CN101421299A

CN101421299A - 用于诱导产生抗淀粉样β肽抗体的肽疫苗

Info

Publication number: CN101421299A
Application number: CNA2007800134767A
Authority: CN
Inventors: 矢野明; 西泽俊树; 三轮尚克
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 2006-02-22
Filing date: 2007-02-16
Publication date: 2009-04-29
Also published as: JP5097695B2; US20100062011A1; US8034353B2; EP1992639A4; WO2007097251A1; TW200801035A; KR20080103560A; EP1992639A1; CA2638775A1; JPWO2007097251A1

Abstract

通过本发明，可提供一种阿尔茨海默病等起因于Aβ的疾病的预防及/或治疗用肽疫苗，使具有确立免疫记忆的多限制性表位型T细胞表位或含有其的肽的氨基酸序列的肽，与含有Aβ特定部位的B细胞表位或含有该表位的肽的氨基酸序列的肽，通过连接肽结合，提供一种在该肽中具有细胞粘附分子的细胞结合基序的氨基酸序列的肽，从而解决了上述课题。

Description

用于诱导产生抗淀粉样β肽抗体的肽疫苗

技术领域

本发明涉及免疫原性优异、可有效的诱导产生抗淀粉样β肽(以下简称为“Aβ”)的抗体的肽，及含有上述肽作为有效成分的组合物及其用途。具体而言，涉及一种有效诱导抗B细胞上针对Aβ的特定的抗原表位的抗体的肽、及以该肽作为有效成分的以阿尔茨海默病为典型的神经病变疾病的预防/或治疗用组合物。

背景技术

在老龄化迅速发展的各发达国家，认知疾病的患者数量的急剧增加已经成为了严重的问题。该认知类疾病可分为起因于脑血管障碍的脑血管性认知疾病和阿尔茨海默症。其中，阿尔茨海默症在老年性认知疾病的发病原因中占大多数，是一种导致患者产生记忆障碍或运动障碍并显著降低QOL的疾病。且在疾病的治疗之外还必需大量护理，是一种不仅会造成医疗花费，而且使患者本人及以其家族为代表的护理者蒙受大量时间损耗、劳动机会的损失和精神上的负担等造成各种社会负担的疾病。上述阿尔茨海默症是一种没有根本性的治疗方法的严重的神经病变性疾病的一种，病理为由40个(序列表中的序列编号1)或42个(序列表中的序列编号2)氨基酸构成的Aβ在中枢神经中积蓄，是以所谓“老人斑”的色素沉着及神经原纤维变化和神经细胞的变性和脱落为特征的疾病。阿尔茨海默症的治疗中，正在实施的有采用胆碱酯酶抑制剂的治疗、及采用抗高血脂症药物或乙基EPA等脑神经保护剂的临床试验。

为了对其进行根治，以在阿尔茨海默症中起到主要作用的Aβ为标靶分子的疫苗的开发也正在进行中(参照例如Agadjanyan、M.G.等，Journal of Immunology，第174卷，第3号，第1580～1586页(2005年))。另外，人类抗Aβ单克隆抗体、DNA疫苗或CpGDNA等新型佐剂、口服给药用肽疫苗等的开发也在进行中。但是，由于DNA疫苗具有主要组织相容性复合体抗原(以下简称为“MHC”)I型限制性，很容易诱导细胞毒性T细胞的活化，而肽疫苗由于免疫原性较弱而缺乏有效诱导抗Aβ的抗体的能力，在抗体的诱导中必须采用佐剂，当抗原为较大的高分子时，多数含有T细胞及B细胞表位，对于上述表位的免疫反应很有可能引起不希望发生的炎症反应，存在因此导致的脑膜炎等副作用的风险，因此仍然不能被确立作为阿尔茨海默症的根本的治疗方法。另外，Aβ虽然还已知与阿尔茨海默症以外的各种疾病的发病和恶化相关，但上述疾病的预防法或治疗方法仍然没有确立。

另一方面，本发明者们为了解决上述问题，公开了在氨基酸末端侧含有T细胞表位的氨基酸序列、隔着连接肽在其羰基末端侧含有B细胞表位的氨基酸序列的多肽上具有细胞结合基序的氨基酸序列肽疫苗，可以诱导产生抗Aβ肽的抗体，并被用于阿尔茨海默症的治疗(参照国际公开WO 2004/87767号说明书)。但是，在该国际公开WO2004/87767号说明书中，未记载有用于解决该问题的肽疫苗的具体的氨基酸序列，并且也已经证明即使以国际公开WO 2004/87767号说明书中记载的重复、位移型(shift)多抗原限制位点型肽(序列表中的序列编号3所示的Overlapping Multiagretope Peptide，以下简称为“OMP”)或人免疫缺陷病毒(以下简称为“HIV”)来源的具有Gag蛋白质第298-312位的氨基酸的序列的多肽(序列表中的序列标号4，以下简称为“Gag”)作为T细胞的表位进行使用，诱导产生抗Aβ的抗体的能力也很弱。另外，为了利用上述多肽作为疫苗，在尽量多数的阿尔茨海默症患者中诱导抗Aβ的抗体，需要受到尽量多数的人MHC类型II，也即受到HLA-DR的单倍型(等位基因)的限制，且和Aβ的B细胞表位连接时，必须设计能够诱导产生抗Aβ的强抗体的T细胞表位。进而，基于阿尔茨海默症，对于其以外的起因于Aβ的各种神经病变性疾病等的预防及/或治疗用疫苗，必须及早的抑制其症状的发展，但是，考虑到经济性，希望有一种以尽可能少的给药次数有效的诱导产生抗Aβ抗体，在对人进行给药时，诱发严重的副作用的风险小的肽。

