JP2003002842A - 肺炎球菌表面タンパク質の菌株選択及び関連する応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも１つのファミリーから選択された
菌株からの少なくとも２種のＰｓｐＡを含有しているワ
クチン組成物（類）に関しており、前記ファミリーはＰ
ｓｐＡのαヘリックス領域のＣ末端領域における整列配
列において５０％以上の相同性を有するファミリーに属
している菌株からのＰｓｐＡによって定義されている。
さらに、これらのファミリーはクレードから構成されて
おり、このときクレードに属する菌株からのＰｓｐＡは
αヘリックス領域のＣ末端領域における整列配列におい
て少なくとも７５％の配列相同性を示している。本発明
のワクチン組成物類は、好ましくは各々単一クレードを
代表している最低４種かつ最高６種の菌株を含んでお
り、少なくとも２種のＰｓｐＡは任意で血清学的又は広
汎に交差反応性である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（関連出願）本願は、１９９６年９月２０
日に提出されたUSSN08/710,749の一部継続出願である。

【０００２】（発明の背景）肺炎連鎖球菌(Streptococc
us pneumoniae)は中耳炎、髄膜炎、菌血症及び肺炎の重
要な原因であり、高齢者及び肺疾患、肝疾患、アルコー
ル中毒症、鎌状赤血球貧血症、脳脊髄液漏出、後天性免
疫不全症候群（ＡＩＤＳ）のような医学的基礎状態を有
する患者、さらに免疫抑制療法を受けている患者におけ
る致死性感染症の主要原因である。肺炎連鎖菌はさら
に、小児における罹病率の主要原因でもある。肺炎球菌
感染症は米国において毎年およそ４０，０００例の死亡
を惹起している。最も重篤な肺炎球菌感染症には侵襲性
髄膜炎及び菌血症感染症が含まれており、それらの発症
数は年間各々３，０００及び５０，０００例である。

【０００３】抗生物質やワクチンが使用されているにも
かかわらず、肺炎球菌感染症の罹患率は過去２５年間に
渡ってほとんど減少していない。菌血症の致死率は一般
集団においては１５〜２０％、高齢者においては３０〜
４０％、そして都市部アフリカ系アメリカ人においては
３６％であると報告されている。菌血症ほど重篤ではな
い肺炎球菌疾患の形態は肺炎及び小児における中耳炎で
あるが、米国においてはそれらの年間発症例中の各々５
００，０００例及び７，０００，０００例が肺炎球菌に
よって惹起されると推定されている。薬剤耐性肺炎連鎖
球菌の菌株は米国及び世界中でますます一般的になりつ
つある。一部の地域では、肺炎球菌の３０％という多種
類の分離菌がペニシリンに対して耐性である。抗生物質
耐性肺炎球菌の増加によって、さらに肺炎球菌感染症を
予防する必要性が高まっている。

【０００４】肺炎球菌は健常者の上気道に無症候的に増
殖する。疾患の発生は、しばしば日和見的事象中に微生
物が鼻咽喉から他の組織へ拡散することによって起こ
る。ヒトにおける保菌の発生率は年齢及び環境によって
様々である。典型的には、成人より小児における保菌率
の方が高い。これまでに実施された試験は、就学前児童
の３８％〜６０％、中学校学齢の２９〜３５％、そして
高等学校学齢の９〜２５％が肺炎球菌の保菌者であるこ
とを証明している。成人の間では、家族に小児のいない
場合は保菌率が６％へ低下するが、家族に小児のいる場
合の保菌率は１８〜２９％である。成人より小児におけ
る方が高い保菌率がこれらの年齢集団における肺炎球菌
疾患の発生率と平行していることは驚くに当たらない。

【０００５】肺炎球菌ワクチン接種の魅力的な目標は、
ワクチン接種を実施した集団における保菌率を低下さ
せ、その結果として肺炎球菌疾患の発生率を減少させる
ことにある。ワクチン接種により肺炎球菌保菌率が低下
すれば、ワクチン接種者と同様に非ワクチン接種者にお
いても疾患発生率を低下させられるのではないかという
推測がある。この上気道細菌性病原体に対するワクチン
接種によって惹起されるこの「集団免疫」は、Ｂ型イン
フルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅ
ｎｚａｅ ｔｙｐｅ ｂ）結合体ワクチンを使用して観
察されている（Ｔａｋａｌａ， Ａ．Ｋ．ら， Ｊ．
Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． １９９１；１６４：９８
２−９８６；Ｔａｋａｌａ， Ａ．Ｋ．ら， Ｐｅｄｉ
ａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． Ｊ．， １９９
３；１２：５９３−５９９；Ｗａｒｄ， Ｊ．ら， Ｖ
ａｃｃｉｎｅｓ， Ｓ．Ａ． Ｐｌｏｔｋｉｎ ａｎｄ
Ｅ．Ａ． Ｍｏｒｔｉｍｅｒ， ｅｄｓ．， １９９
４，ｐｐ．３３７−３８６；Ｍｕｒｐｈｙ， Ｔ．Ｖ．
ら， Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒ．， １９９３；１２２：
５１７−５２３；及びＭｏｈｌｅ−Ｂｏｅｔａｎｉ，
Ｊ．Ｃ．ら， Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄ
ｉｓ． Ｊ．， １９９３；１２：５８９−５９３）。

【０００６】一般に、肺炎連鎖球菌への免疫が肺炎球菌
の莢膜多糖類に対する特異的抗体によって媒介され得る
ことは容認されている。しかし、新生児及び幼児はほと
んどの莢膜多糖類抗原に対して適切な免疫反応を発生す
ることができないので、同一莢膜血清型を含んでいる感
染症を繰返し発症することがある。数多くの被包性細菌
に対して乳児を免役するための１つのアプローチは、莢
膜多糖類抗原を免疫原性にするためにタンパク質と結合
させることである。このアプローチは、例えばＢ型イン
フルエンザ菌については成功を収めている（Ｇｏｒｄｏ
ｎに付与された米国特許第４，４９６，５３８号及びＡ
ｎｄｅｒｓｏｎに付与された米国特許第４，６７３，５
７４号を参照）。

【０００７】しかし、肺炎連鎖球菌には既知の莢膜血清
型が９０種以上あり、疾患の約９５％の原因となってい
るのはそれらのうちの２３種である。肺炎球菌多糖−タ
ンパク質結合体の入手に成功するためには、大多数の肺
炎球菌感染症の原因である莢膜型を適正に免疫原性にし
なければならないであろう。だがこのアプローチは、現
在利用可能なワクチンに含まれている２３種の多糖類は
たとえ成人においても全てが適正には免疫原性ではない
ので、おそらく困難であろう。

【０００８】抗莢膜多糖類抗体反応によって媒介される
防御は多糖類の型だけに限定されている。種々の多糖類
の型はヒト及び他の動物種において特異的にビルレンス
（菌力）を促進する。肺炎球菌ワクチンは、ヒト肺炎球
菌疾患の優勢なタイプである２３種の莢膜多糖類を結合
することによって開発されてきた。これらの２３の多糖
類タイプは１９８３年以降、認可された肺炎球菌ワクチ
ンにおいて使用されている（Ｄ．Ｓ． Ｆｅｄｓｏｎ
ａｎｄ Ｍ． Ｍｕｓｈｅｒ， Ｖａｃｃｉｎｅｓ（ワ
クチン）， Ｓ．Ａ． Ｐｌｏｔｋｉｎ ａｎｄ Ｊ．
Ｅ．Ａ． Ｍｏｎｔｉｍｅｒ， ｅｄｓ．， １９９
４， ｐｐ．５１７−５６４）。認可された２３価の多
糖類ワクチンは、健常成人においてワクチン型の肺炎球
菌によって誘発される菌血症の予防におよそ６０％の有
効性があると報告されている。

【０００９】しかし、このワクチンの有効性はこれまで
議論の的となっており、時々このワクチンの使用が推奨
されることについての正当性が疑問視されている。この
ワクチンの有効性は、２３種の抗原を結合したことによ
ってマイナスの影響を受けるのではないかと推測されて
いる。単一調製物中に多種類の抗原を結合すると抗原競
合が発生するために、混合物中の個々の型に対する抗体
反応にマイナスの影響を及ぼす可能性がある。有効性は
さらに又、２３種の血清型がヒト感染症及び保菌と関連
する全ての血清学的型を含んでいるという事実によって
も影響を受ける。

【００１０】小児、及びさらには高齢者を肺炎球菌感染
症から防御するためのもう１つのアプローチは、防御免
疫反応を引き出せるタンパク質抗原類を同定することで
あろう。そうしたタンパク質類は、それだけでワクチン
として役立つ可能性があるが、さらに上出来の多糖類−
タンパク質結合体と結合して、又は多糖類のための担体
として使用できる可能性がある。

