JP2023541671A - シヌクレイノパチーの処置のためのアルファ－シヌクレインワクチン - Google Patents

Abstract

本開示は、アルファ－シヌクレインペプチドを含むペプチド組成物および免疫療法組成物を提供する。本開示は、対象における神経変性疾患、例えば、パーキンソン病、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、アルツハイマー病またはアルファ－シヌクレイン沈着を伴う他のシヌクレイノパチーを処置するまたはその予防をもたらす方法も提供し、アルファ－シヌクレイン蓄積を含む神経変性疾患を有するか、またはそれを発生するリスクがある対象における、沈着物を取り除く、アルファ－シヌクレインの凝集を阻害または低減する、ニューロンによる取り込みを遮断する、ならびにアルファ－シヌクレインシードの伝播を阻害する方法を含む。本方法は、アルファ－シヌクレインペプチドを含む組成物をそのような患者に投与することを含む。

Description

関連出願
本出願は、２０２０年９月１７日に出願された米国仮特許出願番号第６３／０７９，８１９号の利益を主張し、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表の陳述
コンピューター可読形態の配列表を、電子提出により本出願とともに出願し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列表は、２０２１年５月１９日に作成され、「２０－１０８７－ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というファイル名を有し、１６ｋｂのサイズであるＡＳＣＩＩテキストファイルに含まれる。

分野
本開示は、免疫学および薬の技術分野、特に、アルファ－シヌクレイノパチーの処置に関する。

背景
パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、アルツハイマー病（ＡＤ）および他のものを含むアルファ－シヌクレイノパチーは、さまざまな種類の神経変性機能障害をもたらす進行性神経疾患である。ニューロンおよび他の細胞において見出されるタンパク質であるアルファ－シヌクレインは、これらの神経変性障害を特徴付ける病理の主要な構成要素である。アルファ－シヌクレインの正常な生理学的機能の理解は限定的であるが、証拠は、タンパク質の可溶性形態が他のタンパク質およびある特定の細胞内膜と相互作用し得ることを示す。アルファ－シヌクレイノパチーにおいて、アルファ－シヌクレインタンパク質は、細胞内で異常に凝集しているように見え、これが疾患病理に寄与する。アルファ－シヌクレインのある特定の凝集形態が、ニューロン間で伝達され得、ニューロン機能不全およびニューロン喪失を引き起こす病理の伝播をもたらす証拠が増加している。アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）のミスフォールディングおよび凝集は、多くの場合、アルツハイマー病およびパーキンソン病を含む一部の神経変性疾患におけるβ－アミロイド沈着に付随して起こり得る。

したがって、アルファ－シヌクレイノパチーの防止または処置のための新たな治療および試薬、特に、患者に存在するアルファ－シヌクレインに対する免疫応答を引き起こすことができる治療および試薬についての必要性が存在する。

要旨
一部の実施形態では、本開示は、配列番号０１の残基８１～１４０由来の３～１０アミノ酸、および一部の実施形態では、５～１０アミノ酸を含む第１のペプチドを含むペプチドまたはポリペプチドを対象とする。例えば、ペプチドは、配列番号０２～７２のうちの１つのアミノ酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ペプチドは、アルファ－シヌクレインのＣ末端（配列番号０１の残基１１１～１３１）に由来し、例として、配列番号０２～配列番号３７のいずれか１つを含んでいてもよい。一部の実施形態では、ペプチドは、アルファ－シヌクレインのＮＡＣ領域（配列番号０１の残基８３～１０６）に由来し、例として、配列番号３８～配列番号７２のいずれか１つを含み得る。一部の実施形態では、本開示は、配列番号７３～配列番号８１のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドを対象とする。一部の実施形態では、ペプチドは、Ｎ末端システインおよびＣ末端システインのうちの１つまたは複数をさらに含む。

一部の実施形態では、ペプチドは、ペプチドのＣ末端部分またはペプチドのＮ末端部分にリンカー（例えば、担体へのリンカー）を含んでいてもよく、リンカーは、アミノ酸配列であってもよい。リンカーは、存在する場合、１～１０アミノ酸長であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、約１～１０アミノ酸、約１～９アミノ酸、約１～８アミノ酸、約１～７アミノ酸、約１～６アミノ酸、約１～５アミノ酸、約１～４アミノ酸、約１～３アミノ酸、約２アミノ酸または１アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸または１０アミノ酸である。例えば、リンカーは、ＧＧ、ＧＧＧ、ＡＡ、ＡＡＡ、ＫＫ、ＫＫＫ、ＳＳ、ＳＳＳ、ＡＧＡＧ（配列番号８４）、ＧＧ、ＧＡＧＡ（配列番号８３）およびＫＧＫＧ（配列番号８５）のアミノ酸配列を含んでいてもよい。加えて、担体へのリンカーは、Ｃ末端に存在する場合、Ｃ末端システイン（Ｃ）、例えば、ペプチド－ＸＸＣを含んでいてもよく、ここで、ＸＸは、ＧＧ、ＡＡ、ＫＫ、ＳＳ、ＧＡＧＡ（配列番号８３）、ＡＧＡＧ（配列番号８４）またはＫＧＫＧ（配列番号８５）であり得る。あるいは、担体へのリンカーは、Ｎ末端に存在する場合、Ｎ末端システイン（Ｃ）を含んでいてもよい。例えば、配列は、ＣＸＸ－ペプチドとして表されてもよく、ここで、ＸＸおよびＣは、独立して必要に応じて存在し、存在する場合、ＸＸは、ＧＧ、ＡＡ、ＫＫ、ＳＳ、ＧＡＧＡ（配列番号８３）、ＡＧＡＧ（配列番号８４）またはＫＧＫＧ（配列番号８５）であり得る。例えば、ポリペプチドは、Ｃ末端に付け加えられた－ＸＸＣおよび／またはＮ末端に付け加えられたＣＸＸ－を有するＤＰＤＮＥＡＹ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含んでいてもよく、ここで、ＸＸおよびＣは、独立して必要に応じて存在し、存在する場合、ＸＸは、ＧＧ、ＡＡ、ＫＫ、ＳＳ、ＡＧＡＧ、ＧＧ、ＧＡＧＡ（配列番号８３）、ＡＧＡＧ（配列番号８４）およびＫＧＫＧ（配列番号８５）であり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、Ｎ末端にブロックされたアミンをさらに含む。

他の実施形態では、本開示は、本開示のポリペプチドを含む免疫療法組成物であって、ポリペプチドが担体に連結されていてもよい、免疫療法組成物を対象とする。担体は、血清アルブミン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ジフテリア毒素の遺伝子改変された交差反応物質（ＣＲＭ）、ＣＲＭ１９７、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄ（ＨｉＤ）、ｒＥＰＡ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ）、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、ならびにフラジェリンを含んでいてもよい。

またさらに、本開示の実施形態は、本開示のペプチドおよび／または免疫療法組成物を含み、少なくとも１種のアジュバントを含む医薬組成物および医薬製剤を対象とする。アジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、３脱－Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）およびその合成アナログ、ＱＳ－２１、ＱＳ－１８、ＱＳ－１７、ＱＳ－７、ＴＱＬ１０５５、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、水中油型エマルジョン（スクアレンまたはピーナッツ油など）、ＣｐＧ、ポリグルタミン酸、ポリリシン、ＡｄｄａＶａｘ（商標）、ＭＦ５９（登録商標）、およびそれらの組合せであってもよい。加えて、組成物および製剤は、リポソーム製剤、希釈剤、および／または多重抗原提示システム（ＭＡＰ）を含んでいてもよい。ＭＡＰは、Ｌｙｓ系樹状足場（Lys-based dendritic scaffold）、ヘルパーＴ細胞エピトープ、免疫刺激性親油性部分、細胞透過性ペプチド、ラジカル誘導重合、抗原提示プラットフォームとしての自己組織化ナノ粒子、および金ナノ粒子のうちの１つまたは複数を含んでいてもよい。

加えて、免疫療法組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される希釈剤、および／または多重抗原提示システム（ＭＡＰ）を含んでいてもよい。ＭＡＰは、Ｌｙｓ系樹状足場、ヘルパーＴ細胞エピトープ、免疫刺激性親油性部分、細胞透過性ペプチド、ラジカル誘導重合、抗原提示プラットフォームとしての自己組織化ナノ粒子、および金ナノ粒子のうちの１つまたは複数を含んでいてもよい。

免疫療法組成物は、免疫療法組成物、ならびに少なくとも１種のアジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、３脱－Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＱＳ－２１、ＱＳ－１８、ＱＳ－１７、ＱＳ－７、ＴＱＬ１０５５、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、水中油型エマルジョン（スクアレンまたはピーナッツ油など）、ＣｐＧ、ポリグルタミン酸、ポリリシン、ＡｄｄａＶａｘ（商標）、ＭＦ５９（登録商標）、およびそれらの組合せを含む医薬組成物に含まれていてもよい。

本開示の実施形態は、本開示のポリペプチドおよび免疫療法組成物をコードする核酸配列も対象とする。核酸は、核酸および少なくとも１種のアジュバントを含む核酸免疫療法組成物に含まれていてもよい。

またさらに、本開示の実施形態は、対象におけるアルファ－シヌクレイノパチーを処置するまたはその予防をもたらすための方法、およびパーキンソン病（ＰＤ）、認知症を伴うパーキンソン病（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ；ＭＳＡパーキンソン病型（ＭＳＡ－Ｐ）バリアントおよびＭＳＡ小脳型（ＭＳＡ－Ｃ）バリアントを含む）、アルツハイマー病（ＡＤ；ＡＤのレビー小体バリアント、およびアルファ－シヌクレイン関連病理を含む他のバリアントを含む）、および脳の鉄蓄積を伴う神経変性（ＮＢＩＡ）を含むアルファ－シヌクレイノパチーを有するか、もしくはそれを発生するリスクがある対象において、ニューロンによるアルファ－シヌクレインの取り込みを遮断する、アルファ－シヌクレインシードの細胞間の伝達を阻害する、またはアルファ－シヌクレインの凝集を阻害もしくは低減するための方法を対象とする。方法は、本開示の免疫療法組成物、核酸免疫療法組成物または医薬製剤を対象に投与することを含む。

本開示の方法は、前記投与することを、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回または少なくとも６回繰り返すことを含んでいてもよく、約月２回の、約２１日～約２８日の、約年４回の、約年２回の、または約年１回の間隔で前記投与することを繰り返すことを含んでいてもよい。

またさらに、本開示の方法は、動物における免疫応答を誘導することを対象とする。方法は、アルファ－シヌクレインに特異的に結合する抗体を含む免疫応答を生成するのに有効なレジメンで、本開示のポリペプチド、免疫療法組成物、医薬製剤または核酸免疫療法組成物を動物に投与することを含む。免疫応答は、アルファ－シヌクレインのＣ末端領域および／またはアルファ－シヌクレインのＮＡＣ領域に特異的に結合する抗体を含んでいてもよい。

他の実施形態では、本開示は、本開示の免疫療法組成物を含み、アジュバントを含んでいてもよい免疫キットを対象とし、ここで、免疫療法組成物は、第１の容器中にあってもよく、アジュバントは、第２の容器であってもよい。

またさらに、本開示は、本開示の核酸免疫療法組成物を含み、アジュバントを含んでいてもよいキットを対象とする。核酸は、第１の容器中にあってもよく、アジュバントは、第２の容器中にあってもよい。

図１は、４回の注射後のアルファ－シヌクレイン単一ペプチド免疫原のＣＰＤＮＥＡＹＥ（配列番号７３）、ＤＰＤＮＥＡＹＣ（配列番号７４）およびＣＧＦＶＫＫＤＱ（配列番号７５）に対するマウス血清の力価を比較する実験の結果を示す。全ての免疫原は、マレイミド活性化ＣＲＭ１９７担体へのカップリングのためにＮまたはＣ末端システインを含んでいた。ＱＳ２１は、ＡｄｄａＶａｘスクアレン系水中油型ナノエマルジョンにおいて、アジュバントとして利用された。

図２は、３回の注射後のアルファ－シヌクレイン単一ペプチド免疫原のＣＰＤＮＥＡＹＥ（配列番号７３）およびＤＰＤＮＥＡＹＣ（配列番号７４）に対するモルモット血清の力価を測定する実験の結果を示す。全ての免疫原は、マレイミド活性化ＣＲＭ１９７担体へのカップリングのためにＮまたはＣ末端システインを含んでいた。ＱＳ２１は、ＡｄｄａＶａｘスクアレン系水中油型ナノエマルジョンにおいて、アジュバントとして使用された。０日目、３週目および７週目に、免疫原をモルモットに注射し、血清をそれぞれの注射の１週間後（すなわち、１週目、４週目および８週目）に採取した。全ての動物は、正常な免疫応答を確実にするためにＣＲＭ対照試料を含んでいた。