发明内容

本发明提供一种起因于Aβ的以阿尔茨海默症为代表的神经病变性疾病等的各种疾病的预防及/或治疗用肽疫苗。

本发明者们为了解决上述课题，反复进行了深入研究和试验，结果发现利用在人身体内已经存在的免疫记忆，即预先以含有T细胞表位的肽进行给药，通过选择用于预防接种用的被称为去活化疫苗或毒素的致敏抗原的肽含有的T细胞表位，即使不使用佐剂，也可制备具有优秀的抗B细胞表位的抗体诱导产生能力的肽疫苗。并且，还发现使用Aβ的特定部位的肽作为B细胞表位，该肽与作为上述T细胞表位的肽和连接肽间隔结合而成一种多肽，在该肽内具有细胞粘附分子的细胞结合基序的氨基酸序列，即使是经鼻腔或口腔内等经粘膜给药途径，该多肽都可以有效的诱导只识别Aβ的特异区域部分的抗体。并且，作为T细胞表位通过选择多个被HLA-DR限制的多抗原限制位点型表位，可以回避HLA-DR限制性问题，具有1种氨基酸序列的多肽，可在多个人体个体中有效诱导只识别Aβ的特异性区域部分的抗体。基于上述发现，完成了本发明。

也即，本发明提供一种可有效诱导产生抗Aβ的抗体的多肽，是具有下述通式表示的氨基酸序列的多肽，其特征为T表示已经确立免疫记忆的T细胞表位的氨基酸序列，L为连接肽的氨基酸序列，B表示含有1处或2处以上Aβ的B细胞表位的氨基酸序列的氨基酸序列，R₁、R₂、R₃及R₄中的至少1个表示细胞粘附因子的细胞结合基序的氨基酸序列，以及含有上述多肽的、用于预防及/治疗起因于Aβ的以阿尔茨海默症为代表的神经病变性疾病的各种疾病的组合物。

通式：

R₁-T-R₂-L-R₃-B-R₄

具体实施方式

用于诱导本发明中的抗Aβ抗体的肽指具有通式表示的氨基酸序列，并具有诱导产生抗Aβ的B细胞表位或含有其的氨基酸序列的抗体的能力的肽。

本发明中的抗体指以免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)抗体为主的，基于血液或体液中分泌的抗体，当然也包括鼻腔、口腔、眼、消化道等部位分泌的抗体。

本发明所述的起因于Aβ的疾病指Aβ沉淀于特定组织时等引起的疾病，包括虽然该沉淀并不是主要病因，但伴随其他疾病的Aβ沉淀引起或恶化的疾病、也包含伴随上述疾病产生的临床症状。具体而言，可举出例如阿尔茨海默症、皮克氏病；心包性假性肝硬变、弥散性路易体病、进行性核上麻痹(基底神经节病变综合征)、多系统萎缩(Shy-Drager综合征)、肌萎缩侧索硬化、退行性共济失调、皮质基底变性、顾曼尼安ALS-帕金森-痴呆并发症、亚急性硬化性全脑炎、亨廷顿舞蹈病、帕金森氏病、共核蛋白病、原发进行性失语、纹体黑质变性、包含小脑退行性脊椎运动失调症第三型及橄榄体脑桥小脑萎缩的运动神经元病、抽动秽语综合征(日勒德拉图雷特综合征)、延髓性麻痹及假性延髓麻痹、脊椎及脊髓延髓肌萎缩(肯尼迪综合征)、原发性侧索硬化、家族性痉挛性截瘫、韦-霍二氏综合征、库格尔贝格-韦兰德病、泰-萨克斯病、山多夫氏病、家族性痉挛病、沃-库-韦病、痉挛性截瘫、进行性多源性脑白质病变、朊病毒病(克雅氏病)、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克病、由包括库鲁病及致死性家族失眠症等和年龄增高相关的痴呆症、血管性痴呆、扩散性白质病变(宾斯旺格症)、由内分泌及代谢引起的痴呆症、由头部损伤或扩散性脑损伤引起的痴呆症、狂乱攻击性姿势或额叶型痴呆、由包括脑缺血症、栓塞性梗塞或血栓性梗塞等梗死引发的神经变性疾病、及任意种类的颅内出血引起的神经病变性疾病、脑内损伤、脊椎损伤、遗传性大脑血管障碍、非神经障碍性遗传性淀粉样变性、唐氏综合征、巨球蛋白血症、继发性家族性地中海热、穆-韦二氏综合征、多发性骨髓瘤、与胰脏或心脏疾病相关的淀粉样变性、慢性血液透析关节病、Finland型或Iowa型淀粉样变性、如糖尿病神经病变等神经变性疾病、由Aβ在胰脏沉淀引发的糖尿病，还包括伴随上述疾病的临床症状等。

对于本发明的肽，作为用于诱发抗体产生部位的Aβ的B细胞表位指，含有作为阿尔茨海默症的病因的Aβ的B细胞表位的氨基酸序列的多肽。其中，期望一种能溶解Aβ凝集纤维，抑制Aβ对神经纤维或其他器官的沉积，具有可诱导产生能够抑制与乙酰胆碱结合的抗体的氨基酸序列的多肽，从这一点考虑，特别优选具有在Aβ氨基末端的氨基酸序列，优选由5～20个左右氨基酸构成。构成的氨基酸数量过少时将使抗体诱导能力消失，过多时抗原性过高，将有可能含有能诱发副作用的抗体的表位。可直接使用含有该B细胞表位的肽，也可以串联形式连接使用其2聚体、3聚体或多聚体。另外，如果有必要，可以将存在于Aβ上的2种以上的B细胞表位串联连接，也可以将Aβ全体，例如氨基酸为40个(序列编号1，以下简称为“Aβ(1-40)”)或42个(序列编号2，以下简称为“Aβ(1-42)”)的Aβ作为B细胞表位。另外，通过连接多个表位，还可随意设计能够同时诱导多种抗体的肽。上述情况中，在各B细胞表位之间，通过插入后述连接肽，可以更加确实的实施对各个表位的处理。

