JP2021508672A - シヌクレイノパチーの治療のためのアルファ−シヌクレインタンパク質のｃ末端からのペプチド免疫原及びその製剤 - Google Patents

シヌクレイノパチーの治療のためのアルファ−シヌクレインタンパク質のｃ末端からのペプチド免疫原及びその製剤 Download PDF

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Abstract

本開示は、アルファ−シヌクレイン（αＳｙｎ）ペプチド免疫原コンストラクト、コンストラクトを含む組成物、コンストラクトにより誘発される抗体、ならびにコンストラクト及びその組成物を作製及び使用する方法に関する。開示されるαＳｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに直接または必要に応じて異種スペーサーを介して連結されたαＳｙｎからのＢ細胞エピトープを含む。ペプチド免疫原コンストラクトのＢ細胞エピトープ部分は、全長αＳｙｎの１１１位のグリシン（Ｇ１１１）近辺から（１３５）位のアスパラギン（Ｄ１３５）近辺までの配列に対応するαＳｙｎの約（１０）から約（２５）アミノ酸残基を含む。α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、モノマー、オリゴマー、及び原線維としてのαＳｙｎのベータシートと交差反応する非常に特異的な抗体の生成を刺激するが、αＳｙｎの天然のアルファヘリックスと交差反応するものを刺激せず、シヌクレイノパチーのリスクがある宿主への治療性免疫応答を提供する。
【選択図】図１

Description

本出願は、２０１７年６月１６日に出願された米国仮出願第６２／５２１，２８７号の権益を主張するＰＣＴ国際出願であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、シヌクレイノパチーの治療のためのアルファ−シヌクレイン（α−Ｓｙｎ）タンパク質のＣ末端に基づくペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤に関する。
シヌクレインタンパク質（ウェブサイト：ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｓｙｎｕｃｌｅｉｎにおいて概説される）は、主に神経組織及び特定の腫瘍で発現する脊椎動物に共通の可溶性タンパク質のファミリーである。シヌクレインファミリーには、３つの既知のタンパク質：アルファ−シヌクレイン（ウェブサイト：ｅn.wikipedia.org/wiki/Alpha-synucleinにおいて概説される）、ベータ−シヌクレイン（ウェブサイト：en.wikipedia.org/wiki/Beta-synucleinにおいて概説される）、及びガンマ−シヌクレインが含まれる。すべてのシヌクレインは、交換可能なアポリポタンパク質のクラスＡ２脂質結合ドメインと類似性のある、高度に保存されたアルファヘリックス脂質結合モチーフを共有している。一部のデータは膜安定性及び／または代謝回転の調節における役割を示唆しているが、正常な細胞機能はシヌクレインタンパク質のいずれについても決定されていない。
全長アルファ−シヌクレインタンパク質（α−Ｓｙｎ）は１４０アミノ酸のタンパク質（受託番号ＮＰ＿０００３３６）であり、ＳＮＣＡ遺伝子によってコードされている。選択的スプライシングにより、少なくとも３つのα−Ｓｙｎのアイソフォームが生成される。主な形態は、完全長のタンパク質である。他のアイソフォームは、エクソン３の喪失により残基４１〜５４が欠如しているα−Ｓｙｎ−１２６、及びエクソン５の喪失により残基１０３〜１３０が欠如しているα−Ｓｙｎ−１１２である。
α−Ｓｙｎの一次構造は、通常３つの異なるドメインに分けられる：（１）残基１〜６０：アポリポタンパク質結合ドメインに類似した構造的アルファヘリックス傾向を有するコンセンサス配列ＫＴＫＥＧＶを含む４つの１１残基リピートが支配的な両親媒性Ｎ末端領域；（２）残基６１〜９５：タンパク質凝集に関与する非アミロイドβコンポーネント（ＮＡＣ）領域を含む中央の疎水性領域；（３）残基９６〜１４０：明確な構造的傾向を有さない高酸性のプロリンに富む領域。ＮＡＣ領域の３５アミノ酸のα−Ｓｙｎフラグメントは、アミロイドに富む画分にＡβとともに存在することが発見された。ＮＡＣは、その前駆体タンパク質である、現在ヒトのα−Ｓｙｎと呼ばれる、ゴマフシビレエイ（Torpedo californica）からのシヌクレインの全長ヒト相同体であると後に決定された、ＮＡＣＰのフラグメントであることが後に示された。
ＨＰＬＣで精製されたα−Ｓｙｎのｉｎ ｖｉｔｒｏでの高分解能イオン移動度質量分析（ＩＭＳ−ＭＳ）の使用により、α−Ｓｙｎが自己タンパク質分解性（自己タンパク質分解性）であり、インキュベーション時にさまざまな低分子量フラグメントを生成することが示された。１４．４６ｋＤａの完全長タンパク質は、Ｃ末端及びＮ末端の短縮化によって形成される１２．１６ｋＤａフラグメント（アミノ酸１４〜１３３）及び１０．４４ｋＤａフラグメント（アミノ酸４０〜１４０）、ならびに７．２７ｋＤａフラグメント（アミノ酸７２〜１４０）を含む多数の小さなフラグメントを生成することが見出された。ＮＡＣ領域の大部分を含む７．２７ｋＤａフラグメントは、全長α−Ｓｙｎよりもかなり速く凝集することが示された。これらの自己タンパク質分解性産物は、α−Ｓｙｎの凝集における中間体または補因子としての役割を果たす可能性がある。
α−Ｓｙｎは、ヒトの脳で豊富であり、脳及びグリア細胞の細胞質にあるすべてのタンパク質の１％を占めている。α−Ｓｙｎは、新皮質、海馬、歯状回、嗅球、線条体、視床、及び小脳で広く発現している。また、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞、ならびに単球及び血小板を含む造血細胞でも高度に発現している。少量のα−Ｓｙｎが心臓、筋肉、及びその他の組織で見出される。脳では、α−Ｓｙｎは主にシナプス前終末と呼ばれる特殊な構造の神経細胞（ニューロン）の先端に見出される。これらの構造内で、α−Ｓｙｎはリン脂質及びタンパク質と相互作用する。シナプス前終末は、シナプス小胞として知られているコンパートメントから、ドーパミンなどの神経伝達物質と呼ばれる化学メッセンジャーを放出する。神経伝達物質の放出は、ニューロン間の信号を中継し、認知を含む正常な脳機能にとって重要である。
溶液中のα−Ｓｙｎは、単一の安定した３Ｄ構造を欠いているという点で、天然変性タンパク質であると考えられている。α−Ｓｙｎはチューブリンと顕著に相互作用し、α−Ｓｙｎはタウのような潜在的な微小管関連タンパク質としての活性を持つ可能性があることが示されている。α−Ｓｙｎは古典的に非構造化可溶性タンパク質であると考えられてきたが、非変異α−Ｓｙｎは凝集に抵抗する安定に折り畳まれた四量体を形成する。それにもかかわらず、α−Ｓｙｎは凝集して、レビー小体を特徴とする病態において不溶性原線維を形成し得る。これらの障害はシヌクレイノパチー（ウェブサイト：en.wikipedia.org/wiki/Synucleinopathiesにおいて概説される）として知られている。
シヌクレイノパチーは、共通の病理学的特徴を共有する神経変性障害の多様なグループであり、神経病理学的検査では、不溶性のα−Ｓｙｎの異常な凝集体を含む特徴的な病変が、ニューロン及びグリア細胞の選択的脆弱集団に存在する。最も一般的なシヌクレイノパチーには、パーキンソン病（ＰＤ）、認知症を伴うパーキンソン病（ＰＤＤ）、及びレビー小体を伴う認知症（ＤＬＢ）などのレビー小体障害（ＬＢＤ）、ならびに多系統萎縮症（ＭＳＡ）または脳鉄蓄積型Ｉ（ＮＢＩＡタイプＩ）の神経変性が含まれる。これらの疾患の現在の治療選択肢には、Ｌ−ドーパなどの対症療法薬、抗コリン薬、及びモノアミンオキシダーゼの阻害薬が含まれる。しかしながら、現在のすべての治療の機会は、症候性の緩和につながるだけであり、患者に長期にわたる疾患修飾効果を誘発するものではない。
ＬＢＤは、振戦、硬直、運動緩慢、及び脳内のドーパミン作動性ニューロンの喪失を特徴とする進行性の神経変性障害である。ＤＬＢ及びＰＤＤの場合、兆候には認知障害も含まれる。西欧諸国の６０歳を超える人口の２％までがＰＤ／ＬＢＤの典型的な兆候を示す。遺伝的感受性と環境因子が疾患の発症に関与しているらしい。この疾患に苦しむ患者は、特にドーパミン作動性ニューロンまたはニューロン突起の含有量が高い領域の脳の皮質及び皮質下領域に、レビー小体（ＬＢ）と呼ばれる特徴的な細胞内封入体を発達させる。ＬＢＤでは、α−Ｓｙｎは影響を受ける脳領域全体のＬＢに蓄積する。さらに、α−Ｓｙｎ遺伝子の単一の点変異、及び重複または増殖は、まれな家族型のパーキンソン症候群と関連していることが実証できた。
多系統萎縮症（ＭＳＡ）は、Ｌ−ドーパ抵抗性パーキンソン症候群、小脳性運動失調、及び自律神経障害の症状を特徴とする散発性の神経変性障害である。線条体、黒質、小脳、脳橋、ならびに下オリーブ核、及び脊髄を含むさまざまな脳領域で、多系統の神経損失に苦しむ患者が影響を受ける。ＭＳＡは、α−Ｓｙｎ陽性グリア細胞質（ＧＣＩ）及び中枢神経系全体のまれな神経細胞封入体を特徴とする。
さまざまな神経軸索ジストロフィーなどのその他のまれな障害にもα−Ｓｙｎ病態があり、α−Ｓｙｎはレビー小体原線維の主要な構造成分である。しばしば、レビー小体にはタウタンパク質が含まれるが、α−Ｓｙｎとｔａｕは、同一の封入体内のフィラメントの２つの特徴的なサブセットを構成する。α−Ｓｙｎ病理は、アルツハイマー病の散発性と家族性の両方の症例でも見出される。
α−Ｓｙｎの凝集メカニズムは不明である。単量体のα−Ｓｙｎは溶液中において自然に折り畳み構造がほどけるが、αヘリカルの形態で膜に結合することもできる。折り畳み構造がほどけた単量体は、最初に凝集してβ−シートのような相互作用によって安定化できる小さなオリゴマー種になり、次に高分子量の不溶性原線維になる。α−Ｓｙｎは、非構造、アルファヘリックス、及びベータシートに富む配座異性体が平衡状態にある混合物として存在する。凝集を改善することが知られている変異または緩衝液条件は、ベータ配座異性体の集団を強く増加させ、したがって、これが病原性凝集に関連する立体配座である可能性を示唆している。凝集、そして最終的にはレビー小体の前駆体となり得るベータ構造に富んで構造化された中間体の証拠が存在する。
（１）１つ以上のキナーゼによるリン酸化；（２）カルパインなどのプロテアーゼによる短縮化；及び（３）炎症中に存在する一酸化窒素（ＮＯ）または他の反応性窒素種によるニトロ化を含む、いくつかの生理学的要因がα−Ｓｙｎを修飾し、凝集体の形成をもたらす可能性がある。ＥＲ−ゴルジ輸送、シナプス小胞、ミトコンドリア、リソソーム、及びその他のタンパク質分解機構は、そのような凝集によるα−Ｓｙｎ媒介毒性に関連する提案された細胞標的の一部である。
シヌクレイノパチーを治療する戦略には、α−Ｓｙｎの凝集を阻害する化合物がある。低分子クミンアルデヒドは、α−Ｓｙｎのフィブリル化を阻害することが示されている。低分子療法に加えて、最近の報告は、α−Ｓｙｎ凝集体が免疫療法の標的となる可能性があることを示唆している（Ｌｅｅ ＪＳ ａｎｄ Ｌｅｅ Ｓ−Ｊ， ２０１６の総説）。しかしながら、この報告では、（１）α−Ｓｙｎの正常な生理学的機能への潜在的な干渉；（２）脳実質への抗体薬の送達の困難性；及び（３）免疫療法の有効性を含む、α−Ｓｙｎ免疫療法の開発に伴ういくつかの潜在的な問題または課題を指摘している。
現在まで、シヌクレイノパチーを患っている患者の費用効果の高い治療のための部位特異的ペプチド免疫原及びその製剤を開発する必要性はまだ満たされていない。
参照文献：
1. ”Alpha-synuclein,”Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address:en.wikipedia.org/w/index.php?title=Alpha-synuclein&oldid=781366541（２０１７年５月３０日にアクセスされた）．
2. ”Synucleinopathies,” Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address:en.wikipedia.org/w/index.php?title=Synucleinopathies&oldid=686287116（２０１７年５月３０日にアクセスされた）．
3. ”Beta-synuclein,” Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address:en.wikipedia.org/w/index.php?title=Beta-synuclein&oldid=763171134（２０１７年５月３０日にアクセスされた）．
4. ”Synucleinopathies,” Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address:en.wikipedia.org/w/index.php?title=Synucleinopathies&oldid=686287116（２０１７年５月３０日にアクセスされた）．
5. LEE, J.S., et al., “Mechanism of Anti-α-synuclein Immunotherapy”,J./Mov Disord:, 9(1): 14-19(2016)
6. TRAGGIAI, E., et al.“An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells:potent neutralization of SARS coronavirus”, Nat Med:, 10(8):871-875(2004)
7. WANG, C., et al.“Versatile Structures of α-Synuclein”, Front Mol Neurosci.9:48(2016)
本開示は、アルファ−シヌクレインタンパク質（α−Ｓｙｎ）のペプチド免疫原コンストラクトに関する。本開示はまた、ペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物、ペプチド免疫原コンストラクトを作製及び使用する方法、ならびにペプチド免疫原コンストラクトによって産生される抗体に関する。
開示されるペプチド免疫原コンストラクトは、異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに直接または必要に応じて異種スペーサーを介して連結されたα−ＳｙｎからのＢ細胞エピトープを含む。ペプチド免疫原コンストラクトのＢ細胞エピトープ部分は、全長α−Ｓｙｎ（配列番号１）のアミノ酸１１１位のグリシン（Ｇ１１１）近辺からアミノ酸１３５位のアスパラギン（Ｄ１３５）近辺までの配列に対応するα−ＳｙｎのＣ末端領域からの約１０から約２５アミノ酸残基を含む。ペプチド免疫原コンストラクトの異種Ｔｈエピトープ部分は、病原性タンパク質に由来するアミノ酸配列に由来する。ペプチド免疫原コンストラクトのＢ細胞エピトープ部分及びＴｈエピトープ部分は、宿主に投与されると一緒に作用して、コンストラクトのα−ＳｙｎのＢ細胞エピトープ部分を特異的に認識して結合する抗体の生成を刺激する。
いくつかの実施形態では、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、（ａ）配列番号１のアミノ酸Ｇ１１１近辺からアミノ酸Ｄ１３５近辺に対応するα−ＳｙｎのＣ末端フラグメントからの約１０〜約２５個のアミノ酸残基を含むＢ細胞エピトープと、（ｂ）配列番号７０〜９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴヘルパーエピトープと、（ｃ）アミノ酸、Ｌｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、及びε-Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１４８）からなる群から選択される必要に応じた異種スペーサーと、を含み、Ｂ細胞エピトープは、直接または必要に応じた異種スペーサーを介してＴヘルパーエピトープに共有結合している。特定の実施形態では、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、配列番号１０７、１０８、１１１〜１１３、及び１１５〜１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
本開示はまた、医薬組成物を含む、開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物に関する。開示される医薬組成物は、宿主において開示されたペプチド免疫原コンストラクトに対する免疫応答及び抗体の産生を誘発することができる。開示される組成物は、開示されたペプチド免疫原コンストラクトの１つまたは１つを超えるものの混合物を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、担体、アジュバント、緩衝液、及び他の適切な試薬を含む追加の成分と一緒に、開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含む。ある特定の実施形態において、組成物は、アジュバントが必要に応じて補充されたＣｐＧオリゴマーとの安定化された免疫刺激複合体の形態で開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含む。
特定の実施形態では、組成物は、配列番号１０７、１０８、１１１〜１１３、１１５〜１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む。ある特定の実施形態では、組成物は、配列番号１０７、１０８、１１１〜１１３、１１５〜１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト、及び薬学的に許容可能な担体またはアジュバントを含む医薬組成物である。
本開示はまた、開示されるペプチド免疫原コンストラクトで免疫化された宿主によって産生される抗体に関する。開示される抗体は、ペプチド免疫原コンストラクトのα−ＳｙｎのＢ細胞エピトープ部分を特異的に認識して結合する。開示されるα−Ｓｙｎ抗体は、モノマー、オリゴマー、または原線維の形態でα−Ｓｙｎのβ−シートに対して予想外に高い交差反応性を有する。それらの独特の特徴及び特性に基づいて、開示される抗体は、シヌクレイノパチーの標的化、同定、及び治療に対する免疫療法的アプローチを提供することができる。
特定の実施形態では、抗体またはそのエピトープ結合フラグメントは、配列番号１０７、１０８、１１１〜１１３、１１５〜１４７からなる群から選択されるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトのＢ細胞エピトープに特異的に結合する。
本開示はまた、開示されるペプチド免疫原コンストラクト、抗体、及び組成物を作製及び使用する方法に関する。開示される方法は、ペプチド免疫原コンストラクト及びコンストラクトを含む組成物の低コストの製造及び品質管理を提供し、これはシノパシー（ｓｙｎｏｐａｔｈｙ）を予防及び治療する方法で使用することができる。
本開示はまた、開示されるペプチド免疫原コンストラクト及び／またはペプチド免疫原コンストラクトに対する抗体を使用してシヌクレイノパチーを治療及び／または予防する方法を含む。いくつかの実施形態では、シヌクレイノパチーを治療及び／または予防する方法は、開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物を宿主に投与することを含む。ある特定の実施形態では、方法で利用される組成物は、静電結合により、ＣｐＧオリゴマーなどの負に帯電したオリゴヌクレオチドとの安定な免疫刺激複合体の形で開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含み、この複合体は、必要に応じて、シヌクレイノパチーの患者への投与のためのアジュバントとしての無機塩または油がさらに補充される。開示される方法は、シヌクレイノパチーのリスクがある、またはシヌクレイノパチーを有する宿主にペプチド免疫原コンストラクトを投与するための投与計画、剤形、及び経路も含む。
様々な実施形態では、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト及び／またはα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによって誘発された抗体を使用する方法が記載されている。特定の実施形態では、方法は、抗体を産生し、α−Ｓｙｎ凝集を阻害し、α−Ｓｙｎ凝集体の量を低減し、異なるサイズのα−Ｓｙｎ凝集体を同定するためのものであり、それが記載されている。さまざまな方法は、薬理学的に有効な量のα−Ｓｙｎペプチド免疫原を、それを必要とする宿主に投与することを含む。
α−ＳｙｎのＣ末端に対する抗体の存在下（試料１〜４）または媒体対照の存在下（試料５）での６日後のｉｎ ｖｉｔｒｏでのα−Ｓｙｎ凝集のレベルを示すグラフである。具体的には、α−Ｓｙｎ凝集は、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（試料１）；α−Ｓｙｎ１２１−１３５（試料２）；α−Ｓｙｎ１２３−１３５（試料３）；α−Ｓｙｎ１２６−１３５（試料４）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体または媒体対照（試料５）の存在下で実施された。α−Ｓｙｎ凝集のレベルは、凝集体のチオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）染色により測定された。試料１〜４は、試料５の媒体対照に対して標準化された。エラーバーは、二重化された各研究のＳＥＭ（平均の標準誤差）を表す。 α−ＳｙｎのＣ末端に対する抗体（試料１〜３）または免疫前血清対照（試料４）の存在下で３日間、凝集体をインキュベートした後、事前に形成されたｉｎ ｖｉｔｒｏでのα−Ｓｙｎ凝集体の解離レベルを示すグラフである。具体的には、予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体を、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（試料１）；α−Ｓｙｎ１２６−１３５（試料２）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体、及びα−Ｓｙｎ１１１−１３２及びα−Ｓｙｎ１２６−１３５によって誘発される抗体の組み合わせ（試料３）、または免疫前血清対照（試料４）とともにインキュベートした。α−Ｓｙｎ凝集のレベルは、凝集体のチオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ）染色により測定された。試料１〜３は、試料４の免疫前血清対照に対して標準化された。エラーバーは、二重化された各研究のＳＥＭ（平均の標準誤差）を表す。 α−ＳｙｎのＣ末端に対する抗体（試料１〜４）または媒体対照（試料５）の存在下で神経成長因子（ＮＧＦ）とともにインキュベートされたα−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞におけるα−Ｓｙｎ凝集及びα−Ｓｙｎ脱凝集のレベルを示すグラフである。具体的には、ＰＣ１２細胞は、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（試料１）；α−Ｓｙｎ１２１−１３５（試料２）；α−Ｓｙｎ１２３−１３５（試料３）；α−Ｓｙｎ１２６−１３５（試料４）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体または媒体対照（試料５）とともにインキュベートされた。試料１〜４は、試料５の媒体対照に対して標準化された。エラーバーは、三重化された各研究のＳＤ（標準誤差）を表す。 α−ＳｙｎのＣ末端に対する抗体（試料１〜４）または媒体対照（試料５）の存在下でインキュベートされた細胞からのα−Ｓｙｎ凝集体を介したＴＮＦ−α及びＩＬ−６の放出レベルを示すグラフである。具体的には、ミクログリア細胞は、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（試料１）；α−Ｓｙｎ１２１−１３５（試料２）；α−Ｓｙｎ１２３−１３５（試料３）；α−Ｓｙｎ１２６−１３５（試料４）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体または媒体対照（試料５）とともにインキュベートされた。試料１〜４は、試料５の媒体対照に対して標準化された。エラーバーは、三重化された各研究のＳＤ（標準誤差）を表す。 図５Ａ〜図５Ｃは、ＮＧＦで誘導された神経分化ＰＣ１２細胞における外因性の予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体を有するｉｎ ｖｉｔｒｏ神経変性モデルでの抗α−Ｓｙｎ抗体の効果を示すグラフである。図５Ａは、ＮＧＦ単独（濃い実線）；外因性の予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体を伴うＮＧＦ（点線）；免疫前血清を伴うＮＧＦ（明るい実線）；ならびに外因性の予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体及び免疫前血清を伴うＮＧＦ（破線）で処理したＰＣ１２細胞の神経突起長を評価する。図５Ｂは、媒体を伴うＮＧＦ（濃い実線）；外因性の予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体を伴うＮＧＦ（点線）；α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）によって誘発された抗α−Ｓｙｎ抗体を伴うＮＧＦ（明るい実線）；ならびに外因性の予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体及びα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）によって誘発された抗α−Ｓｙｎ抗体を伴うＮＧＦ（破線）で処理したＰＣ１２細胞の神経突起長を評価する。 図５Ｃは、媒体を伴うＮＧＦ単独（濃い実線）；外因性の予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体を伴うＮＧＦ（点線）；α−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）によって誘発された抗α−Ｓｙｎ抗体を伴うＮＧＦ（明るい実線）；ならびに外因性の予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体及びα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）によって誘発された抗α−Ｓｙｎ抗体を伴うＮＧＦ（破線）で処理したＰＣ１２細胞の神経突起長を評価する。 図６Ａ及び図６Ｂは、ＮＧＦで誘導された神経分化野生型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ神経変性モデルにおける細胞数及び神経突起長に対する抗α−Ｓｙｎ抗体の効果を示すグラフである。細胞を媒体対照（試料１）；α−Ｓｙｎ１０１−１３２（試料２）、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（試料３）、α−Ｓｙｎ１２１−１３５（試料４）、α−Ｓｙｎ１２３−１３５（試料５）、α−Ｓｙｎ１２６−１３５（試料６）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体、α−Ｓｙｎ１１１−１３２及びα−Ｓｙｎ１２６−１３５によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体の組み合わせ（試料７）；または免疫前血清対照（試料８）によって処理した。図６Ａは、ＰＣ１２細胞の数の回復に対する各試料それぞれの保護効果を評価する。図６Ｂは、各試料で処理した細胞の神経突起長を評価する。試料１〜８は、ＮＧＦで誘導された神経分化野生型ＰＣ１２細胞に対して標準化された。ｔ検定は有意性を検定するために使用された（０．０５未満のｐ値は統計的に有意であると定義され、アスタリスク（＊）で示されている）。 図７Ａ及び図７Ｂは、ウエスタンブロット解析により、異なるサイズのα−Ｓｙｎ凝集体を認識及び結合する抗α−Ｓｙｎ抗体の能力を示している。図７Ａは、市販の抗α−Ｓｙｎ抗体であるＳｙｎ２１１（レーン１）；免疫前血清対照（レーン２）；Ｓｙｎ１１１−１３２により誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体（レーン３）；Ｓｙｎ１１１−１３５によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体（レーン４）；Ｓｙｎ１２１−１３５によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体（レーン５）；Ｓｙｎ１２３−１３５によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体（レーン６）；及び、α−Ｓｙｎ１２６−１３５によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体（レーン７）を比較するウエスタンブロットの画像である。 図７Ｂは、さまざまなサイズのα−Ｓｙｎ分子複合体（単量体、二量体、三量体、四量体、及びオリゴマーを含む）に結合する各抗体の相対的能力を示す棒グラフである。図７Ａに示したウエスタンブロットのバンドの化学発光シグナルを定量化し、図７Ｂの棒グラフに報告した。 図８Ａ〜図８Ｃは、α−ＳｙｎのＣ末端に対する抗体が異なる種のα−Ｓｙｎ（すなわち、αヘリックス単量体、β−シート単量体、β−シートオリゴマー及びβ−シート原線維）のみを認識して結合するが、他のアミロイド形成タンパク質（すなわち、Ａβ１−４２及びＴａｕ４４１）の同じ種には認識も結合もしないことを示すドットブロットの画像である。図８Ａは、モルモットの免疫前血清から精製した抗体が、アッセイしたすべてのタンパク質種に対して検出可能なレベルを示さなかったことを示す対照試料である。図８Ｂは、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）によって誘発された抗α−Ｓｙｎ抗体がα−Ｓｙｎ、Ａβ１−４２、及びＴａｕ４４１タンパク質の異なる種を認識して結合する能力を評価する。図８Ｃは、α−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）によって誘発された抗α−Ｓｙｎ抗体がα−Ｓｙｎ、Ａβ１−４２、及びＴａｕ４４１タンパク質の異なる種を認識して結合する能力を評価する。 図９は、免疫細胞化学（ＩＣＣ）研究で陽性シグナルによって測定された、さまざまなＰＣ１２細胞株における細胞内α−Ｓｙｎに対するα−ＳｙｎのＣ末端に対する抗体の相対的な結合親和性をまとめた表である。具体的には、α−Ｓｙｎ１１１−１３２、α−Ｓｙｎ１２１−１３５、α−Ｓｙｎ１２６−１３５によって誘発された抗α−Ｓｙｎ抗体、または免疫前血清対照試料の相対的結合親和性を、ＮＧＦ処理時の、親ＰＣ１２細胞、モック対照ＰＣ１２細胞、野生型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞、及びＡ５３Ｔ変異α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞で評価した。 図１０Ａ〜図１０Ｃは、α−ＳｙｎのＣ末端に対する抗体がＰＤ脳切片のα−Ｓｙｎにのみ結合し、健康な脳切片では結合しないことを示す。図１０Ａは、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトに誘発されたα−Ｓｙｎ抗体及び免疫前抗体が、脳切片を含む正常ヒト組織のパネルで免疫反応性の検出を示さなかったことを示す。 図１０Ｂは、矢じりで示されるように、ＰＤ視床切片のα−Ｓｙｎ凝集体に対する抗体の免疫反応性を示す。 図１０Ｃは、顕微鏡観察下で陽性染色を計数することにより決定された、ＰＤ及び健常な脳の切片におけるα−Ｓｙｎ凝集体に対するα−ＳｙｎのＣ末端に対する抗体及び免疫前血清対照の免疫反応性を報告する表である。 図１１Ａ及び図１１Ｂはアジュバント単独（白丸）またはα−Ｓｙｎ１１１−１３２（白四角）；α−Ｓｙｎ１２６−１３５（黒丸）；もしくは、α−Ｓｙｎ１１１−１３２とα−Ｓｙｎ１２６−１３５の組み合わせ（黒四角）を含むペプチド免疫原による３回の免疫化後のＰＤマウスモデルの血清中の抗α−Ｓｙｎ ＩｇＧのレベルを示すグラフである。図１１Ａは、ＭＰＰ＋誘導マウスモデルのＩｇＧレベルを示す。図１１Ｂは、線維性α−Ｓｙｎを接種したマウスモデルのＩｇＧレベルを示す。 