ｍｇ〜約２．５ｍｇである。いくつかの実施形態では、用量は約１ｍｇである。いくつかの実施形態では、用量は約１ｍｇであり、注射によって投与される。いくつかの実施形態では、用量は約１ｍｇであり、筋肉内に投与される。いくつかの実施形態では、投与の後に、反復（ブースター）用量を続けてもよい。投与量は、対象の年齢、体重、及び一般的な健康状態に応じて最適化され得る。

ペプチド免疫原の混合物を含むワクチンは、より広い集団で免疫効率を向上し得る。いくつかの実施形態では、ペプチド免疫原の混合物は、ＭＶＦ Ｔｈ及びＨＢｓＡｇ Ｔｈに由来するＴｈ部位を含む。いくつかの実施形態では、ペプチド免疫原の混合物を含むワクチンは、標的抗原性部位に対する改善された免疫応答を提供し得る。

Ｔｈ／標的抗原性部位コンジュゲートに対する免疫応答は、生分解性微粒子内またはその上に捕捉されて送達されることにより改善され得る。いくつかの実施形態では、ペプチド免疫原は、アジュバントの有無にかかわらずカプセル化され得、そのような微粒子は、免疫刺激性アジュバントを運搬し得る。いくつかの実施形態では、微粒子は、免疫応答を増強するためにペプチド免疫原と同時投与され得る。

免疫刺激複合体
本開示はまた、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとの免疫刺激複合体の形態でタウペプチド免疫原構築物を含む医薬組成物に関する。例示的なＣｐＧオリゴヌクレオチドを表５に示す。そのような免疫刺激複合体は、アジュバントとして、及びペプチド免疫原安定剤として作用するように特に適合されている。免疫刺激複合体は粒子状であり、タウペプチド免疫原を免疫系の細胞に効率的に提示して免疫応答を生じ得る。免疫刺激複合体は、非経口投与用の懸濁液として処方され得る。免疫刺激複合体はまた、タウペプチド免疫原の非経口投与後の宿主の免疫系の細胞への効率的な送達のために、ミネラル塩と、またはｉｎ ｓｉｔｕのゲル化ポリマーと組み合わせた懸濁液として、ｗ／ｏエマルジョンの形態で処方され得る。

安定化された免疫刺激複合体は、タウペプチド免疫原構築物を、静電会合を介してアニオン性分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはそれらの組み合わせと複合体化することによって形成され得る。安定化された免疫刺激複合体は、免疫原送達システムとして医薬組成物に組み込まれ得る。

特定の実施形態では、タウペプチド免疫原構築物は、５．０から８．０の範囲のｐＨで正に帯電するカチオン性部分を含むように設計される。タウペプチド免疫原構築物または構築物の混合物のカチオン部分の正味電荷は、各リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）に＋１の電荷を割り当て、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）それぞれに−１の電荷、及び配列内の他のアミノ酸に０の電荷を割り当てることによって計算される。電荷は、タウペプチド免疫原構築物のカチオン部分内で合計され、正味平均電荷として表される。適切なペプチド免疫原は、正味平均正電荷が＋１のカチオン部分を有する。好ましくは、ペプチド免疫原は、＋２よりも大きい範囲の正味の正電荷を有する。いくつかの実施形態では、タウペプチド免疫原構築物のカチオン性部分は、異種スペーサーである。特定の実施形態では、タウペプチド免疫原構築物のカチオン部分は、スペーサー配列が（α、ε−Ｎ）Ｌｙｓまたはε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号５３）である場合、＋４の電荷を有する。

本明細書に記載の「アニオン性分子」は、５．０〜８．０の範囲のｐＨで負に帯電されている任意の分子を指す。特定の実施形態では、アニオン性分子は、オリゴマーまたはポリマーである。オリゴマーまたはポリマーの正味の負電荷は、オリゴマーの各ホスホジエステルまたはホスホロチオエート基に−１の電荷を割り当てることによって計算される。適切なアニオン性オリゴヌクレオチドは、８〜６４ヌクレオチド塩基を有する一本鎖ＤＮＡ分子であり、ＣｐＧモチーフの反復の数は、１〜１０の範囲である。好ましくは、ＣｐＧ免疫刺激性一本鎖ＤＮＡ分子は、１８〜４８ヌクレオチド塩基を含み、ＣｐＧモチーフの繰り返し数が３から８の範囲である。

より好ましくは、アニオン性オリゴヌクレオチドは、式：５’Ｘ^１ＣＧＸ^２３’で表され、ここで、Ｃ及びＧはメチル化されておらず、Ｘ１は、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、及びＴ（チミン）からなる群より選択され、Ｘ^２はＣ（シトシン）またはＴ（チミン）である。または、アニオン性オリゴヌクレオチドは、式：５’（Ｘ^３）_２ＣＧ（Ｘ^４）_２３’で表され、ここで、Ｃ及びＧはメチル化されておらず、そしてＸ^３は、Ａ、Ｔ、またはＧからなる群より選択され、Ｘ^４はＣまたはＴである。