【００１１】ＭｃＤａｎｉｅｌら（Ｉ）， Ｊ． Ｅｘ
ｐ． Ｍｅｄ． １６０：３８６−３９７， １９８
４，は、肺炎連鎖球菌上の細胞表面ポリペプチド（類）
を認識するモノクローナル抗体類を産生すること及びそ
うした抗体類によって一定菌株の被包性肺炎球菌による
感染症からマウスを防御することについて述べている。

【００１２】この表面タンパク質抗原は、「肺炎球菌表
面タンパク質Ａ」、若しくは省略して「ＰｓｐＡ」と呼
ばれてきた。

【００１３】ＭｃＤａｎｉｅｌら（ＩＩ）， Ｍｉｃｒ
ｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ １：５１９−
５３１， １９８６，は、ＰｓｐＡの特性付けに関する
研究について述べている。様々な菌株においてＰｓｐＡ
分子には相当に大きな多様性があることが観察されてお
り、同様に種々の抗体よって認識されるエピトープにも
相違があることが観察されている。

【００１４】ＭｃＤａｎｉｅｌら（ＩＩＩ）， Ｊ．
Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６５：３８１−３９４， １
９８７，は、ＰｓｐＡを発現する非被包性肺炎球菌によ
るＸ連関免疫不全性（ＸＩＤ）マウスの免疫は引き続い
ての肺炎球菌による致死性感染症からマウスを防御する
が、ＰｓｐＡを発現しない同質遺伝子型肺炎球菌による
免疫は防御を授けないと述べている。

【００１５】ＭｃＤａｎｉｅｌら（ＩＶ）， Ｉｎｆｅ
ｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ５９：２２２−２２８， １
９９１，は、莢膜型が６Ａ及び３の肺炎球菌株に対する
防御を引き出すことのできる、ＰｓｐＡの組換え全長フ
ラグメントによるマウスの免疫について述べている。

【００１６】Ｃｒａｉｎら， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍ
ｕｎ．， ５６：３２９３−３２９９， １９９０，
は、肺炎連鎖球菌の臨床的及び実験的分離菌株の１００
％（ｎ＝９５）においてＰｓｐＡを検出するウサギ抗血
清について述べている。ＰｓｐＡに対する７種のモノク
ローナル抗体と反応させると、５７種の肺炎連鎖球菌分
離菌が３１種の反応パターンを示した。

【００１７】米国特許第５，４７６，９２９号は、Ｐｓ
ｐＡ及びそのフラグメントを含んでいるワクチン類、Ｐ
ｓｐＡ及びそのフラグメントをコードするＤＮＡを発現
させる方法、ＰｓｐＡ及びそのフラグメントをコードす
るＤＮＡ、ＰｓｐＡ及びそのフラグメントのアミノ酸配
列、ＰｓｐＡ及びそのフラグメントを含んでいる組成物
類及びそうした組成物類を使用する方法について述べて
いる。

【００１８】ＰｓｐＡはビルレンス因子かつ防御抗原で
あると同定されている。ＰｓｐＡは、全ての臨床的分離
菌上で所見される細胞表面分子であり、マウスモデルに
おいて肺炎球菌のフルビルレンスを得るためにはＰｓｐ
Ａの発現が必要とされる（ＭｃＤａｎｉｅｌら（ＩＩ
Ｉ）， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６５：３８１−
３９４，１９８７）。ＰｓｐＡの生物学的機能はまだ明
瞭には定義されてはいないが、予備試験報告書はＰｓｐ
Ａが補体活性化を阻害する可能性のあることを示唆して
いる（Ａｌｏｎｓｏ ＤｅＶｅｌａｓｃｏ，Ｅ．ら，
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖ． １９９
５；５９：５９１−６０３）。

【００１９】ＰｓｐＡタンパク質型は莢膜型とは無関係
である。環境における遺伝突然変異又は交換が莢膜、Ｐ
ｓｐＡ及びおそらく様々な構造を持つ他の分子に関して
高度に相違する大きな菌株のプールの発生を許してきた
のであろう。種々の菌株からのＰｓｐＡの変動性も又、
６７から９９ｋＤに及ぶそれらの分子量からも明らかで
ある。観察された相違は安定して遺伝性であり、タンパ
ク質分解の結果ではない。

【００２０】組換えｌｇｔｌ１クローンの溶解液に含ま
れているＰｓｐＡを用いての免疫は、ＭｃＤａｎｉｅｌ
ら（ＩＶ）， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ５
９：２２２−２２８，１１９１，におけるように、種々
の莢膜型及びｐｓｐＡ型を代表している数種の肺炎連鎖
球菌株を用いたチャレンジに対して防御を引き出した。
上記論文に従ってＰｓｐＡを発現するクローンを形成し
たが、生成物は不溶性で、溶解後の細胞フラグメントか
らの単離は不可能であった。

【００２１】ＰｓｐＡ分子のヌクレオチド及びアミノ酸
配列の解析は３つの主要領域を明らかにしている。この
タンパク質のアミノ末端にある最初の２８８アミノ酸は
強力なαヘリックス構造を有していると予想されてい
る。９０アミノ酸の隣接領域（Ｒｘ１ ＰｓｐＡの２８
９〜３６９）は高密度のプロリン残基を有している。他
の原核タンパク質における類似領域に基づくと、この領
域は細菌細胞壁を横断すると考えられる。この分子のカ
ルボキシル末端にある残りの１９６アミノ酸（Ｒｘ１
ＰｓｐＡの３７０〜５８８）は、ホスホコリン及びリポ
テイコ酸に結合することが証明されている反復アミノ酸
配列を有している。この構造に基づくと、ＰｓｐＡ分子
はこのタンパク質のカルボキシル末端の中央部における
反復領域によって内膜及びリポテイコ酸と結び付いてい
ると思われる。タンパク質の中央にあるプロリン領域
は、肺炎連鎖球菌細胞の外面上にαヘリックス領域を配
置しており、細胞壁を横断すると思われる。このモデル
は、細胞の表面から伸びているαヘリックス領域が防御
エピトープ類を含有しているという証明と一致している
（Ｙｏｔｈｅｒ，Ｊ．ら， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ． １９９２；１７４：６０１−６０９；Ｙｏｔｈｅ
ｒ，Ｊ．ら， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９９
４；１７６：２９７６−２９８５；ＭｃＤａｎｉｅｌ，
Ｌ．Ｓ．ら， Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇ．
１９９４；１７：３２３−３３７；及びＲａｌｐｈ，
Ｂ．Ａ．ら， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓ
ｃｉ．１９９４；７３０：３６１−３６３）。

【００２２】７種のモノクローナル抗体類のパネルを使
用したＰｓｐＡの血清学的解析は、莢膜多糖類と同様
に、ＰｓｐＡ分子は肺炎球菌株間で高度に相違している
ことを示した。これらの解析に基づいて、３０種以上の
ＰｓｐＡタンパク質血清型が定義され、個々の菌株はモ
ノクローナル抗体のパネルとの反応性に基づく分類シス
テムを使用してグループ、つまりファミリー（又は血清
型）に指定された。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシ
ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
解析は、ＰｓｐＡ血清型内において、さらに分子サイズ
に基づき不均質性が存在することを示した。この多様化
はさらに、ＰｓｐＡが自然感染症における防御抗原であ
るという主張を支持している。抗ＰｓｐＡ反応の防御的
性質が、おそらく肺炎球菌に選択的圧力をかけてこの分
子を多様化させたのであろう。しかし、ＰｓｐＡ分子の
この多様化はＰｓｐＡワクチンの開発を複雑化し、Ｐｓ
ｐＡワクチンが多数のＰｓｐＡ菌株を含有しなければな
らない可能性をもたらし、おそらくワクチンを非実際的
にするであろう。

【００２３】Ｂｒｉｌｅｓら（ＰＣＴ ９２／０００８
５７）は、PｓｐＡ特異的プローブを使用して肺炎連鎖
球菌の種々の菌株間に含まれる関連タンパク質を同定し
た。そうしたＰｓｐＡ様ポリペプチドの１つはＰｓｐＣ
を指定した。 ｅｔ ａｌ．， Ａｂｓｔｒａｃｔｓ
ｏｆ ｔｈｅ ９７ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎ
ｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｉ
ｅｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｍａｙ
１９９７（米国微生物学会第９７回年会議の抄録、１９
９７年５月）。ＰｓｐＣをコードする遺伝子は全長Pｓ
ｐＡプローブにハイブリダイズして、分子レベルでのＰ
ｓｐＡ及びＰｓｐＣタンパク質の親密な関連性を証明し
ている。ＰｓｐＡクレードと既知のｐｓｐＣ遺伝子につ
いての共通配列の比較は、一部のＰｓｐＣタンパク質を
定義されたＰｓｐＡクレード間に分類できることを示し
ている。実際に、肺炎連鎖球菌の別の分離菌からのｐｓ
ｐＣ遺伝子の配列解析は、これらのｐｓｐＣ遺伝子の生
成物とクレード２の代表菌株からのｐｓｐＡ遺伝子の生
成物との間にアミノ酸レベルで85％を越える相同性があ
ることを明らかにしている。さらに、ＰｓｐＣはＰｓｐ
Ａについて上記で述べた同一の３つの主要領域、つまり
αヘリックスN末端ドメイン、プロリン富裕領域及びク
ロリン結合Ｃ末端ドメインを含有している。同様に、Ｐ
ｓｐＣに対して産生したポリクローナル抗体類はＰｓｐ
Ａタンパク質と交差反応する。従って、本発明の目的で
は、本明細書及び添付のクレームに記載されている用語
「ＰｓｐＡ」は全長及び不完全形である天然発生形、合
成形、半合成形、又は組換え形のＰｓｐＣのＰｓｐＡを
含んでいる。