作为上述B细胞表位，使用氨基酸末端附近的氨基酸序列时，必须至少具有从Aβ氨基末端起的第4～10位的氨基酸序列，例如可举出具有序列编号表中的序列编号1或2所示的氨基酸序列中第1～11位的DAEFRHDSGYE的氨基酸的肽(序列表中的序列编号5，以下简称为“Aβ(1-11)”)、具有第1～13位的DAEFRHDSGYEVH的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号6，以下简称为“Aβ(1-13)”)、具有第1～15位的DAEFRHDSGYEVHHQ的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号7，以下简称为“Aβ(1-15)”)、具有第3～11位的EFRHDSGYE的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号8，以下简称为“Aβ(3-11)”)、具有第3～15位的EFRHDSGYEVHHQ的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号9，以下简称为“Aβ(3-15)”)等。从诱导产生抗Aβ的抗体的能力或副作用考虑，优选使用Aβ(1-13)或Aβ(1-15)，特别优选使用Aβ(1-13)。

作为用于本发明中的肽中的、在人类免疫记忆中已经存在的T细胞表位指，以本发明的肽疫苗进行给药时，该给药的个体中已经存在的免疫记忆的T细胞表位，例如，对于以本发明的肽进行给药的患者，可预先以含有和本发明的肽相同的T细胞表位的肽进行给药，使其确立免疫记忆。而具有通过预防接种，大多数人从幼儿期以后获得的免疫能力的抗原肽的T细胞表位，即使不实施上述确立免疫记忆的操作也可以使用。另外，对于已经确立免疫记忆的患者，如果再次进行上述操作可以期待获得更好的效果。T细胞表位由于受到HLA-DR单元型限制，被推荐作为辅助T细胞用抗原，因此优选可能多的采用尽HLA-DR单元型(等位基因)的限制的重复位移型多抗原限制位点型肽或含有其的氨基酸序列。本发明中使用的T细胞表位可优选使用例如白喉、破伤风、百日咳疫苗、舌下腺炎、风疹、麻疹、结核等作为预防接种用抗原的肽，因为它们在大部分人群中从幼儿时期起就已经建立免疫记忆，尤其是含有破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳菌苗的三种混合疫苗或BCG(结核)的接种，由于在日本接种是强制进行的，并在世界范围内推广进行，从普遍使用性考虑，特别优选。由于上述肽的氨基酸序列已经众所周知，也可利用该肽的公知的T细胞表位的氨基酸序列，另外在实际中，还可以利用外周血的细胞生成反应，测定抗原部分的肽的表位序列，将具有该测定了的氨基酸序列的肽作为T细胞表位进行使用。另外采用可以利用的HLA-DR的T细胞表位预测程序，选择多个与HLA-DR结合的多抗原限制表位区域，可任意决定肽的氨基酸序列。另外，对于该T细胞表位自身来说，虽然从减少副作用的观点考虑，优选诱导产生抗该表位的抗体的能力较低，但是如果使用来源于预防接种用表位的致敏抗原的氨基酸序列的肽，由于该表位本来在人体中就用于诱导产生针对该表位的抗体。因此即使产生了抗该表位的抗体，其安全性也早已确立，难以发生副作用，这是其优点。上述T细胞表位肽可以直接使用，也可以串连组合使用相同或多个不同种类的T细胞表位。另外，T细胞表位中，限制位(必须与HLA-DR抗原结合的氨基酸残基)的氨基酸残基以外的氨基酸残基即使被其他的氨基酸残基取代仍然可以发挥作用。

该T细胞表位具体而言可举出例如具有下述氨基酸序列的表位：来源于白喉内毒素的表位的AYNFVESIINLFQVVHNSYN的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号10)及具有YNFVESIINLFQVVHNSYN的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号11)(以下分别简称为“DTL”、“DTS19”)、具有来源于破伤风类毒素的表位的LQTMVKLFNRIKNNVA的肽(序列表中的序列编号12)、具有FLQTMVKLFNRIKNNVAG的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号13)、具有IHVLHGLYGMQVSSHE的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号14)、具有LIHVLHGLYGMQVSSHEI的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号15)、具有YIVNEDKFQILYNSIMYG的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号16)、具有QYIVNEDKFQILYNSIMYGF的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号17)、具有SYQMYRSLEYQVDAI的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号18)、具有RSYQMYRSLEYQVDAI的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号19)、具有NINIFMRESSRSFLV的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号20)、具有ININIFMRESSRSFLVN的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号21)(以下分别简称为“TetT1”、“TetT1L”、“TetT2”、“TetT2L”、“TetT3”、“TetT3L”、“TetT4”、“TetT4L”、“TetT5”、“TetT5L”、)；具有来源于已知被称为结核菌(Mycobacteriumtuberculosis/bovis)共同分泌蛋白质的MPT64的肽(以下简称为“MPT”)的IQMSDPAYNINISLPSYYPD氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号22)、具有IQMSDPAYNINISLPS的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号23)、具有DPAYNINISLPSYYPD的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号24)及具有YNINISLPSYYPDQKS的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号25)(以下分别简称为“MptL(43-62)”、“MptN(43-58)”、“MptM(47-62)”、“MptC(50-65)”)等氨基酸序列。其中，因为诱导产生抗体的能力高，希望使用在后述的用HLA-OR限制性预测程序“proprep”预测可以与HLA-OR结合的51个等位基因中的能结合47等位基因、39等位基因、41等位基因或50等位基因的MptL(43-62)、DTL、TetT1L和TetT3L，优选DTL。此外，根据将给药了本发明的疫苗肽的人的外周血和这些T细胞表位混合培养，确认是否有幼化反应，或者取少量给药于皮内，确认是否引起延迟型过敏症(DTH)，确认有无记忆-T细胞的存在，也可随意选择希望给药于人的T细胞表位。