図３は、アルファ－シヌクレイン単一ペプチド免疫原の「単一＃１４」（ＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７６））、「単一＃１３」（ＤＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７７））、「タンデム＃１」（ＰＤＮＥＡＹＥＲＲＤＰＤＮＥＡＹＧＧＣ（配列番号７８））、「タンデム＃２」（ＤＰＤＮＥＡＹＲＲＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７９））、「タンデム＃３」（ＰＤＮＥＡＹＥＲＲＴＧＦＶＫＫＤＧＧＣ（配列番号８０））または「タンデム＃４」（ＴＧＦＶＫＫＤＲＲＤＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号８１））に対するマウス血清の力価を比較する実験の結果を示す。結果は、タンデムアルファ－シヌクレイン構築物についての高い力価、および単一アルファ－シヌクレイン構築物についての低い力価を示す。

図４は、配列番号７８（カラム１）、配列番号７９（カラム２）、配列番号８０（カラム３）、配列番号８１（カラム４）、配列番号７７（カラム１４）、配列番号７６（カラム１３）の免疫原の２回目の注射後のモノマー性および可溶性の凝集したアルファ－シヌクレインに対するタンデムおよび単一アルファ－シヌクレイン構築物の力価を比較する実験の結果を示す。

図５は、配列番号７８でワクチン接種したマウス由来の血清の１：３００希釈を用いた新鮮凍結ヒトパーキンソン脳組織（Ａ）対正常組織（Ｂ）中のシヌクレインの病変の染色を示す。

図６は、配列番号７９でワクチン接種したマウス由来の血清の１：３００希釈を用いた新鮮凍結ヒトパーキンソン脳組織（Ａ）対正常組織（Ｂ）中のシヌクレインの病変の染色を示す。

図７は、配列番号８１でワクチン接種したマウス由来の血清の１：３００希釈を用いた新鮮凍結ヒトパーキンソン脳組織（Ａ）対正常組織（Ｂ）中のシヌクレインの病変の染色を示す。

図８は、スイスウェブスターマウスにおいてタンデムおよび単一アルファ－シヌクレインペプチド免疫原に対して上昇した抗体のアルファ－シヌクレインのＢ１０３ニューロン細胞系への結合を遮断する能力を示す。「１３－ｘ」試料はＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７６）であり、「１４－ｘ」試料はＤＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７７）であり、「１－ｘ」試料はＰＤＮＥＡＹＥＲＲＤＰＤＮＥＡＹＧＧＣ（配列番号７８）であり、「２－ｘ」試料はＤＰＤＮＥＡＹＲＲＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７９）であり、「３－ｘ」試料はＰＤＮＥＡＹＥＲＲＴＧＦＶＫＫＤＧＧＣ（配列番号８０）であり、「４－ｘ」試料はＴＧＦＶＫＫＤＲＲＤＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号８１）である。

図９は、アルファ－シヌクレイン単一ペプチド免疫原のＤＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７７）、ならびにタンデム免疫原のＤＰＤＮＥＡＹＲＲＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７９）およびＴＧＦＶＫＫＤＲＲＤＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号８１）に対するマウス血清の力価を比較する実験の結果を示す。配列番号７７は、タンデム構築物と比較される単一アルファ－シヌクレイン免疫原とするために、対照に２倍の濃度で投薬された。

図１０は、配列番号７９（Ａ；「タンデム＃２」）、配列番号８１（Ｂ；「タンデム＃４」）または配列番号７７（Ｃ；「２倍単一」）でワクチン接種したマウス由来の血清の１：３００希釈を用いた新鮮凍結ヒトパーキンソン脳組織中のシヌクレインの病変の染色を示す。染色は、タンデムアルファ－シヌクレイン試料についてより優れているように見える。

図１１は、Ｂ６マウスにおいてタンデムおよび単一アルファ－シヌクレインペプチド免疫原に対して上昇した抗体のアルファ－シヌクレインのＢ１０３ニューロン細胞系への結合を遮断する能力を示す。「１４－ｘ」試料はＤＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７７）であり、「２－ｘ」試料はＤＰＤＮＥＡＹＲＲＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７９）であり、「４－ｘ」試料はＴＧＦＶＫＫＤＲＲＤＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号８１）である。

説明
本開示は、アルファ－シヌクレインペプチドを含むペプチド組成物および免疫療法組成物を提供する。本開示は、対象におけるアルファ－シヌクレイノパチー、すなわち、アルファ－シヌクレイン蓄積または沈着を伴う疾患を処置するまたはその予防をもたらす方法も提供し、沈着物を取り除くおよびその形成を防止する、アルファ－シヌクレインの凝集を阻害もしくは低減するまたはその存在量を低減する、ニューロンによるアルファ－シヌクレインの結合および／または取り込みを遮断する、細胞間のアルファ－シヌクレイン種の伝達を阻害する、ならびにパーキンソン病（ＰＤ）、認知症を伴うパーキンソン病（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ；ＭＳＡパーキンソン病型（ＭＳＡ－Ｐ）バリアントおよびＭＳＡ小脳型（ＭＳＡ－Ｃ）バリアントを含む）、アルツハイマー病（ＡＤ；ＡＤのレビー小体バリアント、およびアルファ－シヌクレイン関連病理を含む他のバリアントを含む）、および脳の鉄蓄積を伴う神経変性（ＮＢＩＡ）を含むアルファ－シヌクレイノパチー、またはアルファ－シヌクレイン蓄積を含む他の疾患を有するか、もしくはそれを発生するリスクがある対象における脳領域間の病理の伝播を阻害する方法を含む。本方法は、アルファ－シヌクレインペプチドを含む組成物をそのような患者に投与することを含む。

いくつかの用語を下記に定義する。本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、その混合物を含めて、複数の化合物を含み得る。

文脈から別段明らかでない限り、「約」という用語は、ごくわずかな変動、例えば、述べられた値の測定の誤差の標準的な限度（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。例えば、本明細書で使用される「約」という用語は、測定可能な値、例えば、パラメーター、量、時間的な期間に言及する場合、規定の値のおよび規定の値から＋／－１０％もしくはそれ未満、＋／－５％もしくはそれ未満、または＋／－１％もしくはそれ未満（or less or less）の変動を包含し得る。値の範囲の指定は、範囲内または範囲を定義するすべての整数、および範囲内の整数によって定義されるすべての下位範囲を含む。本明細書で使用される場合、統計学的有意性は、ｐ≦０．０５を意味する。

１つまたは複数の列挙された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含んでいてもよい。例えば、ポリペプチド配列を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、配列を単独でまたは他の配列もしくは成分と組み合わせて含有していてもよい。

対象が、少なくとも１つの公知のリスク因子（例えば、年齢、遺伝的、生化学的、家族歴および状況曝露）を有し、リスク因子がない個体よりも疾患を発生する統計的に有意に高いリスクでそのリスク因子を有する個体が置かれている場合、個体は、疾患の増加したリスクがある。

「患者」という用語は、予防的処置または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物対象を含み、処置ナイーブ対象を含む。本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」という用語は、処置が所望される任意の単一の対象を指し、他の哺乳動物対象、例えば、ヒト、ウシ、イヌ、モルモット、ウサギなどを含む。疾患の任意の臨床徴候を示していない臨床研究試験に関与する任意の対象、または疫学的研究に関与する対象、または対照として使用される対象も、対象として含まれることが意図される。

「疾患」という用語は、生理学的機能を損なう任意の異常な状態を指す。この用語は、病因の性質に関わりなく、生理学的機能が損なわれる任意の障害、疾病、異常性、病理、病気、状態または症候群を包含して広く使用される。

「症状」という用語は、対象によって知覚される歩行の変化などの疾患の主観的証拠を指す。「徴候」は、医師によって観察される疾患の客観的証拠を指す。

本明細書で使用される場合、「処置する」および「処置」という用語は、疾患に関連する１つもしくは複数の症状もしくは作用の軽減または寛解、疾患の１つもしくは複数の症状もしくは作用の開始の防止、阻害または遅延、疾患の１つもしくは複数の症状もしくは作用の重症度または頻度を低下させること、および／あるいは、本明細書に記載される所望の転帰の増加またはその方向に向かわせることを指す。

「防止」、「防止する」または「防止すること」という用語は、本明細書で使用される場合、既に存在するアルファ－シヌクレイン病理を伴うまたは伴わない疾患の開始前に本開示のペプチドまたは免疫療法組成物を対象と接触させ（例えば、投与し）（一次および二次予防）、それによって、対象がペプチドまたは免疫療法組成物と接触していない場合と比較して、臨床症状の開始を遅延させることおよび／または疾患の開始後の疾患の症状を軽減することを指し、疾患の開始を完全に抑制することは指さない。一部の場合では、防止は、本開示のペプチドまたは免疫療法組成物の投与後の限られた時間の間に起こり得る。他の場合では、防止は、本開示のペプチドまたは免疫療法組成物を投与することを含む処置レジメンの期間の間に起こり得る。

「低減」、「低減する」または「低減すること」という用語は、本明細書で使用される場合、対象または対象の組織に存在するアルファ－シヌクレインの量を減少させること、あるいは対象または対象の組織に存在するアルファ－シヌクレインの量の増加を抑制することを指し、これは、対象または対象の組織に存在する、蓄積した、凝集した、または沈着したアルファ－シヌクレインの量を減少させること、あるいはその増加を抑制すること（例えば、増加の速度を減少させること）を包含する。ある特定の実施形態では、対象に存在する、蓄積した、凝集した、または沈着したアルファ－シヌクレインの量の減少、あるいはその増加の抑制（例えば、増加の速度を減少させること）は、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に存在する、蓄積した、凝集した、または沈着したアルファ－シヌクレインの量を指す。ある特定の実施形態では、対象に存在する、蓄積した、凝集した、または沈着したアルファ－シヌクレインの量の減少、あるいはその増加の抑制（例えば、増加の速度を減少させること）は、対象の末梢（例えば、末梢循環系）に存在する、蓄積した、凝集した、または沈着したアルファ－シヌクレインの量を指す。ある特定の実施形態では、対象に存在する、蓄積した、凝集した、または沈着したアルファ－シヌクレインの量の減少、あるいはその増加の抑制（例えば、増加の速度を減少させること）は、対象の脳に存在する、蓄積した、凝集した、または沈着したアルファ－シヌクレインの量を指す。一部の実施形態では、低減されるアルファ－シヌクレインは、アルファ－シヌクレイン（例えば、オリゴマー状または線維状のアルファ－シヌクレイン集合体、およびアルファ－シヌクレインオリゴマーのプロトフィブリル中間体）の病理学的形態である。さらに他の実施形態では、神経変性疾患および／またはシヌクレイノパチーの病理学的指標が減少される。

「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は、Ｂ細胞および／もしくはＴ細胞が応答する抗原上の部位、または抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続アミノ酸から、またはタンパク質の三次フォールディングによって並置された非連続アミノ酸からの両方で形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露において保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒による処理において失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間コンフォメーションで少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２または少なくとも１３アミノ酸を含む。エピトープの空間コンフォメーションを決定する方法としては、例えば、ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996)を参照されたい。

「免疫原性剤」または「免疫原」または「抗原」は、必要に応じてアジュバントと併せて、動物への投与の際に、それ自身またはそれ自身の改変／処理バージョンに対する免疫応答を誘導することができる。「免疫原性剤」または「免疫原」または「抗原」という用語は、適切な量（「免疫学的有効量」）で投与された場合に「抗原性」または「免疫原性」である、すなわち、細胞性免疫応答および／もしくは体液性免疫応答を誘導する、誘発する、増大させるまたはブーストすることができ、その応答の産物（Ｔ細胞、抗体）によって認識されることができる、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む化合物または組成物を指す。免疫原は、ペプチド、または２つもしくはそれよりも多くの同じもしくは異なるペプチドの組合せであり得、これは、直線状または空間コンフォメーションで少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２または少なくとも１３アミノ酸を含む。

ペプチド免疫原をコードし、ワクチンとして使用されるＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸は、コードされたポリペプチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡの投与後にｉｎ ｖｉｖｏで発現されるので、「ＤＮＡ［またはＲＮＡ］免疫原」と称される。ペプチドまたはポリペプチドは、ワクチンベクターから組換え的に発現され得、このワクチンベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたペプチドまたはポリペプチドコード配列を含むネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、本明細書に記載される発現ベクターまたはカセットであり得る。

免疫原は、単独で、または別の物質（１回またはいくつかの間隔にわたって投与され得る）と組み合わせて、もしくはそれに連結されて、もしくはそれと融合されて与えられる場合に有効であり得る。免疫原性剤または免疫原は、本明細書に記載される担体に連結されている抗原ペプチドまたはポリペプチドを含み得る。

抗原ペプチドまたはポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸は、コードされたペプチドまたはポリペプチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡの投与後にｉｎ ｖｉｖｏで発現されるので、「ＤＮＡ［またはＲＮＡ］免疫原」と称される。ペプチドまたはポリペプチドは、ワクチンベクターから組換え的に発現され得、このワクチンベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたペプチドまたはポリペプチドコード配列を含むネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、本明細書に記載される発現ベクターまたはカセットであり得る。

「アジュバント」という用語は、抗原と合わせて投与された場合に、抗原に対する免疫応答を増大させるが、単独で投与された場合に、抗原に対する免疫応答を生じさせない、化合物を指す。アジュバントは、リンパ球動員、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激を含むいくつかの製造業者ニズムによって免疫応答を増大させることができる。アジュバントは、天然化合物、天然化合物の改変バージョンもしくは誘導体、または合成化合物であってもよい。