【００２４】上記で特に明記した公表されている文献に
加えて、発明者らは共同研究者と協力して、さらに下記
のようなＰｓｐＡに関する詳細な文献を発表している。

【００２５】１．Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ８９ｔｈ
Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ， ｐ．１２５， ｉｔｅｍ Ｄ−２５
７， Ｍａｙ １９８９（米国微生物学会第８９回年会
議の抄録、ｐ．１２５，項目Ｄ−２５７ 、１９８９年
５月） ２．Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ９０ｔｈ Ａ
ｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ， ｐ．９８， ｉｔｅｍ Ｄ−１０６，
Ｍａｙ １９９０（米国微生物学会第９０回年会議の
抄録、ｐ．９８，項目Ｄ−１０６ 、１９９０年５月） ３．Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ ３ｒｄ Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ ＡＳＭ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
ｐ．１１， ｉｔｅｍ １２， Ｊｕｎｅ １９９０
（第３回国際ＡＳＭ肺炎球菌遺伝学会議の抄録、ｐ．１
１，項目１２，１９９０年６月） ４．Ｔａｌｋｉｎｇｔｏｎら， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍ
ｍｕｎ． ５９：１２８５−１２８９， １９９１； ５．Ｙｏｔｈｅｒら（Ｉ）， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ． １７４：６０１−６０９， １９９２；及び ６．Ｙｏｔｈｅｒら（ＩＩ）， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ． １７４：６１０−６１８， １９９２． ７．ＭｃＤａｎｉｅｌら（Ｖ）， Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ． Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ， １３：２６１−２
６８， １９９４．

【００２６】代替ワクチン接種戦略があれば、そうした
ものは代替投与経路又は免疫反応を発生させる代替経路
を生じさせるので望ましい。同一調製物内に競合する可
能性のある多数の抗原を結合させる必要なく、種々の多
様な肺炎球菌株に対する防御を引き出す免疫学的組成物
又はワクチン接種レジメンを提供することは有益であろ
う。

【００２７】先行技術は広範に有効な肺炎球菌ワクチン
類を提供することに失敗している。驚くべきことに、肺
炎球菌（Pneumococci）内のクレード及びファミリーグ
ループを使用する本発明の技術は、広汎に有効な肺炎球
菌ワクチン類、試薬類及び方法を作り出すために、種々
のクレードファミリーから代表的ＰｓｐＡの合理的選択
を可能にすることによって、先行技術のアプローチの欠
陥を解決しているのである。

【００２８】本発明は、少なくとも２つのファミリーか
ら選択された菌株からの、少なくとも２種のＰｓｐＡか
ら成るワクチン組成物を提供する。ファミリーは、Ｐｓ
ｐＡのαヘリックスのＣ末端領域における整列配列にお
いて５０％以上の相同性を有する菌株からのＰｓｐＡに
よって定義される。

【００２９】本発明はワクチン組成物を提供するが、こ
のときファミリーにはさらに１以上のクレードが含まれ
ている。クレードは、ＰｓｐＡのαヘリックスのＣ末端
領域における整列配列において７５％以上の相同性を有
している菌株からのＰｓｐＡによって定義される。

【００３０】さらに、本発明は、ＰｓｐＡのαヘリック
スのＣ末端領域が重要なエピトープ（類）を含有してい
るワクチン組成物類を提供する。

【００３１】本発明はさらに、αヘリックス領域のＣ末
端１００アミノ酸（Ｒｘ１ ＰｓｐＡの１９２〜２９
０）を含有している中心ドメインが防御反応を引き出す
ことのできるエピトープ（類）を含有しているワクチン
組成物類を提供する。

【００３２】（発明の詳細な説明）現在では驚くべきこ
とに、先行技術では菌株からのＰｓｐＡには明白な多様
性があると主張されているにもかかわらず、ＰｓｐＡの
αヘリックスの一次配列順序は２つの相対保存領域と菌
株からのＰｓｐＡ間で広範な多様性が見られる１つの領
域とを有していることが発見されている。２つの相対保
存領域は、図１及び図２に示されているように、αヘリ
ックスの最初の６０アミノ酸を含むＮ末端と、αヘリッ
クスの最後の約１００アミノ酸を含むＣ末端とから構成
されており、このときαヘリックスのＣ末端は広汎に有
効なＰｓｐＡワクチンを開発するために決定的に重要で
ある交差反応性かつ防御的なエピトープ類を含有してい
る。αヘリックスの最初の６０アミノ酸を含むＮ末端に
おけるあらゆる保存はほとんど菌株の交差反応性におけ
る結果ではなく、従ってＰｓｐＡワクチンの開発には不
適切であることが発見されている。

【００３３】肺炎連鎖球菌の２４種の菌株からのＰｓｐ
ＡにおけるαヘリックスのＣ末端領域でのアミノ酸配列
の比較により、ＰｓｐＡ菌株は７５％を越える相同性を
持つ６つのクレードに分類でき、さらにこれらのクレー
ドは５０％以上の相同性を持つ４つのファミリーに分類
できることが明らかになった。

【００３４】従って、本発明はαヘリックスのＣ末端領
域におけるＰｓｐＡの配列相同性に基づいて、ＰｓｐＡ
の菌株選択方法を提供する。

【００３５】クレードは、本書ではαヘリックスのＣ末
端領域での整列配列において７５％を越える配列相同性
を示すＰｓｐＡを含有していると定義されており、ファ
ミリーは、αヘリックスのＣ末端領域での整列配列にお
いてメンバーＰｓｐＡ配列間で５０％以上の相同性を示
すクレードの集まりであると定義されている。

【００３６】さらに、配列相同性に加えて、クレードの
メンバーは相互に交差反応性及び交差防御性を示すこと
が発見されており、これはおそらく配列相同性と交差反
応性との間に因果関係があることを示唆しているのであ
ろう。同一ＰｓｐＡクレード内の菌株のＰｓｐＡは、免
疫及びチャレンジ実験からの相互的交差防御を示す。こ
れまで、先行技術ではそうした因果関係がある可能性は
認識されていなかった。実際に、ＰｓｐＡ菌株のファミ
リーは血清学的交差反応性に基づいてのみ定義されてお
り、ＰｓｐＡ菌株のファミリーに関する先行技術の定義
に基づいて、ＰｓｐＡ分子には極度の多様性は菌株選択
を無駄な試みに終わらせるであろうと考えられていた。
さらに、ＰｓｐＡのタイプ分類システム（Ｃｒａｉｎ
ら， Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ． ５９：２２２−
２２８，１９９０）は、菌株の適切な分類を提供するこ
とができず、非常な多様性があることを示唆していた。

【００３７】だが先行技術の教示とは対照的に本発明
は、配列相同性及び交差反応性に従って菌株からのＰｓ
ｐＡの選択を可能にするため、多種類のＰｓｐＡを含ん
でいるワクチン組成物の開発が容易になる。

【００３８】本発明はＰｓｐＡの各々が単一クレードを
代表する２種以上の、好ましくは１０種未満の、及びよ
り好ましくは最少４種かつ最高６種の菌株及び製剤学的
に容認可能な担体若しくは希釈剤を含有しているワクチ
ン組成物類を予想している。好ましい実施態様では、ク
レード２のメンバーであるＲｘ１が、本発明のワクチン
組成物に任意で含まれているクレード２及び／又はファ
ミリー１の好ましい菌株である。

