JP2019196397A - アルツハイマー型認知症の予防用及び免疫療法用ペプチドワクチン - Google Patents

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Abstract

【課題】アルツハイマー型認知症の予防用及び免疫療法用のペプチド系ワクチン及び製剤の提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列及びそれらの任意の組合せからなる群から選ばれるβアミロイド（Ａβ）ペプチド免疫原構築物のＡβ部分のＮ末端フラグメントに対する抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。該個別Ａβペプチド免疫原構築物はＢ細胞（Ｂ）エピトープとしてＡβペプチドのＮ末端を有し、該Ｂ細胞（Ｂ）エピトープは、アルツハイマー病の危険性があるか又はアルツハイマー病である患者に陽性免疫反応をもたらす、ＡβペプチドのＮ末端に対して非常に特異的な抗体を発生するのを刺激する作用を共に有する病原体タンパク質由来の異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープにスペーサ残基を介して結合する。【選択図】なし

Description

本願は、2013年3月15日出願の米国特許出願番号13/843,883（該内容はすべて本願に参照として含まれる）の優先権を主張する。
本開示は、アルツハイマー型認知症の予防用及び免疫療法用のペプチド系ワクチン及び製剤に関する。
アルツハイマー病（ＡＤ）は、認知症の最も一般的な形態であって、認知能力の喪失、重度の行動異常及び死によって特徴付けられる慢性の神経変性疾患である。これは、６５歳以上人口のおよそ１０％、８５歳以上人口のおよそ４０％に影響を及ぼす。心疾患、癌及び卒中等の死の他の主要原因とは異なり、医療技術の進歩により、多くの人が認知症の危険性がある年齢に達することが可能となるので、アルツハイマー病による死亡率は今後２０〜３０年で劇的に高まるだろう。米国において、今日、全ての医療費の７〜８％が認知症に関連している。現在、ＡＤと共に生きている患者は、米国に２５０〜４００万人、全世界に１７００〜２５００万人、存在する。この重篤な疾患のための決定的な処置又は治療法は存在しない。
アロイス・アルツハイマーによって１９０７年に最初に定義されたように、２種の微小な沈着物、即ち、神経原線維濃縮体及び老人性アミロイドプラークが疾患の病理学的特徴である。アルツハイマー病の確定診断には、従来、生検又は死後の病理組織診断のいずれかが必要とされてきた。最近の陽電子放出同位体を有するアミロイドプラーク標識リガンドの導入と、認知力検査及び脊髄液中の特定の分子の測定とを組み合わせることにより、現在、この疾患のより確定的な診断が病理組織診断を行わずとも可能になっている。
βアミロイド（Ａβ）ペプチド−老人性アミロイドプラークの主要成分−がＡＤにおいて重要な役割を果たしていることを示唆する多数の証拠が蓄積されてきた。βアミロイド（Ａβ）ペプチドの最新の概説（２０１３年２月１３日）はウィキペディアから入手できる（http://en.wikipedia.org/wiki/Beta_amyloid#cite_note-wales2010-41、このリンクは参照によって本明細書に含まれる）。ＡＤの疾患改変療法の成功は、脳内のβアミロイドの沈着に影響を及ぼす製品を含む可能性が高い。Morgan, D.による最近の出版物（Immunotherapy for Alzheimer’s Disease(Morgan D.,J Int Med 2011;269:54-63））は本発明に関連し、これは本分野における概説として参照により含まれる。
誘発因子（アルツハイマー病にとって必要であるが、十分ではない）は、Ａβペプチドからなるアミロイド凝集体の蓄積である。家族型のアルツハイマー病及びダウン症候群の症例（早発性アルツハイマーの病状が生じる）の遺伝学によれば、共通要素として、より長いＣ末端形状のＡβペプチド（４２アミノ酸長）を過剰産生している。このＡβ１−４２ペプチドは、βシート構造を形成し、オリゴマー及び原線維に凝集する傾向がある。これらのアミロイドの沈着物は、疾患の認知症状が始まる前に、脳内に１０年以上存在し得る。疾患の発病における第二段階は、高度にリン酸化された微小管結合タウタンパク質から神経細胞内での神経原線維濃縮体の形成である。他の神経変性疾患はアミロイド沈着物の不存在下でタウ病理によっても形成され得るが、臨床症状及び脳内の局所性の病理部位の両方でアルツハイマー病とは異なる。タウ遺伝子導入マウスモデルにおいて、タウ沈着物は、アミロイドの頭蓋内注射又はＡβ沈着物産生マウスを育てることによって沈着させることができる。また、抗Ａβ免疫療法によってアミロイド沈着を妨げると、複数の導入遺伝子を発現するマウスにおいてタウ病理の進行を減少させることができる。タウ病理は、精神機能障害のより近因であることと一致して、アミロイド病理よりも認知状態とのより良い相関があると思われる。不確かな機構によって、これらの病理は、シナプス機能の減少、シナプスの減少及び最終的には著しい脳の萎縮につながるニューロンの減少をもたらす。
関連する機構的な段階に関する複数の仮説が存在する。アミロイド及び／又はタウの中間的なサイズの凝集体（オリゴマーと呼ばれる）がより直接的な毒性の原因であると考えられる。疾患の初期段階である「軽度認知障害」（ＭＣＩ）段階においてさえ、プラーク及び濃縮体病理の著しい蓄積、並びにニューロンの減少が見られる。これらの観察から、心疾患で行われているのと同様に、できる限り初期段階で疾患を処置することがアルツハイマー病の管理に必須であろうことが示唆される。
１９９９年、ワクチンアプローチによって、アミロイド前駆体タンパク質を過剰産生する遺伝子導入マウスにおいてアミロイド沈着物が減少することが見いだされた。その後、Ａβを標的とするワクチン又は受動免疫療法が、これらのマウスを記憶障害から救うことが見いだされた。免疫系によって活発に産生されるか、又は受動的に投与される、Ａβ特異的抗体は、Ａβアミロイドーシスに対する異なる遺伝子導入マウスモデルにおけるプラーク負荷を一貫して減少させる。動物モデルにおけるワクチン投与の成功、及びアルツハイマー病の疾患改変療法の任意の代替法が存在しないことを前提として、ＡＤ患者の免疫系を刺激してＡβ抗体を産生するための最初の臨床的試みは、ＡＮ１７９２と呼ばれるワクチンで惹起することであった。このワクチンは、Ｂ及びＴ細胞エピトープの両方を含む全長Ａβ１−４２ペプチドからなり、原線維に凝集した。第Ｉ相安全性試験において、１以上の用量のワクチンで約６０人の患者を処置した。初期観察の１つは、標的のＡβペプチド抗原に対する検出可能な抗体価を生じないワクチン接種された多くの患者での、可変性の抗体反応であった。多くの患者において、免疫応答がないため、ワクチン製剤を変更し、第ＩＩ相安全性及び免疫原性の試験において、アジュバントとしてＱＳ−２１を含有させ、ＡＮ１７９２ワクチン製剤の免疫原性を増強する試みを行った。目標は、複数回の接種を通じてプリセットした抗体価まで患者を免疫化することであった。しかしながら、中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症反応である無菌性の髄膜脳炎が少数の患者（〜６％）で発生したため、臨床試験の開始から短期間で免疫は中止された。ＣＮＳ炎症のこれらの症状を発症した２人の患者が死亡し、その後の検死で髄膜の炎症の明らかな徴候であるＣＮＳのＴ細胞浸潤が明らかになった。ＡＮ１７９２ワクチン製剤の有害な応答は、ワクチンによって引き起こされた自己免疫反応であったと結論が出された（Orgogozo JMら、Neurology 2003;61:46-54）。有効性の観点からは、ＭＲＩによる脳の収縮割合又は認知能力の差異は、ワクチンとそのプラセボワクチン接種との間で観察されなかった。
ＡＮ１７９２ワクチンの後退にもかかわらず、アルツハイマー病の免疫療法用のＡβペプチドに対する新規なワクチン戦略及びアジュバントの開発は、非常に強い創造性の分野になっている。ほとんどの場合、目標は、ＡＮ１７９２の症例で認められたような全長Ａβ１−４２ペプチドに対するワクチンを用いるヒトの試験で見いだされた有害事象が原因で、最小限のＴ細胞の関与（少なくともＡβに対して）で、Ｂ細胞の活性化及び抗体産生を発現させることであった。
現在、発明者及び彼女のチームによって管理されている本発明の製品とは別に、Ａβフラグメントを標的とする各種のワクチン設計及び製剤を使用する能動免疫の第Ｉ相／第ＩＩ相臨床試験が４件ある。これらの試験として、ジフテリアトキソイドタンパク質と複合化したＡβ１−７アミノ末端ペプチドフラグメントを免疫原として使用するＡＣＣ−００１（エラン・コーポレーション社（Elan Corporation Inc.）及びワイス社（Wyeth））；Ｑβウイルス様粒子と結合したＡβ１-５アミノ末端ペプチドフラグメントを免疫原として使用するＣＡＤ１０６（Immunodrug（商標）；サイトス・バイオテクノロジー社（Cytos Biotechnology AG）及びノバルティスファーマ社（Novartis Pharma AG））；ＩＳＣＯ−ＭＡＴＲＩＸと複合化したＡβアミノ末端ペプチドを免疫原として使用するＶ９５０（メルク社）；及び担体分子と複合化したＡβペプチド模倣薬を免疫原として使用するＧＳＫ／アフィリス（GSK/Affiris）；が挙げられる。更に、Tabira Tによる概説（Tohoku J Exp Med 2010;220:95-106）に記載されているようなＡβを標的とする他のワクチンアプローチがある。
ヒトの試験において、現在Ａβを標的とする全てのワクチン設計及び製剤は、上述したように、これらのワクチンを接種された患者の３０％から約７０〜８０％のみが標的のＡβペプチドに対する抗体を生じさせるという、可変性の抗体反応を伴う弱い免疫原性に悩まされており、より複雑な抗Ａβ抗体を産生するワクチンによる有効性の任意の更なる分析を行っている。ほとんどのワクチン設計は複雑で、非常に短いＡβペプチドフラグメントと巨大タンパク質又はウイルス粒子様担体との複合化を必要とし、それ故に、短い標的ペプチドよりもむしろ望まない担体に対してほとんどの抗体反応を向かわせ；複雑なワクチン設計は詳細な製造手順を指示し、それ故に、品質管理を難しくし、且つ費用対効果を悪くする。これらのワクチンは、使用されるアジュバント及び製剤の潜在的なＴｈ１活性化特性のため、それらの安全特性は不明確である。また、現時点で、これらのワクチンは、ワクチンを接種した患者の認知機能における改善のような任意の臨床的有効性を示していない。
先進国では、ＡＤは社会的に最も費用のかかる疾患の１つである。ＡＤを予防するか、その発症を遅らせるか、又はその進行を遅らせるための新たな治療法を見出さなければならない。ＡＤマウスにおける免疫学的処置の有望な知見にも関わらず、アルツハイマー型認知症の予防及び処置のためのＡβを標的とする安全で有効なヒトワクチンには課題が残されている。上述のように、前臨床又は臨床試験における現在のワクチン設計及び製剤に限界があるという観点から、アルツハイマー型認知症の予防及び処置のための、幅広い応答性の免疫療法を提供する、安全で有効なワクチン製剤の開発の緊急のニーズであって未だ満たされていないニーズが存在する。このようなワクチン製剤がアルツハイマー病理に対して成功したら、疾患を予防する標準的なアプローチになるだろう。
発明の概要
本開示は、アルツハイマー病の危険性があるか又はアルツハイマー病である患者に防御免疫応答を提供するＡβペプチドのＮ末端に対する高度に特異的な抗体の産生を刺激するために共に作用する、病原性タンパク質に由来する異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープとスペーサー残基を介して結合するＢ細胞（Ｂ）エピトープとしてＡβペプチドのＮ末端を有する、独自のＡβペプチド免疫原構築物を有する、独自のＡβペプチド免疫原構築物、これらＡβペプチド免疫原構築物及びその混合物を有するペプチド組成物、これらＡβペプチド免疫原構築物を有するワクチン製剤を含む医薬組成物に関する。
ある態様において、Ａβペプチド免疫原構築物は、老人斑中の全長Ａβ１−４２ペプチド（配列番号１）と交差反応性の高度に特異的な抗体の産生を刺激するために共に作用する、麻疹ウイルス融合（ＭＶＦ）タンパク質（配列番号３４）のような病原性タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープと結合するＡβ１−４２ペプチド（例えば、Ａβ１−１０、Ａβ１−１２、Ａβ１−１４）のアミノ末端から１０〜１４アミノ酸長の間にＢ細胞抗原部位を持つ複合Ａβペプチドを有することができる。他の態様において、Ａβペプチド免疫原構築物は、老人斑中の全長Ａβ１−４２ペプチドと交差反応性の抗体を誘発する能力のある各種の病原性タンパク質（配列番号３３〜４７）に由来する異種Ｔｈエピトープと結合するＢ細胞抗原部位のＡβ１−１４ペプチドを持つ複合ペプチドを含む。Ｂ細胞抗原部位のＡβ１−１４ペプチドを増強するために使用される異種Ｔｈエピトープのうち、天然の病原体、ジフテリア毒素（配列番号３７）、熱帯熱マラリア原虫（配列番号３８）、コレラ毒素（配列番号４０）に由来するＴｈエピトープ、並びに麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ１〜５）及びＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ１〜３）に由来する理想的な人工Ｔｈエピトープの単一配列又は組み合わせ配列、例えば配列番号３４及び４１〜４７のいずれかの形態が、免疫原性のスクリーニング試験によって、このようなＢ細胞の抗原性の増強に特に有用であることが見いだされる。他の態様において、Ａβペプチド免疫原構築物と異なる病原体に由来する異種Ｔｈエピトープとの混合物を有するペプチド組成物を用いて、アルツハイマー型認知症の処置及び予防のためのワクチン免疫化でより高い割合のレスポンダーをもたらす患者の遺伝的背景の範囲を幅広くすることを可能にする。ある態様において、組み合わせの形態（配列番号４４及び４５）におけるＭＶＦ及びＨＢｓＡｇに由来する異種Ｔｈエピトープを有するＡβペプチド免疫原構築物（配列番号６２及び６３）を、ワクチン製剤用に、等モル比で混合し、多様な遺伝的背景を持つワクチン宿主人口の範囲を最大にすることができた。Ａβペプチド免疫原構築物における相乗的増強が本発明のペプチド組成物において観察され、抗体反応は、全長Ａβ１−４２に対する所望の交差反応性にほぼ（＞９０％）集中し、免疫原性の増強に使用される異種Ｔｈエピトープには、もしあったとしても、ほとんどなかった。これは、このようなペプチド抗原性を増強するために使用される従来のタンパク質又は他の生物学的担体とは対照的である。別の態様において、単一配列の形態（配列番号４６及び４７）のＭＶＦ及びＨＢｓＡｇに由来する異種Ｔｈエピトープを有する高精製Ａβペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）を、ワクチン製剤用に、必要に応じて等モル比で混合し、多様な遺伝的背景を持つワクチン宿主人口の範囲を最大にすることができた。
本開示は、アルツハイマー型認知症の処置及び予防のためのワクチン製剤を含む医薬組成物にも関する。ある態様において、安定化免疫刺激複合体を有する医薬組成物は、ＣｐＧオリゴマーをＡβペプチド免疫原構築物の混合物を含有するペプチド組成物と混合して静電会合（electrostatic association）によって形成され、老人斑中に存在する全長Ａβ１−４２との所望の交差反応性を目的とするＡβペプチド免疫原性を更に増強する。他の態様において、アジュバントとしてアラム（Alum）ゲル（アルハイドロゲル（Alhydrogel））又はリン酸アルミニウム（アジュホス（Adjuphos））を含む鉱物塩と接触してワクチン製剤懸濁液を形成する、Ａβペプチド免疫原構築物の混合物のペプチド組成物を有する医薬組成物は、ワクチン宿主への投与に使用された。更に他の態様において、ＣｐＧオリゴマーと安定化免疫刺激複合体を形成するＡβペプチド免疫原構築物の混合物のペプチド組成物を有する医薬組成物を、高い安全因子のアジュバントとしてのアラムゲル（アルハイドロゲル（Alhydrogel））又はリン酸アルミニウム（アジュホス（Adjuphos））を含む鉱物塩と任意に混合し、ワクチン宿主への投与のためのワクチン製剤懸濁液を形成する。
本開示は、アルツハイマー型認知症の処置及び予防のための方法も含む。開示する方法は医薬組成物を利用し、該組成物はＣｐＧオリゴマーと安定な免疫刺激複合体を任意に形成する本発明のＡβペプチド免疫原構築物を有するワクチン製剤懸濁液を含有し、さらに、アルツハイマー病の危険性があるか又はアルツハイマー病である患者に投与するためのアジュバントとしての鉱物塩が追加されてもよい。これらの態様において、Ａβペプチド免疫原構築物及びそれらに由来するワクチン製剤を有する医薬組成物は、全長Ａβ１−４２ペプチドに対する抗体を誘発することができ、インビトロで原線維の形成を阻害し、且つ凝集したＡβオリゴマーによってもたらされる、ＰＣ１２細胞株の細胞によって示されるような、神経細胞に対する細胞毒性をインビトロで低減できる。ある態様において、Ａβペプチド免疫原構築物に由来するワクチン製剤を接種した動物又は患者は、全長Ａβ１−４２ペプチドに対する抗体を顕著に産生し、ワクチン宿主の血漿及び血清中のＡβ１−４０レベルの上昇に示される、中枢神経系から末梢への毒性のあるＡβペプチドを引き込むことが見出された。
本発明の別の面において、驚くべきことに、Ａβペプチド免疫原構築物を有するワクチン製剤が、アルツハイマー型認知症を患う温血動物、特にヒトの筋肉内に有利に適用できることが見いだされた。本発明の更に別の面において、２つのＡβペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）の筋肉内投与用の剤形を提供する。筋肉内注射用の好ましい剤形は、３０μｇ〜１０００μｇ／０．５ｍＬ、好ましくは１００μｇ〜４００μｇ／０．５ｍＬ、より好ましくは３００μｇ／０．５ｍＬのＣｐＧオリゴマーと複合化したペプチド免疫原構築物と、アジュバントとして０．５ｍＬの鉱物塩を追加して含有するワクチン製剤である。剤形は２年を超えて安定で、使用直前まで２〜８℃で保管できる。剤形は、好ましくは、温血動物に、特に腕に、注射器を用いる筋肉内注射によって投与される。剤形を温めるために、剤形は、周囲温度に、約１５〜４５分間、例えば３０分間、維持することができる。好ましくは、薬剤物質を吸い上げる前に、潜在的な半可視化（subvisual）粒子の分散のためにバイアルを穏やかに数回反転する。
本発明の別の面において、驚くべきことに、Ａβペプチド免疫原構築物を有するワクチン製剤が、アルツハイマー型認知症を患う温血動物、特にアカゲザル（rhesus macaque）及びヒトの筋肉内に有利に適用でき、微細エピトープマッピング研究で示されるように、Ａβ１−４２ペプチドオリゴマー、凝集体又は老人斑の外側部分に露出するアミノ酸「アスパラギン酸（Ｄ）」を有するＡβ１−１０ペプチドに代表されるＡβペプチドのＮ末端に主に対する高度に特異的な抗体を誘発することが見いだされた。本発明の更に別の面において、驚くべきことに、Ａβペプチド免疫原構築物を有するワクチン製剤が、アルツハイマー型認知症を患う温血動物、特にアカゲザル及びヒトの筋肉内に有利に適用でき、このようなワクチン製剤を接種された全ての動物及び全ての患者において、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端に主に対する高度に特異的な抗体を誘発するため、ワクチン開発の歴史において非常に珍しい１００％の抗体反応率を達成することが見出された。本発明の更に別の面において、驚くべきことに、本発明のＡβペプチド免疫原構築物を有するワクチン製剤が、６０歳以上の臨床的に軽度アルツハイマー病の範疇の患者の筋肉内に有利に適用でき、アルツハイマー病患者の免疫療法が最初に検討されてから前例のない認知スコア（ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ、ＡＤＣＳ−ＣＧＩＣ、ＭＭＳＥ）の著しい改善を示すことが見いだされた。
本発明の更に別の面において、本発明は、ヒト患者のアルツハイマー型認知症の予防及び処置の方法に関し、該方法は、３０μｇ〜７５０μｇ、好ましくは１００μｇ〜４００μｇ、より好ましくは約３００μｇを、それを必要とするヒト患者に、初期免疫後０、４及び８週の３回の注射による初回刺激後、全長Ａβペプチドに対する患者の抗体反応に応じて、１２週毎に約１回、好ましくは２６週毎に約１回、特に５２週毎に約１回投与することを有する。
上記疾患の処置におけるワクチン製剤及びＡβペプチド免疫原構築物の有用性は、適切な臨床研究、例えば実施例に記載されたもの、例えば、９カ月を超える期間にわたって各回３００μｇ／０．５ｍＬ／用量のワクチン製剤を、０、４及び１２週に合計３用量を投与すること、において更に確認できる。抗体価に従って、３カ月毎、６カ月毎又は１２カ月毎に１回、フォローアップ免疫が可能である。
適切な臨床研究は、アルツハイマー病の危険性があるか又はアルツハイマー病の症状を有する患者に対しての、オープンラベル試験、又は、特に無作為化、二重盲検、プラセボコントロールの並行試験である。
本開示は、Ａβペプチド免疫原構築物の低コストの製造方法及び品質管理方法を提供すると共に、アルツハイマー病の危険性があるか又はアルツハイマー病である動物及び患者を保護することができるデリバリシステムをも提供する。
さらなる面において、本発明は、本発明のＡβペプチド免疫原構築物のワクチン製剤を接種した患者によって誘発されるＡβ１−４２に対するヒトモノクローナル抗体を提供する。ヒト患者の血液から単離されたＢ細胞からヒトモノクローナル抗体を製造する効率的な方法は、Elisabetta Traggiaiら、Nature Medicine 10,871-875(2004)に記載されており、この文献は参照により含まれる。
参考文献