図１２Ａ及び図１２Ｂは、アジュバント単独（白丸）またはα−Ｓｙｎ１１１−１３２（白四角）；α−Ｓｙｎ１２６−１３５（黒丸）；もしくは、α−Ｓｙｎ１１１−１３２とα−Ｓｙｎ１２６−１３５の組み合わせ（黒四角）を含むペプチド免疫原による３回の免疫化後のＰＤマウスモデルの末梢循環中のα−Ｓｙｎのレベルを示すグラフである。図１２Ａは、ＭＰＰ＋誘導マウスモデルのα−Ｓｙｎレベルを示す。図１２Ｂは、線維性α−Ｓｙｎを接種したマウスモデルのα−Ｓｙｎレベルを示す。 図１３Ａ及び図１３Ｂは、アジュバント単独（レーン２）またはα−Ｓｙｎ１１１−１３２を含むペプチド免疫原（レーン３）による３回の免疫化を行った未処理の健康なマウスモデル（レーン１）またはＰＤマウスモデル（レーン２〜３）の脳試料中のオリゴマーα−Ｓｙｎのレベルを示す。未処理のＢａｌｂ／ｃマウスは健康なマウスモデルを表し、ＭＰＰ＋誘導マウスはＰＤマウスモデルを表す。図１３Ａは、試料中のオリゴマーα−Ｓｙｎのレベル及びタンパク質ローディング対照としてのＧＡＰＤＨのレベルを示すウエスタンブロットである。図１３Ｂは、タンパク質レベルをＧＡＰＤＨレベルで標準化し、未処理の健康なマウスモデル溶解物の比率を比較のために１．００のレベルにさらに標準化した後、図１３Ａのウエスタンブロットに示される相対的オリゴマーα−Ｓｙｎレベルを比較するグラフである。 図１４Ａ〜図１４Ｇは、アジュバント単独（レーン２）またはα−Ｓｙｎ１１１−１３２（レーン３）もしくはα−Ｓｙｎ１２６−１３５（レーン４）を含むペプチド免疫原による３回の免疫化を行った未処理の健康なマウスモデル（レーン１）またはＰＤマウスモデル（レーン２〜４）の脳試料中のオリゴマーα−Ｓｙｎ及びチロシンヒドロキシラーゼのレベルを示す。未処理のＦＶＢマウスは健康なマウスモデルを表し、線維性α−Ｓｙｎ接種マウスはＰＤマウスモデルを表す。図１４Ａは、同側の黒質の溶解物中のオリゴマーα−Ｓｙｎ及びチロシンヒドロキシラーゼのレベル、ならびにタンパク質ローディング対照としてのＧＡＰＤＨのレベルを示すウエスタンブロットである。図１４Ｂは、タンパク質レベルをＧＡＰＤＨレベルで標準化した後、図１４Ａのウエスタンブロットに示される相対的オリゴマーα−Ｓｙｎレベルを比較するグラフである。図１４Ｃは、タンパク質レベルをＧＡＰＤＨレベルで標準化した後、図１４Ａのウエスタンブロットに示される相対的チロシンヒドロキシラーゼタンパク質レベルを比較するグラフである。 図１４Ｄは、同側の線条体の溶解物中のオリゴマーα−Ｓｙｎ及びタンパク質ローディング対照としてのＧＡＰＤＨのレベルを示すウエスタンブロットである。図１４Ｅは、タンパク質レベルをＧＡＰＤＨレベルで標準化した後、図１４Ｃのウエスタンブロットに示される相対的オリゴマーα−Ｓｙｎレベルを比較するグラフである。 図１４Ｆは、反対側の線条体の溶解物中のオリゴマーα−Ｓｙｎ及びタンパク質ローディング対照としてのＧＡＰＤＨのレベルを示すウエスタンブロットである。図１４Ｇは、タンパク質レベルをＧＡＰＤＨレベルで標準化した後、図１４Ｅのウエスタンブロットに示される相対的オリゴマーα−Ｓｙｎレベルを比較するグラフである。 図１５Ａ〜図１５Ｃは、生理食塩水（レーン１）もしくはアジュバント単独（レーン２）で処理した健康なマウスモデル（レーン１〜２）、あるいはアジュバント単独（レーン３）またはα−Ｓｙｎ１２６−１３５（レーン４）もしくはα−Ｓｙｎ１１１−１３２（レーン５）を含むペプチド免疫原のいずれかで免疫化したＰＤマウスモデル（レーン３〜５）において、ＣａｔＷａｌｋ（商標）ＸＴで測定したマウスの運動機能を評価するグラフである。ｔ検定は有意性を検定するために使用された（０．０５未満のｐ値は統計的に有意であると定義され、アスタリスク「＊」で示されている）。図１５Ａは、処理マウスの左後肢立ち（秒）を評価し、未処理のＦＶＢマウスは健康なマウスモデルを表し、線維性α−Ｓｙｎ接種マウスはＰＤマウスモデルを表す。図１５Ｂは、処理マウスの走行時間（秒）を評価し、未処理のＦＶＢマウスは健康なマウスモデルを表し、線維性α−Ｓｙｎ接種マウスはＰＤマウスモデルを表す。図１５Ｃは、処理マウスの走行時間（秒）を評価し、未処理のＢａｌｂ／ｃマウスは健康なマウスモデルを表し、ＭＰＰ＋誘導マウスはＰＤマウスモデルを表す。 図１６Ａは、ＰＤ−０２１５１４（α−Ｓｙｎ８５−１４０、ｗｐｉ ０８）が最高の親和性でα−Ｓｙｎひずみ原線維を認識することを示す。ひずみリボンと原線維−９１への良好な結合が観察される。オリゴマー及びフィブリル−６５への不十分な結合。α−Ｓｙｎ単量体及びＣ末端の３０アミノ酸残基を欠く原線維（Ｆｉｂ−１１０）への不十分な結合。 図１６Ｂは、ＰＤ−０２１５２２（α−Ｓｙｎ８５−１４０、ｗｐｉ １３）がすべてのひずみ／オリゴマーに結合し、単量体に結合せず、シグナルにおける濃度依存的増加を観察しないことを示す。抗体は、Ｃ末端の３０アミノ酸残基を欠く原線維（Ｆｉｂ−１１０）に結合する。したがって、エピトープはこの領域内にない。 図１６Ｃは、ＰＤ−１００８０６（α−Ｓｙｎ１２６−１３５、ｗｐｉ ０９）がすべてのひずみに結合し、リボンに対して最も高い親和性を示すことを示す。その抗体は、低い効率で天然オリゴマーのα−Ｓｙｎと結合する。グルタルアルデヒド、ドーパミン架橋オリゴマー、及び単量体α−Ｓｙｎへの結合はほとんど観察されない。抗体は、Ｃ末端３０アミノ酸残基を欠く原線維（Ｆｉｂ−１１０）に結合しないため、おそらくはα−Ｓｙｎ３０ Ｃ末端アミノ酸残基に対するものである。 図１６Ｄは、市販の抗体Ｓｙｎ１（クローン４２、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が、グルタルアルデヒド架橋を除くすべてのα−Ｓｙｎひずみ及びオリゴマーに結合することを示す。その抗体はまた、単量体のａｓｙｎに結合する。そのエピトープは、残基９１から９６／９９にまたがると記載されている。それと一致して、その抗体は、Ｃ末端の３０アミノ酸残基を欠く原線維（Ｆｉｂ−１１０）に結合する。 図１６Ｅは、ＰＲＸ００２が単量体α−Ｓｙｎと比べてわずかに良好な親和性で線維性α−Ｓｙｎを認識することを示す。 図１６Ｆは、モルモットで生成された抗体のバックグラウンドの対照を示す。 図１６Ｇは、抗体Ｓｙｎ１のバックグラウンドの対照を示す。 図１６Ｈは、ＰＲＸ００２のバックグラウンドの対照を示す。 図１７Ａ〜図１７Ｄは、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）患者の大脳基底核におけるα−Ｓｙｎに対するＵＮＳ抗体の特異性のＩＨＣ分析である。各抗体（ＰＤ０６２２２０、ＰＤ０６２２０５、ＰＤ１００８０６、及びＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮ）で染色されたα−Ｓｙｎ凝集体の平均パーセンテージ面積は、被殻（図１７Ａ）、内包（図１７Ｂ）、及び島皮質（図１７Ｃ）の総面積７．５ｍｍ２について決定された。各抗体による被殻の免疫染色の代表的な顕微鏡画像を図１７Ｄに示す。ＵＮＳ抗体は、被殻（ＡＮＯＶＡによるＦ（３，７）＝１．５５０、ｐ＝０．２８４）、内包（ＡＮＯＶＡによるＦ（３，７）＝１．３５６、ｐ＝０．３３２）、及び島皮質（ＡＮＯＶＡによるＦ（３，８）＝２．０５０、ｐ＝０．１９５）でより高いパーセンテージ面積のα−Ｓｙｎ凝集体を検出した。Ｐ＜０．０５（＊）；Ｐ＜０．０１（＊＊）；Ｐ＜０．００１（＊＊＊）。データは平均＋ＳＤ（エラーバー）として示される。 図１８Ａ〜図１８Ｄは、パーキンソン病（ＰＤ）患者の大脳基底核におけるα−Ｓｙｎに対するＵＮＳ抗体の特異性のＩＨＣ分析である。各抗体（ＰＤ０６２２２０、ＰＤ０６２２０５、ＰＤ１００８０６、及びＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮ）で染色されたα−Ｓｙｎ凝集体の平均パーセンテージ面積は、３症例のＰＤの被殻（図１８Ａ）、内包（図１８Ｂ）、及び島皮質（図１８Ｃ）の総面積７．５ｍｍ２について決定された。免疫染色の代表的な顕微鏡画像を、被殻について図１８Ｄに示す。ＵＮＳ抗体は、被殻（ＡＮＯＶＡによるＦ（３，１８）＝４．１５２、ｐ＝０．０４７）、内包（ＡＮＯＶＡによるＦ（３，８）＝１．９９５、ｐ＝０．１９３４）、及び島皮質（ＡＮＯＶＡによるＦ（３，８）＝０．４０４４、ｐ＝０．７５４）でより高いパーセンテージ面積のα−Ｓｙｎ凝集体を検出した。ＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮと比較して、ＰＤ１００８０６ではα−Ｓｙｎの有意に高いパーセンテージ面積が検出された（ＰＤ１００８０６対ＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮについてｐ＝０．０２３；ｎ＝３）。Ｐ＜０．０５（＊）；Ｐ＜０．０１（＊＊）；Ｐ＜０．００１（＊＊＊）。一元配置ＡＮＯＶＡに続いてダネット検定を行った。データは平均＋ＳＤ（エラーバー）として示される。 図１９Ａ〜図１９Ｃは、多系統萎縮症（ＭＳＡ）患者の大脳基底核におけるα−Ｓｙｎに対するＵＮＳ抗体の特異性のＩＨＣ分析である。各抗体（ＰＤ０６２２２０、ＰＤ０６２２０５、ＰＤ１００８０６、及びＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮ）で染色されたα−Ｓｙｎ凝集体の平均パーセンテージ面積は、３症例のＭＳＡの被殻（図１９Ａ）、及び内包（図１９Ｂ）の総面積７．５ｍｍ２について決定された。ＭＳＡ患者の島皮質では病理が検出されなかったため、定量化されなかった。ＵＮＳ抗体は、被殻（ＡＮＯＶＡによるＦ（３，８）＝１．５６、ｐ＝０．２７３）及び内包（ＡＮＯＶＡによるＦ（３，８）＝１．１２６、ｐ＝０．３９５）でより高いパーセンテージ面積のα−Ｓｙｎ凝集体を検出した。免疫染色の代表的な顕微鏡画像を、被殻について図１９Ｃに示し、各抗体はＣに示す。Ｐ＜０．０５（＊）；Ｐ＜０．０１（＊＊）；Ｐ＜０．００１（＊＊＊）。データは平均＋ＳＤ（エラーバー）として示される。 図２０Ａ〜図２０Ｅは、異なるシヌクレイノパチー患者の中脳におけるα−Ｓｙｎに対するＵＮＳ抗体の特異性のＩＨＣ分析である。各抗体（ＰＤ０６２２２０、ＰＤ０６２２０５、ＰＤ１００８０６、及びＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮ）で染色されたα−Ｓｙｎ凝集体の平均パーセンテージ面積は、ＰＤ（図２０Ａ）、ＤＬＢ（図２０Ｂ）、及びＭＳＡ（図２０Ｃ）の患者の黒質の総面積７．５ｍｍ２について決定された。各抗体によって染色されたパーセンテージ面積を、診断抗体であるＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮと比較した。ＵＮＳ抗体は、ＭＳＡ（ＡＮＯＶＡによるＦ（３，８）＝０．８３０、ｐ＝０．５１）、ＤＬＢ（ＡＮＯＶＡによるＦ（３，７）＝２．４９３、ｐ＝０．１４４）、及びＰＤ（ＡＮＯＶＡによるＦ（３，７）＝０．１８９、ｐ＝０．９００）の患者の黒質でより高いパーセンテージ面積のα−Ｓｙｎ凝集体を検出した。 各抗体による免疫染色の代表的な顕微鏡画像を図２０Ｄ（ＭＳＡ）及び図２０Ｅ（ＤＬＢ）に示す。Ｐ＜０．０５（＊）；Ｐ＜０．０１（＊＊）；Ｐ＜０．００１（＊＊＊）。データは平均＋ＳＤ（エラーバー）として示される。 図２１Ａ〜図２１Ｆは、異なるシヌクレイノパチー患者の側頭皮質の白質及び灰白質におけるα−Ｓｙｎに対するＵＮＳ抗体の特異性のＩＨＣ分析である。各抗体（ＰＤ０６２２２０、ＰＤ０６２２０５、ＰＤ１００８０６、及びＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮ）で染色されたα−Ｓｙｎ凝集体の平均パーセンテージ面積は、ＰＤ（図２１Ａ及び２１Ｄ）、ＤＬＢ（図２１Ｂ及び２１Ｅ）、ならびにＭＳＡ（図２１Ｃ及び２１Ｆ）の患者の皮質灰白質及び皮質下白質の総面積７．５ｍｍ２について決定された。各抗体によって染色されたパーセンテージ面積を、診断抗体であるＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮと比較した。Ｐ＜０．０５（＊）；Ｐ＜０．０１（＊＊）；Ｐ＜０．００１（＊＊＊）。一元配置ＡＮＯＶＡに続いてダネット検定を行った。データは平均＋ＳＤ（エラーバー）として示される。 図２２Ａ〜図２２Ｃは、異なるシヌクレイノパチー患者の小脳におけるα−Ｓｙｎに対するＵＮＳ抗体の特異性のＩＨＣ分析である。各抗体（ＰＤ０６２２２０、ＰＤ０６２２０５、ＰＤ１００８０６、及びＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮ）で染色されたα−Ｓｙｎ凝集体の平均パーセンテージ面積は、ＰＤ（図２２Ａ）、ＤＬＢ（図２２Ｂ）、及びＭＳＡ（図２２Ｃ）の患者の小脳白質の総面積７．５ｍｍ２について決定された。ＵＮＳ抗体は、ＭＳＡ（ＡＮＯＶＡによるＦ（３，８）＝０．９２９、ｐ＝０．４６９）、ＤＬＢ（ＡＮＯＶＡによるＦ（３，６）＝１．４２６、ｐ＝０．３２５）、及びＰＤ（ＡＮＯＶＡによるＦ（３，６）＝２．５０９、ｐ＝０．１５７）でより高いパーセンテージ面積のα−Ｓｙｎ凝集体を検出した。各抗体によって染色されたパーセンテージ面積を、診断抗体であるＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮと比較した。Ｐ＜０．０５（＊）；Ｐ＜０．０１（＊＊）；Ｐ＜０．００１（＊＊＊）。データは平均＋ＳＤ（エラーバー）として示される。 図２３Ａ及び図２３Ｂは、各抗体による非罹患対照患者の脳からの黒質（図２３Ａ）及び被殻（図２３Ｂ）の免疫染色の代表的な画像である。いずれのＵＮＳ抗体も、ＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮ診断抗体に匹敵するα−Ｓｙｎ病理をいっさい検出しなかった。 図２４Ａ〜図２４Ｄは、ＤＬＢ患者またはＰＤ患者の大脳基底核の島皮質におけるＬＢに対するＵＮＳ抗体の特異性のＩＨＣ分析である。各抗体（ＰＤ０６２２２０、ＰＤ０６２２０５、ＰＤ１００８０６、及びＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮ）で検出された免疫陽性ＬＢの平均パーセンテージ面積は、ＰＤ（図２４Ａ）、及びＤＬＢ（図２４Ｂ）の患者の島皮質の総面積７．５ｍｍ２について決定された。ＬＢのパーセンテージ面積は、各抗体で検出された総α−Ｓｙｎの割合として表される。ＵＮＳ抗体は、ＤＬＢ（ＡＮＯＶＡによるＦ（３，７）＝０．８３６、ｐ＝０．５１６）及びＰＤ（ＡＮＯＶＡによるＦ（３，４）＝０．９１３、ｐ＝０．５１０）の患者の島皮質で、より低い割合のＬＢ（またはより高い割合のＬＮ）を検出した。各抗体によって染色されたパーセンテージ面積を、診断抗体であるＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮと比較した。 各抗体による免疫染色の代表的な顕微鏡画像を図２４Ｃ（ＰＤ）及び図２４Ｄ（ＤＬＢ）に示す。Ｐ＜０．０５（＊）；Ｐ＜０．０１（＊＊）；Ｐ＜０．００１（＊＊＊）。データは平均＋ＳＤ（エラーバー）として示される。 図２５Ａ〜図２５Ｄは、ＤＬＢ患者またはＰＤ患者の側頭皮質の灰白質におけるＬＢに対するＵＮＳ抗体の特異性のＩＨＣ分析である。各抗体（ＰＤ０６２２２０、ＰＤ０６２２０５、ＰＤ１００８０６、及びＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮ）で検出された免疫陽性ＬＢの平均パーセンテージ面積は、ＰＤ（図２５Ａ）、及びＤＬＢ（図２５Ｂ）の患者の灰白質の総面積７．５ｍｍ２について決定された。ＬＢのパーセンテージ面積は、各抗体で検出された総α−シヌクレインの割合として表される。ＵＮＳ抗体は、ＰＤ（ＡＮＯＶＡによるＦ（２，３）＝１．９８３、ｐ＝０．２８２）及びＤＬＢ（ＡＮＯＶＡによるＦ（３，７）＝１．９０６、ｐ＝０．２１７）の患者の灰白質で、より低い割合のＬＢ（またはより高い割合のＬＮ）を検出した。各抗体によって染色されたパーセンテージ面積を、診断抗体であるＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮと比較した。 各抗体による免疫染色の代表的な顕微鏡画像を図２５Ｃ（ＰＤ）及び図２５Ｄ（ＤＬＢ）に示す。Ｐ＜０．０５（＊）；Ｐ＜０．０１（＊＊）；Ｐ＜０．００１（＊＊＊）。データは平均＋ＳＤ（エラーバー）として示される。 図２６Ａ及び図２６Ｂは、ＰＤ（図２６Ｂ）のＤＬＢ（図２６Ａ）患者の中脳の黒質におけるＵＮＳ抗体及びＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮによる免疫染色の代表的な画像である。ＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮと比較して、ＵＮＳ抗体によるＬＮの高い検出が見られる。 図２７Ａ〜図２７Ｃは、α−Ｓｙｎの細胞特異的凝集。ＰＤ（図２７Ａ）、ＤＬＢ（図２７Ｂ）、及びＭＳＡ（図２７Ｃ）を有するヒトの症例の大脳基底核及び中脳からのα−Ｓｙｎ凝集体の最大投影オーバーレイ共焦点画像である。α−Ｓｙｎ（ＰＤ０６２２０５、赤）は、ＰＤとＤＬＢの症例ではニューロン内（ＨｕＤ、緑）に凝集するが、ＭＳＡでは凝集しない。α−Ｓｙｎ（ＰＤ０６２２０５）及びＨｕＤは、出願とともに提出されるグレースケールの図面でラベル付けされているが、要求に応じてカラーコピーを利用できる。スケールバー：１０μＭ。 図２８Ａ〜図２８Ｃは、α−Ｓｙｎの細胞特異的凝集。ＰＤ（図２８Ａ）、ＤＬＢ（図２８Ｂ）、及びＭＳＡ（図２８Ｃ）のヒトの症例からのα−Ｓｙｎ凝集体の最大投影オーバーレイ共焦点画像である。α−Ｓｙｎ（ＰＤ０６２２０５、赤）凝集体は、ＭＳＡの場合は希突起膠細胞（Ｏｌｉｇ２、緑）内にあるが、ＰＤまたはＤＬＢではそうではない。α−Ｓｙｎ（ＰＤ０６２２０５）及びＯｌｉｇ２は、出願とともに提出されるグレースケールの図面でラベル付けされているが、要求に応じてカラーコピーを利用できる。スケールバー：１０μＭ。
発明の詳細な説明
本開示は、アルファ−シヌクレインタンパク質（α−Ｓｙｎ）のペプチド免疫原コンストラクトに関する。本開示はまた、ペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物、ペプチド免疫原コンストラクトを作製及び使用する方法、ならびにペプチド免疫原コンストラクトによって産生される抗体に関する。
開示されるペプチド免疫原コンストラクトは、異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに直接または必要に応じて異種スペーサーを介して連結されたα−ＳｙｎからのＢ細胞エピトープを含む。ペプチド免疫原コンストラクトのＢ細胞エピトープ部分は、全長α−Ｓｙｎ（配列番号１）のアミノ酸１１１位のグリシン（Ｇ１１１）近辺からアミノ酸１３５位のアスパラギン（Ｄ１３５）近辺までの配列に対応するα−ＳｙｎのＣ末端からの約１０から約２５アミノ酸残基を含む。ペプチド免疫原コンストラクトの異種Ｔｈエピトープ部分は、病原性タンパク質に由来するアミノ酸配列に由来する。ペプチド免疫原コンストラクトのＢ細胞エピトープ部分及びＴｈエピトープ部分は、宿主に投与されると一緒に作用して、コンストラクトのα−ＳｙｎのＢ細胞エピトープ部分を特異的に認識して結合する抗体の生成を刺激する。
本開示はまた、医薬組成物を含む、開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物に関する。開示される医薬組成物は、宿主において開示されたペプチド免疫原コンストラクトに対する免疫応答及び抗体の産生を誘発することができる。開示される組成物は、開示されたペプチド免疫原コンストラクトの１つまたは１つを超えるものの混合物を含むことができる。いくつかの実施形態では、組成物は、担体、アジュバント、緩衝液、及び他の適切な試薬を含む追加の成分と一緒に、開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含む。ある特定の実施形態において、組成物は、アジュバントが必要に応じて補充されたＣｐＧオリゴマーとの安定化された免疫刺激複合体の形態で開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含む。
本開示はまた、開示されるペプチド免疫原コンストラクトで免疫化された宿主によって産生される抗体に関する。開示される抗体は、ペプチド免疫原コンストラクトのα−ＳｙｎのＢ細胞エピトープ部分を特異的に認識して結合する。開示されるα−Ｓｙｎ抗体は、モノマー、オリゴマー、または原線維の形態でα−Ｓｙｎのβ−シートに対して予想外に高い交差反応性を有する。それらの独特の特徴及び特性に基づいて、開示される抗体は、シヌクレイノパチーの標的化、同定、及び治療に対する免疫療法的アプローチを提供することができる。
本開示はまた、開示されるペプチド免疫原コンストラクト、抗体、及び組成物を作製及び使用する方法に関する。開示される方法は、ペプチド免疫原コンストラクト及びコンストラクトを含む組成物の低コストの製造及び品質管理を提供し、これはシノパシー（ｓｙｎｏｐａｔｈｙ）を予防及び治療する方法で使用することができる。
本開示はまた、開示されるペプチド免疫原コンストラクト及び／またはペプチド免疫原コンストラクトに対する抗体を使用してシヌクレイノパチーを治療及び／または予防する方法を含む。いくつかの実施形態では、シヌクレイノパチーを治療及び／または予防する方法は、開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物を宿主に投与することを含む。ある特定の実施形態では、方法で利用される組成物は、静電結合により、ＣｐＧオリゴマーなどの負に帯電したオリゴヌクレオチドとの安定な免疫刺激複合体の形で開示されるペプチド免疫原コンストラクトを含み、この複合体は、必要に応じて、シヌクレイノパチーの患者への投与のためのアジュバントとしての無機塩または油がさらに補充される。開示される方法は、シヌクレイノパチーのリスクがある、またはシヌクレイノパチーを有する宿主にペプチド免疫原コンストラクトを投与するための投与計画、剤形、及び経路も含む。
本明細書に使用される節の見出しは、構成目的のものに過ぎず、記載される主題を限定すると解釈されるものではない。本出願で引用されるすべての参考文献または参考文献の一部は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
別途説明されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本発明の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形の用語には、文脈が他を明確に示さない限り、複数の指示対象が含まれる。同様に、「または」という単語は、文脈で明確に示されていない限り、「及び」を含むことを意図している。したがって、「ＡまたはＢを含むこと」とは、ＡもしくはＢ、またはＡ及びＢを含むことを意味する。さらに、ポリペプチドに与えられた全てのアミノ酸サイズ、及び全ての分子量または分子質量値が近似であり、説明のために提供されていることを理解されたい。本明細書において記載されているものと類似または同等の方法及び物質を開示される方法の実施または試験において使用することができるが、適切な方法及び物質を以下に記載する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書が優位となるであろう。更に、物質、方法、及び例は、例示にすぎず、限定を意図しない。
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト
本開示は、異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに直接または必要に応じて異種スペーサーを介して共有結合されたα−ＳｙｎからのＢ細胞エピトープを含むペプチド免疫原コンストラクトを提供する。
本明細書で使用されるとき、「α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト」という語句は、（ａ）全長α−Ｓｙｎ（配列番号１）のアミノ酸１１１位のグリシン（Ｇ１１１）近辺からアミノ酸１３５位のアスパラギン（Ｄ１３５）近辺までの配列に対応するα−ＳｙｎのＣ末端からの約１０から約２５アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープと、（ｂ）異種Ｔｈエピトープと、（ｃ）必要に応じた異種スペーサーと、を含む、ペプチドを指す。
ある特定の実施形態では、ペプチド免疫原コンストラクトは、式：
（Ｔｈ）ｍ−（Ａ）ｎ−（α−ＳｙｎのＣ末端フラグメント）−Ｘ
または
（α−ＳｙｎのＣ末端フラグメント）−（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ
で表すことができ、
式中、
Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり、
Ａは異種スペーサーであり、
（α−ＳｙｎのＣ末端フラグメント）は、α−ＳｙｎのＣ末端から約１０から約２５のアミノ酸残基を持つＢ細胞エピトープであり、
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨまたはα−ＣＯＮＨ２であり、
ｍは、１〜約４であり、
ｎは、０〜約１０である。
開示されるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトのさまざまな構成要素を以下に説明する。
ａ． α−Ｓｙｎ及びα−ＳｙｎのＣ末端フラグメント
本明細書で使用されるとき、「α−Ｓｙｎ」、「アルファ−シヌクレイン」、「α−シヌクレイン」などの用語は、α−Ｓｙｎを発現する任意の生物由来の（ａ）全長α−Ｓｙｎタンパク質及び／または（ｂ）そのフラグメントを指す。α−Ｓｙｎは、膜結合、細胞質、及びアミロイド凝集の状態でのさまざまな条件に適応し、汎用性の高い機能を果たす、極端な立体構造の多様性を特徴とする。いくつかの実施形態では、α−Ｓｙｎタンパク質はヒト由来である。ある特定の実施形態では、全長ヒトα−Ｓｙｎタンパク質（受託番号ＮＰ＿０００３３６）（配列番号１）は１４０個のアミノ酸を有する。
本明細書で使用されるとき、α−Ｓｙｎの「Ｃ末端領域」または「Ｃ末端」という語句は、α−Ｓｙｎのカルボキシル末端部分からの任意のアミノ酸配列を指す。特定の実施形態では、α−ＳｙｎのＣ末端領域またはＣ末端は、α−Ｓｙｎの残基９６〜１４０の間のアミノ酸配列、またはそのフラグメントに関する。α−ＳｙｎのＣ末端領域は、プロリンと負に帯電した残基に富み、これらは溶解性を維持する天然変性タンパク質に見られる一般的な特性である。α−ＳｙｎのＣ末端領域は、疎水性が低く、正味の負電荷が大きいため、一般的にランダムコイル構造で存在する。ｉｎ ｖｉｔｒｏの研究により、これらの負電荷を中和するｐＨの低下によってα−Ｓｙｎ凝集が誘発できることが明らかになっている。
本明細書で使用されるとき、「α−ＳｙｎのＣ末端フラグメント」または「α−ＳｙｎのＣ末端からのＢ細胞エピトープ」という語句は、全長α−Ｓｙｎのアミノ酸１１１位のグリシン（Ｇ１１１）近辺からアミノ酸１３５位のアスパラギン（Ｄ１３５）近辺までの配列に対応するα−ＳｙｎのＣ末端からの約１０から約２５アミノ酸残基を含む全長α−Ｓｙｎ配列の一部を指す。α−ＳｙｎＣ末端フラグメントは、本明細書ではα−ＳｙｎのＧ１１１−Ｄ１３５ペプチド及びそのフラグメントとも呼ばれる。本明細書に記載される様々なα−ＳｙｎのＣ末端フラグメントは、配列番号１により表されるα−Ｓｙｎの全長配列に対するそれらのアミノ酸位置により言及される。
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで使用されるα−ＳｙｎＣの末端フラグメントのアミノ酸配列は、多くの設計原理に基づいて選択された。これらの原理のいくつかには、以下のα−Ｓｙｎペプチド配列の使用が含まれる：
（ｉ）β−Ｓｙｎはα−Ｓｙｎに結合してその凝集を防ぐことができるため、β−Ｓｙｎと交差反応する抗体の生成を避けるために、ベータ−シヌクレイン（β−Ｓｙｎ）と大幅な配列相同性を共有しない。
（ｉｉ）アルツハイマー病の治療のためにＡβ１−４２を標的とするＡＮ１７９２ワクチンを使用した臨床試験で以前に報告されているように、髄膜炎菌性脳炎を引き起こす脳の炎症をもたらす可能性のある自己Ｔ細胞活性化を防ぐために、α−Ｓｙｎ内に自己Ｔヘルパーエピトープを欠く。
（ｉｉｉ）その天然の形態からの立体構造変化の影響を受けやすいα−Ｓｙｎの領域内に含まれる。
（ｉｖ）自己分子であるため、それ自体は非免疫原性である。
（ｖ）タンパク質担体または強力なＴヘルパーエピトープ（複数可）によって免疫原性を付与できる。
（ｖｉ）免疫原性を付与され、宿主に投与されるとき：
（ａ）タンパク質担体または強力なＴヘルパーエピトープ（複数可）ではなく、α−Ｓｙｎペプチド配列（Ｂ細胞エピトープ）に対する高力価抗体を誘発する。
（ｂ）単量体、オリゴマー、または原線維の形態で、α−Ｓｙｎの変性β−シートと反応する高力価抗体を誘発し、そのような抗体がα−Ｓｙｎの凝集を防ぎ、あらゆるα−Ｓｙｎの凝集体を脱凝集させ、毒性のあるα−Ｓｙｎオリゴマー、凝集体、及び／または原線維の除去をもたらし、したがって、脳内に負荷されるα−Ｓｙｎ凝集体が軽減または防止される。
（ｃ）天然α−Ｓｙｎは広い組織分布を持つ主要な細胞タンパク質であるため、高い安全性の懸念を呈する天然α−Ｓｙｎと反応する抗体を誘発しない。
これらの設計原理を考慮して、α−ＳｙｎのＣ末端領域がペプチド免疫原設計の標的として選択された。さらに、α−ＳｙｎのＣ末端領域が選択されたのは、その構造特性に基づいて、この領域がα−Ｓｙｎの他の領域と比較して抗体または他の物理的要因による調節に最も影響を受けやすいと考えられたからである。
実施例でさらに説明するように、α−Ｓｙｎに由来する多数のペプチド配列の評価により、上述の設計原理を満たす複数のα−Ｓｙｎペプチドの同定及び選択がもたらされた。具体的には、設計原理を満たす配列には、全長α−Ｓｙｎのアミノ酸１１１位のグリシン（Ｇ１１１）近辺からアミノ酸１３５位のアスパラギン（Ｄ１３５）近辺までの配列に対応するα−ＳｙｎのＣ末端領域からの約１０から約２５アミノ酸残基を有するペプチドが含まれる。
いくつかの実施形態では、α−ＳｙｎのＣ末端フラグメントは、配列番号１２で表される２５アミノ酸のα−ＳｙｎのＧ１１１−Ｄ１３５ペプチドである。他の実施形態では、α−ＳｙｎのＣ末端フラグメントは、配列番号１２で表されるα−ＳｙｎＧ１１１−Ｄ１３５ペプチドの約１０個の連続したアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、α−ＳｙｎのＣ末端フラグメントは、配列番号１２で表されるα−ＳｙｎＧ１１１−Ｄ１３５ペプチドの、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続したアミノ酸を含む。特定の実施形態では、α−ＳｙｎのＣ末端フラグメントは、表１に示されるように、配列番号１２〜１５、１７、または４９〜６４によって表されるアミノ酸配列を有する。
本開示のα−ＳｙｎのＣ末端フラグメントはまた、α−ＳｙｎＧ１１１−Ｄ１３５ペプチドの免疫学的に機能的な類似体または相同体、及びそのフラグメントを含む。α−ＳｙｎＧ１１１−Ｄ１３５ペプチド及びそのフラグメントの機能的免疫学的類似体または相同体には、元のペプチドと実質的に同じ免疫原性を保持するバリアントが含まれる。免疫学的に機能的な類似体は、アミノ酸位置の保存的置換；全体的な電荷の変更；別の部分への共有結合；またはアミノ酸の付加、挿入、もしくは削除；及び／またはそれらの任意の組み合わせを有することができる。
保存的置換とは、あるアミノ酸残基が、類似の化学的性質を持つ別のアミノ酸残基に置換されるときである。たとえば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれ；正に帯電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、及びヒスチジンが含まれ；負に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸とグルタミン酸が含まれる。
免疫学的に機能的な類似体には、α−ＳｙｎＧ１１１−Ｄ１３５ペプチドと交差反応する免疫応答を誘発する１〜約４個のアミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失、または挿入を含むアミノ酸配列が含まれる。保存的置換、付加、及び挿入は、天然または非天然のアミノ酸により達成できる。非天然アミノ酸には、ε−Ｎリジン、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリン、アミノ安息香酸、６−アミノカプロン酸（Ａｃａ；６−アミノヘキサン酸）、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、３−ニトロチロシン、ピログルタミン酸などが含まれるがこれらに限定されない。天然に存在するアミノ酸には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンが含まれる。
