BR112019026707A2

BR112019026707A2 - imunógenos de peptídeo da extremidade c-terminal da proteína alfa-sinucleína e formulações dos mesmos para o tratamento de sinucleinopatias

Info

Publication number: BR112019026707A2
Application number: BR112019026707-7A
Authority: BR
Inventors: Chang Yi Wang
Original assignee: United Neuroscience
Priority date: 2017-06-16
Filing date: 2018-06-15
Publication date: 2020-06-30
Also published as: EP3638298A4; JP2023082018A; SG11201912195TA; US20210138049A1; RU2020101121A; CA3067231A1; EP3638298A1; RU2020101121A3; AU2018283510A1; MX2019015286A; KR20200054938A; WO2018232369A1; JP2021508672A

Abstract

A presente invenção refere-se aos construtos de imunógeno peptídico de alfa-sinucleína (a-Syn), composições contendo os construtos, anticorpos obtidos pelos construtos e métodos para produzir e utilizar as construções e suas composições. Os construtos de imunógeno peptídico de a-Syn divulgados contêm um epítopo de células B da a-Syn ligado a um epítopo heterólogo de células T (Th) auxiliares diretamente ou através de um espaçador heterólogo opcional. A parte do epítopo de células B dos construtos de imunógeno peptídico contém cerca de 10 a cerca de 25 resíduos de aminoácidos de a-Syn, que corresponde à sequência próxima da glicina na posição 111 (G111) até próxima da asparagina na posição 135 (D135) de a-Syn de comprimento total. Os construtos de imunógeno peptídico de a-Syn estimulam a geração de anticorpos altamente específicos que são reativos cruzados com a folha beta de a-Syn como monômeros, oligômeros e fibrilas, mas não a alfa hélice natural de a-Syn, oferecendo respostas imunes terapêutica aos hospedeiros em risco de sinucleinopatias.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "IMUNÓGENOS DE PEPTÍDEO DA EXTREMIDADE C-TERMINAL DA PROTEÍNA ALFA-SINUCLEÍNA E FORMULAÇÕES DOS MESMOS PARA O TRATAMENTO DE SINUCLEINOPATIAS".

[0001] O presente pedido é um Pedido Internacional PCT que reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. No. de Série 62/521.287, depositado em 16 de junho de 2017, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

CAMPO DE INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se às construções de imunógenos de peptídeo com base na extremidade C-terminal da proteína alfa-sinucleína (a-Syn) e suas formulações para o tratamento de sinucleinopatias.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] As proteínas sinucleínas (revisadas no site da Internet: en.wikipedia.org/wiki/Synuclein) são uma família de proteínas solúveis comuns aos vertebrados que são expressas principalmente no tecido neural e em certos tumores. A família de sinucleína inclui três proteínas conhecidas: alfa-sinucleína (revisada no site da Internet: en.wikipedia.org/wiki/Alpha-synuclein), — beta-sinucleína — (site da Internet: en.wikipedia.org/wiki/Beta-synuclein) e gama-sinucleína. Todas as sinucleínas têm em comum um motivo de ligação lipídica alfa-helicoidal altamente conservada com semelhança com os domínios de ligação lipídica classe A2 das apolipoproteínas permutáveis. As funções celulares normais não foram determinadas para nenhuma das proteínas sinucleínas, embora alguns dados sugiram um papel na regulação da estabilidade da membrana e/ou movimento.

[0004] A proteína alfa-sinucleína de comprimento total (a-Syn) é uma proteína de 140 aminoácidos (No. de acesso NP 000336) e é codificada pelo gene SNCA. Pelo menos três isoformas de a-Syn são produzidas através da recomposição alternativa. A principal forma é a proteína de comprimento total. Outras isoformas são a-Syn-126, que carece de resíduos 41-54 devido à perda do éxon 3; e a-Syn-112, que carece dos resíduos 103-130 devido à perda do éxon 5.

[0005] A estrutura primária de a-Syn é geralmente dividida em três domínios distintos: (1) resíduos 1-60: uma região N-terminal anfipática dominada por quatro repetições de 11 resíduos incluindo a sequência de consenso KTKEGV que possui uma propensão estrutural à hélice alfa semelhante aos domínios de ligação de apolipoproteínas; (2) resíduos 61-95: uma região hidrofóbica central que inclui a região do componente não amiloide-B (NAC) que está envolvida na agregação de proteína; e (3) resíduos 96-140: uma região altamente ácida e rica em prolina que não possui nenhuma propensão estrutural distinta. O fragmento de a-Syn de 35 aminoácidos da região do NAC foi descoberto de estar presente com AB em uma fração enriquecida por amiloide. O NAC foi mais tarde mostrado ser um fragmento de sua proteína precursora, o NACP, mais tarde determinado de ser o homólogo humano de comprimento total da sinucleína do raio elétrico Pacific (Torpedo californica), agora referido como a-Syn humana.

[0006] O uso da espectrometria de massa de mobilidade iônica de alta resolução (IMS-MS) na a-Syn purificada por HPLC in vitro mostrou que a a-Syn é autoproteolítiao, gerando uma variedade de pequenos fragmentos de peso molecular após a incubação. A proteína de comprimento total de 14,46 kDa foi observada de gerar numerosos fragmentos = menores, incluindo um fragmento de 12,16 kDa (aminoácidos 14-133) e um fragmento de 10,44 kDa (aminoácidos 40- 140) formados por truncamentos C- e N-terminais, assim como um fragmento de 7,27 kDa (aminoácidos 72-140). O fragmento de 7,27 kDa, que contém a maioria da região do NAC, demonstrou agregar consideravelmente mais rápido que a a-Syn de comprimento total. É possível que esses produtos autoproteolíticos desempenhem um papel como intermediários ou cofatores na agregação de a-Syn.

[0007] A a-Syn é abundante no cérebro humano que constitui até 1% de todas as proteínas no citosol do cérebro e nas células da glia. À a-Syn é amplamente expressa no neocórtex, hipocampo, giro dentado, bulbo olfativo, estriado, tálamo e cerebelo. Também é altamente expressa em células hematopoiéticas, incluindo células B, T e NK, assim como monócitos e plaquetas. Quantidades menores de a-Syn são encontradas no coração, músculos e outros tecidos. No cérebro, a a-Syn é encontrada principalmente nas pontas das células nervosas (neurônios) em estruturas especializadas chamadas terminais pré- sinápticos. Dentro dessas estruturas, a ao-Syn interage com fosfolipídios e proteínas. Os terminais pré-sinápticos liberam mensageiros químicos, chamados neurotransmissores, tais como a dopamina, de compartimentos conhecidos como vesículas sinápticas. A liberação de neurotransmissores restabelece sinais entre os neurônios e é crítica para a função normal do cérebro, incluindo a cognição.

[0008] A aSyn em solução é considerada uma proteína intrinsecamente desordenada, pois carece de uma única estrutura 3D estável. Foi demonstrado que a a-Syn interage significativamente com a tubulina, e que a a-Syn pode ter atividade como uma proteína potencial associada ao microtúbulo, semelhante a tau. A a-Syn foi classicamente considerada de ser uma proteína solúvel não estruturada, a a-Syn não submetida à mutação forma um tetrâmero dobrado de maneira estável que resiste à agregação. No entanto, a a- Syn pode se agregar para formar fibrilas insolúveis em condições patológicas caracterizadas pelos corpos de Lewy. Esses distúrbios são conhecidos como sinucleinopatias (revisados no site da Internet:

en.wikipedia.org/wiki/Synucleinopathies).

[0009] As sinucleinopatias são um grupo diversificado de distúrbios neurodegenerativos que compartilham uma característica patológica comum: em exames neuropatológicos, lesões características contendo agregados anormais de a-Syn insolúvel estão presentes nas populações seletivamente vulneráveis de neurônios e células da glia. As sinucleinopatias mais comuns incluem distúrbios do corpo de Lewy (LBDs) como a doença de Parkinson (PD), doença de Parkinson com demência (PDD) e demência com corpos de Lewy (DLB), assim como atrofia de múltiplos sistemas (MSA) ou neurodegeneração com acúmulo de ferro cerebral tipo | (NBIA Tipo |). As opções de tratamento atuais para essas doenças incluem medicamentos sintomáticos tais como L-dopa, fármacos anticolinérgicos assim como inibidores da monoamina oxidase. No entanto, todas as oportunidades atuais de tratamento apenas levam ao alívio sintomático, mas não induzem um efeito duradouro de modificação da doença nos pacientes.

[0010] Os LBDs são distúrbios neurodegenerativos progressivos caracterizados por tremor, rigidez, bradicinesia e perda de neurônios dopaminérgicos no cérebro. No caso de DLB e PDD, os sinais também incluem comprometimento cognitivo. Até 2% da população acima de 60 anos de idade nos países ocidentais desenvolvem os sinais típicos de PD/LBD. Parece que a suscetibilidade genética e fatores ambientais estão envolvidos no desenvolvimento da doença. Os pacientes que sofrem desta doença desenvolvem inclusões intracelulares características, chamadas corpos de Lewy (LBs), nas áreas corticais e subcorticais do cérebro, especialmente para regiões com alto conteúdo de neurônios dopaminérgicos ou projeções neuronais. No LBD, a a-Syn se acumula nos LBs em todas as áreas afetadas do cérebro. Adicionalmente, pode ser demonstrado que mutações de ponto único, assim como duplicações ou multiplicações no gene de a-Syn, estão associadas com as formas familiares raras de parkinsonismo.

[0011] A atrofia de múltiplos sistemas (MSA) é um distúrbio neurodegenerativo esporádico, que é caracterizado por sintomas de parkinsonismo resistente a L-DOPA, ataxia cerebelar e disautonomia. Os pacientes que sofrem de perda neuronal multissistêmica seriam afetados em várias áreas do cérebro, incluindo estriado, substância negra, cerebelo, ponte, assim como corpos olivares inferiores e medula espinhal. A MSA é caracterizada por inclusões citoplasmáticas gliais a-Syn-positivas (GCI) e neuronais raras em todo o sistema nervoso central.

[0012] Outros distúrbios raros, tais como várias distrofias neuroaxonais, também possuem patologias de a-Syn, onde a a-Syn é o componente estrutural primário das fibrilas do corpo de Lewy. Ocasionalmente, os corpos de Lewy contêm proteína tau; no entanto, a a-Syn e tau constituem dois subconjuntos distintos de filamentos nos mesmos corpos de inclusão. A patologia de a-Syn também é encontrada em casos tanto esporádicos quanto familiares com a doença de Alzheimer.

[0013] O mecanismo de agregação de a-Syn não é claro. A a-Syn monomérica é desdobrada nativamente em solução, mas também pode se ligar às membranas em uma forma a-helicoidal. O monômero desdobrado pode se agregar primeiro em pequenas espécies oligoméricas que podem ser estabilizadas através de interações do tipo folha B e depois em fibrilas insolúveis de peso molecular mais elevado. A a-Syn existe como uma mistura de conformadores não estruturados, alfa-hélice e ricos em beta-lâminas em equilíbrio. Mutações ou condições de tampão conhecidas por melhorar a agregação aumentam fortemente a população do conformador beta, sugerindo assim que isso possa ser uma conformação relacionada à agregação patogênica. Há evidências de um intermediário estruturado rico em estrutura beta que pode ser o precursor da agregação e, em última análise, os corpos de Lewy.

[0014] Vários fatores fisiológicos podem modificar a a-Syn, levando à sua formação de agregados, incluindo (1) fosforilação por uma ou mais cinases, (2) truncamento através da protease tal como calpaínas; e (3) nitração através de óxido nítrico (NO) ou outras espécies reativas de nitrogênio que estão presentes durante a inflamação. O transporte de ER-Golgi, vesículas sinápticas, mitocôndrias, lisossomos e outros mecanismos proteolíticos são alguns dos alvos celulares propostos para a toxicidade mediada por a-Syn devido a essa agregação.

[0015] Entre as estratégias para o tratamento de sinucleinopatias estão os compostos que inibem a agregação de a-Syn. Foi demonstrado que a cuminaldeído de pequena molécula inibe a fibrilação da a-Syn. Além das terapias de pequenas moléculas, um relatório recente sugere que os agregados de a-Syn podem ser direcionados por imunoterapia (revisado por Lee JS e Lee S-J, 2016). No entanto, este relatório salienta várias possíveis consequências ou problemas que existem com o desenvolvimento de uma imunoterapia de a-Syn, incluindo (1) interferência potencial com a função fisiológica normal da a-Syn; (2) dificuldades na liberação de um medicamento de anticorpo no parênquima cerebral; e (3) eficácia da imunoterapia.

[0016] Até esta data, ainda existe uma necessidade não atendida de desenvolver imunógenos peptídicos direcionados ao sítio e suas formulações para um tratamento econômico de pacientes que sofrem de sinucleinopatias. Referências:

1. —"Alpha-synuclein;" Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address: en.wikipedia.org/w/index.php?title=Alpha- synuclein&oldid=781366541 (accessed May 30, 2017).

2. "Synucleinopathies," Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address: en.wikipedia.org/w/index.php?title=Synucleinopathies&oldid=68628711 6 (accessed May 30, 2017).

3. —"Beta-synuclein'" Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address: en.wikipedia.org/w/index.php?title=Beta- synuclein&oldid=763171134 (accessed May 30, 2017).

4. “"“Synucleinopathies," Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address: en.wikipedia.org/w/index.php?title=Synucleinopathies&oldid=68628711 6 (accessed May 30, 2017).

5. LEE, JS, et al “Mechanism of Antica-Synuclein Immunotherapy”, J Mov Disord.; 9(1):14-19 (2016)

6. TRAGGIAI, E, et al. “An efficient method to make human monoclonal antibodies from memory B cells: potent neutralization of SARS coronavirus”, Nat Med.; 10(8):871-875 (2004) WANG, C,, et al. “Versatile Structures of a-Synuclein”, Front Mol Neurosci. 9:48 (2016)

SUMARIO DA INVENÇÃO

[0017] A presente invenção é direcionada aos construtos de imunógeno peptídico da proteína alfa-sinucleína (a-Syn). A presente invenção também é direcionada às composições que contêm os construtos de imunógeno peptídico, métodos para fabricar e utilizar os construtos de imunógeno peptídico e anticorpos produzidos pelas construtos de imunógeno peptídico.

[0018] Os construtos de imunógeno peptídico divulgados contêm um epítopo de célula B de a-Syn ligada a um epítopo heterólogo de célula T auxiliar (Th) diretamente ou através de um espaçador heterólogo opcional. A parte do epítopo de célula B dos construtos de imunógeno peptídico contém cerca de 10 a cerca de 25 resíduos de aminoácidos da região C-terminal da a-Syn, que corresponde à sequência próxima da glicina na posição de aminoácido 111 (G111) até próxima da asparagina na posição de aminoácido 135 (D135) da a- Syn de comprimento total (SEQ ID NO: 1). A parte heteróloga do epítopo Th dos construtos de imunógeno peptídico é derivada de sequências de aminoácido derivadas de proteínas patogênicas. As partes do epítopo de célula B e do epítopo Th dos construtos de imunógeno peptídico atuam juntas quando administradas a um hospedeiro para estimular a geração de anticorpos que reconhecem e se ligam especificamente à parte do epítopo da célula B de a-Syn das construções.

[0019] Em algumas modalidades, o construto de imunógeno peptídico de a-Syn compreende: (a) um epítopo de célula B que compreende cerca de 10 a cerca de 25 resíduos de aminoácido de um fragmento C-terminal de a-Syn que corresponde aproximadamente ao aminoácido G111 a aproximadamente ao aminoácido D135 da SEQ ID NO: 1; (b) um epítopo auxiliar T que compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 70 a 98; e (c) um espaçador heterólogo opcional selecionado do grupo que consiste em um aminoácido, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (a, E-N)Lys, e e- N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 148), em que o epítopo de célula B está covalentemente ligado ao epítopo auxiliar T diretamente ou através do espaçador heterólogo opcional. Nas modalidades específicas, o construto de imunógeno peptídico de a-Syn compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 107, 108, 111 a 113 e 115 a 147.

[0020] A presente invenção também é direcionada às composições que contêm os construtos de imunógeno peptídico divulgadas, incluindo as composições farmacêuticas. As composições farmacêuticas divulgadas são capazes de extrair uma resposta imune e a produção de anticorpos contra os construtos de imunógeno peptídico divulgadas em um hospedeiro. As composições divulgadas podem conter uma ou uma mistura de mais do que um dos construtos de imunógeno peptídico divulgadas. Em algumas modalidades, as composições contêm os construtos de imunógeno peptídico divulgadas juntamente com os componentes adicionais, incluindo veículos, adjuvantes, tampões e outros reagentes adequados. Em certas modalidades, as composições contêm os construtos de imunógeno peptídico divulgadas na forma de um complexo imunoestimulador estabilizado com um oligômero CpG que é opcionalmente suplementado com um adjuvante.

[0021] Em algumas modalidades, as composições compreendem um construto de imunógeno peptídico de a-Syn compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 107, 108, 111 a 113, 115 a 147. Em certas modalidades, a composição é um produto farmacêutico composição que compreende um construto de imunógeno peptídico de a-Syn selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 107, 108, 111 a 113, 115a 147 e um veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.

[0022] A presente invenção também é direcionada a anticorpos que são produzidos por um hospedeiro que é imunizado com os construtos de imunógeno peptídico divulgados. Os anticorpos divulgados reconhecem e se ligam especificamente à parte do epítopo da célula B de a-Syn dos construtos de imunógeno peptídico. Os anticorpos de a-Syn divulgados possuem uma reatividade cruzada inesperadamente elevada com a lâmina B de a-Syn na forma de monômeros, oligômeros ou fibrilas. Com base em suas características e propriedades únicas, os anticorpos divulgados são capazes de fornecer uma abordagem imunoterapêutica para direcionar, identificar e tratar as sinucleinopatias.

[0023] Nas modalidades específicas, o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao epítopo especificamente se liga ao epítopo da célula B do construto de imunógeno do peptídeo de a-Syn selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 107, 108, 111 a 113, 115 a 147.

[0024] A presente invenção também é direcionada aos métodos de produção e uso dos construtos, anticorpos e composições de imunógeno peptídico divulgados. Os métodos divulgados fornecem a fabricação e controle de qualidade de baixo custo das construções e composições de imunógeno peptídico contendo os construtos, que podem ser utilizadas nos métodos para prevenir e tratar sinopatias.

[0025] A presente invenção também inclui métodos para o tratamento e/ou prevenção de sinucleinopatias utilizando os construtos de imunógeno peptídico divulgadas e/ou anticorpos direcionados contra os construtos de imunógeno peptídico. Em algumas modalidades, os métodos para o tratamento e/ou prevenção de sinucleinopatias incluem a administração a um hospedeiro de uma composição contendo um construto de imunógeno peptídico divulgada. Em certas modalidades, as composições utilizadas nos métodos contêm um construto de imunógeno peptídico divulgada na forma de um complexo imunoestimulador estável com oligonucleotídeos negativamente carregados, tais como oligôêômeros CpG, por meio da associação eletrostática, cujos complexos são ainda suplementados, opcionalmente, com sais minerais ou óleo como adjuvante, para administração a pacientes com sinucleinopatias. Os métodos divulgados também incluem regimes de dosagem, formas de dosagem e vias para a administração dos construtos de imunógeno peptídico a um hospedeiro em risco ou com sinucleinopatias.

[0026] Em várias modalidades, métodos de uso do construto de imunógeno peptídico de a-Syn e/ou anticorpos obtidos pelo construto de imunógeno peptídico de a-Syn são descritos. Nas modalidades específicas, os métodos para produzir anticorpos, inibir a agregação de a-Syn, reduzir a quantidade de agregados de a-Syn e identificar os agregados de a-Syn de diferentes tamanhos são descritos. Os vários métodos compreendem a administtação de uma quantidade farmacologicamente eficaz do imunógeno peptídico de a-Syn a um hospedeiro com sua necessidade.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0027] A Figura 1 é um gráfico que mostra o nível de agregação de a-Syn in vitro após 6 dias na presença de anticorpos direcionados contra a extremidade C-terminal da a-Syn (amostras de 1 a 4) ou na presença de um controle de veículo (amostra 5). Especificamente, a agregação de a-Syn foi realizada na presença de anticorpos anti-a- Syn obtidos por: a-Syn111-1323 (Amostra 1); a-Syn121-135 (Amostra 2); a- SynN123-135 (Amostra 3); a-Syni26-135 (Amostra 4); ou um controle de veículo (Amostra 5). O nível de agregação de a-Syn foi medido através da coloração com Thioflavin-T (ThT) dos agregados. As Amostras de 1 a 4 foram normalizadas contra o controle de veículo da Amostra 5. As barras de erro representam o SEM (erro padrão da média) de cada estudo replicado.

[0028] A Figura 2 é um gráfico que mostra o nível de dissociação de agregados de a-Syn in vitro pré-formados após incubar os agregados durante 3 dias na presença de anticorpos direcionados contra a extremidade C-terminal da a-Syn (Amostras de 1 a 3) ou um controle de soro pré-imune (Amostra 4). Especificamente, os agregados de a-Syn pré-formados foram incubados com anticorpos anti-a-Syn obtidos: a-Syn111-1323 (Amostra 1); a-Syn126-135 (Amostra 2); uma combinação de anticorpos obtidos por a-Syn111-132 E A-SYN126-135 (Amostra 3); ou um controle de soro pré-imune (Amostra 4). O nível de agregação de a-Syn foi medido através da coloração com Thioflavin-T (ThT) dos agregados. As amostras de 1 a 3 foram normalizadas contra o controle de sor pré-imune da Amostra 4. As barras de erro representam o SEM (erro padrão da média) de cada estudo replicado.

[0029] A Figura 3 é um gráfico que mostra os níveis de agregação de aSyn e desagregação de a-Syn nas células PC12 de superexpressão de a-Syn incubadas com fator de crescimento nervoso (NGF) na presença de anticorpos direcionados contra a extremidade C-terminal da a-Syn (Amostras de 1 a 4) ou um controle de veículo (Amostra 5). Especificamente, as células PC12 foram incubadas com anticorpos anti-a-Syn obtidos por: a-Syn111-1323 (Amostra 1); a-Syn121-135 (Amostra 2); a-Syn123-135 (Amostra 3); a-Syn126-135 (Amostra 4); ou um controle de veículo (Amostra 5). As amostras de 1 a 4 foram normalizadas contra o controle de veículo da Amostra 5. As barras de erro representam o SD (desvio padrão) de cada estudo triplicado.

[0030] A Figura 4 é um gráfico que mostra os níveis de liberação mediada por agregados de a-Syn de TNF-a e IL-6 das células incubadas na presença de anticorpos direcionados contra a extremidade C-terminal da a-Syn (Amostras de 1 a 4) ou um controle de veículo (Amostra 5). Especificamente, as células da microglia foram incubadas com anticorpos antica-Syn obtidas por: a-Syni11-132 (Amostra 1); a-Syni21135 (Amostra 2); a-Syn123135 (Amostra 3); a- SynN126-135 (Amostra 4); ou um controle de veículo (Amostra 5). As amostras de 1 a 4 foram normalizadas contra o controle de veículo da Amostra 5. As barras de erro representam o SD (desvio-padrão) de cada estudo triplicado.

[0031] As Figuras 5A a 5C são gráficos que ilustram o efeito de anticorpos anti-a-Syn em um modelo de neurodegeneração in vitro com agregados a-Syn pré-formados exógenos em células PC12 diferenciadas por neurônios induzidas por NGF. A Figura 5A avalia o comprimento das neurites das células PC12 tratadas apenas com NGF (linha sólida escura); NGF com agregados de a-Syn pré-formados exógenos (linha pontilhada); NGF com soros pré-imunes (linha sólida clara); e NGF com agregados de a-Syn pré-formados exógenos e soros pré-imunes (linha tracejada). A Figura 5B avalia o comprimento das neurites das células PC12 tratadas com NGF juntamente com o veículo (linha sólida escura); NGF com agregados de a-Syn pré- formados exógenos (linha pontilhada); NGF com anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn111-1323 (SEQ ID NO: 113) (linha sólida clara); e NGF com agregados de a-Syn pré-formados exógenos e anticorpos anti-a- Syn obtidos por a-Syn111-1323 (SEQ ID NO: 113) (linha tracejada). À Figura 5C avalia o comprimento das neurites das células PC12 tratadas com NGF isoladamente e veículo (linha sólida escura); NGF com agregados de a-Syn pré-formados exógenos (linha pontilhada); NGF com anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syni126-135 (SEQ ID NO: 112) (linha sólida clãra); e NGF com agregados de a-Syn pré-formados exógenos e anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn126-135 (SEQ ID NO: 112) (linha tracejada).

[0032] As Figuras 6A a 6B são gráficos que ilustram o efeito de anticorpos anti-a-Syn sobre o número de células e comprimento de neurites em um modelo de neurodegeneração in vitro utilizando células PC12 de superexpressão de a-Syn do tipo silvestre de diferenciação neuronal induzida por NGF. As células foram tratadas com um controle de veículo (Amostra 1); anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-SyN101-133 (Amostra 2), a-Syn111-132 (Amostra 3), a-SynN121-135 (Amostra 4), a-Syn123-135 (Amostra 5), a-Syni126-135 (Amostra 6), uma combinação de anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn111-1322 e a- SynNi126-135 (Amostra 7); ou um controle de soro pré-imune (Amostra 8). A Figura 6A avalia os respectivos efeitos protetores de cada amostra na restauração do número de células PC12. A Figura 6B avalia o comprimento de neurites das células tratadas com cada amostra. As amostras de 1 a 8 foram normalizadas para células PC12 do tipo silvestre diferenciadas por neurônios induzidas por NGF. Um teste t foi utilizado para o teste de significância (um valor p menor do que 0,05 foi definido como estatisticamente significativo e indicado com um asterisco (*)).

[0033] As Figuras 7A a 7B ilustram a capacidade de anticorpos anti-a-Syn em reconhecer e se ligar aos agregados de a-Syn de diferentes tamanhos pela análise de Western blot. A Figura 7A é uma imagem de um Western blot que compara um anticorpo anti-a-Syn comercialmente disponível, Syn211 (Pista 1); um controle de soro pré- imune (Pista 2); um anticorpo anti-a-Syn obtido por Syn111-132 (Pista 3); um anticorpo anti-a-Syn obtido por Syn111-135 (Pista 4); um anticorpo anti-ca-Syn obtido por Syni21-135 (Pista 5); um anticorpo anti-a-Syn obtido por Syn123-135 (Pista 6); e um anticorpo anti-a-Syn obtido por a- Syni126-135 (Pista 7). A Figura 7B é um gráfico de barras que mostra a capacidade relativa de cada anticorpo de se ligar a complexos moleculares de a-Syn de vários tamanhos (incluindo monômeros, dímeros, — trímeros, —tetrâmeros e oligômeros Os sinais quimioluminescentes das faixas de Western blot mostradas na Figura 7A foram quantificados e relatados no gráfico de barras da Figura 7B.

[0034] As Figuras 8A a 8C são imagens de hibridização em pontos que ilustram que os anticorpos direcionados contra a extremidade C- terminal de a-Syn reconhecem e se ligam apenas a diferentes espécies de a-Syn (isto é, os monômeros de a-hélice, monômeros de folha B, oligômeros de folha B e fibrilas de folha B) e não nas mesmas espécies de outras proteínas amiloidogênicas (isto é, AB1I-42 e Tau441). A Figura 8A é uma amostra de controle que mostra que os anticorpos purificados a partir de soro pré-imune de porquinhos da Índia não revelaram nenhum nível detectável de qualquer uma a todas as espécies de proteína analisadas. A Figura 8B avalia a capacidade de um anticorpo anti-a-Syn obtido por a-Syn111-1322 (SEQ ID NO: 113)

em reconhecer e se ligar a diferentes espécies de proteínas a-Syn, AB1-42 e Tau441. A Figura 8C avalia a capacidade de um anticorpo anti-a-Syn obtido por a-Syn126-135 (SEQ ID NO: 112) em reconhecer e se ligar a diferentes espécies de proteínas a-Syn, AB1-42 e Tau441.

[0035] A Figura 9 é uma tabela que resume as afinidades de ligação relativas dos anticorpos direcionados contra a extremidade C- terminal da a-Syn ao a-Syn intracelular em várias linhagens celulares PC12, conforme medido por sinais positivos em um estudo de imunocitoquímica (ICC). Especificamente, as afinidades de ligação relativas dos anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn111-132, A-SynN121- 135, A-SyN126-135, OU UMa amostra de controle de soro pré-imune foram avaliadas em células PC12 de origem, células PC12 controladas por simulação, células de superexpressão de a-Syn do tipo silvestre e células PC12 de superexpressão de a-Syn submetidas a mutação A53T após tratamento com NGF.

[0036] As Figuras 10A a 10C ilustam que os anticorpos direcionados contra a extremidade C-terminal de a-Syn somente se ligam à a-Syn nas seções do cérebro com PD e não nas seções saudáveis do cérebro. A Figura 10A mostra os anticorpos de a-Syn obtidos por construtos de imunógeno peptídico de a-Syn e os anticorpos pré-imunes não apresentaram nenhuma imunorreatividade detectada em um painel de tecidos humanos normais, incluindo as seções do cérebro. A Figura 10B mostra a imunorreatividade de anticorpos direcionados contra os agregados de a-Syn nas seções de tálamo da PD como indicado pela ponta da seta. A Figura 10C é uma tabela que relata a imunorreatividade de anticorpos direcionados contra a extremidade C-terminal de a-Syn e um controle de soro pré- imune para agregados de a-Syn na PD e também nas seções cerebrais saudáveis, conforme determinado pela contagem das manchas positivas sob observação microscópica.

[0037] As Figuras 11A a 11B são gráficos que mostram o nível de IgG anti-a-Syn no soro de modelos de camundongos com PD após três imunizações com adjuvante isoladamente (círculo aberto) ou imunógenos peptídicos contendo a-Syn111-132 (quadrado aberto); a- Syni126-135 (círculo fechado); ou uma combinação de a-Syn111-1322 e a Syni126-135 (quadrado fechado). A Figura 11A mostra os níveis de IgG em um modelo de camundongo induzido por MPP*. A Figura 11B mostra os níveis de IMG em um modelo de camundongo inoculado com a-Syn fibrilar.

[0038] As Figuras 12A a 12B são gráficos que mostram o nível de a-Syn na circulação periférica dos modelos de camundongo com PD após três imunizações apenas com adjuvante isoladamente (círculo aberto) ou imunógenos peptídicos contendo a-Syn111-1322 (quadrado aberto); a-Syni26-135 (círculo fechado); ou uma combinação de a- SynN111-132 E A-SyN126-135 (quadrado fechado). A Figura 12A mostra os níveis de a-Syn em um modelo de camundongo induzido por MPP*. À Figura 12B mostra os níveis de a-Syn em um modelo de camundongo inoculado com a-Syn fibrilar.