【００３９】αヘリックス領域のＣ末端についてのファ
ミリー構造に関する上記の定義は、限定数の菌株を含む
広汎に有効な肺炎球菌ワクチン組成物の開発を可能にす
る。この交差反応性かつ防御的領域について一部又は全
部のファミリーを代表する菌株を結合することは、肺炎
球菌疾患に対する広範な防御を提供するはずである。フ
ァミリー内の一部のクレード間には交差反応性があるた
め、又はワクチン接種をされる集団にはこれらの菌株又
はクレードの疫学があるために、全てのクレードが代表
される必要はないかも知れない。しかし、過度の実験を
行う負担を伴わずに、１種のワクチン組成物内に含める
べき菌株を決定することは当業者の知識の範囲内に十分
に含まれている。さらに、本発明の選択されたＰｓｐＡ
及びＰｓｐＡ様ポリペプチド類はさらに免疫反応を引き
出すことのできる重要なエピトープ（類）を含んでい
る。重要なエピトープとは、抗体若しくはＴ細胞と相互
作用することのできる重要な抗原若しくは免疫原の部分
である。

【００４０】本発明は、重要なエピトープを有している
肺炎球菌株と製剤学的に容認可能な担体若しくは希釈剤
とを含有している免疫原性、免疫学的又はワクチン組成
物を提供する。重要なエピトープを有するＰｓｐＡを含
有している免疫学的組成物は、局所的又は全身性免疫学
的反応を引き出す。この反応は、防御的であり得るが、
防御的である必要はない。重要なエピトープを有するＰ
ｓｐＡを含有している免疫原性組成物は、防御的であり
得るが、防御的である必要はない局所的又は全身性免疫
学的反応を同様に引き出すことができる。ワクチン組成
物は局所又は全身性防御反応を引き出す。従って、用語
「免疫学的組成物」及び「免疫原性組成物」には「ワク
チン組成物」が含まれている（前者の２つの用語は防御
的組成物であり得るため）。

【００４１】このため本発明はさらに、重要なエピトー
プを有しているＰｓｐＡと製剤学的に容認可能な担体若
しくは希釈剤とを含有している免疫原性、免疫学的又は
ワクチン組成物を宿主に投与することを含んでいる、宿
主哺乳動物において免疫学的反応を誘発する方法も提供
する。重要なエピトープ類に関しては、当業者であれば
しばしばエピトープ類又はペプチド若しくはポリペプチ
ドの免疫学的領域を、さらにそのためにアミノ酸及びペ
プチド若しくはポリペプチドの対応するＤＮＡ配列順序
についての知識から、並びに特定アミノ酸の性質（例、
サイズ、ロット、等）及びコドンディクショナリー（遺
伝暗号表）から過度の実験を行わずにコーディングＤＮ
Ａを識別することができる。

【００４２】免疫学的組成物においてタンパク質のどの
部分を使用すべきかを決定するための一般的方法は重要
な抗原のサイズ及び配列順序に集中している。「一般
に、大きなタンパク質はより強力な抗原決定基を有して
いるので、小さなタンパク質より優れた抗原である。免
疫反応を惹起することにおいては、抗原が異質であるほ
ど、即ち耐性を誘発する自己立体配置に関して類似性が
小さいほど、より有効である」（Ｉｖａｎ Ｒｏｉｔ
ｔ， Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１
９８８．）

【００４３】少なくとも、そうしたペプチドの長さは最
低８又は９アミノ酸でなければならない。これは、ペプ
チドがＣＤ４＋ Ｔ細胞反応（ウイルス感染細胞又は癌
細胞を認識する）を促進するために必要な最小の長さで
ある。ＣＤ８＋ Ｔ細胞反応（病原体を包んでいた細胞
を表現する特別な抗原を認識する）を促進するために
は、１３〜２５アミノ酸の最小ペプチド長が有用であ
る。上記のＫｅｎｄｒｅｗを参照。しかし、これらは最
小の長さであるため、これらのペプチド類は免疫学的反
応、つまり抗体又はＴ細胞反応を発生させると思われ
る；しかし、防御反応（ワクチン組成物からのような）
を発生させるためには、もっと長いペプチドが好まし
い。

【００４４】配列順序に関して、免疫原性ペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列順序はペプチドの少なくとも抗体反
応若しくはＴ細胞反応を発生させる領域をコードする。
Ｔ及びＢ細胞エピトープ類を決定する１つの方法は、エ
ピトープ・マッピングを含んでいる。重要なタンパク質
は、「タンパク分解酵素を含むオーバーラップペプチド
に細分される。個々のペプチドが、その後天然タンパク
質によって誘発された抗体へ結合する、又はＴ細胞若し
くはＢ細胞活性化を誘発する能力について試験される。
このアプローチは特にＴ細胞エピトープ類をマッピング
することにおいて有用であるが、それはＴ細胞がＭＨＣ
分子と複合化している短い直鎖ペプチド類を認識するか
らである。この方法はＢ細胞エピトープ類を決定するた
めにはあまり有効ではない」が、なぜならＢ細胞エピト
ープ類はしばしば直鎖アミノ酸配列ではなく、むしろ折
り畳まれた三次元タンパク質の三次構造から生じるため
である。Ｊａｎｉｓ Ｋｕｂｙ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ，（１９９２） ｐｐ．７９−８０．

【００４５】ＰｓｐＡの場合には、αヘリックス領域の
Ｃ末端１００アミノ酸での主要交差反応性領域の位置探
索は、長さが１００アミノ酸以上から構成される組換え
ペプチドを用いて実施された（ＭｃＤａｎｉｅｌら，
Ｍｉｃｒｏ． Ｐａｔｈｏｇ． １７：３２３−３３
７， １９９４）。

【００４６】重要なエピトープを決定するためのもう１
つの方法は、親水性であるタンパク質の領域を選択する
ことである。親水性残基はしばしばタンパク質の表面上
にあり、そのためにしばしば抗体に接近可能なタンパク
質の領域である。ＪａｎｉｓＫｕｂｙ， Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ，（１９９２）Ｐ．８１．

【００４７】重要なエピトープを決定するためのさらに
もう１つの方法は、抗原（全長）−抗体複合体のＸ線結
晶学解析を実施することである。Ｊａｎｉｓ Ｋｕｂ
ｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（１９９２）Ｐ．８０．

【００４８】一般に、免疫反応は次のように発生する：
Ｔ細胞は、タンパク質がより小さなペプチドに切断され
ているときにのみタンパク質を認識するが、ペプチドは
その後別の細胞表面上に所在する主要組織適合性遺伝子
複合体（「ＭＨＣ」）と呼ばれる複合体中でＴ細胞に対
面する。ＭＨＣ複合体には、クラスＩ及びクラスＩＩの
２つのクラスがあり、各クラスは多数の相違する対立遺
伝子から作り上げられている。相違する患者は相違する
タイプのＭＨＣ複合体対立遺伝子を有している。彼らは
相違する「ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）型」を有している
と言われる。

【００４９】クラスＩのＭＨＣ複合体類は実質的に各細
胞上で所見され、細胞の内側で産生したタンパク質から
ペプチドを表現する。従って、クラスＩのＭＨＣ複合体
類はウイルスに感染している、若しくは癌性になってい
る細胞及び癌遺伝子の発現の結果としての癌細胞を殺す
ために有用である。表面上にＣＤ４と呼ばれるタンパク
質を有しているＴ細胞はＭＨＣクラスＩ細胞に結合し、
リンホカイン類を分泌する。リンホカイン類は反応を刺
激する。細胞に到達し、ウイルス感染細胞を殺す。クラ
スＩＩのＭＨＣ複合体類は抗原表現細胞上でのみ所見さ
れ、抗原表現細胞によってエンドサイトーシスされてい
る循環病原菌からペプチド類を表現するために使用され
る。ＣＤ８と呼ばれるタンパク質を有しているＴ細胞は
ＭＨＣクラスＩＩ細胞に結合し、溶菌顆粒のエキソサイ
トーシスによって細胞を殺す。

【００５０】従って、重要なエピトープ類を識別するた
めのもう１つの方法は、Ｔ細胞反応を発生させることの
できるタンパク質の領域を識別することである。Ｔ細胞
反応を発生させるためには、推定上のエピトープを含ん
でいるペプチドがＭＨＣ複合体の関係において表現され
なければならない。当業者であれば、重要な抗原のタン
パク質配列順序から潜在的ヒトリンパ球抗原（「ＨＬ
Ａ」）アンカー結合主要素を識別することができる。Ｈ
ＬＡアンカー結合主要素は、おそらくＭＨＣ分子に結合
するであろうことが知られているペプチド配列である。
ペプチドは、好ましくはＭＨＣ分子に結合するために適
切なアンカー主要素を含んでおり、さらに免疫反応を発
生させるために十分な高度の親和性で結合しなければな
らない。考慮に入れることのできるその他の要素は次の
通りである：免役されることが予想される患者（脊椎動
物、動物又はヒト）のＨＬＡ型、タンパク質の配列、適
切なアンカー主要素の存在及び他の生体細胞におけるペ
プチド配列の発生。