「ペプチド」および「ポリペプチド」および「（ポリ）ペプチド」という用語は、本明細書で互換的に使用され、２個またはそれよりも多くの連続アミノ酸の鎖を指す。もし区別が行われる場合、区別が行われるときに、文脈は、意味を明確にする。例えば、本明細書に記載される２つまたはそれよりも多くのペプチドが接続されて、二量体または多量体ペプチドになる場合、ポリペプチドは、「ポリ」または「２つ以上」のペプチドを示すために使用され得る。

「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、賦形剤、アジュバントまたは補助剤が、医薬製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントに実質的に有害ではないことを意味する。

「免疫療法」または「免疫応答」という用語は、レシピエントにおけるアルファ－シヌクレインペプチドに対する有益な体液性応答（抗体が媒介する）および／または細胞性応答（抗原特異的Ｔ細胞またはそれらの分泌産物によって媒介される）の発生を指す。そのような応答は、免疫原（例えば、アルファ－シヌクレインペプチド）の投与によって誘導される能動的応答であり得る。細胞性免疫応答は、クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子に関連するポリペプチドエピトープの提示によって誘発されて、抗原特異的ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞および／またはＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する。応答は、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星状膠細胞、ミクログリア細胞、好酸球、または自然免疫の他の構成要素の活性化も含み得る。細胞媒介免疫応答の存在は、増殖アッセイ（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）またはＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイによって決定することができる。免疫原の保護効果または治療効果に対する体液性応答および細胞性応答の相対的な寄与は、免疫された同系動物から抗体およびＴ細胞を別々に単離すること、および第２の対象において保護効果または治療効果を測定することによって区別することができる。

アルファ－シヌクレイン

アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）のミスフォールディングおよび凝集は、多くの場合、一部の神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病およびＡＤのレビー小体バリアントなどのそのサブタイプ）におけるβ－アミロイド沈着に付随して起こり得、アルファ－シヌクレインは、パーキンソン病（ＰＤ）、認知症を伴うパーキンソン病（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ；ＭＳＡパーキンソン病型（ＭＳＡ－Ｐ）バリアントおよびＭＳＡ小脳型（ＭＳＡ－Ｃ）バリアントを含む）、および脳の鉄蓄積を伴う神経変性（ＮＢＩＡ）を含むいくつかの神経変性障害に存在する。

ペプチド免疫原

能動免疫のために使用される薬剤は、患者において免疫応答を誘導することができ、免疫療法としての機能を果たすことができる。能動免疫のために使用される薬剤は、例えば、実験動物においてモノクローナル抗体を生じさせるために使用される同じ種類の免疫原であり得、アルファ－シヌクレインペプチドの領域由来の３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２もしくは１３個、またはそれよりも多くの連続アミノ酸を含んでいてもよい。本明細書に記載されるペプチドの実施形態のそれぞれにおいて、ペプチドは列挙された配列を含み得るか、それからなり得るか、またはそれから本質的になり得る。

本開示の一部の実施形態では、免疫原は、アルファ－シヌクレインポリペプチド（配列番号０１）の残基８１～１４０由来、またはアルファ－シヌクレインのＣ末端領域（配列番号０１の残基１１１～１３１）由来、またはアルファ－シヌクレインのＮＡＣ領域（配列番号０１の残基８３～１０６）由来の３～１０アミノ酸を含むアルファ－シヌクレインペプチドを含み得る。一部の実施形態では、ペプチド断片は、リン酸化されていない。一部の実施形態では、断片は、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）および／またはチロシン（Ｙ）リン酸化部位でリン酸化されている。

一部の実施形態では、アルファ－シヌクレインペプチドは、配列番号０２～配列番号７２のいずれか１つを含むアミノ酸配列を含む。免疫原がアルファ－シヌクレインのＣ末端領域（配列番号０１の残基１１１～１３１）由来である一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号０２～配列番号３７のいずれか１つを含み得る。ペプチド免疫原がアルファ－シヌクレインのＮＡＣ領域（配列番号０１の残基８３～１０６）由来である一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号３８～配列番号７２のいずれか１つを含み得る。一部の実施形態では、ペプチドは、ＤＰＤＮＥＡＹＥ（配列番号１１）、ＤＰＤＮＥＡＹ（配列番号１２）、ＰＤＮＥＡＹＥ（配列番号１８）、ＡＴＧＦＶＫＫ（配列番号４１）、ＴＧＦＶＫＫＤ（配列番号４８）、ＧＦＶＫＫＤＱ（配列番号５４）、ＤＰＤＮＥＡＹＣ（配列番号７４）、ＣＰＤＮＥＡＹＥ（配列番号７３）、ＣＧＦＶＫＫＤＱ（配列番号７５）、ＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７６）、ＤＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７７）、ＰＤＮＥＡＹＥＲＲＤＰＤＮＥＡＹＧＧＣ（配列番号７８）、ＤＰＤＮＥＡＹＲＲＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７９）、ＰＤＮＥＡＹＥＲＲＴＧＦＶＫＫＤＧＧＣ（配列番号８０）、またはＴＧＦＶＫＫＤＲＲＤＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号８１）のうちのいずれか１つを含むアミノ酸配列を含む。それぞれのアルファ－シヌクレイン配列は、必要に応じて、独立して、Ｃ末端システインおよび／またはＮ末端システインをさらに含む。

一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのアルファ－シヌクレインペプチドは、連結されて、アルファ－シヌクレインポリペプチドを形成する。１つまたは複数のアルファ－シヌクレインペプチドは、ペプチド内リンカーによって連結され得、このリンカーは、上記および本明細書に記載される通りである。例えば、ポリペプチドリンカーは、第１のペプチドのＣ末端と第２のペプチドのＮ末端との間に位置している。ペプチド内リンカーありまたはなしで、アルファ－シヌクレインポリペプチドは、任意の順序で配置され得る。例えば、特定のアルファ－シヌクレインペプチド（「アルファ－シヌクレイン１」）は、デュアルアルファ－シヌクレインポリペプチドのＮ末端部分に配置されてもよく、同じまたは異なるアルファ－シヌクレインペプチド（この例について、異なるアルファ－シヌクレインの「アルファ－シヌクレイン２」）は、デュアルポリペプチドのＣ末端部分に配置されてもよい。または、この例におけるアルファ－シヌクレインペプチドは、逆の方向で配置され得る（アルファ－シヌクレイン１に対してＮ末端にアルファ－シヌクレイン２）。本明細書での第１のペプチドまたは第２のペプチドへの言及は、免疫原の２つ以上のアルファ－シヌクレインペプチドを含む実施形態におけるアルファ－シヌクレインペプチドの順序を示唆することを意図するものではない。

加えて、アルファ－シヌクレインペプチドまたはアルファ－シヌクレインポリペプチドのＣ末端部分および／またはＮ末端部分は、リンカー、例えば、ペプチドまたはポリペプチドを担体にコンジュゲートするためのリンカーを含むことができる。ペプチドまたはポリペプチドを担体にカップリングし得るリンカーは、例えば、ペプチドまたはポリペプチドと担体との間に、ＧＧ、ＧＧＧ、ＫＫ、ＫＫＫ、ＡＡ、ＡＡＡ、ＳＳ、ＳＳＳ、ＧＡＧＡ（配列番号８３）、ＡＧＡＧ（配列番号８４）、ＫＧＫＧ（配列番号８５）、および本明細書の他の場所に記載される他のもの（例えば、下記の「リンカー１」および「リンカー２」）を含んでいてもよく、リンカーのＣ末端に（またはリンカーが存在しない場合、ペプチドまたはポリペプチド配列のＣ末端に直接）Ｃ末端システイン、またはリンカーのＮ末端に（またはリンカーが存在しない場合、ペプチドまたはポリペプチド配列のＮ末端に直接）Ｎ末端システインをさらに含んでいてもよい。例えば、（ポリ）ペプチド－Ｇ－Ｇ－Ｃ、（ポリ）ペプチド－Ｋ－Ｋ－Ｃ、（ポリ）ペプチド－Ａ－Ａ－Ｃ、（ポリ）ペプチド－Ｓ－Ｓ－Ｃ、またはＣ－Ｇ－Ｇ－（ポリ）ペプチド、Ｃ－Ｋ－Ｋ－（ポリ）ペプチド、Ｃ－Ａ－Ａ－（ポリ）ペプチド、Ｃ－Ｓ－Ｓ－（ポリ）ペプチド。一部の実施形態では、免疫原ペプチドは、Ｎ末端にブロックされたアミンをさらに含む。

アルファ－シヌクレインペプチドが連結されて、アルファ－シヌクレインポリペプチドを形成する場合、リンカーは、切断可能リンカーであってもよい。本明細書で使用される場合、「切断可能リンカー」という用語は、切断によって（例えば、エンドペプチダーゼ、プロテアーゼ、低ｐＨ、または抗原提示細胞内もしくはその周囲で起こり得る任意の他の手段によって）、アルファ－シヌクレインポリペプチドを、互いから分離するのを促進するか、またはそうでなければ互いからの分離に対して感受性をより強くし、それによって、そのような切断可能リンカーを欠く同等のペプチドよりも抗原提示細胞によってプロセシングされる、抗原ペプチド間の任意のリンカーを指す。一部の実施形態では、切断可能リンカーは、プロテアーゼ感受性のジペプチドまたはオリゴペプチド切断可能リンカーである。ある特定の実施形態では、切断可能リンカーは、プロテアーゼのトリプシンファミリーのプロテアーゼによる切断に対して感受性がある。一部の実施形態では、切断可能リンカーはアルギニン－アルギニン（Ａｒｇ－Ａｒｇ）、アルギニン－バリン－アルギニン－アルギニン（Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ａｒｇ；配列番号８２）、Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ（配列番号８３）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号８４）、Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ（配列番号８５）、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）、バリン－アルギニン（Ｖａｌ－Ａｒｇ）、バリン－リシン（Ｖａｌ－Ｌｙｓ）、バリン－アラニン（Ｖａｌ－Ａｌａ）およびフェニルアラニン－リシン（Ｐｈｅ－Ｌｙｓ）を含むアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、切断可能リンカーは、アルギニン－アルギニン（Ａｒｇ－Ａｒｇ）である。

本開示の一部の実施形態では、アルファ－シヌクレインポリペプチドは、ＤＰＤＮＥＡＹＥ（配列番号１１）、ＤＰＤＮＥＡＹ（配列番号１２）、ＰＤＮＥＡＹＥ（配列番号１８）、ＡＴＧＦＶＫＫ（配列番号４１）、ＴＧＦＶＫＫＤ（配列番号４８）、ＧＦＶＫＫＤＱ（配列番号５４）、ＣＰＤＮＥＡＹＥ（配列番号７３）、ＤＰＤＮＥＡＹＣ（配列番号７４）またはＣＧＦＶＫＫＤＱ（配列番号７５）、ＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７６）、ＤＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７７）、ＰＤＮＥＡＹＥＲＲＤＰＤＮＥＡＹＧＧＣ（配列番号７８）、ＤＰＤＮＥＡＹＲＲＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７９）、ＰＤＮＥＡＹＥＲＲＴＧＦＶＫＫＤＧＧＣ（配列番号８０）、またはＴＧＦＶＫＫＤＲＲＤＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号８１）から選択されるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になり、ここで、ＸＸは、必要に応じて、配列番号１１、１２、１８、４１、４８、５４、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０もしくは８１のＣ末端および／もしくはＮ末端に付け加えられ、システインは、必要に応じて、配列番号１１、１２、１８、４１、４８、５４、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０もしくは８１のＣ末端および／もしくはＮ末端に、またはＸＸが存在する場合、Ｃ末端ＸＸのＣ末端および／もしくはＮ末端ＸＸのＮ末端に付け加えられる。ＸＸは、ＧＧ、ＡＡ、ＫＫ、ＳＳ、ＧＡＧＡ（配列番号８３）、ＡＧＡＧ（配列番号８４）およびＫＧＫＧ（配列番号８５）であり得る。

一部の実施形態では、デュアルアルファ－シヌクレインポリペプチドは、以下の通りである：
［第１のペプチド］－［リンカー１］－［第２のペプチド］－［リンカー２］－［Ｃｙｓ］
（ここで、［第１のペプチド］はアルファ－シヌクレインペプチドであり、［第２のペプチド］は同じまたは異なるアルファ－シヌクレインペプチドであり、［リンカー１］、［リンカー２］および［Ｃｙｓ］のそれぞれは、必要に応じて存在し、存在する任意の［Ｃｙｓ］はＣ末端［Ｃｙｓ］である）。

一部の実施形態では、デュアルアルファ－シヌクレインポリペプチドは、以下の通りである：
［Ｃｙｓ］－［リンカー２］－［第１のペプチド］－［リンカー１］－［第２のペプチド］
（ここで、［第１のペプチド］はアルファ－シヌクレインペプチドであり、［第２のペプチド］は同じまたは異なるアルファ－シヌクレインペプチドであり、［リンカー１］、［リンカー２］および［Ｃｙｓ］のそれぞれは、必要に応じて存在し、存在する任意の［Ｃｙｓ］はＮ末端［Ｃｙｓ］である）。