[0039] As Figuras 13A a 13B/ mostram o nível de a-Syn oligomérica em amostras cerebrais de um modelo de camundongo saudável não tratado (pista 1) ou modelos de camundongo com PD (pistas 2 a 3) que receberam três imunizações com adjuvante isoladamente (pista 2) ou imunógenos peptídicos contendo a-Syn111-132 (pista 3). Os camundongos Balb/c não tratados representam o modelo de camundongo saudável, enquanto que os camundongos induzidos por MPP+ representam os modelos de camundongo com PD. A Figura 13A é um Western blot que mostra o nível de a-Syn oligomérica, assim como a GAPDH como controle de carga de proteína nas amostras. À Figura 13B é um gráfico que compara os níveis relativos de a-Syn oligomérica mostrados no Western blot da Figura 13A, depois que os níveis de proteína foram normalizados com o nível de GAPDH, e a relação do lisado de modelo de camundongo saudável não tratado foi ainda padronizada para um nível de 1,00 para comparação.

[0040] As Figuras 14A a 14G mostram o nível de a-Syn oligomérica e tirosina hidroxilase nas amostras cerebrais de um modelo de camundongo saudável não tratado (pista 1) ou modelos de camundongo com PD (pistas 2-4) administrados com três imunizações com o adjuvante isoladamente (faixa 2) ou imunógenos peptídicos contendo a-Syni11-1323 (pista 3); ou aq-Synias13s (pista 4). Os camundongos FVB não tratados representam o modelo de camundongo saudável, enquanto que os camundongos inoculados com a-Syn fibrilar representam os modelos de camundongo com PD. À Figura 14A é um Western blot que mostra o nível de a-Syn oligomérica e tirosina hidroxilase, assim como a GAPDH como um controle de carga de proteína, em lisados da substância negra do lado ipsilateral. A Figura 14B é um gráfico que compara os níveis relativos de a-Syn oligomérica mostrados no Western blot da Figura 14A, depois que os níveis de proteína foram normalizados com o nível de GAPDH. A Figura 14C é um gráfico que compara os níveis relativos de proteína tirosina hidroxilase mostrados no Western blot da Figura 14A, depois que os níveis de proteína foram normalizados com o nível de GAPDH. A Figura 14D é um Western blot que mostra o nível de a-Syn oligomérica, assim como a GAPDH como um controle de carga de proteínas, em lisados do estriado do lado ipsilateral. A Figura 14E é um gráfico que compara os níveis relativos de a-Syn oligomérica mostrados no Western blot da Figura 14C, depois que os níveis de proteína foram normalizados com o nível de GAPDH. A Figura 14F é um Western blot que mostra o nível de a-Syn oligomérica, assim como uma GAPDH como um controle de carga de proteínas, em lisados do estriado do lado contralateral. A Figura 14G é um gráfico que compara os níveis relativos de a-Syn oligomérica mostrados no Western blot da Figura 14E, após os níveis de proteína terem sido normalizados com o nível de GAPDH.

[0041] As Figuras 15A a 15C são gráficos que avaliam a função motora em camundongos medidos por CatWalk'“ XT em modelos de camundongos saudáveis (pistas 1 a 2) tratados com solução salina (pista 1) ou adjuvante isoladamente (pista 2); ou modelos de camundongo com PD (pistas 3 a 5) imunizados com adjuvante isoladamente (pista 3) ou imunógenos peptídicos contendo a-Syn126-135 (faixa 4) ou a-Syn111-132 (faixa 5). Um teste t foi utilizado para o teste de significância (um valor de p menor do que 0,05 foi definido como estatisticamente significativo e indicado com um asterisco "*") A Figura 15A avalia as posições dos membros posteriores esquerdos nos camundongos tratados, onde os camundongos FVB não tratados representam o modelo de camundongo saudável e os camundongos inoculados com a-Syn fibrilar representam os modelos de camundongo com PD. A Figura 15B avalia as durações de execução nos camundongos tratados, em que os camundongos FVB não tratados representam o modelo de camundongo saudável e os camundongos inoculados com a-Syn fibrilar representam os modelos de camundongo com PD. A Figura 15C avalia as durações de execução nos camundongos tratados, em que os camundongos Balb/c não tratados representam o modelo de camundongo saudável, enquanto que os camundongos induzidos por MPP+ representam os modelos de camundongo com PD.

[0042] Figuras 16A a 16H. A Figura 16A mostra que PD-021514 (a-Syngs-140, wpi 08) reconhece com as fibrilas da cepa de a-Syn de maior afinidade. Boa ligação com as fitas de tensão e fibrilas-91 é observada. Fraca ligação aos oligômeros e fibrilas-65. Fraca ligação ao monômero de a-Syn e às fibrilas que carecem dos 30 resíduos de aminoácido C-terminais (Fib-110). A Figura 16B mostra que a PD- 021522 (a-Syngs-140, Wpi 13) se liga a todas as cepas/oligômeros, não aos monômeros, não se observa claramente um aumento dependente da concentração no sinal. O anticorpo se liga às fibrilas sem os 30 resíduos de aminoácido C-terminais (Fib-110). O epítopo não está, portanto, nesta região. A Figura 16C mostra que D-100806 (a-Syn126- 135, Wpi 09) se liga a todas as cepas, com maior afinidade com relação às fitas. Liga a a-Syn oligomérica nativa com menor eficiência. Quase não se observa ligação ao glutaraldeído, oligômeros reticulados com dopamina e a-syn monomérica. O anticorpo provavelmente é direcionado contra os 30 resíduos de aminoácido do C-terminal da a- syn, pois não se liga às fibrilas que carecem dos 30 resíduos de aminoácido do C-terminal (Fib-110). A Figura 16 D mostra que o anticorpo comercial Syn1 (clone 42, BD bioscience) se liga a todas as cepas de a-Syn e aos oligômeros, exceto as reticulações de glutaraldeído. Também se liga à a-syn monomérica. O seu epítopo é descrito como abrangendo os resíduos 91 a 96/99. Consistente com isso, ele liga as fibrilas que carecem dos 30 resíduos de aminoácido C- terminais (Fib-110). A Figura 16E mostra que o PRX002 reconhece com a a-Syn fibrilar de afinidade um pouco melhor em comparação com a a-Syn monomérica. A Figura 16F mostra o controle com relação à origem dos anticorpos gerados no porquinho da índia. A Figura 16G mostra o controle com relação à origem do anticorpo Syn1. A Figura 16H mostra o controle com relação à origem do PRX002.

[0043] Figuras 17A a 17D. Análise de IHC da especificidade de anticorpos UNS com relação à a-Syn nos gânglios basais de pacientes com Demência com Corpos de Lewy (DLB). A área percentual média dos agregados de a-Syn corados por cada anticorpo (PDO62220, PDO62205, PD100806 e NCL-L-ASYN) foi determinada para uma área total de 7,5 mm? em Putâmen (Figura 17A), cápsula interna (Figura

17B), e córtex ínsula (Figura 17C). Imagens representativas de microscópio de imunocoloração no putâmen com cada anticorpo são mostradas na Figura 17D. Os anticorpos UNS detectaram uma área percentual mais elevada de agregados de a-Syn no putâmen (F(3,7) = 1,550, p = 0,284 por ANOVA), cápsula interna (F(3,7) = 1,356, p = 0,332 por ANOVA) e córtex ínsula (F(3,8) = 2,050, p = 0,195 por ANOVA). P < 0,05 (*); P < 0,01 (**); P < 0,001 (***). Os dados são mostrados como Média + SD (barras de erro).

[0044] Figuras 18A a 18D. Análise de IHC da especificidade de anticorpos UNS para a a-Syn nos gânglios basais de pacientes com Doença de Parkinson (SD). A área percentual média dos agregados de a-Syn corados por cada anticorpo (PDO62220, PDO062205, PD100806 e NCL-L-ASYN) foi determinada para uma área total de 7,5 mm? em Putâmen (Figura 18A), cápsula interna (Figura 18B), e córtex íÍnsula (Figura 18C) de três casos de PD. Imagens representativas de microscópio de imunocoloração são mostradas na Figura 18D com relação ao Putâmen. Os anticorpos UNS detectaram uma área percentual mais elevada de agregados de a-Syn no putâmen (F(3,18) = 4,152, p = 0,047 por ANOVA), cápsula interna (F(3,8) = 1,995, p = 0,1934 por ANOVA), e córtex ínsula (F(3,8) = 0,4044, p = 0,754 por ANOVA). Uma área percentual significativamente mais elevad de a- Syn foi detectada com PD100806 em comparação com NCL-L-ASYN (p = 0,023 para PD100806 vs NCL-L-ASYN; n = 3). P<0,05(*); P < 0,01 (**); P < 0,001 (***). A ANOVA unidirecional foi seguida pelo teste de Dunnett. Os dados são mostrados como Média + SD (barras de erro).

[0045] Figuras 19A-19C: Análise de IHC da especificidade de anticorpos UNS para a a-Syn nos gânglios basais de pacientes com atrofia de múltiplos sistemas (MSA). A área percentual média dos agregados de a-Syn corados por cada anticorpo (PDO062220,

PDO62205, PD100806 e NCL-L-ASYN) foi determinada para uma área total de 7,5 mm? em Putâmen (Figura 19A) e cápsula interna (Figura 19B) em três casos de MSA. Nenhuma patologia foi detectada no córtex ínsula de pacientes com MSA e, portanto, não foi quantificada. Os anticorpos UNS detectaram uma área percentual mais elevada de agregados de a-Syn no putâmen (F(3,8) = 1,56, p = 0,273 por ANOVA) e cápsula interna (F(3,8) = 1,126, p = 0,395 por ANOVA). Imagens representativas de microscópio a partir da imunocoloração são mostradas na Figura 19C com relação ao putâmen com cada anticorpo sendo mostrado em C. P<0.05 (*); P<0.01 (**); P<0.001 (***). Os dados são mostrados como Média + SD (barras de erro).

[0046] Figuras 20A a 20E. Análise de IHC da especificidade de anticorpos UNS para a-Syn no mesencéfalo de pacientes com diferentes sinucleinopatias. A área percentual média dos agregados de a-Syn corados por cada anticorpo (PDO62220, PDO62205, PD100806 e NCL-L-ASYN) foi determinada para uma área total de 7,5 mm? na substância negra dos pacientes com PD (Figura 20A), DLB (Figura 20B) e MSA (Figura 20C). A área percentual corada por cada anticorpo foi comparada com o anticorpo de diagnóstico, NCL-L- ASYN. Os anticorpos UNS detectaram uma área percentual mais elevada de agregados de a-Syn na substância negra de pacientes com MSA (F(3,8) = 0,830, p = 0,51 por ANOVA); DLB (F(3,7) = 2,493, p = 0,144 por ANOVA) e PD (F(3,7) = 0,189, p = 0,900 por ANOVA). Imagens representativas de microscópio de imunocoloração com cada anticorpo são mostradas na Figura 20D (MSA) e na Figura 20E (DLB). P < 0,05 (*); P < 0,01 (**); P < 0,001 (**). Os dados são mostrados como Média + SD (barras de erro).

[0047] Figuras 21A a 21F. Análise de IHC da especificidade de anticorpos UNS para a-Syn na massa branca e cinzenta do córtex temporal de pacientes com diferentes sinucleinopatias. A área percentual média dos agregados de a-Syn corados por cada anticorpo (PDO62220, PDO62205, PD100806 e NCL-L-ASYN) foi determinada para uma área total de 7,5 mm? na massa cinzenta cortical e na massa branca subcortical de pacientes com PD (Figuras 21A e 21D), DLB (Figuras 21B e 21E) e MSA (Figuras 21C e 21F). A área percentual corada por cada anticorpo foi comparada com o anticorpo de diagnóstico, NCL-L-ASYN. P < 0,05 (*); P < 0,01 (**); P <0,001 (***) A ANOVA unidirecional foi seguida pelo teste de Dunnett. Os dados são mostrados como Média + SD (barras de erro).

[0048] As Figuras 22A a 22C. Análise de IHC da especificidade de anticorpos UNS para a-Syn no cerebelo de pacientes com diferentes sinucleinopatias. A área percentual média dos agregados de a-Syn corados por cada anticorpo (PDO62220, PDO62205, PD100806 e NCL- L-ASYN) foi determinada para uma área total de 7,5 mm? na massa branca cerebelar de pacientes com PD (Figura 22A), DLB (Figura 22B) e MSA (Figura 22C). Os anticorpos UNS detectaram uma área percentual mais elevada de agregados de a-Syn em MSA (F(3,8)=0.929, p=0.469 by ANOVA); DLB (F(3,6) = 1,426, p = 0,325 por ANOVA) e PD (F(3,6) = 2,509, p = 0,157 por ANOVA). A área percentual corada por cada anticorpo foi comparada com o anticorpo de diagnóstico, NCL-L-ASYN. P < 0,05 (*); P < 0,01 (**); P < 0,001 (***). Os dados são mostrados como Média + SD (barras de erro).

[0049] Figuras 23A-23B. Imagens representativas de imunocoloração da substância negra (Figura 23A) e putâmen (Figura 23B) de cérebros de pacientes de controle não doentes com cada anticorpo. Nenhum dos anticorpos UNS detectou qualquer patologia de a-Syn, comparável ao anticorpo de diagnóstico NCL-L-ASYN.

[0050] Figuras 24A-24D. Análise de IHC da especificidade de anticorpos UNS para LBs no córtex ínsula dos gânglios basais de pacientes com DLB ou PD. A área percentual média de LBs imuno-

positivos detectados com cada anticorpo (PDO62220, PDO62205, PD100806 e NCL-L-ASYN) foi determinada para uma área total de 7,5 mm? no córtex ínsula de pacientes com PD (Figura 24A) e DLB (Figura 24B). A área percentual de LBs é apresentada como uma proporção do a-Syn total detectada com cada anticorpo. Os anticorpos UNS detectaram uma proporção mais baixa de LBs (ou uma proporção maior de LNs) no córtex ínsula de pacientes com DLB (F(3,7) = 0,836, p = 0,516 por ANOVA) e PD (F(3,4) = 0,913, p = 0,510 por ANOVA). A área percentual corada por cada anticorpo foi comparada com o anticorpo de diagnóstico, NCL-L-ASYN. Imagens representativas de microscópio de imunocoloração com cada anticorpo são mostradas na Figura 24C (PD) e Figura 24D (DLB). P < 0,05 (*); P<0,01 (*); P< 0,001 (***). Os dados são mostrados como Média + SD (barras de erro).

[0051] Figuras 25A a 25D. Análise de IHC da especificidade de anticorpos UNS para LBs na massa cinzenta do córtex temporal de pacientes com DLB ou PD. A área percentual média de LBs imuno- positivos detectados com cada anticorpo (PDO62220, PDO62205, PD100806 e NCL-L-ASYN) foi determinada para uma área total de 7,5 mm? na massa cinzenta de pacientes com PD (Figura 25A) e DLB (Figura 25B). A área percentual de LBs é apresentada como uma proporção do total de alfa-sinucleína detectada com cada anticorpo. Os anticorpos UNS detectaram menor proporção de LBs (ou maior proporção de LNs) na massa cinzenta de pacientes com PD (F(2,3) = 1,983, p = 0,282 por ANOVA) e DLB (F(3,7) = 1,906, p = 0,217 por ANOVA). A área percentual corada por cada anticorpo foi comparada com o anticorpo de diagnóstico, NCL-L-ASYN. Imagens representativas de microscópio de imunocoloração com cada anticorpo são mostradas na Figura 25C (PD) e na Figura 25D (DLB). P < 0,05 (*); P < 0,01 (**); P < 0,001 (***). Os dados são mostrados como Média

+ SD (barras de erro).

[0052] Figuras 26A a 26B. Imagens representativas da imunocoloração com anticorpos UNS e NCL-L-ASYN na substância negra do mesencéfalo de pacientes com DLB (Figura 26A) da PD (Figura 26B). Há uma detecção mais elevada de LNs com anticorpos UNS em comparação com NCL-L-ASYN.

[0053] Figura 27A a 27C. Agregação específica de células de a- Syn. A projeção máxima sobrepôs imagens confocais de agregados a- Syn dos gânglios basais e mesencéfalo de casos humanos com PD (Figura 27A), DLB (Figura 27B) e MSA (Figura 27C). A a-Syn (PDO62205, vermelha) se agrega nos neurônios (HuD, verde) nos casos de PD e DLB, mas não MSA. A a-Syn (PDO62205) e HuD são marcadas nas figuras em escala de cinza que são submetidas com o pedido; no entanto, cópias coloridas estão disponíveis mediante solicitação. Barras de Escala: 10 uM.

[0054] Figura 28A a 28C. Agregação específica de células de a- Syn. A projeção máxima sobrepôs imagens confocais de agregados de a-Syn de casos humanos de PD (Figura 28A), DLB (Figura 28B) e MSA (Figura 28C). A a-Syn (PDO62205, vermelha) agrega rara localização dentro de oligodendrócitos (Olig2, verde) nos casos de MSA, mas não PD ou DLB. a-Syn (PDO62205) e Olig2 são marcados nas figuras em escala de cinza submetidas com o aplicativo; no entanto, cópias coloridas estão disponíveis após solicitação. Barras de escala: 10 uM.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0055] A presente invenção é direcionada aos construtos de imunógeno peptídico da proteína alfa-sinucleína (a-Syn). A presente invenção também é direcionada a composições que contêm os construtos de imunógeno peptídico, métodos para fabricar e usar os construtos de imunógeno peptídico e anticorpos produzidos pelos construtos de imunógeno peptídico.

[0056] Os construtos de imunógeno peptídico divulgadas contêm um epítopo de célula B de a-Syn ligada a um epítopo heterólogo de célula T auxiliar (Th) diretamente ou através de um espaçador heterólogo opcional. A parte do epítopo da célula B dos construtos de imunógeno peptídico contém cerca de 10 a cerca de 25 resíduos de aminoácido de uma extremidade C-terminall da a-Syn, que corresponde à sequência próxima da glicina na posição de aminoácido 111 (G111) até próxima da asparagina na posição de aminoácido 135 (D135) de a-Syn de comprimento total (SEQ ID NO: 1). A parte heteróloga do epítopo Th dos construtos de imunógeno peptídico é derivada das sequências de aminoácido derivadas de proteínas patogênicas. As partes do epítopo da célula B e do epítopo Th dos construtos de imunógeno peptídico atuam em conjunto quando administradas a um hospedeiro para estimular a geração de anticorpos especificamente que reconhecem e se ligam à parte do epítopo da célula B de a-Syn das construções.

[0057] A presente invenção também é direcionada às composições que contêm os construtos de imunógeno peptídico divulgadas, incluindo composições farmacêuticas. As composições farmacêuticas divulgadas são capazes de provocar uma resposta imune e a produção de anticorpos contra os construtos de imunógeno peptídico divulgados em um hospedeiro. As composições divulgadas podem conter uma ou uma mistura de mais de uma dos construtos de imunógeno peptídico divulgadas. Em algumas modalidades, as composições contêm os construtos de imunógeno peptídico divulgados juntamente com componentes adicionais, incluindo veículos, adjuvantes, tampões e outros reagentes adequados. Em certas modalidades, as composições contêm os construtos de imunógeno peptídico divulgados na forma de um complexo imunoestimulador estabilizado com um oligômero CpG que é opcionalmente suplementado com um adjuvante.

[0058] A presente invenção também é direcionada aos anticorpos que são produzidos por um hospedeiro que é imunizado com os construtos de imunógeno peptídico divulgados. Os anticorpos divulgados especificamente reconhecem e se ligam à parte do epítopo da célula B de a-Syn dos construtos de imunógeno peptídico. Os anticorpos de a-Syn divulgados possuem uma reatividade cruzada inesperadamente elevada com a folha BB de a-Syn na forma de monômeros, oligômeros ou fibrilas. Com base em suas características e propriedades únicas, os anticorpos divulgados são capazes de fornecer uma abordagem imunoterapêutica para direcionar, identificar e tratar as sinucleinopatias.

[0059] A presente invenção também é direcionada aos métodos de produção e uso das construções, anticorpos e composições de imunógeno peptídico divulgados. Os métodos divulgados fornecem a fabricação de baixo custo e controle de qualidade de construções e composições de imunógeno peptídico contendo as construções, as quais podem ser utilizadas em métodos para a prevenção e tratamento de sinopatias.

[0060] A presente invenção também inclui métodos para tratamento e/ou prevenção de sinucleinopatias utilizando os construtos de imunógeno peptídico divulgados e/ou anticorpos direcionados contra os construtos de imunógeno peptídico. Em algumas modalidades, os métodos para o tratamento e/ou prevenção de sinucleinopatias, incluindo a administração a um hospedeiro de uma composição contendo um construto de imunógeno peptídico divulgado. Em certas modalidades, as composições utilizadas nos métodos contêm um construto de imunógeno peptídico divulgada na forma de um complexo imunoestimulador estável com oligonucleotídeos negativamente carregados, tais como oligômeros CpG, através da associação eletrostática, cujos complexos são ainda suplementados, opcionalmente, com sais minerais ou óleo como adjuvante, para administração a pacientes com Ssinucleinopatias. Os métodos divulgados também incluem regimes de dosagem, formas de dosagem e vias para a administração dos construtos de imunógeno peptídico a um hospedeiro em risco ou com sinucleinopatias.

[0061] Os títulos de seção aqui utilizados são apenas para propósitos organizacionais e não devem ser interpretados como limitativos do presente assunto descrito. Todas as referências ou partes de referências citadas neste pedido são expressamente incorporadas por referência nesta invenção na sua totalidade para qualquer finalidade.

[0062] A menos que seja explicado de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado como é comumente entendido por uma pessoa de habilidade prática na técnica à qual esta invenção pertence. Os termos singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem os referentes plurais, a não ser que o contexto indique claramente de outra maneira. Da mesma forma, a palavra "ou" deve incluir "e", a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por isso, "compreendendo A ou B" significa incluir A ou B ou A e B. Deve-se entender ainda que todos os tamanhos de aminoácido e todos os valores de peso molecular ou massa molecular, dados para polipeptídeos, são aproximados e são fornecidos para descrição. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser utilizados na prática ou no teste do método divulgado, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência na sua totalidade. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as explicações dos termos, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a serem limitativos. Construtos de imunógeno Peptídico de a-Syn

[0063] A presente invenção fornece construtos de imunógeno peptídico contendo um epítopo de células B a partir da a-Syn covalentemente ligada a um epítopo heterólogo de células T auxiliares (Th) diretamente ou através de um espaçador heterólogo opcional.

[0064] A frase "construto de imunógeno peptídico de a-Syn", como aqui utilizada, refere-se a um peptídeo contendo (a) um epítopo de células B tendo cerca de 10 a cerca de 25 resíduos de aminoácido da extremidade C-terminal de a-Syn, que corresponde à sequência próxima da glicina na posição de aminoácido 111 (G111) até próxima da asparagina na posição de aminoácido 135 (D135) de a-Syn de comprimento total (SEQ ID NO: 1); (b) um epítopo Th heterólogo; e (c) um espaçador heterólogo opcional.

[0065] Em certas modalidades, o construto de imunógeno peptídico pode ser representado pelas fórmulas: (Th)1HA)n(fragmento C-terminal de a-Syn)—X ou (fragmento C-terminal de a-Syn) (A). HTh)nWX em que

[0066] Th é um epítopo auxiliar T heterólogo;

[0067] A é um espaçador heterólogo;

[0068] (fragmento C-terminal de a-Syn) é um epítopo de células B tendo cerca de 10 a cerca de 25 resíduos de aminoácido da extremidade C-terminal de a-Syn;

[0069] X é um a-COOH ou a-CONH2 de um aminoácido;

[0070] m é de | a cerca de 4; e

[0071] n é de O a cerca de 10.

[0072] Os vários componentes do construto de imunógeno peptídico de a-Syn divulgado são descritos abaixo. a. a-Syn e fragmentos C-terminais de a-Syn

[0073] O termo "a-Syn", "alfa-sinucleina", "a-sinucleína" e similares, como utilizado nesta invenção, refere-se (a) à proteína a- Syn de comprimento total e/ou (b) aos seus fragmentos de qualquer organismo que expressa a a-Syn. A a-Syn representa uma diversidade conformacional extrema, que se adapta a diferentes condições nos estados de ligação à membrana, citosol e agregação amiloide e cumpre funções versáteis. Em algumas modalidades, a proteína a-Syn é de ser humano. Em certas modalidades, a proteína a-Syn humana de comprimento total possui 140 aminoácidos (No. de Acesso NP 000336) (SEQ ID NO: 1).

[0074] A frase "região C-terminal" ou "extremidade C-terminal" de a-Syn, como aqui utilizada, refere-se a qualquer sequência de aminoácido da parte terminal carboxila da a-Syn Em certas modalidades, a região C-terminal ou a extremidade C-terminal de a- Syn refere-se à sequência de aminoácido entre os resíduos 96 a 140, ou seus fragmentos, de a-Syn. A região C-terminal do a-Syn é rica em prolinas e resíduos negativamente carregados, que são características comuns encontradas nas proteínas intrinsecamente desordenadas para manter a solubilidade. A região C-terminal do ao-Syn está geralmente presente em uma estrutura de bobina aleatória devido à sua baixa hidrofobicidade e alta carga negativa líquida. Estudos in vitro revelaram que a agregação de a-Syn pode ser induzida pela redução do pH que neutraliza essas cargas negativas.

[0075] A frase "fragmento C-terminal de a-Syn" ou "epítopo de células B da extremidade C-terminal de a-Syn", conforme aqui utilizada, refere-se a uma parte da sequência de a-Syn de comprimento total que inclui cerca de 10 a cerca de 25 resíduos de aminoácido da extremidade C-terminal da a-Syn, que corresponde à sequência próxima da glicina na posição de aminoácido 111 (G111) até próxima da asparagina na posição de aminoácido 135 (D135) da a- Syn. O fragmento C-terminal de a-Syn também é aqui referido como o peptídeo de a-Syn G111-D135 e seus fragmentos. Os vários fragmentos C-terminais de a-Syn aqui descritos são referidos por suas posições de aminoácido em relação à sequência de comprimento total da a-Syn representada pela SEQ ID NO: 1.

[0076] As sequências de aminoácido dos fragmentos do C- terminais de a-Syn utilizados nos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn foram selecionadas com base em várias lógicas do design. Várias dessas lógicas incluem o emprego de uma sequência peptídica de a-Syn que:

[0077] (i) não compartilha homologia de sequência significativa com beta-sinucleína (B-Syn) para evitar a geração de anticorpos que são de reação cruzada com B-Syn, uma vez que B-Syn pode se ligar à a-Syn e impedir sua agregação;

[0078] (ii) é desprovida de um epítopo auxiliar T autólogo dentro da a-Syn para impedir a ativação autóloga de células T, o que poderia levar a inflamação do cérebro resultando em encefalite meningocócica conforme relatado anteriormente em ensaios clínicos usando a vacina AN1792 que direciona AB1-42 para tratamento da doença de Alzheimer;

[0079] (ili) está contida dentro de uma região de a-Syn que é suscetível a alterações conformacionais de sua forma nativa;

[0080] (iv) não é imunogênica por si só, uma vez que é uma auto- molécula;

[0081] (v) pode se tornar imunogênica através de um veículo de proteína ou um epítopo auxiliar T potente;

[0082] vi) quando se torna imunogênica e administrados a um hospedeiro:

[0083] (a) produz anticorpos de alto título direcionados contra a sequência de peptídeo de a-Syn (epítopo de células B) e não contra o veículo de proteína ou epítopos auxiliares T potentes;

[0084] (b) produz anticorpos de alto título que reagem com a folha B desnaturada de a-Syn, na forma de monômeros, oligômeros ou fibrilas, para permitir que tais anticorpos impeçam a a-Syn de se agregar, provocar qualquer agregação de a-Syn para desagregar e resultar na remoção de oligômeros, agregados e/ou fibrilas de a-Syn tóxicos, reduzindo ou impedindo assim a carga agregada de a-Syn no cérebro;

[0085] (c) não produz anticorpos que sejam reativos à a-Syn nativa, o que representaria uma grande preocupação de segurança, uma vez que a a-Syn nativa é uma proteína celular importante com ampla distribuição tecidual.

[0086] Em consideração a essas lógicas do design, a região C- terminal da a-Syn foi escolhida como o alvo para o projeto de imunógeno peptídico. Além disso, a região C-terminal da a-Syn foi selecionada porque, com base em suas características estruturais, essa região parecia ser a mais suscetível à modulação por anticorpos ou outros fatores físicos em comparação com outras regiões da a-Syn.

[0087] A avaliação de numerosas sequências peptídicas derivadas de a-Syn, conforme descrito mais adiante nos Exemplos, levou à identificação e seleção de vários peptídeos de a-Syn que satisfazem as lógicas do design descritas acima. Especificamente, as sequências que satisfazem as lógicas do design incluem peptídeos tendo cerca de a cerca de 25 resíduos de aminoácido da região C-terminal de a- Syn, que corresponde à sequência próxima da glicina na posição de aminoácido 111 (G111) até próxima da asparagina na posição de aminoácido 135 (D135) da a-Syn de comprimento total.

[0088] Em algumas modalidades, o fragmento C-terminal de a-Syn é o peptídeo de a-Syn G111-D135 de 25 aminoácidos representado pela SEQ ID NO: 12. Em outras modalidades, o fragmento C-terminal de a-Syn contém cerca de 10 aminoácidos contíguos do peptídeo de a-Syn G111-D135 representado pela SEQ ID NO: 12. Em certas modalidades, o fragmento C-terminal de a-Syn contém 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos contíguos do peptídeo de a-Syn G111-D135 representado pela SEQ ID NO: 12. Nas modalidades específicas, o fragmento C-terminal de a-Syn possui uma sequência de aminoácido representada pelas SEQ ID NOs: 12 a 15, 17 ou 49 a 64, como mostrado na Tabela 1.

[0089] O fragmento C-terminal de a-Syn da presente invenção também inclui análogos ou homólogos imunologicamente funcionais do peptídeo de a-Syn G111-D135 e seus fragmentos. Análogos ou homólogos imunológicos funcionais do peptídeo de a-Syn G111-D135 e seus fragmentos incluem variantes que retêm substancialmente a mesma imunogenicidade como o peptídeo original. Análogos imunologicamente — funcionais= podem ter uma substituição conservadora na posição de aminoácido; uma mudança na carga geral; uma ligação covalente a outro componente; ou adições, inserções ou eliminações de aminoácido; e/ou qualquer combinação destes.

[0090] As substituições conservadoras são quando um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido com propriedades químicas semelhantes. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; os aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; os aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e os aminoácidos negativamente carregados (acídicos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.