【００５１】タンパク質がＴ細胞反応を促進することの
できる重要なエピトープ類を含んでいるかどうかを判定
することにおける一部の基準には次のものが含まれる：
ペプチド長−ペプチドはＭＨＣクラスＩ複合体内に適合
するためには少なくとも８又は９アミノ酸、及びクラス
ＩＩのＭＨＣ複合体内に適合するためには少なくとも１
３〜２５アミノ酸の長さがなければならない。この長さ
はペプチドがＭＨＣ複合体へ結合するための最低の長さ
である。細胞が発現されたペプチドを切断する可能性が
あるので、ペプチドはこれらの長さよりもっと長いこと
が好ましい。ペプチドは、免疫反応を発生させるために
十分な高度の特異性で、種々のクラスＩ又はクラスＩＩ
分子へ結合することを可能にする適切なアンカー主要素
を含んでいなければならない（Bocchia, M.ら，Specifi
c Binding of Leukemia OncogeneFusion Protein Pepti
des to HLA Class I Molecules（ＨＬＡクラスＩ分子へ
の白血球癌遺伝子融合タンパク質ペプチドの特異的結
合），Blood 85:2680-2684;Englehard, VH, Structure
of peputides associated with class I and ClassII M
HC molecules（クラスＩ及びクラスＩＩのＭＨＣ分子に
関連するペプチドの構造），Ann. Rev. Immunol. 12:18
1(1994)）。これは、過度の実験を行わずに、重要なタ
ンパク質の配列と公表されているＭＨＣ分子に関連する
ペプチドの構造とを比較することによって実施できる。
Ｔ細胞レセプターによって認識されるタンパク質エピト
ープ類は、タンパク質分子の酵素分解によって発生する
ペプチドであり、クラスＩ又はクラスＩＩのＭＨＣ分子
との関連において細胞表面上に表現される。

【００５２】さらに、当業者であればタンパク質配列を
タンパク質データベースに一覧されている配列と比較す
ることによって重要なエピトープを突きとめることがで
きる。相同性をほとんど又は全く共有しないタンパク質
の領域は、そのタンパク質のエピトープであるためには
良好な選択であるので、そのためにワクチン又は免疫学
的組成物において有用である。生体細胞に存在する広く
所見される配列と大きな相同性を共有する領域は避けな
ければならない。

【００５３】さらに又もう１つの方法は、重要なタンパ
ク質の部分を単純に発生又は発現させ、重要なタンパク
質のそれらの部分に対するモノクローナル抗体を発生さ
せ、さらにその後そのタンパク質が由来する病原菌のｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ増殖をそれらの抗体が阻害するかどうか
を確認することである。当業者であれば、それらに対す
る抗体類がｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖を阻害するかどうかに
ついての分析する目的で、重要なタンパク質の部分を発
生又は発現させるためにこの開示及び技術において述べ
られている別のガイドラインを使用することができる。
例えば、当業者であれば次のことによって重要なタンパ
ク質の部分を発生させることができる：タンパク質の８
〜９又は１３〜２５アミノ酸長部分を選択し、親水性領
域を選択し、抗原（全長）−抗体複合体のＸ線データか
ら結合することが証明されている部分を選択し、他のタ
ンパク質とは配列が相違している領域を選択し、潜在的
ＬＡアンカー結合主要素を選択すること、又はこれらの
方法若しくは技術において周知の他の方法を組み合わせ
ること。

【００５４】抗体類によって認識されたエピトープ類は
タンパク質の表面上で発現させられる。抗体反応を最も
刺激すると思われるタンパク質の領域を決定するため
に、当業者であれば好ましくは上記の一般的方法又は技
術において周知の他のマッピング方法を使用してエピト
ープマップを実施することができる。

【００５５】上述のことから明らかなように、過度の実
験を行わずにこの開示及び技術における知識から、当業
者はＴ細胞、Ｂ細胞及び／又は抗体反応を入手するため
に重要なエピトープのアミノ酸及び対応するＤＮＡ配列
を突きとめることができる。さらに、１９９１年５月２
８日にＤｅｆｔｅｒらに発行された米国特許第５，０１
９，３８４号及びその中に引用されている参考文献が参
照してここに組み入れられる（特にこの特許の「関連文
献」の項、及び次のことを開示しているこの特許の第１
３欄を参照：「広汎な重要な微生物に対しては非常に多
数のエピトープ類が定義されている。特に重要なのは、
中和抗体が差し向けられるエピトープ類である。そうし
たエピトープ類に開示は関連文献の項に挙げられている
多数の引用文献の中にある。」）

【００５６】さらに、本発明は１以上の血清学的に相補
的なＰｓｐＡ分子が、より良好な反応、例えば多様な菌
株の肺炎球菌に対する防御を引き出すために抗原的、免
疫学的又はワクチン組成物の中に存在し得ることを証明
している。さらに、本発明は最高に有効な組成物を提供
する目的で、交差防御評価を含んでいる多価組成物を得
るためにＰｓｐＡを選択するシステムを提供する。抗
原、例えばＰｓｐＡ又はその不完全形部分及び発明化合
物における任意の補助剤の量を決定すること及びそれら
の組成物を調製することは、製薬学的又は獣医学技術に
おける当業者に周知の標準技術に従って行うことができ
る。特に、本発明の組成物における抗原及び補助剤の量
及び投与される量は、特定抗原、補助剤（存在する場
合）、特定動物若しくは患者の年齢、性別、体重、種及
び健康状態、及び投与経路のような要素を考慮に入れて
医学又は獣医学の分野の当業者に周知の技術によって決
定される。例えば、免疫学的反応が望ましい適切な宿主
にとっての特定ＰｓｐＡ抗原の用量は、それと一緒に典
型的に投与される補助剤の量と同様に、本開示から当業
者であれば容易に突きとめることができる。従って、当
業者であれば組成物中の、及び本発明の方法で投与され
る抗原及び任意の補助剤の量を容易に決定することがで
きる。典型的には、補助剤は一般にリン酸緩衝液中の
０．００１〜５０ｗｔ％として使用され、抗原は約０．
０００１〜約５ｗｔ％、好ましくは約０．０００１〜約
１ｗｔ％、最も好ましくは約０．０００１〜約０．０５
ｗｔ％のようなマイクログラムからミリグラムの大きさ
で存在する（下記の実施例又はその中に挙げられている
応用例を参照）。しかし、典型的には、抗原はマイクロ
グラムからミリグラムの大きさで、又は約０．００１〜
約２０ｗｔ％、好ましくは約０．０１〜約１０ｗｔ％、
及び最も好ましくは約０．０５〜約５ｗｔ％で存在す
る。

【００５７】もちろん、その構成成分を含む動物若しく
はヒトに投与されるあらゆる組成物及びあらゆる特定投
与方法のためには、それらについて次のことを決定する
ことが好ましい：適切な動物モデル、例えばマウスのよ
うな齧歯類における致死量（ＬＤ）及びＬＤ_５０を決定
することによるような毒性；及び血清の滴定及び例えば
ＥＬＩＳＡ及び／又はＲＦＦＩＴ分析のような抗体又は
抗原についてのそれらの分析によって、組成物の用量、
その中に含まれる構成成分の濃度及び適切な免疫学的反
応を引き出す組成物の投与時機。そうした測定には当業
者の知識、本開示及び本書に引用されている文献から過
度の実験を必要としない。さらに、過度の実験を行わず
に連続的投与を行う時間を突きとめることができる。

【００５８】本発明の組成物類の例には、開口部、例え
ば口、鼻、肛門、膣、経口、胃内、粘膜（例、舌、歯
槽、歯肉、嗅覚若しくは気道粘膜）等から投与するため
の懸濁剤、シロップ剤若しくはエリキシル剤のような液
状製剤、及び非経口、経皮的、皮下、筋肉内若しくは静
脈内投与（例、注射可能な投与）するための無菌懸濁剤
若しくは乳濁剤のような製剤が含まれている。そうした
組成物類は、無菌精製水、生理食塩水、グルコース等の
ような適切な担体、希釈剤若しくは賦形剤と一緒に混合
することができる。組成物は凍結乾燥させることもでき
る。組成物類は湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、ゲ
ル化若しくは増粘性添加剤、防腐剤、着香料、着色料等
のような補助物質を目的の投与経路及び製剤に依存して
含有することができる。適切な製剤を調製するために
は、過度の実験を行わずに、参照してここに組み込まれ
ている「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵ
ＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ（レミントン製薬化学）、
第１７版、１９８５」のような標準参考書を参考にする
ことができる。