得られる免疫刺激複合体は、通常１〜５０ミクロンの範囲のサイズの粒子の形態であり、相互作用する種の相対電荷化学量論及び分子量を含む多くの要因の関数である。粒子状免疫刺激複合体には、ｉｎ ｖｉｖｏでの特定の免疫応答のアジュバント作用及び上方制御を提供するという利点がある。さらに、安定化された免疫刺激複合体は、油中水型エマルジョン、無機塩懸濁液、及びポリマーゲルを含むさまざまなプロセスによる医薬組成物の調製に適している。

用途
本発明のペプチドは、医学的及び獣医学的用途において有用であり得る。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、感染症からの防御免疫を提供するためのワクチン、正常な生理学的プロセスを機能不全にすることから生じる障害を治療するための免疫療法、がんを治療するための免疫療法として、及び正常な生理学的プロセスに介入または改変するための薬剤として使用され得る。

本開示の人工Ｔｈエピトープは、様々な微生物、タンパク質、またはペプチドの標的Ｂ細胞エピトープと組み合わされる場合、免疫応答を誘発し得る。いくつかの実施形態では、本開示の人工Ｔｈエピトープは、１つの標的抗原性部位に連結され得る。いくつかの実施形態では、本開示の人工Ｔｈエピトープは、２つの標的抗原性部位に連結され得る。

本開示の人工Ｔｈエピトープは、様々な疾患及び状態を予防及び／または治療するために、標的抗原性部位に連結してもよい。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、神経変性疾患、感染症、動脈硬化症、前立腺癌、イノシシ臭の予防、動物の免疫学的去勢、子宮内膜症の処置、乳癌及び性腺ステロイドホルモンの影響を受けた他の婦人科がんの予防及び／または治療のため、ならびに男性及び女性の避妊のために使用され得る。例えば、人工Ｔｈエピトープは、以下のタンパク質の抗原性部位に連結され得る：
ａ．家畜の成長を促進するソマトスタチン。
ｂ．アレルギー性疾患を治療するためのＩｇＥ。
ｃ．ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症及び免疫障害を治療及び／または予防するためのＴｈ細胞のＣＤ４受容体。
ｄ．ＦＭＤを予防するための口蹄疫（ＦＭＤ）ウイルスキャプシドタンパク質。
ｅ．ＨＩＶ感染を予防及び治療するためのＨＩＶビリオンエピトープ。
ｆ．マラリアを予防及び治療するための熱帯熱マラリア原虫のスポロゾイト周囲抗原。
ｇ．動脈硬化症を予防及び治療するためのＣＥＴＰ。
ｈ．アルツハイマー病を治療または予防接種するためのＡβ。
ｉ．パーキンソン病を治療または予防接種するためのアルファ−シヌクレイン。
ｊ．アルツハイマー病を含むタウオパチーを治療し、それに対してワクチン接種するタウ。
ｋ．アトピー性皮膚炎を治療するためのＩＬ−３１。

異種の人工Ｔｈエピトープの使用は、神経変性疾患に関与するタンパク質（例えば、Ａβ、アルファ−シヌクレイン、タウ）を標的とするために特に重要であることがわかっている。具体的には、標的神経変性タンパク質の内因性Ｔｈエピトープを含むペプチド免疫原は、対象に投与されたときに脳の炎症を生じ得る。対照的に、神経変性タンパク質の抗原性部位に連結される異種人工Ｔｈエピトープを含むペプチド免疫原構築物は、脳の炎症を引き起こさない。

アミロイドβ
Ａβペプチドは、アルツハイマー病の発症及び進行の要であると考えられている。毒性型のＡβオリゴマー及びＡβ線維は、アルツハイマー病及び認知症の病状につながるシナプス及びニューロンの死の原因であることが示唆されている。アルツハイマー病の疾患修飾療法の成功には、脳内のＡβの性質に影響を与える製品が含まれ得る。

本開示のペプチド免疫原は、Ｔｈ細胞エピトープ及びＡβ標的化ペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｔｈ細胞エピトープは、Ｔｈ１またはＴｈ２である。いくつかの実施形態では、ペプチド免疫原は、Ｔｈ１及びＴｈ２を含み得る。Ａβ標的ペプチド、またはＢ細胞エピトープは、Ａβ_１−１４、Ａβ_１−１６、Ａβ_１−２８、Ａβ_{１７−４２}、またはＡβ_１−４２であり得る。いくつかの実施形態では、Ａβ標的化ペプチドは、Ａβ_１−１４である。本明細書で使用される場合、用語Ａβ_ｘ−ｙは、全長の野生型Ａβタンパク質のアミノ酸ｘからアミノ酸ｙまでのＡβ配列を示す。

本開示のペプチド免疫原は、複数のＡβ標的化ペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペプチド免疫原は、２つのＡβ標的化ペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペプチド免疫原は、１つのＡβ_１−１４及び１つのＡβ_１−４２ペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペプチド免疫原は、２つのＡβ_１−１４標的化ペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ペプチド免疫原は、それぞれが、キメラペプチドとして異なるＴｈ細胞エピトープに連結されている、２つのＡβ_１−１４標的化ペプチドを含んでもよい。