[0091] Análogos imunologicamente funcionais incluem sequências de aminoácidos que compreendem substituições, adições, eliminações ou inserções conservadoras de um a cerca de quatro resíduos de aminoácido que provocam respostas imunes que são reativas cruzadas com o peptídeo de a-Syn G111-D135. As substituições, adições e inserções conservativas podem ser executadas com aminoácidos naturais ou não naturais. Aminoácidos de ocorrência não natural incluem, mas não são limitados a estes, e-N Lisina, B-alanina, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, tiroxina, ácido y-amino butírico, homosserina, citrulinay, ácido aminobenzóico, ácido 6- aminocapróico (Aca; ácido 6-aminoexanóico), hidroxiprolina, ácido mercaptopropiônico (MPA), 3-nitro-tirosina, ácido piroglutâmico, e similares. Os aminoácidos de ocorrência natural incluem alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.

[0092] Em uma modalidade, o análogo imunológico funcional de um peptídeo particular contém a mesma sequência de aminoácido como o peptídeo original e inclui ainda três resíduos de lisina (Lys-Lys- Lys) adicionados ao terminal amino do peptídeo de a-Syn G111-D135 e seus fragmentos peptídeo do epítopo de células B. Nesta modalidade, a inclusão de três resíduos de lisina na sequência de peptídeo original altera a carga total do peptídeo original, mas não altera a função do peptídeo original.

[0093] Em certas modalidades, um análogo funcional do fragmento C-terminal de a-Syn possui pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácido original. Em outras modalidades, o análogo funcional possui pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácidos original. Em mais outras modalidades, o análogo funcional possui pelo menos 85% de identidade com a sequência de aminoácido original. Em ainda outras modalidades, o análogo funcional possui pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade com a sequência de aminoácido original. b. Epítopos heterólogos de células T auxiliares (epítopos Th)

[0094] A presente invenção fornece construtos de imunógeno peptídico contendo um epítopo de células B de a-Syn covalentemente ligada a um epítopo heterólogo de células T auxiliares (Th) diretamente ou através de um espaçador heterólogo opcional.

[0095] O epítopo Th heterólogo na construção do imunógeno de peptídeo de a-Syn aumenta a imunogenicidade do fragmento C- terminal de a-Syn, o que facilita a produção de anticorpos específicos de alto título direcionados contra o epítopo de célula B alvo otimizado (isto é, o fragmento C-terminal de a-Syn) através da lógica do design.

[0096] O termo "heterólogo", como aqui utilizado, refere-se a uma sequência de aminoácidos que é derivada de uma sequência de aminoácido que não faz parte ou é homóloga da sequência do tipo silvestre de a-Syn. Assim, um epítopo Th heterólogo é um epítopo Th derivado de uma sequência de aminoácido que não é encontrada naturalmente na a-Syn (isto é, o epítopo Th não é autólogo á a-Syn). Visto que o epítopo Th é heterólogo ao a-Syn, a sequência de aminoácido natural de a-Syn não é estendida nas direções N-terminais ou C-terminais quando o epítopo Th heterólogo está covalentemente ligado ao fragmento C-terminal de a-Syn.

[0097] O epítopo Th heterólogo da presente invenção pode ser qualquer epítopo Th que não possua uma sequência de aminoácido naturalmente encontrada na a-Syn. O epítopo Th pode ter uma sequência de aminoácido derivada de qualquer espécie (por exemplo, ser humano, porco, gado, cachorro, rato, camundongo, porquinho da Índia, etc.). O epítopo Th também pode ter motivos de ligação promíscuos às moléculas de MHC classe |l de várias espécies. Em certas modalidades, o epítopo Th compreende vários motivos promíscuos de ligação ao MHC classe |l para permitir a ativação máxima de células T auxiliares levando ao início e regulação das respostas imunes. O epítopo Th é preferivelmente imunossilente por si só, isto é, pouco, se houver, dos anticorpos gerados pelos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn que serão direcionados para o epítopo Th, permitindo assim uma resposta imune muito focada direcionada ao epítopo de célula B direcionado do fragmento C- terminal de a-Syn.

[0098] Os epítopos da presente invenção incluem, mas não são limitados a estes, sequências de aminoácidos derivadas de patógenos estranhos, conforme exemplificado na Tabela 2 (SEQ ID NOs: 70 a 98). Além disso, os epítopos Th incluem epítopos Th artificiais idealizados e epítopos Th artificiais idealizados combinatórios (por exemplo, SEQ ID NOs: 71 e 78 a 84). Os peptídeos heterólogos do epítopo Th, apresentados como uma sequência combinatória (por exemplo, SEQ ID NOs: 79 a 82), contêm uma mistura de resíduos de aminoácidos representados em posições específicas dentro da estrutura do peptídeo com base nos resíduos variáveis de homólogos para esse peptídeo particula. Um conjunto de peptídeos combinatórios pode ser sintetizado em um processo mediante a adição de uma mistura dos aminoácidos protegidos designados, em vez de um aminoácido particular, em uma posição especificada durante o processo de síntese. Tais conjuntos de peptídeos de epítopo Th heterólogos combinatórios podem permitir uma ampla cobertura de epítopo Th com relação aos animais que possuem um fundo genético diverso. Sequências combinatórias representativas de peptídeos heterólogos do epítopo Th incluem SEQ ID NOs: 79 a 82, as quais são mostradas na Tabela 2. Os peptídeos do epítopo Th da presente invenção fornecem ampla reatividade e imunogenicidade para animais e pacientes de populações geneticamente diversas.

[0099] Os construtos de imunógeno peptídico de a-Syn compreendendo epítopos Th são produzidos simultaneamente em uma síntese peptídica única em fase sólida em tandem com o fragmento C-terminal de a-Syn. Os epítopos Th também incluem análogos imunológicos dos epítopos Th. Os análogos Th imunológicos incluem análogos de intensificação imunológica, análogos de reatividade cruzada e segmentos de qualquer um desses epítopos Th que são suficientes para intensificar ou estimular uma resposta imune aos fragmentos C-terminais de a-Syn.

[00100] Os análogos imunologicamente funcionais dos peptídeos do epítopo Th também são eficazes e incluídos como parte da presente invenção. Os análogos Th imunológicos funcionais podem incluir substituições, adições, deleções e inserções conservadoras de um a cerca de cinco resíduos de aminoácido no epítopo Th que não modificam essencialmente a função estimuladora de Th do epítopo Th. As substituições, adições e inserções conservativas podem ser executadas com aminoácidos naturais ou não naturais, conforme descrito acima para os fragmentos C-terminais de a-Syn. A Tabela 2 identifica outra variação de um análogo funcional para o peptídeo de epítopo Th. Em particular, as SEQ ID NOs: 71 e 78 de MvF1 e MyvF2 Th são análogos funcionais das SEQ ID NOs: 81 e 83 de MvF4 e MvF5, pois diferem na estrutura de aminoácido pela eliminação (SEQ ID NOs: 71 e 78 ) ou pela inclusão (SEQ ID NOs: 81 e 83) de dois aminoácidos cada um nos terminais N e C. As diferenças entre essas duas séries de sequências análogas não afetariam a função dos epítopos Th contidos nessas sequências. Portanto, os análogos Th imunológicos funcionais incluem várias versões do epítopo Th derivadas da proteína de fusão do sarampo MvF1-4 (SEQ ID NOs: 71,

78, 79, 81 e 83) e da proteína de superfície da hepatite HBsAg 1-3 Ths ( SEQ ID NOs: 80, 82 e 84).

[00101] O epítopo Th no construto de imunógeno peptídico de a- Syn pode ser ligado covalentemente na extremidade N- ou C-terminal do peptídeo C-terminal de a-Syn. Em algumas modalidades, o epítopo Th é covalentemente ligado à extremidade N-terminal do peptídeo C- terminal de a-Syn. Em outras modalidades, o epítopo Th está covalentemente ligado à extremidade C-terminal do peptídeo C- terminal de a-Syn. Em certas modalidades, mais do que um epítopo Th está covalentemente ligado ao fragmento C-terminal de a-Syn. Quando mais do que um epítopo Th está ligado ao fragmento C- terminal de a-Syn, cada epítopo Th pode ter a mesma sequência de aminoácido ou diferentes sequências de aminoácido. Além disso, quando mais do que um epítopo Th estiver ligado ao fragmento C- terminal de a-Syn, os epítopos Th podem ser dispostos em qualquer ordem. Por exemplo, os epítopos Th podem ser ligados consecutivamente à extremidade N-terminal do fragmento C-terminal C de a-Syn, ou consecutivamente ligados à extremidade C-terminal do fragmento — C-terminal de a-Synn ou um epítopo Th estar covalentemente ligado à extremidade N-terminal do fragmento C- terminal de a-Syn enquanto que um epítopo Th separado está covalentemente ligado à extremidade C-terminal do fragmento C- terminal de a-Syn. Não há limitação na disposição dos epítopos Th em relação ao fragmento C-terminal de a-Syn.

[00102] Em algumas modalidades o epítopo Th está covalentemente ligado ao fragmento C-terminal de a-Syn diretamente. Em outras modalidades, o epítopo Th está covalentemente ligado ao fragmento C-terminal de a-Syn através de um espaçador heterólogo descrito com maiores detalhes abaixo. c. Espaçador heterólogo

[00103] Os construtos de imunógeno peptídico de a-Syn divulgados opcionalmente contêm um espaçador heterólogo que liga covalentemente o epítopo de célula B da a-Syn ao epítopo da célula T auxiliar (Th) heteróloga.

[00104] Como tratado acima, o termo "heterólogo" refere-se a uma sequência de aminoácidos que é derivada de uma sequência de aminoácido que não faz parte ou é homóloga da sequência do tipo silvestre de a-Syn. Assim, a sequência natural de aminoácido da a- Syn não é estendida nas direções N-terminais ou C-terminais quando o espaçador heterólogo está covalentemente ligado ao epítopo de células B da a-Syn porque o espaçador é heterólogo à sequência de a-Syn.

[00105] O espaçador é qualquer molécula ou estrutura química capaz de ligar dois aminoácidos e/ou peptídeos entre si. O espaçador pode variar no comprimento ou polaridade, dependendo da aplicação. A ligação do espaçador pode ser feita através de um sistema articulado de amida ou carboxila, mas outras funcionalidades também são possíveis. O espaçador pode incluir um composto químico, um aminoácido de ocorrência natural ou um aminoácido de ocorrência não natural.

[00106] O espaçador pode fornecer características estruturais para o construto de imunógeno peptídico de a-Syn. Estruturalmente, o espaçador fornece uma separação física do epítopo Th do epítopo de células B do fragmento C-terminal de a-Syn. A separação física pelo espaçador pode dividir quaisquer estruturas secundárias artificiais criadas pela união do epítopo Th com o epítopo de células B. Adicionalmente, a separação física dos epítopos pelo espaçador pode eliminar a interferência entre as respostas da célula Th e/ou da célula B. Além disso, o espaçador pode ser projetado para criar ou modificar uma estrutura secundária do construto de imunógeno peptídico. Por exemplo, um espaçador pode ser projetado para atuar como uma dobradiça flexível para intensificar a separação do epítopo Th e do epítopo de células B. Um espaçador de dobradiça flexível também pode permitir interações mais eficientes entre o imunógeno peptídico apresentado e as células Th e células B apropriadas para melhorar as respostas imunes ao epítopo Th e ao epítopo de células B. Exemplos de sequências que codificam as dobradiças flexíveis são encontrados na região de dobradiça da cadeia pesada de imunoglobulina, que geralmente é rica em prolina. Uma dobradiça flexível particularmente útil que pode ser utilizada como espaçador é fornecida pela sequência Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 148), em que Xaa é qualquer aminoácido e, de preferência, ácido aspártico.

[00107] O espaçador também pode fornecer características funcionais para o construto de imunógeno peptídico de a-Syn. Por exemplo, o espaçador pode ser projetado para alterar a carga geral do construto de imunógeno peptídico de a-Syn, que pode afetar a solubilidade do construto de imunógeno peptídico. Adicionalmente, a alteração da carga geral do construto de imunógeno peptídico de a- Syn pode afetar a capacidade do construto de imunógeno peptídico em se associar a outros compostos e reagentes. Como tratado com mais detalhes abaixo, o construto de imunógeno peptídico de a-Syn pode ser formado em um complexo imunoestimulador estável com um oligonucleotídeo altamente carregado, tal como oligômeros CpG através da associação eletrostática. A carga geral do construto de imunógeno peptídico de a-Syn é importante para a formação desses complexos imunoestimuladores estáveis.

[00108] Os compostos químicos que podem ser utilizados como um espaçador incluem, mas não são limitados a estes, ácido (2- aminoetóxi) acético (AEA), ácido 5-aminovalérico (AVA), ácido 6- aminocapróico (Ahx), ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanóico (AEEA, mini-

PEG1), ácido 12-amino-4,7,10-trioxadodecanóico (mini-PEG2), ácido 15-amino-4,7,10,13-tetraoxapenta-decanóico — (mini:PEG3), — ácido trioxatridecano-succinâmico —(Ttds) ácido 12-amino-dodecanóico, ácido Fmoc-5-amino-3-oxapentanóico (O1Pen) e similares.

[00109] Os aminoácidos de ocorrência natural incluem alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.

[00110] Os aminoácidos de ocorrência não natural incluem, mas não são limitados a estes, e-N Lisina, B-alanina, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, tiroxina, ácido y-amino butírico, homosserina, citrulina, ácido aminobenzóico, ácido 6-aminocapróico (Aca; ácido 6- aminoexanóico), hidroxiprolina, ácido mercaptopropiônico (MPA), 3- nitro-tirosina, ácido piroglutâmico, e similares.

[00111] O espaçador no construto de imunógeno peptídico de a-Syn pode ser covalentemente conectado na extremidade N ou C-terminal do epítopo Th e no peptídeo C-terminal de a-Syn. Em algumas modalidades, o espaçador é covalentemente conectado à extremidade C-terminal do epítopo Th e à extremidade N-terminal do peptídeo C- terminal de a-Syn Em outras modalidades, o espaçador é covalentemente conectado à extremidade C-terminal do peptídeo C- terminal de a-Syn e à extremidade N-terminal do epítopo Th. Em certas modalidades, mais do que um espaçador pode ser utilizado, por exemplo, quando mais do que um epítopo Th estiver presente no construto de imunógeno peptídico. Quando mais do que um espaçador for utilizado, cada espaçador pode ser igual entre si ou diferente. Adicionalmente, quando mais do que um epítopo Th estiver presente no construto de imunógeno peptídico, os epítopos Th podem ser separados com um espaçador que pode ser o mesmo ou diferente do espaçador utilizado para separar o epítopo Th do epítopo de células B.

Não existe nenhuma limitação na disposição do espaçador em relação ao epítopo Th ou ao fragmento C-terminal de a-Syn.

[00112] Em certas modalidades, o espaçador heterólogo é um aminoácido de ocorrência natural ou um aminoácido de ocorrência não natural. Em outras modalidades, o espaçador contém mais do que um aminoácido de ocorrência natural ou de ocorrência não natural. Nas modalidades específicas, o espaçador é Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (a, e&- N)Lys, ou e-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 148). d. Modalidades específicas do construto de imunógeno peptídico de a- Syn

[00113] O construto de imunógeno peptídico de a-Syn pode ser representado pelas fórmulas: (Th)rnHA)n—(fragmento C-terminal de a-Syn)—X ou (fragmento C-terminal de a-Syn-(A))—>H(Th)n=X

[00114] emque

[00115] Thé um epiítopo auxiliar T heterólogo;

[00116] Aéum espaçador heterólogo;

[00117] (fragmento C-terminal de a-Syn) é um epítopo de células B tendo cerca de 10 a cerca de 25 resíduos de aminoácidos da extremidade C-terminal de a-Syn;

[00118] Xéuma-COOH ou a-CONH> de um aminoácido;

[00119] méde1acercade4;e

[00120] néde0O acerca de 10.

[00121] Em certas modalidades, o epítopo Th heterólogo no construto de imunógeno peptídico de a-Syn possui uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 70 a 98, ou suas combinações, mostradas na Tabela 2. Nas modalidades específicas, o epítopo Th possui uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 78 a 84. Em certas modalidades, o construto de imunógeno peptídico de a-Syn contém mais do que um epítopo Th.

[00122] Em certas modalidades, o espaçador heterólogo opcional é selecionado a partir de qualquer um de Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (a, e- N)Lys, e-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 148), e suas combinações. Nas modalidades específicas, o espaçador heterólogo é e-N-Lys-Lys- Lys-Lys (SEQ ID NO: 148).

[00123] Em certas modalidades, o fragmento C-terminal de a-Syn possui cerca de 10 a cerca de 25 resíduos de aminoácido da extremidade C-terminal de a-Syn, que corresponde à sequência próxima da glicina na posição de aminoácido 111 (G111) até próxima da asparagina na posição de aminoácido 135 (D135) da a-Syn de comprimento total. Nas modalidades específicas, o fragmento C- terminal de a-Syn possui uma sequência de aminoácido representada pelas SEQ ID NOs: 12 a 15, 17 ou 49 a 64, conforme mostrado na Tabela 1.

[00124] Em certas modalidades, o construto de imunógeno peptídico de a-Syn possui uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 107 a 108, 111 a 113 e 115 a 147, como mostrado na Tabela 3. Nas modalidades específicas, o construto de imunógeno peptídico de a-Syn possui uma sequência de aminoácido selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 107 a 108 e 111 a113. Composições

[00125] A presente invenção também fornece composições compreendendo o construto de imunógeno peptídico de a-Syn divulgado. a. Composições de peptídeo

[00126] As composições contendo um construto de imunógeno peptídico de a-Syn divulgado podem estar na forma líquida ou sólida.

As composições líquidas podem incluir água, tampões, solventes, sais e/ou qualquer outro reagente aceitável que não altere as propriedades estruturais ou funcionais do construto de imunógeno peptídico de a- Syn. As composições de peptídeo podem conter um ou mais dos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn divulgadas. b. Composições farmacêuticas

[00127] A presente invenção também é direcionada às composições farmacêuticas contendo o construto de imunógeno peptídico de a-Syn divulgado.

[00128] As composições farmacêuticas podem conter veículos e/ou outros aditivos em um sistema de liberação farmaceuticamente aceitável. Em conformidade, as composições farmacêuticas podem conter uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um construto de imunógeno peptídico de a-Syn juntamente com veículo, adjuvante e/ou outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como diluentes, aditivos, agentes estabilizantes, conservantes, agentes solubilizantes, tampões, e semelhantes.

[00129] As composições farmacêuticas podem conter um ou mais adjuvantes que atuam para acelerar, prolongar ou intensificar a resposta imune do construto de imunógeno peptídico de a-Syn sem ter qualquer efeito antigênico específico propriamente dito. Os adjuvantes utilizados na composição farmacêutica podem incluir óleos, sais de alumínio, virossomas, fosfato de alumínio (por exemplo, ADJU- PHOSO), hidróxido de alumínio (por exemplo, ALHYDROGELO), liposina, — saponina, — esqualeno, L121, EmulsigenO, lipídeo monofosforila A (MPL), QOS21, ISA 35, ISA 206, ISASOV, ISA51, ISA 720, assim como os outros adjuvantes e emulsificantes.

[00130] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém Montanide'"Y ISA 51 (uma composição adjuvante de óleo composta de óleo vegetal e oleato de mannide para a produção de emulsões de água em óleo), TweenO 80 (também conhecido como: Polissorbato 80 ou Polioxietileno (20)) monooleato de sorbitano), um oligonucleotídeo CpG e/ou qualquer combinação destes. Em outras modalidades, a composição farmacêutica é uma emulsão água em óleo em água (isto é, wWo/w) com Emulsigen ou Emulsigen D como o adjuvante.

[00131] As composições farmacêuticas podem ser formuladas como liberação imediata ou para formulações de liberação controlada. Adicionalmente, as composições farmacêuticas podem ser formuladas para indução de imunidade sistêmica ou mucosa localizada através da captura de imunógenos e coadministração com micropartículas. Tais sistemas de liberação são facilmente determinados por uma pessoa de habilidade prática na técnica.

[00132] As composições farmacêuticas podem ser preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas. Veículos líquidos contendo o construto de imunógeno peptídico de a-Syn também podem ser preparados antes da injeção. A composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer modo de aplicação adequado, por exemplo, i.d., i.v., i.p., i.m., por via intranasal, por via oral, por via subcutânea, etc., e em qualquer dispositivo de liberação adequado. Em certas modalidades, a composição farmacêutica é formulada para administração intravenosa, subcutânea, intradérmica ou intramuscular. As composições farmacêuticas adequadas para outros modos de administração também podem ser preparadas, incluindo aplicações orais e intranasais.

[00133] As composições farmacêuticas podem ser formuladas como liberação imediata ou para formulações de liberação controlada. Adicionalmente, as composições farmacêuticas podem ser formuladas para indução de imunidade sistêmica ou mucosa localizada através da captura de imunógenos e coadministração com micropartículas. Tais sistemas de liberação são facilmente determinados por uma pessoa de habilidade prática na técnica.

[00134] As composições farmacêuticas também podem ser formuladas em uma forma de unidade de dosagem adequada. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém de cerca de 0,5 ug a cerca de 1 mg do construto de imunógeno peptídico de a-Syn por kg de peso corporal. As doses eficazes das composições farmacêuticas variam dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou animal, outros medicamentos administrados e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Geralmente, o paciente é um ser humano, mas mamíferos não humanos, incluindo mamíferos transgênicos, também podem ser tratados. Quando liberadas em doses múltiplas, as composições farmacêuticas podem ser convenientemente divididas em uma quantidade apropriada por forma unitária de dosagem. A dosagem administrada dependerá da idade, peso e saúde geral do indivíduo, como é bem conhecido nas técnicas terapêuticas.

[00135] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém mais do que um construto de imunógeno peptídico de a-Syn. Uma composição farmacêutica contendo uma mistura de mais do que um construto de imunógeno peptídico de a-Syn leva em consideração o aprimoramento sinérgico da imunoeficácia das construções. As composições farmacêuticas contendo mais do que uma construto de imunógeno peptídico de a-Syn podem ser mais eficazes em uma população genética maior devido a uma ampla cobertura de MHC classe Il, fornecendo assim uma resposta imune melhorada aos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn.

[00136] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém um construto de imunógeno peptídico de a-Syn selecionada das SEQ ID NOs: 107 a 108, 111 a 113, 115 a 147, assim como homólogos, análogos e/ou suas combinações. Nas modalidades específicas, as composições farmacêuticas contêm um construto de imunógeno peptídico de a-Syn selecionada das SEQ ID NOs: 107 a 108, 111 a 113, e qualquer combinação destas.

[00137] As composições farmacêuticas contendo um construto de imunógeno peptídico de a-Syn podem ser utilizadas para obter uma resposta imune e produzir anticorpos em um hospedeiro após a administração. c. Complexos imunoestimuladores

[00138] A presente invenção também é direcionada às composições farmacêuticas contendo um construto de imunógeno peptídico de a- Syn na forma de um complexo imunoestimulador com um oligonucleotídeo CpG. Tais complexos imunoestimuladores são especificamente adaptados para atuar como um adjuvante e como um estabilizante de imunógeno peptídico. Os complexos imunoestimuladores estão na forma de um particulado, que pode apresentar eficientemente o imunógeno peptídico de a-Syn às células do sistema imune para produzir uma resposta imune. Os complexos imunoestimuladores podem ser formulados como uma suspensão para administração parenteral. Os complexos imunoestimuladores também podem ser formulados na forma de emulsões w/o, como uma suspensão em combinação com um sal mineral ou com um polímero de formação de gel in situ para a liberação eficiente do imunógeno peptídico de a-Syn às células do sistema imunológico de um hospedeiro após a administração parenteral. Os complexos imunoestimuladores são capazes de produzir uma resposta imune em direção à folha É de a-Syn (por exemplo, Figuras 8A, 8B e 8C do Exemplo 13) com benefício protetor/terapêutico.

[00139] O complexo imunoestimulador estabilizado pode ser formado através da formação de um complexo de um construto de imunógeno peptídico de a-Syn com uma molécula aniônica, oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou suas combinações por meio da associação eletrostática. O complexo imunoestimulador estabilizado pode ser incorporado em uma composição farmacêutica como um sistema de liberação de imunógeno.

[00140] Em certas modalidades, o construto de imunógeno peptídico de a-Syn é projetada para conter uma parte catiônica que é carregada positivamente em um pH na faixa de 5,0 a 8,0. A carga líquida na parte catiônica do construto de imunógeno peptídico de a- Syn, ou mistura de construções, é calculada atribuindo uma carga +1 para cada lisina (K), arginina (R) ou histidina (H), uma carga -1 para cada ácido aspártico (D) ou ácido glutâmico (E) e uma carga de O para o outro aminoácido dentro da sequência. As cargas são somadas dentro da parte catiônica do construto de imunógeno peptídico de a- Syn e expressas como a carga média líquida. Um imunógeno peptídico adequado possui uma parte catiônica com uma carga positiva média líquida de +1. De preferência, o imunógeno peptídico possui uma carga líquida positiva na faixa que é maior que +2. Em algumas modalidades, a parte catiônica do construto de imunógeno peptídico de a-Syn é o espaçador heterólogo. Em certas modalidades, a parte catiônica do construto de imunógeno peptídico de a-Syn possui uma carga de +4 quando a sequência de espaçador for (a, e-N)Lys, e- N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 148).

[00141] Uma "molécula aniônica", como descrita nesta invenção, refere-se a qualquer molécula que é negativamente carregada em um pH na faixa de 5,0 a 8,0. Em certas modalidades, a molécula aniônica é um oligômero ou polímero. A carga líquida negativa no oligômero ou polímero é calculada mediante a designação de uma carga -1 para cada grupo fosfodiéster ou fosforoticato no oligômero. Um oligonucleotídeo aniônico adequado é uma molécula de DNA de fita simples com 8 a 64 bases de nucleotídeo, com o número de repetições do motivo CpG na faixa de 1 a 10. De preferência, as moléculas de DNA de fita simples imunoestimuladoras de CpG contêm de 18 a 48 bases de nucleotídeo, com o número de repetições do motivo CpG na faixa de 3 a 8.

[00142] Mais preferivelmente, o oligonucleotídeo aniônico é representado pela fórmula: 56' X'CGX? 3' em que C e G são não metilados; e X' é selecionado do grupo que consiste em A (adenina), G (guanina) e T (timina); e Xº é C (citosina) ou T (timina). Ou, o oligonucleotídeo aniônico é representado pela fórmula: 5' (Xº)-CG(X*) 3' em que C e G são não metilados; e Xº é selecionado do grupo que consiste em A, Tou G; e Xt é CouT.

[00143] O complexo imunoestimulador resultante está na forma de partículas com um tamanho tipicamente na faixa de 1 a 50 mícrons e é uma função de muitos fatores, incluindo a estequiometria da carga relativa e o peso molecular das espécies de interação. O complexo imunoestimulador particulado tem a vantagem de fornecer adjuvante e suprerregulação de respostas imunes específicas in vivo. Adicionalmente, o complexo imunoestimulador estabilizado é adequado para a preparação de composições farmacêuticas por vários processos, incluindo emulsões de água em óleo, suspensões de sal mineral e géis poliméricos. Anticorpos

[00144] A presente invenção também fornece anticorpos obtidos pelo construto de imunógeno peptídico de a-Syn.

[00145] Os fragmentos C-terminais de a-Syn tendo cerca de 10 a cerca de 25 resíduos de aminoácido da extremidade C-terminal de a- Syn, correspondendo à sequência próxima da glicina na posição de aminoácido 111 (G111) até próxima da asparagina na posição de aminoácido 135 (D135) da a-Syn de comprimento total, não são ou fracamente são imunogênicos por si próprios. No entanto, os construtos de imunógeno peptídico de ao&Syn divulgadas, compreendendo um fragmento C-terminal de a-Syn, epítopo Th heterólogo e espaçador heterólogo opcional, são capazes de provocar uma resposta imune e a produção de anticorpos quando administradas a um hospedeiro. A concepção dos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn pode quebrar a tolerância à própria a-Syn e provocar a produção de anticorpos específicos do sítio que reconhecem epítopos conformacionais não lineares.

[00146] Surpreendentemente, os anticorpos produzidos pelos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn não se ligam à hélice alfa natural do monômero de a-Syn em sua forma nativa. Em vez disso, os anticorpos produzidos pelos construtos de imunógeno peptídico de a- Syn reconhecem e se ligam à folha B desnaturada de a-Syn nas formas de monômeros, oligômeros e fibrilas. Adicionalmente, os anticorpos produzidos pelos construtos de imunógeno peptídico de a- Syn não se ligam às estruturas semelhantes de outras proteínas amiloidogênicas (isto é, AB1-42 e Tau441). Assim, o projeto específico do construto de imunógeno peptídico de a-Syn (compreendendo um fragmento C-terminal de a-Syn, epítopo Th heterólogo e espaçador heterólogo opcional) parece ter alterado a conformação dos fragmentos versáteis C-terminais de a-Syn para permitir conformação do tipo folha É.

[00147] Comparações extensas de anticorpos derivados de soros imunes de animais imunizados com os construtos de imunógeno peptídico de a-Syn foram feitas em muitos ensaios funcionais. Essas comparações demonstraram a capacidade dos anticorpos de se ligarem a a-Syn em células PC12 tratadas com fator de crescimento nervoso (NGF) com alta especificidade apenas para monômeros e oligêmeros de folha B de a-Syn e não para outras espécies de proteínas amiloidogênicas (ver o Exemplo 9).

[00148] Os anticorpos obtidos pelos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn surpreendentemente podem impedir a agregação de a-Syn (atividade antiagregação) e podem dissociar agregados pré- formados de a-Syn (atividade de desagregação). Adicionalmente, os anticorpos podem surpreendentemente reduzir a produção de TNF- alfa e IL6 induzida por células microgliais, o que indica que esses anticorpos podem efetivamente reduzir o agregado de a-Syn ou a ativação microglial mediada por fibrila. Estes anticorpos também foram observados de reduzir a neurodegeneração ativada tanto por agregados de a-Syn exógenos quanto por agregados de a-Syn endógenos em células de superexpressão de a-Syn. Além disso, tais anticorpos reconhecem e se ligam especificamente aos agregados ou fibrilas oligoméricos de a-Syn patológicos, mas não reagem à a-Syn não patológica. Especificamente, os anticorpos reagem com os corpos de Lewy a partir de seções do cérebro retiradas de pacientes com doença de Parkinson de alfa-sinucleinopatias, mas não com tecidos humanos normais.

[00149] Também foi surpreendentemente descoberto que dois modelos de camundongo de Parkinson (um modelo de camundongo induzido por MPP+ e um modelo de camundongo inoculado com a- Syn de fibrila) que foram administrados composições contendo os construtos de imunógeno peptídico de a-Syn (a) produziram anticorpos que eram altamente reativos cruzados com a folha É de a-Syn, (b) tiveram uma redução nos níveis séricos de a-Syn, (c) tiveram uma redução nos níveis oligoméricos de a-Syn no cérebro e (d) tiveram uma redução da neuropatologia levando à recuperação da função motora.

