JP2016513638A - アルツハイマー型認知症の予防用及び免疫療法用ペプチドワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、アルツハイマー病の危険性があるか又はアルツハイマー病である患者に防御免疫応答を提供するAβペプチドのN末端に対する高度に特異的な抗体の産生を刺激するために共に作用する、病原性タンパク質に由来する異種ヘルパーT細胞(Th)エピトープとスペーサー残基を介して結合するB細胞(B)エピトープとしてAβペプチドのN末端を有する、独自のAβペプチド免疫原構築物を有する、独自のAβペプチド免疫原構築物、これらAβペプチド免疫原構築物及びその混合物を有するペプチド組成物、これらAβペプチド免疫原構築物を有するワクチン製剤を含む医薬組成物に関する。
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本開示は、アルツハイマー病の危険性があるか又はアルツハイマー病である患者に防御免疫応答を提供するAβ1−42ペプチドのN末端に対する特異的抗体の産生を刺激するために共に作用する、病原体タンパク質からの異種ヘルパーT細胞(Th)エピトープとスペーサー残基を介して結合したB細胞(B)エピトープとしてAβペプチド(Aβ1−10〜Aβ1−14)のN末端を持つ独自のAβペプチド免疫原構築物を有する、独自のAβペプチド免疫原構築物、これらAβペプチド免疫原構築物及びその混合物を有するペプチド組成物、ワクチン製剤中にこれらペプチド組成物を有する医薬組成物に関する。
「ベータアミロイド」という表題のウィキペディア内の記事は、対象の最新の概説を提供する(http://en.wikipedia.org/wiki/Beta_amyloid)。この記事へのインターネットリンクは、参照として本明細書に提供される。
本発明は、AD患者の脳内の可溶性Aβ1−42及びプラークへの交差反応性を有する、AβペプチドのN末端に特異的な高力価のオリゴクローナル抗体を産生するための新規なペプチド組成物に関する。合理的設計の努力によるペプチド組成物の部位特異性は、担体タンパク質上の不適切な部位に対する抗体の産生を最小化する。
T細胞エピトープは、それらがMHC分子と結合する抗原提示細胞の表面上に存在する。MHCクラスI分子によって提示されるT細胞エピトープは典型的には8〜11アミノ酸長のペプチドである一方、MHCクラスII分子はより長い13〜17アミノ酸長のペプチドを提示し、非古典的MHC分子は糖脂質のような非ペプチド性のエピトープも提示する。
(Aβ1−42ペプチドのN末端フラグメント)−(A)o−(Th)−X
式中、(Aβ1−42ペプチドのN末端フラグメント)は、配列番号4〜6からなる群から選ばれる約10〜約14個のアミノ酸残基を有するB細胞エピトープであり;
各Aは、独立に、アミノ酸、Lys−、Gly−、Lys−Lys−Lys−、(α,ε−N)Lys、又はε−N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号32)からなる群から選ばれるアミノ酸又は結合基であり;
各Thは、配列番号34、37、38、40〜47及びその機能的免疫学的類似体からなる群から選ばれるヘルパーT細胞エピトープを構成するアミノ酸配列を有し;
Xは、アミノ酸のα-COOH又はα-CONH2であり;且つ
oは0〜約4である。
(i)ペプチド組成物
本開示の組成物は1つ又はそれ以上のAβペプチド免疫原構築物を含有することができる。2つ以上のThエピトープを有するAβペプチド免疫原構築物の混合物を有するペプチド組成物は、広いMHCクラスIIの範囲のために、幅広い遺伝的集団における免疫活性の相乗的増強を可能にする医薬製剤/ワクチン製剤に調製することができる。このような組成物はAβ1−42ペプチドフラグメントに対する改善された免疫応答を提供することができる。
本開示は、ADの危険性があるか又はADである患者におけるアルツハイマー型認知症を処置及び/又は予防するための医薬組成物である、Aβペプチド免疫原構築物の混合物を含有する組成物にも関する。
ある態様において、Aβペプチド免疫原構築物を有する医薬組成物は、ワクチン宿主におけるAβペプチドのN末端に対する免疫応答を誘発するのに用いられる。本発明のAβペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物は、ワクチン宿主又はADの危険性があるか若しくはADである患者に対して、アルツハイマー型認知症の予防及び処置のためのワクチンとして用いることができる。
ある態様において、医薬組成物は、(a)CpGオリゴヌクレオチド及び(b)Aβペプチド免疫原構築物を有する免疫刺激複合体を含むことができる。このような免疫刺激複合体は、アジュバントとして及びペプチド免疫原安定化剤として作用するように特に適応される。免疫刺激複合体は粒子状形態であり、これは、免疫応答を生じさせる免疫系細胞にAβペプチド免疫原構築物を効率的に提示することができる。免疫刺激複合体は、非経口投与用の懸濁液として製剤化することができる。免疫刺激複合体は、非経口投与に続いて、ワクチン宿主の免疫系細胞へAβペプチド免疫原構築物を効率的に送達し、予防効果を有する抗Aβ免疫応答を生じさせるために、鉱物塩と、又はその場でゲル化するポリマーと組み合わせた懸濁液として、W/O乳剤の形態に製剤化してもよい。本発明は、カチオン性Aβペプチド免疫原構築物とアニオン性分子又はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド及びその組み合わせとを有する安定化免疫刺激複合体、並びに、静電会合によるアニオン性分子又はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとの複合化によってカチオン性Aβペプチド免疫原構築物を安定化させる方法に関する。安定化免疫刺激複合体は、免疫原のデリバリシステムとして医薬組成物に組み込むことができる。
本開示は、免疫応答を誘発し、ADの危険性があるか又はADである患者を保護するための、Aβペプチド免疫原構築物、組成物及び医薬組成物、ワクチン製剤の製造方法にも関する。
本発明のペプチド免疫原は当業者に周知の化学合成法によって製造することができる。例えば、Moore V.「Synthetic Peptides:A User’s Guide」第2章、GA Grant,W.H.編、Freeman&Co.,ニューヨーク,NY, 1992, p.63-67を参照のこと。したがって、ペプチドは、例えば、アプライド・バイオシステム・ペプチド合成機(モデル430A又は431)で、側鎖を保護したアミノ酸を使用するt−Boc又はF−moc化学のいずれかにより保護されたα−NH2を用いる固相合成の自動メリーフィールド法を使用して合成することができる。Thエピトープのためのコンビナトリアルライブラリーペプチドを有するペプチド構築物の調製は、与えられた可変位置でカップリング用の代替アミノ酸の混合物を提供することによって達成することができる。
各種の例示的な態様は、Aβペプチド免疫原構築物及びCpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)分子を有する免疫刺激複合体(ISC)を製造する方法も含む。ある態様において、図5Aに示すように、安定化免疫刺激複合体はカチオン性ペプチド及びポリアニオン性CpG ODN分子に由来する。図5Aは、電荷の静電中和により引き起こされる自己組織化システムを示す。アニオン性オリゴマーに対するカチオン性ペプチドのモル電荷比の化学量論が会合の程度を決める。ペプチド免疫原及びCpG ODNの非共有結合性の静電会合は、完全に再現性のあるプロセスである。ペプチド/CpG ODN免疫刺激複合体は、自己凝集し、免疫系の「プロフェッショナル」抗原提示細胞(APC)への提示が促進されるため、さらに複合体の免疫原性が増強される。これらの複合体は、製造中の品質管理のために容易に特徴付けられる。ペプチド/CpG ISCはインビボで十分に許容される。
各種の例示的な態様は、図5Bに示すように、鉱物塩を有する油中水型乳剤及び懸濁液を使用するワクチン製剤も含む。投与の目標の一部でもある予防を伴って、多くの人々によって使用されるように設計されたワクチンのためには、安全性は考慮される別の重要な因子になる。臨床試験における多くのワクチン製剤のためのヒトへの油中水型乳剤の使用にもかかわらず、アラムは、その数十年にわたる安全性試験によって、依然としてワクチン製剤での使用のための主要なアジュバントである。実施例8及び9に示すように、アラム又はその鉱物塩であるアジュホス(Adjuphos)アラム(リン酸アルミニウム)を臨床適用のための調製物中でアジュバントとして使用した。
(i)処置の体系的計画(regime)
予防的な適用において、医薬組成物を、アルツハイマー病に影響されやすいか、又はアルツハイマー病の危険性がある患者に、危険性を取り除くかもしくは軽減させるか、重篤度を軽減させるか、又は(生化学的、組織学的及び/又は行動学的に)疾患の発症を遅らせる(疾患の進行中でのその合併症及び中間の病理学的表現型を含む)のに十分な量で、投与する。