一実施形態では、特定のペプチドの機能的免疫学的類似体は、元のペプチドと同じアミノ酸配列を含み、α−ＳｙｎＧ１１１−Ｄ１３５ペプチド及びそのフラグメントのＢ細胞エピトープペプチドのアミノ末端に付加された３個のリジン残基（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）をさらに含む。この実施形態では、元のペプチド配列に３個のリジン残基を含めることにより、元のペプチドの全体的な電荷が変化するが、元のペプチドの機能は変化しない。
ある特定の実施形態では、α−ＳｙｎのＣ末端フラグメントの機能的類似体は、元のアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する。他の実施形態では、機能的類似体は、元のアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する。さらに他の実施形態では、機能的類似体は、元のアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有する。さらに他の実施形態では、機能的類似体は、元のアミノ酸配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％の同一性を有する。
ｂ．異種Ｔヘルパー細胞エピトープ（Ｔｈエピトープ）
本開示は、異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに直接または必要に応じて異種スペーサーを介して共有結合されたα−ＳｙｎからのＢ細胞エピトープを含むペプチド免疫原コンストラクトを提供する。
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの異種Ｔｈエピトープは、α−ＳｙｎのＣ末端フラグメントの免疫原性を増強し、合理的設計を通じて最適化された標的Ｂ細胞エピトープ（すなわち、α−ＳｙｎのＣ末端フラグメント）に対する特異的高力価抗体の産生を促進する。
本明細書で使用されるとき、「異種」という用語は、α−Ｓｙｎの野生型配列の一部ではない、またはそれと相同ではないアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を指す。したがって、異種Ｔｈエピトープは、α−Ｓｙｎに天然に見られないアミノ酸配列に由来するＴｈエピトープであり（すなわち、Ｔｈエピトープはα−Ｓｙｎに対して自己ではない）。Ｔｈエピトープはα−Ｓｙｎと異種であるため、異種Ｔｈエピトープがα−ＳｙｎのＣ末端フラグメントに共有結合しているとき、α−Ｓｙｎの天然アミノ酸配列はＮ末端またはＣ末端のいずれの方向にも伸長していない。
本開示の異種Ｔｈエピトープは、α−Ｓｙｎに天然に見出されるアミノ酸配列を有さない任意のＴｈエピトープであり得る。Ｔｈエピトープは、任意の種（例えば、ヒト、ブタ、ウシ、イヌ、ラット、マウス、モルモットなど）に由来するアミノ酸配列を有することができる。Ｔｈエピトープは、複数の種のＭＨＣクラスＩＩ分子に対する無差別結合モチーフも有することができる。ある特定の実施形態では、Ｔｈエピトープは、免疫応答の開始及び調節をもたらすＴヘルパー細胞の最大活性化を可能にする複数の無差別ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフを含む。Ｔｈエピトープは、それ自体で免疫サイレントであることが好ましく、すなわち、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによって生成される抗体は、いくらかあるとしても、ほとんどがＴｈエピトープに対するものではないため、α−ＳｙｎのＣ末端フラグメントの標的化Ｂ細胞エピトープに対する非常に焦点の合った免疫応答を可能にする。
本開示のエピトープには、表２（配列番号７０〜９８）に例示されるように、外来病原体に由来するアミノ酸配列が含まれるが、これらに限定されない。さらに、Ｔｈエピトープには、理想化された人工Ｔｈエピトープ及び理想化された人工Ｔｈエピトープの組み合わせが含まれる（例えば、配列番号７１及び７８−８４）。コンビナトリアル配列として提示される異種Ｔｈエピトープペプチド（例えば、配列番号７９−８２）は、その特定のペプチドの相同体の可変残基に基づいて、ペプチドフレームワーク内の特定の位置に表されるアミノ酸残基の混合物を含む。コンビナトリアルペプチドの集合は、１つの特定のアミノ酸の代わりに、指定された保護アミノ酸の混合物を合成プロセス中の指定された位置で追加することにより、１つのプロセスで合成することができる。そのようなコンビナトリアル異種Ｔｈエピトープペプチドの集合は、多様な遺伝的背景を有する動物の広範なＴｈエピトープカバレージを可能にし得る。異種Ｔｈエピトープペプチドの代表的なコンビナトリアル配列には、表２に示す配列番号７９〜８２が含まれる。本発明のエピトープペプチドは、遺伝的に多様な集団の動物及び患者に広範な反応性及び免疫原性を提供する。
Ｔｈエピトープを含むα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、α−ＳｙｎのＣ末端フラグメントと並行して単一の固相ペプチド合成で同時に生成される。Ｔｈエピトープには、Ｔｈエピトープの免疫学的類似体も含まれる。免疫学的Ｔｈ類似体には、免疫増強類似体、交差反応性類似体、及びα−ＳｙｎのＣ末端フラグメントに対する免疫応答を増強または刺激するのに十分なこれらのＴｈエピトープの任意のセグメントが含まれる。
Ｔｈエピトープペプチドの機能的免疫学的類似体も有効であり、本発明の一部として含まれる。機能的免疫学的Ｔｈ類似体には、ＴｈエピトープのＴｈ刺激機能を本質的に改変しないＴｈエピトープ中の１〜約５個のアミノ酸残基の保存的置換、付加、欠失及び挿入が含まれ得る。保存的置換、付加、及び挿入は、α−ＳｙｎのＣ末端フラグメントについて上述したように、天然または非天然のアミノ酸で実現できる。表２は、Ｔｈエピトープペプチドの機能的類似体の別のバリエーションを同定する。特に、ＭｖＦ１及びＭｖＦ２のＴｈの配列番号７１及び７８は、それぞれＮ末端及びＣ末端の２つのアミノ酸の欠失（配列番号７１及び７８）または包含（配列番号８１及び８３）によってアミノ酸フレームにおいて異なる、ＭｖＦ４及びＭｖＦ５の配列番号８１及び８３の機能的類似体である。これらの２つの一連の類似配列間の相違は、これらの配列内に含まれるＴｈエピトープの機能に影響を与えないであろう。したがって、機能性免疫学的Ｔｈ類似体には、麻疹ウイルス融合タンパク質ＭｖＦｌ−４ Ｔｈ（配列番号７１、７８、７９、８１、及び８３）、ならびに肝炎表面タンパク質ＨＢｓＡｇ１−３ Ｔｈ（配列番号８０、８２、及び８４）に由来するＴｈエピトープのいくつかのバージョンが含まれる。
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトのＴｈエピトープは、α−ＳｙｎのＣ末端ペプチドのＮ末端またはＣ末端に共有結合し得る。いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは、α−ＳｙｎのＣ末端ペプチドのＮ末端に共有結合している。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは、α−ＳｙｎのＣ末端ペプチドのＣ末端に共有結合している。ある特定の実施形態では、１を超えるＴｈエピトープがα−ＳｙｎのＣ末端フラグメントに共有結合している。１を超えるＴｈエピトープがα−ＳｙｎのＣ末端フラグメントに結合しているとき、各Ｔｈエピトープは同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有することができる。さらに、１を超えるＴｈエピトープがα−ＳｙｎＣ末端フラグメントに結合しているとき、Ｔｈエピトープは任意の順序で配置できる。たとえば、Ｔｈエピトープは、α−ＳｙｎのＣ末端フラグメントのＮ末端に連続して結合するか、またはα−ＳｙｎのＣ末端フラグメントのＣ末端に連続して結合するか、またはＴｈエピトープをα−ＳｙｎのＣ末端フラグメントのＮ末端に共有結合し得るが、別のＴｈエピトープはα−ＳｙｎのＣ末端フラグメントのＣ末端に共有結合する。α−ＳｙｎのＣ末端フラグメントに関連するＴｈエピトープの配置に制限はない。
いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープがα−ＳｙｎのＣ末端フラグメントに直接共有結合している。他の実施形態では、Ｔｈエピトープがα−ＳｙｎのＣ末端フラグメントに、以下に詳細に記載される異種スペーサーを介して共有結合している。
ｃ．異種スペーサー
開示されるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、必要に応じて、α−ＳｙｎからのＢ細胞エピトープを異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに共有結合させる異種スペーサーを含む。
上述したように、「異種」という用語は、α−Ｓｙｎの野生型配列の一部ではない、またはそれと相同ではないアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を指す。したがって、異種スペーサーをα−ＳｙｎからのＢ細胞エピトープに共有結合させるとき、スペーサーがα−Ｓｙｎ配列に対して異種であるので、α−Ｓｙｎの天然アミノ酸配列はＮ末端またはＣ末端のいずれの方向にも伸長していない。
スペーサーは、２つのアミノ酸及び／またはペプチドを一緒に結合できる任意の分子または化学構造である。スペーサーは、用途に応じて長さや極性を変えることができる。スペーサー結合は、アミド結合またはカルボキシル結合を介して行うことができるが、他の官能基も同様に可能である。スペーサーは、化合物、天然に存在するアミノ酸、または天然に存在しないアミノ酸を含むことができる。
スペーサーは、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトに構造的特徴を提供できる。構造的に、スペーサーは、α−ＳｙｎのＣ末端フラグメントのＢ細胞エピトープからＴｈエピトープを物理的に分離する。スペーサーによる物理的分離は、ＴｈエピトープをＢ細胞エピトープに結合することによって作成された任意の人工的な二次構造を破壊する可能性がある。さらに、スペーサーによるエピトープの物理的分離により、Ｔｈ細胞応答及び／またはＢ細胞応答間の干渉を排除することができる。さらに、スペーサーは、ペプチド免疫原コンストラクトの二次構造を作成または改変するように設計できる。例えば、ＴｈエピトープとＢ細胞エピトープの分離を強化するために、柔軟なヒンジとして機能するようにスペーサーを設計できる。柔軟なヒンジスペーサーは、提示されたペプチド免疫原と適切なＴｈ細胞及びＢ細胞との間のより効率的な相互作用を可能にし、Ｔｈエピトープ及びＢ細胞エピトープに対する免疫応答を強化することができる。柔軟なヒンジをコードする配列の例は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域に見られ、多くの場合プロリンに富む。スペーサーとして使用できる特に有用な柔軟なヒンジの１つは、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ配列（配列番号１４８）によって提供され、式中、Ｘａａは任意のアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸である。
スペーサーはまた、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトに機能的特徴を提供できる。たとえば、スペーサーは、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの全体的な電荷を変更するように設計でき、これは、ペプチド免疫原コンストラクトの溶解性に影響を与える可能性がある。さらに、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの全体的な電荷を変更すると、ペプチド免疫原コンストラクトが他の化合物や試薬と結合する能力に影響を及ぼす可能性がある。以下でさらに詳細に記載するように、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、静電結合を介してＣｐＧオリゴマーなどの高荷電オリゴヌクレオチドと安定した免疫刺激複合体を形成できる。α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの全体的な電荷は、これらの安定した免疫刺激複合体の形成に重要である。
スペーサーとして使用できる化合物には、（２−アミノエトキシ）酢酸（ＡＥＡ）、５−アミノ吉草酸（ＡＶＡ）、６−アミノカプロン酸（Ａｈｘ）、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＡＥＥＡ、ミニ−ＰＥＧ１）、１２−アミノ−４，７，１０−トリオキサドデカン酸（ミニ−ＰＥＧ２）、１５−アミノ−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデカン酸（ミニ−ＰＥＧ３）、トリオキサトリデカン−コハク酸（Ｔｔｄｓ）、１２−アミノ−ドデカン酸、Ｆｍｏｃ−５−アミノ−３−オキサペンタン酸（Ｏ１Ｐｅｎ）などが含まれるが、これらに限定されない。
天然に存在するアミノ酸には、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンが含まれる。
非天然アミノ酸には、ε−Ｎリジン、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリン、アミノ安息香酸、６−アミノカプロン酸（Ａｃａ；６−アミノヘキサン酸）、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、３−ニトロチロシン、ピログルタミン酸などが含まれるがこれらに限定されない。
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトのスペーサーは、Ｔｈエピトープ及びα−ＳｙｎのＣ末端ペプチドのＮ末端またはＣ末端に共有結合し得る。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ＴｈエピトープのＣ末端及びα−ＳｙｎのＣ末端ペプチドのＮ末端に共有結合している。他の実施形態では、スペーサーは、α−ＳｙｎのＣ末端ペプチドのＣ末端及びＴｈエピトープのＮ末端に共有結合している。ある特定の実施形態では、例えば、ペプチド免疫原コンストラクトに１を超えるＴｈエピトープが存在するとき、１を超えるスペーサーを使用することができる。１を超えるスペーサーを使用するとき、各スペーサーは互いに同一でも異なっていてもよい。さらに、ペプチド免疫原コンストラクトに１を超えるＴｈエピトープが存在するとき、Ｔｈエピトープはスペーサーで分離することができ、Ｔｈエピトープは、ＴｈエピトープをＢ細胞エピトープから分離するために使用されるスペーサーと同一でも異なっていてもよい。Ｔｈエピトープまたはα−ＳｙｎのＣ末端フラグメントに関するスペーサーの配置に制限がない。
ある特定の実施形態では、異種スペーサーは、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸である。他の実施形態では、スペーサーは、１を超える、天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸を含む。特定の実施形態では、スペーサーはＬｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、またはε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１４８）である。
ｄ．α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの特定の実施形態
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、式：
（Ｔｈ）ｍ−（Ａ）ｎ−（α−ＳｙｎのＣ末端フラグメント）−Ｘ
または
（α−ＳｙｎのＣ末端フラグメント）−（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ
で表すことができ、
式中、
Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり、
Ａは異種スペーサーであり、
（α−ＳｙｎのＣ末端フラグメント）は、α−ＳｙｎのＣ末端から約１０から約２５のアミノ酸残基を持つＢ細胞エピトープであり、
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨまたはα−ＣＯＮＨ２であり、
ｍは、１〜約４であり、
ｎは、０〜約１０である。
ある特定の実施形態では、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの異種Ｔｈエピトープは、表２に示す配列番号７０〜９８のいずれか、またはその組み合わせから選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、Ｔｈエピトープは、配列番号７８〜８４のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは１を超えるＴｈエピトープを含む。
特定の実施形態では、必要に応じた異種スペーサーは、Ｌｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、ε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１４８）、及びそれらの組み合わせのいずれかから選択される。特定の実施形態では、異種スペーサーは、ε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１４８）である。
特定の実施形態では、α−ＳｙｎのＣ末端フラグメントは、全長α−Ｓｙｎのアミノ酸１１１位のグリシン（Ｇ１１１）近辺からアミノ酸１３５位のアスパラギン（Ｄ１３５）近辺までの配列に対応するα−ＳｙｎのＣ末端領域からの約１０から約２５アミノ酸残基を有する。特定の実施形態では、α−ＳｙｎのＣ末端フラグメントは、表１に示されるように、配列番号１２〜１５、１７、または４９〜６４によって表されるアミノ酸配列を有する。
ある特定の実施形態では、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、表３に示す配列番号１０７〜１０８、１１１〜１１３、及び１１５〜１４７のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、配列番号１０７〜１０８、及び１１１〜１１３のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。
組成物
本開示はまた、開示されるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物を提供する。
ａ．ペプチド組成物
開示されるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物は、液体または固体の形態であり得る。液体組成物は、水、緩衝液、溶媒、塩、及び／またはα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの構造的または機能的特性を変えない他の許容可能な試薬を含むことができる。ペプチド組成物は、開示されるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの１つ以上を含むことができる。
ｂ．医薬組成物
本開示はまた、開示されるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物に関する。
医薬組成物は、薬学的に許容される送達システムに担体及び／または他の添加物を含むことができる。したがって、医薬組成物は、薬学的に許容される担体、アジュバント、及び／または希釈剤、添加剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、緩衝液などの他の賦形剤とともに、医薬有効量のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含むことができる。
医薬組成物は、特定の抗原効果自体を持たずに、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトに対する免疫応答を加速、延長、または増強するように作用する１つ以上のアジュバントを含むことができる。医薬組成物に使用されるアジュバントには、油、アルミニウム塩、ウイロソーム、リン酸アルミニウム（ＡＤＪＵ−ＰＨＯＳ（登録商標）など）、水酸化アルミニウム（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）など）、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ（登録商標）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＱＳ２１、ＩＳＡ ３５、ＩＳＡ ２０６、ＩＳＡ５０Ｖ、ＩＳＡ５１、ＩＳＡ ７２０、及びその他のアジュバントと乳化剤が含まれ得る。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ５１（油中水型エマルジョンの製造のための植物油及びマンニドオレエートからなる油アジュバント組成物）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（ポリソルベート８０またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートとしても知られる）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、及び／またはそれらの任意の組み合わせを含む。他の実施形態では、医薬組成物は、アジュバントとしてエムルシゲンまたはエムルシゲンＤを含む水中油中水型（すなわち、ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンである。
医薬組成物は、即時放出製剤として、または持続放出製剤用に製剤化することができる。さらに、医薬組成物は、免疫原の捕捉及び微粒子との同時投与による全身性または局所粘膜免疫の誘導用に製剤化することができる。そのような送達システムは、当業者によって容易に決定される。
医薬組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製することができる。α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む液体ビヒクルは、注射の前に調製することもできる。医薬組成物は、例えば、ｉ．ｄ．、ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、鼻腔内、経口、皮下などの任意の適切な適用様式によって、及び任意の適切な送達装置で投与することができる。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内投与用に製剤化される。経口及び鼻腔内適用を含む他の投与様式に適した医薬組成物も調製することができる。
医薬組成物は、即時放出製剤として、または持続放出製剤用に製剤化することができる。さらに、医薬組成物は、免疫原の捕捉及び微粒子との同時投与による全身性または局所粘膜免疫の誘導用に製剤化することができる。そのような送達システムは、当業者によって容易に決定される。
医薬組成物は、適切な単位剤形で製剤化することもできる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、体重１ｋｇあたり約０．５μｇから約１ｍｇのα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む。医薬組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物、及び治療が予防的または治療的であるかどうかを含む多くの種々の要素に依存して変動する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック動物を含む非ヒト哺乳動物もまた治療できる。複数回投与で送達されるとき、医薬組成物は、単位剤形あたり適切な量に都合よく分割され得る。投与される用量は、治療技術分野でよく知られているように、対象の年齢、体重、及び全体的な健康状態に依存するだろう。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は１を超えるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む。１を超えるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの混合物を含む医薬組成物は、コンストラクトの免疫効果を相乗的に増強することができる。１を超えるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物は、ＭＨＣクラスＩＩが広範囲に及ぶため、より大きな遺伝集団でより効果的であり、したがってα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトに対する免疫応答が改善される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、配列番号１０７〜１０８、１１１〜１１３、１１５〜１４７から選択されるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト、ならびにその相同体、類似体及び／または組み合わせを含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、配列番号１０７〜１０８、１１１〜１１３、及びそれらの任意の組み合わせから選択されるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む。
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を使用して、投与時に宿主で免疫応答を誘発し、抗体を産生することができる。
ｃ．免疫刺激複合体
本開示はまた、ＣｐＧオリゴヌクレオチドとの免疫刺激複合体の形態のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物に関する。そのような免疫刺激複合体は、アジュバント及びペプチド免疫原安定剤として作用するように特に適合されている。免疫刺激複合体は微粒子の形態であり、免疫系の細胞にα−Ｓｙｎペプチド免疫原を効率的に提示して免疫応答を生じさせることができる。免疫刺激複合体は、非経口投与用の懸濁液として製剤化されてもよい。免疫刺激複合体は、α−Ｓｙｎペプチド免疫原の、非経口投与後の宿主の免疫系細胞への効率的な送達のために、無機塩またはｉｎ ｓｉｔｕゲル化ポリマーと組み合わせた懸濁液として、ｗ／ｏエマルジョンの形態で製剤化することもできる。免疫刺激複合体は、保護／治療効果があるα−Ｓｙｎのβ−シートに対する免疫応答を生成することができる（例えば、実施例１３の図８Ａ、８Ｂ、及び８Ｃ）。
安定化された免疫刺激複合体は、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを陰イオン分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または静電結合を介したそれらの組み合わせと複合化することにより形成できる。安定化された免疫刺激複合体は、免疫原送達システムとして医薬組成物に組み込まれ得る。
ある特定の実施形態では、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、５．０〜８．０の範囲のｐＨで正に帯電した陽イオン部分を含むように設計されている。α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト、またはコンストラクトの混合物のカチオン部分の正味電荷は、各リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈ）に＋１電荷を割り当て、各アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）に−１電荷を割り当て、配列内の他のアミノ酸に０の電荷を割り当てることによって計算される。電荷は、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトのカチオン部分内で合計され、正味の平均電荷として表される。適切なペプチド免疫原は、正味の平均正電荷が＋１のカチオン部分を有する。好ましくは、ペプチド免疫原は、正味の正電荷が＋２より大きい範囲である。いくつかの実施形態では、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分は異種スペーサーである。ある特定の実施形態では、スペーサー配列が（ａ，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、ε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１４８）であるとき、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分は、＋４の電荷を有する。
本明細書に記載されるとき、「アニオン性分子」は、５．０〜８．０の範囲のｐＨで負に帯電した任意の分子を指す。特定の実施形態では、アニオン性分子はオリゴマーまたはポリマーである。オリゴマーまたはポリマーの正味の負電荷は、オリゴマーの各ホスホジエステルまたはホスホロチオエート基に−１電荷を割り当てることにより計算される。適切なアニオン性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフの反復数が１〜１０の範囲である、８〜６４ヌクレオチド塩基の一本鎖ＤＮＡ分子である。好ましくは、ＣｐＧ免疫刺激性一本鎖ＤＮＡ分子は、１８〜４８ヌクレオチド塩基を含み、ＣｐＧモチーフの反復数は３〜８の範囲である。
より好ましくは、アニオン性オリゴヌクレオチドは、式：５’ Ｘ１ＣＧＸ２ ３’で表され、式中、Ｃ及びＧはメチル化されておらず；Ｘ１はＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、及びＴ（チミン）からなる群から選択され；Ｘ２はＣ（シトシン）またはＴ（チミン）である。あるいは、アニオン性オリゴヌクレオチドは、式：５’ （Ｘ３）２ＣＧ（Ｘ４）２ ３’で表され、式中、Ｃ及びＧはメチル化されておらず；Ｘ３は、Ａ、Ｔ、またはＧからなる群から選択され；Ｘ４はＣまたはＴである。
得られる免疫刺激複合体は、典型的には１〜５０ミクロンの範囲のサイズの粒子の形態であり、相互作用種の相対電荷化学量論及び分子量を含む多くの要因の関数である。微粒子化された免疫刺激複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏで特定の免疫応答のアジュバント化及び上方制御を提供するという利点を有する。さらに、安定化された免疫刺激複合体は、油中水型エマルジョン、無機塩懸濁液、及びポリマーゲルを含むさまざまなプロセスによって医薬組成物を調製するのに適している。
抗体
本開示はまた、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトにより誘発される抗体を提供する。
全長α−Ｓｙｎのアミノ酸１１１位のグリシン（Ｇ１１１）近辺からアミノ酸１３５位のアスパラギン（Ｄ１３５）近辺までの配列に対応するα−ＳｙｎのＣ末端領域からの約１０から約２５アミノ酸残基を有するα−ＳｙｎのＣ末端フラグメントは、それ自体では非免疫原性または弱免疫原性である。しかしながら、α−ＳｙｎのＣ末端フラグメント、異種Ｔｈエピトープ、及び必要に応じた異種スペーサーを含む開示されるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、宿主に投与されたときに免疫応答及び抗体の産生を誘発することができる。α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの設計は、自己α−Ｓｙｎに対する寛容を破壊し、線形ではなく立体構造のエピトープを認識する部位特異的抗体の産生を誘発することができる。