一部の実施形態では、デュアルアルファ－シヌクレインポリペプチドは、以下の通りである：
［Ｃｙｓ］－［リンカー２］－［第１のペプチド］－［リンカー１］－［第２のペプチド］］－［リンカー２］－［Ｃｙｓ］
（ここで、［第１のペプチド］はアルファ－シヌクレインペプチドであり、［第２のペプチド］は同じまたは異なるアルファ－シヌクレインペプチドであり、［リンカー１］、［リンカー２］および［Ｃｙｓ］のそれぞれは、必要に応じて存在し、存在する［Ｃｙｓ］はＣ末端および／またはＮ末端［Ｃｙｓ］であり得る）。

アルファ－シヌクレインペプチドの例としては、配列番号２～８１のいずれか１つが挙げられる。［リンカー１］は、必要に応じて存在し、存在する場合、切断可能リンカーであってもよい。切断可能リンカーは、存在する場合、１～１０アミノ酸長であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、約１～１０アミノ酸、約１～９アミノ酸、約１～８アミノ酸、約１～７アミノ酸、約１～６アミノ酸、約１～５アミノ酸、約１～４アミノ酸、約１～３アミノ酸、約２アミノ酸または１アミノ酸を含む。一部の実施形態では、切断可能リンカーは、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸または１０アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーは、アルギニン－アルギニン（Ａｒｇ－Ａｒｇ）、アルギニン－バリン－アルギニン－アルギニン（Ａｒｇ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ａｒｇ；配列番号８２）、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）、バリン－アルギニン（Ｖａｌ－Ａｒｇ）、バリン－リシン（Ｖａｌ－Ｌｙｓ）、バリン－アラニン（Ｖａｌ－Ａｌａ）、フェニルアラニン－リシン（Ｐｈｅ－Ｌｙｓ）、グリシン－アラニン－グリシン－アラニン（Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ；配列番号８３）、アラニン－グリシン－アラニン－グリシン（Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ；配列番号８４）およびリシン－グリシン－リシン－グリシン（Ｌｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ；配列番号８５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する切断可能リンカーであってもよい。

［リンカー２］は、必要に応じて存在し、存在する場合、ポリペプチドを担体にカップリングするリンカーである。リンカーは、存在する場合、１～１０アミノ酸長であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、約１～１０アミノ酸、約１～９アミノ酸、約１～８アミノ酸、約１～７アミノ酸、約１～６アミノ酸、約１～５アミノ酸、約１～４アミノ酸、約１～３アミノ酸、約２アミノ酸または１アミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸または１０アミノ酸である。一部の実施形態では、リンカーのアミノ酸組成は、天然のマルチドメインタンパク質において見出されるリンカーの組成を模倣することができ、ここで、ある特定のアミノ酸は、全タンパク質におけるそれらの存在量と比較して、天然リンカーにおいて大きな比率を占めるか、低い比率を占めるか、または同等である。例えば、トレオニン（Ｔｈｒ）、セリン（Ｓｅｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グリシン（Ｇｌｙ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、リシン（Ｌｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アルギニン（Ａｒｇ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびアラニン（Ａｌａ）は、天然リンカーにおいて大きな比率を占める。対照的に、イソロイシン（Ｉｌｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）およびシステイン（Ｃｙｓ）は、低い比率を占める。一般に、大きな比率を占めるアミノ酸は、極性の非荷電または荷電残基であり、これは、天然にコードされるアミノ酸のおよそ５０％を占め、Ｐｒｏ、ＴｈｒおよびＧｌｎは、天然リンカーのために最も好ましいアミノ酸であった。一部の実施形態では、リンカーのアミノ酸組成は、組換えタンパク質において一般に見出されるリンカーの組成を模倣することができ、これは、一般に、可撓性リンカーまたは剛性リンカーとして分類され得る。例えば、組換えタンパク質において見出される可撓性リンカーは、一般に、小型の非極性（例えば、Ｇｌｙ）または極性（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）アミノ酸から構成され、その小さなサイズが、可撓性を提供し、機能性ドメインを接続する可動性を可能にする。例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒの組み込みは、水分子と水素結合を形成することによって、水溶液中でリンカーの安定性を維持することができ、したがって、リンカーと免疫原との間の相互作用を低減することができる。一部の実施形態では、リンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒ残基のストレッチを含む（「ＧＳ」リンカー）。広く使用される可撓性リンカーの例は、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ（配列番号８６）または（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ（配列番号８７）であり、ここで、ｎ＝１～３である。コピー数「ｎ」を調整することで、機能性免疫原ドメインの十分な分離を達成するようにリンカーを最適化して、例えば、免疫原性応答を最大化することができる。多くの他の可撓性リンカーが、本明細書で使用され得る組換え融合タンパク質のために設計されている。一部の実施形態では、リンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒなどの小型または極性アミノ酸がリッチであり得るが、ＴｈｒおよびＡｌａなどのさらなるアミノ酸も含有して、可撓性を維持するだけでなく、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの極性アミノ酸は、溶解性を改善する。例えば、Chen, X. et al., "Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality" Adv Drug Deliv Rev., 15; 65(10): 1357-1369 (203)を参照されたい。ある特定の実施形態では、存在する場合、リンカーは、ＧＧ、ＧＧＧ、ＫＫ、ＫＫＫ、ＡＡ、ＡＡＡ、ＳＳ、ＳＳＳ、Ｇ－Ａ－Ｇ－Ａ（配列番号８３）、Ａ－Ｇ－Ａ－Ｇ（配列番号８４）およびＫ－Ｇ－Ｋ－Ｇ（配列番号８５）からなる群から選択されるアミノ酸配列であり得る。

［Ｃｙｓ］は、必要に応じて存在し、ポリペプチドを担体にコンジュゲートするのに役立ち得る。存在する場合、Ｃｙｓは、ポリペプチドのＣ末端部分、またはポリペプチドのＮ末端部分にあり得る。

ペプチド－担体免疫原

アルファ－シヌクレインペプチド（およびそのポリペプチド）は、本開示に従って、免疫原である。一部の実施形態では、ペプチドは、好適な担体に連結されて、免疫応答の誘発を助けることができる。したがって、本開示の１つまたは複数のペプチドおよびポリペプチドは、担体に連結することができる。例えば、アルファ－シヌクレイン（ポリ）ペプチドのそれぞれは、スペーサーアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ａｌａ－Ａｌａ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ、Ｓｅｒ－Ｓｅｒ、Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ、Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ（配列番号８３）、Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ（配列番号８４）またはＬｙｓ－Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ（配列番号８５））ありまたはなしで、担体に連結されてもよい。ある特定の実施形態では、アルファ－シヌクレイン（ポリ）ペプチドは、Ｃ末端システインを使用して好適な担体に連結されて、（ポリ）ペプチドと担体との間にリンカーを提供することができる。ある特定の実施形態では、アルファ－シヌクレイン（ポリ）ペプチドは、Ｎ末端システインを使用して好適な担体に連結されて、（ポリ）ペプチドと担体との間にリンカーを提供することができる。

好適な担体としては、限定されるものではないが、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド、または他の病原性細菌、例えば、ジフテリア（例えば、ＣＲＭ１９７）、Ｅ．ｃｏｌｉ、コレラもしくはＨ．ｐｙｌｏｒｉ由来のトキソイド、あるいは弱毒化毒素誘導体が挙げられる。Ｔ細胞エピトープも好適な担体分子である。一部のコンジュゲートは、本発明のペプチド免疫原を免疫刺激ポリマー分子（例えば、トリパルミトイル－Ｓ－グリセリンシステイン（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）、マンナン（マンノースポリマー）またはグルカン（β１－２ポリマー））、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－１アルファおよびβペプチド、ＩＬ－２、γ－ＩＮＦ、ＩＬ－１０、ＧＭ－ＣＳＦ）およびケモカイン（例えば、ＭＩＰ１－αおよびβ、ならびにＲＡＮＴＥＳ）に連結することによって、形成することができる。さらなる担体としては、ウイルス様粒子が挙げられる。一部の組成物では、免疫原性ペプチドも、化学架橋によって担体に連結することができる。免疫原を担体に連結するための技法としては、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を使用するジスルフィド連結の形成が挙げられる（ペプチドがスルフヒドリル基を欠く場合、これは、システイン残基の付加によって提供され得る）。これらの試薬は、それら自身とあるタンパク質上のペプチドシステイン残基との間にジスルフィド連結、およびリシン上のイプシロン－アミノまたは他のアミノ酸中の他の遊離アミノ基を通したアミド連結を作り出す。一部の実施形態では、化学架橋は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルおよびブロモアセチル反応性基を介したアミンからスルフヒドリルへのコンジュゲーションのための短い（６．２オングストローム）の架橋剤であるＳＢＡＰ（スクシンイミジル３－（ブロモアセトアミド）プロピオネート）の使用を含むことができる。各種のそのようなジスルフィド／アミド形成剤は、Jansen et al., "Immunotoxins: Hybrid Molecules Combining High Specificity and Potent Cytotoxicity" Immunological Reviews 62:185-216 (February 1982)によって記載されている。他の二官能性カップリング剤は、ジスルフィド連結よりもむしろチオエーテルを形成する。多くのこれらのチオ－エーテル形成剤は、市販されており、６－マレイミドカプロン酸、２－ブロモ酢酸および２－ヨード酢酸、４－（Ｎ－マレイミド－メチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸の反応性エステルが挙げられる。カルボキシル基は、それらをスクシンイミドまたは１－ヒドロキシル－２－ニトロ－４－スルホン酸、ナトリウム塩と混合することによって活性化することができる。シュードビリオンまたはウイルス由来粒子とも呼ばれるウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ｉｎ ｖｉｖｏで定義された球対称のＶＬＰに自己組織化できるウイルスのカプシドおよび／またはエンベロープタンパク質の複数のコピーから構成されるサブユニット構造を表す（Powilleit, et al., (2007) PLoS ONE 2(5):e415）。あるいは、ペプチド免疫原は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の大部分に結合することができる少なくとも１つの人工Ｔ細胞エピトープ、例えば、汎ＤＲエピトープ（「ＰＡＤＲＥ」）に連結することができる。汎ＤＲ結合ペプチド（ＰＡＤＲＥ）は、ＵＳ５，７３６，１４２号、ＷＯ９５／０７７０７号およびAlexander, et al, Immunity, 1:751-761 (1994)に記載されている。

能動免疫原は、免疫原（ペプチドまたはポリペプチド）の複数のコピーが単一の共有結合性分子として担体上に存在する多量体形態で存在し得る。一部の実施形態では、担体は、さまざまな形態のアルファ－シヌクレインペプチドを含む。例えば、免疫原のアルファ－シヌクレインペプチドは、異なるアルファ－シヌクレイン抗原を異なる順序で有するポリペプチドを含むことができ、またはペプチド内リンカーおよび／または担体へのリンカーありまたはなしで存在していてもよい。

一部の組成物では、免疫原性ペプチドはまた、担体との融合タンパク質として発現され得る。ある特定の組成物では、免疫原性ペプチドは、担体と、アミノ末端、カルボキシル末端または内部で連結することができる。一部の組成物では、担体は、ＣＲＭ１９７である。一部の組成物では、担体は、ジフテリアトキソイドである。

核酸

本開示は、本明細書に開示されるアルファ－シヌクレインペプチドのいずれかをコードする核酸をさらに提供する。本明細書に開示される核酸免疫療法組成物は、本明細書に開示される１つまたは複数のアルファ－シヌクレインペプチドをコードする核酸配列を含む。例えば、アルファ－シヌクレインペプチドは、３～１０アミノ酸残基長であって、配列番号０１の残基８１～１４０由来である配列を含む。したがって、配列番号２～８１のいずれかをコードする核酸は、本開示の免疫原および医薬組成物の構成要素を提供する。同じく、アルファ－シヌクレイン配列のいずれかをコードする１つまたは複数の核酸は、Ｎ末端またはＣ末端のジペプチドに対するコドンを含んでいてもよい。ペプチド配列は、本明細書に記載される担体へのリンカーおよびＮまたはＣ末端システインもコードし得る同じまたは別々の核酸配列によってコードされてもよい。加えて、単一の核酸配列が２つ以上のアルファ－シヌクレインペプチドをコードする場合、配列は、本明細書に記載されるペプチド内リンカーまたは切断可能リンカーもコードしてもよい。

本明細書に記載される核酸組成物（医薬組成物）は、アルファ－シヌクレイノパチーを処置するまたはその予防および／もしくは防止をもたらすための方法において使用することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される核酸免疫療法組成物は、対象におけるアルファ－シヌクレイノパチーを処置するまたはその予防をもたらすための組成物を提供する。一部の実施形態では、本明細書に開示される核酸免疫療法組成物は、対象におけるニューロンによるアルファ－シヌクレインの取り込みを遮断する、アルファ－シヌクレインシードの細胞間の伝達を阻害する、および／またはアルファ－シヌクレインの凝集を阻害もしくは低減するための組成物を提供する。一部の実施形態では、核酸免疫療法組成物は、対象におけるおよび／または対象の組織におけるアルファ－シヌクレインを低減するために提供する。別の実施形態では、本明細書に開示される核酸免疫療法組成物は、対象の脳におけるアルファ－シヌクレインを低減するための組成物を提供する。一部の実施形態では、免疫療法組成物によって低減されるアルファ－シヌクレインは、アルファ－シヌクレイン（例えば、オリゴマー状または線維状のアルファ－シヌクレイン集合体、およびアルファ－シヌクレインオリゴマーのプロトフィブリル中間体）の病理学的形態である。さらに他の実施形態では、神経変性疾患および／またはβ－アミロイドパチーの病理学的指標は、免疫療法組成物によって減少される。