処置に適している患者として、アルツハイマー病発症の危険性はあるが症状は示していない者、及び現在症状を示している患者が挙げられる。
本発明の具体的な態様として、次のものを含むが、これらに限定されない。
(1) 下記式を有するAβペプチド免疫原構築物:
(Aβ1−42ペプチドのN末端フラグメント)−(A)o−(Th)−X
式中、(Aβ1−42ペプチドのN末端フラグメント)は、配列番号4、5及び6からなる群から選ばれる約10〜約14個のアミノ酸残基を有するAβ由来のB細胞エピトープであり;
各Aは、独立に、アミノ酸、Lys−、Gly−、Lys−Lys−Lys−、(α,ε-N)Lys、及びε-N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号32)からなる群から選ばれるアミノ酸又は結合基であり;
各Thは、配列番号34、37、38、40〜47及びその機能的免疫学的類似体からなる群から選ばれるヘルパーT細胞エピトープを構成するアミノ酸配列を有し;
Xは、アミノ酸のα-COOH又はα-CONH2であり;且つ
oは0〜約4である。
(2) (Aβ1−42ペプチドのN末端フラグメント)がAβ1−14(配列番号4)である、(1)のAβペプチド免疫原構築物。
(3) Aがε-N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号32)である、(1)のAβペプチド免疫原構築物。
(4) Thエピトープが配列番号45又は46である、(1)のAβペプチド免疫原構築物。
(5) 配列番号48〜65のアミノ酸配列を有する、(1)のAβペプチド免疫原構築物。
(6) 配列番号62〜65のアミノ酸配列から本質的になる、(1)のAβペプチド免疫原構築物。
(7) 配列番号62、63、64、及び/又は65である、(1)のAβペプチド免疫原構築物。
(8) 請求項1のAβペプチド免疫原構築物を有する組成物。
(9) a. (1)のAβペプチド免疫原構築物;及び
b. 医薬上許容可能なデリバリビヒクル及び/又はアジュバント;
を有する医薬組成物。
(10) a. (1)のAβペプチド免疫原構築物;及び
b. 医薬上許容可能なデリバリビヒクル及び/又はアジュバント;
を有するアルツハイマー病ワクチン組成物。
(11) a. (7)のAβペプチド免疫原構築物;及び
b. 医薬上許容可能なデリバリビヒクル及び/又はアジュバント;
を有するアルツハイマー病ワクチン組成物。
(12) (b)のアジュバントが、アルハイドロゲル(Alhydrogel)(Al(OH)3)又はアジュホス(Adjuphos)(AlPO4)からなる群から選ばれるアルミニウムの鉱物塩である、(10)のアルツハイマー病ワクチン組成物。
(13) (a)のペプチド免疫原が、CpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)と混合して安定化免疫刺激複合体を形成する、(10)のアルツハイマー病ワクチン組成物。
(14) (1)のAβペプチド免疫原構築物の(Aβ1−42ペプチドのN末端フラグメント)成分と結合する、単離抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
(15) Aβ1−10(配列番号6)と特異的に結合する、(14)の単離抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
(16) 請求項1のAβペプチド免疫原構築物と結合した、(14)の単離抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
(17) 配列番号6と結合した、(15)の単離抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
(18) (14)の単離抗体又はそのエピトープ結合フラグメントを有する組成物。
(19) (10)のワクチン製剤を投与することを有する、ヒト患者の認知症の重篤度を軽減する方法又はヒト患者の認知症の発病を遅らせる方法。
(20) ADの危険性があるか又はADである患者に、前記ワクチン製剤を1投与当たり10μg〜1000μgを有する水溶液を投与する、(19)の方法。
(1) 本発明のAβペプチド免疫原構築物は、下記式によって表される:
(Aβ1−42ペプチドのN末端フラグメント)−(A)o−(Th)−X
式中、(Aβ1−42ペプチドのN末端フラグメント)は、配列番号4〜6からなる群から選ばれる約10〜約14アミノ酸残基を有するB細胞エピトープであり;
各Aは、独立に、アミノ酸、Lys−、Gly−、Lys−Lys−Lys−、(α,ε-N)Lys、及びε-N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号32)からなる群から選ばれるアミノ酸又は結合基であり;
各Thは、配列番号34、37、38、40〜47及びその機能的免疫学的類似体を有する群から選ばれるヘルパーT細胞エピトープを構成するアミノ酸配列を有し;
Xは、アミノ酸のα-COOH又はα-CONH2であり;且つ
oは0〜約4である。
(2) アルツハイマー病(AD)ワクチン組成物であって、
a.(1)のAβペプチド免疫原構築物;
b.(a)の機能的免疫学的類似体;
c.(a)又は(b)のいかなる組合せ;及び
d.許容可能なデリバリビヒクル又はアジュバント;
を有する上記組成物。
(3) (d)のアジュバントが、アルハイドロゲル(Al(OH)3)又はアジュホス(AlPO4)であるアルミニウムの鉱物塩である、(2)のADワクチン。
(4) (a)のペプチド抗原が、CpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)と混合して安定化免疫刺激複合体を形成する、(2)のADワクチン。
a.配列番号49〜51、54、55、及び57〜65を有する群から選ばれるAβペプチド免疫原構築物;
b.(a)の機能的免疫学的類似体;
c.(a)又は(b)のいかなる組合せ;及び
d.許容可能なデリバリビヒクル又はアジュバント;
を有する上記組成物。
(6)アルツハイマー病(AD)ワクチン組成物であって、
a.(5)のAβペプチド免疫原構築物;
b.(a)の機能的免疫学的類似体;
c.(a)又は(b)のいかなる組合せ;及び
d.許容可能なデリバリビヒクル又はアジュバント;
を有する上記組成物。
(7) (d)のアジュバントが、アルハイドロゲル(Al(OH)3)又はアジュホス(AlPO4)であるアルミニウムの鉱物塩である、(5)のADワクチン。
(8) (a)、(b)、又は(c)のペプチド抗原が、CpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)と混合して安定化免疫刺激複合体を形成する、(5)のADワクチン。
(9) (a)、(b)、又は(c)のペプチド抗原が、CpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)と混合して安定化免疫刺激複合体を形成し、(d)のアジュバントが、アルハイドロゲル(Al(OH)3)又はアジュホス(AlPO4)であるアルミニウムの鉱物塩である、(5)のADワクチン。
a.配列番号62+63、64+65を有する群から選ばれるAβペプチド免疫原構築物;
b.(a)の機能的免疫学的類似体;
c.(a)又は(b)のいかなる組合せ;及び
d.許容可能なデリバリビヒクル又はアジュバント;
を有する上記組成物。
(11) a.配列番号64及び配列番号65の混合物を有するAβペプチド免疫原構築物;及び
b.CpG ODNとさらに混合した(a)の混合物;
を有する組成物。
(12) a.配列番号64及び配列番号65の混合物を有するAβペプチド免疫原構築物;
b.CpG ODNとさらに混合した(a)の混合物;及び
c.アジュホス;
を有する医薬組成物。
b.CpG ODNとさらに混合した(a)の混合物;及び
c.アルハイドロゲル;
を有する医薬組成物。
(14) (13)の医薬組成物をヒトに投与することを有する、ヒトの認知症の重篤度を軽減する方法又はヒトの認知症の発病を遅らせる方法。
(15) (13)の医薬組成物をヒトに300μg/0.5mL/投与で投与することを有する、ヒトの認知症の重篤度を軽減する方法又はヒトの認知症の発病を遅らせる方法。
(16) a.(13)の医薬組成物をヒトに300μg/0.5mL/投与で投与すること;及び
b.初期として0週、4週及び12週に投与すること;
を有する、ヒトの認知症の重篤度を軽減する方法又はヒトの認知症の発病を遅らせる方法。
(17) a.(13)の医薬組成物をヒトに300μg/0.5mL/投与で投与すること;
b.初期として0週、4週及び12週に投与すること;及び
c.(b)の工程後、3カ月毎に1回、及び/又は6カ月毎に1回、及び/又は12カ月毎に1回、追加投与すること;
を有する、ヒトの認知症の重篤度を軽減する方法又はヒトの認知症の発病を遅らせる方法。