驚くべきことに、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによって産生された抗体は、天然型のα−Ｓｙｎ単量体の天然のアルファヘリックスに結合しない。代わりに、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによって生成された抗体は、単量体、オリゴマー、原線維の形態の、α−Ｓｙｎの変性β−シートを認識して結合する。さらに、ａ−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによって産生される抗体は、他のアミロイド生成タンパク質（すなわち、Ａβ１−４２及びＴａｕ４４１）の類似構造に結合しない。したがって、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト（α−ＳｙｎのＣ末端フラグメント、異種Ｔｈエピトープ、及び必要に応じた異種スペーサーを含む）の特定の設計により、汎用性の高いα−ＳｙｎのＣ末端フラグメントの立体構造を変化させてβシート様の立体構造を可能にする。
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化した動物の免疫血清に由来する抗体の広範な比較は、多くの機能アッセイで行われた。これらの比較により、抗体が神経成長因子（ＮＧＦ）処理されたＰＣ１２細胞のα−Ｓｙｎに、β−シート単量体及びα−Ｓｙｎのオリゴマーのみに対する高い特異性で結合し、他の種のアミロイド生成タンパク質には結合しない能力を実証した（実施例９を参照されたい）。
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによって誘発された抗体は、驚くべきことに、α−Ｓｙｎの凝集を防ぎ（抗凝集活性）、予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体を解離（脱凝集活性）できる。さらに、抗体は驚くべきことに、ミクログリア細胞が誘導するＴＮＦ−α及びＩＬ６産生を減少させることができ、これはこれらの抗体がα−Ｓｙｎ凝集体または原線維媒介ミクログリア活性化を効果的に減少できることを示す。これらの抗体は、外因性のα−Ｓｙｎ凝集体とα−Ｓｙｎ過剰発現細胞の内因性α−Ｓｙｎ凝集体の両方によって引き起こされる神経変性を減少させることも見出された。さらに、そのような抗体は、病的なα−Ｓｙｎオリゴマー凝集体または原線維を特異的に認識して結合するが、非病的α−Ｓｙｎには反応しない。具体的には、抗体は、アルファシヌクレイノパチーのパーキンソン病の患者から採取した脳切片のレビー小体と反応するが、正常なヒト組織とは反応しない。
また、驚くべきことに、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物を投与した２つのパーキンソンマウスモデル（ＭＰＰ＋誘発マウスモデル及び線維性α−Ｓｙｎ接種マウスモデル）が、（ａ）α−Ｓｙｎのβ−シートに高度に交差反応性の抗体を産生し、（ｂ）α−Ｓｙｎ血清レベルが低下し、（ｃ）脳内のオリゴマーα−Ｓｙｎレベルが低下し、（ｄ）神経病理学が低下して運動機能の回復をもたらす。
本発明のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化された動物から得られた免疫応答は、コンストラクトが、天然形態のＣ末端α−Ｓｙｎのランダムなコイル構造ではなく、単量体、オリゴマー、及び原線維の形態のα−Ｓｙｎの変性β−シートと反応する強力な部位特異的抗体を産生する能力を示した。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイ
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによって産生される抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ機能アッセイに使用できる。これらの機能アッセイには以下が含まれるが、これらに限定されない：
（ａ）組換えα−Ｓｙｎ凝集のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害；予め形成された組換えα−Ｓｙｎ凝集体を脱凝集する（実施例８を参照されたい）；
（ｂ）細胞内のα−Ｓｙｎ凝集のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害、及び細胞内での予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体の解離（実施例９を参照されたい）；
（ｃ）ミクログリアＴＮＦ−α及びＩＬ６分泌の減少（実施例１０を参照されたい）；
（ｄ）外因性α−Ｓｙｎ凝集体によって引き起こされる神経変性の減少（実施例１１を参照されたい）；
（ｅ）α−Ｓｙｎ過剰発現細胞における神経変性の減少（実施例１２を参照されたい）；
（ｆ）血清α−Ｓｙｎレベルの低下、脳のオリゴマーα−Ｓｙｎレベルの低下、神経病理学の低下及び運動活動の回復を示すマウスの線維性α−Ｓｙｎ接種及びＭＰＰ＋誘発性パーキンソン病モデルでの有効性のｉｎ ｖｉｖｏ証明（実施例１５を参照されたい）。
方法
本開示はまた、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト、組成物、及び医薬組成物を作製及び使用する方法に関する。
ａ．α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの製造方法
本開示のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、当業者によく知られている化学合成法により作製することができる（例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides:A User’s Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, p. 77を参照されたい）。α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓペプチドシンセサイザーモデル４３０Ａまたは４３１の側鎖保護アミノ酸を使用して、ｔ−ＢｏｃまたはＦ−ｍｏｃ化学のいずれかで保護されたα−ＮＨ２によって固相合成の自動Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ技術を使用して合成できる。Ｔｈエピトープのコンビナトリアルライブラリーペプチドを含むα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの調製は、特定の可変位置でカップリングするための代替アミノ酸の混合物を提供することで実現できる。
所望のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを完全に組み立てた後、標準的な手順に従って樹脂を処理して、ペプチドを樹脂から切断し、アミノ酸側鎖の官能基を非ブロック化できる。遊離ペプチドは、ＨＰＬＣにより精製され、例えばアミノ酸分析または配列決定により生化学的に特徴付けられ得る。ペプチドの精製及び特徴付け方法は、当業者に周知である。
この化学プロセスによって生成されるペプチドの品質を制御及び定義することができ、その結果、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの再現性、免疫原性、及び収率を保証できる。固相ペプチド合成によるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの製造の詳細な説明は、実施例１に示される。
意図した免疫学的活性の保持を可能にする構造的変動性の範囲は、小分子薬による特定の薬物活性の保持を可能にする構造的変動性の範囲、または生物由来の薬物と共生成される大きな分子に望ましい活性と望ましくない毒性よりもはるかに順応性があることが見出されている。したがって、意図的に設計されたペプチド類似体、または意図されたペプチドに類似したクロマトグラフィー及び免疫学的特性を有する欠失配列副産物の混合物として合成プロセスのエラーによって必然的に生成されたものは、所望のペプチドの精製調製物と同じくらいしばしば有効である。これらのペプチドを使用した最終製品の再現性と有効性を保証するために、製造プロセスと製品評価プロセスの両方を監視するための識別可能なＱＣ手順が開発されている限り、設計された類似体と意図しない類似体の混合物は効果的である。
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、核酸分子、ベクター、及び／または宿主細胞を含む組換えＤＮＡ技術を使用して作成することもできる。したがって、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト及びその免疫学的に機能的な類似体をコードする核酸分子も本発明の一部として本開示に包含される。同様に、核酸分子を含む発現ベクターを含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞も本発明の一部として本開示に包含される。
様々な例示的実施形態はまた、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト及びα−ＳｙｎＧ１１１−Ｄ１３５フラグメント由来ペプチド免疫原コンストラクトの免疫学的に機能的な類似体の製造方法を包含する。例えば、方法は、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト及び／またはその免疫学的に機能的な類似体をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、ペプチド及び／または類似体が発現されるような条件下でインキュベートするステップを含むことができる。より長い合成ペプチド免疫原は、よく知られた組換えＤＮＡ技術によって合成することができる。このような技術は、詳細なプロトコールを備えたよく知られた標準マニュアルで提供されている。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するために、アミノ酸配列を逆翻訳して、好ましくは遺伝子が発現される生物にとって最適なコドンを有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、典型的には、ペプチド及び必要に応じて任意の調節エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することにより、合成遺伝子が作製される。合成遺伝子は、適切なクローニングベクターに挿入され、宿主細胞にトランスフェクトされる。次いで、ペプチドは、選択された発現系及び宿主に適切な条件下で発現される。ペプチドは精製され、標準的な方法で特徴付けられる。
ｂ．免疫刺激複合体の製造方法
様々な例示的な実施形態はまた、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト及びＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）分子を含む免疫刺激複合体を生成する方法を包含する。安定化された免疫刺激複合体（ＩＳＣ）は、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトのカチオン部分とポリアニオンＣｐＧ ＯＤＮ分子に由来する。自己集合システムは、電荷の静電中和によって駆動される。α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトのカチオン性部分とアニオン性オリゴマーのモル電荷比の化学量論は、会合の程度を決定する。α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトとＣｐＧ ＯＤＮの非共有静電的結合は、完全に再現可能なプロセスである。ペプチド／ＣｐＧ ＯＤＮ免疫刺激複合体の凝集体は、免疫系の「プロフェッショナル」抗原提示細胞（ＡＰＣ）への提示を促進し、したがって複合体の免疫原性をさらに増強する。これらの複合体は、製造中の品質管理のために容易に特徴付けられる。ペプチド／ＣｐＧ ＩＳＣは、ｉｎ ｖｉｖｏで十分に許容される。ＣｐＧ ＯＤＮとα−ＳｙｎＧ１１１−Ｄ１３５フラグメント由来ペプチド免疫原コンストラクトとを含むこの新しい微粒子システムは、ＣｐＧ ＯＤＮの使用に関連する一般化されたＢ細胞マイトジェン性を利用しつつ、バランスのとれたＴｈ−１／Ｔｈ−２型応答を促進するように設計された。
開示される医薬組成物中のＣｐＧ ＯＤＮは、反対の電荷の静電的中和により媒介されるプロセスで免疫原に１００％結合し、ミクロンサイズの微粒子の形成をもたらす。粒子形態は、ＣｐＧアジュバントの従来の使用からのＣｐＧの投与量の大幅な削減、有害な自然免疫応答の可能性の低下を可能にし、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む代替免疫原プロセシング経路を促進する。結果として、そのような製剤は概念的に新規であり、代替メカニズムによる免疫応答の刺激を促進することにより潜在的な利点を提供する。
ｃ．医薬組成物の製造方法
様々な例示的な実施形態はまた、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を包含する。特定の実施形態では、医薬組成物は、油中水型エマルジョン及び無機塩を含む懸濁液を使用する。
医薬組成物を大規模な集団で使用し、α−Ｓｙｎ凝集の予防も投与の目標の一部とするために、安全性は考慮すべき別の重要な要素となる。臨床試験の多くの製剤にヒトの油中水エマルジョンを使用しているにもかかわらず、ミョウバンはその安全性のために製剤で使用するための主要な補助剤のままである。したがって、ミョウバンまたはその無機塩であるリン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）は、臨床応用のための調製においてアジュバントとして頻繁に使用される。
ｄ．医薬組成物を使用する方法
本開示はまた、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を使用する方法を含む。
ある特定の実施形態において、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物は、以下のために使用することができる：
（ａ）宿主でのα−Ｓｙｎ凝集を阻害する；
（ｂ）宿主で予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体の分解を誘発する；
（ｃ）宿主のミクログリアＴＮＦ−α及びＩＬ６分泌を減少させる；
（ｄ）宿主の外因性α−Ｓｙｎ凝集体によって引き起こされる神経変性を減少させる；
（ｅ）α−Ｓｙｎ過剰発現細胞の神経変性を減少させる；
（ｆ）宿主の血清α−Ｓｙｎレベルを低減する；
（ｇ）宿主の脳内のオリゴマーα−Ｓｙｎレベルを低減する；
（ｈ）神経病理を軽減し、宿主の運動活動の回復；など。
上述の方法は、薬理学的に有効な量のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む医薬組成物を、それを必要とする宿主に投与することを含む。
特定の実施形態
本発明の特定の実施形態には、以下が含まれるが、これらに限定されない。
（１）α−シヌクレイン（α−Ｓｙｎ）ペプチド免疫原コンストラクトであって、
配列番号１のアミノ酸Ｇ１１１近辺からアミノ酸Ｄ１３５近辺までに対応するα−ＳｙｎのＣ末端フラグメントからの約１０から約２５アミノ酸残基を含む、Ｂ細胞エピトープと；
配列番号７０〜９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴヘルパーエピトープと；
アミノ酸Ｌｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、及びε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１４８）からなる群から選択される必要に応じた異種スペーサーと、を含み、
前記Ｂ細胞エピトープが、前記Ｔヘルパー細胞エピトープに直接または前記必要に応じた異種スペーサーを介して共有結合している、前記α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
（２）前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号１２〜１５、１７、及び４９〜６３からなる群から選択される、（１）に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
（３）前記Ｔヘルパーエピトープが、配列番号８１、８３、及び８４からなる群から選択される、（１）に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
（４）前記必要に応じた異種スペーサーが、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓまたはε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１４８）である、（１）に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
（５）前記Ｔヘルパーエピトープが、前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端に共有結合している、（１）に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
（６）前記Ｔヘルパーエピトープが、前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端に前記必要に応じた異種スペーサーを介して共有結合している、（１）に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
（７）以下の式：
（Ｔｈ）ｍ−（Ａ）ｎ−（α−ＳｙｎのＣ末端フラグメント）−Ｘ
または
（α−ＳｙｎのＣ末端フラグメント）−（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ
を含み、
式中、
Ｔｈは前記Ｔヘルパーエピトープであり、
Ａは前記異種スペーサーであり、
（α−ＳｙｎのＣ末端フラグメント）は、前記Ｂ細胞エピトープであり、
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨまたはα−ＣＯＮＨ２であり、
ｍは、１から約４であり、
ｎは１から約１０である、
（１）に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
（８）配列番号１０７、１０８、１１１〜１１３、及び１１５〜１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、（１）に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
（９）配列番号１０７、１０８、及び１１１〜１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、（１）に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
（１０）（１）に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物。
（１１）１を超える（１）に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む、組成物。
（１２）前記α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトが配列番号１１２及び１１３のアミノ酸配列を有する、（１１）に記載の組成物。
（１３）（１）に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト及び薬学的に許容される送達媒体及び／またはアジュバントを含む医薬組成物。
（１４）ａ．前記α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号１０７、１０８、１１１〜１１３、及び１１５〜１４７からなる群から選択され、
ｂ．前記アジュバントが、Ａｌ（ＯＨ）３またはＡＩＰＯ４からなるグループから選択されるアルミニウムの無機塩である、
（１３）に記載の医薬組成物。
（１５）ａ．前記α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号１０７、１０８、１１１〜１１３、及び１１５〜１４７からなる群から選択され、
ｂ．前記α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されて安定化された免疫刺激複合体を形成する、
（１３）に記載の医薬組成物。
（１６）（１）に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
（１７）前記α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトに結合した、（１６）に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
（１８）（９）に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
（１９）（１６）に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む組成物。
（２０）（１８）に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む組成物。
（２１）ａ．配列番号１１２の前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントと、
ｂ．配列番号１１３の前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントと、
の混合物を含む、（２０）に記載の組成物。
（２２）（１）に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原と送達媒体及び／またはアジュバントとを含む組成物を宿主に投与することを含む、宿主においてα−Ｓｙｎを認識する抗体を産生する方法。
（２３）薬理学的に有効な量の（１）のα−Ｓｙｎペプチド免疫原を動物に投与することを含む、動物のα−Ｓｙｎ凝集を阻害する方法。
（２４）薬理学的に有効な量の（１）のα−Ｓｙｎペプチド免疫原を動物に投与することを含む、動物のα−Ｓｙｎ凝集体の量を低減する方法。
（２５）生体試料中の異なるサイズのα−Ｓｙｎ凝集体を同定する方法であって、
ａ．生体試料を、（１６）に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに、前記抗体またはそのエピトープ結合フラグメントがα−Ｓｙｎ凝集体に結合することを可能にする条件下で曝露することと、
ｂ．前記生体試料中の前記α−Ｓｙｎ凝集体に結合した前記抗体またはそのエピトープ結合断片の量を検出することと、
を含む、前記方法。
使用される手順の詳細な説明は、次の実施例で提供される。
実施例１
アルファシヌクレインの関連ペプチドの合成及びその製剤の調製
ａ．α−ＳｙｎのＣ末端フラグメントの合成
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの開発努力に含まれていたデザイナーα−ＳｙｎＣ末端フラグメントの合成方法を説明する。ペプチドは、血清学的アッセイ、実験室でのパイロット及びフィールド研究に有用な少量で、ならびに、医薬組成物の産業／商業生産に有用な大規模（キログラム）量で合成された。有効なα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで使用するための最適なペプチドコンストラクトのスクリーニング及び選択のために、約１０から４０アミノ酸の長さの配列を持つα−Ｓｙｎ関連抗原ペプチドの大きなレパートリーが設計された。
さまざまな血清学的アッセイでのエピトープマッピングに使用された、代表的な全長α−Ｓｙｎ（配列番号１）及びβ−Ｓｙｎ（配列番号２）、α−Ｓｙｎ１１１−１３２、α−Ｓｙｎ１２６−１３５などのα−Ｓｙｎセグメント、１０ｍｅｒペプチドなどを表１に示す（配列番号１及び３〜６９）。表２（配列番号７０〜９８）で同定される、麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ）、Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質（ＨＢｓＡｇ）インフルエンザ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ ｔｅｔａｎｉ、及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を含む病原体タンパク質由来の慎重に設計されたヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープに合成的に結合することにより、選択されたα−Ｓｙｎフラグメントをα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトにした。Ｔｈエピトープは、単一の配列（配列番号７０〜７８及び８３〜９８）またはコンビナトリアルライブラリ（配列番号７９〜８２）のいずれかで使用され、それぞれのα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性を増強した。
１００を超えるペプチドコンストラクトから選択された代表的なα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、表３（配列番号９９〜１４７）で同定されている。抗α−Ｓｙｎ抗体の検出及び／または測定のための免疫原性研究または関連する血清学的検査に使用されるすべてのペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌｓ ４３０Ａ、４３１及び／または４３３のペプチドシンセサイザーによるＦ−ｍｏｃ化学を使用して小規模で合成された。各ペプチドは、Ｎ末端でのＦ−ｍｏｃ保護及び三官能性アミノ酸の側鎖保護基を使用して、固相支持体上での独立した合成によって生成された。完成したペプチドを固体支持体から切断し、９０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）により側鎖保護基を除去した。合成ペプチド調製物は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法によって評価され、正しいアミノ酸含有量が確保された。また、各合成ペプチドを逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で評価し、合成プロファイルと調製物の濃度を確認した。合成プロセスの厳密な制御（カップリング効率の段階的なモニタリングを含む）にもかかわらず、ペプチド類似体は、アミノ酸の挿入、欠失、置換、及び中途終止などの伸長サイクル中の意図しない事象により生成された。したがって、合成された調製物は、典型的には、標的ペプチドとともに複数のペプチド類似体を含んでいた。そのような意図しないペプチド類似体の包含にもかかわらず、得られた合成ペプチド調製物は、免疫診断（抗体捕捉抗原として）及び医薬組成物（ペプチド免疫原として）を含む免疫学的用途での使用になおも適していた。典型的には、これらのペプチドを使用した最終製品の再現性と有効性を保証するための製造プロセスと製品評価プロセスの両方をモニターするための識別可能なＱＣ手順が開発されている限り、意図的に設計されるかまたは副産物の混合物として合成プロセスで生成されるかのいずれかのそのようなペプチド類似体は、所望のペプチドの精製製剤と同じくらい頻繁に有効である。数百グラムから数キログラムの量での大規模ペプチド合成は、カスタマイズされた自動ペプチドシンセサイザーＵＢＩ２００３などで１５ｍｍｏｌｅから５０ｍｍｏｌｅのスケールで実施された。臨床試験の最終的な医薬組成物に使用される有効成分については、α−Ｓｙｎペプチドコンストラクトは浅い溶離勾配の下で分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製され、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、アミノ酸分析、及びＲＰ−ＨＰＬＣにより純度と同一性について特徴付けられた。
ｂ．α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物の調製
油中水型エマルジョン及び無機塩を含む懸濁液を使用する製剤を調製した。医薬組成物を大規模な集団で使用するよう設計し、予防も投与の目標の一部とするために、安全性は考慮すべき別の重要な要素となる。臨床試験の多くの医薬組成物にヒトの油中水エマルジョンを使用しているにもかかわらず、ミョウバンはその安全性のために医薬組成物で使用するための主要な補助剤のままである。したがって、ミョウバンまたはその無機塩であるＡＤＪＵＰＨＯＳ（リン酸アルミニウム）は、臨床応用のための調製においてアジュバントとして頻繁に使用される。
簡潔に述べると、以下に説明する各研究群で指定される製剤には、一般的にすべてのタイプのデザイナーα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトが含まれていた。１００を超えるデザイナーα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、免疫原のＢエピトープペプチドを代表する対応するα−Ｓｙｎペプチドとの相対的な免疫原性、及び配列番号１〜１５３を持つものから選択された異なるペプチドでコーティングされたプレートを用いるＥＬＩＳＡアッセイによるさまざまな相同ペプチド間の血清学的交差反応性の評価について、モルモットで最初に評価された。
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、（ｉ）ヒトでの使用に承認されたオイルとしてＳｅｐｐｉｃ Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ５１を含む油中水型エマルジョン中で、または（ｉｉ）無機塩ＡＤＪＵＰＨＯＳ（リン酸アルミニウム）またはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（ミョウバン）と混合し、指定されたペプチドコンストラクトのさまざまな量で調製された。組成物は典型的に、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを約２０〜８００μｇ／ｍＬで水に溶解して調製し、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ ５１で油中水型エマルション（体積で１：１）に、または無機塩またはＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（ミョウバン）（体積で１：１）で製剤化された。組成物を室温で約３０分間維持し、免疫化の前に約１０〜１５秒間ボルテックスにより混合した。一部の動物は、筋肉内経路により、特定の組成物の２回から３回の投与で免疫され、それは０時（プライム）及び初期免疫後３週（ｗｐｉ）（ブースター）、必要に応じて２回目の追加免疫のために５または６ｗｐｉで投与された。次いで、これらの免疫された動物を選択したＢエピトープペプチド（複数可）で試験し、製剤に存在するさまざまなα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性と、関連する標的ペプチドまたはタンパク質との交差反応性を評価した。モルモットの初期スクリーニングにおいて強力な免疫原性を有するこれらのα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、免疫化プロトコールで指示されるように、指定の期間にわたる投与計画の間、霊長類で、油中水型エマルジョン、無機塩、ミョウバンベースの製剤でさらに試験された。
最も有望なα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトのみが、シヌクレイノパチー患者における、治験薬の申請及び臨床試験の提出に備えたＧＬＰガイド前臨床研究において、免疫原性、期間、毒性、及び有効性研究の最終製剤に組み込まれる前に、さらに広範囲に評価された。
実施例２
組換えアルファシヌクレインタンパク質の調製