本開示はまた、それぞれがキメラペプチドとして異なるＴｈ細胞エピトープに連結された２つのＡβ_１−１４標的化ペプチドを含むＡβ_１−１４ペプチドワクチンを提供する。いくつかの実施形態では、キメラＡβ_１−１４ペプチドは、Ｔ細胞の炎症反応性を最小化するために、Ｔｈ１バイアス送達システムにおいて処方され得る。いくつかの実施形態では、キメラＡβ_１−１４ペプチドは、Ｔ細胞の炎症反応性を最小化するために、Ｔｈ２バイアス送達システムにおいて処方され得る。

一般
本書で使用されているセクションの見出しは、組織的な目的でしかなく、説明されている主題を制限するものとして解釈されるべきではない。本出願で引用された全ての参考文献または参考文献の一部は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

別段の説明がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「ある、１つの（ａ：不定冠詞）」、「ある、１つの（ａｎ：不定冠詞）ａｎ」、及び「この、その（ｔｈｅ：定冠詞）」には、文脈で明確に示されていない限り、複数の指示対象が含まれる。同様に、「または」という単語は、文脈が明確に別のことを示さない限り、「及び」を含むものとする。したがって、「ＡまたはＢを含む」とは、ＡもしくはＢ、またはＡ及びＢを含むことを意味する。ポリペプチドについて与えられる全てのアミノ酸サイズ、及び全ての分子量または分子量値は概算であり、かつ記述のために提供されることをさらに理解のこと。本明細書に記載されているものと類似または同等の方法及び材料を、開示された方法の実施または試験に使用してもよいが、適切な方法及び材料を以下に説明する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合は、用語の説明を含む本発明の明細書が優先される。さらに、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。

実施例１
ペプチド及びペプチド免疫原構造の調製
ペプチド免疫原構築物を含むペプチドを、自動固相合成を使用して合成し、分取ＨＰＬＣで精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析、アミノ酸分析、及び逆相ＨＰＬＣによって特徴付けた。

Ａβワクチン（ＵＢ−３１１）は、２つのペプチド免疫原を含み、それぞれがＮ末端Ａβ_１−１４ペプチドを有し、アミノ酸スペーサーを通じて２つの病原体タンパク質（Ｂ型肝炎表面抗原及び麻疹ウイルス融合タンパク質）に由来する異なるＴｈ細胞エピトープペプチド（ＵＢＩＴｈ（登録商標）エピトープ）に合成的に連結されている。具体的には、麻疹ウイルス融合タンパク質に連結されたペプチド免疫原は、Ａβ_１−１４−εＫ−ＫＫＫ−ＭｖＦ５Ｔｈ（配列番号６７）であり、Ｂ型肝炎表面抗原に結合したペプチド免疫原は、Ａβ_１−１４−εＫ−ＨＢｓＡｇ３Ｔｈであった（配列番号６８）。

ＵＢ−３１１は、ミョウバンを含むＴｈ２バイアス送達システムで処方され、ペプチドＡβ_１−１４−εＫ−ＨＢｓＡｇ３及びＡβ_１−１４−εＫ−ＫＫＫ−ＭｖＦ５Ｔｈを等モル比で含んでいた。２つのＡβ免疫原を、ポリアニオン性ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合して、ミクロンサイズの粒子の安定した免疫刺激複合体を形成した。アルミニウムミネラル塩（ＡＤＪＵ−ＰＨＯＳ（登録商標））を、張性のための塩化ナトリウム及び防腐剤としての０．２５％２−フェノキシエタノールとともに最終配合物に加えた。

いくつかの例示的な標的抗原性部位（Ｂ細胞エピトープ）の配列を表３に示す。Ｔｈエピトープに共有結合した標的抗原性部位としてＡβ_１−１４を含むいくつかの例示的なペプチド免疫原構築物の配列を表４に示す。

実施例２
ＴｈエピトープではなくＡβペプチドを標的とするモルモットにおけるペプチド免疫原性構築物の排他的免疫原性
６匹のモルモットを０週目と４週目に、等モル比で一緒に処方されたペプチド免疫原構築物Ａβ_１−１４−εＫ−ＫＫＫ−ＭｖＦ５（配列番号６７）及びＡβ_１−１４−εＫ−ＨＢｓＡｇ３（配列番号６８）で免疫した。８週目に、動物から採血し、血清試料を収集して、ＥＬＩＳＡ試験により抗Ａβペプチド及び抗Ｔｈエピトープ抗体価（ｌｏｇ_１０）を決定した。表６に示すように、６匹全てのモルモットの抗体反応は、Ａβ_１−４２ペプチドを特異的に標的とし、２つの人工Ｔｈエピトープ（ＭｖＦ５Ｔｈ及びＨＢｓＡｇ３Ｔｈ）は標的としなかった。