[00150] As respostas imunes resultantes de animais imunizados com construtos de imunógeno peptídico de a-Syn da presente invenção demonstraram a capacidade das construções de produzir anticorpos direcionados ao sítio potentes que são reativos com a folha B desnaturada de a-Syn nas formas de monômeros, oligômeros e fibrilas e não a estrutura de bobina aleatória da a-Syn C-terminal em sua forma nativa. Ensaios funcionais in vitro

[00151] Os anticorpos produzidos pelos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn podem ser utilizados em ensaios funcionais in vitro. Esses ensaios funcionais incluem, mas não são limitados a estes:

[00152] (a)ainibição in vitro da agregação recombinante de a-Syn; e desagregar agregados recombinantes de a-Syn pré-formados (ver o Exemplo 8);

[00153] (b) a inibição in vitro da agregação de a-Syn celular e dissociação de agregados de a-Syn pré-formados dentro das células (ver o Exemplo 9);

[00154] (c)aredução da secreção microglial de TNF-alfa e IL6 (ver o Exemplo 10);

[00155] (d)a redução da neurodegeneração ativada por agregados exógenos de a-Syn (ver o Exemplo 11);

[00156] (e) a redução da neurodegeneração em células de superexpressão de a-Syn (ver o Exemplo 12);

[00157] (f) a prova in vivo da eficácia no modelo de doença de Parkinson inoculada por a-Syn e induzida MPP+ fibrilar em camundongos que mostram redução no nível de a-Syn no soro, redução no nível de a-Syn oligomérica no cérebro, redução na neuropatologia e recuperação de atividades motoras (ver o Exemplo 15). Métodos

[00158] A presente invenção também é direcionada aos métodos para a produção e uso das construções, composições e composições farmacêuticas de imunógeno peptídico de a-Syn.

[00159] a Métodos para a fabricação do construto de imunógeno peptídico de a-Syn

[00160] Os construtos de imunógeno peptídico de a-Syn da presente invenção podem ser produzidos por métodos de síntese química bem conhecidos do especialista normalmente versado na área (ver, por exemplo, Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: À User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, p. 77). Os construtos de imunógeno peptídico de a-Syn podem ser sintetizados utilizando as técnicas automatizadas de Merrifieldd da síntese em fase sólida com o a-NH>2 protegido pela química t-Boc ou F- moc utilizando aminoácidos protegidos por cadeia lateral em, por exemplo, um Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A ou

431. A preparação de construtos de imunógeno peptídico de a-Syn compreendendo peptídeos de biblioteca combinatória para epítopos Th pode ser executada através do fornecimento de uma mistura de aminoácidos alternativos para acoplamento em uma determinada posição variável.

[00161] Após a montagem completa do construto de imunógeno peptídeo de a-Syn desejada, a resina pode ser tratada de acordo com procedimentos padrão para separar o peptídeo da resina e os grupos funcionais nas cadeias laterais de aminoácido podem ser desbloqueados. O peptídeo livre pode ser purificado por HPLC e caracterizado bioquimicamente, por exemplo, através da análise de aminoácido ou através de sequenciamento. Os métodos de purificação e caracterização de peptídeos são bem conhecidos da pessoa de habilidade prática na técnica.

[00162] A qualidade dos peptídeos produzidos por esse processo químico pode ser controlada e definida e, como um resultado, a reprodutibilidade dos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn, a imunogenicidade e o rendimento podem ser garantidos. A descrição detalhada da fabricação do construto de imunógeno peptídico de a- Syn através da síntese de peptídeo em fase sólida é mostrada no Exemplo 1.

[00163] A faixa na variabilidade estrutural que leva em conta a retenção de uma atividade imunológica planejada foi observada de ser muito mais adaptável do que a faixa na variabilidade estrutural que Leva em conta a retenção de uma atividade medicamentosa específica através de um fármaco de molécula pequena ou as atividades desejadas e as toxicidades indesejadas encontradas em moléculas grandes que são coproduzidas com fármacos biologicamente derivados. Assim, os análogos peptídicos, projetados de modo intencional ou inevitavelmente produzidos por erros do processo sintético como uma mistura de subprodutos da sequência de deleção que possuem propriedades cromatográficas e imunológicas semelhantes ao peptídeo planejado, são frequentemente tão eficazes quanto uma preparação purificada do peptídeo desejado. Misturas de análogos projetados e análogos não planejados são eficazes contanto que um procedimento de QC discernente seja desenvolvido para monitorar tanto o processo de fabricação quanto o processo de avaliação do produto, a fim de garantir a reprodutibilidade e a eficácia do produto final que emprega esses peptídeos.

[00164] Os construtos de imunógeno peptídico de a-Syn também podem ser feitas utilizando a tecnologia de DNA recombinante, incluindo moléculas de ácido nucleico, vetores e/ou células hospedeiras. Como tais, as moléculas de ácido nucleico que codificam o construto de imunógeno peptídico de a-Syn e seus análogos imunologicamente funcionais também são incluídas pela presente invenção como parte da presente invenção. Da mesma forma, vetores,

incluindo vetores de expressão, compreendendo moléculas de ácido nucleico, assim como células hospedeiras contendo os vetores, também são incluídos pela presente invenção como parte da presente invenção.

[00165] Várias modalidades exemplares também abrangem métodos para produzir o construto de imunógeno peptídico de a-Syn e análogos imunologicamente funcionais das construções imunológicas peptídicas derivadas de fragmentos de a-Syn G111-D135. Por exemplo, os métodos podem incluir uma etapa de incubar uma célula hospedeira contendo um vetor de expressão contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um construto de imunógeno peptídico de a-Syn e/ou seu análogo imunologicamente funcional sob tais condições em que o peptídeo e/ou o análogo é expresso. Os imunógenos peptídicos sintéticos mais longos podem ser sintetizados por técnicas de DNA recombinante bem conhecidas. Tais técnicas são fornecidas em manuais padrão bem conhecidos com protocolos detalhados. Para construir um gene que codifica um peptídeo desta invenção, a sequência de aminoácido é trasladada inversamente para obter uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácido, preferivelmente com códons que são ideais para o organismo no qual o gene deve ser expresso. Logo depois, um gene sintético é produzido tipicamente através da sintetização de oligonucleotídeos que codificam o peptídeo e quaisquer elementos reguladores, se necessário. O gene sintético é inserido num vetor de clonagem adequado e transfectado para uma célula hospedeira. O peptídeo é então expresso sob condições adequadas apropriadas para o sistema de expressão e hospedeiro selecionados. O peptídeo é purificado e caracterizado pelos métodos padrão. b. Métodos para a fabricação de complexos imunoestimuladores

[00166] Várias modalidades exemplares também abrangem métodos “para produzir os complexos imunoestimuladores compreendendo construtos de imunógeno peptídico de a-Syn e molécula de oligodesoxinucleotideo CpG (ODN). Os complexos imunoestimuladores estabilizados (ISC) são derivados de uma parte catiônica do construto de imunógeno peptídico de a-Syn e de uma molécula polianiônica de ODN CpG. O sistema de automontagem é acionado pela neutralização eletrostática da carga. A estequiometria da relação de carga molar da parte catiônica do construto de imunógeno peptídico de a-Syn para o oligôêômero aniônico determina a extensão da associação. A associação eletrostática não covalente do construto de imunógeno peptídico de a-Syn e ODN CpG é um processo completamente reprodutível. O complexo imunoestimulador de peptídeo/ODN CpG se agrega, o que facilita a apresentação às células apresentadoras de antígeno "profissionais" (APC) do sistema imunológico, aumentando assim ainda mais a imunogenicidade dos complexos. Esses complexos são facilmente caracterizados para o controle de qualidade durante a fabricação. O peptídeo/ISC CpG é bem tolerado in vivo. Este novo sistema particulado compreendendo construtos de imunógeno peptídico derivadas de fragmento de ODN CpG e a-Syn G111-D135 foi projetado para levar vantagem da mitogenicidade generalizada de células B associada ao uso de ODN CpG, e, no entanto, promovem respostas equilibradas do tipo Th-1/Th-

2.

[00167] O ODN CpG nas composições farmacêuticas divulgadas é 100% ligado ao imunógeno em um processo mediado pela neutralização eletrostática da carga oposta, resultando na formação de partículas do tamanho mícron. A forma particulada leva em conta uma dosagem significativamente reduzida de CpG a partir do uso convencional de adjuvantes de CpG, menos potencial para respostas imunes inatas adversas e facilita as vias alternativas de processamento de imunógeno, incluindo as células apresentadoras de antígeno (APC). Consequentemente, essas formulações são inovadoras conceitualmente e oferecem vantagens potenciais ao promover a estimulação de respostas imunes através de mecanismos alternativos. c. Métodos para a fabricação de composições farmacêuticas

[00168] Várias modalidades exemplares também abrangem composições farmacêuticas contendo construtos de imunógeno peptídico de a-Syn. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas empregam água em emulsões de óleo e em suspensão com sais minerais.

[00169] Para que uma composição farmacêutica seja utilizada por uma grande população e com a prevenção da agregação de a-Syn também fazendo parte do objetivo para administração, a segurança se torna outro fator importante a ser considerado. Apesar do uso de emulsões de água em óleo em seres humanos para muitas formulações em ensaios clínicos, o alume continua sendo o principal adjuvante para uso em formulações devido à sua segurança. O alume ou seus sais minerais fosfato de alumínio (ADJUPHOS) são, portanto, frequentemente utilizados como adjuvante na preparação de aplicações clínicas. d. Métodos que utilizam composições farmacêuticas

[00170] A presente invenção também inclui métodos de uso de composições farmacêuticas contendo construtos de imunógeno peptídico de a-Syn.

[00171] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas contendo construtos de imunógeno peptídico de a-Syn podem ser utilizadas para:

[00172] (a)inibiçãoda agregação de a-Syn em um hospedeiro;

[00173] (b) indução de desagregado de agregados de a-Syn pré-

formados em um hospedeiro;

[00174] (c)redução da secreção microglial de TNF-alfa e IL6 em um hospedeiro;

[00175] (d) redução da neurodegeneração ativada por agregados exógenos de a-Syn em um hospedeiro;

[00176] (e) redução da neurodegeneração em células de superexpressão de a-Syn;

[00177] (f)redução dos níveis séricos de a-Syn em um hospedeiro;

[00178] (g)redução do nível de a-Syn oligomérica no cérebro de um hospedeiro;

[00179] (h)redução da neuropatologia e recuperação das atividades motoras em um hospedeiro; e similar.

[00180] Os métodos acima compreendem a administração de uma composição — farmacêutica — compreendendo uma quantidade farmacologicamente eficaz de um construto de imunógeno peptídico de a-Syn a um hospedeiro com sua necessidade. Modalidades Específicas

[00181] As modalidades específicas da presente invenção incluem, mas não são limitados a estas, as seguintes:

[00182] (1) Um construto de imunógeno peptídico de alfa-sinucleína (a-Syn) compreendendo:

[00183] um epítopo de células B que compreende cerca de 10 a cerca de 25 resíduos de aminoácido de um fragmento C-terminal de a- Syn que corresponde a cerca do aminoácido G111 a cerca do aminoácido D135 da SEQ ID NO: 1;

[00184] um epítopo auxiliar T compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 70 a 98;:e

[00185] um espaçador heterólogo opcional selecionado do grupo que consiste em um aminoácido, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (a, e-N)Lys,

e e-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 148),

[00186] em que o epítopo de células B está covalentemente ligado ao epítopo T auxiliar diretamente ou através do espaçador heterólogo opcional.

[00187] (2) O construto de imunógeno peptídico de a-Syn de (1), em que o epítopo de células B é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 12 a 15, 17 e 49 a 63.

[00188] (3) O construto de imunógeno peptídico de a-Syn de (1), em que o epítopo auxiliar T é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 81, 83 e 84.

[00189] (4) O construto de imunógeno peptídico de a-Syn de (1), em que o espaçador heterólogo opcional é (a, e-N)Lys ou e-N-Lys-Lys-Lys- Lys (SEQ ID NO: 148).

[00190] (5) O construto de imunógeno peptídico de a-Syn de (1), em que o epítopo auxiliar T está covalentemente ligado ao terminal amino do epítopo de células B.

[00191] (6) O construto de imunógeno peptídico de a-Syn de (1), em que o epítopo auxiliar T está covalentemente ligado ao terminal amino do epítopo de células B através do espaçador heterólogo opcional.

[00192] (7) O construto de imunógeno peptídico de a-Syn de (1) que compreende a seguinte fórmula: (Th) (A)n(fragmento C-terminal de a-Syn)—X ou (fragmento C-terminal a-Syn)—(A))—>HTh)n=X

[00193] emque

[00194] Théo epítopoT auxiliar;

[00195] Aéoespaçador heterólogo;

[00196] (fragmento C-terminal de a-Syn) é o epítopo de células B;

[00197] Xéuma-COOH ou a-CONH7? de um aminoácido;

[00198] médel1acercade4;e

[00199] nédel1a cerca de 10.

[00200] (8) O construto de imunógeno peptídico de a-Syn de (1), que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 107, 108, 111 a 113 e 115 a 147.

[00201] (9) O construto de imunógeno peptídico de a-Syn de (1), que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 107, 108 e 111 a 113.

[00202] (10) Uma composição compreendendo o construto de imunógeno peptídico de a-Syn de (1).

[00203] (11) Uma composição compreendendo mais do que um construto de imunógeno peptídico de a-Syn de (1).

[00204] (12) A composição de (11), em que os construtos de imunógeno peptídico de a-Syn possuem sequências de aminoácido das SEQ ID NOs: 112 e 113.

[00205] (13) Uma composição farmacêutica compreendendo o construto de imunógeno peptídico de a-Syn de (1) e um veículo e/ou adjuvante de liberação farmaceuticamente aceitável.

[00206] (14) A composição farmacêutica de (13), em que

[00207] a o construto de imunógeno peptídico de a-Syn é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 107, 108, 111 a 113e 115a 147; e

[00208] b.o adjuvante é um sal mineral de alumínio selecionado do grupo que consiste em AI(OH)3 ou AIPO2.

[00209] (15) A composição farmacêutica de (13), em que

[00210] a o construto de imunógeno peptídico de a-Syn é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 107, 108, 111 a 113e 115a 147; e

[00211] b. o construto de imunógeno peptídico de a-Syn é misturada com um oligodesoxinucleotídeo CpG (ODN) para formar um complexo imunoestimulador estabilizado.

[00212] (16) Um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao epítopo que especificamente se liga ao epítopo de células B do construto de imunógeno peptídico de a-Syn de (1).

[00213] (17) O anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao epítopo de acordo com (16) ligado ao construto de imunógeno peptídico de a-Syn.

[00214] (18) Um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao epítopo que especificamente se liga ao epítopo de células B do construto de imunógeno peptídico de a-Syn de (9).

[00215] (19) Uma composição que compreende o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao epítopo de acordo com (16).

[00216] (20) Uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao epítopo, de acordo com (18).

[00217] (21) Acomposição de (20), compreendendo uma mistura de

[00218] a um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao epítopo que especificamente se liga ao epítopo de células B da SEQ ID NO: 112; e

[00219] b. um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao epítopo que especificamente se liga ao epítopo de células B da SEQ ID NO: 113.

[00220] (22) Um método de produção de anticorpos que reconhecem a a-Syn em um hospedeiro compreendendo a administração ao hospedeiro de uma composição que compreende o imunógeno peptídico de a-Syn de (1) e um veículo e/ou adjuvante de liberação.

[00221] (23) Um método para inibir a agregação de a-Syn em um animal que compreende a administração de uma quantidade farmacologicamente eficaz do imunógeno peptídico de a-Syn de (1) ao animal.

[00222] (24) Um método para reduzir a quantidade de agregados de a-Syn em um animal, compreendendo a administração de uma quantidade farmacologicamente eficaz do imunógeno peptídico de a- Syn de (1) ao animal.

[00223] (25) Método para identificar agregados de a-Syn de diferentes tamanhos em uma amostra biológica que compreende:

[00224] a a exposição da amostra biológica ao anticorpo ou seu fragmento de ligação ao epítopo de acordo com (16) sob condições que permitem que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao epítopo se ligue aos agregados de a-Syn; e

[00225] b.adetecção da quantidade do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao epítopo ligado aos agregados de a-Syn na amostra biológica.

[00226] Uma descrição detalhada dos procedimentos utilizados é fornecida nos seguintes Exemplos. EXEMPLO 1

SÍNTESE DE PEPTÍDEOS RELACIONADOS COM A ALFA

SINUCLEÍNA E PREPARAÇÃO DE SUAS FORMULAÇÕES a. Síntese de fragmentos C-terminais de a-Syn

[00227] Métodos para a sintetização de fragmentos C-terminais de a-Syn projetados que foram incluídos no esforço de desenvolvimento de construtos de imunógeno peptídico de a-Syn São descritos. Os peptídeos foram sintetizados em pequenas quantidades que são úteis para ensaios sorológicos, estudos piloto e de campo de laboratório, assim como grandes quantidades (em quilogramas), que são úteis para a produção industrial/comercial de composições farmacêuticas. Um grande repertório de peptídeos antigênicos relacionados com a a- Syn tendo sequências com comprimentos de aproximadamente 10 a 40 aminoácidos foi projetado para a triagem e seleção dos construtos peptídicos mais ideais para uso em um construto de imunógeno peptídico de a-Syn eficaz.

[00228] a-Syn (SEQ ID NO: 1) e B-Syn (SEQ ID NO: 2) de comprimento total representativos, segmentos de a-Syn tais como peptídeos a-Syn111-132, A-SyN126-135, 10-mer, etc., empregados para o mapeamento de epítopos em vários ensaios sorológicos são identificados na Tabela 1 (SEQ ID NOs: 1 e 3 a 69). Os fragmentos de a-Syn selecionados foram transformados em construtos de imunógeno peptídico de a-Syn através de por ligação sintética a um epítopo de célula T auxiliar (Th) cuidadosamente projetado derivado de proteínas patogênicas incluindo a proteína de fusão do vírus do sarampo (MVF), a proteína do antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) influenza, Clostridum tetani e vírus Epstein-Barr (EBV) identificados na Tabela 2 (SEQ ID NOs: 70 a 98). Os epítopos Th foram utilizados em uma sequência única (SEQ ID NOs: 70 a 78 e 83 a 98) ou em uma biblioteca combinatória (SEQ ID NOs: 79 a 82) para aumentar a imunogenicidade dos seus respectivos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn.

[00229] Os construtos de imunógeno peptídico de a-Syn representativos selecionados de mais de 100 construtos peptídicas são identificados na Tabela 3 (SEQ ID NOs: 99 a 147). Todos os peptídeos utilizados para estudos de imunogenicidade ou testes sorológicos relacionados para detecção e/ou medição de anticorpos anti-a-Syn foram sintetizados em pequena escala utilizando a química F-moc por sintetizadores de peptídeo dos Applied BioSystems Models 430A, 431 e/ou 433. Cada peptídeo foi produzido por uma síntese independente em um suporte de fase sólida, com proteção de F-moc no N-terminal e grupos de proteção de cadeia lateral de aminoácidos trifuncionais. Os peptídeos completos foram clivados a partir do suporte sólido e os grupos de proteção de cadeia lateral foram removidos com ácido trifluoroacético a 90% (TFA). As preparações de peptídeo sintéticas foram avaliadas por Matrix-Assisted Laser

Desorption/lonization-Time-Of-Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry para garantir o teor correto de aminoácido.

Cada peptídeo sintético também foi avaliado por HPLC de fase reversa (RP-HPLC) para confirmar o perfil de síntese e a concentração da preparação.

Apesar do controle rigoroso do processo de síntese (incluindo o monitoramento gradual da eficiência do acoplamento), análogos de peptídeo também foram produzidos devido a eventos sem propósito durante os ciclos de alongamento, incluindo inserção, exclusão, substituição e terminação prematura de aminoácidos.

Assim, as preparações sintetizadas incluem tipicamente múltiplos análogos de peptídeo juntamente com o peptídeo alvo.

Apesar da inclusão de tais análogos de peptídeo sem propósito, as preparações peptídicas sintetizadas resultantes foram, no entanto, adequadas para uso em aplicações imunológicas, incluindo imunodiagnóstico (como antígenos de captura de anticorpos) e composições farmacêuticas (como imunógenos de peptídeo). Tipicamente, esses análogos de peptídeo, projetados intencionalmente ou gerados através de processo sintético como uma mistura de subprodutos, são frequentemente tão eficazes quanto uma preparação purificada do peptídeo desejado, contanto que um procedimento de QC discernente seja desenvolvido para monitorar tanto o processo de fabricação quanto o processo de avaliação do produto para garantir a reprodutibilidade e eficácia do produto final que emprega esses peptídeos.

Sínteses de peptídeo em grande escala nas quantidades de centenas de quilograma foram conduzidas em um sintetizador de peptídeo automatizado personalizado UBI2003 ou similar na escala de 15 mmol a 50 mmol.

Para os ingredientes ativos utilizados na composição farmacêutica final para ensaios clínicos, as construtos de peotídeo de a-Syn foram purificadas por RP-HPLC preparativa sob um gradiente de eluição superficial e caracterizadas por espectrometria de massa MALDI-TOF, análise de aminoácidos e

RP-HPLC para pureza e identidade. b. Preparação de composições contendo construtos de imunógeno peptídico de a-Syn

[00230] As formulações que empregam água em emulsões de óleo e em suspensão com sais minerais foram preparadas. Para que uma composição farmacêutica projetada para ser utilizada por uma grande população e com a prevenção também fazendo parte do objetivo da administração, a segurança se torna outro fator importante a ser considerado. Apesar do uso de emulsões de água em óleo em seres humanos para muitas composições farmacêuticas em ensaios clínicos, o alume continua sendo o principal adjuvante para uso em composição farmacêutica devido à sua segurança. O alume ou seus sais minerais ADJUPHOS (fosfato de alumínio) são, portanto, frequentemente utilizados como adjuvantes na preparação para aplicações clínicas.

[00231] Resumidamente, as formulações especificadas em cada um dos grupos de estudo descritos abaixo geralmente continham todos os tipos de projetos dos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn. Mais de 100 construtos de imunógeno peptídico de a-Syn projetados foram inicialmente avaliados em porquinhos da índia quanto à sua imunogenicidade relativa com o peptídeo de a-Syn correspondente representativo do peptídeo de epítopos B do imunógeno e também para avaliação das reatividades cruzadas sorológicas entre os peptídeos homólogos variáveis por ensaios ELISA com placas revestidas com diferentes peptídeos selecionados daqueles com SEQ ID NOs: 1 a 153.

[00232] Os construtos de imunógeno peptídico de a-Syn foram preparados (i) em uma emulsão de água em óleo com Seppic Montanide'" ISA 51 como o óleo aprovado para uso humano, ou (ii) misturadas com sais minerais ADJUPHOS (fosfato de alumínio) ou ALHYDROGEL (Alume), em quantidades variáveis de construtos peptídicas, conforme especificado. As composições foram tipicamente preparadas através da dissolução dos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn em água ao redor de 20 a 800 pg/ml e formuladas com Montanide'"Y ISA 51 em emulsões de água em óleo (1:1 em volume) ou com sais minerais ou ALHYDROGEL (Alume) (1:1 em volume). As composições foram mantidas na temperatura ambiente durante cerca de 30 min e misturadas em vórtice durante cerca de 10 a 15 segundos antes da imunização. Alguns animais foram imunizados com 2 a 3 doses de uma composição específica, que foram administradas no tempo O (inicial) e 3 semanas após a imunização inicial (wpi) (reforço), opcionalmente 5 ou 6 wpi para um segundo reforço, através da via intramuscular. Estes animais imunizados foram então testados com peptídeos de epítopo B selecionados para avaliar a imunogenicidade dos vários construtos de imunógeno peptídico de a-Syn presentes na formulação, assim como sua reatividade cruzada com peptídeos ou proteínas alvo relacionados. Esses construtos de imunógeno peptídico de a-Syn com imunogenicidade potente na triagem inicial em porquinhos da índia foram posteriormente testadas em emulsões de água em óleo, sais minerais e formulações à base de alume em primatas com relação aos regimes de dosagem durante um período especificado conforme determinado por protocolos de imunização.

[00233] Somente os construtos de imunógeno peptídico de a-Syn mais promissoras foram avaliados extensivamente antes de serem incorporadas nas formulações finais para estudos de imunogenicidade, duração, toxicidade e eficácia em estudos pré-clínicos guiados por GLP em preparação para submissão de uma solicitação da Investigational New Drug e ensaios clínicos em pacientes com sinucleinopatias.

EXEMPLO 2

PREPARAÇÃO DA PROTEÍNA ALFA SINUCLEINA RECOMBINANTE

[00234] A clonagem do gene de a-Syn no vetor pGEX-4T1 foi descrita anteriormente em Neurotoxicology and teratology 2004, 26 (3): 397-406. A sequência alvo (SEQ ID NO: 1) foi inserida no vetor pGEX-4T1 entre os sítios de restrição BamHlI e Xhol. O fragmento foi gerado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando a polimerase de DNA KAPA HIFi (Kapa Biosystems, Inc., Woburn, MA, USA). As sequências iniciadoras são como se segue: iniciador direto, 5'-cgggatccegatgtatitatagaaaggtetgag-3' (SEQ ID NO: 149); iniciador reverso, 5'-ggaattcegatgtatttatagaaagatetgag-3' (SEQ ID NO: 150). À condição de PCR foi como se segue: desnaturação a 94 “C durante 1 minuto seguida de 30 ciclos de desnaturação a 94 “CC durante 15s, recozimento a 60 C durante 30s e extensão a 68 CO durante 2 minutos, e concluída após 5 min adicionais a 68 CC. A mutagênese direcionadas ao sítio de a-Syn A53T foi executada utilizando o Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (New England BioLabs, Beverly, MA, USA). As sequências iniciadoras para a a-Syn mutante são como se segue: iniciador direto, 5'-tcatggtataaccaccegttgcag-3' (SEQ ID NO: 151); iniciador reverso, 5'-accacgccttctttagtttta-3' (SEQ ID NO: 152).

[00235] A a-Syn clonada no vetor pGEX-4T1 GST foi transformada em E. coli BL21 (DE3) para expressão da proteína. A E. coli foi cultivada no caldo LB a 37 C e B-D-1-tiogalactopiranosídeo de isopropila (IPTG) foi adicionado em uma concentração final de 4 mM quando OD600 atingiu 0,8. Após 4 h de incubação, as células foram coletadas por centrifugação em 5.000 x g durante 20 min a 4 O. As células coletadas foram colocadas novamente em suspensão em PBS, divididas por aplicação de energia sonora em gelo e depois centrifugadas em 5.000 x g durante 20 min. A fração de sobrenadante foi carregada em uma coluna Glutathione Sepharose-4B (GE Healthcare) equilibrada com PBS. Após uma lavagem de três vezes com PBS, 1 ml de trombina (20 U/ml em PBS) foi adicionado para digestão durante a noite a 4 (C para liberar GST da proteína de fusão. A aSyn livre de marca foi então eluída, com a trombina subsequentemente removida pela coluna HiTrap Benzamidine FF (GE Healthcare). A a-Syn submetida à diálise foi congelada imediatamente a -80 T. A a-Syn purificada com 14kDa MW foi identificada por western blotting com anticorpo anti-a-Syn (1:2000, Millipore, que direciona a-Syn111-131) após separação por SDS-PAGE 10%. EXEMPLO 3

ENSAIOS SEROLÓGICOS E REAGENTES

[00236] Ensaios sorológicos e reagentes para avaliar a imunogenicidade funcional dos construtos peptídicas sintéticas e suas formulações são descritos em detalhes abaixo. a. Ensaios ELISA baseados em peptídeo para análise da especificidade de anticorpos

[00237] Os ensaios ELISA para avaliar amostras de soro imune descritos nos seguintes Exemplos foram desenvolvidos e descritos abaixo. Os reservatórios das placas de 96 reservatórios foram revestidos individualmente durante 1 hora a 37 (C com 100 ul de fragmentos de a-Syn do peptídeo alvo A85-A140, A91-A140, A101- A140, A111-A140, D121-A140, E126-A140, K97-D135, G101-D135, G111-D135, D121-D135, E123-D135, E126-D135, G101-132 e G111- G132 (SEQ ID NOs: 4 a 17), em 2 ug/ml (a não ser que de outra maneira mencionada), em tampão de NaHCO3 10mM, pH 9,5 (a não ser que de outra maneira mencionada). b. Avaliação da reatividade do anticorpo em relação ao peptídeo Th através de testes ELISA baseados em peptídeo Th

[00238] Os reservatórios revestidos com peptídeo (SEQ ID Nos: 70 a 98) foram incubados com 250 ul de 3% em peso de gelatina em PBS a 37 *C durante 1 hora para bloquear os sítios de | igação de proteínas não específicos, seguidos de três lavagens com PBS contendo 0,05% em volume de TWEENQO 20 e secados. Os soros a serem analisados foram diluídos 1:20 (salvo indicação em contrário) com PBS contendo 20% em volume de soro normal de cabra, 1% em peso de gelatina e 0,05% em volume de TWEENG 20. Cem microlitros (100 ul) das amostras diluídas (por exemplo, soro, plasma) foram adicionados a cada um dos reservatórios e deixados reagir durante 60 minutos a

37. Os reservatórios foram então lavados seis vez es com 0,05% em volume de TWEENQO 20 em PBS, a fim de remover anticorpos não ligados. Anti-lgG de cabra específica de espécies conjugadas com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (por exemplo, camundongo, porquinho da índia ou ser humano), foi utilizada como um marcador marcado para se ligar ao complexo de antígeno de anticorpo/peptídeo formado em reservatórios positivos. Cem microlitros do anti-lgG de cabra marcado com peroxidase, em uma diluição ótima pré-titulada e em 1% em volume de soro normal de cabra com 0,05% em volume de TWEENÔO 20 em PBS, foram adicionados em cada reservatório e incubados a 37 *C durante mais 30 minutos. Os reser vatórios foram lavados seis vezes com 0,05% em volume de TWEENÔO 20 em PBS para remover o anticorpo não ligado e reagiram com 100 ul da mistura de substrato contendo 0,04% em peso de 3, 3, 5, 5- tetrametilbenzidina (TMB) e 0,12% em volume de peróxido de hidrogênio em tampão de citrato de sódio durante mais 15 minutos. Esta mistura de substrato foi utilizada para detectar o marcador de peroxidase através da formação de um produto colorido. As reações foram interrompidas pela adição de 100 ul de H2SOs 1,0 M e absorbância em 450 nm (A450) determinada. Para a determinação dos títulos de anticorpos dos animais imunizados que receberam os vários imunógenos peptídicos derivados de a-Syn, diluições em série de 10 vezes de soros de 1:100 a 1:10.000 foram testadas, e o título de um soro testado, expresso como Logi1o, foi calculado por análise de regressão linear do A4so com o ponto de corte A«so ajustado em 0,5. c. Análise da especificidade fina e mapeamento de epítopos para os fragmentos de a-Syn por testes ELISA baseados em peptídeo por agrupamento do epítopo de células B de 10 meros.