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図１は、本明細書開示の特定の態様によるワクチン製剤についての、発見から商業化（工業化）までの開発プロセスを示すフローチャートである。本開示は、このチャートにまとめた、ペプチド免疫原の設計、ペプチド組成物の設計、ワクチン製剤の設計、インビトロでの機能的抗原性の設計、インビボでの免疫原性及び有効性研究の設計、投与計画の設計、及び臨床プロトコルの設計を含む。合理的な設計に基づく高度に安全で有効なワクチンの商業化の最終的な成功をもたらす、嬉しい驚き及び嬉しくない驚きを伴う、各段階での詳細な評価は本明細書に更に記載する。 図２Ａは、溶出時間が２０分の高精製Ａβペプチド免疫原構築物（配列番号６５）のＨＰＬＣプロファイルを示す。 図２Ｂは、溶出時間が２１分の高精製Ａβペプチド免疫原構築物（配列番号６４）のＨＰＬＣプロファイルを示す。 図２Ｃは、Ａβペプチド免疫原構築物（配列番号６５）について、分子量が３８９２．２７４であると測定された質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）プロファイルであり、これは理論分子量が３８９２．５２であって、ＵＢＩ ＡＤワクチン（ＵＢ−３１１）製剤中の有効医薬成分として使用される分子の性質の高い精度を示す。 図２Ｄは、Ａβペプチド免疫原構築物（配列番号６４）について、分子量が４３７４．５６８であると測定された質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）プロファイルであり、これは理論分子量が４３７４．０７であって、ＵＢＩ ＡＤワクチン（ＵＢ−３１１）製剤中の有効医薬成分として使用される分子の性質の高い精度を示す。 図２Ｅは、溶出時間がそれぞれ２０分及び２１分の高精製Ａβペプチド免疫原構築物（配列番号６５及び６４）のＨＰＬＣプロファイルを示す。２つのＡβペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）を、２〜８℃で３年以上保管後のＵＢ−３１１ワクチン製剤調製物から抽出し、このように合理的に設計されたワクチン製剤の性質の高い精度を示す、以前に混合されたような等モル比での溶出時間を有する、予想ＨＰＬＣプロファイルを示す。 図３Ａは、広範な文献検索に基づく配列番号４６のＴｈペプチドのＨＬＡクラスＩＩ結合モチーフを示す。ワクチンを接種された患者の遺伝的背景の範囲を最大にして免疫応答を広げるために、２つのＡβペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）の組み合わせを使用するために決定された。 図３Ｂは、広範な文献検索に基づく配列番号４７のＴｈペプチドのＨＬＡクラスＩＩ結合モチーフを示す。ワクチンを接種された患者の遺伝的背景の範囲を最大にして免疫応答を広げるために、２つのＡβペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）の組み合わせを使用するために決定された。 図４は、一定量の鉱物塩と組み合わせて、Ａβペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）が様々な量で（０．５ｍＬ投与当たり０、１０、３０、１００〜３００μｇ）組み込まれたワクチン製剤に対する、モルモットの２６週にわたる抗体反応の反応速度論（Kinetics）を示す。 図５Ａは、Ａβペプチド免疫原構築物及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）間の、静電会合／中和による、安定なペプチド／ＣｐＧ免疫刺激複合体の調製のための概略図である。 図５Ｂは、図５Ａに続く、このような免疫刺激複合体及びアルミニウム系鉱物塩を含有する鉱物塩系のワクチン懸濁液の調製のための概略図である。 図６は、異なるアジュバント（アルハイドロゲル（Alhydrogel）／ＮａＣｌ＋ＣｐＧ ＯＤＮ；アジュホス（Adjuphos）／ＮａＣｌ＋ＣｐＧ ＯＤＮ；及びＮａＣｌ＋ＣｐＧ ＯＤＮ）の存在下、３００μｇ／０．５ｍＬ／用量のＡβペプチド免疫原構築物のワクチン製剤の、ヒヒにおける１０週にわたる抗体反応の反応速度論を示す。 ２〜８℃で２年保管後のＡβペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５、等モル比）を有するＵＢＩ ＡＤワクチンのモルモットにおける免疫原性試験。標準の抗原刺激及び追加免疫（３ｗｐｉ）プロトコル後、ＵＢＩ ＡＤワクチンは高い免疫原性及び安定性を維持していた。 図８Ａ：ヒトＡＤ脳の大脳の血管は、免疫前のヒヒ血清のＩｇＧ分画によって免疫組織化学的に染色されない。 図８Ｂ：ヒトＡＤ脳の大脳の血管は、Ａβペプチド免疫原構築物、等モル比の配列番号６２及び６３で免疫化したヒヒの過免疫の血清の精製ＩｇＧによる免疫組織化学染色を示す。 図８Ｃ：ヒトＡＤ脳の大脳の血管は、Ａβ１−１４ペプチドと共にプレインキュベートした図８Ｂに記載の過免疫の血清の精製ＩｇＧによって免疫組織化学的に染色されない。この図から、Ａβ１−１４ペプチドとのプレインキュベーションが過免疫の血清の精製ＩｇＧによる大脳の血管の全ての免疫反応性を吸収することがわかり、Ａβペプチド免疫原構築物（配列番号６２及び６３）を有するワクチン製剤のワクチン接種による過免疫の血清の高い特異性を示す。 図８Ｄ：ヒトＡＤ脳の大脳の血管は、非関連ペプチドと共にプレインキュベーションした図８Ｂに記載の過免疫の血清の精製ＩｇＧによる免疫組織化学染色を示す。 図８Ｅ：ヒトＡＤ脳のアミロイドプラークは、免疫前のヒヒ血清のＩｇＧ分画で免疫組織化学的に染色されない。 図８Ｆ：ヒトＡＤ脳のアミロイドプラークは、Ａβペプチド免疫原構築物、等モル比の配列番号６２及び６３で免疫化したヒヒの過免疫の血清の精製ＩｇＧによる免疫組織化学染色を示す。 図８Ｇ：ヒトＡＤ脳のアミロイドプラークは、Ａβ１−１４ペプチドと共にプレインキュベートした図８Ｂに記載の過免疫の血清の精製ＩｇＧによって免疫組織化学的に染色されない。この図から、Ａβ１−１４ペプチドとのプレインキュベーションが過免疫の血清の精製ＩｇＧによる大脳の血管の全ての免疫反応性を吸収することがわかり、Ａβペプチド免疫原構築物（配列番号６２及び６３）を有するワクチン製剤のワクチン接種による過免疫の血清の高い特異性を示す。 図８Ｈ：ヒトＡＤ脳のアミロイドプラークは、非関連ペプチドと共にプレインキュベーションした図８Ｂに記載の過免疫の血清の精製ＩｇＧによる免疫組織化学染色を示す。 成体ヒヒ（P.anubis）に対するＵＢＩ ＡＤワクチンの免疫原性試験。（パートＡ）鉱物塩（◆、▲、●、■）で製剤化した１投与当たり３００μｇのＵＢＩ ＡＤワクチンで０、３、６週（矢印）にそれぞれのヒヒを免疫化し、ＥＬＩＳＡによって抗Ａβ抗体価をアッセイした。初回免疫後、４頭のヒヒの３頭は抗Ａβ抗体価を生じたことに留意すべき。（パートＢ）鉱物塩で製剤化した３００μｇ（低用量、●、■）又は１２００μｇ（高用量、◆、▲）のＵＢＩ ＡＤワクチンで、７２週の休薬期間後、７８、８１、及び１０４週（矢印）にそれぞれのヒヒを免疫化し、抗Ａβ抗体価をアッセイした。単回のワクチンで追加免疫化後、４頭のヒヒ全てが強い抗Ａβ抗体反応を生じたことに留意すべき。２年の研究期間の最後において、４頭のヒヒ全て健康で活発であった。 ｈＡＰＰ７５１を過剰発現する若齢の遺伝子導入マウスの皮質の脳形態学に対する予防モードにおけるＵＢＩ ＡＤワクチンの効果。アジュバント単独で処置した遺伝子導入マウスから得た脳試料、ＵＢＩ ＡＤワクチンで処置したマウスのレスポンダー（Responder）から得た脳試料、及び無処置マウスから得た脳試料をアミロイドベータプラーク負荷について分析し、無処置及びアジュバント単独処置のものと比較して、ＵＢＩ ＡＤ処置レスポンダーマウスにおけるプラーク数の減少及び「ｕｍ２当たりのより低い平均プラークサイズ」を見出した。 ｈＡＰＰ７５１を過剰発現する若齢の遺伝子導入マウスの海馬の脳形態学に対する予防モードにおけるＵＢＩ ＡＤワクチンの効果。アジュバント単独で処置した遺伝子導入マウスから得た脳試料、ＵＢＩ ＡＤワクチンで処置したマウスのレスポンダーから得た脳試料、及び無処置マウスから得た脳試料をアミロイドベータプラーク負荷について分析し、無処置及びアジュバント単独処置のものと比較して、ＵＢＩ ＡＤ処置レスポンダーマウスにおけるプラーク数の減少及び「ｕｍ２当たりのより低い平均プラークサイズ」を見出した。。 ｈＡＰＰ７５１を過剰発現する若齢の遺伝子導入マウスの脳組織抽出物中のアミロイドβペプチド（Ａβ１−４２）の濃縮に対する予防モードにおけるＵＢＩ ＡＤワクチンの効果。小さなプロトフィブリルを脳組織の生化学的抽出物のトリトンＸ−１００分画から得た。ＵＢＩ ＡＤワクチンで処置した遺伝子導入レスポンダーマウスが、無処置の遺伝子導入マウスのトリトンＸ−１００分画から得た脳組織抽出物と比較して、はるかに少ないプロトフィブリルを有することを見出した。 ｈＡＰＰ７５１を過剰発現する若齢の遺伝子導入マウスの脳組織抽出物中のアミロイドβペプチド（Ａβ１−４２）の濃縮に対する予防モードにおけるＵＢＩ ＡＤワクチンの効果。大きなオリゴマー及びフィブリルを脳組織の生化学的抽出物のＳＤＳデタージェント分画から得た。ＵＢＩ ＡＤワクチンで処置した遺伝子導入レスポンダーマウスが、無処置の遺伝子導入マウスのＳＤＳデタージェント分画から得た脳組織抽出物と比較して、はるかに少ない大きなオリゴマー及びフィブリルを有することを見出した。 患者におけるＵＢＩ ＡＤワクチン処置後の平均抗Ａβ１−１４抗体価。２組のデータについて、１つは試験期間中の０〜２４／２６週（ｎ＝１７、実線）に得られたデータ、他方は０〜４８週のフォローアップ観察期間（ｎ＝１３、破線）を含んで得られたデータをプロットした。Ａβ１−１４のｌｏｇ１０抗体価は時間の経過と共に減少したが、全ての被験者が研究の最後（４８週）において陽性を維持していた。 ＵＢＩ ＡＤワクチンの試験を受けた、被験者（年齢が＞６０歳でベースラインＭＭＳＥスコアが＞２０）における０〜４８週の平均のＡＤＡＳ−Ｃｏｇ（黒丸）、ＭＭＳＥ（白丸）スコア及び抗Ａβ１−１４抗体価（黒のバー）。 年齢が６０歳を超えた軽度ＡＤに対するＵＢＩ ＡＤワクチンの１２カ月にわたる平均ＡＤＡＳ−Ｃｏｇスコアの変化（黒丸）、及びタレンフルルビルの試験における軽度ＡＤのプラセボ群のもの（黒三角）。６人の被験者（年齢が＞６０歳の軽度ＡＤ）は、タレンフルルビルの試験（Greenら、JAMA 2009; 302(23):257-2564）においてプラセボを接種され、同期間にわたってスコア上昇（３．８１の変化）を伴う不十分な応答を示した軽度ＡＤの被験者と比較して、０、４、１２週にＵＢＩ ＡＤワクチンで免疫化後、４、６、１２カ月の評価でスコアの減少を伴う改善を示した（−３．００の変化）。 第Ｉ相臨床試験におけるＵＢＩ ＡＤワクチンを接種した患者の免疫原性試験。軽度〜中程度のアルツハイマー病の１９人全てからの血清試料を、抗Ａβ抗体について、処置前（Ｖ１／Ｖ２；薄い灰色のバー）及び免疫化後１６週（Ｖ７；黒のバー）で評価した。Ａβ１−２８モノマーに対する抗体価（ｌｏｇ１０）を、処置前の来診、及び０、４及び１２週に与えられたＵＢＩ ＡＤワクチンの３回の最後のワクチン投与後４週である１６週に採取した血清試料を使用して、ＥＬＩＳＡ試験によって評価した。処置前の試料において殆ど又は全く抗体反応性を認めなかった（したがって、対応するデータのほとんどの比較においてバーは見えない）。全ての個人は、図１６に示すように、ＡβペプチドのＮ末端に局在するＡβ１−２８モノマーへの処置後に、高力価の抗Ａβ抗体を産生した。 第Ｉ相臨床試験におけるＵＢＩ ＡＤワクチンを接種した患者の免疫原性試験。軽度〜中程度のアルツハイマー病の１９人全てからの血清試料を、抗Ａβ抗体について、処置前（Ｖ１／Ｖ２；薄い灰色のバー）及び免疫化後１６週（Ｖ７；黒のバー）で評価した。Ａβ１−４２モノマーに対する抗体価（ｌｏｇ１０）を、処置前の来診、及び０、４及び１２週に与えられたＵＢＩ ＡＤワクチンの３回の最後のワクチン投与後４週である１６週に採取した血清試料を使用して、ＥＬＩＳＡ試験によって評価した。処置前の試料において殆ど又は全く抗体反応性を認めなかった（したがって、対応するデータのほとんどの比較においてバーは見えない）。全ての個人は、図１６に示すように、ＡβペプチドのＮ末端に局在するＡβ１−４２モノマーへの処置後に、高力価の抗Ａβ抗体を産生した。 第Ｉ相臨床試験におけるＵＢＩ ＡＤワクチンを接種した患者の免疫原性試験。軽度〜中程度のアルツハイマー病の１９人全てからの血清試料を、抗Ａβ抗体について、処置前（Ｖ１／Ｖ２；薄い灰色のバー）及び免疫化後１６週（Ｖ７；黒のバー）で評価した。Ａβ１−４２オリゴマーに対する抗体価（ｌｏｇ１０）を、処置前の来診、及び０、４及び１２週に与えられたＵＢＩ ＡＤワクチンの３回の最後のワクチン投与後４週である１６週に採取した血清試料を使用して、ＥＬＩＳＡ試験によって評価した。処置前の試料において殆ど又は全く抗体反応性を認めなかった（したがって、対応するデータのほとんどの比較においてバーは見えない）。全ての個人は、図１６に示すように、ＡβペプチドのＮ末端に局在するＡβ１−４２オリゴマーへの処置後に、高力価の抗Ａβ抗体を産生した。 免疫化したアルツハイマー病患者の血清によるＡβ１−４２のＮ末端での微細な特異性分析のためのエピトープマッピング。ＵＢＩ ＡＤワクチンで免疫化した患者から１６週に採取された血清試料中の抗体によって認識される主たるエピトープはＡβ１−１０ペプチドに特異的である。このグラフは、３用量のＵＢＩ ＡＤワクチンを接種し、Ａβ１−１４ペプチドに対する抗Ａβ抗体のｌｏｇ１０力価が２．１９８を生じた１人（Ｐ２１０）からの典型的な陽性のエピトープマッピング応答を表す。エピトープマッピング用に血清を１:５０に希釈した。ピークの高さは、異なる１０アミノ酸長Ａβペプチド（配列番号６、８〜３０）に対する被験者の試料の半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。アミノ末端Ａβ配列（配列番号６（Ａβ１−１０：ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ））に対して高度に特異的な免疫反応性に応じて、単一の主要ピークが観察される。
発明の詳細な説明
本開示は、アルツハイマー病の危険性があるか又はアルツハイマー病である患者に防御免疫応答を提供するＡβ１−４２ペプチドのＮ末端に対する特異的抗体の産生を刺激するために共に作用する、病原体タンパク質からの異種ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープとスペーサー残基を介して結合したＢ細胞（Ｂ）エピトープとしてＡβペプチド（Ａβ１−１０〜Ａβ１−１４）のＮ末端を持つ独自のＡβペプチド免疫原構築物を有する、独自のＡβペプチド免疫原構築物、これらＡβペプチド免疫原構築物及びその混合物を有するペプチド組成物、ワクチン製剤中にこれらペプチド組成物を有する医薬組成物に関する。
本開示はアルツハイマー病の処置及び予防のための方法も含む。開示の方法はアルツハイマー病の危険性があるか又はアルツハイマー病である患者に投与するための医薬組成物を利用し、該医薬組成物はワクチン製剤懸濁液を含み、該ワクチン製剤懸濁液は、ＣｐＧオリゴマーのような高度に負に帯電するオリゴヌクレオチドとの静電会合による安定な免疫刺激複合体を任意に形成するＡβペプチド免疫原構築物を有する。この複合体には、更に、アジュバントとして鉱物塩が追加されてもよい。本開示は、ワクチン製剤、具体的には、アルツハイマー病の危険性があるか又はアルツハイマー病である患者の予防及び処置のためのＡβペプチド免疫原構築物を有するワクチン製剤の投与のための、投与計画、投与形式及び剤形を利用する方法も含む。
本開示は、アルツハイマー病の危険性があるか又はアルツハイマー病である動物及び患者を保護することができるＡβペプチド免疫原構築物及びワクチン製剤の、低コストの製造方法及び品質管理方法も提供する。本発明は、安定化免疫刺激複合体及び該安定化免疫刺激複合体を調製する方法に関する。より具体的には、本発明は、インビボで免疫応答を改善するワクチンデリバリシステムに有用である、Ａβペプチド免疫原構築物と、ＣｐＧオリゴマーのような高度に負に帯電するオリゴヌクレオチドとを有する安定化合成免疫刺激複合体を提供する。これらの免疫刺激複合体は、放出制御用デポー剤として機能するように設計されたワクチン製剤の調製にも有用である。
さらなる面において、本発明は、本発明のＡβペプチド免疫原構築物のワクチン製剤を以前に接種した患者の血液から単離されたＢ細胞によって誘発されるＡβ１−４２に対するヒトモノクローナル抗体を提供する。
（ａ）アミロイドベータ（Ａβ）ペプチド
「ベータアミロイド」という表題のウィキペディア内の記事は、対象の最新の概説を提供する（http://en.wikipedia.org/wiki/Beta_amyloid）。この記事へのインターネットリンクは、参照として本明細書に提供される。
アミロイドベータ（Ａβ又はＡベータ）は、アミロイド前駆体タンパク質からプロセシングされたアミノ酸３６〜４３個のペプチドである。Ａβは、アルツハイマー病患者の脳内に見られる沈着物の主成分である。Ａβは、著しく非病理学的な活性を有する、非常に多機能のペプチドであるという証拠も見出されている。
Ａβは、機能が未確定の膜貫通型糖タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の連続的な切断後に形成される。ＡＰＰは、α−、β−及びγ−セクレターゼによってプロセシングされ得；Ａβタンパク質は、β及びγ−セクレターゼの連続的作用により産生する。ＡβペプチドのＣ末端を生成するγ−セクレターゼは、ＡＰＰの膜貫通領域内で切断し、長さが３６〜４３アミノ酸残基のアイソフォームを多数産生することができる。最も一般的なアイソフォームは、Ａβ１−４０（配列番号２）及びＡβ１−４２（配列番号１）であり；より長い形態が典型的には小胞体内で生じる切断によって生成する一方、より短い形態がトランスゴルジネットワーク内での切断によって生成する（Hartmann Tら，１９９７；Nature Medicine 3:1016-1020）。Ａβ１−４０型は２種類の中でより一般的であるが、Ａβ１−４２（配列番号１）はより原線維形成性であるため、病態に関連する。
ＡＰＰにおける常染色体優位の突然変異は、遺伝性の早期発症型アルツハイマー病（家族性ＡＤ又はＦＡＤ）の原因である。この型のＡＤは、全症例のわずか１０％を占めるに過ぎず、大部分のＡＤはこのような突然変異を付随しない。しかしながら、家族性アルツハイマー病は、代わりのタンパク分解プロセシングによって生じる可能性がある。全Ａβレベル、又はＡβ１−４０及びＡβ１−４２の両方の相対濃度（前者は脳血管プラーク中で、後者は老人斑中で、より濃縮されている）のいずれかの上昇は、家族性及び孤発性アルツハイマー病の両方の発病に関係している。
Ａβ１−４２は、そのより疎水性の性質のために、ペプチドの最もアミロイド形成性の型である。しかしながら、中心配列：ＫＬＶＦＦＡＥ（Ａβ１６−２２）（配列番号３１）は、それ自身がアミロイドを形成することが知られており、おそらく原線維のコアを形成する。
プラークがアルツハイマー病の病理の原因であるとする「アミロイド仮説」は、大半の研究者に受け入れられている。対立仮説は、プラークよりもむしろアミロイドオリゴマーが疾患の原因であるというものである。オリゴマーを発現するがプラークを発現しない遺伝子改変マウス（ＡＰＰＥ６９３Ｑ）は疾患を発症する。なお、オリゴマーをプラークに変換するよう更に改変したマウス（ＡＰＰＥ６９３Ｑ×ＰＳ１ΔＥ９）は、オリゴマーのみのマウスよりも損なわれない。ナノスケールの分子表面を可視化できる原子間力顕微鏡法を用いて、インビトロでＡβペプチドの凝集状態（オリゴマー）を測定することができる。
アミロイドベータを測定するための多くの異なる方法が存在する。それは免疫組織化学染色を用いて半定量的に測定でき、部位の決定も可能にする。Ａβは、主に、脳アミロイド血管症のような血管、又は老人斑中及び血管領域に存在するだろう。
Ａβを測定する高感度な方法の１つは、定量的酵素イムノアッセイ法（ｑＥＬＩＳＡ）によるもので、これはＡβを認識する抗体のペアを利用する。
画像化化合物、特にピッツバーグ化合物Ｂ（６−ＯＨ−ＢＴＡ−１、チオフラビン（thioflavin））及びフロルベタピル（florbetapir）Ｆ１８（１８Ｆ−ＡＶ−４５）は、インビトロ及びインビボでアミロイドベータと選択的に結合することができる。ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングと組み合わせるこの手法は、アルツハイマー病患者におけるプラーク沈着物の領域を画像化するために使用されている。
（ｂ）Ｂ細胞エピトープ：ＡβペプチドのＮ末端
本発明は、ＡＤ患者の脳内の可溶性Ａβ１−４２及びプラークへの交差反応性を有する、ＡβペプチドのＮ末端に特異的な高力価のオリゴクローナル抗体を産生するための新規なペプチド組成物に関する。合理的設計の努力によるペプチド組成物の部位特異性は、担体タンパク質上の不適切な部位に対する抗体の産生を最小化する。
表１は、Ａβ１−４２のＮ末端からのペプチドフラグメントを含む、短い直鎖状の多数のペプチドを提供する。Ａβ１−４２（配列番号１）及びＡβ１−２８（配列番号３）のペプチドは担体タンパク質を必要とせずに免疫応答を誘発するのに十分な長さである。しかしながら、Ａβ１−１４、Ａβ１−１２、Ａβ１−１０（配列番号４〜６）のようなより短いＮ末端Ａβペプチドは、実施例７の表４に示されるように（免疫原性の研究において、群３を群１及び２と比較）、それら自身は非免疫原性である。この結果から、Ａβ１−２８ペプチドを免疫原性にする１５〜２８番目のアミノ酸の自己のヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｔｈ）の存在が確認される。短いＡβフラグメントは、担体タンパク質、例えば、実施例７の表６の群４に示されるようなキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）との化学的カップリングによって免疫を増強できる。このような「Ａβペプチド−担体」ワクチンの主な欠陥は、組み合わせによって産生する抗体のほとんど（＞９０％）が、実施例７の表６の群４及びエピトープ抑制の可能性に示されるように、担体タンパク質であるＫＬＨに対する非機能性の抗体であることである。
本発明のペプチド免疫原は、位置１のアミノ酸Ａｓｐ（Ｄ）から開始するＡβペプチドのＮ末端フラグメントの１０〜１４個のアミノ酸（１０〜１４アミノ酸長）を含む。これらのＡβペプチドフラグメントを有する完全合成のペプチド免疫原は、多重のＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフを持つ選ばれたヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｔｈ）（例えば、配列番号３３〜４７）も含有し、これはＡＤ患者の脳内のＡβ１−４２ペプチド及び老人斑に対する高い交差反応性を有するＡβ１−４２ペプチド上のＮ末端標的部位に独占的に集中した免疫応答を誘発する。
（ｃ）異種ヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｔｈエピトープ）
Ｔ細胞エピトープは、それらがＭＨＣ分子と結合する抗原提示細胞の表面上に存在する。ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるＴ細胞エピトープは典型的には８〜１１アミノ酸長のペプチドである一方、ＭＨＣクラスＩＩ分子はより長い１３〜１７アミノ酸長のペプチドを提示し、非古典的ＭＨＣ分子は糖脂質のような非ペプチド性のエピトープも提示する。
ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）は、リンパ球のサブグループで、白血球の一種であり、免疫系、特に獲得免疫系において重要な役割を果たしている。これらは、Ｔ細胞サイトカインを放出することによって、他の免疫細胞の活動を助ける。それらは、Ｂ細胞抗体のクラススイッチ、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化及び増殖、並びにマクロファージのような貪食細胞の殺菌活性の最大化に不可欠である。
ヘルパーＴ細胞エピトープ（Ｔｈエピトープ）は、抗原提示細胞の表面に存在するＴ細胞エピトープであって、それらは、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合し、長さが１３〜１７個のアミノ酸であり、上述したように、ヘルパーＴ細胞によって特異的に認識される。
主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子に結合するペプチドは、免疫応答の開始及び調節に重要である。特異的ＭＨＣ分子に結合するペプチドを予測することは、有望なワクチン候補を決定するのに重要な役割を果たす。クラスＩＩＭＨＣにおける結合溝は、９アミノ酸長より長いペプチドが結合できるように両端が開いている。結合するペプチドの異なる長さ及び９アミノ長の結合コアの位置が変化するため、ペプチドのＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を促進するコンセンサスモチーフを探索するのは困難である。該分子が非特異的（promiscuous）で多数の低親和性ペプチドと結合する場合、難易度は高くなる。
過去２０年間にわたって、本発明者及び彼女のチームは、合理的設計（５，６）によってＢ細胞エピトープに対する特異的な高力価抗体を産生する増強された免疫原性を目的として、特異的な標的Ｂ細胞エピトープ（例えば、Ａβペプチドフラグメント）がこのようなＴｈエピトープにＮ末端又はＣ末端のいずれかで結合するペプチド免疫原構築物（米国特許第６，７１３，３０１ Ｂ１号及びWang CY，2005；米国特許第６，９０６，１６９号）の設計用の異種Ｔｈエピトープとして使用するために、多くの病原体のタンパク質から、異なる種（例えば、ヒト、ブタ、ウシ等）のＭＨＣクラスＩＩ分子に非特異的に（promiscuous）結合するモチーフを有する多くの有望なＴｈエピトープを特定してきた。ワクチンに使用する、合理的に設計された全ての免疫原は、ワクチン製剤で使用される最適なＴｈエピトープを選ぶためのスクリーニング方法（例えば、実施例７、表４、５、６及び７）の一部として、実験的な免疫処置を通じてこのようなＴｈエピトープの有効性を検証するためのものであることを強調する。理想的なＴｈエピトープは、免疫応答の開始及び調節をもたらすヘルパーＴ細胞の活性を最大にする複数の非特異的（promiscuous）ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフを有し、且つそれら自身は、通常、免疫応答しない（即ち、Ｔｈエピトープ（例えば、実施例７の表６の群１、２及び３；並びに実施例８及び９の表７の群１）に対するであろう免疫原構築物によって抗体を産生しない）ため、主に標的のＢ細胞エピトープに対する免疫応答に非常に集中させる。
Ｔｈは、Ｔｈエピトープを有するアミノ酸（天然又は非天然アミノ酸）の配列を意味する。対象ペプチドのＴｈドメインは、約９〜約２５個のアミノ酸、好ましくは約１３〜約１７個のアミノ酸である。Ｔｈセグメント及びその機能的免疫学的類似体は、約１０〜約１４個のアミノ酸残基である、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント（配列番号４〜６）に対する免疫応答を増強又は刺激するのに十分なＴｈエピトープの連続的な部分を有する。
本発明のＴｈエピトープとして、表２（配列番号３３〜４１）で例示したような外来病原体に由来するものが挙げられるが、これに限定されない。また、Ｔｈエピトープとして、理想的な人工Ｔｈ及び理想的な人工コンビナトリアルＴｈ（配列番号４２〜４７）が挙げられる。コンビナトリアルＴｈを有するペプチドは、Ｎ末端Ａβペプチド配列に直列する、単一の固相ペプチド合成で同時に生成する。Ｔｈ部位は、免疫学的類似体も含む。免疫学的Ｔｈ類似体として、免疫が増強された類似体、交差反応性の類似体及びそれらのＴｈエピトープの任意のセグメントが挙げられる。機能的免疫学的Ｔｈ類似体として、また、麻疹ウイルス融合タンパク質ＭＶＦ１〜５Ｔｈ（配列番号３４、４１、４２、４４及び４６）及びＢ型肝炎表面抗原ＨＢｓＡｇ１〜３Ｔｈ（配列番号４３、４５、４７）に由来するＴｈエピトープの幾つかの型で最もよく示されるＴｈエピトープのＴｈ刺激機能が実質的に改変されていないＴｈエピトープの１〜約５個のアミノ酸残基が保存的置換、付加、欠失及び挿入されたものが挙げられる。
本発明のＡβペプチド免疫原構築物は約１３〜約２０個のアミノ酸残基のＴｈエピトープを有し、該Ｔｈエピトープは、「スペーサーＡ」を介して、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント及びその交差反応性類似体又は機能的類似体のＣ末端に共有結合する。本発明のＡβペプチド免疫原構築物（例えば、配列番号４８〜６５）の交差反応性類似体及び機能的類似体は、１〜約５個のアミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失又は挿入をさらに有していてよいが、該ペプチド類似体は、Ａβ１−４２ペプチドと交差反応する免疫応答を誘発できることとする。保存的置換、付加及び挿入は、本明細書に定義される天然又は非天然アミノ酸で行うことができる。