本发明中使用的用于连接含有B细胞表位的肽和T细胞表位的连接肽，只要为参与抗原产生的蛋白酶的识别序列即可，具体而言，可举出赖氨酸-赖氨酸(KK)、赖氨酸-精氨酸(KR)、精氨酸-精氨酸(RR)等二肽，其中，优选使用由作为组织蛋白酶B的识别序列的赖氨酸-赖氨酸构成的二肽。

作为本发明中使用的细胞粘附分子的细胞结合基序，只要可将本发明的肽长期保持在粘膜表面，通过口腔、鼻腔等粘膜给药能具有增强抗体产生的诱导能力的作用即可用于本发明。例如，以对于整合蛋白家族的结合基序为代表，还可以使用其他细胞结合基序的氨基酸序列。例如，属于整合蛋白结合基序的氨基酸序列可举出具有下述氨基酸序列的肽，即已知作为纤连蛋白结合蛋白、胶原蛋白、玻连蛋白、纤维蛋白原、层粘连蛋白、HIV的Tat蛋白等等细胞粘附分子上存在的结合基序的，精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(以下简称为“RGD”)、精氨酸-谷氨酸-天门冬氨酸(以下简称为“RED”)、亮氨酸-天门冬氨酸-缬氨酸(以下简称为“LDV”)、脯氨酸-组氨酸-丝氨酸-精氨酸-天门冬酰胺(PHSRN：序列表中的序列编号26)、精氨酸-赖氨酸-赖氨酸(RKK)、天门冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-丙氨酸(DGEA：序列表中的序列编号27)。另外，作为整合蛋白家族之外的结合基序，还可举出有下述氨基酸序列构成的肽：酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR：序列表中的序列编号28)、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV：序列表中的序列编号29)、精氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-缬氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸-色氨酸-赖氨酸(RFYVVMWK：序列表中的序列编号30)、异亮氨酸-精氨酸-缬氨酸-缬氨酸-甲硫氨酸(IRVVM：序列表中的序列编号31)等氨基酸序列。其中，由RGD、RED、YIGSR的氨基酸序列构成的肽，诱导产生特异性抗体的能力强因而优选，特别优选RGD。另外，作为具有上述细胞结合基序的氨基酸序列的肽的连接部位，可选择T细胞表位的肽的氨基末端或羧基末端侧、或者细胞表位的肽的氨基末端或羧基末端侧合计4个部位，与其中至少1个部位连接即可。也即，在T细胞表位的肽的氨基末端侧或羧基末端侧的一侧、或在此两侧连接细胞粘附分子的细胞结合基序的本发明的肽、由于使B细胞表位的肽特异性抗体产生得到特别的增强，因而优选，特别优选在氨基末端侧连接的肽。

用于本发明的肽的制造的方法并无特别限定，可采用常用的肽合成方法，或通过常用的肽合成法，使预先部分合成的肽相结合而进行制备。而该肽可使用各制造商市售的肽合成仪，按照装置的操作指南进行合成。另外，本发明的肽可通过重组DNA技术进行制备。例如，可按下述方法进行操作：制备编码设计的肽的氨基酸序列的DNA，将其插入可自动复制增殖的载体中，将其导入大肠杆菌、枯草菌、放线菌、酵母等微生物、动植物或它们的细胞或组织等宿主中制成转化体，制成转基因动植物，对其进行培养和养殖后，通过适当的方法提取、纯化本发明的肽。另外，本发明的肽，通过选择适当的蛋白酶切位点的氨基酸序列进行连接和表达，而非选择用于连接T细胞表位和B细胞表位的相关酶切位点的氨基酸序列时，也可自由选择该蛋白酶分解的产物进行使用。另外，也可直接对表达本发明的菌体、动物体或植物体进行加工，作为含有本发明的肽的口服摄取用组合物进行使用。作为植物可举出紫莞科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、伞形科(Apiaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、葡萄科(Vitaceae)、越桔科(Vaccinium)、番木瓜科(Caricaceae)、豆科(Fabaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、或茄科(Solanaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、禾本科(Poaceae)、或薯蓣科(Dioscoreaceae)、或旋花科(Convolvulaceae)等种属的植物；更具体而言可举出莴苣、菊苣、艾菊、绿花椰菜、卷心菜、萝卜、山葵、胡椒、黄瓜、甜瓜、南瓜、佛手瓜、胡萝卜、金鱼藻、芹菜、苹果、李子、杏子、桃、草莓、覆盆子、扁桃、梨、枇杷、葡萄、酸果蔓、覆盆子、蓝莓、木瓜、紫花苜蓿、大豆、胡桃、菠菜、西红柿、红辣椒、蕃薯、梗米、玉蜀黍、小麦、大麦、裸麦、日本薯蓣、马铃薯等。另外，本发明的肽可通过上述任一种方法，直接制备具有完整氨基酸序列的肽，或以化学方法使经合成而具有其一部分的氨基酸序列的肽互相结合而制备，并无特别限制。

在不妨碍本发明的效果的范围内，可在本发明的肽中组合使用制剂学上允许的1种或2种以上的制剂用添加剂，适当的制备为组合物。作为制剂用添加剂，可举出水、乙醇等溶剂、葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、蔗糖等还原性糖；α，α-海藻糖、α-麦芽糖基麦芽糖等α，α-海藻糖衍生物、相同申请人公开的记载于国际公开WO 02/10361号说明书中的具有环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构的环状四糖、记载于特开平2005-95148号公报等中的环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构的环状四糖或环糊精类等非还原性糖、山梨醇、甘露醇、麦芽糖醇、麦芽三糖醇等糖醇；琼脂、支链淀粉、瓜尔胶、阿拉伯胶等水溶性高分子；明胶和蚕丝等蛋白质或它们的水解物；脂类、氨基酸、缓冲剂、稳定剂、抗菌剂、香料、营养功能食品、医药化妆品及药品中的有效成分、白矾、氢氧化铝等免疫佐剂或上述物质之外的食品添加剂、医药品添加剂等，还可以适当组合上述1种或2种以上的物质进行使用。其中优选肽的稳定化效果好的α，α-海藻糖、α，α-海藻糖的糖类衍生物及环状四糖。