[00239] As análises de especificidade fina de anticorpos anti-a-Syn em hospedeiros imunizados foram determinadas por mapeamento de epítopos. Resumidamente, os reservatórios das placas de 96 reservatórios foram revestidos com peptídeos de a-Syn 10 mer individuais (SEQ ID NOs: 18 a 69) em 0,5 ug por 0,1 ml por reservatório e depois 100 ul de amostras de soro (diluição 1:100 em PBS) foram incubados em reservatórios de placas de 10 meros em duplicata, seguindo as etapas do método de ELISA de anticorpo descrito acima. O epítopo de células B da construto de imunógeno peptídico de a-Syn e as análises de especificidade fina relacionadas dos anticorpos anti-a-Syn do soro imune em hospedeiros imunizados foram testadas também com os peptídeos de a-Syn correspondentes (SEQ ID No: 99, 102, 108, 110, 112, 113) ou seu fragmento sem o espaçador e as sequências Th, ou com B-Syn (SEQ ID NO: 153) para reatividade adicional e confirmação de especificidade. d. Avaliação de imunogenicidade

[00240] As amostras de soro pré-imunes e imunes dos animais foram coletadas de acordo com os protocolos experimentais de imunização e aquecidas a 56 CC durante 30 minutos para tornar inativos os fatores de complemento do soro. Após a administração da composição farmacêutica, amostras de sangue foram obtidas de acordo com os protocolos e sua imunogenicidade contra sítios alvos específicos avaliados. Os soros diluídos em série foram testados e os títulos positivos foram expressos como Logi1o da diluição recíproca. À imunogenicidade de uma composição farmacêutica particular é avaliada por sua capacidade de obter resposta de anticorpos de células B de alto título direcionada contra a especificidade de epítopo desejada dentro do antígeno alvo, enquanto mantém uma reatividade de anticorpo baixa a desprezível em relação aos "epítopos de células T auxiliares" empregados para fornecer aprimoramento das respostas desejadas das células B.

[00241] e. Imunoensaio para o nível de a-Syn em soros imunológicos de camundongo

[00242] Os níveis séricos de a-Syn em camundongos que receberam imunógenos peptídicos derivados de a-Syn foram medidos por um ELISA de combinação (Cloud-clon, SEB222Mu) utilizando anticorpos anti-a-Syn como anticorpo de captura e anticorpo anti-a- Syn marcado com biotihna como anticorpo de detecção. Resumidamente, o anticorpo foi imobilizado nas placas de 96 reservatórios em 100 ng/reservatório em tampão de revestimento (Na2CO;3 15 MM, NaHCO;3 35 mM, pH 9,6) e incubado a 4 (C durante a noite. Os reservatórios revestidos foram bloqueados por 200 ul/reservatório de diluentes de ensaio (BSA 0,5%, TWEENG-20 0,05%, ProClin 300 0,02% em PBS) na temperatura ambiente durante 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com 200 ul/reservatório de tampão de lavagem (PBS com TWEENG-20 0,05%). A a-Syn recombinante purificada foi utilizada para gerar uma curva padrão (faixa de 156 a 1250 ng/ml por diluição em série 2 vezes) no diluente de ensaio com soros de camundongo a 5%. 50 ul dos soros diluídos (1:20) e os padrões foram adicionados aos reservatórios revestidos. A incubação foi realizada na temperatura ambiente durante 1 hora. Todos os reservatórios foram aspirados e lavados 6 vezes com 200 ul/reservatório de tampão de lavagem. A a-Syn humana capturada foi incubada com 100 ul de solução de anticorpo de detecção (50 ng/ml de HP6029 marcado com biotina em diluente de ensaio) na temperatura ambiente durante 1 hora. Depois, a biotina-HP6029 ligadas foi detectada utilizando estreptavidina poli-HRP (diluição 1:10.000, Thermo Pierce) durante 1 hora (100 ul/reservatório). Todos os reservatórios foram aspirados e lavados 6 vezes com 200 ul/reservatório de tampão de lavagem e a reação foi interrompida pela adição de 100 ul/reservatórios de H2SO4 1M. A curva padrão foi criada através do uso do software SoftMax Pro (Molecular Devices) para gerar um ajuste de curva logística de quatro parâmetros e utilizado para calcular as concentrações de a-Syn em todas as amostras testadas. Os testes t de Student foram utilizados para comparar os dados mediante o uso do software Prism. f. Preparação de agregados de a-Syn com a-Syn recombinante

[00243] Para preparar a a-Syn agregada, a a-Syn do tipo silvestre ou submetida à mutação com A53T purificada [0,1 ug/ul em 100 ul de tampão de agregação PBS/KCI (MgCl2 2,5 mM, HEPES 50 mM e KCI 150 mM em 1 x PBS, pH 7,4)] foi incubada a 37 C em tubos Eppendorf de 1,5 ml durante 7 dias em um Thermomixer (Eppendorf) sem agitação. A a-Syn agregada foi imediatamente congelada a -80 C para uso posterior. ga. Purificação de anticorpos anti-a-Syn

[00244] Os anticorpos anti-a-Syn foram purificados a partir de soros coletados em 3 a 15 semanas após a injeção (WPI) de porquinhos da Índia imunizados com construtos de imunógeno peptídico de a-Syn contendo peptídeos de diferentes sequências (SEQ ID NOs: 99 a 121) mediante o uso de um coluna de afinidade (Thermo Scientific, Rockford). Resumidamente, após o equilíbrio do tampão (fosfato 0,1 M e cloreto de sódio 0,15 M, pH 7,2), 400 ul de soro foram adicionados à coluna Nab Protein G Spin, seguidos pela mistura total durante 10 min e centrifugação em 5800 x g durante 1 min. A coluna foi lavada com tampão de ligação (400 ul) durante três vezes. Subsequentemente, o tampão de eluição (400 ul, glicina 0,1 M, pH 2,0) foi adicionado na coluna de rotação para eluir os anticorpos após a centrifugação em 5800 x g durante 1 min. Os anticorpos eluídos foram misturados com tampão de neutralização (400 ul, 0,1 M Tris pH 8,0) e as concentrações desses anticorpos purificados foram medidas utilizando Nan-Drop em OD280, com BSA (albumina de soro bovino) como padrão. h. Especificidade de anticorpos anti-a-Syn purificados de antissoros de porquinhos da índia imunizados com diferentes construtos de imunógeno peptídico de a-Syn de diferentes tamanhos

[00245] O Western blot foi utilizado para rastrear anticorpos anti-a- Syn purificados a partir de antissoros de porquinho da índia imunizados com diferentes construtos de imunógeno peptídico de a- Syn para a especificidade de ligação ao complexo molecular de a-Syn de tamanhos diferentes. 20 uM de a-Syn foram separados em Tris- glicina SDS-PAGE 12% e transferidos para a membrana de nitrocelulose (NC) antes do tratamento de reticulação fotoinduzida (PICUP). A membrana foi incubada com anticorpos anti-a-Syn purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia em 1 ug/ml e depois incubada com HRP conjugado de anticorpo anti-porquinho da Índia de burro (706-035-148, Jackson). A mancha foi visualizada com reagente de quimioluminescência Western Lightning ECL Pro (PerkinElmer). Como resultado, a a-Syn monomérica (Mw 14.460 Da) foi manchada ao redor do tamanho de 14 kDa, enquanto que o dímero, trímero ou oligômeros tiveram seus pesos moleculares várias vezes maiores que o tamanho de a-Syn monomérica de 14 kDa. O anticorpo comercial que é capaz de detectar várias espécies oligoméricas, tais como dímeros, trímeros e oligômeros maiores, Syn211 (Abcam), foi empregado como um controle positivo. i. Teste de hibridização em pontos com diferentes espécies de proteínas amiloidogênicas

[00246] A preparação de monômeros de a-hélice, monômeros de folha B, oligômeros de folha B e fibrilas de folha à de AB1-42, Tau e a- Syn é descrita como se segue.

[00247] 1. Monômeros de AB1-42 a-hélice: 20 ug de monômeros AB1-42 folha B (50 ul) foram adicionados em 1 x PBS contendo ácido trifluoroacético a 20% e hexafluoroisopropanol a 20% (10 ul) e incubados a 4 “C durante 24 horas para formar os mo nômeros de a- hélice.

[00248] 2. Monômeros de AB1-42 folha B: 60 ug de AB1-12 em 120 ul de 1 x PBS contendo TFA a 5% agregado a 37 C durante 24 horas foram transferidos para um filtro de corte de 10 kDa (Millipore) para recuperar o monômeros de folha B.

[00249] 3. Oligômeros de AB1-42 folha B: 60 ug de AB1-12 em 120 ul de 1 x PBS agregados a 37 C durante 3 dias foram s ubmetidos à vibração ultrassônica em gelo e transferidos para filtros de corte de 10 e 30 kDa (Millipore) para recuperar as fibrilas oligoméricas de folha B de menos do que 35 kDa.

[00250] 4. Fibrilas de AB1-42 folha B: 60 ug de AB1-42 em 120 ul de 1 x PBS agregados a 37 ºC durante 3 dias foram submetidos à vibração ultrassônica em gelo e transferidos para filtros de corte de 30 kDa (Millipore) para isolar as fibrilas de folha B.

[00251] 5. Monômeros de a-Syn a-hélice: 40 ug de o-Syn recentemente preparados foram dissolvidos em 100 ul de 1 x PBS a 4€ e imediatamente transferidos para um filtro de corte de 10 kDa (Millipore) para recuperar o monômero a-helix.

[00252] 6. Monômeros de a-Syn folha B: 40 ug de a-Syn incubados em 100 ul de tampão PBS/KCI a 37 C durante 24 horas foram transferidos para um filtro de corte de 10 kDa (Millpore) para recuperar os monômeros folha É.

[00253] 7. Oligômeros de a-Syn folha 8: 40 ug de a-Syn agregados em 100 ul de tampão PBS/KCI a 37 “CC durante 8 dias foram submetidos à vibração ultrassônica em gelo e depois transferidos para filtros de corte de 30 e 100 kDa para recuperar a oligômeros de folha B.

[00254] 8. Fibras de a-Syn folha B: 40 ug de a-Syn agregados em 100 ul de tampão PBS/KCI a 37 (C durante 8 dias foram su bmetidos à vibração ultrassônica em gelo e depois transferidos para filtros de corte de 30 e 100 kDa para isolar as fibrilas de folha B. Monômeros de a-hélice Tau441: 60 ug de Tau preparados em 100 ul de 1 x PBS a 4 foram transferidos para um corte de 100 kDa para recuperar os monômeros a-hélice.

[00255] 9. Monômeros de folha B Tau441: 60 ug de Tau agregados em 100 ul de 1 x PBS com 10 unidades/ml de heparina a 25 TO durante 48 horas foram transferidos para um filtro de corte de 100 kDa a 4 C para recuperar os monômeros de folha EB.

[00256] 10. Oligômeros de folha B Tau441: 60 ug de Tau agregados em 100 ul de 1 x PBS com 10 unidades/ml de heparina a 37 T durante 48 horas foram transferidos para filtros de corte de 100 e 300 kDa (Pall) a 4 C para recuperar os oligômeros de f olha B.

[00257] 11. Fibrilas de folha B Tau441: 60 ug de Tau agregado em 100 ul de 1 x PBS com 10 unidades/ml de heparina a 37 C durante 6 dias foram transferidos para filtros de corte de 300 kDa (Pall) a 4 C para isolar as fibrilas de folha B.

[00258] Esses monômeros e oligômeros foram verificados por fluorescência de Thioflavin-T (ThT, Sigma) ou PAGE (eletroforese em gel de poliacrlamida)à;: As concentrações das proteínas amiloidogênicas foram medidas por Nano-Drop com o estoque comercial de AB1-42 amiloidogênico como o padrão. Esses monômeros e oligômeros foram identificados individualmente nas membranas de PVDF com a quantidade de 3 ug para AB1-42, 4 ug para a-Syn e 7 ug para Tau. As membranas foram incubadas com os anticorpos anti-a-Syn purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia (diluição de 1:1000) como anticorpo primário, seguido de hibridação com o anticorpo secundário conjugado com HRP antiporquinho da índia (1:5000; Vector Laboratories). As membranas foram tratadas com Luminata Western HRP Substrates (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) e os sinais foram detectados com um sistema de imagem digital ChemiDoc-lt 810 (UVP Inc., Upland, CA, USA).

[00259] j. Especificidade de ligação à a-Syn agregada em células PC12 com superexpressão de a-Syn após tratamento com fator de crescimento nervoso (NGF)

[00260] “Imunocitoquímica (ICC) com anticorpos antica-Syn purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia coletados em 8 ou 9 WPI em células PC12 de origem, PC12 controladas por simulação e PC12 com superexpressão de a-Syn após o tratamento com NGF para avaliar a afinidade de ligação dos anticorpos obtidos após a imunização. Os núcleos celulares foram contrastados com DAPI (4' 6-diamidino-2-fenilindol). As fotografias foram tiradas com um microscópio de fluorescência e a relação entre o número de células positivamente coradas e o número total de células foi categoricamente pontuada com -, +, ++ e +++, representando < 1%, 1 a 15%, 16 a 50%, > 50%. EXEMPLO 4

CÉLULAS E ANIMAIS UTILIZADOS EM ESTUDOS DE

IMUNOGENICIDADE E EFICÁCIA a. Células PC12 de superexpressão de a-Syn:

[00261] O plasmídeo pZD/XOL-L-a-Syn foi construído através da inserção da sequência de cDNA que codifica a a-Syn do tipo silvestre humana de comprimento total ou a a-Syn submetida à mutação A53T no vetor pZD/XOL-L com promotor de CMV. As construções foram transfectadas para dentro das células PC12 utilizando reagente de transfecção Lipofectamine LTX (Invitrogen, Carisbad, CA, USA) de acordo com o procedimento do fabricante. 2,5 ul da mistura de transfecção, 500 ul de meio Opti-MEM, 2,5 ul de reagente PLUS e 8,75 ul de lipofectamina LTX foram misturados e depois incubados durante 25 minutos na temperatura ambiente. Após a substituição do meio de cultura por 1,5 ml de meio de crescimento RMPI 1640, 500 ul da mistura de transfecção foram adicionados diretamente a cada reservatório, seguidos de incubações a 37 ºC durante um dia. À eficiência da transfecção foi confirmada com a PCR e western blotting. b. Porquinhos da Índia:

[00262] Estudos de imunogenicidade foram conduzidos em porquinhos da Índia Duncan-Hartley maduros, passíveis, machos e fêmeas adultos (300 a 350 g/BW). As experiências utilizaram pelo menos 3 porquinhos da índia por grupo. Os protocolos envolvendo porquinhos da índia Duncan-Hartley (8 a 12 semanas de idade; Covance Research Laboratories, Denver, PA, USA), foram executados sob solicitações aprovadas da IACUC nas instalações de animais contratadas e também na UBI, como patrocinador. c. Modelo de camundongos com Parkinson inoculados com a-Syn fibrilar:

[00263] “Camundongos fêmeas FVB (peso variando de 25 a 30 g) foram mantidos em um ciclo de 12 horas de luz: 12 horas de escuridão, e os cuidados com os animais estavam de acordo com as diretrizes aprovadas pela AAALAC. A a-Syn fibrilar foi preparada mediante a incubação de peptídeos de a-Syn (5 mg/ml) a 37 TC em tampão de PBSKLC superior contendo NaN3 0,1% sem agitação durante 7 dias. A fibrilação foi monitorada medindo a fluorescência de ThT e a confirmação foi feita quando o sinal aumentou mais de 3

7TT7/146 vezes do monômero de a-Syn original. O Western blotting também foi utilizado para validar a agregação de a-Syn antes da inoculação na substância negra unilateral (anterior-posterior; -3,0 mm; medial-lateral: -1,3 mm; dorsal-ventral: -4,7 mm do bregma e dura-máter) e neostriatum dorsal (anterior-posterior; +0,2 mm; medial-lateral: -2 mm; dorsal-ventral: -3,2 mm do bregma e dura-máter) dos animais anestesiados com isoflurano. d. Modelo de camundongo com Parkinson induzido por MPP+:

[00264] “Camundongos Balb/c fêmeas (peso variando de 18 a 20 g) foram mantidos em um ciclo de 12 horas de luz: 12 horas de escuridão, e cuidados com os animais estavam de acordo com as diretrizes aprovadas pela AAALAC. O iodeto de MPP+ (Sigma, St. Luis, MO) foi dissolvido em solução salina e injetado com 10 ul de solução contendo 18 ug de iodeto de MPP+ (0,8 mg/kg) no ventrículo unilateral do animal anestesiado. As coordenadas estereotáxicas do local da injeção foram: bregma -1,0 mm, lateral 1,0 mm, profundidade 2,0 mm. EXEMPLO 5 RACIONAL DE PROJETO, TRIAGEM, IDENTIFICAÇÃO E

OTIMIZAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS COM MÚLTIPLOS COMPONENTES QUE INCORPORAM os

CONSTRUTOS DE IMUNÓGENO PEPTÍDICO DE ALFA SINUCLEÍNA a. História do Projeto

[00265] Cada construto de imunógeno peptídico de a-Syn ou produto imunoterapêutico requer seu próprio foco e abordagem de projeto com base no mecanismo específico da doença e nas proteínas-alvo necessárias para a intervenção. Os alvos que os projetos são modelados em seguida podem incluir proteínas celulares envolvidas em uma via de doença ou um agente infeccioso no qual as várias proteínas do patógeno podem estar envolvidas. O processo de pesquisa para comercialização é muito longo, normalmente leva uma ou mais décadas para ser executado.

[00266] Um extenso processo de validação sorológica é requerido assim que a molécula-alvo é selecionada. A identificação e distribuição dos epítopos de células B e células T dentro da molécula-alvo são importantes para o projeto do construto de imunógeno peptídico de a- Syn molecular. Uma vez que o epítopo de células B alvo é reconhecido — reconhecido, estudos piloto consecutivos de imunogenicidade em pequenos animais são conduzidos para avaliar as propriedades funcionais dos anticorpos obtidos pelas composições farmacêuticas dos peptídeos projetados. Essa aplicação serológica é então realizada em animais das espécies-alvo para validação adicional da imunogenicidade do construto de imunógeno peptídico de a-Syn e propriedades funcionais dos anticorpos obtidos. Todos os estudos são conduzidos em vários grupos paralelos com soros coletados dos hospedeiros imunizados para avaliação. Estudos de imunogenicidade antecipados nas espécies-alvo ou em primatas não humanos, no caso de composições farmacêuticas humanas, também são realizados para validar ainda mais a imunogenicidade e a direção do projeto. Os peptídeos-alvo são então preparados em misturas variadas para avaliar a diferença sutil na propriedade funcional relacionada às respectivas interações entre construtos de peotídeo quando utilizados em combinações para preparar os respectivos projetos de formulação. Após as avaliações adicionais, as construções finais do peptídeo, composições peptídicas e suas formulações, juntamente com os respectivos parâmetros físicos das formulações, são estabelecidas levando ao processo final de desenvolvimento do produto.

[00267] b. Projeto e validação de construtos de imunógeno peptídico derivado de a-Syn para composições farmacêuticas com potencial para tratar pacientes com sinucleinopatias.

[00268] Afim de gerar os construtos peptídicas mais potentes para incorporação nas composições farmacêuticas, um grande repertório de epítopos promissores T auxiliares derivados de vários patógenos ou epítopos auxiliares T artificiais ainda projetados a partir da sequência de proteína da fusão do vírus de sarampo (MVF) ou a proteína do antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) foi produzido em estudos de imunogenicidade em porquinhos da índia Um estudo representativo de construtos peptídicas derivadas de a-Syn126-140, a- SyN121-140, A-SYN111-140, A-SYN101-140, A-SYNg1-140, A-SYNg5-140, A-SyN121- 135, A-SyN111-135, A-SyN101-135, A-SYyNsg7-135, A-SYyN123-135, A-SyN126-135, O- SynN111-132 E a-SyN101-132 como mostrado na Tabela 3 (SEQ ID NOs: 99 a 121) onde o peptídeo a-Syn foi conectado através de eK e/ou KKK como espaçadores com epítopos T auxiliares promissores individuais.

i) Seleção da parte C-terminal de a-Syn como alvo para o projeto de imunógeno peptídico.

[00269] A aquSyné uma proteína intrinsecamente desordenada. Ela consiste de 140 aminoácidos e é dividida em três regiões. A região N- terminal (resíduos 1 a 60) é capaz de formar uma hélice anfipática, que é uma conformação típica para reconhecimento e associação de membranas. A região central que contém os resíduos 61 a 95 é bem conhecida como o componente B não amiloide (NAC) identificado pela primeira vez em placas senis da AD. Esta região apresenta uma alta propensão a formar uma conformação rica em À e é altamente propensa a agregação. Diferentes tipos de modificações pós- translacionais dentro dessa região mostram efeitos distintos na modulação da agregação de a-Syn. A região C-terminal com resíduos 96 a 140 é rica em prolina e resíduos negativamente carregados, o que é uma característica comum encontrada nas proteínas intrinsecamente desordenadas para manter a solubilidade. Este domínio C-terminal está presente em uma estrutura de bobina aleatória devido à sua baixa hidrofobicidade e alta carga negativa líquida. Estudos in vitro revelaram que a agregação de a-Syn pode ser induzida pela redução do pH que neutraliza essas cargas negativas. À a-Syn apresenta uma diversidade conformacional extrema, que se adapta a diferentes condições nos estados de ligação à membrana, citosol e agregação de amiloides e cumpre funções versáteis. Após muita consideração, a bobina aleatória C-terminal e a região intrinsecamente desordenada, importante para a proteína manter a solubilidade, foi selecionada como o alvo para o projeto de imunógeno peptídico, pois essa região seria mais suscetível à modulação por anticorpos ou outros fatores físicos do que a hélice anfipática N- terminal e as regiões centrais de conformação rica em É.

ii) Identificação de epítopos Th autólogos para exclusão no projeto do epítopo de a-Syn B.

[00270] A análise preliminar de imunogenicidade confirmou a presença dos epítopos de célula T auxiliar no C-terminal da a-Syn, em que a exclusão da sequência de peptídeo do N-terminal da sequência de a-Syn forneceu peptídeos a-Syn126-140 (SEQ ID NO: 9), a-SyN121-140 (SEQ ID NO: 8), a Syni11-140 (SEQ ID NO: 7) totalmente não imunogênicos, enquanto que alguma imunogenicidade modesta foi observada com os peptídeos a-Syni101-140 (SEQ ID NO: 6), a-SynNoe1-140 (SEQ ID NO: 5) e a-Syngs-140 (SEQ ID NO: 4) (Tabela 4) indicativos da presença de estrutura semelhante a Th potencial autóloga dentro da sequência C-terminal. A inclusão de tal sequência no projeto do epítopo B pode potencialmente provocar inflamação no cérebro após a imunização de reforço devido à ativação de células T autólogas, como no AN1792 anterior para a vacina contra a doença de Alzheimer. Esta descoberta, portanto, requer que foram projetados construtos de imunógeno peptídico de a-Syn com epítopos de células B começando no resíduo de aminoácido G111, a fim de evitar qualquer chance de incluir epítopos de células T autólogas no projeto de epítopo B. iii) Classificação dos epítopos auxiliares T heterólogos e sua inclusão no projeto de construtos de imunógeno peptídico de a-Syn para restaurar e intensificar a imunogenicidade do peptídeo de epítopo B de a-Syn selecionado.

[00271] A Tabela 2 lista um total de 29 epítopos Th heterólogos (SEQ ID NOs: 70 a 98) que foram testados em nosso grupo quanto à sua potência relativa em várias espécies, de camundongos, ratos, porquinhos da índia, babuínos, macacos etc., para intensificar a imunogenicidade do epítopo de células B. Como mostrado na Tabela 5, os epítopos de células T UBITh1 (SEQ ID NO: 83) e UBITh2 (SEQ ID NO: 84) derivados da proteína MvF podem ambos potenciar o peptídeo de a-Syn101-140 (SEQ ID NO: 6) não imununogênico para fortalecer e moderar a imunogenicidade, respectivamente. Testes extensivos de múltiplas construtos de imunógeno peptídico derivado de a-Syn foram executados para permitir a classificação da imunogenicidade relativa entre essas construções de imunógeno. Atividade imunopotenciadora semelhante é observada com UBITh3 (SEQ ID NO: 81) quando é covalentemente ligado através de um espaçador a vários peptídeos de a-Syn C-terminais (SEQ ID NOs: 4 a 9) como ilustrado na Tabela 6, quando testado em um ELISA com placa revestida com um peptídeo de a-Syn longo A91-A140 (SEQ ID NO: 5). iv) Avaliação da imunogenicidade dos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn C-terminal com relação às suas reatividades de anticorpos com as a-Syn e B-Syn correspondentes.

[00272] A família de sinucleína inclui três proteínas conhecidas: a- Syn, B-Syn e gama-sinucleína. Todas as sinucleínas possuem em comum um motivo de ligação lipídica alfa-helicoidal altamente conservada com semelhança aos domínios de ligação lipídica classe

A2 das apolipoproteínas permutáveis.

A B-Syn é altamente homóloga à a-Syn.

Sugere-se que a B-Syn seja um inibidor da agregação de a- Syn, que ocorre em doenças neurodegenerativas tais como a doença de Parkinson.

Assim, a B-Syn pode proteger o sistema nervoso central dos efeitos neurotóxicos da a-Syn.

Portanto, é preferível ter os construtos de imunógeno peptídico de a-Syn para obter anticorpos que reagem preferencialmente com a a-sinucleína e não a p-Syn protetora da agregação correspondente.

Quando se testa os seis construtos de imunógeno peptídico, todos com terminação C-terminal com A140, todos os anticorpos derivados do soro imune desses construtos mostraram reatividade cruzada significatirkxa com o tamanho correspondente de B-Syn, como mostrado na Tabela 6. Após um exame minucioso da homologia de sequência entre a-Syn e B-Syn (SEQ ID NOs: 1 e 2), a sequência que corresponde aos cinco aminoácidos C-terminais YEPEA mostrou-se idêntica entre as duas proteínas.

É, portanto, desejável conceber epítopos B excluindo a sequência que contém estes cinco aminoácidos YEPEA.

A descoberta dos estudos de imunogenicidade mostrados na Tabela 6 levou à exclusão de YEPEA (Y136 a A140) em nosso projeto de epítopos B.

Após incorporação da sequência espaçadora e, por exemplo, o peptídeo T auxiliar artificial UBITh1 (SEQ ID NO: 83) no projeto de construto de imunógeno peptídico de a-Syn, empregando sequências de epítopos de células B, excluindo a cauda de YEPEA, como mostrado pelos imunógenos peptídicos de a-Syn (SEQ ID NOs: 107- 114) na Tabela 7, todos se tornaram altamente imunogênicos quando avaliados em um peptídeo de a-Syn longo K97-A140 (SEQ ID NO: 110). Nenhum dos soros imunológicos reagiu com a B-Syn.

Tomados os dados obtidos das Tabelas 6 e 7, o projeto de epítopo B para construtos de imunógeno peptídico seria, portanto, limitado à a-Syn G111 a D135 e seus fragmentos.

v) Anticorpos obtidos de construtos de imunógeno peptídico de aSyn reagiram exclusivamente com monômero, oligômero ou fibrila de folha beta, mas não o monômero a-hélice.

[00273] Embora tivéssemos empregado argumentações seguras em nosso projeto de imunógenos peptídicos de a-Syn, foi surpreendente descobrir que os anticorpos gerados a partir dos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn projetadas com epítopos B tendo suas sequências começando em G111 e terminando em D135 ou seus fragmentos, os anticorpos obtidos são reativos especificamente com o monômero, oligômero e fibrila de a-Syn de folha B; e não reativos com a folha B AB1-42 ou Taur-s41, portanto, oferecendo os candidatos ideais de construto de imunógeno peptídico de a-Syn, como mostrado representativamente pelos construtos de imunógeno peptídico de a- Syn (SEQ ID Nos: 112 e 113) na Figura 8. vi) Ampliação da cobertura de MHC utilizando construtos de imunógeno peptídico derivado de a-Syn com diferentes epítopos T auxiliares promissores.

[00274] Quando se projeta uma composição farmacêutica para tratar pacientes com antecedentes genéticos diversos, é importante permitir que o projeto cubra a população máxima com antecedentes genéticos — diversos. Foi, portanto, explorado o efeito de imunogenicidade sinérgica dos construtos de imunógeno peptídico derivado de a-Syn para essa combinação. Visto que os epítopos T auxiliares promíscuos derivados de MVF ou HBsAg representam entre os mais potentes para fornecer esse aprimoramento de imunogenicidade, a combinação de construtos de peotídeos contendo o epítopo auxiliar T foi, portanto, projetada para essa exploração. Uma mistura de dois construtos de imunógeno peptídico com os mesmos epítopos B foi observada de provocar uma resposta imune respeitável quando comparada com aquela provocada pela respectiva construção peptídica individual. EXEMPLO 6

RESPOSTA ANTICORPOS FOCALIZADA OBTIDA PELOS CONSTRUTOS DE IMUNÓGENO PEPTÍDICO DE a-SYN SOMENTE

PARA O EPÍTOPO DE CÉLULAS B DIRECIONADO

[00275] É sabido que todas as proteínas transportadoras (por exemplo, Hemocianina de Lapa Buraco de Fechadura (KLH) ou outras proteínas transportadoras tais como as proteínas de toxoide da difteria (DT) e de toxoide do tétano (TT)) utilizadas para potenciar uma resposta imune direcionada contra o peptídeo de epítopo de células B direcionado por conjugação química desse peptídeo de epítopo de células B à respectiva proteína transportadora irá extrair mais do que 90% dos anticorpos direcionados contra a proteína transportadora potenciadora e menos do que 10% dos anticorpos voltam a direcionar o epítopo de células B diercionado em hospedeiros imunizados. Portanto, é de interesse avaliar a especificidade dos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn da presente invenção. Uma série de oito construtos de imunógeno peptídico de a-Syn (SEQ ID NOs: 107 a 114) com epítopos de células B de comprimentos variados que estão ligados por uma sequência espaçadora ao epítopo heterólogo de células T UBITh1 (SEQ ID NO: 83), foi preparada para avaliação de imunogenicidade. O UBIThi1 (peptídeo auxiliar T utilizado para imunopotenciação do epítopo B) foi revestido com as placas e os soros imunes de porquinho da índia foram empregados para testar as reatividades cruzadas com o peptídeo UBITh1i utilizado para imunopotenciação. Em contraste com a alta imunogenicidade dessas construções em relação aos epítopos B direcionados correspondentes, conforme ilustrado pelos títulos elevados de anticorpos gerados em relação aos epítopos B, como mostrado nas Tabelas 6 e 7, a maioria, se não todos, dos soros imunológicos foi observada não reativos ao peptídeo UBITh1, como mostrado na Tabela 8.