本発明の好ましいペプチド免疫原は、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント（配列番号４〜６）又はその交差反応性の免疫学的類似体；スペーサー（例えば、ε−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ又はε−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）；及び表２のものから選ばれるＴｈエピトープ（配列番号３４、３７、３８、４０〜４７）を含むペプチドである（実施例７の表４の免疫原性試験の結果を参照）。
Ｔｈエピトープペプチドの機能的免疫学的類似体（例えば、ＭｖＦ Ｔｈ（配列番号３４、４１、４２、４４及び４６）；並びにＨＢｓＡｇ Ｔｈ（配列番号４３、４５、４７）の各種の配列）も有効であり、本発明の一部に含まれる。Ａβペプチド免疫原構築物の機能的免疫学的類似体として、元のペプチド、配列番号５１及び６０と同じ免疫原性を実質的に維持する、変異体、配列番号４９〜５１、５４〜５５、５７〜６５及び／又は相同体、配列番号４９〜５１、５４〜５５、５７〜６５が挙げられる。例えば、機能的類似体である変異体は、アミノ酸位置における保存的置換；全体の電荷の変化；別の部分との共有結合；又はアミノ酸の付加、挿入若しくは欠失；及び／又は、その任意の組み合わせを有することができる。
保存的置換とは、１つのアミノ酸残基が、類似の化学的性質を有する別のアミノ酸残基で置換される場合である。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられ；極性の中性アミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられ；正電荷の（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられ；負電荷の（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
特定の態様において、機能的類似体は、元のアミノ酸配列の少なくとも５０％の同一性を有する。別の態様において、機能的類似体は、元のアミノ酸配列の少なくとも８０％の同一性を有する。更に他の態様において、機能的類似体は、元のアミノ酸配列の少なくとも８５％の同一性を有する。また別の態様において、機能的類似体は、元のアミノ酸配列の少なくとも９０％の同一性を有する。
ある態様において、ある特定のペプチドの機能的免疫学的類似体は、元のペプチドと同じアミノ酸配列を含有し、且つペプチドのアミノ末端に３個のリジン（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）を更に含む。この態様において、元のペプチド配列への３個のリジンの包含は、元のペプチドの全体の電荷を変化させるが、ＭＶＦ Ｔｈペプチド系（表２〜７）で示したように、元のペプチドの機能は改変しない。
表２は、Ｔｈエピトープペプチドのための機能的類似体の別の変形例を明らかにする。特に、配列番号３４及び４１のＭＶＦ１ Ｔｈ及びＭＶＦ２ Ｔｈは、各Ｎ末端及びＣ末端の２個のアミノ酸の欠失（配列番号３４及び４１）又は包含（配列番号４４及び４６）によってアミノ酸骨格が相違する、配列番号４４及び４６のＭＶＦ４ Ｔｈ及びＭＶＦ５ Ｔｈの機能的類似体である。これら２種の類似体配列間の相違は、これらの配列内に含まれるＴｈエピトープの機能に影響を与えないだろう（例えば、実施例７の表４の群７、８、１４対実施例７の表５の群１及び実施例８の表７の群１）。
他の変形例において、異種Ｔｈエピトープペプチドは組み合わせ配列として存在することもでき、これは、特定のペプチドの相同体の可変残基に基づくペプチド骨格内の特定の位置にあるアミノ酸残基の混合物を含む。コンビナトリアルペプチドのアッセンブリーは、合成プロセス中に、特定の位置の１個の特定のアミノ酸の代わりに、指定の保護されたアミノ酸の混合物を添加することにより、１工程で合成できる。このようなコンビナトリアル異種Ｔｈエピトープペプチドのアッセンブリーは、多様な遺伝的背景を持つ動物に対するＴｈエピトープの範囲を広くすることができる。異種Ｔｈエピトープペプチドの代表的な組み合わせ配列として、表２に示された配列番号４２〜４５が挙げられる。本発明のＴｈエピトープペプチドは、遺伝的に多様な集団からの動物及び患者に対する広い反応性及び免疫原性を提供する。
一般的に、本発明のＡβペプチド免疫原構築物は、下記式によって表される。
（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）−（Ａ）ｏ−（Ｔｈ）−Ｘ
式中、（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）は、配列番号４〜６からなる群から選ばれる約１０〜約１４個のアミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープであり；
各Ａは、独立に、アミノ酸、Ｌｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、又はε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号３２）からなる群から選ばれるアミノ酸又は結合基であり；
各Ｔｈは、配列番号３４、３７、３８、４０〜４７及びその機能的免疫学的類似体からなる群から選ばれるヘルパーＴ細胞エピトープを構成するアミノ酸配列を有し；
Ｘは、アミノ酸のα-ＣＯＯＨ又はα-ＣＯＮＨ２であり；且つ
ｏは０〜約４である。
本発明のＡβペプチド免疫原構築物は、約２０〜約５０個のアミノ酸残基、好ましくは約２５〜約４０個のアミノ酸残基を有する。
スペーサー（Ａ）によって提供される立体構造の分離により、提示されたＡβペプチド免疫原構築物と適切なＴｈ細胞及びＢ細胞との間のより効率的な相互作用が可能となり、これにより、Ａβペプチド免疫原構築物又はその交差反応性の機能的免疫学的類似体の免疫原性が増強される。
（ｄ）組成物
（ｉ）ペプチド組成物
本開示の組成物は１つ又はそれ以上のＡβペプチド免疫原構築物を含有することができる。２つ以上のＴｈエピトープを有するＡβペプチド免疫原構築物の混合物を有するペプチド組成物は、広いＭＨＣクラスＩＩの範囲のために、幅広い遺伝的集団における免疫活性の相乗的増強を可能にする医薬製剤／ワクチン製剤に調製することができる。このような組成物はＡβ１−４２ペプチドフラグメントに対する改善された免疫応答を提供することができる。
例えば、組成物は、表３に示されるＡβペプチド免疫原構築物（配列番号４８〜６５）、その相同体、類似体及び／又は組み合わせを含むことができる。より具体的には、ペプチド組成物は、配列番号６２、６３、６４及び６５から選ばれる配列を持つＡβペプチド免疫原構築物、その相同体、類似体及び又は組み合わせ（例えば、実施例７に示される配列番号６２及び６３の等モル混合物、又は実施例８、９及び１０における配列番号６４及び６５の別の等モル混合物）を含むことができる。
（ｉｉ）医薬組成物
本開示は、ＡＤの危険性があるか又はＡＤである患者におけるアルツハイマー型認知症を処置及び／又は予防するための医薬組成物である、Ａβペプチド免疫原構築物の混合物を含有する組成物にも関する。
組成物は液剤（例えば、溶液又は懸濁液）に調製できる。典型的には、組成物は溶液又は懸濁液のいずれかの注射剤として調製される。注射前に液状ビヒクルを調製することもできる。他の投与モードに適したさらなる製剤として、経口投与及び鼻腔内投与が挙げられる。上記の状態の処置のための本発明の組成物の有効投与量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒト又は動物であるか、投与される他の薬剤、処置が予防的又は治療的であるかを含む多くの異なる因子に応じて変わる。通常、患者はヒトであるが、遺伝子改変哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物にも処置できる。
医薬組成物は、有効量のＡβペプチド免疫原構築物及び医薬上許容可能な担体を含むように製剤化される。医薬組成物はまた、体重１ｋｇ当たりの免疫原約０．５μｇ〜約１ｍｇを通常含む適切な単位投与形態に製剤化される。複数回投与で送達する場合、医薬組成物は単位投与形態当たりの適切な量に便宜上分割されてもよい。投与量は、ワクチン及び治療分野において周知のように、対象の年齢、体重及び健康状態に依存する。
（ｉｉｉ）医薬ワクチン製剤
ある態様において、Ａβペプチド免疫原構築物を有する医薬組成物は、ワクチン宿主におけるＡβペプチドのＮ末端に対する免疫応答を誘発するのに用いられる。本発明のＡβペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物は、ワクチン宿主又はＡＤの危険性があるか若しくはＡＤである患者に対して、アルツハイマー型認知症の予防及び処置のためのワクチンとして用いることができる。
また、組成物は、医薬上許容可能なデリバリシステム中に、担体及び／又は他の添加物を含むことができる。したがって、Ａβペプチド免疫原構築物を含む組成物は、アジュバント、医薬上許容可能な担体又はワクチン製剤で通常提供される免疫学的アジュバントを含む他の成分を用いる医薬ワクチン製剤として製剤化することができる。免疫アジュバントは、「特異的ワクチン抗原と組み合わせて使用された場合、それ自身は任意の特異的な抗原効果を持つことはなく、抗原特異的な免疫応答を促進、延長又は増強するように作用する任意の物質」として定義される。油、アルミニウム塩及びビロソームを含む、広範囲に使用される多くの公知のアジュバントが存在する。リン酸アルミニウム（例えば、アジュホス（Adjuphos））及び水酸化アルミニウム（例えば、アルハイドロゲル（Alhydrogel））を含む２つの一般的な塩が、ヒトワクチン中で最も一般的なアジュバントである。鉱物塩を選ぶ方法及び使用する鉱物塩又はその組み合わせの好ましい濃度を決定する方法は、当業者に周知である。
本発明においてアジュバントとしても使用できる他の成分として、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、エマルシゲン、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＱＳ２１、ＩＳＡ３５、ＩＳＡ２０６、ＩＳＡ５０Ｖ、ＩＳＡ５１及びＩＳＡ７２０、並びに他の有効なアジュバント及び乳化剤が挙げられる。ある特定の態様において、デリバリビヒクル及びアジュバントは、モンタニド（商標）（MontanideTM）ＩＳＡ５１（油中水型乳剤製造用の、植物油及びオレイン酸マンニド（mannide oleate）から構成される油性ワクチンアジュバント組成物）、ツイーン（登録商標）（TweenR）８０（ポリソルベート８０又はモノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンとしても知られる）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド及び／又はその任意の組み合わせである。別の態様において、医薬組成物は、アジュバントとしてエマルシゲン（Emulsigen）又はエマルシゲンＤを有する水中油中水型（即ち、ｗ／ｏ／ｗ）乳剤である。
ワクチンとしての医薬組成物は、速放性製剤又は徐放性製剤として製剤化することができる。また、医薬組成物は、全身又は局在粘膜への導入、封入された免疫原による免疫及び微粒子を用いる同時投与のために製剤化できる。このようなデリバリシステムは当業者によって簡単に見つけ出される。
本開示のＡβペプチド免疫原構築物を含む各種のワクチン製剤は、ワクチン宿主又はＡＤの危険性があるか若しくはＡＤである患者におけるアルツハイマー型認知症の保護及び処置に有効である。
（ｉｖ）Ａβペプチド免疫刺激複合体
ある態様において、医薬組成物は、（ａ）ＣｐＧオリゴヌクレオチド及び（ｂ）Ａβペプチド免疫原構築物を有する免疫刺激複合体を含むことができる。このような免疫刺激複合体は、アジュバントとして及びペプチド免疫原安定化剤として作用するように特に適応される。免疫刺激複合体は粒子状形態であり、これは、免疫応答を生じさせる免疫系細胞にＡβペプチド免疫原構築物を効率的に提示することができる。免疫刺激複合体は、非経口投与用の懸濁液として製剤化することができる。免疫刺激複合体は、非経口投与に続いて、ワクチン宿主の免疫系細胞へＡβペプチド免疫原構築物を効率的に送達し、予防効果を有する抗Ａβ免疫応答を生じさせるために、鉱物塩と、又はその場でゲル化するポリマーと組み合わせた懸濁液として、Ｗ／Ｏ乳剤の形態に製剤化してもよい。本発明は、カチオン性Ａβペプチド免疫原構築物とアニオン性分子又はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド及びその組み合わせとを有する安定化免疫刺激複合体、並びに、静電会合によるアニオン性分子又はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとの複合化によってカチオン性Ａβペプチド免疫原構築物を安定化させる方法に関する。安定化免疫刺激複合体は、免疫原のデリバリシステムとして医薬組成物に組み込むことができる。
本明細書に記載の「カチオン性ペプチド」であるＡβペプチド免疫原構築物は、５．０〜８．０の範囲内のｐＨで正電荷のペプチドを意味する。ペプチド又はペプチド混合物の正味の電荷は、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）にそれぞれ＋１の電荷、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）にそれぞれ−１の電荷、及び配列中の他のアミノ酸に０の電荷を割り当てることによって計算される。無置換の場合、各ペプチドの末端基であるＮ末端のアミン（＋１）及びＣ末端のカルボン酸塩（−１）からの電荷の寄与は、効果的に互いに相殺する。電荷は各ペプチドについて合計し、正味の平均電荷として示される。適切なペプチド免疫原は正味の平均正電荷が＋１である。好ましくは、ペプチド免疫原は、正味の正電荷が＋２より大きい範囲である。
本明細書に記載の「アニオン性分子」は、５．０〜８．０の範囲内のｐＨで負電荷の分子を意味する。オリゴマー又はポリマーの正味の負電荷は、オリゴマー中のリン酸ジエステル基又はホスホロチオエート基にそれぞれ−１の電荷を割り当てることによって計算される。適切なアニオン性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフの繰り返し数が１〜１０の範囲内で、８〜６４個の核酸塩基を有する一本鎖ＤＮＡ分子である。好ましくは、ＣｐＧ免疫刺激一本鎖ＤＮＡ分子は、ＣｐＧモチーフの繰り返し数が３〜８の範囲内で１８〜４８個の核酸塩基を含む。
より好ましくは、アニオン性オリゴヌクレオチドは、式：５’ Ｘ１ＣＧＸ２ ３’（式中、Ｃ及びＧはメチル化されておらず；Ｘ１はＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）及びＴ（チミン）からなる群から選ばれ；及びＸ２はＣ（シトシン）又はＴ（チミン）である）によって表される。或いは、アニオン性オリゴヌクレオチドは、式：５’ （Ｘ３）２ＣＧ（Ｘ４）２ ３’（式中、Ｃ及びＧはメチル化されておらず；Ｘ３はＡ、Ｔ又はＧからなる群から選ばれ；並びにＸ４はＣ又はＴである）によって表される。
得られる免疫刺激複合体は、典型的には１〜５０ミクロンの範囲内のサイズの粒子状形態であり、相互作用する化学種の相対的な電荷の化学量論及び分子量を含む多くの因子の機能である。粒子状の免疫刺激複合体は、アジュバント作用の提供及びインビボで特異的な免疫応答の増加という追加的な利点を有する。また、安定化免疫刺激複合体は、油中水型乳剤、鉱物塩懸濁液及びポリマーゲルを含む各種プロセスによってワクチン製剤を調製するのに適切である。
（ｅ）製造方法
本開示は、免疫応答を誘発し、ＡＤの危険性があるか又はＡＤである患者を保護するための、Ａβペプチド免疫原構築物、組成物及び医薬組成物、ワクチン製剤の製造方法にも関する。
（ｉ）Ａβペプチド免疫原構築物の製造方法
本発明のペプチド免疫原は当業者に周知の化学合成法によって製造することができる。例えば、Moore V.「Synthetic Peptides:A User’s Guide」第２章、GA Grant,W.H.編、Freeman&Co.，ニューヨーク，NY, 1992, p.63-67を参照のこと。したがって、ペプチドは、例えば、アプライド・バイオシステム・ペプチド合成機（モデル４３０Ａ又は４３１）で、側鎖を保護したアミノ酸を使用するｔ−Ｂｏｃ又はＦ−ｍｏｃ化学のいずれかにより保護されたα−ＮＨ２を用いる固相合成の自動メリーフィールド法を使用して合成することができる。Ｔｈエピトープのためのコンビナトリアルライブラリーペプチドを有するペプチド構築物の調製は、与えられた可変位置でカップリング用の代替アミノ酸の混合物を提供することによって達成することができる。
所望のペプチド免疫原のアッセンブリーの完成後、樹脂を標準の手順に従って処理してペプチドを樹脂から切断し、アミノ酸側鎖上の官能基を脱ブロック化する。遊離ペプチドは、ＨＰＬＣにより精製され、生化学的、例えばアミノ酸分析又は配列決定によって特性が明らかにされる。ペプチドの精製法及び特性評価法は、当業者に周知である。
本発明の免疫原は、分岐状ポリリシルコア樹脂上に直接所望のペプチド構築物を合成することにより、分岐状ポリマーとして調製してもよい（Wangら、Science,1991;254:285-288）。
この化学的方法によって製造されるペプチドの品質を制御及び定義することができ、結果として、抗原性、免疫原性及び収率の再現性を保証することができる。固相ペプチド合成によるペプチド又はペプチド免疫原構築物に関するＡβの製造の詳細な説明を実施例１に示す。
２５年にわたる合成ペプチドの免疫学的応用における経験の間に、出願人は、意図する免疫学的活性の保持を可能にする構造的可変性の範囲が、低分子薬物による特定の薬物活性の保持を可能にする又は生物学的に誘導される薬物と共に生成する高分子において認められる所望の活性及び望ましくない毒性の保持を可能にする構造的可変性の範囲よりも、はるかに適応することを見出した。したがって、意図的に設計されたか、又は意図するペプチドと類似のクロマトグラフィー特性及び免疫学的特性を持つ配列が欠失した副生成物の混合物として合成プロセスの誤りによって必然的に生成する、いずれかのペプチド類似体は、しばしば、所望のペプチドの精製調製物と同様に有効である。これらのペプチドを使用する最終製品の再現性及び有効性を保証するような、製造方法及び製品の評価方法の両方を監視するための識別力のあるＱＣ手法が開発される限り、設計された類似体及び意図しない類似体混合物は有効である。
ペプチドは、核酸分子、ベクター及び／又は宿主細胞を含む組み換えＤＮＡ技術を使用して作製することもできる。このように、Ａβペプチド免疫原構築物及びＡβペプチド免疫原構築物の免疫学的機能的類似体、並びにその類似体／相同体をコードする核酸分子もまた、本発明の一部として本開示に含まれる。同様に、核酸分子を有するベクター（発現ベクターを含む）だけでなく、ベクターを含む宿主細胞もまた、本発明の一部として本開示に含まれる。
各種の例示的な態様は、Ａβペプチド免疫原構築物及びＡβペプチド免疫原構築物の免疫学的機能的類似体の製造方法も含む。例えば、該方法はＡβペプチド免疫原構築物及び／又はその免疫学的機能的類似体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、ペプチド及び／又は類似体が発現するような条件下で培養する工程を含むことができる。より長い合成ペプチド免疫原は、周知の組み換えＤＮＡ技術により合成することができる。このような技術は、詳細なプロトコルを含む周知の標準マニュアルにおいて提供される。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列を逆翻訳して、アミノ酸配列をコードする核酸配列（好ましくは、遺伝子を発現する生物体に最適なコドンを有する）を得る。次に、典型的にはペプチド及び必要に応じて任意の調節エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって合成遺伝子を作製する。合成遺伝子を適切なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞に遺伝子導入する。次いで、選ばれた発現系及び宿主にふさわしい適切な条件下でペプチドを発現する。ペプチドを精製し、標準的な方法により特性を明らかにする。
（ｉｉ）免疫刺激複合体の製造方法
各種の例示的な態様は、Ａβペプチド免疫原構築物及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）分子を有する免疫刺激複合体（ＩＳＣ）を製造する方法も含む。ある態様において、図５Ａに示すように、安定化免疫刺激複合体はカチオン性ペプチド及びポリアニオン性ＣｐＧ ＯＤＮ分子に由来する。図５Ａは、電荷の静電中和により引き起こされる自己組織化システムを示す。アニオン性オリゴマーに対するカチオン性ペプチドのモル電荷比の化学量論が会合の程度を決める。ペプチド免疫原及びＣｐＧ ＯＤＮの非共有結合性の静電会合は、完全に再現性のあるプロセスである。ペプチド／ＣｐＧ ＯＤＮ免疫刺激複合体は、自己凝集し、免疫系の「プロフェッショナル」抗原提示細胞（ＡＰＣ）への提示が促進されるため、さらに複合体の免疫原性が増強される。これらの複合体は、製造中の品質管理のために容易に特徴付けられる。ペプチド／ＣｐＧ ＩＳＣはインビボで十分に許容される。
ある態様において、ワクチン製剤（ＵＢＩ ＡＤワクチン）は、２つのＡβペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）を用い、等モル比で調製し、独占的所有権を有する（proprietary）ＣｐＧ ＯＤＮと混合して、実施例８及び９に記載するように、溶液中で免疫刺激複合体の自発的な形成がもたらされる。ＣｐＧ ＯＤＮ及びＡβペプチド免疫原構築物を有するこの新規な粒子系は、ＣｐＧ ＯＤＮの使用に関連する一般的なＢ細胞の分裂促進性を有利にし、バランスのとれたＴｈ−１／Ｔｈ−２型応答を更に促進するために設計された。
開示するワクチン製剤中のＣｐＧ ＯＤＮは、反対の電荷の静電中和を介するプロセスで免疫原と１００％結合し、ミクロンサイズの粒子の形成がもたらされる。粒子形態は、ＣｐＧアジュバントの通常の使用からＣｐＧの投与量を大幅に低減することを可能にし、不利な自然免疫応答の可能性をより減らし、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む代替的な免疫プロセシング経路を促進する。したがって、開示する製剤（ＵＢＩ ＡＤワクチン）は、概念的に新規であり、代替的な機構によって免疫応答の刺激を促進することにより利点を提供する。
（ｉｉｉ）ワクチン製剤の製造方法
各種の例示的な態様は、図５Ｂに示すように、鉱物塩を有する油中水型乳剤及び懸濁液を使用するワクチン製剤も含む。投与の目標の一部でもある予防を伴って、多くの人々によって使用されるように設計されたワクチンのためには、安全性は考慮される別の重要な因子になる。臨床試験における多くのワクチン製剤のためのヒトへの油中水型乳剤の使用にもかかわらず、アラムは、その数十年にわたる安全性試験によって、依然としてワクチン製剤での使用のための主要なアジュバントである。実施例８及び９に示すように、アラム又はその鉱物塩であるアジュホス（Adjuphos）アラム（リン酸アルミニウム）を臨床適用のための調製物中でアジュバントとして使用した。
（ｆ）アルツハイマー病の処置及び予防のための方法
（ｉ）処置の体系的計画（regime）
予防的な適用において、医薬組成物を、アルツハイマー病に影響されやすいか、又はアルツハイマー病の危険性がある患者に、危険性を取り除くかもしくは軽減させるか、重篤度を軽減させるか、又は（生化学的、組織学的及び／又は行動学的に）疾患の発症を遅らせる（疾患の進行中でのその合併症及び中間の病理学的表現型を含む）のに十分な量で、投与する。
治療的な適用において、組成物を、このような疾患の疑いがあるか又は既にこのような疾患に罹患している患者に、治療、又は（生化学的、組織学的及び／又は行動学的に）疾患の症状を少なくとも部分的に抑制する（疾患の進行中でのその合併症及び中間の病理学的表現型を含む）のに十分な量で、投与する。
ある方法において、薬剤の投与は、まだ特徴的なアルツハイマー病理を発症していない患者における軽度認知障害を軽減又は解消する。治療的又は予防的処置を達成するのに適切な量は、治療的又は予防的に有効な投与量として定義される。予防的及び治療的体系的計画の両方において、薬剤を、通常、十分な免疫応答を達成するまで、幾つかの投与量で投与する。典型的には、免疫応答を監視し、免疫応答が減少し始めたら反復投与する。
（ｉｉ）処置に適している患者
処置に適している患者として、アルツハイマー病発症の危険性はあるが症状は示していない者、及び現在症状を示している患者が挙げられる。
本明細書で使用される用語「予防的処置」は、疾患をもたらす発症プロセスの停止を目的とする処置に関する。
本明細書で使用される用語「処置」は、疾患の進行をもたらすか及び／又は対症的な効果を有する発症プロセスの停止を目的とする処置に関する。
十分に長く生きている人の場合、全ての人がアルツハイマー病を患う危険性があると言ってもよい。したがって、本方法は、対象患者（即ち、生きている人は誰でも患者としての資格があり得る）の危険性の任意の評価は必要とせずに、一般の人々に対して予防的に投与することができる。本方法は、アルツハイマー病の公知の遺伝的危険性を持つ人に対して特に有用である。そのような人としては、この疾患を経験した親類を持つ人、及び遺伝又は生物学的マーカーの分析により危険性が確定した人が挙げられる。アルツハイマー病に対する危険性の遺伝マーカーとしては、ＡＰＰ遺伝子の変異（特に、ハーディ及びスウェーデン変異とそれぞれ呼ばれる、７１７番目並びに６７０及び６７１番目での変異）が挙げられる（Hardy J. Trends in Neurosciences 1997;20:154-159を参照のこと）。危険性の他のマーカーとして、プレセニリン遺伝子ＰＳ１及びＰＳ２、並びにＡｐｏＥ４における変異、ＡＤの家族歴、高コレステロール血症又はアテローム性動脈硬化症がある。