(18) 投与が筋肉注射による(14)〜(17)のいずれかの方法。
(20) ヒトへの投与が以下である(19)の方法:
a.ヒトが軽度ADである場合、投与がADの処置のためである;
b.ヒトがMCIである場合、投与が認知症の重篤度の予防及び/又は軽減のためであるか及び/又は認知症の発病の遅延のためである;
c.ヒトがADの徴候又は症状を示さないが、年齢が60を越えている場合、投与が認知症の重篤度の予防及び/又は軽減のためであるか及び/又は認知症の発病の遅延のためである。
(21) (a)のペプチド抗原が、オリゴデオキシヌクレオチドCpGと混合して安定化免疫刺激複合体を形成する(2)〜(10)のいずれかのADワクチン。
(22) (a)のAβペプチド免疫原構築物が配列番号17〜20のアミノ酸配列を有する上記のADワクチン。
(23) (a)のAβペプチド免疫原構築物が配列番号19及び20のアミノ酸配列を有する上記のADワクチン。
(24) (a)のペプチド抗原の全量が投与当たり約10μg〜約1mgである上記のADワクチン。
(25) デリバリビヒクル又はアジュバントが、モンタニドISA50V、モノオレイン酸ポリオキシエチレン(20)ソルビタン、エマルシゲン、エマルシゲンD、及びCpGオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる上記のADワクチン。
(27) 認知症が、アルツハイマー型の認知症又はアミロイド血管障害を伴う血管認知症である上記のいずれかの方法。
(28) 認知症が、パーキンソン病又はレビー小体型認知症を伴う認知症である上記のいずれかの方法。
(29) 前記ワクチン製剤を、投与当たり10μg〜1000μgを有する水溶液で、ADの危険性があるか又はADである患者に投与する上記のいずれかの方法。また、許容可能なのは、投与当たり100〜750μg又は投与当たり300μgである。300μgは、臨床試験で効能よく用いられるターゲットの投与量とすることができる。
(30) 投与は、3カ月毎に1回及び/又は6カ月毎に1回及び/又は12カ月毎に1回とすることができる。
(31) 投与は、抗体力価に基づいてワクチン投与の頻回を決定することができる。
(33) アルツハイマー病に関連する公知の遺伝子型を有する患者がApoE4遺伝子型を有する患者を有する上記のいずれかの方法。
(34) (a)のAβペプチド免疫原構築物及びその組合せを有するワクチン製剤を、0週、4週及び12週に3回投与による初回刺激のために、投与当たり300μg/0.5mLで投与する上記のいずれかの方法。
(35) ワクチン製剤を、3カ月毎に約1回、その後6カ月毎に1回、及びその後12カ月毎に1回、投与する上記のいずれかの方法。
(36) 以前にワクチン製剤の接種を受けた患者の血液由来のB細胞を、ADの予防及び処置のためにAβペプチドのN末端をターゲットとするヒトモノクローナル抗体の調製及び選択に用いる上記のいずれかの方法。
(37) 初期注射から0週、4週及び12週で初期免疫化を提供し、ついで3カ月に1回、6カ月に1回、最も好ましくは12カ月に1回、追加免疫化を行うことを有する対象者における免疫応答を誘発させる方法。
(38) 投与は、投与当たり10μg〜1000μg、好ましくは100μg〜750μg、より好ましくは投与当たり300μgで行うのがよい。
(39) 上記の投与の経路は、当業界で公知の標準の経路、例えば筋肉内経路、皮下経路、経口などによるのがよい。
a)配列番号49〜51、54、55、及び57〜65;
b)(a)のホモログ;
c)(a)又は(b)の抗原性及び免疫学的機能的類似体;
d)少なくとも1つの保存的アミノ酸置換、アミノ酸付加、及び/又はアミノ酸欠失を有する(a)、(b)又は(c);
e)(a)〜(d)のいかなる組合せ;
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する。
他の特異な製剤において、Aβペプチド免疫原構築物は、配列番号64及び65並びにそれらの混合物からなる群から選ばれる。
他の製剤は、特異な製剤の等モル比混合物をさらに含み、該Aβペプチド免疫原構築物が配列番号62及び63からなる群から選ばれる。他の製剤は、特異な製剤の等モル比混合物をさらに含み、該Aβペプチド免疫原構築物が配列番号64及び65からなる群から選ばれる。
ある特異な製剤において、配列番号62及び63(又は64及び65)の等モル比混合物の量は、投与当たり約1μg〜約1000μgである。
ある特異な製剤において、配列番号62及び63(又は64及び65)の等モル比混合物の量は、投与当たり約100μg〜約750μgである。
ある特異な製剤において、配列番号62及び63(又は64及び65)の等モル比混合物の量は、投与当たり約300μgである。
以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するために用いられるべきでない。
アミロイドベータ(Aβ)関連ペプチドの合成
効能ある標的のAβワクチンの設計及び製剤を目的とする開発の試みに含まれるデザイナーAβ関連ペプチド構築物を合成する方法を記載する。ペプチドは、研究室のパイロット試験及び現場での試験に有用である少量で合成できるだけでなく、ワクチン製剤及び血清学的アッセイの工業的商業生産のために有用である大量(キログラム)でも合成できる。
血清学的アッセイ及び試薬
合成ペプチド構築物及びその製剤の機能的免疫原性を評価するための血清学的アッセイ及び試薬を以下に詳述する。
以下の実施例に記載の免疫血清試料を評価するためのELISAアッセイを開発した。次に説明する。
上述と同様のELISA及び上述と同様にして、96ウェルELISAプレートのウェルを、2μg/mL(特に断りのない限り)KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)のような担体タンパク質、Thペプチド又はThコンビナトリアルペプチドライブラリー(配列番号44〜47)の10mM NaHCO3緩衝剤溶液(pH9.5(特に断りのない限り))100μLで、1時間、37℃でそれぞれコートした。各種Aβペプチドワクチン製剤を接種したワクチン接種動物の抗体価を決定するために、10倍段階希釈の1:100〜1:10,000の血清を試験し、Log10で表される試験血清の力価を、カットオフA450を0.5に設定したA450の線形回帰分析によって計算した。
免疫化した宿主又はワクチンにおける抗Aβ抗体の微細な特異性分析をエピトープマッピングによって測定した。簡潔には、96ウェルプレートのウェルを、0.5μg/0.1mL/ウェルのhAPP10アミノ酸長ペプチド(配列番号6、8〜30)でそれぞれコートし、次いで、血清試料(PBS中1:100希釈)100μLを、上述の抗体ELISA法の重複する次の工程で、10アミノ酸長のプレートウェル中で培養した。ワクチンのB細胞エピトープ、並びに免疫化した宿主におけるヒヒ、マカク及びヒト抗Aβ抗体に関連する微細な特異性分析も、Aβ1−10ペプチド(DAEFRHDSGY、配列番号6)、N末端での置換を有するAβ改変合成ペプチド又は非関連コントロールペプチドで予備吸収し、次いで、更なる特異性確認のために抗Aβ1−28ELISA試験によって試験した。
ヒト被験者又は動物由来の免疫前血清試料及び免疫化血清試料を、実験ワクチン投与プロトコルに従って採取し、56℃で30分間加熱して血清の補体因子を不活性化した。ワクチン製剤の投与に続き、プロトコルに従って血液サンプルを入手し、特異的な標的部位に対するそれらの免疫原性を評価した。連続希釈した血清を試験し、陽性の力価を相互希釈のLog10として表した。特定のワクチン製剤の免疫原性を、所望のB細胞応答を増強するのに用いられる「ヘルパーT細胞エピトープ」に対する抗体の反応性を無視できるほど低く維持しながら、標的抗原内の所望のエピトープ特異性に対する高力価のB細胞抗体反応の誘発能によって評価する。
高感度Aβ1−40イムノアッセイ(インビトロジェン(Invitrogen)(商標)、バイオソース(BioSource)(商標)Cytokines & Signaling、カマリロ、CA、米国)を使用して、キットの指示書に従って、カニクイザルの血清、血漿及びCSF中のAβ1−40濃度を測定した。Aβ1−42レベルは正常なカニクイザルでは検出限界以下であった。hAPP751遺伝子導入マウスの脳組織の血漿、CSF及び化学抽出物中のAβ1−40及びAβ1−42レベルを、Aβ1−40及びAβ1−42イムノアッセイ(Genentics Company Inc.、チューリッヒ・シュリーレン、スイス)の指示書に従って測定した。軽度〜中程度アルツハイマー病の人の血漿中のAβ1−40レベルの定量化を、キット指示書(ヒトアミロイドβ(1−40)アッセイキット、IBL、27714)に従って測定した。ヒト血漿中のAβ1−42レベルは検出限界以下であった。
免疫組織化学的分析