[00276] Em resumo, o projeto simples de imunógeno que incorpora o epítopo de células B alvo ligado ao epítopo auxiliar T cuidadosamente selecionado permite a geração de uma resposta imune focada e completa direcionada apenas ao epítopo de células B da a-Syn. Para o projeto de composição farmacêutica, quanto mais específica for a resposta imune que gera, tanto maior perfil de segurança ele fornece para a composição. Os construtos de imunógeno peptídico de a-Syn desta presente invenção são, portanto, altamente específicos, mas altamente potentes contra o seu alvo. EXEMPLO 7

MAPEAMENTO DE EPÍTOPO PARA ANÁLISE DE ESPECIFICIDADE FINA POR SOROS IMUNOLÓGICOS (9 WPI) CONTRA VÁRIAS CONSTRUTOS DE IMUNÓGENOS PEPTÍDICOS DE ALFA-

SINUCLEÍNA

[00277] Em um estudo fino de mapeamento de epítopos (Tabela 9) para determinar os sítios de ligação de anticorpo aos resíduos específicos na região C-terminal de a-Syn C, 52 sobreposições de 10- mer (SEQ ID Nos: 18 a 69) foram sintetizadas, as quais cobrem a sequência de aminoácido de a-Syn (K80-A140). Dois peptídeos mais longos de (97-135, SEQ ID No: 10) e (111-132, SEQ ID No: 17) foram empregados como controle positivo. Estes peptídeos de 10-mer e dois peptídeos mais longos foram individualmente revestidos em reservatórios de placa de microtitulação de 96 reservatórios como imunoabsorventes em fase sólida. Os antissoros combinados de porquinhos da índia foram adicionados com diluição de 1:100 em tampão de diluente de amostra aos reservatórios da placa revestidos com peptídeo 10-mer em 2,0 ug/ml e depois incubados durante uma hora a 37 *C. Após lavagem dos reservatórios da placa com tampão de lavagem, a proteína conjugada com peroxidase de rábano silvestre

A/G é adicionada e incubada durante 30 min. Depois de lavar com PBS novamente, o substrato é adicionado aos reservatórios para medição da absorvância em 450 nm pela leitora de placas de ELISA, cujas amostras foram analisadas em duplicata. A ligação dos antissoros com o peptídeo de a-Syn longo correspondente do construto de imunógeno do epítopo B representa a ligação máxima.

[00278] Como mostrado na Tabela 9, os soros imunológicos combinados 9 wpi de porquinho da índia obtidos respectivamente de seis construtos de imunógeno peptídico de a-Syn [(K97-D135, SEQ ID No: 110), (G111-D135, SEQ ID No: 108), (G111-G132, SEQ ID No: 113), (E126-D135, SEQ ID No: 112), (G101-A140, SEQ ID No: 104) e (E126-A140, SEQ ID No: 99)] foram selecionados para mapeamento de epítopos finos. Estes seis fragmentos do epítopo B de comprimentos variados cobrem totalmente a sequência 97-140 da região C-terminal da a-Sinucleína. Os resultados do ELISA mostraram que todos os seis soros imunológicos reagiram fortemente com o peptídeo de a-Syn longo representativo (97-135, SEQ ID No: 10). Para o estudo de mapeamento de epítopos finos de 10 meros, os resultados revelaram um epítopo imunogênico que cobre a região de AA114 a 125 (peptídeos 114-123, 115-124, 116-125 das SEQ ID Nos: 52, 53 e 54) e uma região altamente imunogênica na extremidade C-terminal representada pelo peptídeo 131-140 (SEQ ID NO: 69). Curiosamente, a maioria dos soros imunológicos derivados dos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn C-terminais obteve anticorpos que reconhecem epítopos não lineares, mas conformacionais, exceto um que está localizado no C-terminal de a-Syn com a sequência de EGYQDYEPEA (SEQ ID NO: 69) e responsável pela reatividade cruzada com a proteína B-Syn.

[00279] Essa descoberta de mapeamento de epítopo foi menos esperado, mas correlacionou-se bem com a descoberta de que esses anticorpos derivavam dos construtos de imunógeno peptídico de a- Syn, como representado por a-Syn 111-132 (SEQ ID NO: 113) e a-Syn 126-135 (SEQ ID NO: 112) da região da bobina aleatória C-terminal do a-Syn, que está ligada a uma estrutura heteróloga do epítopo Th, que leva a uma estrutura conformacional que se parece com uma folha B desnaturada de a-Syn, e não reativa cruzada com a nativa a-hélice de a-Syn. EXEMPLO 8

ANTICORPOS OBTIDOS PELOS CONSTRUTOS DE IMUNÓGENO PEPTÍDICO DE a-SYN E SUAS E FORMULAÇÕES: EFEITOS DE

ANTIAGREGAÇÃO E DESAGREGAÇÃO NA PROTEÍNA ALFA SINUCLEINA RECOMBINANTE

[00280] Avaliamos os efeitos de construtos de imunógeno peptídico de a-Syn em ensaios de antiagregação e ensaios de desagregação in vitro, utilizando anticorpos anti-a-Syn purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia em a-Syn recombinante. a. Inibição da agregação de a-Syn

[00281] Um ensaio de triagem inicial de diferentes anticorpos anti-a- Syn purificados de porquinhos da índia imunizados com diferentes construtos de imunógeno peptídico de a-Syn com relação à capacidade potencial antiagregação foi conduzido pela quantificação do nível de alterações das agregações de a-Syn através da medição da tiofavina T, conforme descrito no Exemplo 3. A a-Syn recombinante preparada com PBS em 100 uM foi ainda incubada em 40 ul de tampão PBS/KCI (MgCl2 2,5 MM, HEPES 50 mM e KCI 150 mM em 1 x PBS, pH 7,4) na concentração de 5 uM em uma placa de 384 reservatórios durante 6 dias para acionar a agregação. Diferentes concentrações (0,05, 0,5 ou 5 pg/ml) de anticorpos anti-a-Syn purificados de antissoros de porquinhos da índia imunizados com diferentes construtos de imunógeno peptídico de a-Syn, coletadas em diferentes momentos, foram adicionadas à mistura de incubação para avaliar o respectivos efeitos na inibição da agregação de a-Syn. No final da incubação, o nível de agregação foi determinado utilizando os ensaios de ThT. As leituras obtidas de cada série de teste foram normalizadas considerando o nível de agregação no Controle do Veículo como 100% e considerando as leituras obtidas na ausência de a-Syn como 0%.

[00282] “Conforme resumido na Tabela 10, três anticorpos anti-a- Syn obtidos por a-Syn111-132, A-SyN121-135 OU A-SyN126-135 coletados em 9 WPI e além revelaram inibições mais potentes e dependentes da concentração na agregação de a-Syn. De todos os anticorpos anti-a- Syn testados, quatro anticorpos selecionados que foram obtidos por a- SynN111-133 (SEQ ID NO:113), a-Syni121-135 (SEQ ID NO:107), a-SyN123-135 (SEQ ID NO:111) ou a-Syni126-135 (SEQ ID NO:112) (coletados em 9 WPI) demonstraram um efeito inibitório na agregação de a-Syn em quase 40% (Figura 1) em comparação com o nível de agregação do controle de veículo como 100%. b. Dissociação de agregados de a-Syn pré-formados

[00283] A partir dos estudos acima, observou-se que os anticorpos anti-a-Syn purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia imunizados com certos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn possuíam os efeitos sobre a inibição da agregação de a-Syn. Para avaliar ainda mais se os anticorpos obtidos pelos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn permaneceram eficazes na dissociação de agregados pré-formados de a-Syn, ensaios de desagregação in vitro usando anticorpos anti-a-Syn purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia foram conduzidos.

[00284] A auSyn foi agregada em 200 ul de tampão de PBS/KCI na concentração de 5 uM durante 3 dias. Após a centrifugação (13.000 xg, 4 C, 30 min), os agregados de a-Syn foram colhidos e confirmados com os ensaios de ThT. Os agregados de a-Syn pré- formados foram então incubados em 100 ul de tampão de PBS/KCI com ou sem os anticorpos anti-a-Syn purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia (5 ug/ml) durante 3 dias. Após a incubação, os agregados foram coletados após a centrifugação de 13.000 xg a 4 C durante 30 minutos e depois quantificados com o ensaio ThT, conforme descrito no Exemplo 3. Os agregados de a-Syn residuais após as dissociações espontâneas no Controle de Veículo foram normalizados para 100%.

[00285] Dois anticorpos anti-a-Syn selecionados que foram obtidos por a-Syn111-132 (SEQ ID NO: 113) ou a-Syni126-135 (SEQ ID NO: 112), e a combinação de anticorpos anti-a-Syn obtidos de a-Syn111-1322 (SEQ ID NO: 113) e obtidos de a-Syn126-135 (SEQ ID NO: 112) foram testados neste ensaio de desagregação in vitro. Como um resultado, os anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syni26-135 (SEQ ID NO: 112) e a Syn111-1323 (SEQ ID NO: 113) demonstraram um efeito de dissociação nos agregados de a-Syn pré-formados por quase 50% quando comparados com o controle de veículo como 100%, enquanto que os outros anticorpos anti-a-Syn e os anticorpos purificados de animais pré-imunizados falharam em apresentar os efeitos comparáveis (Figura 2). EXEMPLO 9

ANTICORPOS OBTIDOS POR CONSTRUTOS DE IMUNÓGENO PEPTÍDICO DE a-SYN E SUAS FORMULAÇÕES: EFEITOS

ANTIAGREGAÇÃO E DESAGREGAÇÃO SOBRE AS CINÉTICAS DE AGREGAÇÃO DE a-SYN EM CÉLULAS DE SUPEREXPRESSÃO DE a-SYN

[00286] Sabe-se que a agregação de a-Syn acelera durante a diferenciação neuronal. A fim de avaliar os efeitos dos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn na inibição da agregação de a-Syn ou na dissociação de agregados de a-Syn pré-formados em uma condição baseada em células, os anticorpos anti-a-Syn purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia imunizados com diferentes construtos de imunógeno peptídico de a-Syn foram avaliados com os ensaios antiagregação e ensaios de desagregação baseados em células PC12 de superexpressão de a-Syn com diferenciação neuronal tratados com NGF. a. Inibição da agregação de a-Syn

[00287] As células PC1I2 de superexpressão de a-Syn foram semeadas em placas de 96 reservatórios pré-revestidas com poli-D- lisina e depois tratadas com fator de crescimento nervoso (NGF) (100 ng/ml) juntamente com anticorpos antica-Syn purificados de porquinhos da índia imunizados com diferentes construtos de imunógeno peptídico de a-Syn (O ou 0,5 pg/ml) durante 4 dias de modo a validar as atividades de antiagregação.

[00288] As células tratadas foram submetidas à lise e 20 ug de lisados celulares foram separados por SDS-PAGE e depois detectados com anticorpo de a-Syn (BD). A quantidade de sinais de a-Syn detectados na região de peso molecular mais elevado foi quantificada e depois normalizada para o grupo de controle de veículo como 100%. Como mostrado na Figura 3, efeitos inibitórios sobre a quantidade de a-Syn agregada de até 80 a 90% foram observados entre todos os quatro anticorpos anti-a-Syn selecionados obtidos por construtos de imunógeno peptídico de a-Syn a-Syn111-1323 (SEQ ID NO:113), a-Syn121- 135 (SEQ ID NO:107), a-Syni123-135 (SEQ ID NO:111), ou a-Syni126-135 (SEQ ID NO:112), em comparação com a quantidade de a-Syn agregado no controle de veículo. b. Dissociação de agregados de a-Syn pré-formados

[00289] Para validar as atividades de desagregação em agregados de a-Syn pré-formados, as células PC12 de superexpressão de a-Syn foram tratadas com NGF (100 ng/ml) durante 3 dias com relação à diferenciação neuronal para iniciar a agregação de a-Syn, antes ainda tratadas com anticorpos anti-a-Syn purificados de porquinhos da índia imunizados com diferentes construtos de imunógeno peptídico de a- Syn (0 ou 0,5 ug/ml) durante mais 4 dias.

[00290] As células tratadas foram submetidas à lise e 20 ug de lisados celulares foram separados por SDS-PAGE e depois detectados com anticorpo de a-Syn (BD). A quantidade de sinais de a-Syn detectados na região de peso molecular mais elevado foi quantificada e depois normalizada para o grupo de controle de veículo como 100%. Como também mostrado na Figura 3, uma redução de 50 a 60% na quantidade de a-Syn agregada foi observada em anticorpos anti-a-Syn obtidos por construtos de imunógeno peptídico de a-Syn121-135 (SEQ ID NO:107), a-Syniz3135 (SEQ ID O:111) ou a Synize135 (SEQ ID NO:112), enquanto os anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn111-132 (SEQ ID NO: 113) demonstraram um valor superior a 90% de redução na quantidade de a-Syn agregada. EXEMPLO 10

ANTICORPOS OBTIDOS ATRAVÉS DOS CONSTRUTOS DE IMUNÓGENO PEPTÍDICO DE a-SYN E SUAS FORMULAÇÕES: EFEITO NA REDUÇÃO DA SECREÇÃO MICROGLIAL DE TNF-a E IL-6

[00291] Acredita-se que o dano neuronal da substância negra libere a a-Syn agregada na substância negra, que ativa a microglia com a produção de mediadores pró-inflamatórios, levando à neurodegeneração da substância negra persistente e progressiva na PD. Para avaliar os efeitos na redução da ativação da microglia por anticorpos anti-a-Syn purificados de porquinhos da índia imunizados com diferentes construtos de imunógeno peptídico de a-Syn, a quantidade de mediadores pró-inflamatórios, TNF-a (fator da necrose tumoral alfa) e IL-6 (interleucina-6), liberadas por microglias após o tratamento com agregados de a-Syn na presença ou ausência de diferentes anticorpos anti-a-Syn foram medidos.

[00292] Células de murino BV2 ou células humanas SVG p12 foram semeadas em 5000 células/reservatórios em meio RPMI 1640 suplementado com FBS a 1%. As células foram tratadas com a-Syn 1 UM e incubadas a 37 T, CO>2 a 5% em atmosfera umidificada durante 24 horas. Depois disso, o meio de cultura foi coletado, centrifugado e os sobrenadantes foram isolados. As concentrações de IL-6 secretada por células BV2 e TNF-a secretado por células SVG p1i2 nos sobrenadantes foram analisadas em triplicata mediante o uso de kits de ELISA de |L-6 de camundongo ou TNF-a de ser humano (Thermofisher), respectivamente. O sinal foi normalizado com controle de veículo como 100%.

[00293] Os dados mostraram que os anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn111-1322 (SEQ ID NO: 113) e a-Syni23-135 (SEQ ID NO: 111) reduziram a liberação de TNF-a mediada por agregados de a-Syn por células SVG p12 em 30 a 50%, enquanto que os anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn123-135 (SEQ ID NO: 111) reduziram a liberação de IL- 6 pelas células SVGP12 em cerca de 30% (Figura 4). Os resultados indicaram que os anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn123-135 (SEQ ID NO: 111) eram mais potentes do que os outros anticorpos anti-a- Syn testados na mitigação da ativação microglial mediada por agregados de a-Syn. EXEMPLO 11

ANTICORPOS OBTIDOS PELOS CONSTRUTOS DE IMUNÓGENOS PEPTÍDICOS DE o-SYN E SUAS E FORMULAÇÕES: EFEITO NA

REDUÇÃO DA NEURODEGENERAÇÃO ACIONADA PELA ALFA SINUCLEÍNA EXÓGENA

[00294] A fim de avaliar os efeitos neuroprotetores dos anticorpos anti-a-Syn purificados a partir de antissoros de porquinho da índia imunizados com diferentes construtos de imunógeno peptídico de a- Syn, um modelo de neurodegeneração in vitro com agregados de a- Syn pré-formados exógenos em células PC12 diferenciadas neuronais tratadas com NGF foi adotado.

[00295] As células PC12 foram tratadas com NGF (100 ng/ml) durante 6 dias para induzir a diferenciação neuronal. A morfologia das células diferenciadas neuronais foi confirmada e analisada pelo sistema de análise de imagens de alto conteúdo InCell (GE Healthcare). Os efeitos neurotróficos de NGF refletiram sobre o crescimento de neurites e o número de células diferenciadas neuronais foi quantificado. Os níveis de crescimento de neurites e o número de células diferenciadas neuronais foram mostrados em porcentagens (média + SEM) após a normalização. O comprimento de neurite das células PC12 com e sem tratamento com NGF foi considerado como 100% e 0%, respectivamente. O número de células PC12 diferenciadas por neurônios após 6 dias de tratamento com NGF foi normalizado para 100%.

[00296] A neurodegeneração foi observada pela adição de agregados de a-Syn pré-formados exógenos nas células PC12 diferenciadas neuronais. Na presença de agregados de a-Syn pré- formados, o comprimento de neurite foi reduzido e o número de células diminuiu nas células PC12 diferenciadas neuronais. Essa neurodegeneração conduzida por agregados de a-Syn foi proporcional à quantidade de agregados de a-Syn exógenos adicionados e pode ser bloqueada pela curcumina, amplamente conhecida por seus efeitos neuroprotetores contra a neurotoxicidade dos agregados de a- Syn, de uma maneira dependente da concentração. Os anticorpos anti-a-Syn comercialmente disponíveis (BD bioscience), mas não os anticorpos purificados de porquinhos da índia passíveis, atenuaram a neurodegeneração conduzida por agregados de a-Syn. Este modelo foi adotado como uma plataforma de triagem para identificar quais anticorpos anti-a-Syn purificados a partir de antissoros de porquinho da índia imunizados com diferentes construtos de imunógeno peptídico de a-Syn possuíam os efeitos neuroprotetores na restauração do crescimento de neurites, assim como a sobrevivência neuronal em uma maneira dependente da concentração (Tabelas 11 e 12).

[00297] Como um resultado, os anticorpos anti-a-Syn purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia imunizados com mais da metade dos diferentes construtos de imunógeno peptídico de a-Syn, restauraram o crescimento de neurite dependente da concentração (Tabela 11), e os anticorpos anti-ca-Syn purificados a partir de antissoros de porquinho da índia imunizados com quase todos os diferentes construtos de imunógeno peptídico de a-Syn protegeram as células PC12 diferenciadas neuronais da morte neuronal desencadeada por agregados de a-Syn (Tabela 12). Tomando os dois parâmetros diferentes em conjunto, observou-se que quase um terço dos anticorpos anti-a-Syn testados possuíam os efeitos tanto sobre o comprimento de neurite quanto sobre a sobrevivência das células contra a neurotoxicidade dos agregados de a-Syn. Os efeitos antineurodegenerativos dos anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn111- 132 (SEQ ID NO: 113), a-Syn126-135 (SEQ ID NO: 112) e os anticorpos pré-imunes de porquinhos da índia passíveis foram observados e quantificados quanto ao comprimento dos neurites e ao número de células com calceína AM (Life Technologies), um corante fluorescente de marcação de células vivas. Foi demonstrado que nas células PC12 diferenciadas neuronais ricos em neurites, os anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn111-13223 (SEQ ID NO: 113) (Figura 5B) e a-Syni126-135 (SEQ ID NO: 112) (Figura 5C), mas não anticorpos pré-imunes purificados de porquinhos da índia passíevis (Figura 5A),

apresentaram efeitos protetores no encurtamento medido por agregados de a-Syn do comprimento de neurite. EXEMPLO 12

ANTICORPOS OBTIDOS PELOS CONSTRUTOS DE IMUNÓGENOS PEPTÍDICOS DE a-SYN E SUAS FORMULAÇÕES: EFEITO SOBRE

A REDUÇÃO DA NEURODEGENERAÇÃO EM CÉLULAS DE SUPEREXPRESSÃO DA a-SYN

[00298] A fim de avaliar os efeitos neuroprotetores de anticorpos anti-a-Syn purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia imunizados com diferentes construções de imunógenos peptídicos de a-Syn, modelos de neurodegeneração in vitro com células PC12 de superexpressão de a-Syn do tipo silvestre e células PC12 de superexpressão de a-Syn submetidas à mutação A53T foram adotados.

[00299] Após a incubação com NGF, as células controladas por simulação (transfectadas com vetor de plasmídeo) desenvolveram longa extensão de neurites e aumentaram o número de células de forma semelhante às células PC12 de origem tipo silvestre, enquanto que as células PC12 de superexpressão de a-Syn do tipo silvestre e as células PC12 de superexpressão de a-Syn submetidas à mutação A53T falharam em desenvolver extensão comparável de neurites ou aumento no número de células, confimando os efeitos neurodegenerativos = acompanhados de a-Syn agregada após tratamento com NGF. Na caracterização de a-Syn superexpressa nas células PC12 de superexpressão de a-Syn do tipo silvestre após tratamento com NGF, ensaios de western blotting e ThT foram realizados com os lisados celulares das células PC12 de superexpressão de a-Syn do tipo silvestre após tratamento com NGF. O resultado de western blotting demonstrou que a ao-Syn superexpressa nos lisados celulares das células PC12 de superexpressão de a-Syn do tipo silvestre após o tratamento com NGF era oligomérica, e os resultados do ensaio ThT indicaram que a a-Syn no lisado celular das células PC12 de superexpressão de a-Syn do tipo silvestre após tratamento com NGF era de estrutura em folha B (isto é, sinais de fluorescência de ThT elevados). Comparado com os resultados dos ensaios de western blotting e ThT das células PC12 de superexpressão de a-Syn do tipo silvestre sem tratamento com NGF, foi sugerido que uma transição estrutural de a-hélice para folha B de a- Syn superexpressa ocorreu após a diferenciação neuronal induzida por NGF, que pode subsequentemente produzir os efeitos neurodegenerativos da a-Syn oligomérica de folha B. Além disso, em comparação com as células PC12 de superexpressão de a-Syn do tipo silvestre, a a-Syn submetida à mutação com A53T superexpressa resultou em efeitos neurodegenerativos mais fortes refletidos tanto no comprimento reduzido de neurites quanto no número reduzido de células após o tratamento com NGF, indicando que a a-Syn submetida à mutação com A53T desencadeou efeitos neurodegenerativos mais fortes do que a a-Syn do tipo silvestre nas células PC12 de superexpressão de a-Syn.

[00300] O asnticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syni101-1322 (SEQ ID NO:114), a-Syn111-1322 (SEQ ID NO:113), a-Syn121-135 (SEQ ID NO:107), a-Syni23-135 (SEQ ID NO:111) ou a-Syni26-135 (SEQ ID NO:112)) e a combinação de anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn111-1322 (SEQ ID NO:113) e a-Syni26-135 (SEQ ID NO:112) foram testados pelo modelo de neurodegeneração in vitro com células PC12 de superexpressão de a-Syn do tipo silvestre para avaliar seus efeitos protetores individuais contra a neurodegeneração. As células PC12 de superexpressão de a- Syn do tipo silvestre foram tratadas com NGF durante 3 dias para iniciar a diferenciação neuronal, antes sendo incubadas tanto com os anticorpos anti-a-Syn (de uma concentração final de 5 ug/ml) quanto com NGF durante 3 dias adicionais. A observação microscópica das células pelo final do período de incubação revelou o comprimento restaurado de neurites e o aumento do número de células após a coincubação com os anticorpos antica-Syn selecionados, em comparação com o controle de veículo. A quantificação do comprimento de neurite e o número de células foi feita com as leituras das células PC12 de origem tratadas com NGF durante 6 dias normalizadas a 100%. Como um resultado, anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn1io1-13223 (SEQ ID NO:114), a-Syni11-1322 (SEQ ID NO:113) ou a-Syni23135 (SEQ ID NO:111), e a combinação de anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn111-13223 (SEQ ID NO: 113) e a- Syni126-135 (SEQ ID NO: 112) apresentaram número significativamente maior de células, enquanto que os anticorpos anti-a-Syn obtidos por a- Syni101-1322 (SEQ ID NO:114), a-Syn111-1323 (SEQ ID NO:113), a-Syni123-135 (SEQ ID NO:111) ou a-Syni126-135 (SEQ ID NO:112) e a combinação de anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn111-1322 (SEQ ID NO: 115) e a- Syni126-135 (SEQ ID NO: 114) apresentaram comprimento de neurite significativamente mais longo, quando comparado ao controle de veículo (figuras 6A e 6B).

EXEMPLO 13

ANTICORPOS OBTIDOS PELO CONSTRUTO DE IMUNÓGENO PEPTÍDICO DE a-SYN E SUAS FORMULAÇÕES: ESPECIFICIDADE

COM A PROTEÍNA ALFA SINUCLEÍNA OLIGOMÉRICA E FIBRILAR FOLHA BETA

[00301] Afim de melhor caracterizar a especificidade dos anticorpos anti-a-Syn purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia imunizados com diferentes construtos de imunógeno peptídico de a- Syn, uma série de ensaios in vitro foi conduzida em diferentes tamanhos do complexo molecular de a-Syn, diferentes proteínas amiloidogênicas incluindo a-Syn, AB e proteína tau, e a-Syn agregada em células PC12 de superexpressão de a-Syn após tratamento com NGF. a. Especificidade com complexos moleculares de a-Syn maiores

[00302] Western blotting de complexos moleculares de a-Syn de diferentes tamanhos foi realizado utilizando anticorpos anti-a-Syn purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia imunizados com diferentes construtos de imunógeno peptídico de a-Syn como anticorpos primários. Os resultados mostraram que todos os anticorpos — antica-Syn — reagiram — fortemente = com — complexos moleculares de a-Syn de tamanhos maiores, incluindo dímeros, trímeros, tetrâmeros e oligômeros, além da a-Syn monomérica de menor tamanho. Quando comparado ao anticorpo anti-a-Syn comercialmente disponível, Syn211 (Abcam), os anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syni11-13]3 (SEQ ID NO:113), a-Syni21-135 (SEQ ID NO:107), a-Syni23135 (SEQ ID NO:111) e a Synizs135 (SEQ ID NO:112) demonstraram uma relação mais elevada do sinal de complexos moleculares de a-Syn de tamanhos maiores (incluindo dímeros, trímeros, tetrâmeros e oligômeros) ao sinal da a-Syn monomérica de menor tamanho (Figuras 7A e 7B), sugerindo que os anticorpos anti-a-Syn possuíam especificidade para os complexos moleculares de a-Syn maiores. b. Especifiidade para a a-Syn entre diferentes proteínas amiloidogênicas

[00303] Ensaios de hibridização em pontos com diferentes espécies (isto é, os monômeros de a-hélice, monômeros de folha 8, oligômeros de folha B e fibrilas de folha B) de diferentes proteínas amiloidogênicas (isto é, a-Syn, AB1-12 e Tau441) preparadas conforme descrito no Exemplo 3 foram realizados utilizando anticorpos antica-Syn purificados a partir de antissoros de porquinho da índia imunizados com diferentes construtos de imunógeno peptídico de a-Syn como anticorpos primários. Os resultados mostraram que os anticorpos anti- a-Syn obtidos por a-Syn126-135 (SEQ ID NO: 112) e a-Syn111-1322 (SEQ ID NO: 113) reagiram especificamente a todas as formas de folha B (espécies monoméricas, oligoméricas e fibrilares) de a-Syn, mas não para os monômeros de a-hélice (Figuras 8A, 8B e 8C). Além do mais, os anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn126-135 (SEQ ID NO: 112) e a-SynN111-1322 (SEQ ID NO: 113) reagiram mais fortemente às fibrilas de folha B e aos oligômeros de folha B de a-Syn do que aos monômeros de folha B de a-Syn. Em contraste, os anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syni126-135 (SEQ ID NO: 112) e a-Syn111-132 (SEQ ID NO: 113) não apresentaram nenhuma reatividade detectada à B-Syn ou às diferentes espécies (isto é, os monômeros de a-hélice, monômeros de folha É, oligêômeros de folha B e fibrilas de folha B) das proteínas amiloidogênicas AB112 e Tau441 (Figuras 8A, 8B e 8C). As descobertas sugeriram que os anticorpos anti-a-Syn obtidos por a- SynN126-135 (SEQ ID NO: 112) e a-Syn111-1322 (SEQ ID NO: 113) possuíam a especificidade para a-Syn de formas monoméricas de folhas Ç&, formas oligoméricas de folhas B e fibrilares de folhas B.

c. Especificidade de ligação à a-Syn agregada em células PC12 de superexpressão de a-Syn após tratamento com NGF

[00304] A imunocitoquímica (ICC) com anticorpos anti-a-Syn purificados a partir de antissoros de porquinhos da índia imunizados com diferentes construtos de imunógeno peptídico de a-Syn foi realizada nas células PC12 de origem, células PC12 controladas por simulação, células PC12 de superexpressão de a-Syn do tipo silvestre e células PC12 de superexpressão de a-Syn submetidas à mutação A53T para avaliar a afinidade de ligação dos anticorpos à a-Syn agregada após o tratamento com NGF, conforme descrito no Exemplo

3. Como o resultado da quantificação mostrado na Figura 9, os anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn111-1322 (SEQ ID NO: 113), a-

Syni21-135 (SEQ ID NO: 107) ou a-Synixs135 (SEQ ID NO: 112) demonstraram uma reatividade mais forte nas células PC12 de superexpressão de a-Syn tipo silvestre e nas células PC12 de superexpressão de a-Syn submetidas à mutação do que nas células PC12 de origem ou nas células PC12 controladas por simulação após tratamento com NGF. Visto que a agregação de a-Syn superexpressa foi induzida após o tratamento com NGF, as descobertas sugerem que os anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn111-13223 (SEQ ID NO: 113), a- Syni21-135 (SEQ ID NO: 107) ou a-Synixs135 (SEQ ID NO: 112) possuíam a especificidade para a a-Syn agregada nas células PC12 de superexpressão de a-Syn de tipo silvestre e nas células PC12 de superexpressão de a-Syn submetidas à mutação A53T após tratamento com NGF. EXEMPLO 14 COLORAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DO CÉREBRO HUMANO

COM DOENÇA DE PARKINSON PARA AVALIAÇÃO DA

ESPECIFICIDADE DE TECIDO DOS CONSTRUTOS DE IMUNÓGENO PEPTÍDICO DE a-SYN E SUAS FORMULAÇÕES

[00305] Estudo de imuno-histopatologia utilizando anticorpos anti-a- Syn pré-imunes obtidos por a-Syn126-135 (SEQ ID NO: 112) ou a-Synt11- 132 (SEQ ID NO: 113) e combinação 1:1 de ambos os anticorpos anti- a-Syn foram executados nos tecidos humanos normais, a fim de monitorar com relação à especifiidade e autorreatividades indesejáveis de anticorpos. O painel de tecidos humanos (Pantomics) foi desparafinado com xileno, reidratado em etanol e depois tratado com solução de tripsina a 0,25% com CaCl? a 0,5% em PBS durante min e incubado em peróxido de hidrogênio a 1% em metanol para bloquear a atividade da peroxidase endógena seguido de incubação com 10% Block Ace (Sigma) em PBS, antes que os anticorpos anti-a- Syn de porquinhos da índia imunizados com a-Syni126-135 (SEQ ID NO:

112) ou a-Syn111-1322 (SEQ ID NO: 113) e a combinação 1:1 de ambos os anticorpos (diluição 1:300) fossem aplicados. As seções foram desenvolvidas com 3-3'diaminobenzidina (DAB) e foram contracoradas com hematoxilina antes de serem examinadas microscopicamente. Em contraste com a reatividade positiva do anticorpo anti-a-Syn comercial (BD, 610708), os anticorpos anti-a-Syn purificados de porquinhos da Índia imunizados com a-Syni126-135 (SEQ ID NO: 112) ou a-Syn111-132 (SEQ ID NO: 113) e a combinação 1:1 de ambos os anticorpos apresentaram reatividade negativa aos tecidos humanos normais, o que foi compatível com o padrão dos anticorpos pré-imunes de porquinhos da índia passíveis (Figura 10A).