一般に、患者は、軽度認知障害がある患者、アルツハイマー病に関連する公知の遺伝子型を有する患者、２１トリソミーを有する患者（即ち、潜在的なダウン症候群患者）、アルツハイマー病の危険性を示す代替マーカーを有する患者からなる危険群の対象から選ばれる。
無症状の患者において、処置は任意の年齢（例えば、１０、２０、３０歳）で開始することができる。患者が４０、５０、６０又は７０歳に達するまで処置を開始する必要はない。潜在的なダウン症候群の患者の症例では、出生前に母親に又は出生後すぐに治療薬を投与することによって処置を開始することができる。
現在アルツハイマー病に罹患している人は特徴的な認知症から認識でき、これは本明細書で使用されるように、特に、精神疾患の診断・統計マニュアル（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders、第４版）（ＤＳＭ−ＩＶ）基準及び上記の危険因子の存在に従って定義される疾患に関する。また、多くの診断テストがＡＤの人を識別するために利用できる。これらは、ＣＳＦタウ及びＡβ１−４２レベルの測定を含む。タウの上昇及びＡβ１−４２レベルの低下は、ＡＤの存在を表す。アルツハイマー病に罹患している人は、ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡアルツハイマー基準によって診断することもできる。
処置は、典型的には一定期間にわたる複数回投与を必要とする。処置は、治療薬に対する抗体又は活性化Ｔ細胞若しくはＢ細胞の応答をアッセイすることにより（例えばＡβ１−４２ＥＬＩＳＡ）、長時間にわたって監視できる。応答が低下したら追加免疫投与量が指示される。
老人性アミロイドプラークの主成分であるＡβアミロイドペプチドがＡＤの原因となる役割を果たしていることを示唆する、考慮すべき証拠が蓄積されてきた。ＡＤの成功した疾患改変療法は、脳内のβアミロイドの沈着に影響を与える製品を含む可能性がある。免疫系によって積極的に産生するか又は受動的に投与されるＡβ特異的抗体は、異なる遺伝子導入マウスモデルにおけるプラークの負荷を一貫して低減する。抗Ａβ抗体を産生するＡＤ患者の免疫系を刺激する最初の臨床的試みは、しかしながら、許容できない副作用のために中断されなければならなかった（処置した患者の６％に髄膜脳炎、Orgogozo JMら、Neurology 2003;61:46-54）。
驚くべきことに、有害な免疫反応又は微小出血の発生率は、麻疹ウイルス融合（ＭＶＦ）タンパク質及びＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）にそれぞれ由来する、２つの理想的な人工ヘルパーＴエピトープと等モル比で結合した、２つのＡβ１−１４ペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）を使用する本開示の製剤（ＵＢＩ ＡＤワクチン）では観察されない。
開示する方法のある面において、驚くべきことに、Ａβペプチド免疫原構築物は、認知症に罹患した温血動物、特にヒトの筋肉内に有利に適用できることが見出された。
第２の面において、本発明は、Ａβペプチド免疫原構築物を筋肉内に投与するための剤形を提供する。Ａβペプチド免疫原構築物の筋肉内用の好ましい剤形は、アジュバントとしての鉱物塩の存在中でＣｐＧ ＯＤＮと複合化したペプチド免疫原構築物を３０μｇ〜１０００μｇ／０．５ｍＬ／用量、好ましくは１００μｇ〜４００μｇ／０．５ｍＬ／用量、より好ましくは３００μｇ／０．５ｍＬ／用量で含有するワクチン製剤である。剤形は使用直前まで２〜８℃で保管できる。剤形は、好ましくは、温血動物、特にその腕に注射器を用いる筋肉内注射によって投与される。剤形を温めるために、剤形は、周囲温度に、約１５分〜４５分間、例えば３０分間、維持することができる。好ましくは、薬剤物質を吸い上げる前に、潜在的な半可視化粒子の分散のためにバイアルを穏やかに数回反転する。
第３の面において、本発明は、１投与当たり３０μｇ〜１０００μｇ／０．５ｍＬ、好ましくは１投与当たり１００μｇ〜４００μｇ／０．５ｍＬ、より好ましくは１投与当たり約３００μｇ／０．５ｍＬで、それを必要とするヒト患者に、初回免疫後０週、４週及び８週の初回抗原刺激後、１２週毎に約１回、好ましくは２６週毎に約１回、特に５２週に約１回、投与することを有する、ヒト患者における認知症の予防及び処置方法に関する。注射の頻度は、患者の応答に応じて変更できる。例えば、注射が抗体価に従って投与されなければならない場合、投与頻度は変更できる。
上記疾患の処置におけるＡβペプチド免疫原構築物の有用性は、適切な臨床研究、例えば、実施例に記載されたもののように、０週、４週及び１２週の全部で３回、各回１投与当たり３００μｇ／０．５ｍＬのワクチン製剤を投与し、続いて９カ月にわたって追跡する研究において確認することができる。抗体力価に従って、３カ月、６カ月又は１２カ月毎に１回、フォローアップ免疫が可能である。
適切な臨床研究は、アルツハイマー病の危険性があるか又はアルツハイマー病の症状を有する患者に対する、オープンラベル試験または、特に、無作為化、二重盲検、プラセボコントロールの並行試験である。
特定の態様は、ＡＮ−１７９２ワクチン（凝集化Ａβ１−４２、エラン／ワイス）を接種した患者における同種Ｔｈエピトープの類似体で観察された毒性作用を持たない、ヘルパーＴ（Ｔｈ）エピトープ（配列番号４６及び４７）と合成的に結合した、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端（Ａβ１−１４、配列番号４）をそれぞれ有する２つのＡβペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）の混合物を含有するワクチン製剤（ＵＢＩ ＡＤワクチン）を含む。インビトロ研究、及び小動物、ヒヒ及びマカク（macaque）におけるインビボ研究から、予想されるＮ末端部位特異的な抗体が産生し、これらの抗体が、Ａβの毒性作用を中和し、プラークの除去を促進する機能的免疫原性を持つことがわかる。抗体はＣＮＳから、末梢循環へＡβ１−４０を導くように見える。結果から、ワクチンが抗Ａβ１−４２細胞内応答を惹起しないことがわかる。ＵＢＩ ＡＤワクチンは、カニクイザルにおける反復投与での急性毒性試験及び慢性毒性試験で良好な忍容性を示した。実施例８及び９に具体化したＵＢＩ ＡＤワクチン製剤の安全性及び免疫原性は、軽度〜中程度ＡＤの患者に対する第Ｉ相試験において更に試験され、１９人の患者全てにおいてＡβ１−１４ペプチドのＮ末端に特異的な抗体を誘発することが見いだされ、これにより、重篤な又は許容できない任意の有害事象を引き起こすことなく、０、４及び１２週に筋肉内に免疫化した後、前例のない１００％の応答率を達成した。軽度ＡＤの高齢の被験者群（ｎ＝６、年齢が≧６０歳、ＭＭＳＥのベースラインが≧２０）は、ＵＢＩ ＡＤワクチン製剤に対する高い抗体反応、並びに、６カ月の中心的試験中及び６カ月のフォローアップ期間の観察後にベースラインスコアと比較して、（ｉ）ＡＤＡＳ−Ｃｏｇ（アルツハイマー病評価尺度−認知（AD Assessment Scale-Cognitive））；（ｉｉ）ＡＤＣＳ−ＣＧＩＣ（アルツハイマー病共同研究−変化に対する医師の包括的印象（Alzheimer’s Disease Cooperative Study-Clinical Global Impressions of Change））；及び（ｉｉｉ）ＭＭＳＥ（ミニメンタルステート検査（Mini-Mental State Exam））スコアによって評価される認知及び機能転帰の改善を示した。ＡＤＡＳ−Ｃｏｇは、臨床試験で使用される最も一般的な認知力検査の手法である。ＡＤＡＳ−Ｃｏｇは、記憶、言語、習慣、注意及び他の認知能力の障害を測定する１１タスク（７０ポイント）からなり、これはしばしばＡＤのコア症状を示す（スコアの上昇は増悪を示す）。ＡＤＣＳ−ＣＧＩＣは、ベースラインからの変化の単一の国際的な評価である（スコアの低下は増悪を示す）。ＭＭＳＥは認知機能をスクリーニングするために最も一般的に使用される手法であり、見当識、記銘、短期記憶、言語機能の尺度を提供する（スコアの低下は増悪を示す）。第ＩＩａ相試験において、バイオマーカー（分子診断法、脳画像診断、遺伝子タイピング）を使用して、脳内の毒性Ａβオリゴマーの濃度をおそらくは低下させる、循環中の抗Ａβ１−１４抗体を能動免疫を通じて上昇させることによる疾患の進行の軽減の評価を含む、軽度ＡＤの患者に対するワクチン製剤の有効性を評価する。
（ｇ） 具体的な態様
本発明の具体的な態様として、次のものを含むが、これらに限定されない。
（１） 下記式を有するＡβペプチド免疫原構築物：
（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）−（Ａ）ｏ−（Ｔｈ）−Ｘ
式中、（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）は、配列番号４、５及び６からなる群から選ばれる約１０〜約１４個のアミノ酸残基を有するＡβ由来のＢ細胞エピトープであり；
各Ａは、独立に、アミノ酸、Ｌｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α，ε-Ｎ）Ｌｙｓ、及びε-Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号３２）からなる群から選ばれるアミノ酸又は結合基であり；
各Ｔｈは、配列番号３４、３７、３８、４０〜４７及びその機能的免疫学的類似体からなる群から選ばれるヘルパーＴ細胞エピトープを構成するアミノ酸配列を有し；
Ｘは、アミノ酸のα-ＣＯＯＨ又はα-ＣＯＮＨ２であり；且つ
ｏは０〜約４である。
（２） （Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）がＡβ１−１４（配列番号４）である、（１）のＡβペプチド免疫原構築物。
（３） Ａがε-Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号３２）である、（１）のＡβペプチド免疫原構築物。
（４） Ｔｈエピトープが配列番号４５又は４６である、（１）のＡβペプチド免疫原構築物。
（５） 配列番号４８〜６５のアミノ酸配列を有する、（１）のＡβペプチド免疫原構築物。
（６） 配列番号６２〜６５のアミノ酸配列から本質的になる、（１）のＡβペプチド免疫原構築物。
（７） 配列番号６２、６３、６４、及び／又は６５である、（１）のＡβペプチド免疫原構築物。
（８） 請求項１のＡβペプチド免疫原構築物を有する組成物。
（９） ａ． （１）のＡβペプチド免疫原構築物；及び
ｂ． 医薬上許容可能なデリバリビヒクル及び／又はアジュバント；
を有する医薬組成物。
（１０） ａ． （１）のＡβペプチド免疫原構築物；及び
ｂ． 医薬上許容可能なデリバリビヒクル及び／又はアジュバント；
を有するアルツハイマー病ワクチン組成物。
（１１） ａ． （７）のＡβペプチド免疫原構築物；及び
ｂ． 医薬上許容可能なデリバリビヒクル及び／又はアジュバント；
を有するアルツハイマー病ワクチン組成物。
（１２） （ｂ）のアジュバントが、アルハイドロゲル（Alhydrogel）（Ａｌ（ＯＨ）３）又はアジュホス（Adjuphos）（ＡｌＰＯ４）からなる群から選ばれるアルミニウムの鉱物塩である、（１０）のアルツハイマー病ワクチン組成物。
（１３） （ａ）のペプチド免疫原が、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合して安定化免疫刺激複合体を形成する、（１０）のアルツハイマー病ワクチン組成物。
（１４） （１）のＡβペプチド免疫原構築物の（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）成分と結合する、単離抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
（１５） Ａβ１−１０（配列番号６）と特異的に結合する、（１４）の単離抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
（１６） 請求項１のＡβペプチド免疫原構築物と結合した、（１４）の単離抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
（１７） 配列番号６と結合した、（１５）の単離抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
（１８） （１４）の単離抗体又はそのエピトープ結合フラグメントを有する組成物。
（１９） （１０）のワクチン製剤を投与することを有する、ヒト患者の認知症の重篤度を軽減する方法又はヒト患者の認知症の発病を遅らせる方法。
（２０） ＡＤの危険性があるか又はＡＤである患者に、前記ワクチン製剤を１投与当たり１０μｇ〜１０００μｇを有する水溶液を投与する、（１９）の方法。
（ｈ） さらなる態様
（１） 本発明のＡβペプチド免疫原構築物は、下記式によって表される：
（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）−（Ａ）ｏ−（Ｔｈ）−Ｘ
式中、（Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメント）は、配列番号４〜６からなる群から選ばれる約１０〜約１４アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープであり；
各Ａは、独立に、アミノ酸、Ｌｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α，ε-Ｎ）Ｌｙｓ、及びε-Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号３２）からなる群から選ばれるアミノ酸又は結合基であり；
各Ｔｈは、配列番号３４、３７、３８、４０〜４７及びその機能的免疫学的類似体を有する群から選ばれるヘルパーＴ細胞エピトープを構成するアミノ酸配列を有し；
Ｘは、アミノ酸のα-ＣＯＯＨ又はα-ＣＯＮＨ２であり；且つ
ｏは０〜約４である。
（２） アルツハイマー病（ＡＤ）ワクチン組成物であって、
ａ．（１）のＡβペプチド免疫原構築物；
ｂ．（ａ）の機能的免疫学的類似体；
ｃ．（ａ）又は（ｂ）のいかなる組合せ；及び
ｄ．許容可能なデリバリビヒクル又はアジュバント；
を有する上記組成物。
（３） （ｄ）のアジュバントが、アルハイドロゲル（Ａｌ（ＯＨ）３）又はアジュホス（ＡｌＰＯ４）であるアルミニウムの鉱物塩である、（２）のＡＤワクチン。
（４） （ａ）のペプチド抗原が、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合して安定化免疫刺激複合体を形成する、（２）のＡＤワクチン。
（５） アルツハイマー病（ＡＤ）ワクチン組成物であって、
ａ．配列番号４９〜５１、５４、５５、及び５７〜６５を有する群から選ばれるＡβペプチド免疫原構築物；
ｂ．（ａ）の機能的免疫学的類似体；
ｃ．（ａ）又は（ｂ）のいかなる組合せ；及び
ｄ．許容可能なデリバリビヒクル又はアジュバント；
を有する上記組成物。
（６）アルツハイマー病（ＡＤ）ワクチン組成物であって、
ａ．（５）のＡβペプチド免疫原構築物；
ｂ．（ａ）の機能的免疫学的類似体；
ｃ．（ａ）又は（ｂ）のいかなる組合せ；及び
ｄ．許容可能なデリバリビヒクル又はアジュバント；
を有する上記組成物。
（７） （ｄ）のアジュバントが、アルハイドロゲル（Ａｌ（ＯＨ）３）又はアジュホス（ＡｌＰＯ４）であるアルミニウムの鉱物塩である、（５）のＡＤワクチン。
（８） （ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のペプチド抗原が、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合して安定化免疫刺激複合体を形成する、（５）のＡＤワクチン。
（９） （ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のペプチド抗原が、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合して安定化免疫刺激複合体を形成し、（ｄ）のアジュバントが、アルハイドロゲル（Ａｌ（ＯＨ）３）又はアジュホス（ＡｌＰＯ４）であるアルミニウムの鉱物塩である、（５）のＡＤワクチン。
（１０）アルツハイマー病（ＡＤ）ワクチン組成物であって、
ａ．配列番号６２＋６３、６４＋６５を有する群から選ばれるＡβペプチド免疫原構築物；
ｂ．（ａ）の機能的免疫学的類似体；
ｃ．（ａ）又は（ｂ）のいかなる組合せ；及び
ｄ．許容可能なデリバリビヒクル又はアジュバント；
を有する上記組成物。
（１１） ａ．配列番号６４及び配列番号６５の混合物を有するＡβペプチド免疫原構築物；及び
ｂ．ＣｐＧ ＯＤＮとさらに混合した（ａ）の混合物；
を有する組成物。
（１２） ａ．配列番号６４及び配列番号６５の混合物を有するＡβペプチド免疫原構築物；
ｂ．ＣｐＧ ＯＤＮとさらに混合した（ａ）の混合物；及び
ｃ．アジュホス；
を有する医薬組成物。
（１３） ａ．配列番号６４及び配列番号６５の混合物を有するＡβペプチド免疫原構築物；
ｂ．ＣｐＧ ＯＤＮとさらに混合した（ａ）の混合物；及び
ｃ．アルハイドロゲル；
を有する医薬組成物。
（１４） （１３）の医薬組成物をヒトに投与することを有する、ヒトの認知症の重篤度を軽減する方法又はヒトの認知症の発病を遅らせる方法。
（１５） （１３）の医薬組成物をヒトに３００μｇ／０．５ｍＬ／投与で投与することを有する、ヒトの認知症の重篤度を軽減する方法又はヒトの認知症の発病を遅らせる方法。
（１６） ａ．（１３）の医薬組成物をヒトに３００μｇ／０．５ｍＬ／投与で投与すること；及び
ｂ．初期として０週、４週及び１２週に投与すること；
を有する、ヒトの認知症の重篤度を軽減する方法又はヒトの認知症の発病を遅らせる方法。
（１７） ａ．（１３）の医薬組成物をヒトに３００μｇ／０．５ｍＬ／投与で投与すること；
ｂ．初期として０週、４週及び１２週に投与すること；及び
ｃ．（ｂ）の工程後、３カ月毎に１回、及び／又は６カ月毎に１回、及び／又は１２カ月毎に１回、追加投与すること；
を有する、ヒトの認知症の重篤度を軽減する方法又はヒトの認知症の発病を遅らせる方法。
（１８） 投与が筋肉注射による（１４）〜（１７）のいずれかの方法。
（１９） ヒトが軽度ＡＤ、ＭＣＩであるか、又はＡＤの徴候又は症状を示さないが、年齢が６０を越えている（１４）〜（１８）のいずれかの方法。
（２０） ヒトへの投与が以下である（１９）の方法：
ａ．ヒトが軽度ＡＤである場合、投与がＡＤの処置のためである；
ｂ．ヒトがＭＣＩである場合、投与が認知症の重篤度の予防及び／又は軽減のためであるか及び／又は認知症の発病の遅延のためである；
ｃ．ヒトがＡＤの徴候又は症状を示さないが、年齢が６０を越えている場合、投与が認知症の重篤度の予防及び／又は軽減のためであるか及び／又は認知症の発病の遅延のためである。
（２１） （ａ）のペプチド抗原が、オリゴデオキシヌクレオチドＣｐＧと混合して安定化免疫刺激複合体を形成する（２）〜（１０）のいずれかのＡＤワクチン。
（２２） （ａ）のＡβペプチド免疫原構築物が配列番号１７〜２０のアミノ酸配列を有する上記のＡＤワクチン。
（２３） （ａ）のＡβペプチド免疫原構築物が配列番号１９及び２０のアミノ酸配列を有する上記のＡＤワクチン。
（２４） （ａ）のペプチド抗原の全量が投与当たり約１０μｇ〜約１ｍｇである上記のＡＤワクチン。
（２５） デリバリビヒクル又はアジュバントが、モンタニドＩＳＡ５０Ｖ、モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン、エマルシゲン、エマルシゲンＤ、及びＣｐＧオリゴヌクレオチドからなる群から選ばれる上記のＡＤワクチン。
（２６） 上記のいずれかのワクチン製剤を投与することを有する、ヒト患者の認知症の重篤度を軽減する方法又はヒト患者の認知症の発病を遅らせる方法。
（２７） 認知症が、アルツハイマー型の認知症又はアミロイド血管障害を伴う血管認知症である上記のいずれかの方法。
（２８） 認知症が、パーキンソン病又はレビー小体型認知症を伴う認知症である上記のいずれかの方法。
（２９） 前記ワクチン製剤を、投与当たり１０μｇ〜１０００μｇを有する水溶液で、ＡＤの危険性があるか又はＡＤである患者に投与する上記のいずれかの方法。また、許容可能なのは、投与当たり１００〜７５０μｇ又は投与当たり３００μｇである。３００μｇは、臨床試験で効能よく用いられるターゲットの投与量とすることができる。
（３０） 投与は、３カ月毎に１回及び／又は６カ月毎に１回及び／又は１２カ月毎に１回とすることができる。
（３１） 投与は、抗体力価に基づいてワクチン投与の頻回を決定することができる。
（３２） 患者はアルツハイマー病が進行する危険性があり、さらに、患者は、軽度認知障害がある患者、アルツハイマー病に関連する公知の遺伝子型を有する患者、２１トリソミーを有する患者、及びアルツハイマー病の危険性を示す代替マーカーを有する患者からなる群から選ばれる上記のいずれかの方法。
（３３） アルツハイマー病に関連する公知の遺伝子型を有する患者がＡｐｏＥ４遺伝子型を有する患者を有する上記のいずれかの方法。
（３４） （ａ）のＡβペプチド免疫原構築物及びその組合せを有するワクチン製剤を、０週、４週及び１２週に３回投与による初回刺激のために、投与当たり３００μｇ／０．５ｍＬで投与する上記のいずれかの方法。
（３５） ワクチン製剤を、３カ月毎に約１回、その後６カ月毎に１回、及びその後１２カ月毎に１回、投与する上記のいずれかの方法。
（３６） 以前にワクチン製剤の接種を受けた患者の血液由来のＢ細胞を、ＡＤの予防及び処置のためにＡβペプチドのＮ末端をターゲットとするヒトモノクローナル抗体の調製及び選択に用いる上記のいずれかの方法。
（３７） 初期注射から０週、４週及び１２週で初期免疫化を提供し、ついで３カ月に１回、６カ月に１回、最も好ましくは１２カ月に１回、追加免疫化を行うことを有する対象者における免疫応答を誘発させる方法。
（３８） 投与は、投与当たり１０μｇ〜１０００μｇ、好ましくは１００μｇ〜７５０μｇ、より好ましくは投与当たり３００μｇで行うのがよい。
（３９） 上記の投与の経路は、当業界で公知の標準の経路、例えば筋肉内経路、皮下経路、経口などによるのがよい。
Ａβペプチド免疫原構築物ワクチン製剤として有用である医薬組成物は、Ａβペプチド免疫原構築物及び許容可能なデリバリビヒクル又はアジュバントを含み、該Ａβペプチド免疫原構築物は、
ａ）配列番号４９〜５１、５４、５５、及び５７〜６５；
ｂ）（ａ）のホモログ；
ｃ）（ａ）又は（ｂ）の抗原性及び免疫学的機能的類似体；
ｄ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換、アミノ酸付加、及び／又はアミノ酸欠失を有する（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）；
ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいかなる組合せ；
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有する。
ある特異な製剤において、Ａβペプチド免疫原構築物は、配列番号６２及び６３並びにそれらの混合物からなる群から選ばれる。
他の特異な製剤において、Ａβペプチド免疫原構築物は、配列番号６４及び６５並びにそれらの混合物からなる群から選ばれる。
他の製剤は、特異な製剤の等モル比混合物をさらに含み、該Ａβペプチド免疫原構築物が配列番号６２及び６３からなる群から選ばれる。他の製剤は、特異な製剤の等モル比混合物をさらに含み、該Ａβペプチド免疫原構築物が配列番号６４及び６５からなる群から選ばれる。
ある特異な製剤において、配列番号６２及び６３（又は６４及び６５）の等モル比混合物の量は、投与当たり約１μｇ〜約１０００μｇである。
ある特異な製剤において、配列番号６２及び６３（又は６４及び６５）の等モル比混合物の量は、投与当たり約１００μｇ〜約７５０μｇである。
ある特異な製剤において、配列番号６２及び６３（又は６４及び６５）の等モル比混合物の量は、投与当たり約３００μｇである。
本発明のペプチド組成物の効能は、動物、例えばモルモット、ヒヒ、カニクイザル、又はヒトに、本発明のペプチドを有する免疫原性組成物で注射することによって確立することができる。表４、５、６、７及び８、並びに配列番号４８〜６５を参照のこと。液性免疫応答は、約１０〜約１４のアミノ酸残基であるＡβ１−４２ペプチドのＮ末端フラグメントに向けられている。用いた手順の詳細な記述は、実施例で提供する。
以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を限定するために用いられるべきでない。
実施例１
アミロイドベータ（Ａβ）関連ペプチドの合成
効能ある標的のＡβワクチンの設計及び製剤を目的とする開発の試みに含まれるデザイナーＡβ関連ペプチド構築物を合成する方法を記載する。ペプチドは、研究室のパイロット試験及び現場での試験に有用である少量で合成できるだけでなく、ワクチン製剤及び血清学的アッセイの工業的商業生産のために有用である大量（キログラム）でも合成できる。