α−Ｓｙｎ遺伝子のｐＧＥＸ−４Ｔ１へのクローニングは、Neurotoxicology and teratology 2004, 26 (3):397-406で、以前記載されていた。標的配列（配列番号１）をＢａｍＨＩとＸｈｏＩ制限部位の間でｐＧＥＸ−４Ｔ１ベクターに挿入した。フラグメントは、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ， ＵＳＡ）を使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成された。プライマー配列は以下の通りである：フォワードプライマー５’−ｃｇｇｇａｔｃｃｇａｔｇｔｇｔｔｔａｔｇａａａｇｇｔｃｔｇａｇ−３’（配列番号１４９）；リバースプライマー５’−ｇｇａａｔｔｃｃｇａｔｇｔｇｔｔｔａｔｇａａａｇｇｔｃｔｇａｇ−３’（配列番号１５０）。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９４℃で１分間の変性後、９４℃で１５秒間の３０サイクルの変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で２分間の伸長、さらに６８℃で５分間の後終了。Ｑ５ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ， ＵＳＡ）を使用して、Ａ５３Ｔα−Ｓｙｎの部位特異的変異導入を実施した。変異型α−Ｓｙｎのためのプライマー配列は以下のとおりである：フォワードプライマー５’−ｔｃａｔｇｇｔｇｔｇａｃｃａｃｃｇｔｔｇｃａｇ−３’（配列番号１５１）；リバースプライマー５’−ａｃｃａｃｇｃｃｔｔｃｔｔｔｇｇｔｔｔｔｇ−３’（配列番号１５２）。
ｐＧＥＸ−４Ｔ１ ＧＳＴベクターにクローニングされたα−Ｓｙｎは、タンパク質発現のためにＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換された。Ｅ． ｃｏｌｉを３７℃のＬＢブロスで培養し、ＯＤ６００が０．８に達したときにイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を４ｍＭの最終濃度まで添加した。４時間のインキュベーション後、４℃における５，０００×ｇで２０分間の遠心分離により細胞を収集した。収集した細胞をＰＢＳに再懸濁し、氷上で超音波処理して破壊し、５，０００×ｇで２０分間遠心分離した。上清画分を、ＰＢＳで平衡化したグルタチオンセファロース−４Ｂカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。ＰＢＳで３回洗浄した後、トロンビン１ｍＬ（ＰＢＳ中２０Ｕ／ｍＬ）を４℃で一晩消化するために添加して、融合タンパク質からＧＳＴを放出させた。次いで、タグフリーのα−Ｓｙｎを溶離し、続いてトロンビンをＨｉＴｒａｐ Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で除去した。透析されたα−Ｓｙｎは、直ちに−８０℃で凍結された。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、１４ｋＤａ ＭＷの精製α−Ｓｙｎを、抗α−Ｓｙｎ抗体（１：２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、α−Ｓｙｎ１１１−１３１を標的とする）を用いたウエスタンブロッティングにより同定した。
実施例３
血清学的アッセイ及び試薬
合成ペプチドコンストラクト及びその製剤の機能的免疫原性を評価するための血清学的アッセイ及び試薬について、以下に詳述する。
ａ．抗体特異性分析のためのペプチドベースのＥＬＩＳＡ試験
以下の実施例に記載されている免疫血清試料を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイが開発され、以下に記載されている。９６ウェルプレートのウェルを、１０ｍＭのＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９．５中（特に明記しない限り）、２μｇ／ｍｌ（特に明記しない限り）での、標的ペプチドであるα−ＳｙｎフラグメントＡ８５−Ａ１４０、Ａ９１−Ａ１４０、Ａ１０１−Ａ１４０、Ａ１１１−Ａ１４０、Ｄ１２１−Ａ１４０、Ｅ１２６−Ａ１４０、Ｋ９７−Ｄ１３５、Ｇ１０１−Ｄ１３５、Ｇ１１１−Ｄ１３５、Ｄ１２１−Ｄ１３５、Ｅ１２３−Ｄ１３５、Ｅ１２６−Ｄ１３５、Ｇ１０１−１３２、及びＧ１１１−Ｇ１３２ペプチド（配列番号：４〜１７）の１００μｌで３７℃において１時間、個別にコーティングした。
ｂ．ＴｈペプチドベースのＥＬＩＳＡ試験によるＴｈペプチドに対する抗体反応性の評価
ペプチド（配列番号７０〜９８）でコーティングされたウェルを、非特異的タンパク質結合部位をブロッキングするために、ＰＢＳ中の３重量％のゼラチン２５０μＬによって３７℃で１時間インキュベートし、その後、０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳで３回洗浄して乾燥させた。分析対象の血清は、２０体積％の正常ヤギ血清、１重量％のゼラチン、及び０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含むＰＢＳで１：２０に希釈した（特に明記しない限り）。希釈した検体（例えば、血清、血漿）１００マイクロリットル（１００μＬ）を各ウェルに添加し、３７℃で６０分間反応させた。次いで、結合していない抗体を除去するために、ＰＢＳの０．０５体積％ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０でウェルを６回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合の種（例えば、マウス、モルモット、またはヒト）に特異的なヤギ抗ＩｇＧは、陽性ウェルで形成された抗体／ペプチド抗原複合体と結合する標識トレーサーとして使用された。あらかじめ滴定された最適希釈で、ＰＢＳ中０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含む１体積％の正常ヤギ血清中のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ＩｇＧの１００マイクロリットルを各ウェルに添加して３７℃でさらに３０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ中の０．０５体積％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０で６回洗浄して未結合抗体を除去し、０．０４重量％の３’，３’，５’，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む基質混合物１００μＬと反応させ、クエン酸ナトリウム緩衝液中の０．１２体積％の過酸化水素をさらに１５分間反応させた。この基質混合物を使用して、着色生成物を形成することによりペルオキシダーゼ標識を検出した。１００μＬの１．０ＭのＨ２ＳＯ４を添加して反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）を決定した。さまざまなα−Ｓｙｎ由来ペプチド免疫原を投与された免疫動物の抗体価の決定のために、１：１００から１：１０，０００までの血清の１０倍連続希釈が試験され、Ｌｏｇ１０として表される試験された血清の力価は、カットオフＡ４５０を０．５に設定したＡ４５０の線形回帰分析によって計算された。
ｃ．Ｂ細胞エピトープクラスターの１０ｍｅｒペプチドベースのＥＬＩＳＡ試験によるα−Ｓｙｎフラグメントに対する詳細な特異性分析とエピトープマッピング
免疫された宿主における抗α−Ｓｙｎ抗体の詳細な特異性分析は、エピトープマッピングによって決定された。簡潔に述べると、９６ウェルプレートのウェルは、ウェルあたり０．１ｍＬあたり０．５μｇで個々のα−Ｓｙｎの１０ｍｅｒペプチド（配列番号１８〜６９）でコーティングされ、その後、１００μＬの血清試料（ＰＢＳ中１：１００希釈）を、上記の抗体ＥＬＩＳＡ法のステップに従って、１０ｍｅｒプレートウェルで二重化してインキュベートした。α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトのＢ細胞エピトープと、免疫された宿主における免疫血清の抗α−Ｓｙｎ抗体の関連する詳細な特異性分析は、対応するα−Ｓｙｎペプチド（配列番号９９、１０２、１０８、１１０、１１２、１１３）もしくはスペーサー及びＴｈ配列なしのそのフラグメント、または追加の反応性と特異性の確認のためのβ−Ｓｙｎ（配列番号１５３）についても試験された。
ｄ．免疫原性評価
動物から免疫前及び免疫血清試料を実験的免疫プロトコールに従って収集し、５６℃で３０分間加熱して血清補体因子を不活性化した。医薬組成物の投与後、プロトコールに従って血液試料が得られ、特定の標的部位（複数可）に対するそれらの免疫原性が評価された。連続希釈した血清を試験し、正の力価を相互希釈のＬｏｇ１０として表した。特定の医薬組成物の免疫原性は、標的抗原内の所望のエピトープ特異性に対する高い力価のＢ細胞抗体応答を誘発する一方で、利用される「ヘルパーＴ細胞エピトープ」に対する抗体反応性を低いものから無視できるものに維持し、所望のＢ細胞応答の増強をもたらす能力によって評価される。
ｅ．マウス免疫血清のα−Ｓｙｎレベルのイムノアッセイ
α−Ｓｙｎ由来ペプチド免疫原を投与されたマウスの血清α−Ｓｙｎレベルは、捕捉抗体として抗α−Ｓｙｎ抗体及び検出抗体としてビオチン標識抗α−Ｓｙｎ抗体を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｃｌｏｕｄ−ｃｌｏｎ、ＳＥＢ２２２Ｍｕ）によって測定された。簡潔に述べると、抗体を９６ウェルプレートにコーティング緩衝液（１５ｍＭのＮａ２ＣＯ３、３５ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中１００ｎｇ／ウェルで固定し、４℃で一晩インキュベートした。コーティングされたウェルは、２００μＬ／ウェルのアッセイ希釈液（ＰＢＳ中、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、０．０２％ＰｒｏＣｌｉｎ ３００）により室温で１時間ブロッキングされた。プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。精製組換えα−Ｓｙｎを使用して、５％マウス血清を含むアッセイ希釈液で標準曲線（２倍連続希釈で１５６〜１２５０ｎｇ／ｍＬの範囲）を作成した。５０μＬの希釈血清（１：２０）と標準液をコーティングしたウェルに添加した。インキュベーションは室温で１時間行った。すべてのウェルを吸引し、２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で６回洗浄した。捕捉されたヒトα−Ｓｙｎを、室温で１時間、１００μＬの検出抗体溶液（アッセイ希釈液中の５０ｎｇ／ｍｌのビオチン標識ＨＰ６０２９）とインキュベートした。次いで、ストレプトアビジンｐｏｌｙ−ＨＲＰ（１：１０，０００希釈、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ）を１時間（１００μＬ／ウェル）使用して、結合したビオチン−ＨＰ６０２９を検出した。すべてのウェルを吸引し、２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で６回洗浄し、１００μＬ／ウェルの１ＭのＨ２ＳＯ４の添加により反応を停止させた。標準曲線は、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して作成され、４つのパラメーターロジスティック曲線適合を生成し、試験されたすべての試料のα−Ｓｙｎの濃度を計算するために使用された。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用することにより、スチューデントｔ検定を使用してデータを比較した。
ｆ．組換えα−Ｓｙｎによるα−Ｓｙｎ凝集体の調製
凝集したα−Ｓｙｎを調製するために、精製した野生型またはＡ５３Ｔ変異型α−Ｓｙｎ［１００μＬのＰＢＳ／ＫＣｌ凝集緩衝液（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び１５０ｍＭのＫＣｌ）中、０．１μｇ／μｌ］を振とうせずに、サーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で７日間、１．５ｍＬエッペンドルフチューブ中で、３７℃でインキュベートした。凝集したα−Ｓｙｎは、後で使用するためにすぐに−８０℃で凍結した。
ｇ．抗α−Ｓｙｎ抗体の精製
抗α−Ｓｙｎ抗体は、アフィニティーカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を使用することによって、異なる配列のペプチド（配列番号９９〜１２１）を含むα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモットの注射後３〜１５週間（ＷＰＩ）に収集した血清から精製した。簡潔に述べると、緩衝液（０．１Ｍリン酸及び０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ ７．２）平衡化後、４００μＬの血清をＮａｂプロテインＧスピンカラムに添加し、１０分間の転倒混和と５，８００×ｇで１分間の遠心分離を行った。カラムを結合緩衝液（４００μＬ）で３回洗浄した。続いて、溶離緩衝液（４００μＬ、０．１ＭグリシンｐＨ ２．０）をスピンカラムに添加し、５，８００×ｇで１分間遠心分離した後、抗体を溶離した。溶離した抗体を中和緩衝液（４００μＬ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０）と混合し、これらの精製抗体の濃度を、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を標準として、ＯＤ２８０でＮａｎ−Ｄｒｏｐを使用して測定した。
ｈ．サイズの異なるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモット抗血清から精製した抗α−Ｓｙｎ抗体の特異性
ウエスタンブロットを使用して、異なるサイズのα−Ｓｙｎ分子複合体への結合特異性について、異なるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモット抗血清から精製した抗α−Ｓｙｎ抗体をスクリーニングした。２０μＭのα−Ｓｙｎを１２％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、光誘起架橋（ＰＩＣＵＰ）処理の前にニトロセルロース（ＮＣ）膜に転写した。膜を、モルモット抗血清から精製した１μｇ／ｍＬでの抗α−Ｓｙｎ抗体とともにインキュベートし、次いで、ＨＲＰ（７０６−０３５−１４８、Ｊａｃｋｓｏｎ）と結合したロバ抗モルモット抗体とともにインキュベートした。ブロットは化学発光試薬Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ ＥＣＬ Ｐｒｏ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で視覚化された。その結果、単量体α−Ｓｙｎ（Ｍｗ１４，４６０Ｄａ）は１４ｋＤａのサイズ付近でブロットされたが、二量体、三量体、またはオリゴマーの分子量は１４ｋＤａの単量体α−Ｓｙｎのサイズよりも数倍大きくなった。二量体、三量体、及びより大きなオリゴマーなどのさまざまなオリゴマー種を検出できる市販の抗体、Ｓｙｎ２１１（Ａｂｅａｍ）を陽性対照として使用した。
ｉ．アミロイド形成タンパク質の異なる種を用いたドットブロットアッセイ
Ａβ１−４２、Ｔａｕ、及びα−Ｓｙｎのα−ヘリックス単量体、β−シート単量体、β−シートオリゴマー、及びβ−シート原線維の調製は以下のとおりである。
１．Ａβ１−４２α−ヘリックス単量体：２０μｇのＡＰ１−４２β−シート単量体（５０μＬ）を２０％トリフルオロ酢酸及び２０％ヘキサフルオロイソプロパノール（１０μＬ）を含む１×ＰＢＳに添加し、４℃で２４時間インキュベートしてα−ヘリックス単量体を形成した。
２．Ａβ１−４２β−シート単量体：３７℃で２４時間凝集した５％ＴＦＡを含む１２０μＬのｌ×ＰＢＳ中の６０μｇのＡβ１−４２を１０ｋＤａカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、β−シート単量体を回収した。
３．Ａβ１−４２β−シートオリゴマー：３７℃で３日間凝集した１２０μＬの１×ＰＢＳ中の６０μｇのＡβ１−４２を氷上で超音波処理し、１０及び３０ｋＤａカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移して３５ｋＤａ未満のβシートオリゴマー原線維を回収した。
４．Ａβ１−４２β−シート原線維：３７℃で３日間凝集した１２０μＬの１×ＰＢＳ中の６０μｇのＡβ１−４２を氷上で超音波処理し、３０ｋＤａカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移してβシート原線維を単離した。
５．α−Ｓｙｎα−ヘリックス単量体：新たに調製した４０μｇのα−Ｓｙｎを４℃の１００μＬの冷１×ＰＢＳに溶解し、直ちに１０ｋＤａカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移してα−ヘリックス単量体を回収した。
６．α−Ｓｙｎβ−シート単量体：１００μＬのＰＢＳ／ＫＣｌ緩衝液で３７℃、２４時間インキュベートした４０μｇのα−Ｓｙｎを１０ｋＤａカットオフフィルター（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ）に移し、β−シート単量体を回収した。
７．α−Ｓｙｎβ−シートオリゴマー：１００μＬのＰＢＳ／ＫＣｌ緩衝液で３７℃、８日間凝集した４０μｇのα−Ｓｙｎを氷上で超音波処理した後、３０及び１００ｋＤａカットオフフィルターに移してβシートオリゴマーを回収した。
８．α−Ｓｙｎβ−シート原線維：１００μＬのＰＢＳ／ＫＣｌ緩衝液で３７℃、８日間凝集した４０μｇのα−Ｓｙｎを氷上で超音波処理した後、３０及び１００ｋＤａカットオフフィルターに移してβシート原線維を単離した。Ｔａｕ４４１α−ヘリックス単量体： ４℃で１００μＬのｌ×ＰＢＳで調製した６０μｇのＴａｕを１００ｋＤａカットオフに移し、αヘリックス単量体を回収した。
９．Ｔａｕ４４１β−シート単量体：２５℃で４８時間、１０ユニット／ｍＬヘパリンを含む１００μＬの１×ＰＢＳで凝集した６０μｇのＴａｕを４℃で１００ｋＤａカットオフフィルターに移し、βシート単量体を回収した。
１０．Ｔａｕ４４１β−シートオリゴマー：３７℃で４８時間、１０ユニット／ｍＬヘパリンを含む１００μＬのｌ×ＰＢＳで凝集した６０μｇのＴａｕを、４℃で１００及び３００ｋＤａカットオフフィルター（Ｐａｌｌ）に移してβシートオリゴマーを回収した。
１１．Ｔａｕ４４１β−シート原線維：３７℃で６日間、１０ユニット／ｍＬヘパリンを含む１００μＬのｌ×ＰＢＳで凝集した６０μｇのＴａｕを、４℃で３００ｋＤａカットオフフィルター（Ｐａｌｌ）に移し、βシート原線維を単離した。
これらの単量体及びオリゴマーは、チオフラビン−Ｔ（ＴｈＴ、Ｓｉｇｍａ）蛍光またはＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によって検証された。アミロイド形成タンパク質の濃度は、市販のアミロイド形成Ａβ１−４２ストックを標準としてＮａｎｏ−Ｄｒｏｐで測定した。これらの単量体とオリゴマーは、Ａβ１−４２について３μｇ、α−Ｓｙｎについて４μｇ、Ｔａｕについて７μｇの量で、ＰＶＤＦ膜に個別にスポットされた。膜を、一次抗体としてモルモット抗血清から精製した抗α−Ｓｙｎ抗体（１：１０００希釈）とインキュベートした後、抗モルモットＨＲＰ結合二次抗体（１：５０００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とのハイブリダイゼーションを行った。膜をＬｕｍｉｎａｔａ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ基質（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）で処理し、シグナルをＣｈｅｍｉＤｏｃ−Ｉｔ ８１０デジタル画像システム（ＵＶＰ Ｉｎｃ．、Ｕｐｌａｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で検出した。
ｉ．神経成長因子（ＮＧＦ）処理時のα−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞における凝集したα−Ｓｙｎへの結合特異性
ＮＧＦ処理後の親ＰＣ１２、モック対照ＰＣ１２、及びα−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞で、８または９ＷＰＩで収集したモルモット抗血清から精製した抗α−Ｓｙｎ抗体を用いた免疫細胞化学（ＩＣＣ）を行って、免疫後に誘発された抗体の結合親和性を評価した。細胞核をＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で対比染色した。蛍光顕微鏡で写真を撮影し、細胞の総数に対する陽性染色された細胞の数の比率を、１％未満、１〜１５％、１６〜５０％、５０％を超えるものを表す、−、＋、＋＋、及び＋＋＋で分類してスコア化した。
実施例４
免疫原性及び有効性の研究に使用される細胞及び動物
ａ．α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞：
全長ヒト野生型α−ＳｙｎまたはＡ５３Ｔ変異型α−ＳｙｎをコードするｃＤＮＡ配列を、ＣＭＶプロモーターを持つｐＺＤ／ＸＯＬ−Ｌベクターに挿入することにより、ｐＺＤ／ＸＯＬ−Ｌ−α−Ｓｙｎプラスミドを構築した。製造業者の手順に従って、リポフェクタミンＬＴＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、コンストラクトをＰＣ１２細胞にトランスフェクトした。２．５μＬのトランスフェクション混合物、５００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地、２．５μＬのＰＬＵＳ試薬、及び８．７５μＬのリポフェクタミンＬＴＸを混合し、室温で２５分間インキュベートした。培地を１．５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０増殖培地に交換した後、５００μＬのトランスフェクション混合物を各ウェルに直接添加し、３７℃で１日間インキュベートした。トランスフェクション効率は、ＰＣＲ及びウエスタンブロッティングで確認された。
ｂ．モルモット：
免疫原性の研究は、成熟した、ナイーブな、成体のオス及びメスのダンカン・ハートレー・モルモット（３００〜３５０ｇ／ＢＷ）で実施された。実験では、群ごとに少なくとも３匹のモルモットを使用した。ダンカン・ハートレー・モルモット（８〜１２週齢；Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＰＡ、ＵＳＡ）を含むプロトコールは、承認されたＩＡＣＵＣ申請の下で、契約動物施設、及びスポンサーとしてＵＢＩで実行された。
ｃ．線維性α−Ｓｙｎを接種したパーキンソンマウスモデル
ＦＶＢメスマウス（体重２５〜３０ｇ）は、１２時間の明期：１２時間の暗期のサイクルで飼育され、動物のケアはＡＡＡＬＡＣが承認したガイドラインに従った。繊維性α−Ｓｙｎは、α−Ｓｙｎペプチド（５ｍｇ／ｍＬ）を０．１％ＮａＮ３含有ＰＢＳ／高ＫＣｌ緩衝液中で、３７℃で振とうせずに７日間インキュベートすることにより調製した。ＴｈＴ蛍光を測定することによって線維化をモニターし、シグナルが元のα−Ｓｙｎ単量体の３倍を超えて増加したときに確認した。ウエスタンブロット法はまた、イソフルラン麻酔動物の片側黒質（前−後；−３．０ｍｍ；内側−外側：−１．３ｍｍ；背−腹：ブレグマ及び硬膜から−４．７ｍｍ）、ならびに背部新線条体（前−後；＋０．２ｍｍ、内側−外側；−２ｍｍ、背−腹：ブレグマ及び硬膜から−３．２ｍｍ）への接種の前にα−Ｓｙｎの凝集を検証するために使用された。
ｄ．ＭＰＰ＋誘導パーキンソンマウスモデル
Ｂａｌｂ／ｃメスマウス（体重１８〜２０ｇ）は、１２時間の明期：１２時間の暗期のサイクルで飼育され、動物のケアはＡＡＡＬＡＣが承認したガイドラインに従った。ＭＰＰ＋ヨージド（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｕｉｓ、ＭＯ）を生理食塩水に溶解し、１８μｇのＭＰＰ＋ヨージド（０．８ｍｇ／ｋｇ）を含む１０μｌの溶液を麻酔動物の片側脳室に注射した。注射部位の定位座標は、ブレグマ−１．０ｍｍ、横１．０ｍｍ、深さ２．０ｍｍであった。
実施例５
アルファシヌクレインペプチド免疫原コンストラクトを組み込んだ多成分医薬組成物の設計原理、スクリーニング、同定、及び最適化
ａ．設計の歴史
各α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトまたは免疫療法製品には、特定の疾患メカニズムと介入に必要な標的タンパク質（複数可）に基づいた独自の設計フォーカスとアプローチが必要である。設計の対象となる標的には、病気の経路に関与する細胞タンパク質、または病原体由来のいくつかのタンパク質が関与する可能性のある感染因子が含まれ得る。研究から商品化までのプロセスは非常に長く、典型的には、達成するまでに１０年以上必要とする。
標的分子を選択したら、広範な血清学的検証プロセスが必要である。標的分子内のＢ細胞及びＴ細胞エピトープの同定と分布は、分子α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの設計にとって重要である。標的Ｂ細胞エピトープが認識されると、小動物での連続的なパイロット免疫原性研究が実施され、デザイナーペプチドの医薬組成物によって誘発される抗体の機能的特性が評価される。次いで、誘発された抗体のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性及び機能特性のさらなる検証のために、そのような血清学的適用が標的種の動物で行われる。すべての研究は複数の並行群で実施され、血清は評価のために免疫された宿主から収集された。標的種またはヒト医薬組成物の場合の非ヒト霊長類における初期の免疫原性研究も実施され、免疫原性及び設計の方向性をさらに検証する。次いで、さまざまな混合物で標的ペプチドを調製し、組み合わせて使用してそれぞれの製剤設計を調製するとき、ペプチドコンストラクト間のそれぞれの相互作用に関連する機能特性の微妙な相違を評価する。追加の評価の後、最終的なペプチドコンストラクト、ペプチド組成物、及びその製剤が、製剤のそれぞれの物理的パラメーターとともに確立され、最終製品開発プロセスをもたらす。
ｂ．シヌクレイノパチー患者を治療する可能性のある医薬組成物のためのα−Ｓｙｎ由来ペプチド免疫原コンストラクトの設計と検証
医薬品組成物に組み込むための最も強力なペプチドコンストラクトを生成するために、麻疹ウイルス融合（ＭＶＦ）タンパク質配列またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質からさらに設計された、さまざまな病原体または人工Ｔヘルパーエピトープに由来する無差別Ｔヘルパーエピトープの大きなレパートリーは、モルモットの免疫原性研究に組み込まれた。α−Ｓｙｎ１２６−１４０、α−Ｓｙｎ１２１−１４０、α−Ｓｙｎ１１１−１４０、α−Ｓｙｎ１０１−１４０、α−Ｓｙｎ９１−１４０、α−Ｓｙｎ８５−１４０、α−Ｓｙｎ１２１−１３５、α−Ｓｙｎ１１１−１３５、α−Ｓｙｎ１０１−１３５、α−Ｓｙｎ９７−１３５、α−Ｓｙｎ１２３−１３５、α−Ｓｙｎ１２６−１３５、α−Ｓｙｎ１１１−１３２、及びα−Ｓｙｎ１０１−１３２由来のペプチドコンストラクトの代表的な研究は、表３（配列番号９９〜１２１）に示され、α−Ｓｙｎペプチドは、スペーサー（複数可）としてεＫ及び／またはＫＫＫを介して、個々の無差別Ｔヘルパーエピトープと結合していた。
ｉ）ペプチド免疫原設計の標的としてのα−ＳｙｎのＣ末端部分の選択。
α−Ｓｙｎは天然変性タンパク質である。それは、１４０個のアミノ酸で構成され、３つの領域に分かれている。Ｎ末端領域（残基１〜６０）は、膜の認識と結合の典型的な立体構造である両親媒性ヘリックスを形成できる。残基６１〜９５を含む中央領域は、ＡＤ老人斑で最初に同定された非アミロイドβ成分（ＮＡＣ）としてよく知られている。この領域は、βに富む立体配座を形成する傾向が高く、凝集しやすい傾向がある。この領域内の異なるタイプの翻訳後修飾は、α−Ｓｙｎ凝集の調節に明確に異なる効果を示す。残基９６〜１４０のＣ末端領域は、プロリンと負に帯電した残基に富み、これは、溶解性を維持する天然変性タンパク質に見られる一般的な特性である。このＣ末端ドメインは、疎水性が低く、正味の負電荷が大きいため、一般的にランダムコイル構造で存在する。ｉｎ ｖｉｔｒｏの研究により、これらの負電荷を中和するｐＨの低下によってα−Ｓｙｎ凝集が誘発できることが明らかになっている。α−Ｓｙｎは、膜結合、細胞質、及びアミロイド凝集の状態でのさまざまな条件に適応し、汎用性の高い機能を果たす、極端な立体構造の多様性を特徴とする。タンパク質が溶解性を維持するために重要なＣ末端のランダムコイルと天然変性領域は、ペプチド免疫原設計の標的として選択されたが、この領域がＮ末端両親媒性ヘリックスと中央のβに富む立体配座領域と比べて抗体または他の物理的要因による調節に最も影響を受けやすいと考えられたからである。
ｉｉ）α−Ｓｙｎ Ｂエピトープ設計における除外のための自己Ｔｈエピトープの同定。
予備的な免疫原性分析により、α−Ｓｙｎ配列のＮ末端からのペプチド配列の削除により、α−Ｓｙｎ１２６−１４０（配列番号９）、α−Ｓｙｎ１２１−１４０（配列番号８）、α−Ｓｙｎ１１１−１４０（配列番号７）ペプチドを完全に非免疫原性にするが、いくつかの中程度の免疫原性が、α−Ｓｙｎ１０１−１４０（配列番号６）、α−Ｓｙｎ９１−１４０（配列番号５）、及びα−Ｓｙｎ８５−１４０（配列番号４）ペプチド（表４）で観察され、Ｃ末端配列内に潜在的な自己Ｔｈ様構造の存在を示し、α−ＳｙｎのＣ末端にヘルパーＴ細胞エピトープ（複数可）構造の存在が確認された。Ｂエピトープ（複数可）設計にこのような配列を含めると、先立つアルツハイマー病ワクチンのＡＮ１７９２のように、自己Ｔ細胞の活性化による追加免疫での脳の炎症を引き起こす可能性がある。したがって、この発見では、Ｂエピトープ設計に自己Ｔ細胞エピトープ（複数可）が含まれる可能性を避けるために、アミノ酸残基Ｇ１１１から始まるＢ細胞エピトープ（複数可）でα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを設計する必要がある。
ｉｉｉ）異種Ｔヘルパーエピトープのランキングと、選択されたα−Ｓｙｎ Ｂエピトープペプチドの免疫原性を回復及び強化するためのα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト設計へのそれらの包含。
表２には、Ｂ細胞エピトープ免疫原性を強化するために、マウス、ラット、モルモット、ヒヒ、マカクなどから得られた多種の相対効力について群内で試験された合計２９の異種Ｔｈエピトープ（配列番号７０〜９８）が列挙される。表５に示すように、ＭｖＦタンパク質に由来するＵＢＩＴｈ１（配列番号８３）及びＵＢＩＴｈ２（配列番号８４）Ｔ細胞エピトープは、両方とも非免疫原性α−Ｓｙｎ１０１−１４０（配列番号６）ペプチドをそれぞれ強力及び中程度の免疫原性に増強することができる。複数のα−Ｓｙｎ由来のペプチド免疫原コンストラクトの広範な試験が実行され、これらの免疫原コンストラクト間の相対的な免疫原性のランキングが可能になった。ＵＢＩＴｈ３（配列番号８１）でも、長いα−ＳｙｎペプチドＡ９１−Ａ１４０（配列番号５）でコーティングしたプレートで、ＥＬＩＳＡで試験するとき、表６に示すように、スペーサーを介してさまざまなＣ末端α−Ｓｙｎペプチド（配列番号４〜９）に共有結合するとき、同様の免疫増強活性が見られる。
ｉｖ）対応するα−Ｓｙｎ及びβ−Ｓｙｎとの抗体反応性に関するＣ末端α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの免疫原性の評価。
シヌクレインファミリーには、３つの既知のタンパク質、α−Ｓｙｎ、β−Ｓｙｎ、及びガンマ−シヌクレインが含まれる。すべてのシヌクレインは、交換可能なアポリポタンパク質のクラスＡ２脂質結合ドメインと類似性のある、高度に保存されたアルファヘリックス脂質結合モチーフを共有している。β−Ｓｙｎは、α−Ｓｙｎと非常に相同である。β−Ｓｙｎは、パーキンソン病などの神経変性疾患で起こるα−Ｓｙｎ凝集の阻害剤であることが示唆されている。したがって、β−Ｓｙｎは、α−Ｓｙｎの神経毒性作用から中枢神経系を保護する可能性がある。したがって、対応する凝集保護β−Ｓｙｎではなく、α−シヌクレインと優先的に反応する抗体を誘発するために、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを有することが好ましい。Ｃ末端がＡ１４０で終わる６つのペプチド免疫原コンストラクトを試験するとき、これらのコンストラクトの免疫血清に由来するすべての抗体は、表６に示すように、対応するサイズのβ−Ｓｙｎと大幅な交差反応性を示した。α−Ｓｙｎとβ−Ｓｙｎ（配列番号１及び２）の間の配列相同性を綿密に調べると、Ｃ末端の５個のアミノ酸ＹＥＰＥＡに対応する配列が２つのタンパク質間で同一であることが示された。したがって、これらのＹＥＰＥＡの５個のアミノ酸を含む配列を除くＢエピトープ（複数可）を設計することが望ましい。したがって、表６に示す免疫原性研究からの発見は、Ｂエピトープ（複数可）設計におけるＹＥＰＥＡ（Ｙ１３６〜Ａ１４０）の削除をもたらす。スペーサー配列、及び、例えば人工ＴヘルパーペプチドＵＢＩＴｈ１（配列番号８３）のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトへの組み込みの際、表７のα−Ｓｙｎペプチド免疫原（配列番号１０７〜１１４）で示されるＹＥＰＥＡテールを除くＢ細胞エピトープ配列を使用する設計は、長いα−ＳｙｎペプチドＫ９７−Ａ１４０（配列番号１１０）で評価すると、すべて高い免疫原性となった。どの免疫血清もβ−Ｓｙｎと反応しなかった。したがって、表６及び表７から得られたデータから、ペプチド免疫原コンストラクトのＢエピトープ設計は、α−ＳｙｎＧ１１１からＤ１３５及びそのフラグメントに限定される。