[00306] Outro estudo de imuno-histopatologia utilizando anticorpos anti-a-Syn pré-imunes obtidos por a-Syn126-135 (SEQ ID NO: 112) ou a- Syn111-132] (SEQ ID NO: 113) e a combinação 1:1 de ambos os anticorpos anti-a-Syn foram executados para testar a sua reatividade com o cérebro de doença de Parkinson humana. As seções de tecido de três regiões (isto é, cerebelo, corpo caloso e tálamo) (BioChain) foram testadas. Como um resultado, os anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syni126-135 (SEQ ID NO: 112) ou a-Syn111-1322 (SEQ ID NO: 113) e a combinação 1:1 de ambos os anticorpos anti-a-Syn apresentaram reatividade positiva (com setas de indicação) para as seções cerebrais de PD nas três regiões, em comparação com a reatividade negativa nas seções cerebrais saudáveis (Figuras 10B e 10C). A quantificação da reatividade aos agregados de a-Syn nas seções cerebrais de PD foi feita através da contagem das manchas positivas sob observação microscópica. Os resultados mostraram que os anticorpos anti-a-Syn obtidos por a-Syn126-135 (SEQ ID NO: 112) ou a-Syn111-132 (SEQ ID NO: 113) e a combinação 1:1 de ambos os anticorpos anti-a-Syn tiveram forte positividade nas seções cerebrais de PD, em comparação com as seções saudáveis do cérebro humano. E dos três anticorpos anti-a-

Syn diferentes testados, os anticorpos obtidos por a-Syn111-132 (SEQ ID NO: 113) tiveram a imunorreatividade mais forte para os agregados de a-Syn nas seções cerebrais da PD. EXEMPLO 15

PROVA DE EFICÁCIA PARA OS CONSTRUTOS DE IMUNÓGENO PEPTÍDICO DE a-SYN E SUAS FORMULAÇÕES EM MODELOS

ANIMAIS a. Imunização e coleta de sangue/tecido cerebral

[00307] Os modelos de camundongo de Doença de Parkinson (PD) foram estabelecidos conforme descrito no Exemplo 4. Duas semanas após a injeção de MPP* ou 7 semanas após a inoculação fibrilar de a- Syn, os camundongos foram divididos aleatoriamente em três grupos, incluindo o peptídeo a-Syn111-132]3 (SEQ ID NO: 113) ligado a UBITh1, peptídeo a-Syni26135 (SEQ ID NO: 112) ligado a UBITN1 e a combinação de ambos os peptídeos, além do grupo adjuvante (imunizado com os adjuvantes e o solvente utilizado na preparação das composições (ISA 51 VG, CpG3, TWEENQO-80 0,2%)). A imunização intramuscular (IM) foi administrada por três vezes com intervalo de 3 semanas, na dose de 40 ug. Os esquemas de administração e coleta de sangue foram realizados de acordo com a Tabela 13.

[00308] Em cada momento, 200 ul de sangue foram coletados por meio de amostragem de sangue na veia facial. O sangue escorrendo da veia submandibular perfurada foi coletado em um microtubo e o soro foi preparado por centrifugação em 300 rpm durante 10 minutos. Após o sacrifício dos animais, amostras de tecido cerebral foram coletadas para western blotting.

[00309] Db. Resposta imune em camundongos modelo de PD que recebem composições contendo construtos de imunógeno peptídico de a-Syn111-1322 (SEQ ID NO: 113) e/ou a-Syn126-135 (SEQ ID NO: 112)

[00310] As amostras de soro reunidas de cada grupo de tratamento foram diluídas em BSA a 1% (em PBST) e depois aplicadas na placa ELISA revestida com 200 ul de peptídeo de comprimento total de a- Syn (Cloud-clone) em bicarbonato de sódio 0,1 M (concentração de a- Syn 4,4 ug/ul, pH 9,6). Após 2 horas de incubação na temperatura ambiente e três lavagens com PBST, 100 ul de anticorpo de IgG anti- camundongo conjugado com HRP diluído em 1:3000 com BSA a 1% foram adicionados para reagir durante 2 horas na temperatura ambiente. Após o que, as placas foram lavadas três vezes com PBST e incubadas com 100 ul de 3,3,5,5-tetrametilbenzidina (TMB) durante minutos no escuro. 100 ul de H2SO.a 2M foram então aplicados e incubados durante 15 a 30 minutos antes que o valor da densidade óptica (OD) em 450 nm fosse medido com SpectraMax i3x Multi-Mode Detection (Molecular Devices).

[00311] Os dois modelos de murino com PD imunizados com a a- Syn111-1323 (SEQ ID NO: 113) formulada, a a-Syni26-135 (SEQ ID NO: 112) formulado, ou a combinação de ambos os construtos de imunógeno peptídico tinham um valor da densidade óptica (OD) de anticorpo anti-a-Syn maior do que 3,0 após a segunda imunização, que permaneceu elevada pelo tempo do término do estudo em 15 ou 19 semanas após a imunização inicial, no modelo induzido por MPP+ (Figura 11A) ou modelo inoculado por a-Syn fibrilar (Figura 11B), respectivamente, enquanto que os animais administrados com adjuvante não provocaram resposta imune mensurável anti-a-Syn.

[00312] Observa-se que no modelo inoculado por a-Syn fibrilar, oconstruto a-Syn111-1323 provocou uma resposta imune mais forte do que a construção de a-Syn126-135 (Figura 11B), enquanto que a diferença na imunogenicidade não foi observada no modelo induzido por MPP* (Figura 11A). c. Redução no nível de a-Syn no soro

[00313] Os níveis de a-Syn do soro reunido de animais de cada grupo foram testados utilizando o kit ELISA (SEB222Mu, USCN) que podia detectar tanto a alfa hélice quanto a folha À de a-Syn descritas no Exemplo 3.

[00314] O ELISA quantitativo de a-Syn foi para testar se a resposta do anticorpo anti-a-Syn dos grupos imunizados estava associada com uma quantidade reduzida de a-Syn periférica quando comparada aos animais não tratados. Foi demonstrado que a imunização com a a- Syni126-135 (SEQ ID NO: 112), a-Syn111-1322 (SEQ ID NO: 113) ou a combinação dessas construções teve valores de densidade óptica (OD) diminuídos dos níveis de a-Syn quando comparados com os animais administrados com adjuvante, tanto no modelo induzido por MPP* (Figura 12A) quanto no modelo inoculado por a-Syn fibrilar (Figura 12B). Os resultados sugeriram que com a geração da resposta de anticorpo antica-Syn após a imunização com construtos de imunógeno peptídico de a-Syn, a quantidade de a-Syn na circulação periférica foi reduzida consequentemente. d. Redução no nível de a-Syn oligomérica no cérebro

[00315] Após o sacrifício dos animais, amostras de tecido cerebral foram coletadas para western blotting. Para camundongos induzidos por MPP*, o cérebro foi removido e homogeneizado, enquanto que para camundongos inoculados com a-Syn fibrilar, as regiões do estriado e da substância negra foram isoladas em primeiro lugar e depois homogeneizadas. O lisado de tecido cerebral foi preparado mediante a adição de tampão de lise (Amresco) e 1x inibidor de proteinase (Roche) ao homogenato. O lisado foi então separado por SDS-PAGE a 10% (eletroforese em dodecil sulfato de sódio-gel de poliacrilamida), transferido para a membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) e incubado durante a noite com leite 5% em PBS. Para detectar a abundância de neurônios dopaminérgicos, as membranas foram incubadas com anticorpo anti-tirosina hidroxilase (diluição 1:1000, Abcam), seguido de hibridização com o anticorpo secundário conjugado com IgG HRP anti-coelho (H + L) de cabra (diluição de 1:5000, Jackson Immunoresearch). Para visualização, Luminata Western HRP Substrates foram utilizados e o sinal resultante foi capturado com o sistema de imagem digital ChemiDoc-lt 810. A quantificação do nível de a-Syn oligomérica foi realizada através da normalização com o nível de GAPDH, e a relação de lisado não lesionado foi ainda padronizada para 100% para comparação.

[00316] No modelo induzido por MPP*, a redução na fração de a- Syn oligomérica foi mostrada nos animais imunizados com o construto de imunógeno peptídico de a-Syni11-1322 (Figura 13A). Da mesma forma, nos camundongos inoculados com a-Syn fibrilar, western blotting com lisados da substância negra e também do estriado do lado ipsilateral como a inoculação de a-Syn fibrilar (Figuras 14A e 14D) e com os lisados do estriado do lado contralateral da inoculação de a- Syn fibrilar (Figura 14F) mostrou que o nível de a-Syn oligomérica aumentado em até 2 a 3 vezes visto nos camundongos de controle adjuvantes foi mitigado após o tratamento com a construção formulada com a-Syn111-132 (SEQ ID NO: 113) e com a construção de a-Syn126-135 (SEQ ID NO: 112). A quantificação dos resultados de western blotting foi apresentada nas Figuras 13B, 14B, 14C, 14D e 14G. e. Redução na neuropatologia

[00317] Para os camundongos inoculados com a-Syn fibrilar, as regiões da substância negra foram isoladas em primeiro lugar e depois homogeneizadas. O lisado de tecido foi preparado pela adição de tampão de lise (Amresco) e 1x inibidor de proteinase (Roche) ao homogenato. O lisado foi então separado por SDS-PAGE a 10% (eletroforese em dodecil sulfato de sódio-gel de poliacrilamida), transferido para a membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) e incubado durante a noite com leite 5% em PBS. Para detectar a abundância de neurônios dopaminérgicos, as membranas foram incubadas com anticorpo anti-tirosina hidroxilase (diluição 1:1000, Abcam), seguido de hibridização com o anticorpo secundário conjugado com IgG HRP anti-coelho (H + L) de cabra (diluição de 1:5000, Jackson Immunoresearch). Para visualização, Luminata Western HRP Substrates foram utilizados e o sinal resultante foi capturado com o sistema de imagem digital ChemiDoc-lt 810. O nível de expressão de a-Syn foi padronizado com GAPDH (gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase) utilizado como o controle de carga de proteínas.

[00318] Os resultados demonstraram que a imunização com a construção de a-Syn111-132 restaurou a quantidade de tirosina hidroxilase para um nível equivalente àquela de animais normais não lesionados (Figuras 14C a 14D), sugerindo o efeito neuroprotetor dos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn contra a neurotoxicidade associada com a a-Syn agregada inoculada nos camundongos. f. Recuperação de atividades motoras

[00319] O CatWalk'" XT (Noldus information Technology, Wageningen, Netherlands) é um sistema de análise baseado em vídeo utilizado para medir objetivamente vários aspectos dos passos de maneira dinâmica, com base na posição, pressão e área de superfície de cada passo. Todos os camundongos foram treinados para atravessar a pista de maneira consistente pelo menos três vezes ao dia antes da experimentação. Um percurso bem-sucedido foi definido quando um animal atravessou a pista sem interrupção ou hesitação, e os camundongos que falharam no treinamento foram excluídos do estudo.

[00320] Uma média de 5 cruzamentos de cada mouse foi analisada. Visto que a inoculação de a-Syn fibrilar foi executada no cérebro direito, o tempo de espera das patas posteriores esquerdas foi considerado um parâmetro de referência, isoladamente com a duração do percurso.

[00321] No modelo inoculado com a-Syn fibrilar, observou-se diferença significativa na medição do tempo de espera do membro posterior esquerdo após o tratamento com composições contendo a- Syni126-135 (SEQ ID NO: 112) ou a-Syn111-1322 (SEQ ID NO: 113) (Figura 15A). Enquanto isso, tanto no modelo inoculado com a-Syn fibrilar quanto no modelo induzido por MPP*, diferença significativa na medição da duração do percurso foi observada após o tratamento com composições contendo a-Syn111-1322 (SEQ ID NO: 113) (Figuras 15B e 15C). Os resultados sugeriram uma associação de tratamento com construtos de imunógeno peptídico de a-Syn formuladas com a-Syn126- 135 (SEQ ID NO: 112) ou a-Syn111-1322 (SEQ ID NO: 113) e a melhora nas funções motoras dos dois modelos de mouse com PD. EXEMPLO 16

REATIVIDADES DE ANTICORPOS GERADOS PELO CONSTRUTO DE IMUNÓGENO PEPTÍDICO DE a-SYN COM DIFERENTES CLASSES DE a-SYN ENCONTRADAS NA DOENÇA

NEURODEGENERATIVA

[00322] A ao-Syn conduz a doença de Parkinson e outras sinucleinopatias. A proteína a-Syn é capaz de formar tipos distintos de agregados que possuem diferentes tamanhos e estruturas, e diferentes efeitos nas células, de modo que cada uma dessas doenças é impulsionada por um ou mais tipos diferentes de agregados. Os agregados de a-Syn de formas diferentes podem provocar diferentes padrões de danos no cérebro e podem ainda provocar doenças cerebrais distintas. Este estudo foi desenvolvido para avaliar como os anticorpos gerados pelos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn interagem com diferentes classes de a-Syn encontradas nas doenças neurodegenerativas.

[00323] Dr. Ronald Melki foi um colaborador deste estudo. Vários tipos distintos de agregados de a-Syn foram produzidos em laboratório os quais incluem (a) fibrila — um filamento sem interrupção longo, torcido e com zíper de proteínas a-Syn; (b) fita - uma estrutura mais ampla e mais plana; e (c) oligômeros de a-Syn (O550), oligômeros estabilizados por dopamina (ODA) e estabilizados por glutaraldeído (OGA).

[00324] Os anticorpos gerados em porquinhos da índia por vários construtos de imunógeno peptídico de a-Syn aqui divulgados foram testados quanto às suas afinidades relativas. Amostras representativas de PD-021514 (a-Syngs-140, wpi 08), PD-021522 (a-Synss-140, Wpi 13), PD-100806 (a-Syn126-135, wpi 09), PRX002, e uma Syn1 de anticorpo monoclonal comercial (clone 42) foram testadas nas montagens de a- Syn distintas, incluindo: fibrilas, fitas, fibrilas 65, fibrilas 91, fibrilas 110, na via de montagem fibrilar de oligômeros de a-Syn (O550), oligêmeros estabilizados por dopamina (ODA) e estabilizados por glutaraldeído (OGA), juntamente com um monômero de controle utilizando um ensaio de captura de filtro. Métodos e materiais a. Montagem de a-Syn em fibrilas e fitas

[00325] Para a formação de fibrilas, WT a-Syn solúvel foi incubada em tampão A (Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, KCl 150 mM) a 37 CT sob agitação contínua em um Eppendorf Thermomixer ajustado em 600 rom. A montagem foi monitorada continuamente em um espectrofluorímetro Cary Eclipse (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA) na presença de Thioflavin T (15 UM) em cubetas de 1 x 1 cm sob agitação (100 rpm) utilizando uma barra de agitação magnética (6 x 3 mm) com um comprimento de onda de excitação fixado em 440 nm e comprimentos de onda de emissão fixados em 440 nm e 480 nm, e um tempo médio de 1 s. Para a formação da fita, a WT a-Syn foi submetida à diálise 16 h contra 1000 volume de tampão B (Tris-HCI 5 mM pH 7,5) a 4 T, depois incubada a 37 C sob agit ação contínua em um Eppendorf Thermomixer ajustado em 600 rpm. A montagem foi monitorada pela medição da luz dispersa em 440 nm. Alternativamente, a quantidade de proteína remanescente no sobrenadante após sedimentação em 35.000 xg foi determinada pela medição da absorvância em 280 nm com um espectrofotômetro de matriz de diodos Hewlett Packard 8453. A natureza das espécies oligoméricas foi avaliada utilizando um Jeol 1400 (Jeol Ltd.) TEM após a adsorção das amostras em grades de malha 200 revestidas com carbono e coloração negativa com acetato de uranila a 1%. As imagens foram gravadas com uma câmera Gatan Orius CCD (Gatan). A capacidade das montagens de a-Syn de ligar o vermelho Congo foi avaliada como se segue: fibrilas e fitas de a-Syn foram incubadas durante 1 h com Congo Red 100 uM (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) em tampão Tris 20 mM (pH 7,5 ) Os polímeros foram então sedimentados a 20 C em uma ultracentrífuga TLI100 Tabletop Beckman (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA, USA) em 25.000 g durante 30 min. Os grânulos foram lavados quatro vezes utilizando um volume igual de água. Após ressuspensão dos grânulos, uma alíquota foi colocada em uma lamínula de vidro e retratada imediatamente ou deixada secar. As amostras foram visualizadas em campo claro e luz com polarização cruzada por microscopia de polarização utilizando um microscópio Leica (MZ12.5) equipado com polarizadores cruzados (Leica Microsystems, Ltd. Heerbrugg, Switzerland).

b. Determinação das concentrações de fibrila e fita de a-Syn

[00326] A heterogeneidade do comprimento das fibrilas e fitas de a- Syn foi reduzida por aplicação de energia sonora durante 20 minutos em gelo em tubos Eppendorf de 2 ml! em um VialTweeter alimentado por um processador ultrassônico UIS250v (250W, 2,4kHz; Hielscher Ultrasonic, Teltow, Germany) fixado em 75% de amplitude, pulsos de 0,5 s. As velocidades de sedimentação das fibrilas e fitas de a-Syn foram medidas. Os limites da sedimentação foram analisados com o software Sedfit, utilizando a modelagem do limite dos mínimos quadrados |s—-g*(s), que é mais adequada para misturas heterogêneas de partículas grandes. Isso produziu uma distribuição de partículas com coeficientes de sedimentação variando de 50 a 1508 para as fitas de a-Syn, de 100 a 10008 para as fibrilas de a-Syn, centradas em espécies que possuem coeficiente de sedimentação de —90S e 375S para fitas e fibrilas de a-Syn, respectivamente, correspondendo às partículas que possuem um peso molecular de -11.500 kDa, por exemplo, produzidas de -800 moléculas de a-Syn (12.000 kDa/14,5 kDa) para fitas de a-Syn, -102.000 kDa, por exemplo, produzidas de

7.000 moléculas de a-Syn (102.000 kDa/14,5 kDa) para fibrilas de a- Syn. Assim, na concentração de trabalho de 20 UM, as concentrações globais de partículas de fitas e fibrilas de a-Syn são 20 yuM/-800 = 0,02 uM, 20 uM/-7.000 = —-0,003 uM para fitas e fibrilas de a-Syn, respectivamente, dado que 100% de a-Syn é montado em fitas ou fibrilas em um estado estacionário, visto que 100% da proteína é encontrada na fração granulado após a centrifugação das amostras.

c. Avaliação da afinidade de endocorpos em diferentes fibrilas e fitas de a-Syn

[00327] A afinidade dos anticorpos gerados pelos construtos de imunógeno peptídico de a-Syn aqui divulgadas foi avaliada para montagens distintas de a-Syn utilizando um ensaio de captura de filtro com anticorpo como uma referência. As montagens de a-Syn (fibrilas, fitas, fibrilas 65, fibrilas 91, fibrilas 110, na via de montagem fibrilar oligômeros de a-Syn (O550), oligômeros estabilizados com dopamina

(ODA) e estabilizados com glutaraldeído (OGA)) são descritos em Bousset L. et al., 2013 Nat Commun 4:2575; Makky A. et al., 2016 Sci Rep 6:37970; e Pieri L. et al, 2016 Sci. Rep 6:24526. Uma a-Syn monomérica de controle também foi utilizada.

[00328] Quantidades crescentes de a-Syn fibrilar, oligomérica ou monomérica, na faixa de 20 pg a 200 ng, foram detectadas em filtros de nitrocelulose utilizando um mecanismo de filtração por hibridização em pontos. Os filtros foram então bloqueados com leite desnatado, incubados com o anticorpo PRX002 ou Syn1 ou os anticorpos GP de teste desta divulgação na diluição indicada. Após lavagem extensa, um segundo IgG-HRP anti-humano ou anti-porquinho da índia foi utilizado para detecção de perfis de ligação de anticorpos primários. Um controle apenas com o anticorpo secundário também foi testado. O Super Signal ECL (Pierce %34096) foi utilizado nos blots e os blots foram então representados em um gerador de imagens BioRad (sistema de formação de imagem Chemidoc MP/software BioRad imagelab). O tempo de exposição e a faixa dinâmica são indicados nas Figuras 16A a 16H. Um homogenato de cérebro humano de um caso DLB foi visto na membrana neste conjunto de medições. d. Resultados

[00329] A afinidade dos anticorpos de porquinho da índia PD- 021514 (a-Synss-140, wpi 08), PD-021522 (a-Synes-140, wpi 13), PD- 100806 (a-Syni126-135, wpi 09) de GPs imunizados, o PRX002 e os anticorpos comerciais Syn1 (clone 42) foram comparados para montagens distintas de a-Syn utilizando um ensaio de captura de filtro. As montagens de a-Syn utilizadas incluíam fibrilas, fitas, fibrilas 65, fibrilas 91, fibrilas 110, na via de montagem fibrilar oligômeros de a- Syn (O550), oligômeros estabilizados com dopamina (ODA) e estabilizados com glutaraldeído (OGA), juntamente com uma a-Syn monomérica de controle.

[00330] As Figuras 16A a 16H mostram que o anticorpo de referência, PRX002, reconhece com uma afinidade ligeiramente melhor com relação à a-Syn fibrilar, quando comparado com a a-Syn monomérica; enquanto que PD-100806 e PD-021514, ambos direcionados contra uma construção peptídica de a-Syn126-135 desta divulgação, possuem uma afinidade muito maior com relação à a-Syn fibrilar em comparação com a a-Syn monomérica, indicando que ambos possuem uma ligação preferencial à a-Syn fibrilar. As afinidades de PRX002 em relação à a-Syn oligomérica e fibrilar foram observadas serem semelhantes. Anticorpo monoclonal de Syn1 ligado a a-Syn fibrilar, assim como a a-Syn oligomérica e monomérica, sem muita preferência diferenciadora. EXEMPLO 17 ESTUDO DE IMUNO-HISTOQUÍMICA PARA ANTICORPOS DERIVADOS DE CONSTRUTOS DE IMUNÓGENO PEPTÍDICO DE a-

SYN COM SECÇÕES CEREBRAIS DE PACIENTES COM DOENÇA DE PARKINSON (PD), ATROFIA DE MÚLTIPLOS SISTEMAS (MSA) E DEMÊNCIA COM CORPOS LEWY (DLB)

[00331] Os anticorpos obtidos a partir da imunização de porquinhos da índia com um construto de imunógeno peptídico de a-Syn 26135 representativa desta invenção foram utilizados em um estudo imunoquímico para caracterizar sua capacidade de se ligar à a-Syn presente em seções cerebrais de pacientes com alfa-sinucleinopatias. O estudo foi conduzido em colaboração com a Prof. Roxana Carare. À capacidade dos anticorpos de se ligarem à a-Syn presente nas seções cerebrais obtidas de pacientes com PD, LBD e MSA foi avaliada. Tecidos saudáveis foram incluídos no estudo como um controle negativo. NCL-L-ASYN, um anticorpo monoclonal comercialmente disponível utilizado para o diagnóstico post-mortem de alfa- sinucleinopatias, foi incluído como um controle positivo. Esta investigação fornece evidência de imunorreatividade positiva de anticorpos direcionados contra o construto de imunógeno peptídico de a-SynN126-135 em seções teciduais de cérebros humanos de pacientes com SD, LBD e MSA. A ligação foi vista especificamente em cérebros de pacientes com sinucleopatias, mas não em cérebros de pacientes não mais com a ligação sendo mais pronunciada com os anticorpos de teste do que com o anticorpo de diagnóstico comercial. Métodos e materiais a. Descrição dos reagentes utilizados e seus fornecedores

[00332] Os anticorpos obtidos a partir da imunização em porquinhos da índia com um construto de imunógeno peptídico de a-Syn126-135 representativa foram utilizados na diluição de 1:100. PDO62220-09-1- 2-Syn; PDO62205-09-1-2-Syn; PD100806-09-1-2-Syn foram fornecidos pela United NeuroScience (UNS), NCL-L-ASYN (anticorpo monoclonal de camundongo utilizado na diluição 1:100) foi fornecido pela Leica Biosystems, HuD(E-l) (anticorpo monoclonal de camundongo em diluição de 1:100) foi fornecido pela Santa Cruz Biotechnology, Olig2 (anticorpos de coelho na diluição de 1:100) foi fornecido pela Millipore, Alexa Flour 594 (anti-porquinho da índia de cabra na diluição em 1:200), Alexa Flour 488 (anti-camundongo de cabra em 1:200) e Alexa Flour 488 (cabra-coelho em diluição de 1:200) foram fornecidos pela Molecular Probes life technologies. b. Tecido do Cérebro Humano

[00333] Seções de espessura em um foram obtidas no banco de cérebros UCL e utilizadas neste estudo. Todas as amostras foram coletadas e preparadas de acordo com os protocolos aprovados do National Research Ethics Service.

[00334] O tecido foi obtido de indivíduos (Tabela 15) com patologia de a-Syn primária, incluindo atrofia de múltiplos sistemas (MSA; n=3), Demência com corpos de Lewy (DLB; n = 3) e doença de Parkinson

(PD; n = 3). Os indivíduos foram diagnosticados post-mortem de acordo com os critérios publicados**.

c. Imuno-histoquímica de Seres Humanos de Sinucleinopatias

[00335] A imuno-histoquímica (IHC) em seres humanos de três diferentes sinucleinopatias (MSA, DLB e PD) foi conduzida de modo a comparar quantitativamente a especificidade para agregados de a-Syn dos três anticorpos fabricados pela United Neuroscience (UNS). A especificidade dos anticorpos da UNS (PDO062220, PDO62205 e PD100806) com relação aos agregados de a-Syn foi comparada com a especificidade de um anticorpo diagnóstico comercialmente disponível (NCL-L-ASYN). A especificidade do anticorpo foi analisada nas seguintes quatro regiões cerebrais em cada paciente e tipo de doença (1) Putâmen, Cápsula Interna e Córtex Ínsula; (2) Mesencéfalo: Substância Negra; (3) Córtex Temporal: Massa Cinzenta Cortical; e (4) Cerebelo: Massa Branca Subcortical; Massa Branca Cerebelar.

[00336] Estas regiõês do cérebro são conhecidas de serem afetadas pela agregação de a-Syn em graus variados e em vários estágios da progressão da doença em cada tipo de doença. Geralmente, os gânglios basais e o mesencéfalo são afetados no início da DLB, SD e MSA e também apresentam a maior carga agregada. O córtex temporal e o cerebelo são afetados em estágios posteriores da doença, com muito pouco agregado cerebelar presente na PD e DLB. Controles negativos (não utilizando nenhum anticorpo primário) foram executados ao lado de cada protocolo IHC para confirmar a ausência de ligação não específica do anticorpo secundário. As lâminas embebidas em parafina foram submetidas ao tratamento de retirada de parafina em um forno a 60 (C durante 15 a 20 minutos e depois imersas em Xylene | e Il durante 5 minutos cada. O tecido foi reidratado em 4 diluições de IMS de 100% a 50% durante min cada. O tecido foi lavado 3 vezes durante 5 minutos em 1 x PBS e subsequentemente incubado durante 3 minutos em ácido fórmico a 100% para recuperação de antígeno.

O tecido foi lavado cuidadosamente com 1 x PBS antes de extinguir a atividade de peroxidase endógena com H2O2 a 3% durante 10 min.

O tecido foi deixado esfriar e lavado mais 3 vezes em 1 x PBS (5 min cada) antes da colocação em microondas com tampão de citrato (15 mM de tris citrato de sódio, TWEEN, pH 6) em aquecimento médio durante 25 min, a fim de garantir a microonda igual por operação, 3 prateleiras de lâminas em 3 recipientes foram incluídas de cada vez.

As lâminas foram deixadas esfriar e foram lavadas três vezes em 1 x PBS (5 min) antes de bloquear os sítios de ligação não específicos com soro de cabra normal a 15%. O tecido foi incubado em anticorpo primário (1:100 em TBS/t 0,1%) durante a noite a 4 (C.

O tecido foi lavado 3 x 5 min em 1 x PBS e incubado durante 1 hora (RT) em um anticorpo secundário biotinilado.

A solução ABC foi preparada 30 minutos antes de sua aplicação.

Após a lavagem do tecido 3 x 5 min 1 x PBS, ele foi incubado em ABC durante 1 hora na RT.

O substrato de peroxidase VIP foi preparado utilizando o Kit IMMPACTVIP peroxidase, conforme detalhado nas instruções do fabricante.

O substrato de peroxidase VIP foi adicionado durante 7 minutos na RT e lavado em dH2O.

Antes da montagem em DPX, o tecido foi desidratado durante 2 min cada em IMS 50%, 70%, 95%, 100%, 100% e Xylenes | & Il.

Para dupla coloração imunofluorescente, o tecido não foi suprimido com H2O>2 a 3% antes da aplicação do anticorpo primário.

Após a aplicação dos primeiros anticorpos primários e secundários equivalentes, o tecido foi bloqueado com soro de cabra normal a 15% durante 30 min e incubado com o segundo anticorpo primário e secundário como descrito anteriormente.