另外，含有本发明的肽的制剂的形态只要可使得制剂中的肽能够长期稳定保存，并无特别限制，可从溶液、冻干制品、片剂、舌下片剂、含剂、软膏、糖浆剂等剂型出发，考虑给药对象、给药方法、制剂的保存方法或运送方法进行适当的选择即可。另外本发明的肽或含有其的组合物可根据需要，通过封装入脂质体，或合并使用皮肤、组织的渗透促进剂或离子导入法等，适当的实施促进向抗原呈递细胞的存在部位的渗透。另外本发明的肽可以被包含在糖片剂、糖果、软饮料等各种饮品和食品，经口服摄取，可任意的使肽经粘膜进行给药。另外，通过将编码本发明的肽的RNA直接对生物体进行给药，通过在细胞内导入DNA的所谓基因治疗等方法，可以在生物体内表达本发明的肽。

本发明的肽或含有其的组合物对人体的给药方法并无特别限制，只要为可将本发明的肽确实的传递至给药部位的方法即可。例如，可以使用滴管或注射器适量的滴加在粘膜上，也可以经口摄入，也可制成膏状或凝胶状涂布于粘膜上，通过导管等导入给药部位，进一步还可以通过喷雾器和喷洒剂等吹散为雾状，吸入至鼻腔、气管或肺部中。通过在皮下、皮内、肌肉内、血管内、腹腔内或胸腔内等体腔内的给药，可采用注射器、导管、点滴等给药方法进行。本发明的肽得给药量可考虑抗体诱导能力、疾病的种类、给药途径、给药方法、给药对象动物等适当的进行决定即可，通常为0.00001至100mg/kg体重，优选为0.0001至25mg/kg体重，进一步优选为0.001至10mg/kg体重。另外，本发明的肽在第一次给药时，可以有效的诱导抗Aβ的抗体，此后，即使在以只具有该肽的B细胞表位的氨基酸序列的肽进行追加免疫时，还可增强抗Aβ抗体的产生。以下，基于实施例对本发明的肽进行更详细的说明。

<实验例1：抗Aβ抗体产生对B细胞表位的影响>

研究抗Aβ抗体产生对B细胞表位的影响的实验如下进行。

<抗体产生用肽的制备>

使用具有HIV-1来源的Gag蛋白质的第298-312位的氨基酸序列的肽(序列表中的序列编号4)作为T细胞表位(以下简称为“Gag”)。另外，作为B细胞表位，使用具有Aβ(序列表中的序列编号1或2)的氨基酸末端开始的第1至11位的氨基酸序列的Aβ(1～11)(序列表中的序列编号5)、具有第1至13位的氨基酸序列的Aβ(1～13)(序列表中的序列编号6)、及具有第3至11位的氨基酸序列的Aβ(3～11)(序列表中的序列编号8)。作为该T细胞表位的氨基末端的细胞结合基序，可连接精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(RGD)，在其羧基末端连接赖氨酸-赖氨酸(KK)；在其羧基末端链接连接Aβ(1-11)、Aβ(1-13)或Aβ(3-11)作为B细胞表位，合成表1表示的肽，即RGD-Gag-KK-Aβ(3-11)(序列表中的序列编号32)、RGD-Gag-KK-Aβ(1-11)(序列表中的序列编号33)、RGD-Gag-KK-Aβ(1-13)(序列表中的序列编号34)作为抗原使用。需要说明的是，本说明书中记载的肽是使用肽合成仪(Advanced Chemtech公司制造，Mode1350 Multiple Peptide Synthesizer)以Fmoc法合成，使用TSK-GEL柱(柱直径：直径1cm，长度30cm，东曹株式会社制造)的逆向HPLC纯化至纯度95％以上委托合成的产品(SIGMAGenosys事业部，肽纯度95％左右)。

<小鼠体内免疫及抗体滴度测定>

将上述肽向BALB/c小鼠(日本SLC公司市售，雌；5周龄；一组；5只)鼻腔内给药后，分别在小鼠血中测定抗Gag抗体及抗Aβ抗体的产量(抗体滴度)。免疫如下进行：将肽以50μg/小鼠/次的条件，每个两周4次给药，从最后的给药至1周后，从各小鼠采血，将血清中含有的抗Gag抗体及抗Aβ抗体的抗体滴度，采用以Gag及Aβ(序列表中的序列编号2)作为包被抗原使用的常用的ELISA方法进行测定。其结果在表1中表示。需要说明的是，在本说明书的实验中，各抗原的抗体滴度如下进行检测，将从各个小鼠身上采取的血液的血清，分别连续两倍稀释的标准品中的抗体量，通过ELISA法，使用酶联抗体进行检测，通过微孔板度数仪(MULTISCAN Bichromatech，Labosystem公司生产)，对分析使用的微孔滴定板的各孔测定405nm的吸光度，以该吸光度和未使用包被抗原的对照孔的吸光度进行比较，求得其差为0.1以上的血清的最高稀释倍率，求其平均值并作为抗体滴度表示。另外，使用未进行免疫的未给药小鼠的血清作为阴性对照。

表1

从表1可知，用于免疫的3种肽，在任意的情况下的抗原性都很低，抗体滴度结果如下：作为T细胞表位使用的抗Gag抗体为11至16，作为B细胞表位使用的抗Aβ抗体为14.9至32，在任一种情况下抗体的滴度均比未给药的血清(对照)低2～3倍左右，与背景水平几乎没有差别，因此从该实验系统看，上述肽不适合用于诱导抗Aβ的特异性抗体。