長さが約１０〜４０個のアミノ酸の配列を持つ、豊富なＡβ関連抗原性ペプチドのレパートリーを、効能あるＡＤワクチン中で使用する最適のペプチド構築物をスクリーニング及び選択するために、設計した。各種の血清学的アッセイにおけるエピトープマッピングに使用される代表的なＡβ１−４０、Ａβ１−４２ペプチド、Ｎ末端ＡβペプチドフラグメントＡβ１−２８、Ａβ１−１４、Ａβ１−１０、Ａβ１５−４２、及び１０アミノ酸長のペプチドを表１（配列番号１〜３２）で特定する。Ａβペプチドフラグメント（Ａβ１−１０〜Ａβ１−１４）を含有する各構築物は、病原タンパク質（麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ）及びＢ型肝炎表面抗原タンパク質（ＨＢｓＡｇ）を含む）に由来する慎重に設計されたヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープに合成的に結合し、表２（配列番号３３〜４７）に、そのそれぞれのＡβペプチド免疫原構築物の免疫原性を増強するための、単一配列（配列番号３３〜４１、４６、４７）又はコンビナトリアルライブラリー（配列番号４２〜４５）のいずれかを特定する。１００を超えるペプチド構築物から選ばれた１８個の代表的なＡβペプチド免疫原構築物を表３（配列番号４８〜６５）で特定する。
抗Ａβ抗体の検出及び／又は測定のための免疫原性試験又は関連する血清学的試験で使用する全てのペプチドは、ペプチド合成機（アプライド・バイオシステムズ、４３０Ａ、４３１及び／又は４３３モデル）によるＦｍｏｃ化学を使用して少量で合成した。Ｎ末端のＦｍｏｃ保護及び三官能アミノ酸の側鎖保護基を有する固相担体上で、独立して合成することによって、各ペプチドを製造した。完成したペプチドを固体担体から切断し、側鎖保護基を９０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって除去した。合成ペプチド調製物を、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計によって評価し、正確なアミノ酸含量を決定した。各合成ペプチドを逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によっても評価し、合成プロファイル及び調製物の濃度を確認した。
合成プロセスの微細な制御（カップリング効率の逐次モニタリングを含む）にもかかわらず、アミノ酸の挿入、欠失、置換、及び早期終了を含む、伸長サイクル中の意図しない現象が原因でペプチド類似体も生成した。したがって、合成された調製物は、典型的には、標的ペプチドと共に多数のペプチド類似体を含んでいた。このような意図しないペプチド類似体を含んでいたにもかかわらず、得られた合成されたペプチド調製物は、免疫診断（抗体捕捉抗原として）及びワクチン投与（ペプチド免疫原として）を含む、免疫学的応用における使用に適していた。典型的には、意図的に設計したか、又は合成プロセスを通じて副生物の混合物として生じたかの、いずれかによるこのようなペプチド類似体は、これらのペプチドを使用する最終製品の再現性及び有効性を保証するような、製造方法及び製品の評価方法の両方を監視するための識別力のあるＱＣ手法が開発される限り、所望のペプチドの精製調製物と同様にしばしば有効である。数百グラムからキログラム量での大量のペプチド合成は、１５ミリモル〜５０ミリモルスケールで、特別注文の自動ペプチド合成機ＵＢＩ２００３で行った。
臨床試験用の最終ワクチン製剤で使用される有効成分として、Ａβペプチド構築物を、浅い濃度勾配下の分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計、アミノ酸分析及びＲＰ−ＨＰＬＣによって、純度及び同一性を特徴付けた。
実施例２
血清学的アッセイ及び試薬
合成ペプチド構築物及びその製剤の機能的免疫原性を評価するための血清学的アッセイ及び試薬を以下に詳述する。
ａ．抗体の特異性分析のための、Ａβ １−４２ 、Ａβ １−４０ 、Ａβ １−２８ 又はＡβ １−１４ ペプチドに基づくＥＬＩＳＡ試験
以下の実施例に記載の免疫血清試料を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイを開発した。次に説明する。
９６ウェルプレートのウェルを、２μｇ／ｍＬ（特に断りのない限り）標的ペプチド（Ａβ１−４２、Ａβ１−４０、Ａβ１−２８又はＡβ１−１４（配列番号１〜４））の１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３緩衝剤溶液（ｐＨ９．５（特に断りのない限り））１００μＬで、１時間、３７℃でそれぞれコートした。
ペプチドでコートしたウェルを３重量％ゼラチンのＰＢＳ溶液２５０μＬと共に培養して、３７℃で１時間、非特異的タンパク質の結合部位をブロックし、０．０５体積％ツウィーン（登録商標）２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、乾燥した。分析する血清を、２０体積％正常ヤギ血清、１重量％ゼラチン及び０．０５体積％ツウィーン（登録商標）２０を含有するＰＢＳで１：２０（特に断りのない限り）に希釈した。希釈試料（例えば、血清、血漿）１００マイクロリットル（１００μＬ）を各ウェルに添加し、３７℃で６０分間反応させた。
次いで、未結合の抗体を除去するために、ウェルを０．０５体積％ツウィーン（登録商標）２０のＰＢＳ溶液で６回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合化種（例えば、マウス、モルモット又はヒト）特異的ヤギ抗ＩｇＧを、陽性ウェル中で形成した抗体／ペプチド抗原複合体と結合する標識化トレーサーとして使用した。ペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗ＩｇＧ １００μＬを、予備滴定での最適希釈で、ＰＢＳ中０．０５体積％ツウィーン（登録商標）２０を有する１体積％正常ヤギ血清中、各ウェルに添加し、３７℃で更に３０分間培養した。ウェルを０．０５体積％ツウィーン（登録商標）２０のＰＢＳ溶液で６回洗浄して未結合抗体を除去し、０．０４重量％ ３’，３’，５’，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及び０．１２体積％過酸化水素のクエン酸ナトリウム緩衝剤溶液を含む基質混合物１００μＬと更に１５分間反応させた。この基質混合物は着色生成物を形成することによってペルオキシダーゼ標識を検出するのに用いた。１．０Ｍ Ｈ２ＳＯ４ １００μＬを添加して反応を停止し、４５０ｎｍ（Ａ４５０）での吸光度を測定した。ヒヒ及びマカクのＩｇ／ＩｇＧ検出のため、霊長類のＩｇＧに対して高い交差反応性を有するＨＲＰ複合化ヤギ抗ヒトＴｇＧ試薬をトレーサーとして使用した。試験中の患者からの臨床試料について、検証済のＥＬＩＳＡテストキットで最適に力価測定された、ＨＲＰ複合化タンパク質Ａ／Ｇ試薬を、血清の力価を決定するために使用した。各種Ａβペプチドワクチン製剤を接種したワクチン接種動物の抗体価を決定するために、１０倍段階希釈の１：１００〜１：１０，０００の血清を試験し、Ｌｏｇ１０で表される試験血清の力価を、カットオフＡ４５０を０．５に設定したＡ４５０の線形回帰分析によって計算した。
ｂ．担体タンパク質上のヘルパーＴ細胞エピトープ、特異的な担体タンパク質によるＴｈペプチド又はＴｈコンビナトリアルペプチドライブラリー、ＥＬＩＳＡ試験に基づくＴｈペプチド又はＴｈコンビナトリアルライブラリーに対する抗体反応性の評価
上述と同様のＥＬＩＳＡ及び上述と同様にして、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルを、２μｇ／ｍＬ（特に断りのない限り）ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）のような担体タンパク質、Ｔｈペプチド又はＴｈコンビナトリアルペプチドライブラリー（配列番号４４〜４７）の１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３緩衝剤溶液（ｐＨ９．５（特に断りのない限り））１００μＬで、１時間、３７℃でそれぞれコートした。各種Ａβペプチドワクチン製剤を接種したワクチン接種動物の抗体価を決定するために、１０倍段階希釈の１：１００〜１：１０，０００の血清を試験し、Ｌｏｇ１０で表される試験血清の力価を、カットオフＡ４５０を０．５に設定したＡ４５０の線形回帰分析によって計算した。
ｃ．Ｂ細胞エピトープクラスターの１０アミノ酸長ペプチドに基づくＥＬＩＳＡ試験による、Ａβ及びｈＡＰＰ（ヒトアミロイド前駆体タンパク質）に対する、微細な特異性分析及びエピトープマッピングの評価
免疫化した宿主又はワクチンにおける抗Ａβ抗体の微細な特異性分析をエピトープマッピングによって測定した。簡潔には、９６ウェルプレートのウェルを、０．５μｇ／０．１ｍＬ／ウェルのｈＡＰＰ１０アミノ酸長ペプチド（配列番号６、８〜３０）でそれぞれコートし、次いで、血清試料（ＰＢＳ中１：１００希釈）１００μＬを、上述の抗体ＥＬＩＳＡ法の重複する次の工程で、１０アミノ酸長のプレートウェル中で培養した。ワクチンのＢ細胞エピトープ、並びに免疫化した宿主におけるヒヒ、マカク及びヒト抗Ａβ抗体に関連する微細な特異性分析も、Ａβ１−１０ペプチド（ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ、配列番号６）、Ｎ末端での置換を有するＡβ改変合成ペプチド又は非関連コントロールペプチドで予備吸収し、次いで、更なる特異性確認のために抗Ａβ１−２８ＥＬＩＳＡ試験によって試験した。
ｄ．免疫原性の評価
ヒト被験者又は動物由来の免疫前血清試料及び免疫化血清試料を、実験ワクチン投与プロトコルに従って採取し、５６℃で３０分間加熱して血清の補体因子を不活性化した。ワクチン製剤の投与に続き、プロトコルに従って血液サンプルを入手し、特異的な標的部位に対するそれらの免疫原性を評価した。連続希釈した血清を試験し、陽性の力価を相互希釈のＬｏｇ１０として表した。特定のワクチン製剤の免疫原性を、所望のＢ細胞応答を増強するのに用いられる「ヘルパーＴ細胞エピトープ」に対する抗体の反応性を無視できるほど低く維持しながら、標的抗原内の所望のエピトープ特異性に対する高力価のＢ細胞抗体反応の誘発能によって評価する。
ｅ．血液及び脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＡβ関連ペプチド抗原を検出するための固相の酵素結合イムノアッセイ
高感度Ａβ１−４０イムノアッセイ（インビトロジェン（Invitrogen）（商標）、バイオソース（BioSource）（商標）Cytokines & Signaling、カマリロ、ＣＡ、米国）を使用して、キットの指示書に従って、カニクイザルの血清、血漿及びＣＳＦ中のＡβ１−４０濃度を測定した。Ａβ１−４２レベルは正常なカニクイザルでは検出限界以下であった。ｈＡＰＰ７５１遺伝子導入マウスの脳組織の血漿、ＣＳＦ及び化学抽出物中のＡβ１−４０及びＡβ１−４２レベルを、Ａβ１−４０及びＡβ１−４２イムノアッセイ（Genentics Company Inc.、チューリッヒ・シュリーレン、スイス）の指示書に従って測定した。軽度〜中程度アルツハイマー病の人の血漿中のＡβ１−４０レベルの定量化を、キット指示書（ヒトアミロイドβ（１−４０）アッセイキット、ＩＢＬ、２７７１４）に従って測定した。ヒト血漿中のＡβ１−４２レベルは検出限界以下であった。
実施例３
免疫組織化学的分析
正常成人ヒト組織（PhenoPath Laboratories Inc.社、シアトル、ＷＡ、米国）及びアルツハイマー病症例の脳標本（Dr.Felicia Gaskin、バージニア大学、バージニア、シャーロッツビル、ＶＡ、米国）を、死後及び／又は外科病理標本から入手した。カニクイザル組織標本（Beijing Jo-Inn New Drug Research Center、北京、中国）及びｈＡＰＰ遺伝子導入マウスの脳標本（JSW-Rearch GmbH、グラーツ、オーストリア）を剖検にて入手した。組織は、液体窒素中でスナップ凍結、冷ＯＣＴ包埋化合物中に浸漬及び凍結切片のいずれかであるか、或いはホルマリン固定、パラフィン包埋及び標準的な手法によって調製した切片であった。
凍結保存組織切片の間接的免疫蛍光分析を、モルモット、ｈＡＰＰ遺伝子導入マウス、ヒヒ及びマカクの、免疫前及び過免疫の血清又は精製ＩｇＧを用いて、又は市販のマウスモノクローナル抗体と蛍光色素との複合化二次抗体を用いて、行った。アビジン−ビオチンが増強された市販キットを使用する間接的免疫ペルオキシダーゼ染色を、精製モルモット抗ＡβＩｇＧを使用する正常成体組織の凍結保存組織切片に、又は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８（Ｔリンパ球分画）、ＣＤ１１ｂ（マイクログリア細胞活性化マーカー）、ＧＦＡＰ（アストロサイト）及び特異的Ａβエピトープを検出する市販のモノクローナル抗体を使用するコントロール及びＵＢＩ ＡＤワクチン（ＵＢ−３１１）で処置したマカクの脳切片に、行った。標準的な病理学検査室の手順に従って免疫組織化学的分析を行った。
実施例４
リンパ球増殖及びサイトカイン産生に対するＴ細胞機能アッセイ
Ｔ細胞の活性化を評価するためのリンパ球増殖及びサイトカイン産生を含むＴ細胞機能アッセイの手順を以下に詳述する。
ａ．末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離、凍結及び解凍
ヘパリン処置血液を採取し、ＰＢＭＣをフィコール−ハイパーク（Ficoll-Hypaque）密度勾配遠心分離によって単離した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄後、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したＲＰＭＩ１６４０からなる細胞培地でＰＢＭＣを再懸濁した。いくつかの実験では、単離ＰＢＭＣを凍結し、液体Ｎ２中で保管し、続くインビトロでの培養のために解凍した。
ｂ．Ｔ細胞及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖アッセイ
ワクチン接種した動物のＰＢＭＣを、選択したワクチン免疫組成物１０．０μｇの存在下、２４ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ）のそれぞれのウェルに２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬで培養した。抗原を刺激しないＰＢＭＣのみを含有するネガティブコントロールの培養物も培養した。全ての培養物を５．０％ＣＯ２インキュベータ中３７℃で３日間保った。培養開始から３日後、上清を採取し、上記の定量アッセイを使用してそれぞれのサイトカインを測定した。
ヒヒ及びカニクイザル由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をフィコール−ハイパーク勾配遠心分離によって単離した。ペプチド誘発増殖及びサイトカイン産生のために、細胞（２×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル）を、それのみで又はそれぞれのペプチドドメイン（Ａβ１−４２、Ａβ１−１４、Ａβ１５−４２、Ｔｈペプチド、及びネガティブコントロールとして非関連ペプチドを含む）を添加して、培養した。マイトジェン（Mitogen）（ＰＨＡ、ＰＷＭ、Ｃｏｎ Ａ）をポジティブコントロールとして使用した。６日目に、３Ｈ−チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ）１μＣｉを、３つの各複製細胞培養ウェルに添加した。１８時間培養後、細胞を採取し、３Ｈ−ＴｄＲ取り込みを測定した。刺激指数（Ｓ．Ｉ．）は、抗原存在下の１分当たりのカウント（ｃｐｍ）を抗原不存在下のｃｐｍで割ったものを表し；Ｓ．Ｉ．が＞３．０は有意であると考えられる。
ｃ．ＵＢＩ ＡＤワクチンでの免疫前後のＰＢＭＣ培養物によって産生するサイトカインの評価
カニクイザルのＰＭＢＣ培養物のサイトカイン分析（ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ）を、培地のみ、又は各種Ａβペプチドドメイン又はマイトジェン存在下のアリコートで行った。サル特異的サイトカインサンドイッチＥＬＩＳＡ試験キット（U-CyTech Biosciences社、ユトレヒト、オランダ）を使用して、キットの指示書に従ってそれぞれのサイトカイン濃度を測定した。
実施例５
安全性、免疫原性、毒性及び有効性研究で使用した動物
モルモット：免疫原性試験は、成熟した無感作の、成体の雄性及び雌性ダンカン−ハートレー系モルモット（３００〜３５０ｇ／ＢＷ）で実施した。実験は１群当たり少なくとも３頭のモルモットを用いた。ダンカン−ハートレー系モルモット（８〜１２週齢；Covance Research Laboratories、デンバー、ＰＡ、米国）が関わるプロトコルを、ＩＡＣＵＣ申請の承認の下、契約した動物施設だけでなく、スポンサーのＵＢＩにおいても行った。
アヌビスヒヒ：成体の雄性ヒヒ（Papio anubis、８〜１０歳齢；オクラホマ大学ヘルス・サイエンス・センター、オクラホマシティ、ＯＫ、米国）における免疫原性試験を、ＩＡＣＵＣ申請の承認の下、契約した動物施設だけでなく、スポンサーのＵＢＩにおいても実施した。
カニクイザル：成体の雄性及び雌性サル（Macaca fascicularis、約４歳齢；Beijing Jo-Inn New Drug Research Center、北京、中国）における免疫原性及び反復投与毒性の研究を、ＩＡＣＵＣ申請の承認の下、契約した動物施設だけでなく、スポンサーのＵＢＩにおいても実施した。
ｈＡＰＰ７５１遺伝子導入マウス：若齢のｈＡＰＰ７５１遺伝子導入（ｔｇ＋）マウス及びその同腹仔（１４±２週齢）における免疫原性及び有効性研究を、アルツハイマー病の予防モデルで使用し、老齢のｔｇ＋マウス及びその同腹仔（５２±２週齢）を治療モデルで使用した。両研究は、ＩＡＣＵＣ申請の承認の下、契約した動物施設（ＪＳＷ−リサーチ社、グラーツ、オーストリア）だけでなく、スポンサーのＵＢＩにおいても実施した。
ｈＡＰＰ７５１ｔｇ＋マウスは、マウスのＴｈｙ−１プロモーターの調節管理の下、ロンドン（Ｖ７１７Ｉ）及びスウェーデンＫ６７０Ｍ／Ｎ６７１Ｌ）の二重変異を含むヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）を構造的に過剰発現する（Rockenstein Eら、1995及び2001）。Ａβ１−４２沈着は、前頭皮質中に成熟したプラークの出現を伴って、早ければ３〜４月齢で生じ、５〜７月齢になると、プラーク形成はｈＡＰＰ７５１ｔｇ＋マウスの海馬、視床及び嗅部に広がる。１６週にわたる筋肉へのワクチン投与の効果は、血清のＥＬＩＳＡアッセイによる抗体反応、脳のアミロイド沈着及び脳のプラーク負荷、並びに、免疫染色及び生化学的抽出により、脳内の細胞反応性（例えば、Ｔ細胞の浸潤、ミクログリア細胞の活性化）のレベル上昇の証拠を観察した。
免疫前に、この実施例で上記した方法に従って、それぞれの動物の血清及び／又は血漿試料について、Ａβ標的ペプチドの存在を試験した。各動物は、種及びプロトコルに応じて、ワクチン製剤の１投与当たりのＡβ標的ペプチド構築物で免疫化した。
実施例６
モルモット及びヒヒに対するＡβペプチド構築物の免疫原性の初回順位のための一般的なワクチン製剤
各実験で用いる医薬組成物及びワクチン製剤を下記の実施例においてより詳述する。簡潔には、各研究群で特定した製剤は、通常、異なる型のスペーサー（例えば、εＫ又はペプチド構築物の溶解度を向上するＫＫＫを有するεＫ）、並びにデザイナーペプチド構築物のＮ末端で結合したＡβペプチドフラグメントを有する麻疹ウイルス融合タンパク質及びＢ型肝炎表面抗原に由来する人工ヘルパーＴエピトープの２つのセットを含有する非特異的（promiscuous）ヘルパーＴ細胞エピトープの変異体を介して結合するＡβペプチドのフラグメントを有する、全ての型のデザイナーＡβペプチド構築物を含有する。１００を超えるデザイナーＡβペプチド構築物は、全長Ａβ１−４２に対するそれらの相対的な免疫原性を最初にモルモットで評価し、更にＡＤ患者の脳切片からの天然プラークとのそれらの交差反応性を評価した。Ａβペプチド構築物を、特定のペプチド構築物の様々な量で、鉱物塩又はアルハイドロゲル（Alhydrogel）（アラム）と混合した、ヒトワクチン用に承認された油としてセピック・モンタニド（Seppic Montanide）（商標）ＩＳＡ５１を有する油中水型乳剤に調製した。ワクチンは、通常、Ａβペプチド構築物を水に約２０〜８００μｇ／ｍＬで溶解することによって調製し、モンタニド（商標）ＩＳＡ５１で油中水型乳剤（体積で１：１）に、又は鉱物塩若しくはアルハイドロゲル（Alhydrogel）（アラム）（体積で１：１）と共に製剤化した。ワクチン製剤を室温で約３０分間保ち、免疫前に約１０〜１５秒間ボルテックスによって混合した。
数体の動物は、特定のワクチン製剤で２〜３回の投与で免疫化し、筋肉内経路で、時間０（抗原刺激）及び３週後に初回免疫（ｗｐｉ）（追加免疫）を、２回目の追加免疫として任意に５又は６ｗｐｉに投与した。これらの免疫化した動物を、次いで、ワクチン製剤中に存在する各種合成Ａβペプチド免疫原の免疫原性、並びにＡβ１−２８及び全長Ａβ１−４２とのそれらの交差反応性を評価するために試験した。免疫プロトコルによって指示されるような特定の期間にわたる投与計画で、モルモットの一次スクリーニングにおいて強力な免疫原性を有するＡβペプチド免疫原を、次いで油中水型乳剤、鉱物塩及びアラム系製剤の両方をヒヒにおいて更に試験し、この種はヒトと類似の免疫応答プロファイルを持つように較正した。
新薬臨床試験開始届の提出及びアルツハイマー病患者に対する臨床試験のための準備として、ＧＬＰに沿った前臨床研究における免疫原性、持続性、毒性及び有効性研究用の最終ワクチン製剤に組み込まれる前に、最も有望なＡβペプチド免疫原候補のみを更に広く評価した。
実施例７
アルツハイマー型認知症の予防及び処置のための、Ａβ１−１４ペプチド免疫原構築物を組み込む多成分ワクチン製剤の設計原理、スクリーニング、同定及び最適化
設計の歴史：各ワクチン又は免疫療法製品は、特定の疾患の機構及び治療介入に必要な標的タンパク質に基づく独自設計の焦点とアプローチが必要である。後に設計がモデル化された標的は、疾患経路に関与する細胞タンパク質又は病原体の幾つかのタンパク質が関与してよい感染因子を含むことができる。研究から商業化へのプロセスは、達成までに典型的には１０年以上を必要とする非常に長いプロセスである。
標的分子が選ばれると、血清学的検証の広範なプロセスが必要になる。標的分子内のＢ細胞及びＴ細胞エピトープの同定及び分布は分子ワクチン設計に重要である。標的Ｂ細胞が認識されると、小動物における継続的なパイロット免疫原性試験が行われ、デザイナーペプチドのワクチン製剤によって誘発される抗体の機能的特性を評価する。次いで、ワクチン免疫原性及び誘発した抗体の機能的特性をさらに検証するために、標的の種の動物でこのような血清学的適用を行う。評価用に免疫化した宿主から採取した血清を用いる複数の並行群で全ての研究を実施する。ヒトワクチンの場合での標的の種又は非ヒト霊長類に対する初期の免疫原性試験も実施して、免疫原性及び設計の方向性をさらに検証する。次いで、混合物を変えて標的ペプチドを調製し、それぞれの製剤設計で調製した組み合わせで使用する場合の、ペプチド構築物の中でのそれぞれの相互作用に関する機能的特性におけるわずかな相違を評価する。更なる評価の後、最終的なペプチド構築物、ペプチド組成物及びその製剤を、製剤のそれぞれの物理的パラメータと共に確立し、最終製品開発プロセスに至る。
幅広い設計経験は、図１に示す加速されたペースでの商業化に向けて、発見から次世代のワクチン製品の開発を可能にする。
ａ．アルツハイマー病患者を処置する可能性を有するワクチン製剤のための適切なＡβ １−１４ 由来ペプチド構築物の設計及び検証
本発明者によって開示された以前の発明（Wang CY、米国特許第６，９０６，１６９号（米国、ユナイテッド・バイオメディカル社、２００５）；Wang CY．、米国特許第７，９５１，９０９号（米国、ユナイテッド・バイオメディカル社、２００１）；Wang CY．、米国特許第８，２３２，３７３号（米国、ユナイテッド・バイオメディカル社、２０１２）に続くものとして、髄膜脳炎のような重篤な副作用を引き起こす、アルツハイマー病患者にしばしば存在するヘルパーＴエピトープ類似体を発現する配列のＣ末端ドメインが欠損したＡβ１−１４ペプチド上に沈着したＡβ分子からのＢ細胞エピトープの更なる改良物を、ワクチン製剤に組み込まれる設計中の標的Ｂ細胞エピトープとして選択した。