正常成人ヒト組織(PhenoPath Laboratories Inc.社、シアトル、WA、米国)及びアルツハイマー病症例の脳標本(Dr.Felicia Gaskin、バージニア大学、バージニア、シャーロッツビル、VA、米国)を、死後及び/又は外科病理標本から入手した。カニクイザル組織標本(Beijing Jo-Inn New Drug Research Center、北京、中国)及びhAPP遺伝子導入マウスの脳標本(JSW-Rearch GmbH、グラーツ、オーストリア)を剖検にて入手した。組織は、液体窒素中でスナップ凍結、冷OCT包埋化合物中に浸漬及び凍結切片のいずれかであるか、或いはホルマリン固定、パラフィン包埋及び標準的な手法によって調製した切片であった。
リンパ球増殖及びサイトカイン産生に対するT細胞機能アッセイ
T細胞の活性化を評価するためのリンパ球増殖及びサイトカイン産生を含むT細胞機能アッセイの手順を以下に詳述する。
ヘパリン処置血液を採取し、PBMCをフィコール−ハイパーク(Ficoll-Hypaque)密度勾配遠心分離によって単離した。リン酸緩衝食塩水(PBS)で2回洗浄後、10%ウシ胎児血清(FCS)を補充したRPMI1640からなる細胞培地でPBMCを再懸濁した。いくつかの実験では、単離PBMCを凍結し、液体N2中で保管し、続くインビトロでの培養のために解凍した。
ワクチン接種した動物のPBMCを、選択したワクチン免疫組成物10.0μgの存在下、24ウェル培養プレート(Nunc)のそれぞれのウェルに2.5×106cells/mLで培養した。抗原を刺激しないPBMCのみを含有するネガティブコントロールの培養物も培養した。全ての培養物を5.0%CO2インキュベータ中37℃で3日間保った。培養開始から3日後、上清を採取し、上記の定量アッセイを使用してそれぞれのサイトカインを測定した。
カニクイザルのPMBC培養物のサイトカイン分析(IL−2、IL−6、IL−10、IL−13、TNF−α、IFN−γ)を、培地のみ、又は各種Aβペプチドドメイン又はマイトジェン存在下のアリコートで行った。サル特異的サイトカインサンドイッチELISA試験キット(U-CyTech Biosciences社、ユトレヒト、オランダ)を使用して、キットの指示書に従ってそれぞれのサイトカイン濃度を測定した。
安全性、免疫原性、毒性及び有効性研究で使用した動物
モルモット:免疫原性試験は、成熟した無感作の、成体の雄性及び雌性ダンカン−ハートレー系モルモット(300〜350g/BW)で実施した。実験は1群当たり少なくとも3頭のモルモットを用いた。ダンカン−ハートレー系モルモット(8〜12週齢;Covance Research Laboratories、デンバー、PA、米国)が関わるプロトコルを、IACUC申請の承認の下、契約した動物施設だけでなく、スポンサーのUBIにおいても行った。
モルモット及びヒヒに対するAβペプチド構築物の免疫原性の初回順位のための一般的なワクチン製剤
各実験で用いる医薬組成物及びワクチン製剤を下記の実施例においてより詳述する。簡潔には、各研究群で特定した製剤は、通常、異なる型のスペーサー(例えば、εK又はペプチド構築物の溶解度を向上するKKKを有するεK)、並びにデザイナーペプチド構築物のN末端で結合したAβペプチドフラグメントを有する麻疹ウイルス融合タンパク質及びB型肝炎表面抗原に由来する人工ヘルパーTエピトープの2つのセットを含有する非特異的(promiscuous)ヘルパーT細胞エピトープの変異体を介して結合するAβペプチドのフラグメントを有する、全ての型のデザイナーAβペプチド構築物を含有する。100を超えるデザイナーAβペプチド構築物は、全長Aβ1−42に対するそれらの相対的な免疫原性を最初にモルモットで評価し、更にAD患者の脳切片からの天然プラークとのそれらの交差反応性を評価した。Aβペプチド構築物を、特定のペプチド構築物の様々な量で、鉱物塩又はアルハイドロゲル(Alhydrogel)(アラム)と混合した、ヒトワクチン用に承認された油としてセピック・モンタニド(Seppic Montanide)(商標)ISA51を有する油中水型乳剤に調製した。ワクチンは、通常、Aβペプチド構築物を水に約20〜800μg/mLで溶解することによって調製し、モンタニド(商標)ISA51で油中水型乳剤(体積で1:1)に、又は鉱物塩若しくはアルハイドロゲル(Alhydrogel)(アラム)(体積で1:1)と共に製剤化した。ワクチン製剤を室温で約30分間保ち、免疫前に約10〜15秒間ボルテックスによって混合した。
アルツハイマー型認知症の予防及び処置のための、Aβ1−14ペプチド免疫原構築物を組み込む多成分ワクチン製剤の設計原理、スクリーニング、同定及び最適化
設計の歴史:各ワクチン又は免疫療法製品は、特定の疾患の機構及び治療介入に必要な標的タンパク質に基づく独自設計の焦点とアプローチが必要である。後に設計がモデル化された標的は、疾患経路に関与する細胞タンパク質又は病原体の幾つかのタンパク質が関与してよい感染因子を含むことができる。研究から商業化へのプロセスは、達成までに典型的には10年以上を必要とする非常に長いプロセスである。
本発明者によって開示された以前の発明(Wang CY、米国特許第6,906,169号(米国、ユナイテッド・バイオメディカル社、2005);Wang CY.、米国特許第7,951,909号(米国、ユナイテッド・バイオメディカル社、2001);Wang CY.、米国特許第8,232,373号(米国、ユナイテッド・バイオメディカル社、2012)に続くものとして、髄膜脳炎のような重篤な副作用を引き起こす、アルツハイマー病患者にしばしば存在するヘルパーTエピトープ類似体を発現する配列のC末端ドメインが欠損したAβ1−14ペプチド上に沈着したAβ分子からのB細胞エピトープの更なる改良物を、ワクチン製剤に組み込まれる設計中の標的B細胞エピトープとして選択した。
多様な遺伝的背景の患者を処置するワクチンを設計する場合、多様な遺伝的背景を有する人口の範囲を最大にする設計とすることが重要である。したがって、そのような組合せのためにAβ1−14由来ペプチド免疫原構築物の相乗的な免疫原性効果を探索した。MVF及びHBsAgに由来する非特異的(promiscuous)ヘルパーTエピトープは、このような免疫原性の増強を提供するための最も潜在能力あるものの中の代表であるので、これら2つのヘルパーTエピトープを含むペプチド構築物の組み合わせをこのような探索のために設計した。MVF及びHBsAg(配列番号44及び45)両方のためのヘルパーTエピトープのコンビナトリアルライブラリーの形態を、表2に示すように、最大のMHC結合モチーフ範囲を考慮して、Aβ1−14由来構築物(配列番号62及び63)に対して設計し、それらは、個々に又は組み合わせて、続いて、1投与当たり100μg/0.5mLで抗原刺激(0wpi)及び2回の追加免疫(3及び5wpi)の予定で、モルモットに対する免疫原性を評価した。表5に示すように、2つの免疫原の等重量比混合物は、個々のペプチド構築物それぞれによって誘発されるものと比較して、かなりの免疫応答を誘発した。
Bエピトープ免疫原性を増強するために使用されるそれぞれのヘルパーTエピトープを試験するために、初回免疫後8週(wpi)の過免疫の血清を免疫化した宿主から採取した。同様に免疫化した宿主の過免疫の血清は、Aβ1−14ペプチドのN末端にシステイン残基を付加する化学的カップリングによって調製されたKLH結合Aβ1−14ペプチドの同様の抗原刺激及び追加免疫の免疫の予定によって得られた。表6から明らかなように、単独又は組み合わせのいずれかのデザイナーAβ1−14ペプチド免疫原構築物(配列番号62及び63)で免疫化した全ての宿主は、標的のAβ1−42の交差反応性に対する抗Aβ1−14抗体の交差反応性に所望の高い力価をもたらした一方、2つのヘルパーTエピトープ(配列番号44及び45)に対しては、反応性はわずかであるか又は全く生じなかった。対照的に、Aβ1−14エピトープ(Log10力価が2.2〜3.9)に対する慣用の担体タンパク質KLHによって生じる相対的な免疫原性にもかかわらず、担体タンパク質KLHに対する非常に高い抗体反応が、非常に高い力価(GeoMeanのLog10力価が6.2)を有する全ての動物によって生じ、「標的B細胞エピトープ」に対して特異な「集中した」応答が、B細胞及びT細胞エピトープの構造及び機能の理解に基づいて、これらの合理的に設計されたペプチド免疫原構築物での免疫化の結果であるという以前の知見が再度検証された。