免疫原をコードし、ワクチンとして使用されるＤＮＡなどの核酸は、コードされたポリペプチドがＤＮＡの投与後にｉｎ ｖｉｖｏで発現されるので、「ＤＮＡ免疫原」または「ＤＮＡワクチン」と称され得る。ＤＮＡワクチンは、目的のタンパク質をコードするＤＮＡをベクター（プラスミドまたはウイルス）に組み込むこと、ベクターを対象に投与すること、およびベクターが投与されて、対象の免疫系が刺激される対象において目的のタンパク質を発現させることによって、それらが対象においてコードする目的のタンパク質に対する抗体を誘導することが意図される。ＤＮＡワクチンは、投与後長期間にわたり対象の身体中に残り、コードされたタンパク質をゆっくりと産生し続ける。このようにして、過剰の免疫応答を回避することができる。ＤＮＡワクチンは、遺伝子操作技法を使用して改変することもできる。必要に応じて、そのような核酸は、シグナルペプチドをさらにコードし、ペプチドに連結されたシグナルペプチドとともに発現され得る。核酸のコード配列は、調節配列と作動可能に連結されて、コード配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナルなどの発現を確実にすることができる。アルファ－シヌクレインをコードする核酸は、単離された形態で生じ得るか、または１つもしくは複数のベクターにクローニングされ得る。核酸は、例えば、固体状態の合成または重複するオリゴヌクレオチドのＰＣＲによって合成することができる。リンカーおよび／または切断可能リンカーありおよびなし、ならびにタンパク質系担体ありまたはなしのアルファ－シヌクレインペプチドまたはアルファ－シヌクレインポリペプチドをコードする核酸は、例えば発現ベクター内で、１つの連続核酸として接続され得る。

ＤＮＡは、ＲＮＡよりも安定であるが、いくつかの潜在的な安全性のリスク、例えば、抗ＤＮＡ抗体の誘導を含み、したがって、一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡであり得る。免疫原をコードし、ワクチンとして使用されるＲＮＡ核酸は、コードされたポリペプチドがＲＮＡの投与後にｉｎ ｖｉｖｏで発現されるので、「ＲＮＡ免疫原」または「ＲＮＡワクチン」または「ｍＲＮＡワクチン」と称され得る。リボ核酸（ＲＮＡ）ワクチンは、対象の細胞機構を安全に誘導して、目的の１つまたは複数の（ポリ）ペプチドを産生することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡワクチンは、非複製性ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）またはウイルス由来の自己増幅性ＲＮＡであり得る。ｍＲＮＡ系ワクチンは、目的の抗原をコードし、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有するが、自己増幅性ＲＮＡは、抗原だけでなく、細胞内ＲＮＡ増幅および豊富なタンパク質発現を可能にするウイルス複製機構もコードする。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡは、Ｔ７、Ｔ３またはＳｐ６ファージＲＮＡポリメラーゼを使用して、線状ＤＮＡ鋳型から産生され得る。得られる産物は、５’－および３’－ＵＴＲ配列、５’キャップならびにポリ（Ａ）テールに隣接する本明細書に開示される目的のペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含有し得る。一部の実施形態では、ＲＮＡワクチンは、トランス増幅性ＲＮＡ（例えば、Beissert et al., Molecular Therapy January 2020 28(1):119-128を参照されたい）を含むことができる。ある特定の実施形態では、ＲＮＡワクチンは、本明細書に開示されるアルファ－シヌクレイン（ポリ）ペプチドをコードし、特に未成熟抗原提示細胞などの細胞に移入される場合、アルファ－シヌクレインペプチドを発現することができる。ＲＮＡはまた、免疫刺激エレメントなどの他のポリペプチド配列をコードする配列を含有していてもよい。一部の実施形態では、ＲＮＡワクチンのＲＮＡは、改変されたＲＮＡであり得る。ＲＮＡの文脈における「改変された」という用語は、ＲＮＡ中に天然に存在しないＲＮＡの任意の改変を含むことができる。例えば、改変されたＲＮＡは、５’－キャップを有するＲＮＡを指し得るが、しかしながら、ＲＮＡは、さらなる改変を含んでいてもよい。５’－キャップは、それらに結合した場合にＲＮＡを安定化する能力を持つように改変することができる。ある特定の実施形態では、さらなる改変は、天然に存在するポリ（Ａ）テールの伸長もしくは切断、または５’－または３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）の変更であってもよい。一部の実施形態では、ＲＮＡ、例えばまたはｍＲＮＡワクチンは、対象において抗原特異的免疫応答を生じるように、有効量で製剤化される。例えば、ＲＮＡワクチン製剤は、アルファ－シヌクレイン抗原に対する対象の体液性免疫系および／または細胞性免疫系を刺激するために、対象に投与され、したがって、１種または複数のアジュバント、希釈剤、担体および／または賦形剤をさらに含んでいてもよく、アルファ－シヌクレイン（ポリ）ペプチド抗原に対する保護的なおよび／または治療的な免疫反応を誘発するために、任意の好適な経路で対象に適用される。

そのすべてが参照により本明細書に組み込まれる分子生物学の一般方法を開示する基本テキストとしては、Sambrook, J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989；Ausubel, F M et al. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Wiley-Interscience, New York（現行版）；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；Glover, D M, ed, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II, IRL Press, 1985；Albers, B. et al., Molecular Biology of the Cell, 2^nd Ed., Garland Publishing, Inc., New York, N.Y. (1989)；Watson, J D et al., Recombinant DNA, 2^nd Ed., Scientific American Books, New York, 1992；およびOld, R W et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2^nd Ed., University of California Press, Berkeley, Calif. (1981)が挙げられる。

例えば、配列における変異の発生、サブクローニング、プローブの標識、シークエンシング、ハイブリダイゼーションなどのような核酸の操作のための技法は、科学文献および特許文献に十分に記載されている。例えば、Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997)；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993)を参照されたい。

核酸、ベクター、カプシド、ポリペプチドなどは、当業者に周知のいくつかの一般手段のいずれかによって分析および定量することができる。これらとしては、例えば、ＮＭＲ、分光光度法、Ｘ線撮影、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および超拡散クロマトグラフィー、さまざまな免疫学的方法、例えば、流体またはゲル沈降素反応、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、サザン解析、ノーザン解析、ドットブロット解析、ゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、ＲＴ－ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、他の核酸または標的またはシグナル増幅法、放射性標識、シンチレーション計数、ならびにアフィニティークロマトグラフィーなどの分析生化学法が挙げられる。

医薬組成物

本明細書に記載されるペプチドおよび免疫原のそれぞれは、薬学的に許容されるアジュバントおよび薬学的に許容される賦形剤とともに投与される医薬組成物中に存在し得る。アジュバントは、ペプチドが単独で使用された場合の状況と比べて、誘導される抗体の力価および／または誘導される抗体の結合親和性を増加させる。各種のアジュバントを、本開示の免疫原と組み合わせて使用して、免疫応答を誘発することができる。いくつかのアジュバントは、応答の質的形態に影響を及ぼす免疫原のコンフォメーション変化を引き起こすことなく、免疫原に対する内因性応答を増大させる。アジュバントは、天然化合物、天然化合物の改変バージョンもしくは誘導体、または合成化合物であってもよい。

いくつかのアジュバントとしては、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、３脱－Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（商標））（ＧＢ２２２０２１１号（ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔａｎａ、現在はＣｏｒｉｘａの一部）を参照されたい）が挙げられる。本明細書で使用される場合、ＭＰＬは、ＭＰＬの天然バージョンおよび合成バージョンを指す。合成バージョンの例としては、ＰＨＡＤ（登録商標）、３Ｄ－ＰＨＡＤ（登録商標）および３Ｄ（６Ａ）－ＰＨＡＤ（登録商標）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｌａｂａｍａ）が挙げられる。

ＱＳ－２１は、南米で見出されたＱｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ樹の樹皮から単離されたトリテルペングリコシドまたはサポニンである（Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995)を参照されたい）。ＱＳ－２１製品としては、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；現在はＡｇｅｎｕｓ，Ｉｎｃ．Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）およびＱＳ－２１ワクチンアジュバント（Ｄｅｓｅｒｔ Ｋｉｎｇ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が挙げられる。ＱＳ－２１は、ＵＳ５，０５７，５４０号およびＵＳ８，０３４，３４８号において、開示され、特徴付けられ、評価されており、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、ＱＳ－２１は、さまざまな投薬量で多数の臨床研究において評価されている。ＮＣＴ００９６０５３１（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ｓｔｕｄｙ／ＮＣＴ００９６０５３１）、Huell et al., Curr Alzheimer Res. 2017 Jul; 14(7): 696-708（ワクチンＡＣＣ－００１のさまざまな用量とともに５０ｍｃｇのＱＳ－２１を評価）；Gilman et al., "Clinical effects of Abeta immunization (AN1792) in patients with AD in an interrupted trial" Neurology. 2005 May 10; 64(9):1553-62；Wald et al., "Safety and immunogenicity of long HSV-2 peptides complexed with rhHsc70 in HSV-2 seropositive persons" Vaccine 2011; 29(47):8520-8529；およびCunningham et al., "Efficacy of the Herpes Zoster Subunit Vaccine in Adults 70 Years of Age or Older." NEJM. 2016 Sep 15; 375(11):1019-32を参照されたい。ＱＳ－２１は、ＳＨＩＮＧＲＩＸを含むＦＤＡで承認されたワクチンにおいて使用されている。ＳＨＩＮＧＲＩＸは、５０ｍｃｇのＱＳ－２１を含有する。ある特定の実施形態では、ＱＳ－２１の量は、約１０μｇ～約５００μｇである。

ＴＱＬ１０５５は、ＱＳ－２１のアナログ（Ａｄｊｕｖａｎｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）である。半合成ＴＱＬ１０５５は、ＱＳ－２１との比較において、高純度、増加した安定性、減少した局所耐容性、減少した全身耐容性を有するとして特徴付けられている。ＴＱＬ１０５５は、ＵＳ２０１８０３２７４３６Ａ１号、ＷＯ２０１８１９１５９８Ａ１号、ＷＯ２０１８２００６５６Ａ１号およびＷＯ２０１９０７９１６０Ａ１号において、開示され、特徴付けられ、評価されており、それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＵＳ２０１８０３２７４３６Ａ１号は、２０μｇのＱＳ－２１よりも２．５倍超ＴＱ１０５５が優れていたが、５０μｇのＴＱ１０５５に対する改善はなかったことを教示している。しかしながら、ＱＳ－２１とは異なって、ＴＱＬ１０５５用量の増加につれて、体重減少またはＲＢＣの溶血のいずれかの増加はなかった。ＷＯ２０１８２００６５６Ａ１号は、ＴＱ１０５５の最適量で、抗原の量を低下させ、優れた力価を達成することができることを教示している。ある特定の実施形態では、ＴＱＬ１０５５の量は、約１０μｇ～約５００μｇである。

他のアジュバントは、必要に応じてモノホスホリルリピドＡ（Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)を参照されたい）、プルロニック（登録商標）ポリマーおよび殺滅マイコバクテリアなどの免疫刺激剤と組み合わされた、水中油型エマルジョン（スクアレンまたはピーナッツ油など）である。Ｒｉｂｉアジュバントは、水中油型エマルジョンである。Ｒｉｂｉは、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を含有する食塩水と乳化された代謝可能油（スクアレン）を含有する。Ｒｉｂｉは、免疫刺激剤として作用する精製マイコバクテリア産物および細菌モノホスホリルリピドＡも含有する。他のアジュバントは、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＷＯ９８／４０１００号を参照されたい）、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－１アルファおよびβペプチド、ＩＬ－２、γ－ＩＮＦ、ＩＬ－１０、ＧＭ－ＣＳＦ）、ケモカイン（例えば、ＭＩＰ１－αおよびβ、ならびにＲＡＮＴＥＳ）、サポニン、ＲＮＡ、ならびに／またはＴＬＲアゴニスト（例えば、ＭＰＬおよび合成ＭＰＬ分子などのＴＬＲ４アゴニスト）、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート、および他のＴＬＲアゴニストであり得る。アジュバントは、活性薬剤とともに治療組成物の構成要素として投与することができ、または治療剤の投与前、投与と同時に、または投与後に別々に投与することができる。