<实验2：T细胞记忆对产生抗淀粉样β肽的特异性抗体造成的影响>

研究T细胞记忆对产生抗淀粉样β肽的特异性抗体造成的影响的实验如下进行。即，在实验1的系统中，抗T细胞表位和B细胞表位的抗体产生的诱导几乎未被检测到，与背景水平一致。此处，预先诱导针对T细胞表位的记忆T细胞后，以本发明的肽进行免疫时，对小鼠血清中的抗体滴度按照与实验1中同样的方法进行测定。另外，在考虑将本发明的肽使用于人体时，因为诱导针对人很少被致敏的抗原(如Gag等)的记忆T细胞是不实用的，所以在该实验中，使用了通过预防接种而在大部分成人中已经确立免疫记忆的存在记忆T细胞的，来源于破伤风类毒素及白喉内毒素的T细胞表位。上述内毒素中含有的T细胞表位，使用已知的HLA-DR限制性预测程序(程序名称为“ProPrep”)(参照Singh H.and Raghava G.P.S.，”ProPrep：prediction of HLA-DR binding sites.”，Bioinfomatics，第17巻、第1236-1237页，2001年)，研究其多抗原识别表位区域，选择来源于白喉内毒素的T细胞表位作为DTL，选择来源于破伤风类毒素的T细胞表位作为TetT3L。需要说明的是，通过将具有上述T细胞表位的氨基酸序列的肽预先与不同HLA-DR单元型的小鼠3只或人3位的末梢血进行混合培养，确认任一种肽都可以诱导该T细胞的分化抗小鼠和人的多限制性表位，并用于本实验。

<诱导抗体产生用肽的制备>

除了使用DTL或TetT3L作为T细胞表位，使用Aβ(1-13)作为B细胞表位之外，合成了具有与实验1的肽相同的氨基酸序列的2种肽：RGD-DTL-KK-Aβ(1-13)(序列表中的序列编号35)、RGD-TetT3L-KK-Aβ(1-13)(序列表中的序列编号36)。

<对小鼠的免疫及抗体滴度的测定>

预先在以上述肽给药的1周前，将50μl破伤风、白喉2种混合疫苗(财团法人化学及血清疗法研究所制造，在1ml中含有白喉50Lf和破伤风类毒素约80μg以下)，对BALB/c小鼠(日本SLC株式会社市售，雌，5周，一群，5只)的皮下进行给药，诱导对应破伤风类毒素及白喉内毒素的记忆T细胞，以50μg/小鼠/次，采用上述肽的任一种，以2周作为间隔经鼻腔给药4次，在第4次给药1周后采血，该血中的抗DTL抗体、抗TetT3L抗体，或抗Aβ抗体的抗体滴度按照实验1同样的方法进行测定的结果在表2中表示。此外作为对照，无2种混合疫苗的先给药，将3种肽以与先给药2种混合疫苗时相同的给药量和相同方法进行免疫，同样地测定血中的抗体滴度，其结果表示于表2中。需要说明的是，使用了具有DTL、TetT3L或Aβ的氨基酸序列的肽作为抗体滴度测定用包被抗原。

表2

由表2可知，与实验1不同，给药的肽在任一小鼠中均有效诱导了抗Aβ的抗体。而在预先以2种混合疫苗进行给药，诱导对于各肽的T细胞表位的记忆T细胞时，与未预先给药相比，确认使用白喉内毒素来源的T细胞表位(DTL)时抗体滴度上升了64倍，而使用破伤风类毒素来源的T细胞表位(TetT3L)时抗体滴度约上升了26倍。另外，抗具有用作T细胞表位的氨基酸序列的肽的抗体的产生中，使用DTL作为T细胞表位时几乎未发现诱导的发生。而使用TetT3L时，该肽在小鼠中也是B细胞表位，因此抗TetT3L的抗体滴度虽然也上升，即使2种混合疫苗的预先给药由追加免疫引起的抗体滴度的上升为不进行预先给药的2倍左右。需要说明的是，连接2个以上Aβ(1-13)时，可增加抗体产生量的增加。另外，以Aβ(1-15)、Aβ(3-11)、Aβ(3-15)代替Aβ(1-13)，也能得到大致相同的结果。

该实验结果说明，可以制备一种肽，该肽在将本发明的肽给药至生物体内前，在该生物体内已经确立了免疫，通过使用存在记忆T细胞的表位或含有其的肽，可有效的增强Aβ特异性抗体的产生。该实验结果进一步说明，通过预先将用于致敏的多肽的T细胞表位对应的记忆T细胞给药至生物体内进行诱导，能增强针对用于致敏的肽的B细胞表位的抗体的产生的诱导能力。或者，针对T细胞表位的抗体产生较低时，DTL优选作为T细胞表位。需要说明的是，如将TetT3L作为T细胞表位使用的肽一样，因MHC的类型II的单元型的原因，该表位也可能作为B细胞表位而被识别。只要为通常的肽疫苗，虽然针对目的表位以外的表位的抗体产生的诱导将增加副作用风险，但只要在选择具有用于预防接种的肽的氨基酸序列的T细胞表位的范围内，该T细胞表位，因为本来就是用于在人体中诱导产生抗该表位的抗体产生，假如即使诱导产生抗该T细胞表位的抗体，也不会带来副作用的问题，这一点已经被确认，可以判断本发明的肽的安全性极高。

以下通过实施例对本发明进行进一步详细的说明，但下述实施例并不用于对本发明的技术范围进行任何限定性的解释。需要说明的是，以下的实施例的各成分的配合量如无特别说明，以对配合的对象物质整体的比例(％)进行表示。