ワクチン製剤に組み込まれる最も潜在能力のあるペプチド構築物を得るために、麻疹ウイルス融合（ＭＶＦ）タンパク質配列又はＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質から更に設計された、各種の病原体又は人工ヘルパーＴエピトープに由来する、豊富な非特異的（promiscuous）ヘルパーＴエピトープのレパートリーを、モルモットに対する免疫原性試験にて作製した。表３（配列番号４８、５１〜６５）に示すように、１６個のＡβ１−１４由来ペプチド構築物の代表的な研究で、Ａβ１−１４ペプチドは、スペーサーとしてのεＫを介して、それぞれの非特異的（promiscuous）ヘルパーＴエピトープと結合した。ペプチド免疫原構築物をモンタニド（商標）ＩＳＡ５１油中水型乳剤で製剤化し、０ｗｐｉに抗原刺激、及び３ｗｐｉに追加免疫のために、標準化ＩＳＡ５１乳剤で１００μｇ／０．５ｍＬに調製したそれぞれのワクチン製剤を投与することによって、それらの免疫原性それぞれをモルモットで試験した。予備的な免疫原性分析で、Ａβ配列の１５〜２８番目のアミノ酸のペプチド配列の欠失が、Ａβ１−１４配列自身を非免疫原性にする（表４、群１〜３）、Ａβ１−４２のＣ末端におけるヘルパーＴ細胞エピトープの構造の特徴の存在を確認した。Ａβ１−１４ペプチドの免疫原性の免疫原性を復元及び増強するのに用いられるヘルパーＴエピトープの昇順での予備的な順位を、最も弱いペプチド構築物が最初に記載される表４に示す：ＭＶＦ（配列番号５１、５８、５９）及びＨＢｓＡｇ（配列番号６０）に由来する人工ヘルパーＴエピトープの間で順位付けすると、マンソン住血吸虫Ｔｈ（配列番号５６）＜破傷風菌１Ｔｈ（配列番号４８）＜百日咳菌Ｔｈ（配列番号５２）＜破傷風菌２Ｔｈ（配列番号５３）＜ジフテリアＴｈ（配列番号５４）＜コレラ毒素Ｔｈ（配列番号５７）を有する熱帯熱マラリア原虫Ｔｈ（配列番号５５）。Ａβ１−１４由来ペプチド構築物（配列番号５１）は、潜在能力あるペプチド免疫原構築物として（配列番号６１）に示す分枝状の４量体構造として設計することもできる。要約すると、上記免疫原性試験は、ＡＤ患者の老人斑の主要な生化学的成分である、全長Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端に対して抗体を誘発するための最終的なワクチン製剤の設計において使用される免疫原としての、特異的なＡβ１−１４由来構築物（配列番号５１、５７〜６１）の適合性を検証した。
ｂ．異なる非特異的（promiscuous）ヘルパーＴエピトープを有するＡβ １−１４ 由来構築物を用いることによるＭＨＣの広範囲化
多様な遺伝的背景の患者を処置するワクチンを設計する場合、多様な遺伝的背景を有する人口の範囲を最大にする設計とすることが重要である。したがって、そのような組合せのためにＡβ１−１４由来ペプチド免疫原構築物の相乗的な免疫原性効果を探索した。ＭＶＦ及びＨＢｓＡｇに由来する非特異的（promiscuous）ヘルパーＴエピトープは、このような免疫原性の増強を提供するための最も潜在能力あるものの中の代表であるので、これら２つのヘルパーＴエピトープを含むペプチド構築物の組み合わせをこのような探索のために設計した。ＭＶＦ及びＨＢｓＡｇ（配列番号４４及び４５）両方のためのヘルパーＴエピトープのコンビナトリアルライブラリーの形態を、表２に示すように、最大のＭＨＣ結合モチーフ範囲を考慮して、Ａβ１−１４由来構築物（配列番号６２及び６３）に対して設計し、それらは、個々に又は組み合わせて、続いて、１投与当たり１００μｇ／０．５ｍＬで抗原刺激（０ｗｐｉ）及び２回の追加免疫（３及び５ｗｐｉ）の予定で、モルモットに対する免疫原性を評価した。表５に示すように、２つの免疫原の等重量比混合物は、個々のペプチド構築物それぞれによって誘発されるものと比較して、かなりの免疫応答を誘発した。
ｃ．Ｂ細胞エピトープのみを標的することに集中し且つ明らかな免疫応答をもたらす、複数のＭＨＣ結合モチーフを有する慎重に選ばれたヘルパーＴエピトープと結合する標的のＢエピトープを組み込む簡便な免疫原の設計
Ｂエピトープ免疫原性を増強するために使用されるそれぞれのヘルパーＴエピトープを試験するために、初回免疫後８週（ｗｐｉ）の過免疫の血清を免疫化した宿主から採取した。同様に免疫化した宿主の過免疫の血清は、Ａβ１−１４ペプチドのＮ末端にシステイン残基を付加する化学的カップリングによって調製されたＫＬＨ結合Ａβ１−１４ペプチドの同様の抗原刺激及び追加免疫の免疫の予定によって得られた。表６から明らかなように、単独又は組み合わせのいずれかのデザイナーＡβ１−１４ペプチド免疫原構築物（配列番号６２及び６３）で免疫化した全ての宿主は、標的のＡβ１−４２の交差反応性に対する抗Ａβ１−１４抗体の交差反応性に所望の高い力価をもたらした一方、２つのヘルパーＴエピトープ（配列番号４４及び４５）に対しては、反応性はわずかであるか又は全く生じなかった。対照的に、Ａβ１−１４エピトープ（Ｌｏｇ１０力価が２．２〜３．９）に対する慣用の担体タンパク質ＫＬＨによって生じる相対的な免疫原性にもかかわらず、担体タンパク質ＫＬＨに対する非常に高い抗体反応が、非常に高い力価（ＧｅｏＭｅａｎのＬｏｇ１０力価が６．２）を有する全ての動物によって生じ、「標的Ｂ細胞エピトープ」に対して特異な「集中した」応答が、Ｂ細胞及びＴ細胞エピトープの構造及び機能の理解に基づいて、これらの合理的に設計されたペプチド免疫原構築物での免疫化の結果であるという以前の知見が再度検証された。
ｄ．ＩＳＡ５１油中水型乳剤中及びアラム中にＡβ １−１４ 構築物（配列番号６２及び６３）を様々な量で含むワクチン製剤の抗原刺激（０ｗｐｉ）及び追加免疫（３及び６ｗｐｉ）後のヒヒにおける免疫原性の評価
これらのＡβ１−１４ペプチド免疫原構築物によって誘発される抗体の機能的特性を調査する、さらなる開発事業に移行する前に、ヒトの試験で最も頻繁に使用される２つの異なる製剤にこれらのペプチド構築物（配列番号６２及び６３、等モル比）を様々な量で組み込んだワクチン製剤の相対的な免疫原性の評価をヒヒにおいて評価した。ヒヒは、尺度がヒトのものと最も似ている免疫応答を生じる動物種である。全てのワクチン製剤を、１投与当たり０．５ｍＬで動物に投与した。将来の使用のための本来の標的用量は１００μｇ／ｍＬであるので、この用量で３頭の動物に投与した。より弱いが最も頻繁に使用されるアジュバントであるアラムに対する、より潜在能力のあるＩＳＡ５１油中水型製剤の相対的な免疫原性の評価を、同じ１００μｇで行った。試験した油中水型乳剤系において、１投与当たり、２５μｇ、１００μｇ及び４００μｇで用量漸増試験を評価した。この試験の最初の観察では、１投与当たり０．５ｍＬ中１００μｇを与える同じペプチド免疫原含量を有するＩＳＡ油中水型乳剤の製剤と比較して、アラム系製剤では低下した免疫応答（１Ｌｏｇ１０以上の抗体価）が生じた。１投与当たり１００μｇが免疫化した宿主に対する将来のワクチン製剤投与のための本来の標的量であったが、表７に示すように、２５μｇから、１００μｇ、４００μｇそれぞれに投与量を増加すると、免疫応答の上昇が観察された。したがって、デザイナーＡβ１−１４ペプチド免疫原構築物（配列番号６２及び６３）又はそれらの類似体のペプチド免疫原構築物は、１００μｇを超える用量が更に検討されるだろう。
実施例８
アルツハイマー型認知症処置用の成功裡の免疫治療ワクチンの開発の基準
免疫治療ワクチンを開発するためのＵＢＩの戦略は、「自己」バリア、及び遺伝的多様性の制限、並びに安全な（Safe）、独特の（Unique）、特徴的な（Characterizable）、費用対効果の高い（Cost-effective）、有効で（Efficacious）、安定（Stable）且つスケーラブルな（Scalable）（造語としてのＳＵＣＣＥＳＳ）、最適なペプチド系ワクチン製剤の開発を克服するための基盤技術に基づく標的のＢ配列と結合する独占的所有権を有する非特異的（promiscuous）Ｔｈエピトープの設計を含む（Wang CYら、2005；Sokoll KK，2004）。特別な注意を初期設計段階に払うことで、このワクチンとしての規制当局の承認の観点から特徴付けられるワクチン製剤のためのプログラムの開発段階に入るであろうペプチド免疫原を選ぶことを可能にし、第ＩＩＩ相試験後に患者への効能が証明されたとき、これまでの人類の歴史において、数百万の用量基準で、患者に投与される最初の完全な合成ペプチド系ワクチンになるだろう。かなりの所望の免疫応答が生じることが既に証明された多くの中から選ばれたペプチドの品質設計への特別な注意が、細部にわたるとき、使用されるそれぞれのペプチドの「溶解性」、合成化学収率、及び配列設計に固有の精製ハードルに対してはらわれる。高い安全因子を有する十分に許容されるアジュバントもまた、多くの許容される選択の中で、考慮する重要な因子になるだろう。免疫原性の安全因子とスケール間のバランスを考慮しなければならない。また、免疫原性が安全因子によって妥協される場合、免疫応答をさらに高めるために、他のワクチン製剤のいかなる特徴をも組み込むことができる。再び、ワクチンの成功は、多様な遺伝的背景を有する、可能な限り多くの幅広い人口において、所望の免疫応答を生じるその能力に帰し、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）の幅広い範囲はまた、考慮における非常に重要な因子でなければならない。
Ａβ分子のＮ末端を標的とするＳＵＣＣＥＳＳワクチンを達成するための上記の考慮を踏まえると、コンビナトリアルライブラリーの形式におけるそれらのカウンターパートと比較して、コンビナトリアル形状の代わりに単一配列のペプチドが、それらの相対的に弱い免疫原性にもかかわらず選ばれるだろう。ヘルパーＴエピトープが増強する高度に強力な免疫原性は、通常、疎水性のアミノ酸残基の長い区間を有し、これは対応するペプチドを不溶性にする傾向があるので、ペプチドの溶解性もまた試験における重要な因子である。Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ及びＡｒｇのように高荷電の残基がペプチドの溶解性を高めるために特定の位置に付加されるか否かについて、特別な注意を払わなければならない。合成における高収率を達成するために、中間体の生成を伴う全ての合成プロセスに関する化学が広範囲に全て評価され、ワクチン製剤の重要な成分として想定されるであろう最終ペプチドの最適配列に到達した。免疫原性の面からの全ての高度に制限されたペプチド候補のバランスのよい考慮の後、ＭＶＦ系列のペプチド（配列番号６４）、及びＨＢｓＡｇ系列のペプチド（配列番号６５）を有する、２つのＡβ１−１４ペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）を選択し、ワクチン製剤の更なる探索のために更に分析した。
これらのペプチドを合成し、図２Ａ、２Ｂ、２Ｅに示すように高純度に精製した。浅い濃度勾配の逆相分析下、配列番号６５及び６４の両方のペプチドのＨＰＬＣプロファイルは、それぞれ２０分及び２１分の溶出時間を示した。これらの精製ペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、図２Ｃ及び２Ｄに示すように、両方とも高精度で、配列番号６５のペプチドが３８９２．２７４（理論値は３８９２．５２）、配列番号６４のペプチドが４３７４．５６８（理論値は４３７４．０４）の分子量を与えた。
双方共にＡβ１−１４の免疫原性を増強するのに用いられる配列番号４６及び４７の「Ｔｈ」ペプチドは、図３Ａ及び３Ｂに示すように、各種の集合においてそれらの結合モチーフを広く評価した。すべての患者の遺伝的背景の範囲を最大にするために、ワクチン設計に２つの非特異的ヘルパーＴエピトープを組み込むことが安全である。範囲の割合の分析から、このワクチンは、ワクチンを接種する患者全てではないが多くの人口、大規模な試験を正当化する重要因子及びワクチンの高い臨床的価値を拡大する開発努力をカバーする非常に合理的な機会を有するだろう。
投与の目標の一部として予防も含む多くの人口によって使用されるワクチン設計のために、安全性は考慮される別の重要因子になる。臨床試験における多くのワクチン製剤のためのヒトへの油中水型乳剤の使用にもかかわらず、アラムは、その数十年にわたる安全性試験によって、依然としてワクチン製剤での使用のための主要なアジュバントである。アラム又はその鉱物塩であるアジュホス（リン酸アルミニウム）を臨床適用のための調製物中でアジュバントとして使用することを検討した。
ａ．一定量の鉱物塩と共に高精製Ａβ １−１４ ペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）を様々な量で含むワクチン製剤の抗原刺激（０ｗｐｉ）及び追加免疫（３及び６ｗｐｉ）後のモルモットにおける免疫原性の評価
前臨床及び臨床試験用のＵＢＩ ＡＤワクチンの開発のための多くの免疫原候補の中から２つの高精製Ａβ１−１４ペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）を選択した後、これら２つのペプチドの等モル比混合物を、図４に示すように、モルモットに対する投薬研究において、一定量（０．５ｍＬ）のアラム／鉱物塩の存在下でそれらの免疫原性を試験した。上記の２つのＡβ１−１４ペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）を含むペプチド混合物の様々な量として、０．５ｍＬの鉱物塩（リン酸アルミニウム、アジュホス（Adjuphos））中、０μｇ、１０μｇ、３０μｇ、１００μｇ〜３００μｇを、２６週間にわたる免疫原性の観察を伴う０、３及び５ｗｐｉ（初回免疫後の週）の免疫の予定に基づき、モルモットで試験した。初回免疫後５週あたりの免疫応答のピークで、１投与当たり３００μｇを接種した動物は最も高い免疫応答を与え、１００μｇ及び３０μｇを接種したものと続き、次いで１０μｇ用量であり、続く２６週間を通じて同様の免疫応答の順位であった。したがって、０．５ｍＬアジュホス当たり３００μｇでの最高用量は免疫の最適条件であると考えられ、異なる種での他の関連する製剤において、免疫原性を研究するための手引きとして使用されるだろう。
ｂ．ペプチド及びオリゴヌクレオチド間の免疫刺激複合体（ＩＳＣ）の形成によってワクチン製剤の免疫原性を更に上昇させる手段
アジュバントとしてアラム又はその関連する鉱物塩の使用に内在する、関連するワクチン製剤の免疫原性は、それらの標的のＡβ１−１４Ｂ細胞エピトープの力価も約１Ｌｏｇ１０まで低下するだろう（実施例７における類似の研究から推測される）。したがって、ワクチン製剤の免疫原性を更に上昇させる手段を検討する。
より具体的には、図５Ａに示すＵＢＩ製剤において、安定化免疫刺激複合体（ＩＳＣ）はカチオン性ペプチド及びポリアニオン性ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）分子に由来する（上段）（Sokoll KK, 2004）。これは、電荷の静電中和によって駆動する自己組織化システムである。アニオン性オリゴマーに対するカチオン性ペプチドのモル電荷比の化学量論が会合の程度を決める。ペプチド免疫原及びＣｐＧ ＯＤＮの非共有結合的な静電会合は、完全に再現性のあるプロセスである。免疫系の「プロフェッショナル」抗原提示細胞（ＡＰＣ）への提示を促進するペプチド／ＣｐＧ ＯＤＮ免疫刺激複合体の凝集体は、これにより複合体の免疫原性を更に増強する。これらの複合体は、製造中の品質管理のために容易に特徴付けられる。ペプチド／ＣｐＧ ＩＳＣはインビボで十分に許容される。
次いで、図５Ｂの下段に示すように、免疫刺激複合体は、水性懸濁液を形成する鉱物／アルミニウム塩アジュバントと組み合わすことができる。
ＣｐＧモチーフは、樹状細胞（ｐＤＣ）及びＢ細胞のサブセットで見いだされるトール様受容体９（ＴＬＲ９）のアゴニストとして特徴付けられている。トール様受容体は、
細菌、ウイルス及び寄生虫のような一般的な外来性の侵入者の個々の分子パターンの特徴を認識する能力を持つ。具体的にはメチル化されていない、合成ＣｐＧ配列は、ＴＬＲ９に結合し、活性化することができる。潜在能力のあるＢ細胞のマイトジェンとして、ＴＬＲ９アゴニストは、強い抗体免疫応答を誘導するのに有効である。ＣｐＧの作用のメカニズムは、それらの中で、持続性の抗原特異的抗体の産生に関与する。
標的のＡβ１−４２凝集性ワクチンに対して患者の抗体が３０％しか誘発しない免疫原性、及び６％の患者に生じた髄膜脳炎様の副作用の両方で失敗したＡＮ１７９２（Ａβ１−４２ペプチドワクチン）の臨床試験の観点から、ＵＢＩ ＡＤワクチンのために本発明で使用するアルミニウム系アジュバントは、Ｔｈ−２型の免疫応答（即ち、ＩＬ−４及びＩＬ−５サイトカイン）を刺激することが知られている。また、Ａβペプチド免疫原構築物／ＣｐＧ ＯＤＮ免疫刺激複合体は粒子状である。粒子状の免疫原のプロセシングは、Ｔｈ−２型の応答の傾向があるＡＰＣによって促進される。
要約すると、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、幾つかのヒト臨床試験（＞１，０００の患者）において安全に（Safely）使用されている。ペプチド／ＣｐＧ ＯＤＮ由来免疫刺激複合体は容易に特徴付けられる（Characterized）。生理的条件下にて安定で（Stable）、インビボで十分に許容される。多数のペプチド免疫原に由来するＣｐＧ系複合体の単独又は鉱物塩との組み合わせは、最小限の有害事象の報告を伴って、マウス、モルモット、ブタ、イヌ、ウシ、ヒヒ及びマカクでの効能（Efficacious）が証明されている。アルミニウム系鉱物塩は、米国において現在承認されているワクチンに含有される唯一のアジュバントである。これらのアジュバントを使用するワクチン組成物は費用対効果が高く（Cost-effective）、スケール（Scale）効率も知られている。特定のワクチン／アジュバント製剤は、対アジュバント単独として承認される。ＵＢＩは独特の（Unique）組成物を探索し、開発してきた。認知症の処置のためのＵＢＩ ＡＤワクチンの上記した特徴はＳＵＣＣＥＳＳに向けての必要な全ての要素を持つ。
実施例９
筋肉内注射用のＵＢＩ ＡＤワクチン製剤
Ａβ１−１４−εＫ−ＫＫＫ−ＭｖＦ５ Ｔｈペプチド免疫原構築物（配列番号６４）及びＡβ１−１４−εＫ−ＨＢｓＡｇ３ Ｔｈペプチド免疫原構築物（配列番号６５）は、生理学的なｐＨにおいてカチオン性である。図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ（左側）は、２つのペプチド単独及び等モル比混合物のＨＰＬＣプロファイルを示す。図２Ｄ及び２Ｅ（右側）は、それぞれ分子量（Ｄａ）が３８９２及び４３７４の２つのペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって特徴付けられるプロファイルを示す。ポリアニオン性ＣｐＧ ＯＤＮの添加は、電荷の中和、溶液中での免疫刺激複合体（ＩＳＣ）の即時の「自己集合」を生じさせる。カチオン性ペプチド：アニオン性ＣｐＧのモル電荷比の化学量論が会合の程度を決める。ＵＢＩ ＡＤワクチンを段階的に調製した：おおよそ等しいＣｐＧ ＯＤＮに対するモル電荷比を有する、２つのＡβペプチド免疫原構築物の等モル混合物を用いて注射用水でＩＳＣを調製した。
ａ．アジュバントとしてアラム又はアジュホスの不存在下又は存在下でＣｐＧオリゴマーと免疫刺激複合体を形成する３００μｇ／０．５ｍＬの高精製Ａβ １−１４ ペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）を含むワクチン製剤の抗原刺激（０ｗｐｉ）及び追加免疫（３及び６ｗｐｉ）後のヒヒにおける、１０週にわたる免疫原性の評価
高精製Ａβ１−１４ペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）を用いるモルモットの免疫原性の初期レベル及び投薬研究に基づき、２つのＡβ１−１４ペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）を等モル比で含む混合物３００μｇを、上述のように、ＣｐＧオリゴマーを有する免疫刺激複合体として調製した。次いで、１０週にわたって特異的抗体レベルを観察する０、３、６週の免疫プロトコルに基づいて、筋肉注射用の１投与当たり３００μｇのペプチドをヒヒに免疫化するために、それらをアラム若しくはアジュホスのいずれかを有するか、又はアジュバントなしで製剤化した。この動物種は尺度が人のものと最も似ている免疫応答を生じるので、このような免疫原性評価及びヒト試験の導入前の最終製剤の評価のためにヒヒを使用した。全てのワクチン製剤を１群当たり２頭の動物で、１投与当たり０．５ｍＬで動物に与えた。図６に示すように、１投与当たり０．５ｍＬ中３００μｇにおいて、アジュバントとしてアラム若しくはアジュホスが存在するか又は不存在の３つの製剤全てが、Ａβ１−１４ペプチドに対するＥＬＩＳＡによって示すように、０．５Ｌｏｇ１０スケールの範囲内で約同等レベルの免疫原性を示した。ＩＳＣ製剤はペプチド単独によって発現する免疫原性を著しく増強させた。しかしながら、８〜１０週にわたる観察後、アジュホスによって支持されている製剤は、他の２群と比較して、応答スケールが０．５〜１Ｌｏｇ１０に拡大した、著しく高い免疫応答を維持していた（即ち、約３〜１０倍更に強力）。３つの密接に関連する製剤であって、アジュバントからの任意の複雑な要因がないように非常に集中し且つ所望の免疫応答を生じる高精製の合理的に設計されたペプチドを使用することによる高い安全因子であるように設計された製剤でヒヒの免疫原性をこのように慎重に較正することによって、ＵＢＩ ＡＤワクチン製剤は、以下の実施例に示すように、免疫原性、特異性、誘発抗体に関する機能的特性、急性及び慢性毒性、並びに最終的に臨床的有効性のための、霊長類及びヒトにおける更なる探索のために最終化される。
ｂ．免疫原性、急性毒性、慢性毒性、効能、及び臨床的安全性、忍容性及び効能研究用のＵＢＩ ＡＤワクチン製剤の調製
ＣｐＧ ＯＤＮに対するペプチドのおおよそ等しいモル電荷比でＣｐＧと更に混合した２つのＡβペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）の等モル比混合物を用いて、注射用水でＩＳＣを調製した。反対の電荷の静電中和を介するプロセスにおいて、ＵＢＩ ＡＤワクチン製剤中のＣｐＧ ＯＤＮはペプチド免疫原構築物と１００％結合し、ミクロンサイズの粒子の形成をもたらした。この粒子状形態により、ＣｐＧ アジュバントの通常の使用からＣｐＧ ＯＤＮの投与量を著しく低減すること、有害な自然免疫応答の可能性を低減すること、且つプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む代替の免疫原のプロセシング経路を促進することが可能となる。予め形成したＩＳＣに、アルミニウム鉱物塩、浸透圧のための生理的食塩水、及び保存剤を連続して添加した。アルミニウム鉱物塩のうち、リン酸アルミニウムを、免疫原性の更によい維持（sustenance）に対するヒヒの免疫原性試験の結果に基づき、アラムゲルに代えて、使用した。
ｃ．ＵＢＩ ＡＤワクチン製剤の安定性研究及び免疫原性試験
アジュバントとして２０％の過剰でリン酸アルミニウム（アジュホス）を有する１投与当たり０．５ｍＬ中３００μｇで調製したＵＢＩ ＡＤワクチン製剤を上述したように調製し、１ｍＬ無菌ガラスバイアルに充填し、２〜８℃で２年間保管した。安定性試験のプロトコルに従って試料を回収した。すべての物理的パラメータは品質管理（ＱＣ）規格に適合していた。Ａβ１−１４ペプチド免疫原構築物は、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）及びアジュホスアジュバントから脱複合化して、各ペプチド用の分析規格に従ってＨＰＬＣにより分析した。図２Ｃの左下側に示すように、２つのＡβ１−１４ペプチド免疫原構築物（配列番号６４及び６５）は、ＨＰＬＣ分析における予想溶出時間で、２つのペプチドそれぞれの等モル混合物であることが明らかになった。
モルモットにおける免疫原性試験のために、ＵＢＩ ＡＤワクチン製剤を含むバイアルを回収した。各６頭ずつ有する２群について、１つは１投与当たり３００μｇのワクチン群に０及び３ｗｐｉで投与し、他の群はプラセボワクチン製剤（即ち、２つのペプチド免疫原構築物を含まない同じ製剤）を投与し、試験した。図７に示すように、著しい免疫原性を、３ｗｐｉでの追加免疫後、５ｗｐｉまでに応答のピークに達する単回投与で、全ての動物で達成した。８ｗｐｉで採取した免疫血清は、免疫原性の増強を提供するのに用いられるそれぞれのＴｈペプチドとのそれらの反応性について更に試験した。表８に示すように、これら２つのＴｈペプチドの「免疫応答しない（Immunosilent）」性質を更に確認するために、任意の反応性がＴｈペプチドに対してわずかな場合、これにより、ＡβペプチドのＮ末端に独占的に向けられた非常に集中した免疫応答を可能にする。したがって、ＵＢＩ ＡＤワクチン製剤は、十分に特徴付けられていない生物学的材料を独占的に扱う歴史的なワクチン業界とは違って、設計したように集中した免疫応答を生じる、十分に定義された化学物質で構成され、モノクローナル抗体よりもより幅広い反応性を有し、これにより、通常のペプチド−担体複合型のワクチンよりも明らかに、有効性においてより効果的であるため、高い安全因子が得られる。
実施例１０
ＵＢＩ ＡＤワクチンの血清学的特異性及び安全性を評価するための、アルツハイマー病のヒトの脳の免疫組織化学染色
実施例７に記載の等モル比のＡβペプチド免疫原構築物（配列番号６２及び６３）で免疫化した群３及び群４のヒヒから過免疫の血清を精製ＩｇＧ分画として貯蔵し、ヒトＡＤ脳とのそれらの反応性を試験した。図８に示すように、大脳の血管及びアミロイドプラーク両方の染色は、過免疫血清からの精製ＩｇＧによって認められたが、免疫前の血清から同様のＩｇＧ分画からは認められなかった。Ａβ１−１４ペプチドでの免疫血清のプレインキュベーションは、脳の血管及びアミロイドプラーク両方との全ての免疫反応性を吸収するが、非関連ペプチドによっては吸収せず、Ａβペプチド免疫原構築物（配列番号６２及び６３）を有するワクチン製剤でのワクチン投与による免疫血清における抗Ａβ抗体の反応性の高い特異性を示す。
免疫前及び過免疫のモルモットＩｇＧを使用する別の免疫病理組織学研究を、特異性及び望ましくない抗体の自己反応性を監視するために、正常成人ヒト組織の凍結切片で行った。ヒト組織のパネル（Ｎ＝３２）を、ＵＢＩ ＡＤ 免疫治療ワクチンで免疫化したモルモットの精製抗Ａβ１−１４ＩｇＧでの免疫反応性についてスクリーニングし、同じ動物の免疫前の精製ＩｇＧと比較した。正常成体組織の切片で観察された免疫染色パターンをPhenoPath Laboratoriesの認定臨床病理学者によって検討した。幾つかの筋肉組織（例えば、子宮内膜）の弱い陽性免疫反応性を除き、試験した全ての成人ヒト組織は、３つの成体の脳検体の１つにおける老人斑に対する強い陽性反応性及び脊髄試料中の脳脊髄液の陽性の免疫染色以外は陰性であった。