ｖ）αＳｙｎペプチド免疫原コンストラクトによって誘発された抗体は、α−ヘリックス単量体ではなく、ベータシート単量体、オリゴマー、または原線維とのみ反応した。
α−Ｓｙｎペプチド免疫原の設計に適切な原理を使用したが、設計されたα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトから生成された抗体が、Ｇ１１１で始まりＤ１３５で終わる配列またはそのフラグメントを持つＢエピトープを持つことが驚くべきことに見出され、誘発された抗体は、β−シートα−Ｓｙｎ単量体、オリゴマー、及び原線維と特異的に反応するが、β−シートＡβ１−４２またはＴａｕ１−４４１と反応しないため、図８のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１１２及び１１３）で代表的に示されるように、理想的なα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの候補を提供する。
ｖｉ）α−Ｓｙｎ由来のペプチド免疫原コンストラクトと異なる無差別Ｔヘルパーエピトープを使用することによるＭＨＣカバレッジの拡大。
多様な遺伝的背景を持つ患者を治療するための医薬組成物を設計するとき、設計を多様な遺伝的背景を持つ最大人口をカバーできるようにすることが重要である。したがって、このような組み合わせに対するα−Ｓｙｎ由来ペプチド免疫原コンストラクトの相乗的免疫原性効果について調査された。ＭＶＦまたはＨＢｓＡｇに由来する無差別Ｔヘルパーエピトープは、このような免疫原性の強化を提供する最も強力なものの１つであるため、ヘルパーＴエピトープを含むペプチドコンストラクトの組み合わせは、そのような探索のために設計された。同じＢエピトープを持つ２つのペプチド免疫原コンストラクトの混合物は、それぞれの個々のペプチドコンストラクトによって誘発される免疫応答と比較したときに、かなりの免疫応答を誘発することが見出された。
実施例６
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトにより標的化Ｂ細胞エピトープのみに対して誘発される焦点化抗体応答
標的化Ｂ細胞エピトープペプチドに対する免疫応答を、そのようなＢ細胞エピトープペプチドのそれぞれの担体タンパク質への化学的コンジュゲーションによって増強するために使用されるすべての担体タンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、またはジフテリアトキソイド（ＤＴ）及び破傷風トキソイド（ＴＴ）タンパク質などの他の担体タンパク質）は、免疫された宿主において、９０％を超える強化担体タンパク質に対する抗体、及び１０％未満の標的化Ｂ細胞エピトープに対する抗体が誘発される。したがって、本発明のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの特異性を評価することは興味深い。免疫原性評価のために、スペーサー配列を介して異種Ｔ細胞エピトープＵＢＩＴｈ１（配列番号８３）に結合されたさまざまな長さのＢ細胞エピトープを持つ、一連の８つのα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト（配列番号１０７から１１４）を調製した。ＵＢＩＴｈ１（Ｂエピトープ免疫増強に使用されるＴヘルパーペプチド）をプレートにコーティングし、モルモット免疫血清を使用して、免疫増強に使用したＵＢＩＴｈ１ペプチドとの交差反応性を試験した。表６及び表７に示すように、Ｂエピトープ（複数可）に対して生成された高力価の抗体によって示されるように、対応する標的化Ｂエピトープに対するこれらのコンストラクトの高い免疫原性とは対照的に、表８に示すように、すべてではないが、免疫血清の多くは、ＵＢＩＴｈ１ペプチドに対して非反応性であることが見出された。
要約すると、慎重に選択されたＴヘルパーエピトープに結合した標的Ｂ細胞エピトープを組み込んだ簡単な免疫原設計により、α−ＳｙｎＢ細胞エピトープのみを標的とする焦点化された欠点のない免疫応答の生成が可能になる。医薬組成物の設計では、免疫応答がより特異的になればなるほど、組成物に提供される安全性プロファイルが高くなる。したがって、本発明のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトは、その標的に対して非常に特異的であるが非常に強力である。
実施例７
さまざまなアルファ−シヌクレインペプチド免疫原コンストラクトに対する免疫血清（９ ＷＰＩ）による詳細な特異性分析のためのエピトープマッピング
α−ＳｙｎのＣ末端領域内の特定の残基への抗体結合部位（複数可）を決定する詳細なエピトープマッピング研究（表９）では、（Ｋ８０−Ａ１４０）のα−Ｓｙｎアミノ酸配列を包含する、５２の重複する１０ｍｅｒ（配列番号１８〜６９）が合成された。（９７−１３５、配列番号１０）及び（１１１−１３２、配列番号１７）の２つのより長いペプチドを陽性対照として使用した。これらの１０ｍｅｒペプチドと２つのより長いペプチドを、固相免疫吸着剤としての９６ウェルマイクロタイタープレートウェルに個別にコーティングした。プールしたモルモット抗血清を、試料希釈緩衝液で１：１００希釈して、２．０μｇ／ｍＬの１０ｍｅｒペプチドでコーティングしたプレートウェルに添加し、次いで、３７℃で１時間インキュベートした。プレートウェルを洗浄緩衝液で洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合プロテインＡ／Ｇを添加し、３０分間インキュベートする。ＰＢＳで再度洗浄した後、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定するために基質をウェルに添加し、試料を二重化して分析した。抗血清とＢエピトープ免疫原コンストラクトの対応する長いα−Ｓｙｎペプチドとの結合は、最大の結合を表す。
表９に示すように、６つのα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト［（Ｋ９７−Ｄ１３５、配列番号１１０）、（Ｇ１１１−Ｄ１３５、配列番号１０８）、（Ｇ１１１−Ｇ１３２、配列番号１１３）、（Ｅ１２６−Ｄ１３５、配列番号１１２）、（Ｇ１０１−Ａ１４０、配列番号１０４）、及び（Ｅ１２６−Ａ１４０、配列番号９９）］からそれぞれ得られたプールされた９ｗｐｉモルモット免疫血清は、詳細なエピトープマッピングのために選択された。さまざまな長さのこれらの６つのＢエピトープ断片は、α−シヌクレインのＣ末端領域の９７〜１４０の配列を完全に包含している。ＥＬＩＳＡの結果は、６つの免疫血清すべてが代表的なα−Ｓｙｎの長いペプチド（９７−１３５、配列番号１０）と強く反応することを示した。１０ｍｅｒの詳細なエピトープマッピング研究の結果、ＡＡ１１４から１２５の領域（配列番号５２、５３、５４のペプチド１１４〜１２３、１１５〜１２４、１１６〜１２５）近辺を包含する免疫原性エピトープと、ペプチド１３１−１４０（配列番号６９）で表されるＣ末端での高度の免疫原性の領域とを明らかにした。興味深いことに、Ｃ末端α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトに由来する多くの免疫血清は、ＥＧＹＱＤＹＥＰＥＡ（配列番号６９）の配列を持つα−ＳｙｎのＣ末端に位置し、β−Ｓｙｎタンパク質との交差反応性を担うエピトープを除き、線形ではなく立体構造エピトープを認識する抗体を誘発した。
このエピトープマッピングの結果はあまり予期されなかったが、これらの抗体が、α−Ｓｙｎの変性β−シートに類似し、天然のα−Ｓｙｎのαヘリックスと非交差反応性の配座構造をもたらす異種Ｔｈエピトープ構造に結合したα−ＳｙｎのＣ末端ランダムコイル領域からのα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）及びα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）で表されるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトに由来するという発見とよく相関した。
実施例８
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによって誘発される抗体とその製剤：組換えアルファシヌクレインタンパク質に対する、抗凝集及び脱凝集効果
組換えα−Ｓｙｎに対するモルモット抗血清から精製した抗α−Ｓｙｎ抗体を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗凝集アッセイ及び脱凝集アッセイにおけるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの効果を評価した。
ａ．α−Ｓｙｎ凝集の阻害
潜在的な抗凝集能について、異なるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモットから精製した異なる抗α−Ｓｙｎ抗体の初期スクリーニングアッセイを、実施例３に記載されるように、チオファビンＴ測定によりα−Ｓｙｎ凝集の変化のレベルを定量化することにより実施した。ＰＢＳで１００μＭに調製した組換えα−Ｓｙｎを、３８４ウェルプレートで５μＭの濃度で、４０μＬのＰＢＳ／ＫＣｌ緩衝液（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４中２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び１５０ｍＭのＫＣｌ）でさらに６日間インキュベートして凝集を引き起こした。異なる時点で収集された異なるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化されたモルモット抗血清から精製された抗α−Ｓｙｎ抗体の異なる濃度（０．０５、０．５、または５μｇ／ｍＬ）をインキュベーション混合物に添加し、α−Ｓｙｎの凝集を阻害するそれぞれの効果を評価した。インキュベーションの終わりまでに、ＴｈＴアッセイを使用して凝集レベルを決定した。各試験実施から得られた測定値は、媒体対照の凝集レベルを１００％とし、α−Ｓｙｎの非存在下で得られた測定値を０％として標準化された。
表１０に要約されるように、９ＷＰＩ以上で収集されたα−Ｓｙｎ１１１−１３２、α−Ｓｙｎ１２１−１３５、またはα−Ｓｙｎ１２６−１３５によって誘発された３つの抗α−Ｓｙｎ抗体は、α−Ｓｙｎ凝集に対する、より強力な、濃度依存的な阻害を明らかにした。アッセイしたすべての抗α−Ｓｙｎ抗体のうち、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）、α−Ｓｙｎ１２１−１３５（配列番号１０７）、α−Ｓｙｎ１２３−１３５（配列番号１１１）、またはα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）によって誘発された４つの選択された抗体（９ＷＰＩで収集）は、１００％の媒体対照の凝集レベルと比較して、ほぼ４０％のα−Ｓｙｎ凝集に対する抑制効果を示した（図１）。
ｂ．予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体の解離
上記の研究から、特定のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化されたモルモット抗血清から精製された抗α−Ｓｙｎ抗体が、α−Ｓｙｎ凝集の阻害に効果があることが認められた。α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによって誘発された抗体が、予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体の解離に有効であるかどうかをさらに評価するために、モルモット抗血清から精製された抗α−Ｓｙｎ抗体を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ脱凝集アッセイを実施した。
α−Ｓｙｎは、５μＭの濃度で、２００μＬのＰＢＳ／ＫＣｌバッファー中で３日間凝集した。遠心分離（１３，０００×ｇ、４℃、３０分）後、α−Ｓｙｎ凝集体を回収し、ＴｈＴアッセイで確認した。次いで、予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体を、モルモット抗血清から精製された抗α−Ｓｙｎ抗体（５μｇ／ｍＬ）を含むまたは含まない１００μＬのＰＢＳ／ＫＣｌ緩衝液中で３日間インキュベートした。インキュベーション後、４℃、１３，０００×ｇで３０分間の遠心分離後に凝集物を収集し、実施例３に記載されているようにＴｈＴアッセイで定量した。媒体対照での自発的な解離後の残留α−Ｓｙｎ凝集体を、１００％に標準化した。
α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）またはα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）によって誘発された２つの選択された抗α−Ｓｙｎ抗体、ならびにα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）誘発及びα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）誘発抗α−Ｓｙｎ抗体の組み合わせは、このｉｎ ｖｉｔｒｏ脱凝集アッセイで試験された。その結果、α−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）及びα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）によって誘発された抗α−Ｓｙｎ抗体は、予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体に対して、１００％としての媒体対照と比較してほぼ５０％の解離効果を実証したが、他の抗ａ−Ｓｙｎ抗体及び事前免疫動物から精製した抗体は、同等の効果を示すことができなかった（図２）。
実施例９
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによって誘発される抗体とその製剤：α−Ｓｙｎ過剰発現細胞におけるα−Ｓｙｎ凝集速度論に対する抗凝集効果及び脱凝集効果
α−Ｓｙｎ凝集は神経分化中に加速することが知られている。α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトが細胞ベースの条件でα−Ｓｙｎ凝集を阻害すること、または予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体を解離することのいずれかに対するα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの効果を評価するために、異なるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによって免疫化したモルモット抗血清から生成された抗α−Ｓｙｎ抗体を、ＮＧＦ処理、神経分化α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞ベースの抗凝集アッセイ及び脱凝集アッセイで評価した。
ａ．α−Ｓｙｎ凝集の阻害
α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞をポリ−Ｄ−リジンプレコート９６ウェルプレートに播種し、次いで、異なるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモットから精製した抗α−Ｓｙｎ抗体（０または０．５μｇ／ｍＬ）とともに神経成長因子（ＮＧＦ）（１００ｎｇ／ｍＬ）で４日間処理し、抗凝集活性を検証した。
処理した細胞を溶解し、２０μｇの細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次いでα−Ｓｙｎ抗体（ＢＤ）で検出した。高分子量領域で検出されたα−Ｓｙｎシグナルの量を定量化し、１００％としての媒体対照群に標準化された。図３にも示すように、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）、α−Ｓｙｎ１２１−１３５（配列番号１０７）、α−Ｓｙｎ１２３−１３５（配列番号１１１）、またはα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）によって誘発された４つの選択されたすべての抗α−Ｓｙｎ抗体では、媒体対照での凝集したα−Ｓｙｎの量と比較して、凝集したα−Ｓｙｎの量に対する８０〜９０％までの阻害効果が観察された。
ｂ．予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体の解離
予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体の脱凝集活性を検証するために、α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞を神経分化してα−Ｓｙｎの凝集を開始するためにＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）で３日間処理し、異なるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモットから精製した抗α−Ｓｙｎ抗体（０または０．５μｇ／ｍＬ）で追加の４日間さらに処理した。
処理した細胞を溶解し、２０μｇの細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次いでα−Ｓｙｎ抗体（ＢＤ）で検出した。高分子量領域で検出されたα−Ｓｙｎシグナルの量を定量化し、１００％としての媒体対照群に標準化された。図３にも示すように、α−Ｓｙｎ１１１−１３５（配列番号１０７）、α−Ｓｙｎ１２３−１３５（配列番号１１１）、またはα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）ペプチド免疫原コンストラクトにより誘発された抗α−Ｓｙｎ抗体では、凝集したα−Ｓｙｎの量の５０〜６０％の低下が観察されたが、一方、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）により誘発された抗α−Ｓｙｎ抗体は、凝集したα−Ｓｙｎの量の９０％を超える低下を示した。
実施例１０
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによって誘発される抗体とその製剤：ミクログリアＴＮＦ−α及びＩＬ−６分泌の減少に対する影響
黒質のニューロン損傷は、凝集したα−Ｓｙｎを黒質に放出し、炎症誘発性メディエーターの産生によりミクログリアを活性化し、それによりＰＤの持続的かつ進行性の黒質神経変性をもたらすと考えられている。異なるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモットから精製した抗α−Ｓｙｎ抗体によるミクログリア活性化の低減効果を評価するために、異なる抗α−Ｓｙｎ抗体の存在下または非存在下においてα−Ｓｙｎ凝集体で処理する際にミクログリアによって放出される炎症誘発性メディエーター、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子アルファ）及びＩＬ−６（インターロイキン−６）の量を測定した。
マウスＢＶ２細胞またはヒトＳＶＧ ｐ１２細胞を、１％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地に５，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を１μＭのα−Ｓｙｎで処理し、３７℃、５％ＣＯ２、加湿雰囲気で２４時間インキュベートした。その後、培地を回収し、遠心分離し、上清を分離した。上清中のＢＶ２細胞によって分泌されたＩＬ−６及びＳＶＧ ｐ１２細胞によって分泌されたＴＮＦ−αの濃度を、それぞれマウスＩＬ−６またはヒトＴＮＦ−αマウスＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して三重化して分析した。シグナルは、１００％としての媒体対照に標準化された。
データは、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）及びα−Ｓｙｎ１２３−１３５（配列番号１１１）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体が、ＳＶＧ ｐ１２細胞によるα−Ｓｙｎ凝集体を介したＴＮＦ−α放出を３０〜５０％減少させるが、一方、α−Ｓｙｎ１２３−１３５（配列番号１１１）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体は、ＳＶＧｐ１２細胞によるＩＬ−６放出を約３０％減少させた（図４）。結果は、α−Ｓｙｎ１２３−１３５（配列番号１１１）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体は、α−Ｓｙｎ凝集体媒介ミクログリア活性化の緩和において試験した他の抗α−Ｓｙｎ抗体よりも強力であることを示した。
実施例１１
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによって誘発される抗体とその製剤：外因性アルファシヌクレインによって誘発される神経変性の減少に対する影響
異なるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化されたモルモット抗血清から精製された抗α−Ｓｙｎ抗体の神経保護効果を評価するために、ＮＧＦ処理された神経分化ＰＣ１２細胞での外因性の予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体を持つｉｎ ｖｉｔｒｏ神経変性モデルが採用された。
ＰＣ１２細胞をＮＧＦ（１００ ｎｇ／ｍＬ）で６日間処理して、神経分化を誘導した。神経分化細胞の形態を確認し、ＩｎＣｅｌｌハイコンテンツ画像分析システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で分析した。ＮＧＦの神経栄養効果は、神経突起伸長に反映され、神経分化細胞の数が定量化された。神経突起伸長のレベルと神経分化細胞の数は、標準化後のパーセンテージ（平均値±ＳＥＭ）で示された。ＮＧＦ処理を有するものと有さないもののＰＣ１２細胞の神経突起長は、それぞれ１００％と０％とした。６日間のＮＧＦ処理による神経分化ＰＣ１２細胞の数は、１００％に標準化された。
神経変性は、外因性の予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体をニューロン分化ＰＣ１２細胞に加えることにより観察された。予め形成されたα−Ｓｙｎ凝集体の存在下では、神経突起長が短縮され、神経分化ＰＣ１２細胞の細胞数が減少した。このα−Ｓｙｎ凝集体駆動性の神経変性は、添加された外因性α−Ｓｙｎ凝集体の量に比例し、濃度依存的な方法で、α−Ｓｙｎ凝集体の神経毒性に対する神経保護効果で広く知られているクルクミンによってブロックし得た。市販の抗α−Ｓｙｎ抗体（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、α−Ｓｙｎ凝集体駆動神経変性を弱めたが、ナイーブモルモットから精製された抗体ではそうならなかった。このモデルは、異なるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモット抗血清から精製したどの抗α−Ｓｙｎ抗体が、濃度依存性の様式で、神経突起の成長と神経細胞の生存を回復する神経保護効果を有するかを識別するスクリーニングプラットフォームとして採用された（表１１及び表１２）。
その結果、半数を超える異なるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化されたモルモット抗血清から精製された抗α−Ｓｙｎ抗体が、神経突起成長を濃度依存的に回復し（表１１）、ほぼすべての異なるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモット抗血清から精製した抗α−Ｓｙｎ抗体は、神経分化ＰＣ１２細胞をα−Ｓｙｎ凝集体によって誘発される神経細胞死から保護した（表１２）。２つの異なるパラメーターを合わせると、アッセイした抗α−Ｓｙｎ抗体のほぼ３分の１が、神経突起長とα−Ｓｙｎ凝集体の神経毒性に対する細胞の生存の両方に効果があることが見出された。α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）、α−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）によって誘発された抗α−Ｓｙｎ抗体、及びナイーブモルモットからの免疫前抗体の抗神経変性効果が観察され、神経突起長及び蛍光生細胞標識色素であるカルセインＡＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による細胞数が定量化された。神経突起に富む神経分化ＰＣ１２細胞では、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）（図５Ｂ）及びα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）（図５Ｃ）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体がα−Ｓｙｎ凝集体が媒介する神経突起長の短縮に対する保護効果を示したが、ナイーブモルモットから精製された免疫前抗体（図５Ａ）ではそうならなかったことが見出された。
実施例１２
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによって誘発される抗体とその製剤：α−Ｓｙｎ過剰発現細胞の神経変性の減少に対する効果
異なるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化されたモルモット抗血清から精製された抗α−Ｓｙｎ抗体の神経保護効果を評価するために、野生型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞及びＡ５３Ｔ変異型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏ神経変性モデルが採用された。
ＮＧＦとのインキュベーション後、モック対照細胞（プラスミドベクターでトランスフェクトされた）は長い神経突起伸長を発達させ、親の野生型ＰＣ１２細胞と同様に細胞数を増加させたが、野生型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞及びＡ５３Ｔ変異型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞は、同等の神経突起伸長または細胞数の増加を発現せず、ＮＧＦ処理時に凝集したα−Ｓｙｎを伴う神経変性効果を確認した。ＮＧＦ処理時の野生型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞での過剰発現α−Ｓｙｎの特性評価では、ＮＧＦ処理後の野生型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞の細胞溶解物を用いてウエスタンブロット及びＴｈＴアッセイを実施した。ウエスタンブロット法の結果は、ＮＧＦ処理時に野生型α−Ｓｙｎを過剰発現するＰＣ１２細胞の細胞溶解物でα−Ｓｙｎが過剰発現することを示し、ＴｈＴアッセイの結果は、ＮＧＦ処理時に野生型α−Ｓｙｎを過剰発現するＰＣ１２細胞の細胞溶解物中のα−Ｓｙｎがβ−シート構造であったことを示した（すなわち、ＴｈＴ蛍光シグナルの上昇）。ＮＧＦ処理を伴わない野生型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞のウエスタンブロット法及びＴｈＴアッセイの結果と比較して、β−シートオリゴマーα−Ｓｙｎの神経変性効果を後にもたらす可能性のある、過剰発現α−Ｓｙｎのαヘリックスからβ−シートへの構造移行がＮＧＦ誘導神経分化時に起きることが示唆された。さらに、野生型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞と比較して、過剰発現したＡ５３Ｔ変異型α−Ｓｙｎは、ＮＧＦ処理時の神経突起長の短縮と細胞数の減少の両方に反映される強力な神経変性効果をもたらし、Ａ５３Ｔ変異型α−Ｓｙｎは、α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞において、野生型α−Ｓｙｎよりも強い神経変性効果を引き起こしたことを示す。
α−Ｓｙｎ１０１−１３２（配列番号１１４）、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）、α−Ｓｙｎ１２１−１３５（配列番号１０７）、α−Ｓｙｎ１２３−１３５（配列番号１１１）、またはα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体、ならびにα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）及びα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体の組み合わせは、神経変性に対する個々の保護効果を評価するための野生型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ神経変性モデルによってアッセイされた。野生型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞をＮＧＦで３日間処理して神経分化を開始し、その後、抗α−Ｓｙｎ抗体（最終濃度５μｇ／ｍＬ）とＮＧＦの両方とともにさらに３日間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりまでの細胞の顕微鏡観察により、選択された抗α−Ｓｙｎ抗体との共インキュベーションにより、媒体対照と比較して、神経突起長が回復し、細胞数が増加したことが明らかになった。神経突起長及び細胞数の定量化は、１００％に標準化された６日間ＮＧＦで処理された親ＰＣ１２細胞の読み取り値で行われた。その結果、媒体対照と比較したとき、α−Ｓｙｎ１０１−１３２（配列番号１１４）、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）、またはα−Ｓｙｎ１２３−１３５（配列番号１１１）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体、ならびにα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）及びα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体の組み合わせが、大幅に多い細胞数を示し、一方で、α−Ｓｙｎ１０１−１３２（配列番号１１４）、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）、α−Ｓｙｎ１２３−１３５（配列番号１１１）、またはα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体、ならびにα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１５）及びα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１４）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体の組み合わせは、大幅に長い神経突起長を示した（図６Ａ及び図６Ｂ）。
実施例１３