本開示のさまざまな実施形態では、アジュバントは、ＱＳ－２１（Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標））である。一部の組成物では、アジュバントは、ＭＰＬである。ある特定の実施形態では、ＭＰＬの量は、約１０μｇ～約５００μｇである。一部の組成物では、アジュバントは、ＴＱＬ１０５５である。ある特定の実施形態では、ＴＱＬ１０５５の量は、約１０μｇ～約５００μｇである。一部の組成物では、アジュバントは、ＱＳ２１である。ある特定の実施形態では、ＱＳ２１の量は、約１０μｇ～約５００μｇである。一部の組成物では、アジュバントは、ＭＰＬおよびＱＳ－２１の組合せである。一部の組成物では、アジュバントは、ＭＰＬおよびＴＱＬ１０５５の組合せである。一部の組成物では、アジュバントは、リポソーム製剤にすることができる。

加えて、本開示の一部の実施形態は、多重抗原提示システム（ＭＡＰ）を含むことができる。多重抗原提示ペプチドワクチンシステムは、従来のワクチン（すなわち、生－弱毒化病原体、殺滅病原体、または不活性化病原体）、担体タンパク質および細胞傷害性アジュバントに関連する有害効果を回避するために開発された。２つの主要なアプローチを使用して、多重抗原提示ペプチドワクチンシステムが開発された：（１）機能性構成要素、例えば、Ｔ細胞エピトープ、細胞透過性ペプチドおよび親油性部分の付加；ならびに（２）サイズ規定ナノ材料、例えば、自己組織化ペプチド、非ペプチド性デンドリマーおよび金ナノ粒子を、抗原提示プラットフォームとして使用する合成アプローチ。多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）システムの使用は、サブユニットペプチドワクチンの、ときには不十分な免疫原性を改善することができる。ＭＡＰシステムでは、抗原ペプチドの複数のコピーは、非免疫原性Ｌｙｓ系樹状足場のａ－およびε－アミノ基に同時に結合し、分解からの安定性を付与するのを助け、このようにして、小型抗原ペプチド単独と比較して、免疫細胞による分子認識およびより強い免疫応答の誘導を増強する。一部の組成物では、ＭＡＰは、Ｌｙｓ系樹状足場、ヘルパーＴ細胞エピトープ、免疫刺激性親油性部分、細胞透過性ペプチド、ラジカル誘導重合、抗原提示プラットフォームとしての自己組織化ナノ粒子、および金ナノ粒子のうちの１つまたは複数を含む。

非経口投与のための医薬組成物は、好ましくは無菌で、実質的に等張であり、ＧＭＰ条件下で製造される。医薬組成物は、単位剤形（すなわち、単回投与のための投薬量）で提供することができる。医薬組成物は、１種または複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または補助剤を使用して製剤化することができる。製剤は、選択された投与の経路に依存する。注射のために、本開示のペプチドは、水溶液で、好ましくは、（注射の部位での不快感を低減するために）ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩水もしくは酢酸緩衝液などの生理的に適合性の緩衝液中で製剤化することができる。溶液は、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含有することができる。あるいは、ペプチド組成物は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、無菌のパイロジェンフリーの水で構成するための凍結乾燥形態であり得る。

本明細書に記載されるペプチドおよびポリペプチド（および必要に応じて、ペプチドに融合された担体）は、ペプチドをコードする核酸の形態で投与し、対象においてｉｎ ｓｉｔｕで発現させることもできる。免疫原をコードする核酸セグメントは、典型的には、調節エレメント、例えば、対象の意図される標的細胞においてＤＮＡセグメントの発現を可能にするプロモーターおよびエンハンサーに連結される。血液細胞における発現のために、免疫応答の誘導のために所望されるように、例えば、軽鎖または重鎖免疫グロブリン遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサーエレメント、またはＣＭＶ主要中間初期プロモーターおよびエンハンサーが、発現を方向付けるために好適である。連結された調節エレメントおよびコード配列は、多くの場合、ベクターにクローニングされる。

ＤＮＡおよびＲＮＡは、ネイキッド形態（すなわち、コロイド状材料または封入材料なしで）送達することができる。あるいは、レトロウイルス系（例えば、Boris-Lawrie and Teumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3(1):102-109 (1993)を参照されたい）；アデノウイルスベクター（例えば、Bett et al, J. Virol. 67(10);5911-21 (1993)を参照されたい）；アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、Zhou et al., J. Exp. Med. 179(6):1867-75 (1994)を参照されたい）；ワクシニアウイルスおよびトリポックスウイルスを含むポックスファミリー由来のウイルスベクター、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルスに由来するものなどのアルファウイルス属由来のウイルスベクター（例えば、Dubensky et al., J. Virol. 70(1):508-519 (1996)を参照されたい）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＵＳ５，６４３，５７６号を参照されたい）、および水疱性口内炎ウイルス（ＷＯ９６／３４６２５号を参照されたい）などのラブドウイルス、ならびにパピローマウイルス（ＷＯ９４／１２６２９号；Ohe et al., Human Gene Therapy 6(3):325-333 (1995)；およびXiao & Brandsma, Nucleic Acids. Res. 24(13):2620-2622 (1996)）を含むいくつかのウイルスベクター系を使用することができる。

免疫原をコードするＤＮＡおよびＲＮＡ、またはそれを含有するベクターは、リポソーム、ナノ粒子またはリポタンパク質複合体にパッケージすることができる。他の好適なポリマーとしては、例えば、プロタミンリポソーム、多糖粒子、カチオン性ナノエマルジョン、カチオン性ポリマー、カチオン性ポリマーリポソーム、カチオン性脂質ナノ粒子、カチオン性脂質、コレステロールナノ粒子、カチオン性脂質－コレステロール、ＰＥＧナノ粒子またはデンドリマーナノ粒子が挙げられる。さらなる好適な脂質および関連アナログは、ＵＳ５，２０８，０３６号、ＵＳ５，２６４，６１８号、ＵＳ５，２７９，８３３号およびＵＳ５，２８３，１８５号によって記載されており、これらのそれぞれは、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。免疫原をコードするベクターおよびＤＮＡは、微粒子担体に吸着または会合させることもでき、その例としては、ポリメチルメタクリレートポリマー、ならびにポリラクチドおよびポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（例えば、McGee et al., J. Micro Encap. Mar-Apr 1997; 14(2):197-210を参照されたい）が挙げられる。

薬学的に許容される担体組成物としては、限定されるものではないが、水、薬学的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアガム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ペトロラタム、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、および医薬添加剤として許容される界面活性剤を含む添加剤を含むこともできる。

処置に適する対象

異常に凝集した細胞内アルファ－シヌクレインの存在は、パーキンソン病（ＰＤ）、認知症を伴うパーキンソン病（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ；ＭＳＡパーキンソン病型（ＭＳＡ－Ｐ）バリアントおよびＭＳＡ小脳型（ＭＳＡ－Ｃ）バリアントを含む）、ＡＤのレビー小体バリアントを含むアルツハイマー病（ＡＤ）、およびアルファ－シヌクレイン関連病理を含む他のバリアント、ならびに脳の鉄蓄積を伴う神経変性（ＮＢＩＡ）を含むいくつかの疾患において見出されている。

本開示の組成物および方法は、これらの疾患および他のシヌクレイノパチーのいずれかの処置または予防において使用することができる。神経疾患とアルファ－シヌクレインとの間の広範囲の関連のために、本開示の組成物および方法は、神経疾患なしの個体における平均値と比較して、（例えば、ＣＳＦにおける）アルファ－シヌクレインの上昇したレベルを示す任意の対象の処置または予防において使用することができる。本開示の組成物および方法は、神経疾患に関連するアルファ－シヌクレインに変異を有する個体における神経疾患の処置または予防において使用することもできる。方法は、アルファ－シヌクレイノパチーの処置または予防に特に好適である。

処置に適する対象としては、疾患のリスクがあるが、症状を示していない個体、および現在症状を示している患者が挙げられ、疾患に対して以前に処置されていない処置ナイーブ対象を含む。疾患のリスクがある対象としては、高齢集団における対象、アルファ－シヌクレイン病理を有し、疾患の公知の遺伝的リスクを有する無症候性対象が挙げられる。そのような個体としては、この疾患を経験している親族を有する個体、およびそのリスクが遺伝子マーカーまたは生化学的マーカーの解析によって決定されている個体が挙げられる。リスクの遺伝子マーカーとしては、アルファ－シヌクレインにおける変異、および神経疾患に関連する他の遺伝子における変異が挙げられる。例えば、ヘテロ接合型のＡｐｏＥ４対立遺伝子、ましてやホモ接合型のＡｐｏＥ４対立遺伝子は、アルツハイマー病（ＡＤ）のリスクに関連する。アルツハイマー病のリスクの他のマーカーとしては、ＡＰＰ遺伝子における変異、特に、７１７位における変異、ならびにハーディ変異およびスウェーデン変異とそれぞれ称される６７０位および６７１位での変異、プレセニリン遺伝子ＰＳ１およびＰＳ２における変異、ＡＤ、高コレステロール血症またはアテローム性動脈硬化症の家族歴が挙げられる。現在アルツハイマー病、パーキンソン病、およびアルファ－シヌクレインが関与する他の神経障害を患っている個体は、特徴的な認知症、および上記のリスク因子の存在からいくつか（例えば、アルツハイマー病）を、ＰＥＴイメージングによって認識することができる。加えて、いくつかの診断検査が、例えば、パーキンソン病またはアルツハイマー病を有する個体を特定するために利用可能である。アルツハイマー病のために、これらとしては、ＣＳＦもしくは血液のアルファ－シヌクレインまたはホスホ－アルファ－シヌクレインおよびＡβ４２レベルの測定が挙げられる。上昇したアルファ－シヌクレインまたはホスホ－アルファ－シヌクレインおよび減少したΑβ４２レベルは、ＡＤの存在を示す。パーキンソン病に関連する変異としては、例えば、Ａｌａ３０ＰｒｏもしくはＡｌａ５３Ｔｈｒ、またはロイシンリッチリピートキナーゼなどの他の遺伝子（ＬＲＲＫ２またはＰＡＲＫ８）における変異が挙げられる。対象はまた、ＤＳＭ ＩＶ ＴＲの基準によって、上記に言及された神経疾患のいずれかと診断され得る。

無症候性対象では、処置は、任意の年齢（例えば、１０、２０、３０、またはそれよりも上）で開始することができる。しかしながら、通常、対象が２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０歳に達するまで、処置を開始する必要はない。処置は、典型的には、一定の期間にわたって、複数回投薬を必要とする。処置は、経時的に抗体レベルをアッセイすることによってモニターすることができる。応答が低下すると、ブースター投薬が指示される。潜在的なダウン症候群患者の場合では、処置は、母親に治療剤を投与することによって出生前に、または出生直後に開始することができる。

処置および使用の方法

本開示は、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）など）を有するか、またはそれを発生するリスクがある対象におけるアルファ－シヌクレインの凝集を阻害または低減する方法を提供する。方法は、本明細書に開示される組成物を対象に投与することを含む。治療有効量は、有効な期間に与えられる場合に、所望の免疫学的効果または臨床効果を達成する投薬量である。投薬量レジメンは、最適な治療応答を提供するために調整されてもよい。例えば、いくつかの分割用量が、設定された間隔で（例えば、毎週、毎月）投与されてもよく、または用量は、治療状況の緊急性によって示される通りに比例的に低減されてもよい。

予防的適用では、本明細書に記載される組成物は、疾患（例えば、パーキンソン病、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、アルツハイマー病など）に罹患しやすいか、またはそうでなければそのリスクがある対象に、疾患のリスクを低減する、疾患の重症度を下げる、または疾患の少なくとも１つの徴候もしくは症状の開始を遅延させるのに有効なレジメン（投与の用量、頻度および経路）で投与することができる。特に、レジメンは、脳におけるアルファ－シヌクレインもしくはホスホ－アルファ－シヌクレイン（およびそれらから形成される対フィラメント）の凝集を阻害もしくは遅延させる、ならびに／またはその毒性作用を阻害もしくは遅延させる、ならびに／または行動の欠陥の発生を阻害もしくは遅延させるのに有効である。治療的適用では、本明細書に記載される組成物は、疾患（例えば、パーキンソン病、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、アルツハイマー病など）の疑いがある対象、または疾患を既に患っている患者に、疾患の少なくとも１つの徴候または症状を改善する、またはそのさらなる悪化を少なくとも阻害するのに有効なレジメン（投与の用量、頻度および経路）で投与される。特に、レジメンは、好ましくは、アルファ－シヌクレイン、ホスホ－アルファ－シヌクレイン、もしくはそれから形成される対フィラメントのレベルのさらなる増加、関連する毒性、および／または行動の欠陥を低減または少なくとも阻害するのに有効である。

処置された個体が、本発明の方法によって処置されていない同等の対象の対照集団における平均転帰よりも好ましい転帰を達成する場合に、あるいはより良好な転帰が、比較臨床試験（例えば、フェーズＩＩ、フェーズＩＩ／ＩＩＩまたはフェーズＩＩＩ試験）において、対照対象に対する処置された対象においてｐ＜０．０５もしくは０．０１、またはさらに０．００１のレベルで実証される場合に、レジメンは、治療的または予防的に有効と考えられる。

多くの異なる要因、例えば、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がＡｐｏＥキャリアであるかどうか、患者がヒトまたは動物であるかどうか、投与される他の薬、および処置が予防的または治療的であるかどうかに応じて、有効用量は変わる。