実施例１１
成体ヒヒにおけるプロトタイプのＵＢＩ ＡＤワクチン製剤の免疫原性試験
プロトコルのパートＡにおいて、独占的所有権を有する免疫刺激複合体（ＩＳＣ）に複合化し、アルミニウム鉱物塩アジュバントで製剤化したＡβ１−１４ペプチド免疫原（１投与当たり３００μｇの全ペプチド）で、４頭の成体雄ヒヒを０、３及び６週に免疫化した。ＩＳＣ／鉱物塩製剤は強い抗Ａβ抗体反応を全ての動物にもたらした（図９Ａ）。有害な注射部位反応は認められなかった。
プロトコルのパートＢの目的は：（１）標的の臨床用量及び４倍の高用量で反復曝露による安全性及び注射部位の反応源性を監視すること、（２）用量漸増試験における免疫原性を監視すること、及び（３）リコール抗体反応の反応速度論を評価すること、であった。次いで、これらの動物を７２週間休薬した。暫定では、抗Ａβ抗体の血清レベルは１０〜１００倍まで減少していた。初回注射後７８及び８１週で（図９Ｂ）、４頭の動物に、動物番号５６４及び５６５に３００μｇのペプチド用量を、又は動物番号５５６及び５６１に１２００μｇの用量のいずれかのワクチンを投与した。リコール応答は４頭のヒヒ全てにおいて抗体価のピークを迅速に回復した。１０４週までに抗体価は減少し始め、１０４週での追加免疫投与によって、動物は再び力価のピークを回復した。血清の抗Ａβ抗体反応の反応速度論を、抗Ａβ１−２８ペプチドＥＬＩＳＡによって、０週、２週、５週、６週、８週、１０週、７８週、８１週、８４週、８８週、９２週、９６週、１００週、１０４週、１０７週及び１１１週で測定した。３００μｇ用量を接種した動物において注射部位反応は認められなかった。しかしながら、７８週のみ高用量（１２００μｇ）を接種したヒヒの注射部位に、幾らかの赤み及び炎症が認められ；この一過性の反応は１週間以内に完全に回復した。他の有害な事象及び安全性の懸念は、ヒヒを評価した２年を通じて報告されなかった。
実施例１２
抗Ａβ抗体による原線維形成の阻害及びＡβ１−４０が介する毒性からの保護のためのインビトロでの神経毒性アッセイ
神経毒性アッセイは、Solomon Bら（Proc Natl Acad Sci USA 1997;94:4109-4112）によって以前に記載されたように、ラット褐色細胞腫株ＰＣ−１２及びＡβ１−４０ペプチドの熟成溶液を使用した。ペプチド溶液は、コンゴレッドバインディング（Congo Red Binding）により、原線維の形成によって特徴付けられた。６日及び９日目に、Ａ５４０ｎｍで吸収を示す等量の染料と溶液を結合した。この観察は、有毒なＡβ１−４０凝集体の形成の証拠を提供し；９日の調製物をＰＣ−１２細胞に対する毒性について試験した。
ＰＣ−１２細胞を組織培養液中で増殖させ、アッセイ培地に懸濁し、９６ウェルの丸底組織培養プレートのウェルに、１００μＬ中５×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルで入れた。３７℃で培養したペプチド（即ち、凝集したＡβ１−４０）及び新たに調製したペプチド（即ち、非凝集）の毒性を、２５及び６．５μＭで繰り返し試験した。アッセイ培地のみのＰＣ−１２細胞をコントロールとした。プレートを、３７℃で４８時間、ＣＯ２インキュベータで培養した。細胞に対する毒性を、プロメガサイトトックス（Promega CytoTox）96（登録商標）細胞毒性アッセイによって測定した。溶解をＡ４９２ｎｍでの吸収によって測定し、結果を１００％溶解に対する細胞毒性の百分率として表した。
機能的免疫原性のためのＵＢＩ ＡＤワクチンのインビトロでの評価
ラット褐色細胞腫株ＰＣ−１２及び毒性を特徴付けるＡβ１−４０ペプチドの熟成溶液を使用する神経毒性アッセイを用いて、ＵＢＩ ＡＤワクチンの抗体反応の機能的効能を評価した。Ａβ１−４０ペプチドの熟成溶液を、動物の免疫プロトコルからのモルモット又はヒヒの抗Ａβ血清の存在中で１時間のプレインキュベーションに続いて、ＰＣ−１２細胞に対する毒性について、試験した。抗Ａβ血清を１：３０及び１：９０希釈で試験した。最終的な結果を、Ａβ１−４０原線維凝集の抑制割合及びＡβ１−４０原線維が媒介する細胞毒性からのＰＣ−１２細胞の保護割合として表した。両方の免疫実験の０週の予備免疫血清をコントロールとして含めた。５及び８週の免疫性のモルモット血清及びヒヒ血清の１：３０及び１：９０の両方の希釈液は、相当する希釈液の予備免疫血清の５〜１０％のバックグラウンド阻害と比較して、著しい阻害を提供し（それぞれ、５及び８週の両方で採血されたモルモット血清の１：３０及び１：９０の両方の希釈液で、５０〜７０％）；且つ原線維の阻害アッセイにおける免疫前のヒヒ血清の１５％のバックグラウンド阻害と比較して、著しい阻害を提供した（それぞれ、５及び８週の両方で採血されたヒヒ血清の１：３０及び１：９０の希釈液で、７５及び５０％）。同様に、モルモット及びヒヒの両方の予備免疫血清から得られたバックグラウンドの結果と比較して、６０〜８０％の範囲内でＡβ１−４０が媒介する毒性からのＰＣ−１２細胞の保護がこれらの条件で認められた。これらの結果から、ＵＢＩＴｈ（登録商標）アミロイドβペプチド免疫原での免疫化によって惹起される抗体のための有毒なＡβ１−４０ペプチドに対する機能的中和活性が確立される。
実施例１３
ｈＡＰＰ７５１を過剰発現する若齢の遺伝子導入マウスの脳試料における、脳形態学上の予防モード及びアミロイドβペプチド（Ａβ１−４２）濃度に対するＵＢＩ ＡＤワクチンの効果
我々は、スウェーデン及びロンドン変異を有するｈＡＰＰ７５１を過剰発現する若齢の遺伝子導入（ｔｇ＋）マウス並びにその非遺伝子導入（ｎｔｇ）同腹仔（Rockenstein EM.ら、1995及び2001）の脳試料における、脳形態学上の予防モード及びアミロイドβペプチド（Ａβ１−４２）濃度に対するＵＢＩ ＡＤワクチンの効果を評価した。
若齢の遺伝子導入（ｔｇ＋）マウスを〜１４週齢で、ＵＢＩ ＡＤワクチンで、予防モードで免疫化した。アミロイドプラークを測定するために脳組織を抗Ａβ１−４２抗体で免疫組織化学的に染色した場合、これらの応答性の若齢のｔｇ＋マウスの結果は、プラーク負荷が減少することがわかった。ワクチン接種した若齢のｔｇ＋マウスの脳組織を生化学的に抽出し、定量的アッセイによってＡβ１−４２レベルを評価した場合、若齢のｔｇ＋レスポンダーマウスの結果はＡβ沈着の減少を示した。これらのパラメータは両方とも、Ａβ１−４２負荷の減少がＵＢＩ ＡＤワクチンに対する抗体反応に相関することを示す。
更に、抗ＣＤ１１ｂ抗体を使用するミクログリア細胞の活性化及び抗ＣＤ３抗体を使用するＴ細胞の浸潤の相対パーセントの測定は、無処置のｔｇ＋コントロール動物と比較して、ＡＤワクチン処置の若齢のｔｇ＋動物の脳における免疫細胞活性化の増加の証拠がないことを明らかにした。
ａ．全体的な目的：
脳アミロイド沈着及び脳プラーク負荷、並びに血漿中のヒトアミロイドβペプチド（Ａβ１−４２）レベルに対する、１２〜１６週にわたるＵＢＩ ＡＤ免疫治療ワクチンの筋肉内ワクチン投与の効果を評価すること
遺伝子導入動物は、マウスのＴｈｙ−１プロモーターの調節管理の下、ロンドン（７１７）及びスウェーデン（６７０／６７１）変異を有するヒトアミロイド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）を恒常的に過剰発現する（Rockenstein EMら、1995及び2001）。Ａβ１−４２沈着は、前頭皮質中に成熟したプラークの出現を伴って、早ければ３〜４月齢で生じ、５〜７月齢になると、プラーク形成はｈＡＰＰ７５１ｔｇ＋マウスにおける海馬、視床及び嗅覚の流れ（stream）の皮質突起部に広がる。
ｂ．予防モードのためのプロトコルの概要
ｈＡＰＰ７５１遺伝子導入（ｔｇ＋）マウス及びそれらの非遺伝子導入（ｎｔｇ）同腹仔（１４＋２週齢）を選び、脳Ａβ沈着及び脳Ａβプラーク負荷に対するＵＢＩ ＡＤワクチンの効果を評価した。全部で３３頭のｔｇ＋マウス及び１０頭のｎｔｇマウスを４群に分けた：ｔｇ＋プラセボコントロールマウス（ｎ＝１０）にアジュバントのみを注射した；ｔｇ＋実験マウス（ｎ＝１３）にＵＢＩ ＡＤワクチン（１５０μＬ投与当たり９０μｇ）を注射した；無処置ｔｇ＋コントロールマウス（ｎ＝１０）；及び無処置ｎｔｇコントロールマウス（ｎ＝１０）。全部で３用量を０、３、１２週に投与し、追加用量を１６週に投与した。２５．５週にて、全てのマウスについて、モリスの水迷路試験によって空間学習を観察した。マウスを更に４週間追跡し、その後屠殺した。
ｃ．抗Ａβ １−２８ 抗体価の測定
全てのｔｇ＋及びｎｔｇマウスについて、０、３、６、９、１２、１６、１９、２２及び２９週に採血した。Ａβ１−２８ＥＬＩＳＡを使用して抗Ａβ１−２８抗体価を測定するために血清を分離した。プラセボ処置ｔｇ＋マウス及び無処置ｔｇ＋マウスでは抗Ａβ１−２８抗体価は検出不能であった。しかしながら、ＵＢＩ ＡＤワクチン注射を少なくとも２回受けた若齢のｔｇ＋マウスでは検出可能な抗体価を有していた。
ｄ．アミロイド沈着及びプラーク負荷の脳形態学及び分析
生存中の研究の最後にマウスを死なせ、マウスを生理的（０．９％）食塩水で経心的灌流し、脳を素早く取り出し、半切除し、更なる分析用に調製した。左半球を凍結し、後で以下の項目ｅで記載するようにして分析した。右半球は、新鮮な４％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液、ｐＨ７．４で１時間、浸漬固定した。次いで凍結保護用の１５％ショ糖溶液に半球を移した。翌日、脳をドライアイス上で凍結し、組織学的検査で使用するまで−８０℃で保管した。凍結切片（１０ｎｍ厚さ）をＨ＆Ｅで染色し、記録し、神経細胞層の完全性及び肉眼で形態を評価した。モノクローナル抗体４Ｇ８（抗Ａβ１７−２４）を用いてクライオカット（cryocut）組織切片を評価し、皮質及び海馬におけるＡβ沈着及びプラーク負荷を測定した。プラーク数及びプラークで覆われた面積を定量化し、各動物の矢状の脳を横断する５つの異なる層からの９組織切片の平均値を、動物について統計的に関連する値で構築した。ＵＢＩ ＡＤワクチン処置群の７頭のｔｇ＋マウス、及び無処置コントロール群の７頭のｔｇ＋マウスを評価した。結果を、ＵＢＩ ＡＤワクチン処置（ｎ＝７）対無処置（ｎ＝７）動物のＡβ１−２８プラーク負荷のパーセントとして表し（図１０Ａ、１０Ｂ）、免疫組織化学的検査による９組織切片で検出された相対的なプラーク負荷の平均を表す。ＵＢＩ ＡＤワクチンレスポンダーｔｇ＋マウス対無処置動物の比較は、大脳皮質（０．２２％対０．３２％）及び海馬（０．２０％対０．２９％）も含み；プラーク負荷の平均の減少が、高度に応答性のワクチン処置動物で示された。
ｅ．脳組織の生化学的分画によるＡβ １−４２ の測定
動物を死なせ、以下の項目で記載するようにして脳を準備した。左脳半球を別々に凍結し、その後、４つの脳抽出物の可溶性分画について、ジェネティクス社（スイス）によって製造されている抗原検出用の高感度Ａβ１−４２ＥＬＩＳＡキットを使用してＡβ１−４２ペプチドレベルを評価し；製造者から提供されている標準と比較してＡβ１−４２レベルを測定した。４つの脳の分画から得られた結果は「ｎｇ／ｇ ｗｅｔ脳」として示す。各動物の左脳半球（嗅球を含む）を特徴付けるためにＴＲＩＳ緩衝食塩水（ＴＢＳ）、トリトンＸ−１００界面活性剤、ＳＤＳ界面活性剤及びギ酸（ＦＡ）で抽出し、Ａβ１−４２及び分画の評価を繰り返して試験した。簡潔には、ＴＢＳ抽出物は脳組織の水溶性Ａβ１−４０及びＡβ１−４２分画を含有する。残存するβアミロイドペプチドを溶解するために、界面活性剤及び酸が必要である。トリトンＸ−１００は、２つの性質を有するオリゴ−エチレングリコール誘導体であり；ベンゼン環を有するイソオクチル残基が無極性のファンデルワールス力を破壊し、且つ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−残基の繰り返しが水素結合を分解する。ＳＤＳは類似する二面の効果を持つが、それは強く、全体の二次構造を破壊し；Ａβペプチドは直鎖状を獲得し、ペプチド鎖が伸ばされるだろう。ギ酸は最強の溶媒で、主に水素結合を破壊する。ＴＢＳがオリゴマー構造を可溶化することが推測できる。トリトンはプロトフィブリル様の低分子ポリマーを可溶化する。ＳＤＳは残存する構造の全体を破壊し、強く複合化した不溶性の原線維を有する残存部分は、ＦＡ中で主にモノマーとして分離できる。したがって、ベータアミロイドの重合状態及び抗アミロイド生成性の試験化合物の効果を評価するために、４分画全てを調査する。
ワクチン処置（ＵＢＩ ＡＤワクチン）レスポンダーｔｇ＋マウスが抗Ａβ抗体反応するか否かのＡβ定量的ＥＬＩＳＡ及び生化学的抽出試験は、無処置ｔｇ＋マウスと比較して、減少したＡβ負荷と関連する。特に注目すべきは、脳組織の４つの生化学的抽出物それぞれのＡβ１−４２レベルを無処置ｔｇ＋コントロール動物（図１１Ａ、１１Ｂ）の結果と比較して、ＵＢＩ ＡＤワクチンレスポンダーｔｇ＋マウスにおけるＡβ１−４２の全体的なレベルの減少である。
ｆ．ミクログリア細胞の活性化の測定
クライオカット組織切片について、ＣＤ１１ｂ抗体を使用して活性化ミクログリア細胞を評価し；対象の平均サイズを、ミクログリア細胞のクラスターの平均測定値として各切片中の対象の数による面積を指数として評価し；各動物の矢状の脳を横断する５つの異なる層からの９切片の平均値を、動物について統計的に関連する値で構築した。
ワクチン処置ｔｇ＋マウス（ｎ＝７）対無処置ｔｇ＋マウス（ｎ＝７）の結果を、大脳皮質及び海馬中の染色されたＣＤ１１ｂ陽性細胞の面積の割合として表し、無処置ｔｇ＋コントロール動物と比較して、処置動物は染色面積の低い平均割合を示した。これらの結果は、無処置の遺伝子導入マウスと比較して、ワクチン処置動物は活性化ミクログリア細胞の数の増加を示さないことを示す。
ｇ．脳組織におけるＴ細胞浸潤の測定
クライオカット組織切片を評価して、大脳皮質、海馬及び血管内のＴ細胞の数を検出し、細胞の計数のみ行った。各動物の矢状の脳を横断する５つの異なる層からの９組織切片の平均値を、動物について統計的に関連する値で構築した。ワクチン処置ｔｇ＋マウス（ｎ＝７）対無処置ｔｇ＋コントロールマウス（ｎ＝７）の結果を、大脳皮質及び海馬中の染色されたＣＤ３陽性Ｔ細胞数として表し、血管内の染色されたＴ細胞数は、無処置ｔｇ＋コントロール動物と比較して、ワクチン処置動物が大脳皮質、海馬及び血管中で計数された免疫染色Ｔ細胞の平均数のわずかな減少を示すことを示す。
ｈ．結論
ｈＡＰＰ７５１遺伝子導入マウスに、１６週間にわたって、ＵＢＩ ＡＤワクチン又はプラセボワクチンを筋肉内経路により３又は４回注射した。動物はＵＢＩ ＡＤワクチンに対して全体的に良好な忍容性を示し、特に、これら動物に対してＵＢＩ Ａβ１−１４ペプチド免疫原構築物が１投与当たり９０μｇ／１５０μＬの高濃度での投与が考慮された。レスポンダーにおいて、これら動物の４脳組織抽出物においてＡβプラーク負荷の減少及びＡβ１−４２レベルの減少が見出された。Ａβ沈着及びプラークの減少も免疫組織化学的検査により示された。ワクチン処置ｔｇ＋ｈＡＰＰ７５１マウスの脳内のミクログリア細胞の活性化又はＴ細胞の浸潤の証拠は存在しなかった。
実施例１４
安全性のためのＵＢＩ ＡＤ ワクチンに対する抗体反応のエピトープマッピング
固相抗原としてＡβ１−１４（配列番号４）、Ａβ１−２８（配列番号３）、Ａβ１７−４２（配列番号６７）、ＭｖＦ５ Ｔｈ（配列番号４６）、ＨＢｓＡｇ３ Ｔｈ（配列番号４７）ペプチドでコートしたプレートを用いるＥＬＩＳＡ試験で、免疫化したモルモット及びヒヒの血清中のＵＢＩ ＡＤワクチンに対する抗体反応の特異性を評価した。ワクチンによって惹起された高力価の抗Ａβ抗体がＡβ１−１４及びＡβ１−２８抗原で検出され（表１）；しかしながら、Ａβ１−２８ペプチドについて、潜在的に有害な交差反応性の原因である１４アミノ酸を超える「Ｂ細胞エピトープ伝播」による追加抗体も検出されたことが懸念された。
この懸念に立ち向かうために、過免疫のモルモットの抗血清及び過免疫のヒヒの抗血清をＥＬＩＳＡによるＡβ１７−４２ペプチドでも試験した。ＥＬＩＳＡ力価から、試験した過免疫の試料においてエピトープ伝播が検出されなかったことがわかる。過免疫の血清は、Ａβ１−２８ペプチドへの増強された結合を示したが、Ａβ１７−４２とは反応しなかった。過免疫の血清はＭｖＦ５ Ｔｈ（配列番号４６）又はＨＢｓＡｇ３ Ｔｈ（配列番号４７）ペプチドドメインのいずれとも反応しなかった。標的領域内の特定の残基に対する主な抗体結合部位を局在化させるための微細エピトープマッピング法において、２４番目が重複する１０アミノ酸長ペプチドをＡβ１−１４ペプチド配列のＮ末端アスパラギン酸残基「Ｄ」及びヒトアミロイドβペプチド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）の隣接領域の周囲に合成し、Ａβ１−１４に加えて隣接するｈＡＰＰ部位全体の長さをカバーした（表９）。これらのネステッド（nested）ペプチドを、ＥＬＩＳＡ試験用の固相免疫吸着剤としてマイクロタイターウェルをそれぞれコートするのに用いた。ポジティブコントロールのＥＬＩＳＡプレートをＡβ１−２８でコートした。それらを、０、１０、８４及び１１１週に、４頭の免疫化したヒヒの血清と結合する抗体について試験した。ヒヒ血清を連続希釈し、５μｇ／ｍＬの１０アミノ酸長ペプチドでコートされたプレートでアッセイした。予想通り、Ａβ１−１４（配列番号４）のＮ末端の１０アミノ酸長を表す配列番号６のペプチド（ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ）は、４頭のヒヒ全ての免疫血清と強く反応した。Ａβ１−１４の１番目の「Ｄ」は抗体特異性の主要部であった。「Ｄ」の欠失又は１番目の「Ｅ」（グルタミン酸）への改変は、１０アミノ酸長ペプチドに対する結合の激しい減少をもたらし、Ａβ１−１０（配列番号６）に対するヒヒ抗体の高い特異性、及びＡβ１−４２ペプチド又はその前駆体の他にＡβペプチド免疫原構築物に対する交差反応性の抗体の認識部位が出現する可能性が低いことを示す。また、免疫血清によって認識される微細な特異性に対するエピトープマッピングを、表１０に示す競合的阻害ＥＬＩＳＡによって更に確認した。要するに、これらの抗体エピトープの知見から、ＵＢＩ ＡＤ免疫治療ワクチン候補によって誘導される抗体が、１４残基を超える部位でもＭｖＦ５ Ｔｈ又はＨＢｓＡｇ３ Ｔｈドメインでもなく、ＡβのＮ末端ドメインに特異的であることがわかった。
実施例１５
ＵＢＩ ＡＤワクチンで複数回免疫化したカニクイザルの血清及びＣＳＦ中の抗体反応及びＡβ１−４０レベル
ワクチン応答の反応速度論から、低用量群２（０．２５ｍＬ当たり１５０μｇ）の６頭のカニクイザルのうちの４頭が、及び高用量群３（１．２５ｍＬ当たり７５０μｇ）の６頭のカニクイザル全てが、初回免疫後、Ａβ１−４２との交差反応性のＡβ１−１４ペプチド免疫原構築物に対する抗体を産生したことがわかった。
表１１に示すように、低用量及び高用量の動物両方で、研究の間（２７週を通じて）、高力価の抗体が持続した。ＵＢＩ ＡＤワクチンの高用量（７５０μｇ）又は低用量（１５０μｇ）のいずれかで３回（９ｗｐｉ）及び５回（１５ｗｐｉ）免疫化した、１群当たり４頭のカニクイザルの血清によるエピトープマッピング（表１２）による抗体反応の微細な特異性は、先のヒヒの研究（表９）の免疫血清における観察と同様に、１群当たり４頭の動物全てにおいてＮ末端Ａβ１−１０ペプチド（ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ）（配列番号６）への強い特異性を示した。ヒヒにおいて観察された反応性パターンとは異なり、幾つかの中程度の反応性が、Ａβ１−４２ペプチドのＮ末端の４、５及び６番目のＲＨＤ残基の周囲の配列番号２０〜２２のペプチドについて、４頭の動物全てで観察された。上述の４頭では、他の１０アミノ酸長ペプチド以外に対する更なる反応性は、試験したカニクイザル試料のいずれにおいても示さない。
血清及びＣＳＦ中のＡβ１−４０レベルに対するＵＢＩ ＡＤワクチンの効果を市販のイムノアッセイキットを使用して測定した。表１３に示すように、ワクチン投与後のＡβ１−４０濃度を、０、１５、２１及び２５．５週の血清、並びに屠殺時（１５週＋１日又は２７週）のＣＳＦで測定した。血清中のＡβ１−４０レベルはＵＢＩ ＡＤワクチンを接種したマカクにおいて上昇したが、プラセボワクチンを接種した動物は正常レベルを示した。対照的に、Ａβ１−４０レベルはプラセボ又はＵＢＩ ＡＤワクチンのいずれかを接種したカニクイザルの脳脊髄液（ＣＳＦ）中で定常状態を維持した。これらの結果は抗Ａβ抗体の作用機序として「末梢シンク（Peripheral Sink）仮説」を支持し、それによって抗体は脳から末梢循環系へのＡβペプチドの排出を促進する。
実施例１６
ＵＢＩ ＡＤワクチンで複数回免疫化したカニクイザルの細胞免疫応答
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料を１５、２１及び２５．５週に採取した全血から単離し、次いで各種Ａβペプチドの存在中で培養した。表１４に示すように、Ａβ１−１４ペプチドを培地に添加した場合、リンパ球による増殖応答は観察されなかった。しかしながら、Ａβ１−４２又はＡβ１７−４２（配列番号６７）ペプチドを幾つかのＰＢＭＣ培養物に添加した場合、陽性の増殖応答を示した。
１５、２１及び２５．５週に採取されたＰＢＭＣ試料について、Ａβペプチド又はＰＨＡマイトジェンの存在中でサイトカイン分泌も試験した。表１５に示すように、３つのサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α）は、全長Ａβ１−４２ペプチドへの応答に対して検出可能な分泌を示したが、Ａβ１−１４ペプチドへは示さず；サイトカイン分泌の増加は、プラセボワクチン試料と比較して、ＵＢＩ ＡＤワクチン処置試料において検出されなかった。Ａβペプチド存在中で試験した３つの他のサイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ）は全てのＰＢＭＣ培養物においてアッセイの検出限界以下であった。
外来のヘルパーＴエピトープを有し、Ａβ１７−４２ペプチドドメイン有さないＮ末端Ａβ１−１４ペプチド免疫原のみを持つＵＢＩ ＡＤワクチンでカニクイザルを免疫化し、Ａβ１−４２ペプチドが存在するＰＢＭＣ培養物中で示した陽性の増殖の結果はＵＢＩ ＡＤワクチン応答に関連しないが、むしろ天然のＡβに対するバックグラウンドの応答であることを示した。
これらの結果から、Ａβ１−１４及び外来のヘルパーＴエピトープのみを持つＵＢＩ ＡＤワクチンの安全性を支持し、正常カニクイザルにおけるＡβペプチドへの潜在的な炎症性の抗自己細胞性免疫応答を生じないことがわかった。対照的に、ＡＮ−１７９２ワクチンの臨床試験研究における脳炎に関連する有害事象は、ワクチンの原線維／凝集したＡβ１−４２免疫原内のＴ細胞エピトープの包含に部分的に起因する。
実施例１７
モルモット、マカク及びヒヒの異なるレベルでのＵＢＩ ＡＤワクチンの免疫原性の比較
ＡＤワクチンの主要成分としてのそれらの適合性に対する各種Ａβペプチド免疫原構築物の詳細な試験の後、配列番号６４及び６５を有するペプチド構築物を選択し、ワクチン製剤を考案及び設計した。ＣｐＧオリゴマーと免疫刺激複合体を形成する２つのペプチド免疫原構築物を有し、鉱物塩のアジュホスで補充した、選択したワクチン製剤（ＵＢＩ ＡＤワクチン）を、実施例８〜１５に記載されたように詳細に試験し、複数の種（モルモット、マカク及びヒヒ）におけるその免疫原性、及び臨床試験でのその使用のための調製物における投与の管理体制を較正した。表１６に、１又は２回投与後のペプチド用量対レスポンダーの割合（陽性の力価を有する動物数／試験した全動物数）、及びＵＢＩ ＡＤワクチンの投与予定の評価のための各種の体重をまとめる。分析からは、追加免疫において高い又はほぼ完全な応答率を可能にするであろう単回注射後のかなりの応答率を達成するために、関係する全ての種のデータに基づき、用量レベル当たり１００μｇより高く設定することが好ましい。０．５ｍＬ用量当たり３００μｇのＵＢＩ ＡＤワクチンをヒト被験者での研究のために選んだ。第Ｉ相臨床試験において、個人を０、４、１２週に免疫化した。１回目投与後４週で、登録された１９人の被験者のうち２人が陽性の抗Ａβ抗体価を示し；８週での２回目投与後４週で、１９人の被験者のうち１７人が陽性であり；１６週での３回目投与後４週で、１９人の被験者の全てが陽性であり、２４〜２６週の第Ｉ相試験終了まで陽性を維持した。
実施例１８
ＵＢＩ ＡＤワクチン（ＵＢ−３１１）による治療効果を示唆する第Ｉ相臨床試験
Ａβペプチドは、疾患過程におけるその役割を支持する、病理学的、生化学的及び遺伝的証拠に基づくＡＤの主要な治療標的である。ＵＢＩ ＡＤワクチン（ＵＢ−３１１）のような活性Ａβ免疫療法の目標は、免疫応答を刺激し、循環から過剰のＡβペプチドを補足し且つ認知機能低下を予防するか又は遅らせる頑強な抗Ａβ抗体を産生することである。
「軽度〜中程度のアルツハイマー病の患者に対するＵＢＩ ＡＤ免疫治療ワクチン（ＵＢ−３１１）の安全性、忍容性及び免疫原性を評価するための第Ｉ相オープンラベル試験」という表題のＵＢ−３１１の第Ｉ相臨床試験を、承認された最終的な臨床プロトコルに基づき実施した。全部で１９人の軽度〜中程度のＡＤ患者を登録した。各患者は０、４及び１２週に、試験薬（ＵＢ−３１１）の筋肉内注射を３回受けた。全試験期間は２４〜２６週であった。
安全性の評価に加えて、忍容性、免疫原性及び効能データをＵＢ−３１１第Ｉ相臨床試験から収集し、探索目的で研究被験者の抗体結合エピトープ、Ａβペプチドレベル及び免疫機能の研究の分析を記載する。血清学的及び免疫原性分析用の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及び血清／血漿試料を単離するための、０、４、８、１２、１６及び２４／２６週でのＵＢ−３１１免疫前後に採取した血液の結果は、（１）抗Ａβ抗体価、（２）エピトープマッピング、（３）血漿Ａβ１−４０レベル、及び（４）インビトロでのリンパ球増殖及びサイトカイン分析を含む。