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによって誘発される抗体とその製剤：ベータシートオリゴマー及び線維性アルファシヌクレインタンパク質に対する特異性
異なるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモット抗血清から精製した抗α−Ｓｙｎ抗体の特異性をよりよく特徴付けるために、一連のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを、異なるサイズのα−Ｓｙｎ分子複合体、α−Ｓｙｎ、Ａβ、及びｔａｕタンパク質を含む異なるアミロイド形成タンパク質、ならびにＮＧＦ処理時のα−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞で凝集したα−Ｓｙｎで実施した。
ａ．大きなα−Ｓｙｎ分子複合体に対する特異性
異なるサイズのα−Ｓｙｎ分子複合体のウエスタンブロットは、一次抗体として異なるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化されたモルモット抗血清から精製された抗α−Ｓｙｎ抗体を使用して実施された。結果は、すべての抗α−Ｓｙｎ抗体が、より小さなサイズの単量体α−Ｓｙｎに加えて、二量体、三量体、四量体、及びオリゴマーを含むより大きなサイズのα−Ｓｙｎ分子複合体と強く反応することを示した。市販の抗α−Ｓｙｎ抗体、Ｓｙｎ２１１（Ａｂｃａｍ）と比較するとき、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）、α−Ｓｙｎ１２１−１３５（配列番号１０７）、α−Ｓｙｎ１２３−１３５（配列番号１１１）、及びα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体は、より大きなサイズのα−Ｓｙｎ分子複合体（二量体、三量体、四量体、及びオリゴマーを含む）のシグナルの、より小さなサイズの単量体α−Ｓｙｎのシグナルに対する比率が高いことを示し（図７Ａ及び図７Ｂ）、抗α−Ｓｙｎ抗体がより大きなα−Ｓｙｎ分子複合体に対する特異性を有していることを示唆している。
ｂ．異なるアミロイド形成タンパク質間のα−Ｓｙｎに対する特異性
実施例３に記載されているように調製された異なるアミロイド生成タンパク質（すなわち、α−Ｓｙｎ、Ａβ１−４２及びＴａｕ４４１）の異なる種（すなわち、α−ヘリックス単量体、β−シート単量体、β−シートオリゴマー、及びβ−シート原線維）によるドットブロットアッセイは、異なるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモット抗血清から精製した抗α−Ｓｙｎ抗体を一次抗体として使用して実施した。その結果、α−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）及びα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）によって誘発された抗α−Ｓｙｎ抗体は、α−Ｓｙｎのすべてのβ−シート型（単量体、オリゴマー、原線維種）に特異的に反応することが示されたが、α−ヘリックス単量体には反応しなかった（図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃ）。さらに、α−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）及びα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）によって誘発された抗α−Ｓｙｎ抗体は、β−シートの−シート単量体よりも、α−Ｓｙｎのβ−シート原線維及びα−Ｓｙｎのβ−シートオリゴマーにより強く反応した。対照的に、α−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）及びα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）によって誘発された抗α−Ｓｙｎ抗体は、β−Ｓｙｎまたはアミロイド形成タンパク質Ａβ１−４２及びＴａｕ４４１の異なる種（すなわち、αヘリックス単量体、βシート単量体、βシートオリゴマー及びβシート原線維）に対して、検出される反応性をまったく示さなかった（図８Ａ、図８Ｂ、及び図８Ｃ）。この発見は、α−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）及びα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体が、β−シート単量体、β−シートオリゴマー、及びβ−シート繊維状形態のα−Ｓｙｎに対する特異性を有することを示唆した。
ｃ．ＮＧＦ処理時のα−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞における凝集したα−Ｓｙｎへの結合特異性
異なるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化したモルモット抗血清から精製した抗α−Ｓｙｎ抗体を用いた免疫細胞化学（ＩＣＣ）は、親ＰＣ１２細胞、モック対照ＰＣ１２細胞、野生型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞、及びＡ５３Ｔ変異型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞で実施され、実施例３に記載されるように、ＮＧＦ処理時に凝集したα−Ｓｙｎに対する抗体の結合親和性を評価した。図９に示すように、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）、α−Ｓｙｎ１２１−１３５（配列番号１０７）、またはα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体は、ＮＧＦ処理時の、親ＰＣ１２細胞またはモック対照ＰＣ１２細胞よりも野生型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞及びＡ５３Ｔ変異型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞でより強い反応性が実証された。過剰発現α−Ｓｙｎ凝集がＮＧＦ処理により誘導されたため、この発見は、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）、α−Ｓｙｎ１２１−１３５（配列番号１０７）、またはα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）によって誘発された抗α−Ｓｙｎ抗体が、ＮＧＦ処理時の、野生型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞及びＡ５３Ｔ変異型α−Ｓｙｎ過剰発現ＰＣ１２細胞において凝集したα−Ｓｙｎに対する特異性を有していたことを示唆した。
実施例１４
α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤の組織特異性の評価のためのパーキンソン病によるヒト脳の免疫組織化学的染色
免疫前、α−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）またはα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体、及び両方の抗α−Ｓｙｎ抗体の１：１の組み合わせを用いる免疫組織病理学研究は、特異性及び望ましくない抗体の自己反応性をモニターするために、正常なヒト組織で実施された。ヒト組織パネル（Ｐａｎｔｏｍｉｃｓ）をキシレンで脱パラフィン化し、エタノールで再水和し、次いでＰＢＳ中に０．５％ＣａＣｌ２を含む０．２５％トリプシン溶液で３０分間処理し、メタノール中の１％過酸化水素でインキュベートして内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックし、その後、ＰＢＳ中の１０％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（Ｓｉｇｍａ）とのインキュベーションをし、α−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）またはα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）によって免疫化されたモルモットからの抗α−Ｓｙｎ抗体、及び両方の抗体の１：１の組み合わせ（１：３００希釈）を適用した。切片は３−３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で発色し、顕微鏡で検査される前にヘマトキシリンで対比染色された。市販の抗α−Ｓｙｎ抗体（ＢＤ、６１０７０８）の陽性反応とは対照的に、α−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）またはα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）で免疫化したモルモットから精製した抗α−Ｓｙｎ抗体、及び両方の抗体の１：１の組み合わせは、正常なヒト組織に対して負の反応性を示したが、これは、ナイーブモルモットの免疫前抗体のパターンに適合した（図１０Ａ）。
免疫前、α−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）またはα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体、及び両方の抗α−Ｓｙｎ抗体の１：１の組み合わせを用いる別の免疫組織病理学研究は、ヒトのパーキンソン病の脳との反応性を試験するために実施された。３つの領域（すなわち、小脳、脳梁、及び視床）の組織切片（ＢｉｏＣｈａｉｎ）をアッセイした。その結果、α−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）またはα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）によって誘発された抗α−Ｓｙｎ抗体、及び両方の抗α−Ｓｙｎ抗体の１：１の組み合わせが健康な脳切片の負の反応性と比較して、３つの領域すべてのＰＤ脳切片に対する陽性の反応性を示した（矢印による）（図１０Ｂ及び図１０Ｃ）。ＰＤ脳切片中のα−Ｓｙｎ凝集体に対する反応性の定量化は、顕微鏡観察下で陽性染色を計数することにより行った。結果は、α−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）またはα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）によって誘発される抗α−Ｓｙｎ抗体、及び両方の抗α−Ｓｙｎ抗体の１：１の組み合わせは、健康なヒトの脳切片と比較して、ＰＤ脳切片で強い陽性を有したことを示した。そして、アッセイされた３つの異なる抗α−Ｓｙｎ抗体のうち、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）によって誘発された抗体は、ＰＤ脳切片のα−Ｓｙｎ凝集体に対して最も強い免疫反応性を有した。
実施例１５
動物モデルにおけるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト及びその製剤の有効性の証明
ａ．免疫化と血液／脳組織の収集
パーキンソン病（ＰＤ）マウスモデルは、実施例４で記載されたように確立された。ＭＰＰ＋注射の２週間後、または線維性α−Ｓｙｎ接種の７週間後、マウスを、アジュバント群（組成物の調製に使用されるアジュバント及び溶媒で免疫化された（ＩＳＡ ５１ ＶＧ、ＣｐＧ３、０．２％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０））に加えて、ＵＢＩＴｈ１結合α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）ペプチド、ＵＢＩＴｈ１結合α−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）ペプチド、及び両方のペプチドの組み合わせを含む３つの群にランダムに分けた。筋肉内（ＩＭ）免疫を４０μｇの用量で３週間の間隔で３回投与した。投与及び採血のスケジュールは、表１３に従って実施された。
各時点で、２００μＬの血液が顔面静脈採血により採取された。穿刺した顎下静脈から滴る血液をマイクロチューブに集め、３００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血清を調製した。動物を犠牲にした後、脳組織試料をウエスタンブロッティングのために収集した。
ｂ．α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）または／及びα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）ペプチド免疫原コンストラクトを含む組成物を投与されたＰＤモデルマウスにおける免疫応答
各処理群のプールされた血清試料を１％ＢＳＡ（ＰＢＳＴ中）で希釈し、次いで、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（α−Ｓｙｎ濃度４．４μｇ／μｌ、ｐＨ ９．６）中の２００μＬのα−Ｓｙｎ全長ペプチド（Ｃｌｏｕｄ−ｃｌｏｎｅ）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに適用した。室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した後、１％ＢＳＡで１：３０００に希釈したＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体１００μｌを添加して、室温で２時間反応させた。その後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μｌの３，３，５，５−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とともに暗所で１０分間インキュベートした。次いで、１００μＬの２ＭのＨ２ＳＯ４を添加し、１５〜３０分間インキュベートした後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３ｘマルチモード検出（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で４５０ｎｍの光学濃度（ＯＤ）値を測定した。
製剤化されたα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）、製剤化されたα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）、または両方のペプチド免疫原コンストラクトの組み合わせで免疫化された２つのＰＤマウスモデルには、それぞれ、ＭＰＰ＋誘導モデル（図１１Ａ）または線維性α−Ｓｙｎ接種モデル（図１１Ｂ）で、２回目の免疫後、３．０を超える抗α−Ｓｙｎ抗体光学濃度（ＯＤ）値があり、初期免疫後１５週間また１９週間の研究の終了時まで上昇を維持したが、アジュバント投与動物は測定可能な抗α−Ｓｙｎ免疫応答を誘発しなかった。
線維性α−Ｓｙｎ接種モデルでは、α−Ｓｙｎ１１１−１３２コンストラクトはα−Ｓｙｎ１２６−１３５コンストラクトより強い免疫応答を誘発したが（図１１Ｂ）、ＭＰＰ＋誘導モデルでは免疫原性の違いは観察されなかった（図１１Ａ）ことに留意されたい。
ｃ．血清α−Ｓｙｎレベルの低下
各群の動物からプールされた血清のα−Ｓｙｎレベルは、実施例３に記載されるように、アルファヘリックスとβ−シートのα−Ｓｙｎの両方を検出できるＥＬＩＳＡキット（ＳＥＢ２２２Ｍｕ、ＵＳＣＮ）を使用してアッセイされた。
α−Ｓｙｎ定量ＥＬＩＳＡは、免疫化群の抗α−Ｓｙｎ抗体応答が、未処理動物と比較した場合の末梢α−Ｓｙｎの減少量と関連しているかどうか試験するためのものであった。ＭＰＰ＋誘導モデル（図１２Ａ）及び線維性α−Ｓｙｎ接種モデル（図１２Ｂ）の両方において、α−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）、またはこれらのコンストラクトの組み合わせによって免疫すると、アジュバント投与動物と比較して、α−Ｓｙｎレベルの光学濃度（ＯＤ）値が減少したことが示された。結果は、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトで免疫化するときに抗α−Ｓｙｎ抗体応答が発生すると、末梢循環のα−Ｓｙｎの量がそれに応じて減少したことを示唆した。
ｄ．脳でのオリゴマーα−Ｓｙｎレベルの減少
動物を犠牲にした後、脳組織試料をウエスタンブロッティングのために収集した。ＭＰＰ＋誘導マウスでは、脳を摘出し、ホモジナイズしたが、一方、線維性α−Ｓｙｎを接種したマウスでは、線条体及び黒質領域を最初に分離してからホモジナイズした。溶解緩衝液（Ａｍｒｅｓｃｏ）及び１×プロテイナーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）をホモジネートに添加することにより、脳組織溶解物を調製した。次いで、溶解物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で分離し、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写し、ＰＢＳ中の５％ミルクで一晩インキュベートした。ドーパミン作動性ニューロンの存在量を検出するために、膜を抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体（１：１０００希釈、Ａｂｃａｍ）とインキュベートし、続いてヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ結合二次抗体（１：５０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）でハイブリダイズした。視覚化には、Ｌｕｍｉｎａｔａ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓを使用し、結果のシグナルをＣｈｅｍｉＤｏｃ−Ｉｔ ８１０デジタル画像システムでキャプチャした。オリゴマーα−Ｓｙｎレベルの定量化は、ＧＡＰＤＨレベルで標準化することにより行われ、非病変溶解物の比率は、比較のために１００％にさらに標準化された。
ＭＰＰ＋誘導モデルでは、α−Ｓｙｎ１１１−１３２ペプチド免疫原コンストラクトで免疫化した動物において、オリゴマーα−Ｓｙｎ画分の減少が示された（図１３Ａ）。同様に、線維性α−Ｓｙｎを接種したマウスでは、線維性α−Ｓｙｎ接種と同側の黒質及び線条体の溶解物（図１４Ａ及び１４Ｄ）ならびに線維性α−Ｓｙｎ接種の反対側の線条体の溶解物（図１４Ｆ）を用いたウエスタンブロットは、アジュバント対照マウスで見られる２〜３倍までのオリゴマーα−Ｓｙｎレベルの増加が、製剤化されたα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）及びα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）コンストラクトでの処理後に軽減されたことを示した。ウエスタンブロッティングの結果の定量化は、図１３Ｂ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ、及び図１４Ｇに示される。
ｅ．神経病理学の減少
線維性α−Ｓｙｎを接種したマウスの場合、黒質領域を最初に単離し、次いでホモジナイズした。溶解緩衝液（Ａｍｒｅｓｃｏ）及び１×プロテイナーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）をホモジネートに添加することにより、組織溶解物を調製した。次いで、溶解物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）で分離し、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写し、ＰＢＳ中の５％ミルクで一晩インキュベートした。ドーパミン作動性ニューロンの存在量を検出するために、膜を抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体（１：１０００希釈、Ａｂｃａｍ）とインキュベートし、続いてヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ結合二次抗体（１：５０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）でハイブリダイズした。視覚化には、Ｌｕｍｉｎａｔａ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓを使用し、結果のシグナルをＣｈｅｍｉＤｏｃ−Ｉｔ ８１０デジタル画像システムでキャプチャした。α−Ｓｙｎの発現レベルは、タンパク質ローディング対照として使用されるＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）に対して標準化された。
その結果、α−Ｓｙｎ１１１−１３２コンストラクトによる免疫化により、チロシンヒドロキシラーゼの量が非病変の正常動物と同等のレベルに回復することが実証され（図１４Ｃ−１４Ｄ）、マウスに接種された凝集α−Ｓｙｎに関連する神経毒性に対するα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの神経保護効果が示唆された。
ｆ．運動活動の回復
ＣａｔＷａｌｋ（商標）ＸＴ（Ｎｏｌｄｕｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）は、ビデオベースの分析システムであり、各フットフォールの位置、圧力、表面積に基づいて、フットフォールのさまざまな側面を動的に客観的に測定する。すべてのマウスは、実験前に少なくとも１日３回、一貫した方法でランウェイを横断するように訓練された。成功した実行とは、動物が中断またはためらうことなくランウェイを走り抜けたと定義され、訓練に失敗したマウスは研究から除外された。
各マウスの平均５回の横断を分析した。線維性α−Ｓｙｎ接種は右脳で行われたため、左後肢立ち時間は、走行時間だけで参照パラメーターとみなされた。
線維性α−Ｓｙｎ接種モデルでは、α−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）またはα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）を含む組成物で処理した後、左後肢立ち時間の測定に有意差が見られた（図１５Ａ）。一方、線維性α−Ｓｙｎ接種モデル及びＭＰＰ＋誘発モデルの両方で、α−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）を含む組成物で処理した後、走行時間の測定値に有意差が見られた（図１５Ｂ及び１５Ｃ）。結果は、製剤化されたα−Ｓｙｎ１２６−１３５（配列番号１１２）または製剤化されたα−Ｓｙｎ１１１−１３２（配列番号１１３）のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによる処理と２つのＰＤマウスモデルの運動機能の改善との間の関連性を示唆した。
実施例１６
神経変性疾患で見出された異なるα−Ｓｙｎ系統を有するα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトにより生成される抗体の反応性
α−Ｓｙｎはパーキンソン病及びその他のシヌクレイノパチーを駆動する。α−Ｓｙｎタンパク質は、サイズと構造が異なり、細胞に及ぼす影響が異なる明確に区別されるタイプの凝集体を形成できるため、これらの各疾患は１つ以上の異なるタイプの凝集体によって引き起こされる。異なる形状のα−Ｓｙｎ凝集体は、脳にさまざまな損傷パターンを引き起こし、明確に区別される脳疾患を引き起こすことさえある。この研究は、α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによって生成された抗体が、神経変性疾患に見られるさまざまなα−Ｓｙｎ系統と相互作用する方法を評価するために設計された。
Ｒｏｎａｌｄ Ｍｅｌｋｉ博士はこの研究の共同研究者であった。ラボでは、次のような異なる種類のα−Ｓｙｎ凝集体が生成された。（ａ）原線維−α−Ｓｙｎタンパク質の長い、ねじれた、チャック式に一緒になった鎖；（ｂ）リボン−より広く平らな構造、及び（ｃ）α−Ｓｙｎオリゴマー（Ｏ５５０）、ドーパミン安定化（ＯＤＡ）及びグルタルアルデヒド安定化（ＯＧＡ）オリゴマー。
本明細書に開示される様々なα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトによりモルモットで生成された抗体は、それらの相対的親和性について試験された。ＰＤ−０２１５１４（α−Ｓｙｎ８５−１４０、ｗｐｉ ０８）、ＰＤ−０２１５２２（α−Ｓｙｎ８５−１４０、ｗｐｉ １３）、ＰＤ−１００８０６（α−Ｓｙｎ１２６−１３５、ｗｐｉ ０９）からの代表的な試料、ＰＲＸ００２、及び市販のモノクローナル抗体Ｓｙｎ１（クローン４２）は、フィルタートラップアッセイを使用して対照単量体とともに、原線維、リボン、原線維６５、原線維９１、原線維１１０、線維性アセンブリ経路α−Ｓｙｎオリゴマー（Ｏ５５０）、ドーパミン安定化（ＯＤＡ）及びグルタルアルデヒド安定化（ＯＧＡ）オリゴマーを含む個別のα−Ｓｙｎアセンブリで試験された。
方法及び材料
ａ．α−Ｓｙｎの原線維とリボンへのアセンブリ
原線維形成のために、可溶性ＷＴα−Ｓｙｎを緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＫＣｌ）で、６００ｒ．ｐ．ｍに設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒで連続的に振盪しながら３７℃でインキュベートした。磁気攪拌棒（６×３ｍｍ）を使用して、攪拌（１００ｒ．ｐ．ｍ．）下で１×１ｃｍキュベット中のチオフラビンＴ（１５μＭ）の存在下で、４４０ｎｍに設定された励起波長と４４０ｎｍ及び４８０ｎｍに設定された発光波長、ならびに１秒の平均時間で、Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ分光蛍光光度計（Ｖａｒｉａｎ Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって、アセンブリを連続的にモニターした。リボン形成のために、ＷＴα−Ｓｙｎを４℃で１，０００倍の緩衝液Ｂ（５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５）に対して１６時間透析し、次いで、６００ｒ．ｐ．ｍに設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒで連続的に振盪しながら３７℃でインキュベートした。４４０ｎｍの散乱光の測定により、アセンブリをモニターした。代替的に、３５，０００×ｇでの沈降後に上清に残っているタンパク質の量を、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ８４５３ダイオードアレイ分光光度計で２８０ｎｍの吸光度を測定することにより決定した。オリゴマー種の性質は、Ｊｅｏｌ１４００（Ｊｅｏｌ Ｌｔｄ．）ＴＥＭを使用して、炭素コーティング２００メッシュグリッドへの試料の吸着と１％酢酸ウラニルによるネガティブ染色を使用して評価した。画像はＧａｔａｎ Ｏｒｉｕｓ ＣＣＤカメラ（Ｇａｔａｎ）で記録された。α−Ｓｙｎアセンブリのコンゴレッドへの結合能を次のように評価した：α−Ｓｙｎ原線維及びリボンを、２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）中の１００μＭのＣｏｎｇｏ Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）とともに１時間インキュベートした。次いで、ポリマーをＴＬ１００卓上Ｂｅｃｋｍａｎ超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）で、２０℃で、２５，０００ｇで３０分間沈殿させた。等量の水を使用してペレットを４回洗浄した。ペレットの再懸濁後、アリコートをカバーガラス上に置き、すぐに画像化するか、または乾燥させた。試料は、交差偏光子を装備したライカ（ＭＺ１２．５）顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｔｄ．、Ｈｅｅｒｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した偏光顕微鏡により、明視野及び交差偏光で観察された。
ｂ．α−Ｓｙｎ原線維及びリボン濃度の決定
α−Ｓｙｎ原線維とリボンの長さの不均一性は、７５％振幅、０．５秒パルスに設定された超音波プロセッサーＵＩＳ２５０ｖ（２５０Ｗ、２．４ｋＨｚ、Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ、Ｔｅｌｔｏｗ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を搭載したＶｉａｌＴｗｅｅｔｅｒの２ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブで、氷上で２０分間超音波処理することにより減少させた。α−Ｓｙｎ原線維とリボンの沈降速度を測定した。沈降境界は、大きな粒子の不均一混合物に最適な最小二乗境界モデリング１ｓ−ｇ＊（ｓ）を使用して、Ｓｅｄｆｉｔソフトウェアで分析された。これにより、α−Ｓｙｎリボンでは５０〜１５０Ｓ、α−Ｓｙｎ原線維では１００〜１，０００Ｓの沈降係数の範囲の粒子の分布が得られ、α−Ｓｙｎリボン及び原線維では、それぞれ沈降係数が約９０Ｓ及び３７５Ｓの種を中心とし、α−Ｓｙｎリボンの場合、約１１，５００ｋＤａの分子量を有する粒子に対応し、例えば、約８００個のα−Ｓｙｎ分子（１２，０００ｋＤａ／１４．５ｋＤａ）で構成され、α−Ｓｙｎ原線維の場合、約１０２，０００ｋＤａの分子量を有する粒子に対応し、例えば、約７，０００個のα−Ｓｙｎ分子（１０，２０００ｋＤａ／１４．５ｋＤａ）で構成される。したがって、試料の遠心分離によりペレット画分においてタンパク質の１００％が見つかるため、α−Ｓｙｎの１００％は定常状態でリボンまたは原線維にアセンブリすると仮定すれば、２０μＭの使用濃度では、α−Ｓｙｎリボン及び原線維の粒子全体の濃度は、α−Ｓｙｎリボン及び原線維の場合、それぞれ２０μＭ／約８００＝約０．０２μＭ、２０μＭ／約７，０００＝約０．００３μＭである。
ｃ．さまざまなα−Ｓｙｎ原線維及びリボンに対するエンドボディの親和性の評価
本明細書に開示されるα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトにより生成された抗体の親和性は、抗体を参照として用いるフィルタートラップアッセイを使用して、別個のα−Ｓｙｎアセンブリについて評価された。α−Ｓｙｎアセンブリ（原線維、リボン、原線維６５、原線維９１、原線維１１０、原線維アセンブリ経路α−Ｓｙｎオリゴマー（Ｏ５５０）、ドーパミン安定化（ＯＤＡ）及びグルタルアルデヒド安定化（ＯＧＡ）オリゴマー）は、Bousset L. et al., 2013 Nat Commun 4:2575; Makky A. et al., 2016 Sci Rep 6:37970; 及びPieri L. et al, 2016 Sci. Rep 6:24526に記載されている。対照の単量体α−Ｓｙｎも使用された。
スロットブロットろ過装置を使用して、ニトロセルロースフィルター上に、２０ｐｇ〜２００ｎｇの範囲で増加する量の線維性、オリゴマー、または単量体α−Ｓｙｎをスポットした。次いで、フィルターを脱脂乳でブロッキングし、指定の希釈度での、ＰＲＸ００２またはＳｙｎ１抗体、または本開示の試験ＧＰ抗体とともにインキュベートした。徹底的な洗浄後、２次抗ヒトまたは抗モルモットＩｇＧ−ＨＲＰを使用して、一次抗体結合プロファイルを検出した。二次抗体のみの対照も試験された。Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＣＬ（Ｐｉｅｒｃｅ＃３４０９６）をブロットに使用し、次いでブロットをＢｉｏＲａｄイメージャー（Ｃｈｅｍｉｄｏｃ ＭＰイメージングシステム／ＢｉｏＲａｄ ｉｍａｇｅｌａｂソフトウェア）でイメージングした。露出時間とダイナミックレンジは、図１６Ａ〜図１６Ｈに示されている。この一連の測定では、ＤＬＢ症例のヒト脳ホモジネートが膜にスポットされた。
ｄ．結果