【００５９】本発明の組成物類は、便宜的には例えば等
張性水溶液、懸濁液、乳濁液若しくは選択されたｐＨへ
緩衝できる粘性組成物のような液状製剤として提供され
る。消化管による吸収が好ましい場合は、本発明の組成
物類は、徐放性若しくは例えばそれによって腸へ送達さ
れるためにゼラチンが胃内で溶解されるゼラチン被覆液
体のような液体充填剤を有している「固形」製剤を含む
ピル剤、錠剤、カプセル剤、カプレット剤等の「固体」
形であってよい。経鼻若しくは経気管（粘膜）投与が望
ましい場合は、組成物類は圧搾スプレー式ディスペンサ
ー、ポンプ式ディスペンサー又はエアゾール式ディスペ
ンサーによって投与される剤形であってよい。エアゾー
ル類は、通常は炭化水素による圧力下に置かれる。ポン
プ式ディスペンサーは、好ましくは計量された１回量又
は特定粒径を有する用量を分与する。

【００６０】本発明の組成物類は、特にそれらが経口投
与される場合は、それらをより魅力的なものとするため
に製剤学的に容認可能な芳香剤及び／又は着色料を含有
することができる。粘性組成物類は、ゲル剤、ローショ
ン剤、難航剤、クリーム剤その他の剤形であってよく、
典型的には粘度が約２，５００〜６，５００ｃｐｓであ
るために十分な量の増粘剤を含有しているであろうが、
より粘性の組成物類では１０，０００ｃｐｓまでの量さ
え使用することができる。粘性組成物類は、それを超え
る範囲では投与するのがより困難になるので、好ましく
は２，５００〜５，０００ｃｐｓの粘度を有している。
しかし、それを超える範囲では、組成物類は固形剤若し
くはゼラチン剤の剤形に近づくことができるので、その
後は経口摂取のための嚥下用ピル剤として容易に投与さ
れる。

【００６１】液状製剤類は、通常はゲル剤等の粘性組成
物類及び固形組成物類より容易に調製することができ
る。さらに、液状組成物類は、特に動物、小児、特に幼
児、及びピル剤、錠剤、カプセル剤その他を嚥下するの
が困難な可能性がある人々、又は反復投与の状態におい
て特に注射又は経口投与によって投与する方が幾らかよ
り便宜的である。他方粘性組成物類は、胃の内壁又は鼻
粘膜のような粘膜と長期の接触時間を生じさせるために
適切な粘度範囲内で製剤化することができる。

【００６２】明らかに、適切な担体類等の添加剤類の選
択は、正確な投与経路及び特定剤形、例えば液状剤形
（例、その組成物が液剤、懸濁剤、ゲル剤若しくはその
他の液状剤形に製剤化されるかどうか）、又は固形剤形
（例、その組成物がピル剤、錠剤、カプセル剤、カプレ
ット剤、徐放性剤形若しくは液剤充填剤形に製剤化され
るかどうか）の性質に依存するであろう。

【００６３】液剤、懸濁剤及びゲル剤は、通常は抗原に
加えて多量の水（好ましくは精製水）及び任意の補助剤
を含有している。少量のｐＨ調整剤（例、ＮａＯＨのよ
うな塩基）、乳化剤若しくは分散剤、緩衝剤、防腐剤、
湿潤剤、ジェル化剤（例、メチルセルロース）、着色料
及び／又は芳香剤のようなその他の成分も又存在するこ
とがある。組成物類は等張性であり得る、つまり血液及
び涙液と同一浸透圧を有していることができる。

【００６４】本発明の組成物類の望ましい等張性は、塩
化ナトリウム、又はデキストロース、ホウ酸、四酢酸ナ
トリウム、プロピレングリコール若しくはその他の無機
若しくは有機溶質のような製剤学的に容認可能な物質を
用いて達成することができる。ナトリウムイオンを含有
している緩衝剤のためには塩化ナトリウムが特に好まし
い。

【００６５】組成物類の粘度は、製剤学的に容認可能な
増粘剤を使用して選択されたレベルに維持することがで
きる。メチルセルロースは容易かつ経済的に入手するこ
とができ、取り扱いが容易であるために好ましい。その
他の適切な増粘剤には、例えばキサンタンゴム、カルボ
キシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロー
ス、カルボマー等が含まれる。増粘剤の好ましい濃度は
選択された物質に依存するであろう。重要なポイント
は、選択された粘度を達成するであろう量を使用するこ
とである。粘性組成物類は、通常はそうした増粘剤の添
加によって液剤から調製される。

【００６６】製剤学的に容認可能な防腐剤は、組成物類
の保管寿命を延長させるために使用することができる。
ベンジルアルコールが適切であるが、例えばパラベン、
ティメロサール、クロロブタノール、又は塩化ベンザル
コニウムを含む様々な防腐剤も又使用できる。防腐剤の
適切な濃度は総量に基づいて０．０２％〜２％であろう
が、選択された物質に依存して多少の変動があってよ
い。

【００６７】当業者であれば、組成物類の構成成分がＰ
ｓｐＡ抗原及び任意の補助剤に関して化学的に不活性で
あるように選択されなければならないことを認識するで
あろう。これは化学的及び製剤学的原理における当業者
にとっては問題とはならない、又は問題は標準的参考書
を参照して又は本開示及び本書に引用されている参考文
献から単純な実験（過度の実験を含んでいない）によっ
て容易に回避することができる。

【００６８】本発明の免疫学的に有効な組成物類は、一
般に容認された方法に従って成分を混合することによっ
て調製される。例えば選択された成分は、ブレンダー、
又は濃縮混合物を生じさせるためのその他の標準的装置
内で単純に混合され、その後水若しくは増粘剤及びもし
かするとｐＨを調節するために緩衝剤又は張度を調節す
るために追加の溶質の添加によって最終濃度及び粘度に
調製することができる。一般にｐＨは約３〜７．５であ
ってよい。組成物類は、特定の患者又は動物の年齢、性
別、体重及び健康状態のような要素を考慮に入れて医学
及び獣医学の分野における当業者に周知の用量及び技術
で、さらに投与のために使用される組成物形（例、固体
対液体）によって投与することができる。ヒト又はその
他の動物に投与するための用量は、過度の実験を行わず
に本開示、本書に引用されている参考文献及び下記の実
施例（例、マウスを含む実施例から）から当業者であれ
ば決定することができる。

【００６９】初回投与及びブースター投与又は連続的投
与のために適切なレジメンは変動性であり、初回投与後
に引き続きの投与を含んでいることがある。しかしそれ
にも関わらず、本開示、本書に引用されている参考文献
及び下記の実施例から当業者であれば突きとめることが
できる。

【００７０】下記の実施例は例示のために提供されてお
り、本発明を限定すると見なすべきではない。

【００７１】（実施例）実施例１−ＰｓｐＡ間の配列相同性の確認 ＰｓｐＡ菌株には多様性があると報告されてはいるが、
ワクチン開発のために有用である可能性のある保存領域
が維持されているかどうかに関して、ＰｓｐＡ分子のヌ
クレオチド及びアミノ酸配列を評価した。ＰｓｐＡの多
種類の菌株から入手したヌクレオチド及びアミノ酸配列
の比較により、αヘリックスの一次配列は２つの相対保
存の領域及び菌株間で広汎に多様性である領域を有して
いることが明らかになった。多様性である２つの領域
は、図１及び２に示されているように、αヘリックスの
最初のＮ末端６０アミノ酸とαヘリックスの最後のＣ末
端１００アミノ酸とから構成されている。

【００７２】図１は、相互に相同性領域について比較さ
れた、どちらも同一ファミリー又はクレードのメンバー
であるＲｘ１及びＥＦ１０１９７からのｐｓｐＡ遺伝子
のαヘリックス及びプロリン領域のヌクレオチド配列を
示している。この比較は、３０ヌクレオチドのウィンド
ウ、７０％の最小相同率、６のＨａｓｈ値、及び１のジ
ャンプ値を用いて、Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒバージョン
５．０２ソフトウエア内のＰｕｓｔｅｌｌ ＤＮＡマト
リックス解析を使用して実施した。グラフ上の点又は線
は、基準を越えて一致する２つの遺伝子間の相同領域を
示している。本試験の成績は、αヘリックス領域のＮ末
端及びＣ末端をコードする遺伝子部分並びにプロリン領
域における相同性を証明している。

【００７３】図２は、相互に相同領域について比較され
た、どちらも同一ファミリー又はクレードのメンバーで
あるＲｘ１及びＥＦ１０１９７からのＰｓｐＡタンパク
質のαヘリックス及びプロリン領域のアミノ酸配列を示
している。この比較は、Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒバージョ
ン５．０２ソフトウエア内のＰｕｓｔｅｌｌタンパク質
マトリックス解析を使用して実施した。この解析では８
アミノ酸のウインドー、７０％の最小相同率、２のＨａ
ｓｈ値、及びｐａｍ２５０スコアリングマトリックスを
使用した。グラフ上の点又は線は２種のタンパク質間の
相同領域を示している。本試験の成績は、αヘリックス
領域のＮ末端及びＣ末端並びにプロリン領域における相
同性を証明している。