Após a aplicação final dos anticorpos secundários marcados com fluorescência, o tecido foi incubado em 1% Sudan Black durante 5 min para suprimir a autofluorescência, lavado em TBS/T 0,1% e imediatamente montado em movwiol citifluor. O tecido corado com fluorescência foi armazenado a 4 CC até que retratado. d. Análise e Estatística de Imagens

[00337] As lâminas foram lidas opticamente para análise na objetiva x20 utilizando um Olympus VS110 high throughput Virtual Microscopy System ou Olympus dot Slide Virtual Microscopy System. Trinta imagens (cada uma de 500 um?) foram capturadas da imagem digitalizada utilizando o software Olympus VS das áreas equivalentes de cada região de cada indivíduo (ver as Figuras 17A-17D, 18A-18D, 19A-19C, 20A-20E, 21A-21F, 22A- 22C,24A-24D e 25A-25D). Isso permitiu a análise de uma área total de 7,5 mm? em cada região do cérebro. O software ImageJ version Fiji windows-64 foi utilizado para a análise quantitativa da imunorreatividade a-Syn de cada imagem.

[00338] Para a análiseda quantidade total de a-Syn detectada por cada anticorpo, as imunorreatividades foram relatadas como uma porcentagem da área total da imagem. O limiar aplicado para a seleção da imunorreatividade positiva para a-Syn foi ajustado para cada região do cérebro analisada, a fim de explicar as diferenças na coloração de fundo que poderiam afetar os resultados. A área percentual média coberta por agregados positivos de a-Syn foi calculada para cada anticorpo e região do cérebro analisada.

[00339] Para análise da especificidade relativa de cada anticorpo para LBs ou LNs, o software Fiji foi utilizado para quantificar a imunorreatividade dos LBs com base em parâmetros de tamanho e circularidade para distingui-los dos LNs (ver as Figuras 24A-24D, 25A- 25D e 26A-26B). As regiões do cérebro com morfologia distinta de LBs e LNs foram selecionadas para esta análise para evitar falsos positivos e incluíram o córtex ínsula dos gânglios basais e a massa cinzenta cortical do córtex temporal. A imunorreatividade de LB foi expressa como uma porcentagem da imunorreatividade total de a-Syn.

[00340] A análise estatística foi conduzida utilizando o software GraphPad Prism v7.01 e é relatada como média + SD (a menos que especificado de outra forma). Os resultados foram analisados com uma análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida de análise post-hoc com correções de Dunnett, onde aplicável. As diferenças foram consideradas como significativas quando p < 0,05 (*). Os números (n) se referem ao número de indivíduos utilizados para cada experimento.

[00341] A análise qualitativa da localização da a-Syn dentro dos neurônios ou glia foi obtida pela coloração com dupla imunofluorescência como descrita anteriormente. As lâminas foram visualizadas com um microscópio confocal de varredura a laser Leica SP8. As imagens sobrepostas de projeções máximas foram obtidas em objetiva x40 em série. Essas imagens compreenderam uma série de imagens z-slide empilhadas juntamente com os dois canais de cores sobrepostos para mostrar suas posições relativas. e. Anticorpos de a-Syni26-135 detectaram um padrão diferente de agregados de a-Syn, em comparação com NCL-L-ASYN

[00342] O tipo de célulae a localização subcelular dos agregados a- Syn variam entre as diferentes sinucleinopatias. A MSA é caracterizada por inclusões citoplasmáticas gliais (GCI), enquanto que na DLB e PD a agregação de a-Syn ocorre dentro dos corpos celulares dos neurônios (LBs) e nos processos axonais (LNs). À análise da área percentual corada permitiu a quantificação do total de agregados de a-Syn detectados por cada anticorpo. No entanto, isso não levou em consideração as diferenças no tipo ou localização subcelular dos agregados detectados. O padrão distinto de agregados de a-Syn nos corpos celulares e neurites nos casos de SD e DLB, permitiu que a sensibilidade relativa dos anticorpos da UNS desta divulgação a esses diferentes tipos de agregados de a-Syn seja quantificada.

[00343] Para investigar isso, a proporção de agregados detectados dentro dos corpos celulares foi estimada para cada anticorpo nos casos de DLB e PD. Utilizando o software FIJI, os agregados dentro dos corpos celulares foram selecionados com base em seu tamanho e circularidade. A área percentual média dos agregados do corpo celular foi então calculada como uma proporção do total de a-Syn detectado e os resultados são mostrados nas Figuras 24A a 24D e 25A a 25D. À diferença na área percentual de a-Syn total e do corpo celular foi atribuída aos agregados axonais de a-Syn (LNs) com base na análise qualitativa do tecido. Uma diminuição na proporção da detecção de a- Syn do corpo celular retribui um aumento na detecção de LN. Esta análise foi conduzida na massa cinzenta do córtex temporal e córtex ínsula porque essas regiões apresentaram patologias semelhantes tanto a LB quanto a LN. Os LNs eram muito esparsos e espalhados de maneira desigual através do putâmen e cápsula e, portanto, essas regiões dos gânglios basais não foram selecionadas para esta análise. Uma correlação semelhante foi observada na substância negra do mesencéfalo (Figuras 26A e 26B) com anticorpos da UNS desta divulgação detectando níveis mais altos de LNs em comparação com NCL-L-ASYN em DLB e PD. No entanto, devido à morfologia complexa dos LNs e LBs, não foi possível diferenciá-los e quantificá- los de maneira confiável com o mesmo método.

[00344] Os resultados nas Figuras 24A a 24D mostram que, da a- Syn total detectada por cada anticorpo, a proporção de agregados detectados dentro dos corpos celulares foi diminuída com anticorpos da UNS em comparação com NCL-L-ASYN. Isso significa que a relação de inclusões do corpo celular por LNs foi reduzida e uma proporção mais elevada de LNs foi detectada com anticorpos da UNS.

Dos anticorpos UNS, o PDO62205 foi consistente entre DLB e PD na detecção de altas proporções de LNs no córtex ínsula (Figuras 17A a 17D e 18A a 18D). Por outro lado, todos os anticorpos de a-Syn126-135 detectaram proporções mais elevadas de agregados do corpo celular em comparação com NCL-L-ASYN na massa cinzenta do córtex temporal dos casos de DLB e PD (Figura 25A a 25B). f. Agregação de a-Syn é Específica do Tipo de Célula

[00345] Os agregados contendo a-Syn são a marca patogênica característica das sinucleinopatias, incluindo MSA, DLB e PD. Embora a agregação de a-Syn seja a principal proteína causadora nas sinucleinopatias, o padrão de agregação e os tipos de células suscetíveis à formação de agregados diferem entre os subtipos específicos das doenças. A caracterização clínica de MSA, DLB e PD descreve o acúmulo de a-Syn dentro dos corpos celulares e processos neríticos de neurônios em DLB e PD, mas em MSA é encontrado principalmente dentro das célula da glia e oligodendrócitos.

[00346] A fim de estabelecer a seletividade de anticorpos de a- SyNi126-135 para os agregados de a-Syn específicos de células, a imunofluorescência dupla foi executada utilizando PDO62205 e marcadores para neurônios (HuD) ou oligodendrócitos (Olig2).

[00347] Os resultados da Figura 27A a 27C mostram que a a-Syn, detectado por PDO62205, se colocaliza dentro dos corpos celulares neuronais nos gânglios basais e no mesencéfalo (regiões de alta patologia) na PD e DLB, mas não na MSA. Utilizando marcadores para oligodendrócitos (Olig2), as Figuras 28A a 28C mostram que na MSA, mas não na PD ou DL, a a-Syn se agrega dentro das células da glia. Estes resultados demonstram que os anticorpos de a-Syni26-135 São consistentes com a caracterização clínica dessas sinucleinopatias e confirmam a especificidade desses anticorpos com relação aos agregados patológicos de a-Syn.

Resultados a. Análise Quantitativa de Anticorpos derivados da imunização em porquinhos da índia com um construto de imunógeno peptídico de a- SynN126-135 representativa para imunoterapia

[00348] Para investigar o uso de novos anticorpos anti-a-Syn para imunoterapia, a análise quantitativa da especificidade relativa de cada anticorpo para a-Syn foi executada por imuno-histoquímica (IHC) em casos humanos de três sinucleinopatias (MSA, DLB e PD). b. Anticorpos derivados da imunização em porquinhos da índia com um construto de imunógeno peptídico de a-Syn126-135 representativa são mais sensíveis do que os anticorpos de diagnóstico comercialmente utilizados na ligação aos agregados de a-Syn

[00349] Afim de investigar a antigenicidade relativa dos anticorpos de a-Syni26-135 divulgados, a carga de a-Syn detectada com cada anticorpo foi comparada a um anticorpo de diagnóstico comercialmente disponível para sinucleinopatias (NCL-L-ASYN). Ao examinar Em primeiro lugar o padrão geral de resultados mostrado nas Figuras 17A-D a 22A-22C, pode-se observar que há um aumento notável na área percentual média de a-Syn detectada com anticorpos de a-Syni26135 em comparação com NCL-L-ASYN. Esta tendência é consistente em cada região do cérebro e tipo de doença e sugere que os anticorpos de a-Syn1i26-135 divulgados sejam mais sensíveis ou seletivos na ligação à a-Syn agregada do que NCL-L-ASYN. Embora o tamanho da amostra tenha sido relativamente pequeno neste estudo (n = 3), uma clara tendência nos dados ainda pode ser vista. À especificidade dos anticorpos de a-Syn126-135 divulgados para a a-Syn foi confirmada nas mesmas regiões do cérebro de cérebros de pacientes de controle não doentes. Estes resultados, que são mostrados nas Figuras 23A-23B, mostram a ausência de qualquer coloração imuno-positiva com cada anticorpo incluindo NCL-L-ASYN.

Estes dados indicam que os anticorpos de a-Syn126-135 divulgados são específicos para formas patológicas de a-Syn. c. O nível mais elevado de a-Syn detectado utilizando anticorpos de a- SyN126135 é indicativo de sua sensibilidade e especificidade melhoradas quando comparado com os anticorpos comerciais

[00350] Os anticorpos de a-Syniz6135 da presente invenção detectam uma quantidade maior de a-Syn quando comparados com NCL-L-ASYN, o que indica que os anticorpos divulgados são mais favoráveis para uso em imunoterapia para facilitar a depuração desses agregados de a-Syn.

[00351] A primeira etapa na seleção de um anticorpo apropriado para uso como reagente de imunoterapia é estabelecer a seletividade dos anticorpos para o antígeno alvo (a-Syn) no tecido cerebral humano com patologia primária de a-Syn. As diferentes sinucleinopatias variam nos mecanismos e no padrão neuroanatômico da agregação de a-Syn, assim como na vulnerabilidade de tipos celulares específicos à agregação.

[00352] É importante avaliar a seletividade dos anticorpos de a- Syni126-135 com relação à a-Syn em diferentes sinucleinopatias com neuropatologia distinta, a fim de investigar o uso de um reagente como uma imunoterapia para sinucleinopatias em geral. Casos clinicamente confirmados de SD, DLB e MSA foram selecionados para esse propósito. PD e DLB são as segundas formas mais comuns de demência e são provocadas principalmente pelo acúmulo de a-Syn nos neurônios (LB e LN). Em contraste com a PD, sabe-se que as patologias de beta-amiloide e tau contribuem para a neurodegeneração na DLB2. Um padrão diferente de agregação de a- Syn é observado em MSA, em que os agregados são formados principalmente dentro das células da glia em vez dos neurônios (Figuras 27A a 27C e 28A a 28B). Além disso, a progressão da patologia de a-Syn varia entre os tipos de doenças com o mesencéfalo e os gânglios basais sendo regiões comuns da patologia precoce. O exame da antigenicidade de cada anticorpo nas regiões do cérebro afetadas em estágios variados da doença fornecerá discernimento sobre qual anticorpo pode ser mais eficaz no tratamento dos estágios iniciais da doença. d. Os anticorpos de a-Syn126-135 (PDO62220, PDO062205 e PD100806) são capazes de se ligar especificamente aos agregados patológicos de a-Syn no tecido cerebral humano de PD, DLB e MSA (Figuras 17A- D a 22A-22C) sem detectar qualquer patologia da sinucleíina em controles saudáveis (Figuras 23A-23B).

[00353] A detecção de a-Syn pelos anticorpos de a-SynNi126-135 divulgados foi alcançada com a mesma especificidade de tipo de célula que foi descrita na neuropatologia clínica (Figuras 27A a 27B e 28A a 28B). É importante ressaltar que os anticorpos de a-Syn126-135 divulgados não demonstraram antigenicidade igual para todas as formas de a-Syn humana.

[00354] A especifiidade de PDO62205 e PD100806 foi ainda verificada em cada capacidade de anticorpo para detectar uma proporção maior de LNs do que NCL-L-ASYN nos gânglios basais (Figuras 24A a 24D). Isso também foi observado visualmente no mesencéfalo (Figura 26A a 26B). Tomados em conjunto, com a maior área percentual de a-Syn detectada por PDO62205 e PD100806, esses resultados indicam que a a-Syn adicional detectada pelos anticorpos de a-Syn126-135 divulgados pode ser parcialmente atribuída a uma especificidade aumentada desses anticorpos para LNs. Esses resultados são benéficos para a imunoterapia porque, nos estágios iniciais da doença, os LNs são a forma predominante de agregação de a-Syn nos gânglios basais. Outros reagentes para o tratamento de sinucleinopatias que estão sob desenvolvimento pré-clínico, não fornecem detecção por IHC de LNs. Assim, as construções de imunógenos peptídicos divulgadas e os anticorpos de a-Syni126-135 gerados a partir dos construtos de imunógeno peptídico possuem propriedades e características únicas em comparação com outros produtos comercialmente disponíveis.

[00355] O presente estudo utilizou a IHC para analisar a sensibilidade dos anticorpos de a-Syni126-135 obtidos pelos construtos de imunógeno peptídico divulgadas medindo a quantidade média de agregados de a-Syn nas regiões cerebrais afetadas. O presente estudo, que quantificou a área percentual média da a-Syn em amostras de cérebro, demonstra que os anticorpos de a-Syni126-135 divulgados eram muito sensíveis à detecção de a-Syn mais precoce na progressão da doença de MSA, DLB e PD comparados a um anticorpo comercialmente disponível.

[00356] A maior sensibilidade encontrada neste estudo pode ser atribuída a uma maior especificidade dos anticorpos divulgados aos LNs sobre o anticorpo de diagnóstico, NCL-L-ASYN. Estes resultados sugerem que os anticorpos de a-Syniaxs-135 divulgados sejam provavelmente os candidatos mais eficazes para a investigação da depuração auxiliada por anticorpos de agregados de a-Syn nas sinucleinopatias. Tabela 1 Sequências de Aminoácido de a-Syn e Seus Fragmentos Empregados nos Ensaios Sorológicos [georsesnmádo [00H [sei — —

VTGVT AVAOK TVEGA GSIAA ATGFV KKDOQL GKNEE GAPQE GILED MPVDP DNEAY EMPSE EGYQD YEPEA

DMPVD PDNEA YEMPS EEGYQ DYEPE A ssa [001 [sus —

PDNEA YEMPS EEGYQ DYEPEA

EMPSE EGYQD YEPEA memo Je CSS SS

YEPEA GYQD

[gossscemca [sbt | mer — — Tabela 1 (continuação) [Pops arimennão — Tamo ses — [ssmaenma Toto a EEDNTAVR | [sena tao Tg ver —

Tabela 2 Sequências de Aminoácido dos Epítopos Th Derivados da Proteína Patogênica Incluindo Epítopos Th Artificiais Idealizados para o Emprego no Projeto dos Construtos de imunógeno Peptídico de a-Syn so SRB Tea Clostridium tetani1 Th 70 Clostridium tetani2 Th 73

TRT TRT KKKLFLLTKLLTLPQSLD

RRRIKII RILIL IR HBsAg1 Th VRVW WVIV

FFF FFFVF F TRT TR

FFLL LITTI ASA TRATOR jor meat a sera sea favs — | Clostridium tetani TT2 Th |

RR ER RAE [re E Te

FERE RARO Tabela 3 Sequências de Aminoácido dos Construtos de imunógeno Peptídico de a-Syn Descrição do Peptídeo ” Pp Sequência ——a mA UBITh3-cK-KKK-a-Sinucleína 121-140 — [100 UBITh3-ek-KKk-DNEAYEMPSEEGYQDYEPEA UBITh3-cK-KKK-a-Sinucleina 111-140 — | 101 DBMTIS-eeKdo

GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA UBITh3-ek-kkk- UBITh3-cK-KKK-a-Sinucleína 101-140 — | 102 GKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGY

QDYEPEA UBITh1-ek-kkk- UBITh1-eK-KKK-a-Sinucleína 101-140 — | 103 GKNEEGAPQEGILEDMPVYDPDNEAYEMPSEEGY

QDYEPEA UBITh2-ek-kkk- UBITh2-cK-KKK-a-Sinucleina 101-140 — | 104 GKNEEGAPQEGILEDMPVYDPDNEAYEMPSEEGY

QDYEPEA UBITh3-ek-kkk- UBITh3-cK-KKK-a-Sinucleína 91-140 105 ATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEA

YEMPSEEGYQDYEPEA UBIT3-ck-kkk- UBITh3-cK-KKK-a-Sinucleína 85-140 106 AGSIAMATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPV

DPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA UBITh1-eK-KKK-a-Sinucleína 121-1385 — [107 UBITh1-ek-kKkk-DNEAYEMPSEEGYQD

GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQD meets e mana

GKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQD

1. , SeqlD o Descrição do Peptídeo no: Sequência UBITh1-ek-kkk- UBITh1-eK-KKK-a-Sinucleína 97-135 110 KDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSE

EGYQD UBITh1-eK-KKK-a-Sinucleína 123-135 111 UBITh1-ek-kkk-EAYEMPSEEGYQD UBITh1-eK-KKK-a-Sinucleína 126-135 112 UBITh1-ek-kkk-EMPSEEGYQD UBITh1-eK-KKK-a-Sinucleína 111-132 113 UBITh1-ek-kkk-GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG UBITh1-ek-kkk- UBITh1-eK-KKK-a-Sinucleína 101-132 114

GKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG UBITh1-ecK-KKK- — Mouse — counterpart , 115 UBITh1-ek-kkk-GILEDMPVYDPGSEAYEMPSEEG a-Sinucleína 111-132 UBITh3-cK-KKK-a-Sinucleína 126-135 116 UBITh3-ek-kkk-EMPSEEGYQD UBITh3-eK-KKK-a-Sinucleína 111-132 117 UBITh3-ek-kkk-GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG UBITh1-eK-a-Sinucleína 126-135 118 UBITh1-ck-EMPSEEGYQD UBITh1-eK-a-Sinucleína 111-132 119 UBITh1-ek-GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG UBITh2-eK-a-Sinucleína 126-135 120 UBITh2-ek-EMPSEEGYQD UBITh2-eK-a-Sinucleína 111-132 121 UBITh2-ek-GILEDMPVYDPDNEAYEMPSEEG KKQYIKANSKFIGITEL-ek- Clostridium tetanit Th-cK-a-Syn 111-132 | 122

GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG LSEIKGVIVHRLEGV-ek- MvF1 Th-eK-a-Sinucleína 111-132 123

GILEDMPVYDPDNEAYEMPSEEG GAYARCPNGTRALTVAELRGNAEL-ek- Bordetella pertussis Th-cK-a-Syn 111-132 | 124

GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG WVRDIIDDFTNESSOKT-ek- Clostridium tetani2 Th-eK-a-Syn 111-132 | 125

GILEDMPVYDPDNEAYEMPSEEG DSETADNLEKTVAALSILPGHGC-ek- Diphtheria Th-eK-a-Syn 111-132 126

GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG Plasmodium falciparum Th-eK-a-Syn 111- sm DHEKKHAKMEKASSVFNVVNS-ek- 132 GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG Schistosoma mansoni Th-cK-a-Syn 111- 128 KWFKTNAPNGVDEKHRH-ek- 132 GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG ALNIWDRFDVFCTLGATTGYLKGNS-ek- Cholera Toxin Th-cK-a-Syn 111-132 129

GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG ISEIKGVIVHKIEG|-ek- MvF2 Th-eK-a-Syn 111-132 130

GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG

Tabela 3 (continuação) Seq Descrição do Peptídeo ID Sequência NO: KKKISISEIKGVIVHKIEGILF-ek- KKKMvF3 Th-eK-a-Syn 111132 131 |GILEDMPVYDPDNEAYEMPSEEG

TRT TRT KKKLFLLTKLLTLPOSLD-ek- 13 GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG

RRRIKI RI LIR HBsAg1 Th-eK-a-Syn 111-132

VRVW WVIV FFF FFFVF

F KKKIITITRIITIPOSLD-ek-GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG HBsAg2 Th-cK-a-Syn 111-132 133

FFLL LITTI Influenza MP1 1 Th-eK-a-Syn/111- 13 134 | FVFTLTVPSER-âk-GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG Influenza MP1 2 Th-eK-a-Syn/111- 13 135 | SGPLKAEIAQRLEDV-âk-GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG Influenza NSP1 Th-eK-a-Syn 111-132 [1386 | DRLRRDOKS-âk-GILEDMPVYDPDNEAYEMPSEEG AGLTLSLLVICSYLFISRG-âk- EBV BHRF1 Th-cK-a-Syn 111-132 — | 137

GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG Clostridium tetani TT1 Th-cK-a-Syn 111132 138 | QYIKANSKFIGITEL-ák-GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG PGPLRESIVCYFMVFLOTH|-âk- EBV EBNA-1 Th-cK-a-Syn 111-132 — [139

GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG Clostridium tetani TT2 Th-eK-a-Syn 14 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-âk- 111-132 GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG Clostridium tetani TT3 Th-eK-a-Syn 114132 141 | KFIKRYTPNNEIDSF-âk-GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG Clostridium tetani TT4 Th-eK-a-Syn 111132 142 |VSIDKFRIFCKALNPK-âk-GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG VPGLYSPCRAFFNKEELL-âk- EBV CP Th-eK-a-Syn 111-132 148

GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG HCMV IE1 Th-eK-a-Syn 111-132 DKREMWMACIKELH-âk-GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG EBV GP340 Th-cK-a-Syn 111-132 — [145 | TGHGARTSTEPTTDY-âk-GILEDMPVYDPDNEAYEMPSEEG EBV BPLF1 Th-eK-a-Syn 111-132 KELKRQYEKKLRO-âk-GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG EBV EBNA-2 Th-cK-a-Syn 111-132 TVFYNIPPMPL-âk-GILEDMPVDPDNEAYEMPSEEG

Tabela 4 Avaliação da Imunogenicdade em Porquinhos da Índia de Fragmentos de peptídeo de a-Syn C-terminal para Identificação de Epítopos Th Autólogos Seq ID la-Syn (a8s-4140) (SEQ ID NO: 4) Título de ELISA Logio

Descrição do Peptídeo

5413 Joo7s 9,000 9,000 9,000

15414 — [0,086 10,000 10,000 10,000 a-sinucleína (E126-A140)

5415 fo,o7o 9,000 9,000 9,000 juédia Jo,oso 0,000 o,000 0,000

5416 — Joose 9,000 9,000 9,000 faiz Joca ooo 9,000 9,000 a-sinucleína (D121-A140)

15418 — [0,066 10,000 10,000 10,000 juédia Joo71 9,000 0,000 9,000

15419 — [0,060 10,000 10,000 10,000

5420 — Jo,089 9,000 9,000 1,026 la-sinucleína (G111-A140) — |7

5422 — Jo,o84 0,000 1,997 3,096

5423 — Jo,o72 9,000 9,000 9,000 a-sinucleína (G101-A140) 6

5424 foor7 9,000 9,000 9,000 juédia Jo,o78 0,000 0,666 032 =

5425 — Jo,o82 0,000 9,000 0,000 a-sinucleína (A91-A140) 5

5427 — Jo,093 9,000 2,840 3,355

5429 — Jo,o82 9,000 9,000 9,000 (a-sinucleína (A85-A140) 4

5430 [ao — Jovooo 3,005 2,894

Tabela 5 Classificação de Imunogenicidade em Porquinhos da Índia de Construtos de imunógeno Peptídico de a-Syn , [a-Syn (6101-2140) (SEQ ID NO: 6) 'construto de imunógeno — [Seg ID YR tídico de a-sinucleí o: Título ELISA Logio a-sinucleína (G101-A140) 5433 — Jotio 4,799 4,920 4,924 Média — lo,129 4,775 4,946 4,885 5434 — foto 10,000 3,095 2 UBITh2-eK-KKK- 104 [5485 oro 2,743 4,439 4,052 la-sinucleína (G101-A140) 5436 0,097 9,967 1,790 veda fon fia ars eso c > ; : - ee — AA S s 3 PE

S " = F8Ss ke FE * des o 5 F sil is o sos lb des : ão TT ss) ele = vs =. a : * n32 ss 2 os + ! : i N es 28 oe os : é : a ss * : ão TE S 2 2 Ss = des gv, o 85” ee [a] ie É sc = + : o S| — seja -- e (=) ss TE ã. 2. o Zss IO e : : se S à. - E &s s8/S 2 | - = Se — ST = FEZ " : : o <a Re - á v"v 8 1 í 2 . ds | + alle Ss) = i SaSS 5 à. : ? E FsS5 Zles : 7 SE ls a “ E gs o [ O à. o - 3 8/2 o . õ E : á : o S Se : = R 28 de ' o q cd - io a de : o Í S & S 5 de * : . alelos o Silos E IM f < d : E a jd: : + ae e) v : é : ss - : a : : o ss SR * < à : Sis ss de :

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Tabela 10 Inibição da Agregação de a-Syn por Anticorpos de Animais que Recebem Construtos de imunógeno Peptídico de a-Syn Descrição do Peptídeo ema fe emssntameno Jo RR A

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Tabela 12 Avaliação Neuroprotetora nos Neurônios Neurodegenerativos Acionados por Agregados de a-Syn pela Quantificação do Número de Neurônios através da Análise de Alto Conteúdo utilizando Anticorpos de Animais que Recebem Construtos de imunógeno Peptídico de a-Syn Descrição do peptídeo ETs pes UBITh3-eK-KKK-a-Sinucleína 85140 Sc Fr rec UBITh3-eK-KKK-a-Sinucleína 111-140 e ER RE UBITh3-eK-KKK-a-Sinucleína 121-140 e ER so rr E

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Tabela 15

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Construto de imunógeno peptídico de alfa-sinucleína (a- Syn), caracterizado pelo fato de que compreende: um epítopo de células B compreendendo cerca de 10 a cerca de 25 resíduos de aminoácido de um fragmento C-terminal de a- Syn que corresponde próximo do aminoácido G111 até próximo do aminoácido D135 da SEQ ID NO: 1; um epítopo auxiliar T compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 70 a 98; e um espaçador heterólogo opcional selecionado do grupo que consiste em um aminoácido, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (a, e-N)Lys, e e-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 148), em que o epítopo de células B está covalentemente ligado ao epítopo T auxiliar diretamente ou através do espaçador heterólogo opcional.

2. Construto de imunógeno peptídico de a-Syn de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o epítopo de células B é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 12 a 15, 17 e 49 a 63.

3. Construto de imunógeno peptídico de a-Syn de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o epítopo auxiliar T é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 81, 83 e 84.

4. Construto de imunógeno peptídico de a-Syn de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o espaçador heterólogo opcional é (a, e-N)Lys ou e-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 148).

5. Construto de imunógeno peptídico de a-Syn de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o epítopo auxiliar T é covalentemente ligado ao terminal amino do epítopo de células B.

6. Construto de imunógeno peptídico de a-Syn de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o epítopo auxiliar T está covalentemente ligado ao terminal amino do epítopo de células B através do espaçador heterólogo opcional.

7. Construto de imunógeno peptídico de a-Syn de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a seguinte fórmula: (Th) HA) fragmento C-terminal de a-Syn)—X ou (fragmento — C-terminalh de — a-Syn)— (A) (Th)n=X em que Thé o epítopo T auxiliar; A é o espaçador heterólogo; (fragmento C-terminal de a-Syn) é o epítopo de células B; X é um a-COOH ou a-CONH>2 de um aminoácido; m é de | a cerca de 4; e n é de 1 a cerca de 10.

8. Construto de imunógeno peptídico de a-Syn de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 107, 108, 111 a 113 é 115 a 147.

9. Construto de imunógeno peptídico de a-Syn de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 107, 108 e 111 a 113.

10. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o construto de imunógeno peptídico de a-Syn como definido na reivindicação 1.

11. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende mais do que um construto de imunógeno peptídico de a- Syn como definido na reivindicação 1.

12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que os construtos de imunógeno peptídico de a-Syn possuem sequências de aminoácido das SEQ ID NOs: 112 e

113.

13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o construto de imunógeno peptídico de a-Syn como definido na reivindicação 1 e um veículo e/ou adjuvante de liberação farmaceuticamente aceitável.

14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a. o construto de imunógeno peptídico de a-Syn é selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 107, 108, 111 a 113e 115a 147; e b. o adjuvante é um sal mineral de alumínio selecionado do grupo que consiste em AI(OH)3 ou AIPO..

15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a. o construto de imunógeno peptídico de a-Syn é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 107, 108, 111 a 113e 115a 147; e b. o construto de imunógeno peptídico de a-Syn é misturado com um oligodesoxinucleotídeo CpG (ODN) para formar um complexo imunoestimulador estabilizado.

16. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao epítopo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao epítopo de células B do construto de imunógeno peptídico de a-Syn como definido na reivindicação 1.

17. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao epítopo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que está ligado ao construto de imunógeno peptídico de a-Syn.

18. Anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao epítopo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao epítopo de células B do construto de imunógeno peptídico de a-Syn como definido na reivindicação 9.

19. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao epítopo como definido na reivindicação 16.

20. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao epítopo como definido na reivindicação 18.

21. Composição de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que compreende uma mistura de a. um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao epítopo que se liga especificamente ao epítopo de células B da SEQ ID NO: 112; e b. um anticorpo isolado ou seu fragmento de ligação ao epítopo que se liga especificamente ao epítopo de células B da SEQ ID NO: 113.

22. Método de produção de anticorpos que reconhecem a a-Syn em um hospedeiro, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao hospedeiro de uma composição compreendendo o imunógeno peptídico de a-Syn como definido na reivindicação 1 e um veículo e/ou adjuvante de liberação.

23. Método para inibir a agregação de a-Syn em um animal, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade farmacologicamente eficaz do imunógeno peptídico de a- Syn como definido na reivindicação 1 ao animal.

24. Método para reduzir a quantidade de agregados de a-

Syn em um animal, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma quantidade farmacologicamente eficaz do imunógeno peptídico de a-Syn como definido na reivindicação 1 ao animal.

25. Método para identificar agregados de a-Syn de diferentes tamanhos em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende: a. a exposição da amostra biológica ao anticorpo ou seu fragmento de ligação ao epítopo de acordo com a reivindicação 16, sob condições que permitem que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao epítopo se ligue aos agregados de a-Syn; e b. a detecção da quantidade do anticorpo ou seu fragmento de ligação ao epítopo ligado aos agregados de a-Syn na amostra biológica.