これらのAβ1−14ペプチド免疫原構築物によって誘発される抗体の機能的特性を調査する、さらなる開発事業に移行する前に、ヒトの試験で最も頻繁に使用される2つの異なる製剤にこれらのペプチド構築物(配列番号62及び63、等モル比)を様々な量で組み込んだワクチン製剤の相対的な免疫原性の評価をヒヒにおいて評価した。ヒヒは、尺度がヒトのものと最も似ている免疫応答を生じる動物種である。全てのワクチン製剤を、1投与当たり0.5mLで動物に投与した。将来の使用のための本来の標的用量は100μg/mLであるので、この用量で3頭の動物に投与した。より弱いが最も頻繁に使用されるアジュバントであるアラムに対する、より潜在能力のあるISA51油中水型製剤の相対的な免疫原性の評価を、同じ100μgで行った。試験した油中水型乳剤系において、1投与当たり、25μg、100μg及び400μgで用量漸増試験を評価した。この試験の最初の観察では、1投与当たり0.5mL中100μgを与える同じペプチド免疫原含量を有するISA油中水型乳剤の製剤と比較して、アラム系製剤では低下した免疫応答(1Log10以上の抗体価)が生じた。1投与当たり100μgが免疫化した宿主に対する将来のワクチン製剤投与のための本来の標的量であったが、表7に示すように、25μgから、100μg、400μgそれぞれに投与量を増加すると、免疫応答の上昇が観察された。したがって、デザイナーAβ1−14ペプチド免疫原構築物(配列番号62及び63)又はそれらの類似体のペプチド免疫原構築物は、100μgを超える用量が更に検討されるだろう。
アルツハイマー型認知症処置用の成功裡の免疫治療ワクチンの開発の基準
免疫治療ワクチンを開発するためのUBIの戦略は、「自己」バリア、及び遺伝的多様性の制限、並びに安全な(Safe)、独特の(Unique)、特徴的な(Characterizable)、費用対効果の高い(Cost-effective)、有効で(Efficacious)、安定(Stable)且つスケーラブルな(Scalable)(造語としてのSUCCESS)、最適なペプチド系ワクチン製剤の開発を克服するための基盤技術に基づく標的のB配列と結合する独占的所有権を有する非特異的(promiscuous)Thエピトープの設計を含む(Wang CYら、2005;Sokoll KK,2004)。特別な注意を初期設計段階に払うことで、このワクチンとしての規制当局の承認の観点から特徴付けられるワクチン製剤のためのプログラムの開発段階に入るであろうペプチド免疫原を選ぶことを可能にし、第III相試験後に患者への効能が証明されたとき、これまでの人類の歴史において、数百万の用量基準で、患者に投与される最初の完全な合成ペプチド系ワクチンになるだろう。かなりの所望の免疫応答が生じることが既に証明された多くの中から選ばれたペプチドの品質設計への特別な注意が、細部にわたるとき、使用されるそれぞれのペプチドの「溶解性」、合成化学収率、及び配列設計に固有の精製ハードルに対してはらわれる。高い安全因子を有する十分に許容されるアジュバントもまた、多くの許容される選択の中で、考慮する重要な因子になるだろう。免疫原性の安全因子とスケール間のバランスを考慮しなければならない。また、免疫原性が安全因子によって妥協される場合、免疫応答をさらに高めるために、他のワクチン製剤のいかなる特徴をも組み込むことができる。再び、ワクチンの成功は、多様な遺伝的背景を有する、可能な限り多くの幅広い人口において、所望の免疫応答を生じるその能力に帰し、主要組織適合抗原複合体(MHC)の幅広い範囲はまた、考慮における非常に重要な因子でなければならない。
前臨床及び臨床試験用のUBI ADワクチンの開発のための多くの免疫原候補の中から2つの高精製Aβ1−14ペプチド免疫原構築物(配列番号64及び65)を選択した後、これら2つのペプチドの等モル比混合物を、図4に示すように、モルモットに対する投薬研究において、一定量(0.5mL)のアラム/鉱物塩の存在下でそれらの免疫原性を試験した。上記の2つのAβ1−14ペプチド免疫原構築物(配列番号64及び65)を含むペプチド混合物の様々な量として、0.5mLの鉱物塩(リン酸アルミニウム、アジュホス(Adjuphos))中、0μg、10μg、30μg、100μg〜300μgを、26週間にわたる免疫原性の観察を伴う0、3及び5wpi(初回免疫後の週)の免疫の予定に基づき、モルモットで試験した。初回免疫後5週あたりの免疫応答のピークで、1投与当たり300μgを接種した動物は最も高い免疫応答を与え、100μg及び30μgを接種したものと続き、次いで10μg用量であり、続く26週間を通じて同様の免疫応答の順位であった。したがって、0.5mLアジュホス当たり300μgでの最高用量は免疫の最適条件であると考えられ、異なる種での他の関連する製剤において、免疫原性を研究するための手引きとして使用されるだろう。
アジュバントとしてアラム又はその関連する鉱物塩の使用に内在する、関連するワクチン製剤の免疫原性は、それらの標的のAβ1−14B細胞エピトープの力価も約1Log10まで低下するだろう(実施例7における類似の研究から推測される)。したがって、ワクチン製剤の免疫原性を更に上昇させる手段を検討する。
細菌、ウイルス及び寄生虫のような一般的な外来性の侵入者の個々の分子パターンの特徴を認識する能力を持つ。具体的にはメチル化されていない、合成CpG配列は、TLR9に結合し、活性化することができる。潜在能力のあるB細胞のマイトジェンとして、TLR9アゴニストは、強い抗体免疫応答を誘導するのに有効である。CpGの作用のメカニズムは、それらの中で、持続性の抗原特異的抗体の産生に関与する。
筋肉内注射用のUBI ADワクチン製剤
Aβ1−14−εK−KKK−MvF5 Thペプチド免疫原構築物(配列番号64)及びAβ1−14−εK−HBsAg3 Thペプチド免疫原構築物(配列番号65)は、生理学的なpHにおいてカチオン性である。図2A、2B、2C(左側)は、2つのペプチド単独及び等モル比混合物のHPLCプロファイルを示す。図2D及び2E(右側)は、それぞれ分子量(Da)が3892及び4374の2つのペプチドのMALDI−TOF質量分析によって特徴付けられるプロファイルを示す。ポリアニオン性CpG ODNの添加は、電荷の中和、溶液中での免疫刺激複合体(ISC)の即時の「自己集合」を生じさせる。カチオン性ペプチド:アニオン性CpGのモル電荷比の化学量論が会合の程度を決める。UBI ADワクチンを段階的に調製した:おおよそ等しいCpG ODNに対するモル電荷比を有する、2つのAβペプチド免疫原構築物の等モル混合物を用いて注射用水でISCを調製した。
高精製Aβ1−14ペプチド免疫原構築物(配列番号64及び65)を用いるモルモットの免疫原性の初期レベル及び投薬研究に基づき、2つのAβ1−14ペプチド免疫原構築物(配列番号64及び65)を等モル比で含む混合物300μgを、上述のように、CpGオリゴマーを有する免疫刺激複合体として調製した。次いで、10週にわたって特異的抗体レベルを観察する0、3、6週の免疫プロトコルに基づいて、筋肉注射用の1投与当たり300μgのペプチドをヒヒに免疫化するために、それらをアラム若しくはアジュホスのいずれかを有するか、又はアジュバントなしで製剤化した。この動物種は尺度が人のものと最も似ている免疫応答を生じるので、このような免疫原性評価及びヒト試験の導入前の最終製剤の評価のためにヒヒを使用した。全てのワクチン製剤を1群当たり2頭の動物で、1投与当たり0.5mLで動物に与えた。図6に示すように、1投与当たり0.5mL中300μgにおいて、アジュバントとしてアラム若しくはアジュホスが存在するか又は不存在の3つの製剤全てが、Aβ1−14ペプチドに対するELISAによって示すように、0.5Log10スケールの範囲内で約同等レベルの免疫原性を示した。ISC製剤はペプチド単独によって発現する免疫原性を著しく増強させた。しかしながら、8〜10週にわたる観察後、アジュホスによって支持されている製剤は、他の2群と比較して、応答スケールが0.5〜1Log10に拡大した、著しく高い免疫応答を維持していた(即ち、約3〜10倍更に強力)。3つの密接に関連する製剤であって、アジュバントからの任意の複雑な要因がないように非常に集中し且つ所望の免疫応答を生じる高精製の合理的に設計されたペプチドを使用することによる高い安全因子であるように設計された製剤でヒヒの免疫原性をこのように慎重に較正することによって、UBI ADワクチン製剤は、以下の実施例に示すように、免疫原性、特異性、誘発抗体に関する機能的特性、急性及び慢性毒性、並びに最終的に臨床的有効性のための、霊長類及びヒトにおける更なる探索のために最終化される。
CpG ODNに対するペプチドのおおよそ等しいモル電荷比でCpGと更に混合した2つのAβペプチド免疫原構築物(配列番号64及び65)の等モル比混合物を用いて、注射用水でISCを調製した。反対の電荷の静電中和を介するプロセスにおいて、UBI ADワクチン製剤中のCpG ODNはペプチド免疫原構築物と100%結合し、ミクロンサイズの粒子の形成をもたらした。この粒子状形態により、CpG アジュバントの通常の使用からCpG ODNの投与量を著しく低減すること、有害な自然免疫応答の可能性を低減すること、且つプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)を含む代替の免疫原のプロセシング経路を促進することが可能となる。予め形成したISCに、アルミニウム鉱物塩、浸透圧のための生理的食塩水、及び保存剤を連続して添加した。アルミニウム鉱物塩のうち、リン酸アルミニウムを、免疫原性の更によい維持(sustenance)に対するヒヒの免疫原性試験の結果に基づき、アラムゲルに代えて、使用した。