【００７４】αヘリックス領域のＣ末端の保存された領
域は、２種の菌株間で保存された防御エピトープ類を含
んでいることが証明された領域と相関していた。

【００７５】αヘリックス領域のＣ末端領域がワクチン
開発のために決定的に重要であることを論証するため
に、この領域におけるアミノ酸配列の異質性及びファミ
リー構造について試験した。２６種のＰｓｐＡ菌株間で
この領域におけるアミノ酸配列を比較することによっ
て、ＰｓｐＡ菌株は７５％以上の相同性を有する６つの
クレードに分類できることが明らかになった。これらの
クレードはさらに５０％以上の相同性を有する４つのフ
ァミリーに分類することができた。これらのデータは表
１〜６、及び図３〜８に示されている。

【００７６】

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】 これらのファミリーの免疫学的関連性は、数種の相違す
るＰｓｐＡに対して作製された多数のモノクローナル抗
体を用いたＳ．Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌株の血清学的分
析によって証明された。表７から明らかなように、モノ
クローナル抗体のクレード３、４、５及び６における菌
株との反応パターンは、概して配列によって定義された
クレードと相関していた。

【００７７】

【表７】

【００７８】実施例２−種々の菌株のＰｓｐＡ抗原によ
る抗Ｒｘ１ポリクローナル抗体類の競合阻害 ＰＡＲｘ１抗原を塗布したＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)セ
ンサリー・チップを使用して、ＰＡＲｘ１抗原への抗Ｐ
ＡＲｘ１結合の競合阻害について分析した。試験成績は
図９に示されている。ウサギポリクローナル抗ＰＡＲｘ
１（１，２００ｎｇ／ｍＬ）を単独又は濃度を上昇させ
ながらＰＡＲｘ１抗原（図９において＋で示されてい
る）若しくはＰＡ３１４ ＰｓｐＡ抗原（図９において
□で示されている）の存在下のどちらかで反応させた。
ＰＡ３１４ ＰｓｐＡ抗原はＲｘ１のアミノ酸９６〜３
１４を含有している。ＢＩＡ ｃｏｒｅ(登録商標)器具
上での質量輸送測定値を使用して、センサリー・チップ
表面上のＰＡＲｘ１抗原に結合できた阻害されなかった
抗体の濃度を測定した。これらの測定の標準物質とし
て、マウスモノクローナルＩｇＧ抗ＰｓｐＡ抗体である
Ｐ８１−１２２Ｆ１０．Ａ１１を使用した。

【００７９】これらの実験の成績は、Ｎ末端保存領域が
ＰｓｐＡ反応のための抗原性エピトープを含有していな
いこと、及びαヘリックスのＣ末端での保存領域が広汎
に有効なＰｓｐＡワクチンの開発にとって決定的に重要
である交差反応性及び防御エピトープを含有しているこ
とを示した。さらに、図９は、上記の競合検定において
使用したＰＡ３１４ ＰｓｐＡ抗原がＲｘ１の９６〜３
１４アミノ酸を含有しているので、αヘリックスの最初
のＮ末端領域６０アミノ酸には重要性が欠如しているこ
とを証明している。

【００８０】図１０は、ＰＡＲｘ１及びＰＡＥＦ５６６
８抗原の阻害を示している。ＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)
センサリー・チップにＰＡＲｘ１抗原を塗布し、ウサギ
ポリクローナル抗ＰＡＲｘ１（７ｍＭ）を単独又は濃度
を上昇させながらＰＡＲｘ１抗原（図１０においては□
で示されている）若しくはＰＡＥＦ５６６８抗原（図１
０においてはダイヤモンド形で示されている）の存在下
のどちらかで反応させた。これらの競合抗原の濃度（ｍ
Ｍ）はＸ軸上のｌｏｇスケール上に示されており、ＢＩ
Ａｃｏｒｅ(登録商標)器具上での質量輸送測定値を使用
して、センサリー・チップセンサリー・チップ表面上の
ＰＡＲｘ１抗原に結合できた阻害されなかった抗体の濃
度（ｍＭ）を測定したが、これは図１０のＹ軸上に示さ
れている。

【００８１】予想通りに、活性の非競合的に阻害された
ポリクローナル抗ＰＡＲｘ１の濃度は競合阻害剤の濃度
が増加するにつれて低下した。ＰＡＲｘ１抗原は十分に
抗原過剰な濃度でポリクローナル抗体を完全に阻害し
た。ＰＡＥＦ５６６８抗原は最高阻害率８．４％を有し
ていた。この検定において活性ポリクローナル抗体の濃
度を計算するための標準物質として、マウスモノクロー
ナルＩｇＧ抗ＰｓｐＡ抗体であるＰ８１−１２２Ｆ１
０．Ａ１１を使用した。

【００８２】ＰＡＲｘ１及びＰＡＧ６３８０抗原による
阻害試験の成績は、図１１に示されている。ＢＩＡｃｏ
ｒｅ（登録商標）センサリー・チップにＰＡＲｘ１抗原
を塗布し、ウサギポリクローナル抗ＰＡＲｘ１（７ｍ
Ｍ）を単独又は濃度を上昇させながらＰＡＲｘ１抗原
（図１１において□で示されている）若しくはＰＡＢＧ
６３８０抗原（図１１においてＸで示されている）の存
在下のどちらかで反応させた。これらの競合抗原の濃度
（ｍＭ）はＸ軸上のｌｏｇスケール上に示されており、
ＢＩＡｃｏｒｅ(登録商標)器具上での質量輸送測定値を
使用して、センサリー・チップセンサリー・チップ表面
上のＰＡＲｘ１抗原に結合できた阻害されなかった抗体
の濃度（ｍＭ）を測定したが、これは図１１のＹ軸上に
示されている。

【００８３】予想通りに、活性の非競合的に阻害された
ポリクローナル抗ＰＡＲｘ１の濃度は競合的阻害剤の濃
度が増加するにつれて低下した。ＰＡＲｘ１抗原は十分
に抗原過剰な濃度でポリクローナル抗体を完全に阻害し
た。ＰＡＢＧ６３８０抗原はポリクローナル抗体反応を
有意には阻害しなかった。この検定において活性ポリク
ローナル抗体の濃度を計算するための標準物質として、
マウスモノクローナルＩｇＧ抗ＰｓｐＡ抗体であるＰ８
１−１２２Ｆ１０．Ａ１１を使用した。

【００８４】さらに、表８は選択的クレードの代表的菌
株によるウサギポリクローナル抗Ｒｘ１抗体の阻害試験
の成績を示している。表に示されているように、抗体類
はクレード２を効果的に阻害するが、抗体自体の特異性
が相違するクレードにおけるＰｓｐＡの阻害はあまり効
果的ではない。

【００８５】

【表８】

【００８６】実施例３−相違するクレードからのＰｓｐ
Ａ抗原類によるクレード３特異的抗ＰｓｐＡポリクロー
ナル抗体類の競合阻害 ６クレードの代表から組換え的に発現させたＰｓｐＡ抗
原類に対してウサギポリクローナル抗血清を産生させ
た。クレード１の代表としてＢＧ９７３９を選択し、Ｒ
ｘ１はクレード２の代表、ＥＦ３２９６はクレード３の
代表、ＥＦ５６６８はクレード４の代表、ＡＴＣＣ６３
０３はクレード５の代表、そしてＢＧ６３８０はクレー
ド６の代表であった。

【００８７】各クレードからの組換えＰｓｐＡ抗原を個
々のＢＩＡｃｏｒｅセンサリーチップへ各々共有的に結
合させた。次に、クレード特異的ポリクローナル抗Ｐｓ
ｐＡ抗体を各組換えＰｓｐＡ抗原の単独又は濃度を上昇
させながらの存在下のどちらかで各チップと反応させ
た。チップ上でＰｓｐＡへ結合できた抗ＰｓｐＡ抗体の
活性濃度は質量輸送測定を用いて決定した。可溶性Ｐｓ
ｐＡの添加によって阻害されなかった反応及び阻害され
た反応における活性抗体の濃度を比較することによっ
て、菌株を決定した。これらの試験成績は表９に推定交
差反応性として例示されている。

【００８８】交差反応性分析は、ＢＩＡｃｏｒｅチップ
を被覆するための組換えＰｓｐＡ抗原類及び代表的クレ
ードからの天然ＰｓｐＡ抗原類を用いて阻害された上記
のクレード特異的ポリクローナル抗血清を使用しても実
施した。推定交差反応性の成績は表１０に示されてお
り、表９に示された成績を用いて入手された成績と良好
に匹敵している。各々の場合に、同一クレードの代表は
最大の交差反応性を示している。同一ファミリー内の相
違するクレードの代表は中等度の交差反応性を示してお
り、相違するファミリーの代表は最小の交差反応性を示
している。