実施例３
ヒヒ及びカニクイザル（macaque）の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）培養物における細胞性免疫反応
ヒヒ及びカニクイザル（Cynomolgus macaque）由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心分離によって単離した。ペプチド誘導増殖及びサイトカイン産生のために、細胞（１ウェルあたり２×１０^５個）を単独で、または個々のペプチドドメイン（Ａβ_１−１４、Ａβ_１−４２、ＵＢＩＴｈ（登録商標）、及び関連性のないペプチドを含む）を加えて培養した。マイトジェン（ＰＨＡ、ＰＷＭ、Ｃｏｎ Ａ）を陽性対照として使用した（培養液１％ｖ／ｖで１０μｇ／ｍＬ）。６日目に、１μＣｉの３Ｈ−チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）を、３つの複製培養ウェルのそれぞれに添加した。１８時間のインキュベーション後、細胞を回収し、３Ｈ−ＴｄＲの取り込みを測定した。刺激指数（Ｓ．Ｉ．）は、抗原の存在下でのｃｐｍを抗原の非存在下でのｃｐｍで割ったものを表す。Ｓ．Ｉ．＞３．０は有意であると見なされた。

カニクイザルＰＢＭＣ培養物からのサイトカイン分析（ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＴＮＦα、ＩＦＮγ）は、培養液のアリコートのみで、またはペプチドドメインもしくはマイトジェンの存在下で実施した。サル特異的サイトカインサンドイッチＥＬＩＳＡキット（U-CyTech Biosciences, Utrecht, The Netherlands）を使用して、キットの指示に従って個々のサイトカインの濃度を決定した。

ＰＢＭＣは、１５、２１、及び２５．５週目にカニクイザル（macaque）から収集された全血から単離された。単離されたＰＢＭＣは、さまざまなＡβペプチド（Ａβ_１−１４及びＡβ_１−４２）の存在下で培養された。

Ａβ_１−１４ペプチドを培養培地に添加した場合、リンパ球による増殖反応は観察されなかった。しかし、Ａβ_１−４２ペプチドをＰＢＭＣ培養物に添加すると、陽性の増殖反応が見られた。

１５、２１、及び２５．５週に収集されたＰＢＭＣ試料を、ＡβペプチドまたはＰＨＡマイトジェンの存在下でのサイトカイン分泌についても試験した。表７に示すように、３つのサイトカイン（ＩＬ２、ＩＬ６、ＴＮＦα）は、全長のＡβ_１−４２ペプチドに応答して検出可能な分泌を示したが、Ａβ_１−１４ペプチドには応答しなかった。プラセボワクチン試料と比較した場合、ＵＢＩＴｈ（登録商標）ＡＤワクチン処理試料ではサイトカイン分泌の上方制御は検出されなかった。Ａβペプチドの存在下で試験された他の３つのサイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮγ）は、全てのＰＢＭＣ培養中でアッセイ検出限界を下回った。

カニクイザル（macaque）は、Ａβ_{１７−４２}ペプチドドメインを含まない、外来Ｔヘルパーエピトープを有するＮ末端Ａβ_１−１４ペプチド免疫原のみを有するＵＢ−３１１ワクチンで免疫され、Ａβ_１−４２ペプチドの存在下でのＰＢＭＣ培養物で注目される陽性増殖結果は、ＵＢ−３１１ワクチンの反応とは関係がなく、ネイティブＡβに対するバックグラウンドの反応であったことが示されている。

これらの結果、Ａβ_１−１４と外来Ｔヘルパーエピトープのみを含むＵＢ−３１１ワクチンの安全性を裏付けており、正常なカニクイザル（macaque）のＡβペプチドに対する潜在的に炎症性の抗自己細胞性免疫応答を生成しないことが示されている。対照的に、ＡＮ−１７９２ワクチンの臨床試験研究における脳炎に関連する有害事象は、そのワクチンの原線維／凝集Ａβ_１−４２免疫原内にＴ細胞エピトープが含まれていることに一部起因していた。

実施例４
リンパ球増殖分析及びサイトカイン分析
アルツハイマー病患者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心分離によって単離した。ペプチド誘導増殖及びサイトカイン産生のために、細胞（１ウェルあたり２．５×１０^５）を、三重で単独で培養するか、またはＡβ_１−１４（配列番号５６）、Ａβ_１−１６（配列番号５７）、Ａβ_１−２８（配列番号５９）、Ａβ_{１７−４２}（配列番号５８）、Ａβ_１−４２（配列番号６０）及び非関連３８−ｍｅｒペプチド（ｐ１４１２）を含む個々のペプチドドメインを追加して（最終濃度１０μｇ／ｍＬで）培養した。培養物を３７℃で５％ＣＯ_２とともに７２時間インキュベートした後、１００μＬの上清を各ウェルから取り出し、サイトカイン分析のために−７０℃で凍結した。０．５μＣｉの^３Ｈ−チミジン（^３Ｈ−ＴｄＲ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号ＴＲＫ６３７）を含む１０μＬの培養培地を各ウェルに添加し、１８時間インキュベートした後、液体シンチレーションカウンティングによって放射性同位元素の取り込みを検出した。マイトジェンフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）を、リンパ球増殖の陽性対照として使用した。ＡβペプチドまたはＰＨＡマイトジェンなしで単独で培養された細胞を、陰性及び陽性対照として使用した。刺激指数（ＳＩ）は、Ａβペプチドを用いた３回の実験培養の１分あたりの平均カウント（ｃｐｍ）を３回の陰性対照培養の平均ｃｐｍで割ったものとして計算された。ＳＩ＞３．０は、有意な増殖反応と見なされた。