アジュバントとして20%の過剰でリン酸アルミニウム(アジュホス)を有する1投与当たり0.5mL中300μgで調製したUBI ADワクチン製剤を上述したように調製し、1mL無菌ガラスバイアルに充填し、2〜8℃で2年間保管した。安定性試験のプロトコルに従って試料を回収した。すべての物理的パラメータは品質管理(QC)規格に適合していた。Aβ1−14ペプチド免疫原構築物は、CpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)及びアジュホスアジュバントから脱複合化して、各ペプチド用の分析規格に従ってHPLCにより分析した。図2Cの左下側に示すように、2つのAβ1−14ペプチド免疫原構築物(配列番号64及び65)は、HPLC分析における予想溶出時間で、2つのペプチドそれぞれの等モル混合物であることが明らかになった。
UBI ADワクチンの血清学的特異性及び安全性を評価するための、アルツハイマー病のヒトの脳の免疫組織化学染色
実施例7に記載の等モル比のAβペプチド免疫原構築物(配列番号62及び63)で免疫化した群3及び群4のヒヒから過免疫の血清を精製IgG分画として貯蔵し、ヒトAD脳とのそれらの反応性を試験した。図8に示すように、大脳の血管及びアミロイドプラーク両方の染色は、過免疫血清からの精製IgGによって認められたが、免疫前の血清から同様のIgG分画からは認められなかった。Aβ1−14ペプチドでの免疫血清のプレインキュベーションは、脳の血管及びアミロイドプラーク両方との全ての免疫反応性を吸収するが、非関連ペプチドによっては吸収せず、Aβペプチド免疫原構築物(配列番号62及び63)を有するワクチン製剤でのワクチン投与による免疫血清における抗Aβ抗体の反応性の高い特異性を示す。
成体ヒヒにおけるプロトタイプのUBI ADワクチン製剤の免疫原性試験
プロトコルのパートAにおいて、独占的所有権を有する免疫刺激複合体(ISC)に複合化し、アルミニウム鉱物塩アジュバントで製剤化したAβ1−14ペプチド免疫原(1投与当たり300μgの全ペプチド)で、4頭の成体雄ヒヒを0、3及び6週に免疫化した。ISC/鉱物塩製剤は強い抗Aβ抗体反応を全ての動物にもたらした(図9A)。有害な注射部位反応は認められなかった。
抗Aβ抗体による原線維形成の阻害及びAβ1−40が介する毒性からの保護のためのインビトロでの神経毒性アッセイ
神経毒性アッセイは、Solomon Bら(Proc Natl Acad Sci USA 1997;94:4109-4112)によって以前に記載されたように、ラット褐色細胞腫株PC−12及びAβ1−40ペプチドの熟成溶液を使用した。ペプチド溶液は、コンゴレッドバインディング(Congo Red Binding)により、原線維の形成によって特徴付けられた。6日及び9日目に、A540nmで吸収を示す等量の染料と溶液を結合した。この観察は、有毒なAβ1−40凝集体の形成の証拠を提供し;9日の調製物をPC−12細胞に対する毒性について試験した。
ラット褐色細胞腫株PC−12及び毒性を特徴付けるAβ1−40ペプチドの熟成溶液を使用する神経毒性アッセイを用いて、UBI ADワクチンの抗体反応の機能的効能を評価した。Aβ1−40ペプチドの熟成溶液を、動物の免疫プロトコルからのモルモット又はヒヒの抗Aβ血清の存在中で1時間のプレインキュベーションに続いて、PC−12細胞に対する毒性について、試験した。抗Aβ血清を1:30及び1:90希釈で試験した。最終的な結果を、Aβ1−40原線維凝集の抑制割合及びAβ1−40原線維が媒介する細胞毒性からのPC−12細胞の保護割合として表した。両方の免疫実験の0週の予備免疫血清をコントロールとして含めた。5及び8週の免疫性のモルモット血清及びヒヒ血清の1:30及び1:90の両方の希釈液は、相当する希釈液の予備免疫血清の5〜10%のバックグラウンド阻害と比較して、著しい阻害を提供し(それぞれ、5及び8週の両方で採血されたモルモット血清の1:30及び1:90の両方の希釈液で、50〜70%);且つ原線維の阻害アッセイにおける免疫前のヒヒ血清の15%のバックグラウンド阻害と比較して、著しい阻害を提供した(それぞれ、5及び8週の両方で採血されたヒヒ血清の1:30及び1:90の希釈液で、75及び50%)。同様に、モルモット及びヒヒの両方の予備免疫血清から得られたバックグラウンドの結果と比較して、60〜80%の範囲内でAβ1−40が媒介する毒性からのPC−12細胞の保護がこれらの条件で認められた。これらの結果から、UBITh(登録商標)アミロイドβペプチド免疫原での免疫化によって惹起される抗体のための有毒なAβ1−40ペプチドに対する機能的中和活性が確立される。
hAPP751を過剰発現する若齢の遺伝子導入マウスの脳試料における、脳形態学上の予防モード及びアミロイドβペプチド(Aβ1−42)濃度に対するUBI ADワクチンの効果
我々は、スウェーデン及びロンドン変異を有するhAPP751を過剰発現する若齢の遺伝子導入(tg+)マウス並びにその非遺伝子導入(ntg)同腹仔(Rockenstein EM.ら、1995及び2001)の脳試料における、脳形態学上の予防モード及びアミロイドβペプチド(Aβ1−42)濃度に対するUBI ADワクチンの効果を評価した。
脳アミロイド沈着及び脳プラーク負荷、並びに血漿中のヒトアミロイドβペプチド(Aβ1−42)レベルに対する、12〜16週にわたるUBI AD免疫治療ワクチンの筋肉内ワクチン投与の効果を評価すること
hAPP751遺伝子導入(tg+)マウス及びそれらの非遺伝子導入(ntg)同腹仔(14+2週齢)を選び、脳Aβ沈着及び脳Aβプラーク負荷に対するUBI ADワクチンの効果を評価した。全部で33頭のtg+マウス及び10頭のntgマウスを4群に分けた:tg+プラセボコントロールマウス(n=10)にアジュバントのみを注射した;tg+実験マウス(n=13)にUBI ADワクチン(150μL投与当たり90μg)を注射した;無処置tg+コントロールマウス(n=10);及び無処置ntgコントロールマウス(n=10)。全部で3用量を0、3、12週に投与し、追加用量を16週に投与した。25.5週にて、全てのマウスについて、モリスの水迷路試験によって空間学習を観察した。マウスを更に4週間追跡し、その後屠殺した。
全てのtg+及びntgマウスについて、0、3、6、9、12、16、19、22及び29週に採血した。Aβ1−28ELISAを使用して抗Aβ1−28抗体価を測定するために血清を分離した。プラセボ処置tg+マウス及び無処置tg+マウスでは抗Aβ1−28抗体価は検出不能であった。しかしながら、UBI ADワクチン注射を少なくとも2回受けた若齢のtg+マウスでは検出可能な抗体価を有していた。
生存中の研究の最後にマウスを死なせ、マウスを生理的(0.9%)食塩水で経心的灌流し、脳を素早く取り出し、半切除し、更なる分析用に調製した。左半球を凍結し、後で以下の項目eで記載するようにして分析した。右半球は、新鮮な4%パラホルムアルデヒドのPBS溶液、pH7.4で1時間、浸漬固定した。次いで凍結保護用の15%ショ糖溶液に半球を移した。翌日、脳をドライアイス上で凍結し、組織学的検査で使用するまで−80℃で保管した。凍結切片(10nm厚さ)をH&Eで染色し、記録し、神経細胞層の完全性及び肉眼で形態を評価した。モノクローナル抗体4G8(抗Aβ17−24)を用いてクライオカット(cryocut)組織切片を評価し、皮質及び海馬におけるAβ沈着及びプラーク負荷を測定した。プラーク数及びプラークで覆われた面積を定量化し、各動物の矢状の脳を横断する5つの異なる層からの9組織切片の平均値を、動物について統計的に関連する値で構築した。UBI ADワクチン処置群の7頭のtg+マウス、及び無処置コントロール群の7頭のtg+マウスを評価した。結果を、UBI ADワクチン処置(n=7)対無処置(n=7)動物のAβ1−28プラーク負荷のパーセントとして表し(図10A、10B)、免疫組織化学的検査による9組織切片で検出された相対的なプラーク負荷の平均を表す。UBI ADワクチンレスポンダーtg+マウス対無処置動物の比較は、大脳皮質(0.22%対0.32%)及び海馬(0.20%対0.29%)も含み;プラーク負荷の平均の減少が、高度に応答性のワクチン処置動物で示された。
動物を死なせ、以下の項目で記載するようにして脳を準備した。左脳半球を別々に凍結し、その後、4つの脳抽出物の可溶性分画について、ジェネティクス社(スイス)によって製造されている抗原検出用の高感度Aβ1−42ELISAキットを使用してAβ1−42ペプチドレベルを評価し;製造者から提供されている標準と比較してAβ1−42レベルを測定した。4つの脳の分画から得られた結果は「ng/g wet脳」として示す。各動物の左脳半球(嗅球を含む)を特徴付けるためにTRIS緩衝食塩水(TBS)、トリトンX−100界面活性剤、SDS界面活性剤及びギ酸(FA)で抽出し、Aβ1−42及び分画の評価を繰り返して試験した。簡潔には、TBS抽出物は脳組織の水溶性Aβ1−40及びAβ1−42分画を含有する。残存するβアミロイドペプチドを溶解するために、界面活性剤及び酸が必要である。トリトンX−100は、2つの性質を有するオリゴ−エチレングリコール誘導体であり;ベンゼン環を有するイソオクチル残基が無極性のファンデルワールス力を破壊し、且つ−O−CH2−CH2−残基の繰り返しが水素結合を分解する。SDSは類似する二面の効果を持つが、それは強く、全体の二次構造を破壊し;Aβペプチドは直鎖状を獲得し、ペプチド鎖が伸ばされるだろう。ギ酸は最強の溶媒で、主に水素結合を破壊する。TBSがオリゴマー構造を可溶化することが推測できる。トリトンはプロトフィブリル様の低分子ポリマーを可溶化する。SDSは残存する構造の全体を破壊し、強く複合化した不溶性の原線維を有する残存部分は、FA中で主にモノマーとして分離できる。したがって、ベータアミロイドの重合状態及び抗アミロイド生成性の試験化合物の効果を評価するために、4分画全てを調査する。