免疫化したＧＰからのモルモット（ＧＰ）抗体ＰＤ−０２１５１４（α−Ｓｙｎ８５−１４０、ｗｐｉ ０８）、ＰＤ−０２１５２２（α−Ｓｙｎ８５−１４０、ｗｐｉ １３）、ＰＤ−１００８０６（α−Ｓｙｎ１２６−１３５、ｗｐｉ ０９）、ＰＲＸ００２及び市販の抗体Ｓｙｎ１（クローン４２）の親和性を、フィルタートラップアッセイを使用して、異なるα−Ｓｙｎアセンブリについて比較した。使用されたα−Ｓｙｎアセンブリには、対照単量体α−Ｓｙｎとともに、原線維、リボン、原線維６５、原線維９１、原線維１１０、原線維アセンブリ経路α−Ｓｙｎオリゴマー上（Ｏ５５０）、ドーパミン安定化（ＯＤＡ）、及びグルタルアルデヒド安定化（ＯＧＡ）オリゴマーが含まれる。
図１６Ａ〜図１６Ｈは、単量体α−Ｓｙｎと比較した場合、参照抗体ＰＲＸ００２が、繊維性α−Ｓｙｎに対してわずかに良好な親和性で認識し、一方、両方とも本開示のα−Ｓｙｎ１２６−１３５ペプチドコンストラクトに対するＰＤ−１００８０６及びＰＤ−０２１５１４は、単量体α−Ｓｙｎと比較して線維性α−Ｓｙｎに対してはるかに高い親和性を有し、両方が線維性α−Ｓｙｎへの優先的結合を有することを示す。オリゴマー及び線維性α−Ｓｙｎに対するＰＲＸ００２の親和性は類似していることが見出された。Ｓｙｎ１モノクローナル抗体は、繊維性α−Ｓｙｎならびにオリゴマー及び単量体α−Ｓｙｎに結合したが、それほど差別化された選好性はなかった。
実施例１７
パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、及びレビー小体型認知症（ＤＬＢ）を患う患者の脳切片にα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト由来の抗体の免疫組織化学的研究
本発明の代表的なα−Ｓｙｎ１２６−１３５ペプチド免疫原コンストラクトによるモルモットの免疫から得られた抗体は、免疫化学的研究で使用され、α−シヌクレイノパチー患者の脳切片に存在するα−Ｓｙｎに結合する能力を特徴付けた。この研究は、Ｒｏｘａｎａ Ｃａｒａｒｅ教授と共同で実施された。ＰＤ、ＬＢＤ、及びＭＳＡ患者から得られた脳切片に存在するα−Ｓｙｎに結合する抗体の能力を評価した。健康な組織は、陰性対照として研究に含まれていた。ＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮは、α−シヌクレイノパチーの死後診断に使用される市販のモノクローナル抗体であり、陽性対照として含まれていた。この調査は、ヒトＰＤ、ＬＢＤ、及びＭＳＡ患者の脳の組織切片上のα−Ｓｙｎ１２６−１３５ペプチド免疫原コンストラクトに対する抗体の陽性免疫反応性の証拠を提供する。結合は、シヌクレオパチー患者の脳で特に見られたが、非患者の脳では見られず、市販の診断抗体よりも試験抗体の方が、結合が顕著であった。
方法及び材料
ａ．使用する試薬とその供給者の説明
代表的なα−Ｓｙｎ１２６−１３５ペプチド免疫原コンストラクトによるモルモットの免疫から得られた抗体を１：１００希釈で使用した。ＰＤ０６２２２０−０９−１−２−Ｓｙｎ；ＰＤ０６２２０５−０９−１−２−Ｓｙｎ；ＰＤ１００８０６−０９−１−２−ＳｙｎはＵｎｉｔｅｄ ＮｅｕｒｏＳｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＳ）によって提供され、ＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮ（１：１００希釈で使用されるマウスモノクローナル抗体）はＬｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより提供され、ＨｕＤ（Ｅ−Ｉ）（１：１００希釈でのマウスモノクローナル抗体）はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより提供され、Ｏｌｉｇ２（１：１００希釈でのウサギ抗体）はＭｉｌｌｉｐｏｒｅにより提供され、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ５９４（１：２００希釈でのヤギ抗モルモット）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８（１：２００希釈でのヤギ抗マウス）ならびにＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８（１：２００希釈でのヤギ−ウサギ）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより提供された。
ｂ．ヒト脳組織
この研究では、μｍ厚さの切片をＵＣＬ脳バンクから入手した。すべての試料は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ承認の手続きに従って収集及び準備された。
組織は、多系統萎縮症（ＭＳＡ；ｎ＝３）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ；ｎ＝３）、及びパーキンソン病（ＰＤ；ｎ＝３）を含む原発性α−Ｓｙｎ病態の対象（表１５）から得られた。対象は公表された基準＊＊に従って死後診断された。
ｃ．シヌクレイノパチーのヒト対象の免疫組織化学
Ｕｎｉｔｅｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＳ）が製造した３つの抗体のα−Ｓｙｎ凝集体に対する特異性を定量的に比較するために、３つの異なるシヌクレイノパチー（ＭＳＡ、ＤＬＢ、及びＰＤ）のヒト対象の免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施した。α−Ｓｙｎ凝集体に対するＵＮＳ抗体（ＰＤ０６２２２０、ＰＤ０６２２０５、及びＰＤ１００８０６）の特異性を、市販の診断抗体（ＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮ）の特異性と比較した。抗体の特異性は、各患者の対象と疾患の種類の次の４つの脳領域で分析された。（１）被殻、内包、及び島皮質；（２）中脳：黒質；（３）側頭皮質：皮質灰色物質；（４）小脳：皮質下白質；小脳白質。
これらの脳領域は、さまざまな程度で、各疾患タイプの疾患進行のさまざまな段階でα−Ｓｙｎ凝集の影響を受けることが知られている。一般に、大脳基底核及び中脳は、ＤＬＢ、ＰＤ、及びＭＳＡの初期段階で影響を受け、また凝集体の総負荷が最も高い。側頭皮質及び小脳は疾患の後期に影響を受け、ＰＤ及びＤＬＢには小脳凝集体がほとんど存在しない。二次抗体の非特異的結合が存在しないことを確認するために、各ＩＨＣプロトコールと一緒に陰性対照（一次抗体を使用しない）を実行した。パラフィン包埋スライドを６０℃のオーブンで１５〜２０分間脱ろうし、次いでキシレンＩ及びＩＩにそれぞれ５分間浸漬した。組織を、それぞれ５分間、１００％〜５０％のＩＭＳの４希釈で再水和した。組織を１×ＰＢＳで５分間３回洗浄し、その後、抗原回復のために１００％ギ酸で３分間インキュベートした。内因性ペルオキシダーゼ活性を３％Ｈ２Ｏ２で１０分間クエンチする前に、組織を１×ＰＢＳで徹底的に洗浄した。組織を冷却し、１×ＰＢＳでさらに３回（各５分）洗浄した後、クエン酸緩衝液（１５ｍＭクエン酸トリスナトリウム、ＴＷＥＥＮ、ｐＨ６）で、２５分間中温で電子レンジにかけ、実行ごとに同等の電子レンジを確保するために、３つの容器中の３ラックのスライドを、毎回含めた。スライドを冷却し、１×ＰＢＳで３回（５分）洗浄した後に、非特異的結合部位を１５％正常ヤギ血清でブロッキングした。組織を一次抗体（０．１％ＴＢＳ／ｔ中１：１００）で、４℃で一晩インキュベートした。組織を１×ＰＢＳで３×５分間洗浄し、ビオチン化二次抗体中で１時間（ＲＴ）インキュベートした。ＡＢＣ溶液は、その適用の３０分前に調製された。組織を３×５分、ｌ×ＰＢＳで洗浄した後、ＡＢＣで、室温で１時間インキュベートした。ＶＩＰペルオキシダーゼ基質は、製造元の説明書に詳述されているように、ＩｍｍＰＡＣＴＶＩＰペルオキシダーゼキットを使用して調製した。ＶＩＰペルオキシダーゼ基質をＲＴで７分間添加し、ｄＨ２Ｏで洗浄した。ＤＰＸにマウントする前に、ＩＭＳ５０％、７０％、９５％、１００％、１００％ならびにキシレンＩ及びＩＩをそれぞれ２分間で、組織を脱水した。二重免疫蛍光染色では、一次抗体を適用する前に組織を３％Ｈ２Ｏ２でクエンチしなかった。最初の一次抗体及び同等の二次抗体を適用した後、組織を１５％正常ヤギ血清で３０分間ブロッキングし、前述のように第２の一次抗体及び二次抗体とともにインキュベートした。蛍光標識二次抗体の最終適用後、組織を１％Ｓｕｄａｎ Ｂｌａｃｋで５分間インキュベートして自己蛍光をクエンチし、０．１％ＴＢＳ／Ｔで洗浄し、すぐにｍｏｗｉｏｌ ｃｉｔｕｆｌｏｕｒにマウントした。蛍光染色された組織は、画像化されるまで４℃で保存された。
ｄ．画像分析と統計
ＯｌｙｍｐｕｓＶＳ１１０高スループットＶｉｒｔｕａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＳｙｓｔｅｍまたはＯｌｙｍｐｕｓ ｄｏｔ Ｓｌｉｄｅ Ｖｉｒｔｕａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、２０倍対物レンズでの分析のためにスライドをスキャンした。各対象の各領域の同等エリアからＯｌｙｍｐｕｓ ＶＳソフトウェアを使用して、スキャンした画像から３０枚の画像（各５００μｍ２）をキャプチャした（図１７Ａ〜図１７Ｄ、図１８Ａ〜図１８Ｄ、図１９Ａ〜図１９Ｃ、図２０Ａ〜図２０Ｅ、図２１Ａ〜図２１Ｆ、図２２Ａ〜図２２Ｃ、図２４Ａ〜図２４Ｄ、及び図２５Ａ〜図２５Ｄを参照されたい）。これにより、各脳領域の総面積７．５ｍｍ２の分析が可能になった。ＩｍａｇｅＪバージョンＦｉｊｉ ｗｉｎｄｏｗｓ−６４ソフトウェアは、各画像のα−Ｓｙｎ免疫反応性の定量分析に使用された。
各抗体によって検出されたα−Ｓｙｎの総量の分析のために、免疫反応性は画像の総面積のパーセンテージとして報告された。α−Ｓｙｎ陽性免疫反応性の選択に適用される閾値は、結果に影響を与える可能性のあるバックグラウンド染色の差異を説明するために、分析された各脳領域に対して調整された。α−Ｓｙｎ陽性凝集体によって包含される平均パーセンテージ面積は、分析された各抗体及び脳領域について計算された。
ＬＢまたはＬＮに対する各抗体の相対的特異性の分析のために、Ｆｉｊｉソフトウェアを使用して、サイズと真円度のパラメーターに基づいてＬＢの免疫反応性を定量化し、ＬＮと区別した（図２４Ａ〜図２４Ｄ、図２５Ａ〜図２５Ｄ、及び図２６Ａ〜図２６Ｂを参照されたい）。偽陽性を回避するために、ＬＢ及びＬＮの異なる形態を持つ脳領域がこの分析のために選択され、大脳基底核の島皮質及び側頭皮質の皮質灰白質が含まれていた。ＬＢ免疫反応性は、総α−Ｓｙｎ免疫反応性のパーセンテージとして表された。
統計学的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ７．０１ソフトウェアを使用して実施され、平均値＋ＳＤとして報告される（特に指定のない限り）。結果は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析され、その後、該当する場合は、ダネット補正による事後分析が続いた。ｐ＜０．０５（＊）の場合、差は有意とみなされた。数字（ｎ）は、各実験に使用された対象の数を指す。
ニューロンまたはグリア内のα−Ｓｙｎの位置の定性分析は、上述のように二重免疫蛍光染色によって達成された。Ｌｅｉｃａ ＳＰ８レーザー走査共焦点顕微鏡でスライドを観察した。最大投影オーバーレイ画像は、４０倍対物レンズで連続して取得された。これらの画像は、相対的な位置を示すためにオーバーレイされた両方のカラーチャネルと一緒に積み重ねられた一連のｚスライド画像で構成されていた。
ｅ．α−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体は、ＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮと比較して異なるパターンのα−Ｓｙｎ凝集体を検出した
α−Ｓｙｎ凝集体の細胞型と細胞内局在は、異なるシヌクレイノパチーの間で異なる。ＭＳＡはグリア細胞質内封入体（ＧＣＩ）によって特徴付けられるが、ＤＬＢ及びＰＤでは、ニューロン細胞体（ＬＢ）及び軸索突起（ＬＮ）内でα−Ｓｙｎ凝集が発生する。染色された面積のパーセンテージの分析により、各抗体によって検出された総α−Ｓｙｎ凝集体の定量化が可能になった。しかしながら、これは、検出された凝集体のタイプまたは細胞内位置の相違を考慮しなかった。ＰＤ及びＤＬＢの場合の細胞体及び神経突起内のα−Ｓｙｎ凝集体の明確に異なるパターンにより、これらの異なるタイプのα−Ｓｙｎ凝集体に対する本開示のＵＮＳ抗体の相対的感度を定量化することができた。
これを調べるために、ＤＬＢ及びＰＤの場合の各抗体について、細胞体内で検出された凝集体の割合を推定した。ＦＩＪＩソフトウェアを使用して、細胞体内の凝集体は、それらのサイズと真円度に基づいて選択された。次いで、細胞体凝集体の平均パーセンテージ面積を、検出された総α−Ｓｙｎの割合として計算し、結果を図２４Ａ〜図２４Ｄ及び２５Ａ〜図２５Ｄに示す。総α−Ｓｙｎ及び細胞体α−Ｓｙｎの面積のパーセンテージの差異は、組織の定性分析に基づいたα−Ｓｙｎの軸索凝集体（ＬＮ）に起因した。細胞体α−Ｓｙｎ検出の割合が減少すると、ＬＮ検出の増加をもたらす。この分析は、側頭皮質と島皮質の灰白質で行われたが、これは、これらの領域がＬＢ及びＬＮのような病態の両方を示したためである。ＬＮは非常にまばらであり、被殻と被膜全体に不均一に広がっていたため、この分析では大脳基底核のこれらの領域は選択しなかった。同様の相関が中脳の黒質で観察され（図２６Ａ及び図２６Ｂ）、本開示のＵＮＳ抗体はＤＬＢ及びＰＤのＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮと比較してより高いレベルのＬＮを検出した。しかしながら、ＬＮとＬＢの複雑な形態により、同じ方法でこれらを確実に区別して定量化することはできなかった。
図２４Ａ〜図２４Ｄの結果は、各抗体によって検出された総α−Ｓｙｎのうち、細胞体内で検出された凝集体の割合がＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮと比較してＵＮＳ抗体で減少したことを示す。これは、細胞体の封入体のＬＮに対する比率が減少し、ＬＮのより高い割合がＵＮＳ抗体によって検出されたことを意味する。ＵＮＳ抗体のうち、ＰＤ０６２２０５は、島皮質におけるＬＮの高い割合の検出においてＤＬＢとＰＤの間で一貫していた（図１７Ａ〜図１７Ｄ及び１８Ａ〜図１８Ｄ）。対照的に、すべてのα−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体は、ＤＬＢ及びＰＤ症例の側頭皮質灰白質におけるＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮと比較して、より高い割合の細胞体凝集体を検出した（図２５Ａ〜図２５Ｂ）。
ｆ．α−Ｓｙｎの凝集は細胞型特異的である
α−Ｓｙｎ含有凝集体は、ＭＳＡ、ＤＬＢ、及びＰＤを含むシヌクレイノパチーの特徴的な病原性の特徴である。α−Ｓｙｎ凝集はシヌクレイノパチーの主な原因タンパク質であるが、凝集のパターンと凝集形成を起こしやすい細胞型は特定の疾患サブタイプ間で異なる。ＭＳＡ、ＤＬＢ、及びＰＤの臨床的特徴は、ＤＬＢとＰＤの両方における細胞体及びニューロンの浅海神経突起内へのα−Ｓｙｎの蓄積を説明するが、ＭＳＡでは主にグリア細胞及び希突起膠細胞内に見出される。
細胞特異的なα−Ｓｙｎ凝集体に対するα−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体の選択性を確立するために、ＰＤ０６２２０５とニューロン（ＨｕＤ）または希突起膠細胞（Ｏｌｉｇ２）のいずれかのマーカーを使用して二重免疫蛍光法を実施した。
図２７Ａ〜図２７Ｃの結果は、ＰＤ０６２２０５によって検出されたα−Ｓｙｎが、ＭＳＡではなく、ＰＤ及びＤＬＢの大脳基底核及び中脳（高病態領域）の神経細胞体内に共局在することを示す。希突起膠細胞のマーカー（Ｏｌｉｇ２）を使用すると、図２８Ａ〜図２８Ｃは、ＰＤまたはＤＬではなくＭＳＡでα−Ｓｙｎがグリア細胞内で凝集することを示す。これらの結果は、α−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体がこれらのシヌクレイノパチーの臨床的特徴と一致し、α−Ｓｙｎの病的凝集体に対するこれらの抗体の特異性を確認していることを示す。
結果
ａ．免疫療法用の代表的なα−Ｓｙｎ１２６−１３５ペプチド免疫原コンストラクトを用いたモルモットの免疫に由来する抗体の定量分析
免疫療法のための新規抗α−Ｓｙｎ抗体の使用を調査するために、α−Ｓｙｎに対する各抗体の関連特異性の定量分析を３つのシヌクレイノパチー（ＭＳＡ、ＤＬＢ、及びＰＤ）のヒトの症例における免疫組織化学（ＩＨＣ）によって実施した。
ｂ．代表的なα−Ｓｙｎ１２６−１３５ペプチド免疫原コンストラクトによるモルモットの免疫に由来する抗体は、α−Ｓｙｎ凝集体への結合において、市販の診断抗体よりも感度が高い
開示されるα−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体の相対的抗原性を調べるために、各抗体で検出されたα−Ｓｙｎ負荷を、シヌクレイノパチーの市販の診断抗体（ＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮ）と比較した。最初に図１７Ａ〜図Ｄから図２２Ａ〜図２２Ｃに示された結果の全体的なパターンを調べることにより、ＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮと比較して、α−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体によって検出されたα−Ｓｙｎの平均パーセンテージ面積における顕著な増加があることを見出すことができる。この傾向は、各脳領域及び疾患タイプ全体で一貫しており、開示されるα−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体は、ＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮよりも凝集したα−Ｓｙｎへの結合においてより高感度または選択的であることを示唆している。この研究では、試料サイズは比較的小さかった（ｎ＝３）が、データには明確な傾向がなおも見られる。α−Ｓｙｎに対する開示されるα−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体の特異性は、非罹患対照患者の脳の同じ脳領域で確認された。図２３Ａ〜図２３Ｂに示すこれらの結果は、ＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮを含む各抗体による免疫陽性染色がまったくないことを示している。これらのデータは、開示されるα−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体がα−Ｓｙｎの病的形態に特異的であることを示している。
ｃ．α−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体を使用して検出されたより高いレベルのα−Ｓｙｎは、市販の抗体と比較した場合の感度と特異性の向上を示している
本開示のα−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体は、ＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮと比較してより多くのα−Ｓｙｎを検出し、これは、開示される抗体がこれらのα−Ｓｙｎ凝集体のクリアランスを促進する免疫療法での使用により好ましいことを示す。
免疫療法試薬として使用するための適切な抗体を選択する第１のステップは、一次α−Ｓｙｎ病変を有するヒト脳組織における標的抗原（α−Ｓｙｎ）に対する抗体の選択性を確立することである。異なるシヌクレイノパチーは、α−Ｓｙｎ凝集のメカニズム及び神経解剖学的パターン、ならびに凝集に対する特定の細胞型の脆弱性が異なる。
一般的なシヌクレイノパチーの免疫療法としての試薬の使用を調査するために、異なる神経病理学を有する異なるシヌクレイノパチーにおけるα−Ｓｙｎに対するα−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体の選択性を評価することが重要である。ＰＤ、ＤＬＢ、及びＭＳＡの臨床的に確認された症例がこの目的のために選択された。ＰＤ及びＤＬＢは認知症の２番目に一般的な形態であり、主にニューロン（ＬＢ及びＬＮ）内のα−Ｓｙｎの蓄積によって引き起こされる。ＰＤとは対照的に、アミロイドベータとｔａｕの病理は、ＤＬＢ２の神経変性に寄与することが知られている。α−Ｓｙｎ凝集の異なるパターンがＭＳＡで見られ、凝集体はニューロンではなくグリア細胞内で主に形成される（図２７Ａ〜図２７Ｃ及び図２８Ａ〜図２８Ｂ）。さらに、α−Ｓｙｎ病理の進行は疾患タイプ間で異なり、中脳及び大脳基底核は初期病理の一般的な領域である。疾患のさまざまな段階で影響を受ける脳領域の各抗体の抗原性を調べることで、疾患の初期段階の治療にどの抗体がより効果的であるかについての洞察が得られる。
ｄ．α−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体（ＰＤ０６２２２０、ＰＤ０６２２０５、及びＰＤ１００８０６）は、ＰＤ、ＤＬＢ、及びＭＳＡのヒト脳組織におけるα−Ｓｙｎの病的凝集体に特異的に結合することができ（図１７Ａ〜図Ｄから図２２Ａ〜図２２Ｃまで）、健康な対照におけるシヌクレインの病態をまったく検出しない（図２３Ａ〜図２３Ｂ）。
開示されるα−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体によるα−Ｓｙｎの検出は、臨床神経病理学に記載されているのと同じ細胞型特異性で達成された（図２７Ａ〜図２７Ｂ及び図２８Ａ〜図２８Ｂ）。重要なことに、開示されるα−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体は、すべての形態のヒトα−Ｓｙｎに対して同等の抗原性を示さなかった。
ＰＤ０６２２０５及びＰＤ１００８０６の特異性は、大脳基底核でＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮよりも大きな割合のＬＮを検出する各抗体の能力でさらに検証された（図２４Ａ〜図２４Ｄ）。これは、中脳でも視覚的に観察された（図２６Ａ〜図２６Ｂ）。まとめると、ＰＤ０６２２０５及びＰＤ１００８０６によって検出されるα−Ｓｙｎのパーセンテージ面積が高いことから、これらの結果は、開示されるα−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体によって検出される追加のα−Ｓｙｎが、これらの抗体のＬＮに対する特異性の増加に部分的に起因し得ることを示している。疾患の初期段階では、ＬＮが大脳基底核におけるα−Ｓｙｎ凝集の主要な形態であるため、これらの結果は免疫療法に有益である。前臨床開発中のシヌクレイノパチーを治療するための他の試薬は、ＬＮのＩＨＣ検出を提供しない。したがって、開示されるペプチド免疫原コンストラクト及びペプチド免疫原コンストラクトから生成されたα−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体は、他の市販製品と比較して独特の特性と特徴を有している。
本研究では、罹患した脳領域のα−Ｓｙｎ凝集体の平均量を測定することにより、開示されるペプチド免疫原コンストラクトによって誘発されたα−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体の感度を、ＩＨＣを使用して分析した。脳試料中のα−Ｓｙｎの平均パーセンテージ面積を定量化した本研究は、開示されるα−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体が、市販の抗体と比較して、ＭＳＡ、ＤＬＢ、及びＰＤの疾患進行の早期にα−Ｓｙｎ検出に非常に高感度であることを実証している。
この研究で見出されたより高い感度は、診断抗体であるＮＣＬ−Ｌ−ＡＳＹＮよりも、開示される抗体のＬＮに対する特異性が高いことに起因する。これらの結果は、開示されるα−Ｓｙｎ１２６−１３５抗体は、シヌクレイノパチーにおけるα−Ｓｙｎ凝集体の抗体補助クリアランスの調査のための最も効果的な候補である可能性が高いことを示唆している。
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Claims (25)

  1. アルファ−シヌクレイン（α−Ｓｙｎ）ペプチド免疫原コンストラクトであって、
    配列番号１のアミノ酸Ｇ１１１近辺からアミノ酸Ｄ１３５近辺までに対応するα−ＳｙｎのＣ末端フラグメントからの約１０から約２５アミノ酸残基を含む、Ｂ細胞エピトープと；
    配列番号７０〜９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴヘルパーエピトープと；
    アミノ酸Ｌｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、及びε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１４８）からなる群から選択される必要に応じた異種スペーサーと、を含み、
    前記Ｂ細胞エピトープが、前記Ｔヘルパー細胞エピトープに直接または前記必要に応じた異種スペーサーを介して共有結合している、前記α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
  2. 前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号１２〜１５、１７、及び４９〜６３からなる群から選択される、請求項１に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
  3. 前記Ｔヘルパーエピトープが、配列番号８１、８３、及び８４からなる群から選択される、請求項１に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
  4. 前記必要に応じた異種スペーサーが、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓまたはε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１４８）である、請求項１に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
  5. 前記Ｔヘルパーエピトープが、前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端に共有結合している、請求項１に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
  6. 前記Ｔヘルパーエピトープが、前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端に前記必要に応じた異種スペーサーを介して共有結合している、請求項１に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
  7. 以下の式：
    （Ｔｈ）ｍ−（Ａ）ｎ−（α−ＳｙｎのＣ末端フラグメント）−Ｘ
    または
    （α−ＳｙｎのＣ末端フラグメント）−（Ａ）ｎ−（Ｔｈ）ｍ−Ｘ
    を含み、
    式中、
    Ｔｈは前記Ｔヘルパーエピトープであり、
    Ａは前記異種スペーサーであり、
    （α−ＳｙｎのＣ末端フラグメント）は、前記Ｂ細胞エピトープであり、
    Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨまたはα−ＣＯＮＨ２であり、
    ｍは、１から約４であり、
    ｎは１から約１０である、
    請求項１に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
  8. 配列番号１０７、１０８、１１１〜１１３、及び１１５〜１４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
  9. 配列番号１０７、１０８、及び１１１〜１１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト。
  10. 請求項１に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む、組成物。
  11. １を超える請求項１に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトを含む、組成物。
  12. 前記α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトが配列番号１１２及び１１３のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の組成物。
  13. 請求項１に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクト及び薬学的に許容される送達媒体及び／またはアジュバントを含む医薬組成物。
  14. ａ．前記α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号１０７、１０８、１１１〜１１３、及び１１５〜１４７からなる群から選択され、
    ｂ．前記アジュバントが、Ａｌ（ＯＨ）３またはＡｌＰＯ４からなる群から選択されるアルミニウムの無機塩である、
    請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. ａ．前記α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトが、配列番号１０７、１０８、１１１〜１１３、及び１１５〜１４７からなる群から選択され、
    ｂ．前記α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトがＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されて、安定化された免疫刺激複合体を形成する、
    請求項１３に記載の医薬組成物。
  16. 請求項１に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
  17. 前記α−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトに結合した、請求項１６に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
  18. 請求項９に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原コンストラクトの前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメント。
  19. 請求項１６に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む組成物。
  20. 請求項１８に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントを含む組成物。
  21. ａ．配列番号１１２のＢ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントと、
    ｂ．配列番号１１３のＢ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合フラグメントと、
    の混合物を含む、請求項２０に記載の組成物。
  22. 宿主においてα−Ｓｙｎを認識する抗体を産生する方法であって、請求項１に記載のα−Ｓｙｎペプチド免疫原と送達媒体及び／またはアジュバントとを含む組成物を前記宿主に投与することを含む、前記方法。
  23. 動物のα−Ｓｙｎ凝集を阻害する方法であって、薬理学的に有効な量の請求項１のα−Ｓｙｎペプチド免疫原を前記動物に投与することを含む、前記方法。
  24. 動物のα−Ｓｙｎ凝集体の量を低減する方法であって、薬理学的に有効な量の請求項１のα−Ｓｙｎペプチド免疫原を前記動物に投与することを含む、前記方法。
  25. 生体試料中の異なるサイズのα−Ｓｙｎ凝集体を同定する方法であって、
    ａ．生体試料を、請求項１６に記載の抗体またはそのエピトープ結合フラグメントに、前記抗体またはそのエピトープ結合フラグメントが前記α−Ｓｙｎ凝集体に結合することを可能にする条件下で曝露することと、
    ｂ．前記生体試料中の前記α−Ｓｙｎ凝集体に結合した前記抗体またはそのエピトープ結合断片の量を検出することと、
    を含む、前記方法。
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