ａ．増殖分析
末梢血単核細胞試料は、０週目（ベースライン）及び１６週目（３回目の投与から４週間後）に収集された全血から単離され、次いで、さまざまなＡβペプチドの有無の下で培養した。表８に示すように、Ａβ_１−１４、他のＡβペプチド、またはｐ１４１２（関連性のない対照ペプチド）を培養培地に添加した場合、リンパ球による有意な増殖反応は観察されなかった。予想どおり、ＰＨＡマイトジェンを培養培地に添加すると陽性の増殖反応が認められた。ＵＢ ３１１免疫の前後のＰＨＡに対する同様の反応の観察（ｐ＝０．８７）では、研究対象の免疫機能に有意な変化がないことが示唆される（表８）。

統計分析。０週目と１６週目のリンパ球増殖の相違を、対応のあるｔ検定で調べた。統計的有意水準は、両側検定によって決定された（ｐ＜０．０５）。Ｒバージョン２．１４．１は、全ての統計分析に使用された。

ｂ．サイトカイン分析
ＰＢＭＣ培養物からのサイトカイン分析（ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ）は、細胞のみを含むか、またはＡβペプチドドメインもしくはＰＨＡの存在下で、培養培地のアリコートで実施された。ヒト特異的サイトカインサンドイッチＥＬＩＳＡキット（U-CyTech Biosciences, Utrecht, The Netherlands）を使用して、製造元の指示（Clin Diag Lab Immunol. 5(1): 78-81(1998)）に従って個々のサイトカインの濃度（ｐｇ／ｍＬ）を決定した。

０週目と１６週目に収集されたＰＢＭＣ試料は、細胞のみ（陰性対照）またはＡβペプチド、ｐ１４１２（関連性のないペプチド）もしくはＰＨＡマイトジェン（陽性対照）の存在下で３日間培養した後、サイトカイン分泌についても試験された。キットの定量範囲は５〜３２０ｐｇ／ｍＬである。５ｐｇ／ｍＬ未満または３２０ｐｇ／ｍＬを超える任意の測定濃度は、それぞれ定量限界未満（ＢＱＬ）または定量限界超（ＡＱＬ）として示された。ただし、統計上の考慮事項として、ＢＱＬまたはＡＱＬは、それぞれ定量可能な下限（５ｐｇ／ｍＬ）または上限（３２０ｐｇ／ｍＬ）に置き換えられた。０週目と１６週目の各サイトカインの平均濃度を表９に示す。予想どおり、ＩＬ−２を除いて、陽性対照であるＰＨＡの存在下でサイトカイン産生が有意に増加した。Ａβ_１−１４または他のＡβペプチドによる刺激に応答したサイトカインの産生は、ベースライン（０週目）及び１６週目に観察されたが、ほとんどの値は対応する陰性対照（細胞のみ）と同様に見えた。

免疫後の細胞性免疫応答の変化を評価するために、ベースラインから１６週までの平均サイトカイン濃度の変化を、陰性対照の変化と比較し、対応のあるウィルコクソンの符号付き順位検定で調べた。４つのサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α）は、全長のＡβ_１−４２ペプチドに応答して分泌の顕著な増大を示した。この観察結果は、Ａβ_１−４２凝集体の立体配座エピトープに起因し得る。サイトカイン分泌の上方制御は、Ａβ_１−１４または他のＡβペプチドでは検出されなかった。

ｃ．概要
ＵＢ−３１１ワクチンには、それぞれＭｖＦ５Ｔｈ及びＨＢｓＡｇ３Ｔｈエピトープに合成的に結合したＮ末端Ａβ_１−１４ペプチドを有する２つのペプチド免疫原が含まれている。細胞性免疫応答に対するＵＢ−３１１ワクチンの免疫化の影響を評価するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏのリンパ球増殖及びサイトカイン分析を使用した。表８に示すように、Ａβ_１−１４ペプチドまたは任意の他のＡβペプチドを培養培地に添加した場合、リンパ球による増殖反応は観察されなかった。ＵＢ−３１１ワクチン免疫患者のリンパ球によるサイトカイン分泌の上方制御は、治療前の０週目のレベルで比較した場合（表９）、１６週目のＵＢ−３１１免疫後に４つのサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α）のかなりの増加を誘発した、Ａβ_１−１４及びＡβ_１−４２を除く他のＡβペプチドによる治療時には検出されなかった。Ｔｈ２型のＴ細胞応答によるサイトカイン放出の増大は、Ａβ_１−１４のみでは上方制御が検出されないため、ＵＢ−３１１ワクチン応答とは無関係である可能性が高い。Ａβ_１−４２に対する応答は、Ａβ_１−４２で同定されたネイティブＴヘルパーエピトープに関連している可能性のあるネイティブＡβに対するバックグラウンド応答であると疑われている。ＰＨＡに応答したＩＬ−２産生の欠如が観察され、これは、正常なヒトＰＢＭＣと同様の実験条件下、Katial RK, et al. Clin Diagn Lab Immunol 1998; 5: 78-81によって報告される知見と一致している。結論として、これらの結果は、ＵＢ−３１１ワクチンが、第Ｉ相臨床試験に参加した軽度から中等度のアルツハイマー病患者において潜在的に炎症性の抗自己細胞性免疫応答を生成しなかったことを示し、したがって、ＵＢ−３１１ワクチンの安全性をさらに実証している。