クライオカット組織切片について、CD11b抗体を使用して活性化ミクログリア細胞を評価し;対象の平均サイズを、ミクログリア細胞のクラスターの平均測定値として各切片中の対象の数による面積を指数として評価し;各動物の矢状の脳を横断する5つの異なる層からの9切片の平均値を、動物について統計的に関連する値で構築した。
クライオカット組織切片を評価して、大脳皮質、海馬及び血管内のT細胞の数を検出し、細胞の計数のみ行った。各動物の矢状の脳を横断する5つの異なる層からの9組織切片の平均値を、動物について統計的に関連する値で構築した。ワクチン処置tg+マウス(n=7)対無処置tg+コントロールマウス(n=7)の結果を、大脳皮質及び海馬中の染色されたCD3陽性T細胞数として表し、血管内の染色されたT細胞数は、無処置tg+コントロール動物と比較して、ワクチン処置動物が大脳皮質、海馬及び血管中で計数された免疫染色T細胞の平均数のわずかな減少を示すことを示す。
hAPP751遺伝子導入マウスに、16週間にわたって、UBI ADワクチン又はプラセボワクチンを筋肉内経路により3又は4回注射した。動物はUBI ADワクチンに対して全体的に良好な忍容性を示し、特に、これら動物に対してUBI Aβ1−14ペプチド免疫原構築物が1投与当たり90μg/150μLの高濃度での投与が考慮された。レスポンダーにおいて、これら動物の4脳組織抽出物においてAβプラーク負荷の減少及びAβ1−42レベルの減少が見出された。Aβ沈着及びプラークの減少も免疫組織化学的検査により示された。ワクチン処置tg+hAPP751マウスの脳内のミクログリア細胞の活性化又はT細胞の浸潤の証拠は存在しなかった。
安全性のためのUBI AD ワクチンに対する抗体反応のエピトープマッピング
固相抗原としてAβ1−14(配列番号4)、Aβ1−28(配列番号3)、Aβ17−42(配列番号67)、MvF5 Th(配列番号46)、HBsAg3 Th(配列番号47)ペプチドでコートしたプレートを用いるELISA試験で、免疫化したモルモット及びヒヒの血清中のUBI ADワクチンに対する抗体反応の特異性を評価した。ワクチンによって惹起された高力価の抗Aβ抗体がAβ1−14及びAβ1−28抗原で検出され(表1);しかしながら、Aβ1−28ペプチドについて、潜在的に有害な交差反応性の原因である14アミノ酸を超える「B細胞エピトープ伝播」による追加抗体も検出されたことが懸念された。
UBI ADワクチンで複数回免疫化したカニクイザルの血清及びCSF中の抗体反応及びAβ1−40レベル
ワクチン応答の反応速度論から、低用量群2(0.25mL当たり150μg)の6頭のカニクイザルのうちの4頭が、及び高用量群3(1.25mL当たり750μg)の6頭のカニクイザル全てが、初回免疫後、Aβ1−42との交差反応性のAβ1−14ペプチド免疫原構築物に対する抗体を産生したことがわかった。
UBI ADワクチンで複数回免疫化したカニクイザルの細胞免疫応答
末梢血単核球(PBMC)試料を15、21及び25.5週に採取した全血から単離し、次いで各種Aβペプチドの存在中で培養した。表14に示すように、Aβ1−14ペプチドを培地に添加した場合、リンパ球による増殖応答は観察されなかった。しかしながら、Aβ1−42又はAβ17−42(配列番号67)ペプチドを幾つかのPBMC培養物に添加した場合、陽性の増殖応答を示した。
モルモット、マカク及びヒヒの異なるレベルでのUBI ADワクチンの免疫原性の比較
ADワクチンの主要成分としてのそれらの適合性に対する各種Aβペプチド免疫原構築物の詳細な試験の後、配列番号64及び65を有するペプチド構築物を選択し、ワクチン製剤を考案及び設計した。CpGオリゴマーと免疫刺激複合体を形成する2つのペプチド免疫原構築物を有し、鉱物塩のアジュホスで補充した、選択したワクチン製剤(UBI ADワクチン)を、実施例8〜15に記載されたように詳細に試験し、複数の種(モルモット、マカク及びヒヒ)におけるその免疫原性、及び臨床試験でのその使用のための調製物における投与の管理体制を較正した。表16に、1又は2回投与後のペプチド用量対レスポンダーの割合(陽性の力価を有する動物数/試験した全動物数)、及びUBI ADワクチンの投与予定の評価のための各種の体重をまとめる。分析からは、追加免疫において高い又はほぼ完全な応答率を可能にするであろう単回注射後のかなりの応答率を達成するために、関係する全ての種のデータに基づき、用量レベル当たり100μgより高く設定することが好ましい。0.5mL用量当たり300μgのUBI ADワクチンをヒト被験者での研究のために選んだ。第I相臨床試験において、個人を0、4、12週に免疫化した。1回目投与後4週で、登録された19人の被験者のうち2人が陽性の抗Aβ抗体価を示し;8週での2回目投与後4週で、19人の被験者のうち17人が陽性であり;16週での3回目投与後4週で、19人の被験者の全てが陽性であり、24〜26週の第I相試験終了まで陽性を維持した。
UBI ADワクチン(UB−311)による治療効果を示唆する第I相臨床試験
Aβペプチドは、疾患過程におけるその役割を支持する、病理学的、生化学的及び遺伝的証拠に基づくADの主要な治療標的である。UBI ADワクチン(UB−311)のような活性Aβ免疫療法の目標は、免疫応答を刺激し、循環から過剰のAβペプチドを補足し且つ認知機能低下を予防するか又は遅らせる頑強な抗Aβ抗体を産生することである。
全ての被験者に対するAβ1−14ドメインのN末端に特異的なUB−311ワクチン誘発抗体の投与
表12に示すように、抗Aβ1−14抗体レベルの変化を、0、4、8、12、16及び24〜26週で測定し、UB−311ワクチンの免疫原性を評価した。0週(処置前)の全ての被験者についてlog10に変換した抗Aβ1−14抗体レベルの平均値が1.14であり、4週で1.21にわずかに上昇し、8及び12週で2.00及び1.91に顕著に上昇し、16週(3回目免疫後4週)に2.7のピークに達し、24〜26週で2.28に減少した。
軽度〜中程度のアルツハイマー病に対するUB−311ワクチンの効能を評価する神経学的、認知及び機能試験
UB−311の効能を、19人の患者におけるADAS−Cogスコア、MMSEスコア及びADCS−CGICの変化の測定することによって評価した。ADAS−Cogスコア及びADCS−CGICを0週(V2)、16週(V7)及び24〜26週に評価した。MMSEスコアを事前検査(V1)、16週及び24〜26週に測定した。被験者のうち、1.42及び0.79のADAS−Cogスコアの上昇が、0週から16週、及び16週から24〜26週でそれぞれ観察された。ベースラインでの平均ADAS−Cogスコアは被験者で26.26であり、16週に27.68に上昇し、24〜26週に28.47にわずかに上昇した。更に、MMSEスコアの0.32及び0.79の減少が、事前検査来診から16週、及び16週から24〜26週で認められた(図13)。
Aβ1−28モノマー、Aβ1−42モノマー又はAβ1−42オリゴマーに対するヒト抗体の検出用の酵素イムノアッセイ(ELISA)
アルツハイマー病の研究から、Aβ凝集体及びAβ由来オリゴマーがAD発病において中心的な役割を果たしていることがわかる。N−メチル−D−アスパラギン酸(NMDA)型グルタミン酸受容体(NMDA−R)サブユニットNR1及びNR2Bを発現するニューロンとのAβオリゴマーの結合はLacor PNによってCurrent Genomics 2007; 8:486-508に報告されている。海馬のニューロン細胞におけるNR1及びNR2BにAβオリゴマーが結合すると、このリガンド−受容体結合はシナプス終末数の著しい減少をもたらし、これは記憶及び認知障害及び認知症に関連する。最近、細胞でのインビトロ研究及び臨床試験の結果から、抗Aβオリゴマー抗体が、この結合を遮断でき、Aβオリゴマー毒性からニューロンを保護することがわかった。UBI ADワクチン(UB−311)は、各ペプチドが異なるTh2−バイアスN末端ペプチドエピトープと合成的に結合した短鎖のN末端Aβペプチド(Aβ1−14)を含む、2つのペプチド免疫原を含む。UBI ADワクチン応答の免疫原性を評価するために、Aβ1−28モノマー、Aβ1−42モノマー及びAβ1−42オリゴマーに対する抗体をインビトロで検出するための抗Aβ抗体酵素イムノアッセイ(ELISA)試験を開発した。
エピトープマッピング:N末端ペプチドに対するヒト抗体の検出用の競合的結合阻害酵素イムノアッセイ(EIA)