实施例1

<抗Aβ抗体产生增强用组合物>

使用来源于结核菌的分泌蛋白MPT来源的T细胞表位(MptL(43-62))及Aβ(1-13)，按照实验1的方法进行制备，以蒸馏水进行溶解，通过常用方法灭菌得到糖浆剂，使具有RGD-IQMSDPAYNINISLPSYYPD-KK-DAEFRHDSGYEVH(序列表中的序列编号37)的氨基酸序列的肽为100μg/ml，且α，α-海藻糖(试剂级，林原生物化学研究所公司市售)达到40％的浓度。将其以2ml量分别注入灭菌安培瓶中，密闭，制备含有肽的糖浆剂。本品的稳定性优秀，受到广阔范围的HLA-DR的单元型的限制，因此对很多人群，尤其结核病阳性者，经鼻腔、或口服给药，可发挥能有效增强具有预防及治疗以阿尔茨海默症为代表的神经病变性疾病等的各种疾病效果的抗Aβ的抗体的产生的疫苗的效果。需要说明的是，连接2个以上Aβ(1-13)时，可增加抗体产生量。另外，即使以Aβ(1-15)、Aβ(3-11)、Aβ(3-15)代替Aβ(1-13)时，也能发挥大致相同的效果。

实施例2

<抗Aβ抗体产生增强用组合物>

在含有1％(w/v)蔗糖的作为稳定剂的生理盐水中，使用来源于白喉内毒素的T细胞表位(DTL)及Aβ(1-13)，溶解按照实验1的方法配制的具有RGD-AYNFVESIINLFQVVHNSYN-KK-DAEFRHDSGYEVH(序列表中的序列编号35)的氨基酸序列的肽，使其达到10μg/ml、100μg/ml、或1,000μg/ml，过滤灭菌。将其以1ml量分别注入灭菌安培瓶中，以常规方法冷冻干燥，密闭，制备含有肽的制剂。任一本品均可用蒸馏水1ml完全溶解使用。本品的稳定性优秀，受到广阔范围的HLA-DR的单元型的限制，因此对很多人群，尤其对于接受白喉的预防接种的人，经鼻腔、或口服给药，可发挥能有效增强具有预防及治疗以阿尔茨海默症为代表的神经病变性疾病等的各种疾病效果的抗Aβ的抗体的产生的疫苗的效果。需要说明的是，连接2个以上Aβ(1-13)时，可增加抗体产生量。另外，即使以Aβ(1-15)、Aβ(3-11)、Aβ(3-15)代替Aβ(1-13)时，也能发挥大致相同的效果。

实施例3

<抗Aβ抗体的产生的增强作用组合物的安全性试验>

将实施例1或实施例2中配制的肽以含有0.5％蔗糖的生理盐水稀释，以达到12.5mg/ml，采用其对出生后5周龄的DDY系雄性小鼠，通过常用方法以口服、腹腔内或肌肉内等途径进行给药，研究LD₅₀。上述任一标准品的LD₅₀换算为肽的质量时为100mg/kg小鼠体重以上，从此看出，本发明的肽即使对人进行给药也无毒性，是一种安全的制剂。

实施例4

<抗Aβ抗体产生增强用组合物>

使用来源于破伤风内毒素来源的T细胞表位(TetT1L)及Aβ(1-13)作为T细胞表位，按照实验1的方法配制含有150μg/ml具有RGD-FLQTMVKLFNRIKNNVAG-KK-DAEFRHDSGYEVH(序列表中的序列编号38)的氨基酸序列的肽、及100mg/ml甘露醇的生理盐水溶液。将其以分别注入5ml安培瓶中以达到1ml/安培瓶，以常规方法冷冻干燥。本品由于受到广阔范围的HLA-DR的单元型的限制，通过人体的粘膜或透皮给药，对很多人群，尤其对于接受破伤风的预防接种的人，经鼻腔、或口服给药，可发挥能有效增强具有预防及治疗以阿尔茨海默症为代表的神经病变性疾病等的各种疾病效果的抗Aβ的抗体的产生的疫苗的效果。需要说明的是，连接2个以上Aβ(1-13)时，可增加抗体产生量。另外，即使以Aβ(1-15)、Aβ(3-11)、Aβ(3-15)代替Aβ(1-13)时，也能发挥大致相同的效果。

实施例5

<抗Aβ抗体产生增强用组合物>

使用来源于破伤风内毒素来源的T细胞表位(TetT3L)及Aβ(1-13)作为T细胞表位，按照实验1的方法配制含有75μg/ml具有RGD-QYIVNEDKFQILYNSIMYGF-KK-DAEFRHDSGYEVH(序列表中的序列编号36)的氨基酸序列的肽、及0.5mg/ml人白蛋白的生理盐水溶液。将其以分别注入5ml安培瓶中以达到1ml/安培瓶，以常规方法冷冻干燥。本品由于受到广阔范围的HLA-DR的单元型的限制，对很多人群，尤其对于接受破伤风的预防接种的人，通过粘膜或透皮给药，可发挥能有效增强具有预防及治疗以阿尔茨海默症为代表的神经病变性疾病等的各种疾病效果的抗Aβ的抗体的产生的疫苗的效果。需要说明的是，连接2个以上Aβ(1-13)时，可增加抗体产生量。另外，即使以Aβ(1-15)、Aβ(3-11)、Aβ(3-15)代替Aβ(1-13)时，也能发挥大致相同的效果。

产业实用性

如上所述，本发明涉及一种含有在人体中已确立的免疫记忆的T细胞表位和具有Aβ的B细胞表位的氨基酸序列或含有该序列的肽，可以在不存在免疫佐剂的额情况下，也能特异性增强对Aβ特异性的的抗体的产生的肽、及含有该肽的组合物。另外，由于本发明的肽受到广阔范围的HLA-DR的单元型的限制，对很多人群，尤其对于通过预防接种确立免疫记忆的人，可作为诱导具有预防及治疗以阿尔茨海默症为代表的神经病变性疾病等的各种疾病效果的抗Aβ的抗体的产生的肽疫苗进行使用。而且，本发明的肽疫苗，不需要使用免疫佐剂，并可以以鼻腔给药或口服给药等经粘膜给药形式进行使用，与采用注射的透皮给药等比较，是一种简便而安全的肽疫苗。本发明是一种显示出明显作用效果的发明，对该领域做出了很大贡献，确实是一种有意义的发明。