一部の実施形態では、有効量は、２５μｇ～１０００μｇ、または５０μｇ～１０００μｇの総用量である。一部の実施形態では、有効量は、１００μｇの総用量である。一部の実施形態では、有効量は、合計で２回対象に投与される２５μｇの用量である。一部の実施形態では、有効量は、合計で２回対象に投与される１００μｇの用量である。一部の実施形態では、有効量は、合計で２回対象に投与される４００μｇの用量である。一部の実施形態では、有効量は、合計で２回対象に投与される５００μｇの用量である。一部の実施形態では、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ワクチンは、皮内注射、筋肉内注射によって、または鼻腔内投与によって、対象に投与される。

一部の実施形態では、能動免疫療法のための薬剤の量は、患者あたり、１～１，０００マイクログラム（μｇ）、または０．１～５００μｇ、または１０～５００μｇ、または５０～２５０μｇまで変わり、ヒト投与のための注射あたり１～１００μｇまたは１～１０μｇであり得る。注射のタイミングは、１日に１回から、１週間に１回、１か月に１回、１年に１回、１０年に１回まで非常に大きく変わり得る。典型的なレジメンは、免疫と、それに続く６週間間隔または２か月などの時間間隔でのブースター注射からなる。別のレジメンは、免疫と、それに続く１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２か月後の１回または複数回のブースター注射からなる。別のレジメンは、生涯にわたり、２か月ごとの注射を必然的に伴う。あるいは、ブースター注射は、免疫応答のモニタリングによって示されるように、不定期であり得る。投与の頻度は、副作用が臨床的に許容される範囲内である限り、１回または複数回であってもよい。

一部の実施形態では、本明細書に開示される組成物または方法は、第１のペプチドおよび第２のペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する１つまたは複数のＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンを対象に投与することを含み、１０μｇ／ｋｇ～４００μｇ／ｋｇの核酸ワクチンの投薬量が対象に投与される。一部の実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドの投薬量は、用量あたり、１～５μｇ、５～１０μｇ、１０～１５μｇ、１５～２０μｇ、１０～２５μｇ、２０～２５μｇ、２０～５０μｇ、３０～５０μｇ、４０～５０μｇ、４０～６０μｇ、６０～８０μｇ、６０～１００μｇ、５０～１００μｇ、８０～１２０μｇ、４０～１２０μｇ、４０～１５０μｇ、５０～１５０μｇ、５０～２００μｇ、８０～２００μｇ、１００～２００μｇ、１２０～２５０μｇ、１５０～２５０μｇ、１８０～２８０μｇ、２００～３００μｇ、５０～３００μｇ、８０～３００μｇ、１００～３００μｇ、４０～３００μｇ、５０～３５０μｇ、１００～３５０μｇ、２００～３５０μｇ、３００～３５０μｇ、３２０～４００μｇ、４０～３８０μｇ、４０～１００μｇ、１００～４００μｇ、２００～４００μｇまたは３００～４００μｇである。一部の実施形態では、核酸は、皮内注射または筋肉内注射によって対象に投与される。一部の実施形態では、核酸は、０日目に対象に投与される。一部の実施形態では、核酸の２回目の用量は、７日目、または１４日目、または２１日目に対象に投与される。

本明細書に記載される組成物は、好ましくは、末梢経路（すなわち、投与される組成物が血液脳関門を通過し、脳、脊髄または眼における意図される部位に達して、頑強な免疫応答および／または誘導される抗体集団をもたらす経路）を介して投与される。末梢疾患のためには、誘導される抗体は、意図される末梢器官に達するように血管系から離れる。投与の経路としては、経口、皮下、鼻腔内、皮内または筋肉内が挙げられる。能動免疫のためのいくつかの経路は、皮下および筋肉内である。筋肉内投与および皮下投与は、単一の部位または複数の部位で行うことができる。筋肉内注射は、最も典型的には、腕または脚の筋肉に行われる。一部の方法では、薬剤は、沈着物が蓄積している特定の組織に直接注射される。

投与される投薬の数は、より頑強な免疫応答（例えば、より高い力価）をもたらすように、調整することができる。急性障害または慢性障害の急性悪化のためには、多くの場合、１～１０回用量で十分である。時には、急性障害または慢性障害の急性悪化に対して、必要に応じて、分割形態の単一ボーラス用量で十分である。慢性障害のために、本明細書に開示されるワクチン／免疫療法は、規則的な間隔、例えば、毎週、隔週、毎月、３か月ごと、６か月ごとに、少なくとも１、５または１０年間、または患者の生涯にわたり投与することができる。

免疫原をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの有効量は、レシピエントの体重１キログラムあたり約１ナノグラム～約１グラム、または約０．１μｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇであり得る。内部投与のために好適な剤形は、好ましくは、単位あたり約０．１μｇ～１００μｇの活性成分を含有する（後者の用量範囲について）。活性成分は、組成物の総重量に基づいて、重量基準で０．５～９５％まで変わり得る。あるいは、抗原がロードされた樹状細胞の有効用量は、約１０^４～１０^８個細胞である。免疫療法の当業者であれば、過度の実験なく、これらの用量を調整することが可能である。

核酸組成物は、簡便な様式、例えば、簡便かつ有効な経路による注射で投与されてもよい。経路としては、限定されるものではないが、皮内「遺伝子銃」送達または筋肉内注射が挙げられ得る。改変された樹状細胞は、皮下、静脈内または筋肉内経路によって投与される。他の可能な経路としては、経口投与、髄腔内、吸入、経皮適用、または直腸投与が挙げられる。

投与の経路に応じて、組成物は、酵素、酸、および化合物が不活性になり得る他の天然状態の作用から化合物を保護する材料でコーティングされていてもよい。したがって、その不活性化を防止する材料で組成物をコーティングすること、またはその材料とともに組成物を共投与することが必要であってもよい。例えば、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼの酵素阻害剤（例えば、膵トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェートおよびトラジロール）、またはリポソーム（水中油中水型エマルジョンを含む）および従来のリポソーム（Strejan et al., J. Neuroimmunol 7(1):27-41, 1984）などの適切な担体中。

本明細書に開示される免疫療法用組成物はまた、アルファ－シヌクレインの蓄積および／または凝集に関連する疾患のための他の処置、例えば、本明細書に開示されるアルファ－シヌクレインエピトープのいずれかに特異的に結合する抗体などの抗アルファ－シヌクレイン抗体、ＡＢＢＶ－８Ｅ１２、ゴスラネマブ、ザゴテネマブ、ＲＧ－６１００、ＢＩＩＢ０７６、またはＷＯ２０１４／１６５２７１号、ＵＳ１０，５０１，５３１号、ＷＯ２０１７／１９１５５９号、ＷＯ２０１７／１９１５６０号、ＷＯ２０１７／１９１５６１号、ＵＳ２０１９０３３０３１４号、ＵＳ２０１９０３３０３１６号およびＷＯ２０１８／２０４５４６号に開示される抗体のいずれかと組み合わせて使用されてもよい。一部の併用療法の方法では、患者は、本明細書に開示される能動免疫療法の方法の前に、受動免疫療法を受ける。他の方法では、患者は、処置の同じ期間の間に、受動免疫療法および能動免疫療法を受ける。あるいは、患者は、受動免疫療法の前に、能動免疫療法を受けてもよい。組合せはまた、小分子治療および非免疫原性療法、例えば、ＲＡＺＡＤＹＮＥ（登録商標）（ガランタミン）、ＥＸＥＬＯＮ（登録商標）（リバスチグミン）およびＡＲＩＣＥＰＴ（登録商標）（ドネペジル）、ならびに脳における神経細胞の機能を改善する他の組成物を含んでいてもよい。

本開示の組成物は、本明細書に記載される処置レジメンのための医薬の製造において使用されてもよい。

処置レジメン

本明細書に開示される処置の方法の所望の転帰は、疾患および患者のプロファイルに従って変わり、当業者に決定可能である。所望の転帰としては、患者の健康状態の改善が挙げられる。一般に、所望の転帰としては、測定可能な指標、例えば、病原性アルファ－シヌクレイン凝集物の低減または排除、減少または阻害されたアルファ－シヌクレイン凝集、ならびに病原性および／または凝集したアルファ－シヌクレイン凝集物に対する増加した免疫応答が挙げられる。所望の転帰としては、アルファ－シヌクレイノパチー疾患の特異的な症状の寛解も挙げられる。本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加する」または「低減する」などの相対的な用語は、対照、例えば、本明細書に記載される処置の開始前の同じ個体における測定値、または対照個体もしくは対照群における測定値と比べた値を示す。対照個体は、開示される免疫療法／ワクチン製剤を使用して処置を受けていないが、処置されている個体とおよそ同じ年齢である（処置された個体および対照個体における疾患のステージが同等であることを確実にするため）、処置されている個体と同じアルファシヌクレイノパチー疾患に苦しむ個体である。あるいは、対照個体は、処置されている個体とおよそ同じ年齢である健康な個体である。治療に対する応答の変化または改善は、一般に、統計学的有意であり、有意であると見なされ得る０．１未満または０．１に等しい、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満または０．００１未満のｐ値によって記載される。

対象の処置のための本明細書に開示される組成物の有効用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトまたは動物であるかどうか、あれば投与される他の薬、および処置が予防的または治療的であるかどうかを含む多くの異なる要因に応じて変わる。処置投薬量は、安全性および有効性を最適化するために用量設定することができる。免疫原の量は、アジュバントも投与されるかどうかにも依存し得、アジュバントの非存在下ではより高い投薬量が必要である。投与のための免疫原の量は、時には、患者あたり１～５００μｇ、より一般的には、ヒト投与のための注射あたり５～５００μｇまで変わる。時折、投薬あたり１～２ｍｇのより高い用量が使用される。典型的には、約１０、２０、５０または１００μｇが、各ヒト投薬のために使用される。投薬のタイミングは、１日に１回から、１年に１回、１０年に１回まで非常に大きく変わり得る。免疫原の投薬が与えられる任意の所与の日に、投薬量は、１μｇ／患者より高く、通常、アジュバントも投与される場合は１０μｇ／患者より高く、アジュバントの非存在下では１０μｇ／患者より高く、通常は、１００μｇ／患者より高い。典型的なレジメンは、免疫と、それに続く６週間の間隔のブースター投薬からなる。別のレジメンは、免疫と、それに続く１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２か月後のブースター投薬からなる。別のレジメンは、生涯にわたり、２か月ごとの投薬を伴う。あるいは、ブースター投薬は、免疫応答のモニタリングによって示されるように、不定期であり得る。

第２の処置、例えば、アルツハイマー病または認知症を伴うパーキンソン病（ＰＤＤ）のための第２の処置、例えば、Ｒａｚａｄｙｎｅ（登録商標）（ガランタミン）、Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標）（リバスチグミン）およびＡｒｉｃｅｐｔ（登録商標）（ドネペジル）と組み合わせて投与される場合、第２の処置は、製品ラベルに従って、または本開示の組成物による処置を考慮して必要により、投与することができる。

キット

本開示は、本明細書に開示される組成物、および関連する材料、例えば、使用のための指示（例えば、添付文書）を含むキット（例えば、容器）をさらに提供する。使用のための指示は、例えば、組成物、および必要に応じて１つまたは複数の追加の薬剤の投与のための指示を含んでいてもよい。ペプチドおよび／または核酸組成物の容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数回用量パッケージ）またはサブ単位用量であってもよい。

添付文書は、適応症、用法、投薬量、投与、禁忌、および／またはそのような治療用製品の使用に関する警告についての情報を含む治療用製品の市販パッケージに習慣的に含まれる指示を指す。キットは、薬学的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などを含む第２の容器を含むこともできる。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針および注射器を含む、商業的および使用者の観点から望まれる他の材料を含むこともできる。

使用

本明細書に記載されるペプチド、ポリペプチド、免疫原および医薬組成物のそれぞれは、本明細書に記載される疾患のうちの１つまたは複数の処置における使用のためのものであってもよい。加えて、本明細書に記載されるペプチド、ポリペプチド、免疫原および医薬組成物のそれぞれは、本明細書に記載される疾患のうちの１つまたは複数を処置するための方法における使用のためのものであってもよい。本明細書に記載されるペプチド、ポリペプチド、免疫原および医薬組成物のそれぞれは、本明細書に記載される疾患のうちの１つまたは複数を処置するためまたはその処置における使用のための医薬を製造するための方法において使用されてもよい。

以下は、例証目的だけのために提供され、上記の広範な用語で記載された本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

本明細書において特定された全ての米国特許出願および国際特許出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