【００８９】

【表９】

【００９０】実施例４−ＥＬＩＳＡによる肺炎連鎖球菌
菌株のセロタイプ解析 ６クレードの代表からの組換え的に発現したＰｓｐＡ抗
原に対してウサギポリクローナル抗血清を産生させた。
クレード１の代表としてＢＧ９７３９を選択し、Ｒｘ１
はクレード２の代表、ＥＦ３２９６はクレード３の代
表、ＥＦ５６６８はクレード４の代表、ＡＴＣＣ６３０
３はクレード５の代表、そしてＢＧ６３８０はクレード
６の代表であった。

【００９１】各抗血清は最初に大まかに等価の特異活性
を含有するように標準化した。その後、各クレードの代
表のセタバロン溶解液を塗布したＥＬＩＳＡプレートと
抗血清の順次１．５倍の希釈液を反応させた。陰性対照
として、肺炎連鎖球菌菌株のｐｓｐＡ遺伝子を「ノック
アウト」した、つまり組換え事象によって不活性とし、
このノックアウト菌株のセタバロン溶解液をＥＬＩＳＡ
プレートウエルに塗布するために使用した。次に、各ウ
エルをヒツジ抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ結
合体（Ｋｉｅｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍａｒｙｌａｎｄ）と
一緒にインキュベートし、洗浄し、その後リン酸ｐ−ニ
トロフェニル（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，
Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を添加した。比色反応の結果は４
０５ｎｍで読み取った。

【００９２】抗血清の混合液を調製し、等特異活性の抗
Ｒｘ１、ＥＦ３２９６及びＥＦ５６６８を１カクテルに
結合し、第２カクテルに抗Ｒｘ１，ＥＦ３２９６，ＥＦ
５６６８及びＢＧ６３８０を結合した。これらのカクテ
ルはクレード２、３及び４又は２、３、４及び６と反応
する抗体を含んでおり、広汎な免疫を授けるための様々
なワクチン組み合わせの能力に近づけるために使用し
た。これらの抗体の混合液は試験した各肺炎連鎖球菌菌
株と良好に反応し、本発明のクレード定義に基づくワク
チンの組み合わせが広範囲の肺炎連鎖球菌分離菌に対し
て免疫を授けるはずであることを証明した。

【００９３】個々のクレードからのポリクローナル抗体
類は、他のファミリーの代表との交差反応性をほとんど
示さなかった。クレード１と２との菌株間で、さらにク
レード４と５との菌株間では有意な交差反応性が観察さ
れた。この観察所見はこれらのクレードを各々ファミリ
ー１及び３へ分類することと一致している。各菌株は、
セロタイプ化してポリクローナル抗ＰｓｐＡとの反応性
に基づいて定義されたＰｓｐＡのファミリー又はクレー
ド内へ配置することができた。

【００９４】米国及びヨーロッパからの総計４３７種の
肺炎連鎖球菌菌株をポリクローナル抗ＰＳＡ ＥＬＩＳ
Ａ法によって評価した。この解析結果は表１１に示され
ている。

【００９５】試験した全菌株のおよそ３６％はクレード
２、２２％はクレード３及び２３％はクレード４である
とセロタイプ化された。これら３つのクレードだけから
のＰｓｐＡから構成されるワクチンは８０％を越える肺
炎連鎖球菌をカバーするであろう。これらの菌株の％は
６クレード中の１つにセロタイプ化できたので、同様に
肺炎連鎖球菌によって誘発される感染症に対する広汎な
免疫を授与するクレード特異的ＰｓｐＡに基づいた限定
数のワクチン成分を入手できる可能性を証明している。
実際に、ファミリー内の高度の交差反応性に基づくと、
各ファミリーの単一代表メンバーから構成されたワクチ
ン組成物はそうした免疫を授与するはずである。

【００９６】本発明の一定の好ましい実施態様を詳細に
記載してあるが、本発明の精神又は範囲から逸脱するこ
となくそれらの数多くの明白な変形が可能であるので、
添付のクレームによって定義された本発明は上記の説明
において述べた特定の詳細によって限定されないと理解
されるべきである。

【００９７】（引用文献） １．Center of Disease Control. 19484. 米国疾患管理
センター「肺炎球菌多糖類ワクチンの使用」。MMWR 33:
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8.６種のモノクローナル抗体類への反応性に基づく肺炎
連鎖球菌のタンパク質セロタイプ化。Microb. Pathog.
5:159-67.

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、Ｒｘ１及びＥＦ１０１９７菌株のＰｓ
ｐＡ遺伝子間の相同性についてのＰｕｓｔｅｌｌ ＤＮ
Ａマトリックス解析を示している。

【図２】図２は、Ｒｘ１及びＥＦ１０１９７菌株のＰｓ
ｐＡ遺伝子間の相同性についてのＰｕｓｔｅｌｌタンパ
ク質マトリックス解析を示している。

【図３】図３は、ＰｓｐＡクレード１共通の配列一致を
示しており、表３に示されたデータと対応している。

【図４】図４は、ＰｓｐＡクレード２共通の配列一致を
示しており、表４に示されたデータと対応している。

【図５】図５は、ＰｓｐＡクレード３共通の配列一致を
示しており、表５に示されたデータと対応している。

【図６】図６は、ＰｓｐＡクレード４共通の配列一致を
示しており、表６に示されたデータと対応している。

【図７】図７は、クレード５の代表的菌株である菌株Ａ
ＴＣＣ６３０３からのＰｓｐＡの配列を示している。

【図８】図８は、クレード６の代表的菌株である菌株Ｂ
Ｇ６３８０からのＰｓｐＡの配列を示している。

【図９】図９は、ＰＡ３１４によるウサギポリクローナ
ル抗Ｒｘ１の競合阻害を示しており、組換えＲｘ１はア
ミノ酸９６〜３１４を含有している。

【図１０】図１０は、ＰＡＲｘ１及びＰＡＥＦ５６６８
抗原によるウサギポリクローナル抗Ｒｘ１抗体類の阻害
を示している。

【図１１】図１１は、ＰＡＲｘ１及びＰＡＢＧ６３８０
抗原によるウサギポリクローナル抗Ｒｘ１抗体類の阻害
を示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート エス． ベッカー アメリカ合衆国 18332 ペンシルヴェニ ア州 ヘンリーヴィル シルヴァン カス ケイドス ボックス 545エイ アールア ール ナンバー１ (72)発明者 デイヴィッド イー． ブリルズ アメリカ合衆国 35222 アラバマ州 バ ーミンガム リンウッド ロード 760 (72)発明者 スーザン ホリングスヘッド アメリカ合衆国 35205 アラバマ州 バ ーミンガム サーティセカンド ストリー ト サウス 1008 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA02 HA20 4C085 AA03 BA14 CC07

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 相違するファミリーから選択された少な
   くとも２種のＰｓｐＡから成るワクチン組成物。
2. 【請求項２】 前記ファミリーがさらに１つ以上のクレ
   ードから成るものである、請求項１に記載のワクチン組
   成物。
3. 【請求項３】 さらに前記組成物が、１つ以上のクレー
   ドからの菌株から入手された、最低で４種、最高で６種
   のＰｓｐＡから成る、請求項２に記載のワクチン組成
   物。
4. 【請求項４】 さらに前記組成物が、菌株Ｒｘ１からの
   ＰｓｐＡから成る、請求項１に記載のワクチン組成物。
5. 【請求項５】 さらに前記組成物が、菌株Ｒｘ１からの
   ＰｓｐＡから成る、請求項２に記載のワクチン組成物。
6. 【請求項６】 さらに前記組成物が、菌株Ｒｘ１からの
   ＰｓｐＡから成る、請求項３に記載のワクチン組成物。
7. 【請求項７】 さらに前記組成物が、菌株Ｒｘ１からの
   ＰｓｐＡから成る、請求項４に記載のワクチン組成物。
8. 【請求項８】 さらに前記組成物が、少なくとも１つの
   ファミリーから選択された少なくとも２種のＰｓｐＡか
   ら成る、請求項４に記載のワクチン組成物。
9. 【請求項９】 前記ファミリーがさらに１つ以上のクレ
   ードから成る、請求項８に記載のワクチン組成物。
10. 【請求項１０】 さらに前記組成物が、１つ以上のクレ
    ードから入手された最低で３種、最高で６種のＰｓｐＡ
    から成る、請求項９に記載のワクチン組成物。
11. 【請求項１１】 さらに前記組成物が、菌株Ｒｘ１から
    のＰｓｐＡから成る、請求項８に記載のワクチン組成
    物。
12. 【請求項１２】 さらに前記組成物が、菌株Ｒｘ１から
    のＰｓｐＡから成る、請求項９に記載のワクチン組成
    物。
13. 【請求項１３】 さらに前記組成物が、菌株Ｒｘ１から
    のＰｓｐＡから成る、請求項１０に記載のワクチン組成
    物。