エピトープマッピングを用いて、結合部位、又はAβペプチド(Aβ上の9残基〜24残基の間)の10アミノ酸長のアミノ酸配列と重複する直鎖状の抗Aβ1−14抗体のエピトープを、ELISA試験で特定した。被験者19人の試験の血清試料を評価した。0、4及び12週での3回の免疫後である、16週における結果を以下に示す(図16)。
UB−311で免疫化した患者の血清試料中の抗体によって認識される主なエピトープはAβ1−10ペプチドに特異的であった
標的領域(表17)内の特定の残基に対する主な抗体結合部位を局在化させるための微細なエピトープマッピング法において、24番目が重複する10アミノ酸長ペプチド(配列番号6、8〜30)をAβ1−14ペプチド配列(配列番号4)及びヒトアミロイドβペプチド前駆体タンパク質(hAPP)の隣接領域の周囲に合成し、隣接するhAPP部位に加えてN末端アスパラギン酸残基「D」で始まるAβ1−14の全体の長さをカバーした(図16)。被験者19人から採取した血清試料を、免疫前及びUB−311を3回投与後16週に試験した。処置前の試料をベースライン抗Aβ抗体レベルとした(データは示さない)。予想通り、陽性のエピトープマップをもたらした19人全ての試料における主たる抗体反応は、図16及び表17に示すように、Aβ(配列番号6)の遊離アミノ末端に対するものであった。より具体的には、N末端の10アミノ酸長のAβ1−14で表されるペプチド(DAEFRHDSGY)が19人の患者全ての免疫化した血清と最も強く反応した。他のAβの10アミノ酸長ペプチドに対する弱い反応性を有する更なる抗体反応を、被験者19人のうち8人で検出した。全てではなく幾人かの被験者から、4、8、12及び24〜26週に採取した血清試料も試験し、一致した結果を示した(データは示さない)。要約すれば、これらのデータから、UB−311によって誘発された抗体の大部分は、14個の残基を超える部位ではなく、AβのN末端ドメインに特異的に向けられたことがわかる。
UBI ADワクチン(UB−311)の3回の免疫後の血漿中で増加したAβ1−40ペプチド
現在のところ、Aβ1−40(配列番号2)、Aβ1−42(配列番号1)の血漿濃度の変化、又はAβ1−42:Aβ1−40の比率について、疾患修飾処置の臨床試験における設定、又はコリンエステラーゼ阻害剤で処置したAD患者のいずれかの処置への応答との有意な関連は見いだされていない。それにもかかわらず、血漿Aβレベルは可能性のあるADのバイオマーカーとして提案されている。
Aβ1−14又はAβ1−42ペプチド存在下でヒトリンパ球(PBMC)を刺激しないUB−311の免疫用量
新たなワクチンの出現及び特定の免疫及び自己免疫疾患の間の関連を主張する広く公表された報告の数の増加は、免疫の危険性を超えた社会的関心となっている。抗原刺激に応答したリンパ球増殖及びサイトカインの産生は、ワクチン投与に続いて免疫系が過剰に活性化されるか否か、もしあればどの経路が関与するかを評価するために使用することができる。本研究の目的は、Aβペプチド又はポジティブコントロールとしてPHAマイトジェンの不存在下又は存在下でのリンパ球増殖の刺激指数(SI)、並びに16週の3回のUB−311免疫の前後のAD患者の培養リンパ球におけるサイトカイン濃度を測定することによって、UB−311の免疫原(Aβ1−14)の安全性を評価することであった。
Aβ1−14ペプチド存在下でのヒトサイトカインを刺激しないUB−311の免疫用量
PBMC培養物のサイトカイン分析(IL−2、IL−6、IL−10、TNF−α、IFN−γ)を、細胞のみ又はAβペプチドドメイン若しくはPHAの存在下で培地のアリコートで行った。ヒト特異的サイトカインのサンドイッチELISAキット(U-CyTech Biosciences社、ユトレヒト、オランダ)を使用して、製造者の指示書に従ってそれぞれのサイトカイン濃度(pg/mL)を測定した。0週及び16週に採取したPBMC試料についても、細胞のみ(ネガティブコントロール)又はAβペプチド、p1412(非関連ペプチド)若しくはPHAマイトジェン(ポジティブコントロール)の存在下のいずれかで3日間培養後、サイトカイン分泌を試験した。キットの定量範囲は5〜320pg/mLである。5pg/mL未満、又は320pg/mLを上回って測定された任意の濃度は、定量限界未満(BQL)又は定量限界超(AQL)として、それぞれ示した。しかしながら、統計的な考慮のために、BQL又はAQLを、それぞれ定量限界より低い(5pg/mL)又は上回る(320pg/mL)に置き換えた。0週及び16週での各サイトカインの平均濃度を表20に示す。予想通り、ポジティブコントロールであるPHAの存在中において、IL−2を除き、サイトカインの産生は有意に上昇した。Aβ1−14又は他のAβペプチドの刺激による応答に対するサイトカインの産生をベースライン(0週)及び16週で観察したが、ほとんどの値は、相当するネガティブコントロール(細胞のみ)と同様に見えた。
Claims (20)
- 下記式
(式中、(Aβ1−42ペプチドのN末端フラグメント)は、配列番号4、5、及び6からなる群から選ばれる約10〜約14個のアミノ酸残基を有するAβ由来のB細胞エピトープであり;
各Aは、独立に、アミノ酸、Lys−、Gly−、Lys−Lys−Lys−、(α,ε-N)Lys、及びε-N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号32)からなる群から選ばれるアミノ酸又は結合基であり;
各Thは、配列番号34、37、38、40〜47及びその機能的免疫学的類似体からなる群から選ばれるヘルパーT細胞エピトープを構成するアミノ酸配列を有し;
Xは、アミノ酸のα-COOH又はα-CONH2であり;且つ
oは0〜約4である)
を有するAβペプチド免疫原構築物:
(Aβ1−42ペプチドのN末端フラグメント)−(A)o−(Th)−X。 - (Aβ1−42ペプチドのN末端フラグメント)がAβ1−14(配列番号4)である請求項1記載のAβペプチド免疫原構築物。
- Aがε-N−Lys−Lys−Lys−Lys(配列番号32)である、請求項1記載のAβペプチド免疫原構築物。
- Thエピトープが配列番号45又は46である請求項1記載のAβペプチド免疫原構築物。
- 配列番号48〜65のアミノ酸配列を有する請求項1記載のAβペプチド免疫原構築物。
- 配列番号62〜65のアミノ酸配列から本質的になる請求項1記載のAβペプチド免疫原構築物。
- 配列番号62、63、64、及び/又は65である請求項1記載のAβペプチド免疫原構築物。
- 請求項1のAβペプチド免疫原構築物を有する組成物。
- a. 請求項1記載のAβペプチド免疫原構築物;及び
b. 医薬上許容可能なデリバリビヒクル及び/又はアジュバント;
を有する医薬組成物。 - a. 請求項1記載のAβペプチド免疫原構築物;及び
b. 医薬上許容可能なデリバリビヒクル及び/又はアジュバント;
を有するアルツハイマー病ワクチン組成物。 - a. 請求項7記載のAβペプチド免疫原構築物;及び
b. 医薬上許容可能なデリバリビヒクル及び/又はアジュバント;
を有するアルツハイマー病ワクチン組成物。 - (b)のアジュバントが、アルハイドロゲル(Alhydrogel)(Al(OH)3)又はアジュホス(Adjuphos)(AlPO4)からなる群から選ばれるアルミニウムの鉱物塩である、請求項10記載のアルツハイマー病ワクチン組成物。
- (a)のペプチド抗原をCpGオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)と混合して安定化免疫刺激複合体を形成する、請求項10記載のアルツハイマー病ワクチン組成物。
- 請求項1記載のAβペプチド免疫原構築物の(Aβ1−42ペプチドのN末端フラグメント)成分と結合する、単離抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
- Aβ1−10(配列番号6)と特異的に結合する請求項14記載の単離抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
- 請求項1のAβペプチド免疫原構築物と結合した請求項14記載の単離抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
- 配列番号6と結合した請求項15記載の単離抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
- 請求項14記載の単離抗体又はそのエピトープ結合フラグメントを有する組成物。
- 請求項10記載のワクチン製剤を投与することを有する、ヒト患者の認知症の重篤度を軽減するか又はヒト患者の認知症の発病の遅らせる方法。
- アルツハイマー病の診断の危険性があるか又はADである患者に、前記ワクチン製剤を1投与当たり10μg〜1000μgを有する水溶液で投与する、請求項19記載の方法。
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