全部で１９人の軽度〜中程度のアルツハイマー病（ＡＤ）の被験者を試験に登録し、０、４及び１２週に、ＵＢＩ ＡＤ免疫治療ワクチン（ＵＢ−３１１）の筋肉内注射を３回接種した。
臨床的に実証された軽度〜中程度のＡＤの患者に投与した場合、ＵＢ−３１１は満足な安全性及び忍容性プロファイルを示した。恐らく又は多分ＵＢ−３１１に関連することが明確な有害事象（ＡＥ）の発生率を、ＵＢ−３１１処置の安全性を評価するための一次評価項目として設計した。試験期間中、１６の処置関連のＡＥのエピソードが１９人の被験者のうち９人で報告された。処置関連のＡＥのうち、軽度の注射部位反応（５被験者）、中程度の興奮（２被験者）、及び軽度の赤血球沈降速度の増加（２被験者）であった。全ての処置関連のＡＥは、重篤度のグレード１（軽度）又はグレード２（中程度）として評価され、これらのエピソードについての措置は取らなかった。強直性脊椎炎及び糖尿病の病歴を有する１人の被験者について、追跡調査期間中に、帯状疱疹の重篤有害事象（ＳＡＥ）が報告された。被験者は事象の発生時にすぐに入院させ、適切な処置を行った。ＳＡＥは因果関係がある可能性は低いと判定され、被験者は状態の改善により２週間後病院から退院した。
ＵＢ−３１１の忍容性を評価した。１９人の被験者全て処置を終了し、ＡＥの発生にもかかわらず、試験の早期中止はなかった。したがって、忍容性は１００％であった。
実施例１９
全ての被験者に対するＡβ１−１４ドメインのＮ末端に特異的なＵＢ−３１１ワクチン誘発抗体の投与
表１２に示すように、抗Ａβ１−１４抗体レベルの変化を、０、４、８、１２、１６及び２４〜２６週で測定し、ＵＢ−３１１ワクチンの免疫原性を評価した。０週（処置前）の全ての被験者についてｌｏｇ１０に変換した抗Ａβ１−１４抗体レベルの平均値が１．１４であり、４週で１．２１にわずかに上昇し、８及び１２週で２．００及び１．９１に顕著に上昇し、１６週（３回目免疫後４週）に２．７のピークに達し、２４〜２６週で２．２８に減少した。
抗体価をｌｏｇ１０に変換し、０週でのそれらの値をベースラインとして使用した。比較可能な傾向が３つの特異的抗体価の全てで観察された。抗体価の変化の平均値は、抗Ａβ１−４２モノマー抗体を除いて、被験者が０週に既にＵＢ−３１１の初回投与を受け、２回目投与前の時点である４週でわずかに上昇した。抗体価は、被験者が４週に２回目投与を受けた後８週でも上昇した。１２週での３回目投与後、抗体価の平均変化のピークを１６週に検出した。
実施例２０
軽度〜中程度のアルツハイマー病に対するＵＢ−３１１ワクチンの効能を評価する神経学的、認知及び機能試験
ＵＢ−３１１の効能を、１９人の患者におけるＡＤＡＳ−Ｃｏｇスコア、ＭＭＳＥスコア及びＡＤＣＳ−ＣＧＩＣの変化の測定することによって評価した。ＡＤＡＳ−Ｃｏｇスコア及びＡＤＣＳ−ＣＧＩＣを０週（Ｖ２）、１６週（Ｖ７）及び２４〜２６週に評価した。ＭＭＳＥスコアを事前検査（Ｖ１）、１６週及び２４〜２６週に測定した。被験者のうち、１．４２及び０．７９のＡＤＡＳ−Ｃｏｇスコアの上昇が、０週から１６週、及び１６週から２４〜２６週でそれぞれ観察された。ベースラインでの平均ＡＤＡＳ−Ｃｏｇスコアは被験者で２６．２６であり、１６週に２７．６８に上昇し、２４〜２６週に２８．４７にわずかに上昇した。更に、ＭＭＳＥスコアの０．３２及び０．７９の減少が、事前検査来診から１６週、及び１６週から２４〜２６週で認められた（図１３）。
事前検査来診での被験者の平均ＭＭＳＥスコアは１９．１６であった。１６週で１８．８４に、２４〜２６週の最終来診で１８．０５にスコアが減少した。特に、２つのスケールの平均スコアの変化にもかかわらず、それぞれの被験者のスコア分布は完全に分散しており、２つのスケールの傾向は安定的であると思われた。
ＡＤＣＳ−ＣＧＯＣ評点として、３５％超の被験者が、最後の処置（３回目投与）後４週である１６週で改善を示した。これらの改善率は、２４〜２６週での処置の長い休止後、患者群の１８％以下で減少した。１６週において、被験者の半分弱はＡＤＣＳ−ＣＧＩＣの変化がなく、このカテゴリーの被験者は、１６週後の更に８〜１０週の無処置の追跡調査期間後、全被験者の５０％超にまで穏やかに増加した。悪化に対して改善した被験者の割合を比較すると、１６週で試験薬に有利な陽性の結果を示したが、２４〜２６週では示さなかった（最後のワクチン投与後１２週）。
サブグループの分析において、結果から、軽度ＡＤ（年齢が＞６０歳、ベースラインＭＭＳＥが＞２０）の高齢被験者は、（１）平均ＡＤＡＳ−Ｃｏｇが３ポイント減少（１２カ月にわたるタレンフルルビルの第ＩＩ相試験のプラセボ群における３．８１ポイントの上昇と比較して）、（２）安定な平均のＭＭＳＥスコア（１２カ月にわたるタレンフルルビルの第ＩＩ相試験のプラセボ群における２．０４ポイントの減少と比較して）、並びに、図１４に示すように、（３）改善の高い割合、及びＡＤＣＳ−ＣＧＩＣの比率の変化なし、であることがわかり、ＵＢ−３１１ワクチンに対してより良い応答を有していた。年齢が＞６０歳の軽度ＡＤ患者における３つの認知スコアについて、３人に対してこのような改善が報告されたことはなく、最も熱狂的に受け取られた。
実施例２１
Ａβ１−２８モノマー、Ａβ１−４２モノマー又はＡβ１−４２オリゴマーに対するヒト抗体の検出用の酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
アルツハイマー病の研究から、Ａβ凝集体及びＡβ由来オリゴマーがＡＤ発病において中心的な役割を果たしていることがわかる。Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）型グルタミン酸受容体（ＮＭＤＡ−Ｒ）サブユニットＮＲ１及びＮＲ２Ｂを発現するニューロンとのＡβオリゴマーの結合はLacor PNによってCurrent Genomics 2007; 8:486-508に報告されている。海馬のニューロン細胞におけるＮＲ１及びＮＲ２ＢにＡβオリゴマーが結合すると、このリガンド−受容体結合はシナプス終末数の著しい減少をもたらし、これは記憶及び認知障害及び認知症に関連する。最近、細胞でのインビトロ研究及び臨床試験の結果から、抗Ａβオリゴマー抗体が、この結合を遮断でき、Ａβオリゴマー毒性からニューロンを保護することがわかった。ＵＢＩ ＡＤワクチン（ＵＢ−３１１）は、各ペプチドが異なるＴｈ２−バイアスＮ末端ペプチドエピトープと合成的に結合した短鎖のＮ末端Ａβペプチド（Ａβ１−１４）を含む、２つのペプチド免疫原を含む。ＵＢＩ ＡＤワクチン応答の免疫原性を評価するために、Ａβ１−２８モノマー、Ａβ１−４２モノマー及びＡβ１−４２オリゴマーに対する抗体をインビトロで検出するための抗Ａβ抗体酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）試験を開発した。
Ａβ１−２８モノマー、Ａβ１−４２モノマー又はＡβ１−４２オリゴマーを、固定化抗原としてマイクロプレートのウェル上にプレコートした。アッセイの過程で、血清試料を１：１０で、１：１００〜１：１００，０００に連続希釈し、プレコートしたマイクロプレートに添加した。抗Ａβ１−２８モノマー、抗Ａβ１−４２モノマー又はオリゴマー抗体は、存在するならば、固定化抗原に結合する。ウェルを洗浄して非結合抗体及び他の血清成分を除去した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合化組み換えタンパク質Ａ／Ｇの標準調製物を各ウェルに添加し、結合抗体と反応させた。ウェルを洗浄することによって非結合複合体を除去し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及び過酸化水素を含む基質溶液を各ウェルに添加した。試験した血清試料中に、もし存在するなら、存在するＡβ特異的抗体の量に比例して黄色が強くなった。酵素−基質反応を、希硫酸溶液の添加により停止した。次いで、各ウェル中で生じた色の変化を、波長４５０ｎｍ（Ａ４５０）にてマイクロプレートリーダーで吸光度を分光光度測定することによって測定した。ＵＢＩ（登録商標）ＥＬＩＳＡ力価計算プログラムを使用して、相対的な抗体価を計算した。
Ａβオリゴマーは、Ａβモノマー又はアミロイドプラークと比較して、ニューロンに対して最も毒性があることを示す。活性免疫療法の目標は、ＡβモノマーだけでなくＡβオリゴマーにも特異的な抗体の産生を誘発することである。８、１６及び２４週にＵＢ−３１１をそれぞれ注射する前の０（ベースライン）、４及び１２週に軽度〜中程度の１９人のＡＤ患者から採取した血清試料について、抗Ａβ抗体価を分析した。図１５は、１９人の登録被験者それぞれについて、スクリーニング来院時（Ｖ１／Ｖ２）、及び最後のＵＢ−３１１免疫後４週である１６週（Ｖ７）における、抗Ａβ１−２８モノマー、抗Ａβ１−４２モノマー及び抗Ａβ１−４２オリゴマーの抗体価を示す。
実施例２２
エピトープマッピング：Ｎ末端ペプチドに対するヒト抗体の検出用の競合的結合阻害酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）
エピトープマッピングを用いて、結合部位、又はＡβペプチド（Ａβ上の９残基〜２４残基の間）の１０アミノ酸長のアミノ酸配列と重複する直鎖状の抗Ａβ１−１４抗体のエピトープを、ＥＬＩＳＡ試験で特定した。被験者１９人の試験の血清試料を評価した。０、４及び１２週での３回の免疫後である、１６週における結果を以下に示す（図１６）。
合成Ａβ１−２８ペプチドを固定化抗原として選択し、マイクロプレートのウェル上に２μｇ／ｍＬの濃度でプレコートした。実験前に、各血清試料を１：５０、１：１００、１：２００及び１：４００で希釈し、試験して、最適な希釈を決定した。最適希釈の抗Ａβ血清試料を、液相免疫吸着剤としてそれぞれ設計したアミノ酸長ペプチドと混合した。Ａβ１−２８でプレコートされたプレートに移す前に、混合物を最適希釈の血清で１：５で連続希釈した。最適希釈の抗Ａβ血清単独をコントロールとして用いた。アッセイの過程で、１０アミノ酸長ペプチドは主たる抗体結合部位に特異的に結合し、抗Ａβ抗体及び固定化抗原の結合を競合的に阻害した。ウェルを洗浄して非結合抗体及び他の血清成分を除去した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合化組み換えタンパク質Ａ／Ｇの標準調製物を各ウェルに添加し、結合抗体と反応させた。ウェルを洗浄して非結合複合体を除去した後、過酸化水素及び３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む基質溶液を各ウェルに添加した。試験した血清試料中に、もし存在するなら、存在するＡβ特異的抗体の量に比例して黄色が強くなった。酵素−基質反応を、希硫酸溶液の添加により停止した。次いで、各ウェル中で生じた色の変化を、ＩＣ５０５Ｘプログラム（分子デバイス）を使用することによって、波長４５０ｎｍ（Ａ４５０）にてマイクロプレートリーダーで分光光度測定した。コントロールウェル中の抗Ａβ抗体と固定化抗原との結合を最大の結合（１００％）で表し、１０アミノ酸長ペプチドの半数最大阻害濃度（ＩＣ５０）をエピトープ特異性の指標として使用した。
実施例２３
ＵＢ−３１１で免疫化した患者の血清試料中の抗体によって認識される主なエピトープはＡβ１−１０ペプチドに特異的であった
標的領域（表１７）内の特定の残基に対する主な抗体結合部位を局在化させるための微細なエピトープマッピング法において、２４番目が重複する１０アミノ酸長ペプチド（配列番号６、８〜３０）をＡβ１−１４ペプチド配列（配列番号４）及びヒトアミロイドβペプチド前駆体タンパク質（ｈＡＰＰ）の隣接領域の周囲に合成し、隣接するｈＡＰＰ部位に加えてＮ末端アスパラギン酸残基「Ｄ」で始まるＡβ１−１４の全体の長さをカバーした（図１６）。被験者１９人から採取した血清試料を、免疫前及びＵＢ−３１１を３回投与後１６週に試験した。処置前の試料をベースライン抗Ａβ抗体レベルとした（データは示さない）。予想通り、陽性のエピトープマップをもたらした１９人全ての試料における主たる抗体反応は、図１６及び表１７に示すように、Ａβ（配列番号６）の遊離アミノ末端に対するものであった。より具体的には、Ｎ末端の１０アミノ酸長のＡβ１−１４で表されるペプチド（ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹ）が１９人の患者全ての免疫化した血清と最も強く反応した。他のＡβの１０アミノ酸長ペプチドに対する弱い反応性を有する更なる抗体反応を、被験者１９人のうち８人で検出した。全てではなく幾人かの被験者から、４、８、１２及び２４〜２６週に採取した血清試料も試験し、一致した結果を示した（データは示さない）。要約すれば、これらのデータから、ＵＢ−３１１によって誘発された抗体の大部分は、１４個の残基を超える部位ではなく、ＡβのＮ末端ドメインに特異的に向けられたことがわかる。
実施例２４
ＵＢＩ ＡＤワクチン（ＵＢ−３１１）の３回の免疫後の血漿中で増加したＡβ１−４０ペプチド
現在のところ、Ａβ１−４０（配列番号２）、Ａβ１−４２（配列番号１）の血漿濃度の変化、又はＡβ１−４２：Ａβ１−４０の比率について、疾患修飾処置の臨床試験における設定、又はコリンエステラーゼ阻害剤で処置したＡＤ患者のいずれかの処置への応答との有意な関連は見いだされていない。それにもかかわらず、血漿Ａβレベルは可能性のあるＡＤのバイオマーカーとして提案されている。
我々の以前の研究において、ＵＢＩ ＡＤワクチンを接種したマカクで血清中のＡβ１−４０レベルが上昇したが、プラセボワクチンを接種した動物では正常レベルを示した。これらの結果から、「末梢シンク仮説」が抗Ａβ抗体の作用機序であるかもしれないことがわかった。抗Ａβ抗体価は、３回の免疫後のヒト被験者における抗体価よりも、６回のＵＢ−３１１免疫後のマカクの方がずっと高かったが、この現象は現在の研究においても観察された。表１８に示すように、ＵＢ−３１１処置前及び１６週（３回目の免疫後４週）に試験したＡβ１−４０血漿試料の１２組の症例の血漿Ａβ１−４０レベルを、１６週の血清Ａβ１−２８抗体濃度と比較した。すべての抗体価は、ＵＢ−３１１免疫前、陰性であった。ｌｏｇ１０が２．４を超える抗Ａβ１−２８抗体価を有する８人は、ＵＢＩ ＡＤワクチン（ＵＢ−３１１）を接種後、Ａβ１−４０力価が上昇した；一方、ｌｏｇ１０が２．０未満の抗体レベルを有する４人のうち３人は処置後、上昇しなかった。Ａβ１−４０レベルの上昇は、１つの例外を除いて（被験者Ｐ１０９）、ほとんどの症例において小さく、免疫前の血漿中の異常に高いＡβ１−４０レベル、及び免疫後著しく高いレベル（１０３１．９ｐｇ／ｍＬ）が示された。非常に高いＡβ１−４０の理由は不明のままである。血漿中のＡβ１−４２ペプチドが測定可能なレベルの被験者はいなかった。
実施例２５
Ａβ１−１４又はＡβ１−４２ペプチド存在下でヒトリンパ球（ＰＢＭＣ）を刺激しないＵＢ−３１１の免疫用量
新たなワクチンの出現及び特定の免疫及び自己免疫疾患の間の関連を主張する広く公表された報告の数の増加は、免疫の危険性を超えた社会的関心となっている。抗原刺激に応答したリンパ球増殖及びサイトカインの産生は、ワクチン投与に続いて免疫系が過剰に活性化されるか否か、もしあればどの経路が関与するかを評価するために使用することができる。本研究の目的は、Ａβペプチド又はポジティブコントロールとしてＰＨＡマイトジェンの不存在下又は存在下でのリンパ球増殖の刺激指数（ＳＩ）、並びに１６週の３回のＵＢ−３１１免疫の前後のＡＤ患者の培養リンパ球におけるサイトカイン濃度を測定することによって、ＵＢ−３１１の免疫原（Ａβ１−１４）の安全性を評価することであった。
ＡＤ患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をフィコール−ハイパーク勾配遠心分離により単離した。ペプチド誘発増殖及びサイトカイン産生について、細胞（２．５×１０５／ウェル）を３連で、単独又はそれぞれのペプチドドメイン（Ａβ１−１４（配列番号４）、Ａβ１−１６（配列番号は含まない）、Ａβ１−２８（配列番号３）、Ａβ１７−４２（配列番号（ＩＤＮ）は含まない）、Ａβ１−４２（配列番号１）及び非関連３８アミノ酸長ペプチド（ｐ１４１２）を含む）を添加して（最終濃度１０μｇ／ｍＬで）培養した。培養物を、３７℃、５％ＣＯ２にて７２時間培養し、次いで上清１００μＬを各ウェルから取り出し、サイトカイン分析用に−７０℃で凍結した。３Ｈ−チミジン（３Ｈ−ＴｄＲ、アマシャム社、カタログＮｏ．ＴＲＫ６３７）０．５μＣｉを含む培地１０μＬを各ウェルに添加し、１８時間培養し、続いて液体シンチレーション計数により放射性同位体の取り込みを検出した。マイトジェンである植物性血球凝集素（ＰＨＡ）をリンパ球増殖のポジティブコントロールとして使用した。Ａβペプチド又はＰＨＡマイトジェンなしで培養した細胞をネガティブ及びポジティブコントロールとして使用した。３連のＡβペプチドを有する実験培養物の１分当たりの平均カウント（ｃｐｍ）を３連のネガティブコントロールの培養物の平均ｃｐｍによって割ることによって刺激指数（ＳＩ）を計算し；ＳＩ＞３．０は有意な増殖応答と考えられた。
０週（ベースライン）及び１６週（３回目投与後４週）に採取した全血から末梢血単核球試料を単離し、次いで各種Ａβペプチドの不存在下又は存在下で培養した。表１９に示すように、Ａβ１−１４、他のＡβペプチド又はｐ１４１２（非関連コントロールペプチド）を培地に添加した場合、リンパ球による有意な増殖応答は観察されなかった。予想通り、ＰＨＡマイトジェンを培地に添加した場合、陽性の増殖応答を示した。ＵＢ−３１１の免疫前後でのＰＨＡに対する類似の応答の観察（Ｐ＝０．８７）から、被験者の免疫機能の研究において、有意な変化がないことが示唆される（表１９）。
実施例２６
Ａβ１−１４ペプチド存在下でのヒトサイトカインを刺激しないＵＢ−３１１の免疫用量
ＰＢＭＣ培養物のサイトカイン分析（ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ）を、細胞のみ又はＡβペプチドドメイン若しくはＰＨＡの存在下で培地のアリコートで行った。ヒト特異的サイトカインのサンドイッチＥＬＩＳＡキット（U-CyTech Biosciences社、ユトレヒト、オランダ）を使用して、製造者の指示書に従ってそれぞれのサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍＬ）を測定した。０週及び１６週に採取したＰＢＭＣ試料についても、細胞のみ（ネガティブコントロール）又はＡβペプチド、ｐ１４１２（非関連ペプチド）若しくはＰＨＡマイトジェン（ポジティブコントロール）の存在下のいずれかで３日間培養後、サイトカイン分泌を試験した。キットの定量範囲は５〜３２０ｐｇ／ｍＬである。５ｐｇ／ｍＬ未満、又は３２０ｐｇ／ｍＬを上回って測定された任意の濃度は、定量限界未満（ＢＱＬ）又は定量限界超（ＡＱＬ）として、それぞれ示した。しかしながら、統計的な考慮のために、ＢＱＬ又はＡＱＬを、それぞれ定量限界より低い（５ｐｇ／ｍＬ）又は上回る（３２０ｐｇ／ｍＬ）に置き換えた。０週及び１６週での各サイトカインの平均濃度を表２０に示す。予想通り、ポジティブコントロールであるＰＨＡの存在中において、ＩＬ−２を除き、サイトカインの産生は有意に上昇した。Ａβ１−１４又は他のＡβペプチドの刺激による応答に対するサイトカインの産生をベースライン（０週）及び１６週で観察したが、ほとんどの値は、相当するネガティブコントロール（細胞のみ）と同様に見えた。
免疫後、細胞性免疫応答の変化を評価するために、ベースラインから１６週の平均サイトカイン濃度の変化をネガティブコントロールのものと比較し、対応ウィルコクソンの符号順位検定によって検討した。４つのサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α）は、全長Ａβ１−４２ペプチドに応答する分泌の著しい上昇を示し；この観察は、Ａβ１−４２凝集体の高次構造的なエピトープに起因するものであろう。サイトカイン分泌の増加は、Ａβ１−１４又は他のＡβペプチドで検出されなかった。
要約：ＵＢＩ ＡＤワクチンは、遊離Ｎ末端Ａβ１−１４ペプチドがＭｖＦ５ Ｔｈ及びＨＢｓＡｇ３Ｔｈエピトープそれぞれと合成的に結合した、２つのペプチド免疫原を含有する。インビトロのリンパ球増殖及びサイトカイン分析を使用して、細胞免疫応答に対するＵＢＩ ＡＤワクチンの免疫の影響を評価した。表１９に示すように、Ａβ１−１４ペプチド又は任意の他のＡβペプチドを培地に添加した場合、リンパ球による増殖応答は観察されなかった。Ａβ１−１４及び他のＡβペプチド（Ａβ１−４２を除く）での処置において、ＵＢＩ ＡＤワクチン免疫患者のリンパ球によるサイトカイン分泌の増加は検出されず、処置前の０週のレベルと比較して、１６週でＵＢ ３１１免疫後、４つのサイトカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α）のかなりの増加を誘発した（表２０）。Ｔｈ２型Ｔ細胞の応答によるサイトカイン放出の増加は、Ａβ１−１４のみで増加が検出されなかったので、ＵＢＩ ＡＤワクチン応答に無関係の可能性がより高い。Ａβ１−４２に対する応答は、Ａβ１−４２上で識別される天然ヘルパーＴエピトープに関係し得る天然Ａβに対するバックグラウンド応答であると疑われる。ＰＨＡに対する応答におけるＩＬ−２産生の欠如が観察され、これは、正常ヒトＰＢＭＣを使用する類似の実験条件下、Katial RKらによって報告された知見（Clin Diagn Lab Immunol 1998;5:78-81）と一致する。結論として、これらの結果から、第Ｉ相臨床試験に参加した軽度〜中程度のアルツハイマー病の患者において、ＵＢＩ ＡＤワクチンが潜在的な炎症性の抗自己細胞性免疫応答を生じさせないことがわかり、さらにＵＢＩ ＡＤ ワクチン（ＵＢ−３１１）の安全性が実証された。
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Claims (17)

  1. 配列番号６２、６３、６４、６５及びそれらの任意の組合せからなる群から選ばれるβアミロイド（Ａβ）ペプチド免疫原構築物のＡβ部分のＮ末端フラグメントに対する抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
  2. Ａβペプチド免疫原構築物が配列番号６２である請求項１記載の抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
  3. Ａβペプチド免疫原構築物が配列番号６３である請求項１記載の抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
  4. Ａβペプチド免疫原構築物が配列番号６４である請求項１記載の抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
  5. Ａβペプチド免疫原構築物が配列番号６５である請求項１記載の抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
  6. 抗体又はそのエピトープ結合フラグメントが、ＡβのＮ末端に結合する請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
  7. 抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
  8. 抗体がヒトポリクローナル抗体又はヒトモノクローナル抗体である請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
  9. 配列番号６２、６３、６４、６５及びそれらの任意の組合せからなる群から選ばれるＡβペプチド免疫原構築物をヒトに投与することによって産生される請求項１記載の抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
  10. 配列番号６２のＡβペプチド免疫原構築物をヒトに投与することによって産生される請求項１記載の抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
  11. 配列番号６３のＡβペプチド免疫原構築物をヒトに投与することによって産生される請求項１記載の抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
  12. 配列番号６４のＡβペプチド免疫原構築物をヒトに投与することによって産生される請求項１記載の抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
  13. 配列番号６５のＡβペプチド免疫原構築物をヒトに投与することによって産生される請求項１記載の抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
  14. 配列番号６２及び配列番号６３のＡβペプチド免疫原構築物の混合物をヒトに投与することによって産生される請求項１記載の抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
  15. 配列番号６４及び配列番号６５のＡβペプチド免疫原構築物の混合物をヒトに投与することによって産生される請求項１記載の抗体又はそのエピトープ結合フラグメント。
  16. 請求項１〜１５のいずれか一項記載の抗体又はそのエピトープ結合フラグメントを有する組成物。
  17. 請求項１〜１５のいずれか一項記載の抗体又はそのエピトープ結合フラグメント、及び医薬上許容可能なデリバリビヒクル及び／又はアジュバントを有する医薬組成物。
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