序列表

<110>Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo

<120>用于诱导产生抗淀粉样β肽抗体的肽疫苗

<130>WO1132

<160>38

<210>1

<211>40

<212>PRT

<213>人

<223>淀粉样β(1-40)

<400>1

<210>2

<211>42

<212>PRT

<213>人

<223>淀粉样β(1-42)

<400>2

<210>3

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<223>交叠多限制位肽

<400>3

<210>4

<211>15

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒

<223>gag蛋白(部分序列)

<400>4

<210>5

<211>11

<212>PRT

<211>人

<213>人

<223>淀粉样β(N-末端部分序列(1-11))

<400>5

<210>6

<211>13

<212>PRT

<213>人

<223>淀粉样β(N-末端部分序列(1-13))

<400>6

<210>7

<211>15

<212>PRT

<213>人

<223>淀粉样β(N-末端部分序列(1-15))

<400>7

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>人

<223>淀粉样β(N-末端部分序列(3-11))

<400>8

<210>9

<211>13

<212>PRT

<213>人

<223>淀粉样β(N-末端部分序列(3-15))

<400>9

<210>10

<211>20

<212>PRT

<213>白喉杆菌

<223>白喉类毒素(部分序列)

<400>10

<210>11

<211>19

<212>PRT

<213>白喉杆菌

<223>白喉类毒素(部分序列)

<400>11

<210>12

<211>16

<212>PRT

<213>肉毒芽孢杆菌(Clostridium tenani)

<223>破伤风毒素(部分序列)

<400>12

<210>13

<211>18

<212>PRT

<213>肉毒芽孢杆菌

<223>破伤风毒素(部分序列)

<400>13

<210>14

<211>16

<212>PRT

<213>肉毒芽孢杆菌

<223>破伤风毒素(部分序列)

<400>14

<211>18

<212>PRT

<213>肉毒芽孢杆菌

<223>破伤风毒素(部分序列)

<400>15

<210>16

<211>18

<212>PRT

<213>肉毒芽孢杆菌

<223>破伤风毒素(部分序列)

<400>16

<210>17

<211>20

<212>PRT

<213>肉毒芽孢杆菌

<223>破伤风毒素(部分序列)

<400>17

<210>18

<211>15

<212>PRT

<213>肉毒芽孢杆菌

<223>破伤风毒素(部分序列)

<400>18

<210>19

<211>16

<212>PRT

<213>肉毒芽孢杆菌

<223>破伤风毒素(部分序列)

<400>19

<210>20

<211>15

<212>PRT

<213>肉毒芽孢杆菌

<223>破伤风毒素(部分序列)

<400>20

<210>21

<211>17

<212>PRT

<213>肉毒芽孢杆菌

<223>破伤风毒素(部分序列)

<400>21

<210>22

<211>17

<212>PRT

<213>结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<223>MPT64(部分序列)

<400>22

<210>23

<211>16

<212>PRT

<213>结核杆菌

<223>MPT64(部分序列)

<400>23

<210>24

<211>16

<212>PRT

<213>结核杆菌

<223>MPT64(部分序列)

<400>24

<210>25

<211>16

<212>PRT

<213>结核杆菌

<223>MPT64(部分序列)

<400>25

<210>26

<211>5

<212>PRT

<213>人

<223>细胞粘附分子的结合基序

<400>26

<210>27

<211>4

<212>PRT

<213>人

<223>细胞粘附分子的结合基序

<400>27

<210>28

<211>5

<212>PRT

<213>人

<223>细胞粘附分子的结合基序

<400>28

<210>29

<211>5

<212>PRT

<213>人

<223>细胞粘附分子的结合基序

<400>29

<210>30

<211>8

<212>PRT

<213>人

<223>细胞粘附分子的结合基序

<400>30

<210>31

<211>5

<212>PRT

<213>人

<223>细胞粘附分子的结合基序

<400>31

<210>32

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<223>用于产生抗淀粉样B肽抗体的肽

<400>32

<210>33

<211>31

<212>PRT

<213>人工序列

<223>用于产生抗淀粉样B肽抗体的肽

<400>33

<210>34

<211>33

<212>PRT

<213>人工序列

<223>用于产生抗淀粉样B肽抗体的肽

<400>34

<210>35

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

<223>用于产生抗淀粉样B肽抗体的肽

<400>35

<210>36

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

<223>用于产生抗淀粉样B肽抗体的肽

<400>36

<210>37

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

<223>用于产生抗淀粉样B肽抗体的肽

<400>37

<210>38

<211>36

<212>PRT

<213>人工序列

<223>用于产生抗淀粉样B肽抗体的肽

<400>38

Claims

1.一种肽，其是具有下述通式表示的氨基酸序列的肽，其特征为T表示含有已经确立免疫记忆的T细胞表位的氨基酸序列的氨基酸序列，L表示连接肽的氨基酸序列，B表示含有1个或2个以上淀粉样β肽的B细胞表位的氨基酸序列的氨基酸序列，R₁、R₂、R₃及R₄中的至少1个表示细胞粘附分子的细胞结合基序的肽的氨基酸序列，通式为：

R₁-T-R₂-L-R₃-B-R₄。

2.如权利要求1所述的肽，其特征为T细胞表位具有选自来自结核、白喉、破伤风、百日咳中的任1种或2种以上的肽的氨基酸序列。

3.组合物，其含有权利要求1或2中所述的肽和制剂学允许的1种以上的制剂用添加剂，并可通过经粘膜给药诱导抗淀粉样β肽的抗体。

4.如权利要求3中所述的组合物，其用于阿尔茨海默症的预防和/或治疗。

5.编码权利要求1或2中所述的肽的DNA。