実施例５
無差別な人工Ｔｈ応答性細胞は、陰性対照と比較した場合、中程度の免疫原性炎症反応を伴う正常な献血者のナイーブ末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）で検出され得る
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して、正常な献血者のナイーブ末梢血単核細胞の無差別人工Ｔｈ応答細胞を検出し、強力なマイトジェンであるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）及び陰性対照と比較した場合の炎症反応を誘発する効力を評価した。

ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、サンドイッチ酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）技術を採用している。Ｔ細胞の活性化を検出するために、ＩＦＮ−γまたは関連するサイトカインが分析物として検出された。選択した分析物に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかを、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）で裏打ちされたマイクロプレートにプレコートした。適切に刺激された細胞を、ピペットでウェルに入れ、マイクロプレートを加湿した３７℃のＣＯ_２インキュベーターに指定された時間入れた。このインキュベーション期間中、分泌細胞のすぐ近くにある固定化抗体は、分泌された分析物に結合した。細胞と未結合物質を洗い流した後、選択した分析物に特異的なビオチン化ポリクローナル抗体をウェルに添加した。未結合のビオチン化抗体を除去するために洗浄した後、ストレプトアビジンに結合したアルカリホスファターゼを添加した。続いて、未結合の酵素を洗浄により除去し、基質溶液（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を加えた。青黒色の沈殿物が形成され、サイトカイン局在化の部位にスポットとして現れ、各々の個々のスポットは個々の分析物分泌細胞を表す。スポットは、自動化されたＥＬＩＳｐｏｔリーダーシステムを使用して、または実体顕微鏡を使用して手動でカウントした。

実施されたｉｎ ｖｉｔｒｏ研究では、１０μｇ／ｍＬ培養のＰＨＡを陽性対照として使用した。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１（配列番号１７）及びＵＢＩＴｈ（登録商標）５（配列番号６）ペプチドを、通常の正常な献血者の末梢血単核細胞に存在する応答性細胞の数について試験した。配列番号３３〜５２を有する無差別な人工Ｔｈエピトープペプチドの混合物を、別の陽性対照として調製した。標準的なＴ細胞刺激細胞培養条件では、培地のみを陰性対照として使用した。簡単に説明すると、マイトジェン（１０μｇ／ｍＬのＰＨＡ）またはＴｈ抗原（ＵＢＩＴｈ（登録商標）１、ＵＢＩＴｈ（登録商標）５、または１０μｇ／ｍＬのｍｕｌｔｉ−Ｔｈの混合物）で刺激した１００μＬ／ウェルのＰＢＭＣ（２ｘ１０^５細胞）を、３７℃で、ＣＯ_２インキュベーター中で４８時間、インキュベートした。ウェル／プレート由来の上清を収集した。プレート上の細胞を洗浄し、標的分析物であるＩＦＮ−γの検出のために処理した。

図１に示すように、代表的なドナー１、２、及び３を、無差別な人工ＵＢＩＴｈ（登録商標）１またはＵＢＩＴｈ（登録商標）５エピトープペプチドに対する応答性細胞について試験した。圧倒的なＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数は、常にナイーブドナー（ＰＨＡで培養されたＰＢＭＣ；数えるには多すぎる）で検出されたが、対照培地で培養されたＰＢＭＣは、５〜５０のバックグラウンドＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴ数を示した。中程度のＥＬＩＳＰＯＴ数が、ＵＢＩＴｈ（登録商標）１またはＵＢＩＴｈ（登録商標）５で２０〜約１２０まで培養されたナイーブなドナーＰＢＭＣについて検出された。配列番号３３−５２のマルチＴｈペプチドの混合物もナイーブなドナーＰＢＭＣで培養され、ＥＬＩＳＰＯＴ数と比較して、予想どおり、２０〜約３００になる。ＵＢＩＴｈ（登録商標）１またはＵＢＩＴｈ（登録商標）５ペプチドによって引き起こされるこのような刺激反応は、陰性対照と比較して約３〜５倍である。

要約すると、無差別な人工Ｔｈ応答性細胞は、免疫応答を開始して、シグネチャーサイトカインを分泌することによってＢ細胞抗体産生及び対応するエフェクターＴ細胞応答を助ける準備ができているナイーブドナーＰＢＭＣで容易に検出され得る。ここでは、ＩＦＮ−γを１つの例として使用して、これらのＴｈエピトープペプチドのこの刺激性を説明した。しかしながら、そのような刺激性炎症反応は、ワクチン接種プロセス中に有害な炎症性病態生理学的反応を引き起こさないように、適切なエフェクター細胞反応（抗体産生のためのＢ細胞、標的抗原細胞の殺傷のための細胞傷害性Ｔ細胞）を開始するのに十分穏やかである。

Claims (63)

1. ペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含む状態を治療する方法であって、前記ペプチドがＴヘルパー細胞エピトープ及び抗原提示エピトープを含み、前記ペプチドが、陽性対照の免疫原性炎症反応よりも少なくとも約３倍低い、免疫原性炎症応答を生じる状態を治療する、前記方法。
2. 前記抗原提示エピトープがＢ細胞エピトープである、請求項１に記載の方法。
3. 前記抗原提示エピトープがペプチドハプテンである、請求項１に記載の方法。
4. 前記抗原提示エピトープがβ−アミロイド（Ａβ）である、請求項１に記載の方法。
5. 前記抗原提示エピトープが、Ａβ_１−１４、Ａβ_１−１６、Ａβ_１−２８、Ａβ_{１７−４２}、及びＡβ_１−４２からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
6. 前記抗原提示エピトープがＡβ_１−１４である、請求項５に記載の方法。
7. 前記抗原提示エピトープがＡβ_１−４２である、請求項５に記載の方法。
8. 前記Ｔヘルパー細胞エピトープがＴｈ１エピトープである、請求項１に記載の方法。
9. 。
10. 前記Ｔヘルパー細胞エピトープがＴｈ２エピトープである、請求項１に記載の方法。
11. 前記Ｔヘルパー細胞エピトープ及び前記抗原提示エピトープが共有結合している、請求項１に記載の方法。
12. 前記Ｔヘルパー細胞エピトープが、前記抗原提示エピトープのＮ末端またはＣ末端に共有結合されている、請求項１１に記載の方法。
13. 前記Ｔヘルパー細胞エピトープ及び前記抗原提示エピトープが、チオエステル結合によって共有結合している、請求項１１に記載の方法。
14. 前記Ｔヘルパー細胞エピトープが、スペーサーを介して前記抗原提示エピトープに付着されている、請求項１に記載の方法。
15. 前記スペーサーがＧｌｙ−Ｇｌｙである、請求項１４に記載の方法。
16. 前記スペーサーが（ε−Ｎ）Ｌｙｓである、請求項１４に記載の方法。
17. 前記ペプチドが免疫刺激配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
18. 前記免疫刺激配列がインベーシンタンパク質のドメインである、請求項１７に記載の方法。
19. 前記状態がアルツハイマー病である、請求項１に記載の方法。
20. 前記状態が初期アルツハイマー病である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記状態が軽度のアルツハイマー病である、請求項１９に記載の方法。
22. 前記免疫学的炎症反応が末梢血単核細胞において測定される、請求項１に記載の方法。
23. 前記免疫学的炎症反応が、単離された末梢血単核細胞において測定される、請求項１に記載の方法。
24. 前記免疫学的炎症反応がサイトカイン濃度の増大である、請求項１に記載の方法。
25. サイトカイン濃度の前記増大が、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γ、またはＴＮＦ−αの濃度の増大である、請求項１に記載の方法。
26. 前記投与が静脈内である、請求項１に記載の方法。
27. 前記投与が筋肉内である、請求項１に記載の方法。
28. 前記陽性対照がフィトヘマグルチニンマイトジェンである、請求項１に記載の方法。
29. 投与が、約１５０μｇの前記ペプチドを投与することを含む、請求項１に記載の方法。
30. 前記投与が、約７５０μｇの前記ペプチドを投与することを含む、請求項１に記載の方法。
31. 請求項１に記載の方法であって、前記ペプチドが以下の式：
    （Ａ）_ｎ−（標的抗原性部位）−（Ｂ）_ｏ−（Ｔｈ）_ｍ−Ｘ
    または
    （Ａ）_ｎ−（Ｂ）_ｏ−（Ｔｈ）_ｍ−（Ｂ）_ｏ−（標的抗原性部位）−Ｘ
    または
    （Ａ）_ｎ−（Ｔｈ）_ｍ−（Ｂ）_ｏ−（標的抗原性部位）−Ｘ
    または
    （標的抗原性部位）−（Ｂ）_ｏ−（Ｔｈ）_ｍ−（Ａ）_ｎ−Ｘ
    または
    （Ｔｈ）_ｍ−（Ｂ）_ｏ−（標的抗原性部位）−（Ａ）_ｎ−Ｘ
    のペプチドであり、
    式中：
    −Ａがアミノ酸または免疫刺激性配列であり、
    −Ｂが、少なくとも１つのアミノ酸、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＯ−、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＯ（εＮ）Ｌｙｓ−、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２Ｓ−スクシンイミジル（εＮ）Ｌｙｓ−、または−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２Ｓ−（スクシンイミジル）−であり、
    −Ｔｈが、ヘルパーＴ細胞エピトープ、その類縁体、またはセグメントであり、
    −標的抗原性部位がＢ細胞エピトープまたはその免疫学的に反応性の類縁体であり、
    −Ｘが、アミノ酸α−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ_２であり、
    −ｎが１〜約１０であり、
    −ｍが１〜約４であり、かつ
    −ｏが、０〜約１０である、
    前記方法。
32. 前記Ｔ細胞エピトープが人工Ｔ細胞エピトープである、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
33. ペプチドを、それを必要とする対象に投与することを含む状態を治療する方法であって、前記ペプチドがＴヘルパー細胞エピトープ及び抗原提示エピトープを含み、前記ペプチドが、陰性対照の免疫原性炎症反応よりも約３倍未満高い、対象における免疫原性炎症反応を生成する、前記方法。
34. 前記抗原提示エピトープがＢ細胞エピトープである、請求項３３に記載の方法。
35. 前記抗原提示エピトープがペプチドハプテンである、請求項３３に記載の方法。
36. 前記抗原提示エピトープがβ−アミロイド（Ａβ）である、請求項３３に記載の方法。
37. 前記抗原提示エピトープが、Ａβ_１−１４、Ａβ_１−１６、Ａβ_１−２８、Ａβ_{１７−４２}、及びＡβ_１−４２からなる群より選択される、請求項３６記載の方法。
38. 前記抗原提示エピトープがＡβ_１−１４である、請求項３７に記載の方法。
39. 前記抗原提示エピトープがＡβ_１−４２である、請求項３７に記載の方法。
40. 前記Ｔヘルパー細胞エピトープがＴｈ１エピトープである、請求項３３に記載の方法。
41. 前記Ｔヘルパー細胞エピトープがＴｈ２エピトープである、請求項３３に記載の方法。
42. 前記Ｔヘルパー細胞エピトープ及び前記抗原提示エピトープが共有結合されている、請求項３３に記載の方法。
43. 前記Ｔヘルパー細胞エピトープが、前記抗原提示エピトープのＮ末端またはＣ末端に共有結合されている、請求項４２に記載の方法。
44. 前記Ｔヘルパー細胞エピトープ及び前記抗原提示エピトープが、チオエステル結合によって共有結合されている、請求項４２に記載の方法。
45. 前記Ｔヘルパー細胞エピトープが、スペーサーを介して前記抗原提示エピトープに付着されている、請求項３３に記載の方法。
46. 前記スペーサーがＧｌｙ−Ｇｌｙである、請求項４５に記載の方法。
47. 前記スペーサーが（ε−Ｎ）Ｌｙｓである、請求項４５に記載の方法。
48. 前記ペプチドが免疫刺激配列をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
49. 前記免疫刺激配列がインベーシンタンパク質のドメインである、請求項４８に記載の方法。
50. 前記状態がアルツハイマー病である、請求項３３に記載の方法。
51. 前記状態が初期アルツハイマー病である、請求項５０に記載の方法。
52. 前記状態が軽度のアルツハイマー病である、請求項５０に記載の方法。
53. 前記免疫学的炎症反応が末梢血単核細胞において測定される、請求項３３に記載の方法。
54. 前記免疫学的炎症反応が、単離された末梢血単核細胞において測定される、請求項３３に記載の方法。
55. 前記免疫学的炎症反応がサイトカイン濃度の増大である、請求項３３に記載の方法。
56. 前記サイトカイン濃度の増大が、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＮＦ−γ、またはＴＮＦ−αの濃度の増大である、請求項３３に記載の方法。
57. 前記投与が静脈内である、請求項３３に記載の方法。
58. 前記投与が筋肉内である、請求項３３に記載の方法。
59. 前記陽性対照がフィトヘマグルチニンマイトジェンである、請求項３３に記載の方法。
60. 投与が、約１５０μｇの前記ペプチドを投与することを含む、請求項３３に記載の方法。
61. 前記投与が、約７５０μｇの前記ペプチドを投与することを含む、請求項３３に記載の方法。
62. 請求項３３に記載の方法であって、前記ペプチドが以下の式：
    （Ａ）_ｎ−（標的抗原性部位）−（Ｂ）_ｏ−（Ｔｈ）_ｍ−Ｘ
    または
    （Ａ）_ｎ−（Ｂ）_ｏ−（Ｔｈ）_ｍ−（Ｂ）_ｏ−（標的抗原性部位）−Ｘ
    または
    （Ａ）_ｎ−（Ｔｈ）_ｍ−（Ｂ）_ｏ−（標的抗原性部位）−Ｘ
    または
    （標的抗原性部位）−（Ｂ）_ｏ−（Ｔｈ）_ｍ−（Ａ）_ｎ−Ｘ
    または
    （Ｔｈ）_ｍ−（Ｂ）_ｏ−（標的抗原性部位）−（Ａ）_ｎ−Ｘ
    のペプチドであって、
    式中：
    −Ａがアミノ酸または免疫刺激性配列であり、
    −Ｂが、少なくとも１つのアミノ酸、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＯ−、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２ＳＣＨ_２ＣＯ（εＮ）Ｌｙｓ−、−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２Ｓ−スクシンイミジル（εＮ）Ｌｙｓ−、または−ＮＨＣＨ（Ｘ）ＣＨ_２Ｓ−（スクシンイミジル）−であり、
    −Ｔｈが、前記ヘルパーＴ細胞エピトープ、その類縁体、またはセグメントであり、
    −標的抗原性部位がＢ細胞エピトープまたはその免疫学的に反応性の類縁体であり、
    −Ｘが、アミノ酸α−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ_２であり、
    −ｎが１〜約１０であり、
    −ｍが１〜約４であり、かつ
    −ｏが、０〜約１０である、
    前記方法。
63. 前記Ｔ細胞エピトープが人工Ｔ細胞エピトープである、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
    

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