（実施例１）
動物免疫

図１および図２に示される実験について、雌スイスウェブスターマウスに、０日目、１４日目、４２日目および７０日目に、１００μｌの試験物質を２つの部位に皮下注射した。図３～図８に示される実験について、雌スイスウェブスターマウスに、０日目、ならびに４週目および８週目に、１００μｌの試験物質を２つの部位に皮下注射した。図９～図１１に示される実験について、雌Ｂ６マウスに、０日目、ならびに４週目および８週目に、１００μｌの試験物質を２つの部位に皮下注射した。図９～図１１に示される実験について、２×（５０μｇ）の試験免疫原（配列番号７７）を使用したことを除いて、試験物質を、２５μｇの試験免疫原、および２００μｌ中のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２５μｇのＱＳ２１アジュバントを混合することによって調製した。尾を傷つけ、５０μｌの血液を採取することによって、２１日目、４９日目および７７日目に、図１および図２に示される実験において使用されるマウスから採血し、続いて血清に処理した。図３～図１１に示される実験において使用されるマウスは、５週目および８週目に採血した。試験したペプチドには、ＣＰＤＮＥＡＹＥ（配列番号７３）、ＤＰＤＮＥＡＹＣ（配列番号７４）、ＣＧＦＶＫＫＤＱ（配列番号７５）、ＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７６）、ＤＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７７）、ＰＤＮＥＡＹＥＲＲＤＰＤＮＥＡＹＧＧＣ（配列番号７８）、ＤＰＤＮＥＡＹＲＲＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７９）、ＰＤＮＥＡＹＥＲＲＴＧＦＶＫＫＤＧＧＣ（配列番号８０）、またはＴＧＦＶＫＫＤＲＲＤＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号８１）が含まれていた。免疫原は、１つのアルファ－シヌクレイン（ポリ）ペプチド、Ｃ末端リンカーおよびＣ末端システイン（すなわち、－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－；Ｃ末端「－ＧＧＣ」によって配列番号７６～配列番号８１において特に言及されるが、配列番号７３～配列番号７５についてはそうではない）を含有し、Ｃ末端システインを介してマレイミド結合によってＣＲＭ－１９７とカップリングされていた。

モルモットに、２００μｌのＡｄｄａｖａｘ中、５０μｇの試験免疫原、２５μｇのＱＳ２１を、０日目、２１日目、４９日目、および７７日目に筋肉内注射した。免疫の７日後に採血した。試験したペプチドには、ＣＰＤＮＥＡＹＥ（配列番号７３）およびＤＰＤＮＥＡＹＣ（配列番号７４）が含まれていた。免疫原は、１つのアルファ－シヌクレインペプチド、Ｃ末端リンカーおよびＣ末端システイン（すなわち、－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－）を含有し、Ｃ末端システインを介してマレイミド結合によってＣＲＭ－１９７とカップリングされていた。

雌モルモットは研究開始時に少なくとも５週齢であり、体重はほぼ３５０～５００ｇであった。適切な動物舎ならびに動物の飼育および世話のための研究手順は、米国農務省（ＵＳＤＡ）および国際実験動物管理評価・認定協会（Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のガイドラインに従って、認証を受けた施設で行った。

免疫原の濃度は０．５ｍｇ／ｍｌであった、試験免疫原のそれぞれの投与の前に、注射部位を可視化するために、それぞれの後肢の約３ｃｍ^２の区域を剃毛し、エタノールで拭った。それぞれの動物に、２００μｌ（０．２５μｇ／μｌ）の試験免疫原用量を、１注射あたりそれぞれ１００μｌで、２つの離れた部位に分けて投与した（すなわち、動物に１００μｌＰＢＳ中５０μｇの免疫原＋１００μｌＡｄｄａｖａｘ中２５μｇのＱＳ－２１を投与した）。２５Ｇ～２７Ｇの針を後肢の筋肉内、約０．２５～０．５ｃｍの深さに挿入し、１部位あたり１００μｌで注射した。後肢１本あたり少なくとも２ｃｍ離した４つの離れた部位の間で投与ごとに注射部位をローテーションした。

（実施例２）
抗体力価の測定

モルモットについて、１週目、４週目、８週目および１２週目に１回の採取あたり２５０～３５０μｌで頸静脈を介して、およびマウスについて、尾を傷つけることによって、１週目、３週目、７週目および１１週目に１回の採血あたり５０μｌで、凝固活性剤チューブに全血試料を採取した。最終採血の週の終わりに心穿刺を介して最大体積の全血を凝固活性剤チューブに採取した。全ての血液試料は室温で３０分を超えて凝血させ、周囲温度（約２０～２５℃）で、３，０００ＲＰＭで１０～１５分、遠心分離し、血清上清を清潔な凍結バイアルに個別に移した。血清上清は－８０℃（±１２℃）で凍結保存した。

モルモット採血の力価 － アルファ－シヌクレインペプチド

２μｇ／ｍｌのアルファ－シヌクレインをＰＢＳ中１００μｌ／ウェルでプレートにコーティングし、室温で一夜インキュベートした。プレートをＰＢＳ中１％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。プレートを吸引し、Ａ行に２００μｌのＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ中０．１％ＢＳＡを加えた。カラム１に陰性モルモット血清を１００倍希釈で加え、一方で行の残りは１００倍希釈の試験血清を含んでいた。行をプレートの下でステップごとに５０％で段階希釈して１００倍～１２８００倍の希釈範囲とした。ウェルを室温で２時間インキュベートし、次いで洗浄した。０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ中、抗モルモットＩｇＧ ＨＲＰの５０００倍希釈を調製し、次いで洗浄したウェルに１００μｌを加えた。試料を１時間インキュベートし、次いで洗浄した。Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ ＯＰＤ錠剤を用い、１０ｍＬあたり１錠剤でＯＰＤ基質を調製した。Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ基質緩衝液を１０倍希釈で加え、各ウェルに１００μｌを加え、１５分インキュベートした。５０μｌの２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止させ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘにより４９０ｎｍでプレートを読み取った。力価は最大ＯＤの５０％を与える希釈倍率として定義し、希釈倍率の間に入る場合には外挿した。

アルファ－シヌクレインマウスに対する力価

２μｇ／ｍｌの組換えアルファ－シヌクレインをＰＢＳ中１００μｌ／ウェルでプレートにコーティングし、室温で一夜インキュベートした。プレートをＰＢＳ中１％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。プレートを吸引し、Ａ行に２００μｌのＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ中０．１％ＢＳＡを加えた。カラム１に陰性マウス血清を１００倍希釈で加え、一方で行の残りは１００倍希釈の試験血清を含んでいた。行をプレートの下で１：２段階希釈して１００倍～１２８００倍の希釈とした。ウェルを室温で２時間インキュベートし、次いで洗浄した。０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ中、抗マウスＩｇＧ ＨＲＰの５０００倍希釈を調製し、次いで洗浄したウェルに１００μｌを加えた。反応混合物を１時間インキュベートし、次いで洗浄した。Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ ＯＰＤ錠剤を用い、１０ｍＬあたり１錠剤でＯＰＤ基質を調製した。Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ基質緩衝液を１０倍希釈で加え（各ウェルに１００μｌを加える）、混合物を１５分インキュベートした。５０μｌの２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止させ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘにより４９０ｎｍでプレートを読み取った。力価は最大ＯＤ測定値の５０％を与える希釈倍率として定義し、希釈倍率の間に入る場合には外挿した。

上記のように免疫されたモルモットにおいて観察された抗体力価を表１に示す。免疫は、Ａｄｄａｖａｘ中のＱＳ２１を用いて行った。報告された力価は、３回目の注射後の採血についてである。これらの結果を図１に表す。

上記のように免疫されたマウスにおいて観察された抗体力価を表２、表３、表４および表５に示す。免疫は、ＱＳ２１を用いて行った。報告された力価は、他に言及されない限り、３回目の注射後の採血についてである。表２の結果を図２に表し；表３の結果を図３に表し；表４の結果を図４に表し；表５の結果を図９に表す。

（実施例３）
本明細書で開示したワクチンで免疫した動物由来の血清によるパーキンソン脳組織の染色

剖検したパーキンソン病ドナーまたは非疾患対照由来の新鮮凍結ヒト脳組織を最適切断温度コンパウンド（ＯＣＴコンパウンド）中に包埋し、クライオスタットで切断して１０μｍの凍結切片を生成した。組織切片をアジ化ナトリウムの存在下、グルコースオキシダーゼおよびベータＤ－グルコースの溶液中でインキュベートして内因性ペルオキシダーゼをブロックした。ワクチン接種したマウスまたは対照マウス由来の血清による染色は、次いで、自動化されたＬｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｒｘ Ｓｔａｉｎｅｒ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で、１：１０００希釈で行なった。抗体結合は、Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＤＳ９８００、Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出した。これは、抗マウスポリマー検出、ＤＡＢ可視化、およびヘマトキシリン核対比染色に基づいている。カバースリップの後、染色した組織スライドを、Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＮａｎｏＺｏｏｍｅｒ ２．０ＨＴスライドスキャナー（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、ＮＤＰ．スキャン２．５．８５ソフトウェアによってデジタルイメージングした。デジタル化した画像を目視観察し、ＮＤＰ．ｖｉｅｗ ２．７．４３．０ソフトウェアを用いて解析した。

結果は、アルファ－シヌクレインの病変が、それらの典型的な組織病理学的特徴に基づいて同定されたことを実証している。そのような病変は、対照マウス血清とインキュベートベートした組織には存在しなかった。また、正常な非疾患組織はワクチン接種したマウス由来の血清とインキュベートした後に、そのような病変染色を有しなかった。図５（Ａ）は、配列番号７８でワクチン接種したマウス由来の血清の１：３００希釈を用いた新鮮凍結ヒトパーキンソン脳組織対図６（Ｂ）の正常組織中のシヌクレインの病変の染色を示す。図６（Ａ）は、配列番号７９でワクチン接種したマウス由来の血清の１：３００希釈を用いた新鮮凍結ヒトパーキンソン脳組織対図６（Ｂ）の正常組織中のシヌクレインの病変の染色を示す。図７（Ａ）は、配列番号８１でワクチン接種したマウス由来の血清の１：３００希釈を用いた新鮮凍結ヒトパーキンソン脳組織対図７（Ｂ）の正常組織中のシヌクレインの病変の染色を示す。表６に、特定したペプチドでワクチン接種した動物由来のマウス血清を用いたシヌクレインの病変の染色の結果をまとめる。

配列番号７７、配列番号７９および配列番号８１について実験を繰り返した。図１０（Ａ）、図１０（Ｂ）および図１０（Ｃ）は、それぞれ、配列番号７９、配列番号８１および配列番号７７についての新鮮凍結ヒトパーキンソン脳組織におけるシヌクレインの病変の染色を示し、タンデム配列についての２つと比較される単一アルファ－シヌクレインペプチドを有することを補償するためのモノマー性アルファ－シヌクレインペプチド（配列番号７７）についての２×投薬を含む。全ての試料は、（染色された）アルファ－シヌクレインの病変に結合し、配列番号７９および配列番号８１のポリペプチドはこの実験においてより効率的に染色した。表７に、特定したペプチドでワクチン接種した動物由来のマウス血清を用いたシヌクレインの病変の染色の結果をまとめる。

（実施例４）
シヌクレイン調製

シヌクレインの製造

ヒトアルファ－シヌクレイン（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＢＣ１０８２７５．１）についてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する細菌発現ベクターｐＥＴ２１ｄを発現のために使用し、同一性をシークエンシングによって確認した。組換えアルファ－シヌクレインの発現および精製のために、ＢＬ２１ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞における発現を０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、細胞を超音波処理またはマイクロフルイダイザーによって溶解した。溶解物を、沸騰させることによって清澄化して、熱安定性アルファ－シヌクレインが豊富な溶解物を生成し、この溶解物を、アニオン交換クロマトグラフィーによって解析した。プールしたアルファ－シヌクレインの純粋な画分を、保管のためにＰＢＳに透析した。

シヌクレインの凝集

モノマー性シヌクレインの凝集を、２．５％（ｖ／ｖ）のＨＦＩＰ（Ｓｉｇｍａ）のＰＢＳ中の２．６ｍｇ／ｍＬの精製シヌクレインへの添加によって誘導した。ＨＦＩＰを伴うアルファ－シヌクレインタンパク質を、１０００ｒｐｍに設定した３７℃のサーモミキサーにおいて４日間インキュベートして、凝集を誘導した。さらなる使用の前に、ＨＦＩＰを、フード内で試料から蒸発させ、アミロイド含有量を、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）アッセイを用いてチェックした。

シヌクレインのｐＨｒｏｄｏ標識

凝集したおよびモノマー性のアルファ－シヌクレイン試料を、ｐＨｒｏｄｏ ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、暗所で、室温で１時間標識した。遊離色素を、モノマー試料に対する広範囲の透析を介して、および凝集したシヌクレインの超遠心分離を介して除去し、得られたペレットのすすぎを繰り返した。凝集したアルファ－シヌクレインを、元の体積のＰＢＳに再懸濁させ、浴を、１０秒の間隔で１０％の出力、および３分の超音波処理時間について５秒の休止で超音波処理（ＱＳｏｎｉｃａ）した。標識度を、製造業者の指示に従って定量化し、モノマーおよび凝集したアルファ－シヌクレインの両方について２色素：１タンパク質であると決定した。

（実施例５）
Ｂ１０３遮断アッセイ

Ｂ１０３ニューロン細胞株へのシヌクレインの結合を遮断するオリゴクローナルおよびポリクローナル血清の能力を評価した。

使用前に、精製ｐＨｒｏｄｏ標識アルファ－シヌクレインを、成長培地に再懸濁し、ＩｇＧ切断物に結合する前に、１０ｕｇ／ｍＬの４×操作濃度を達成した。

ＩｇＧ切断物を成長培地に希釈した（１，２００ｕｇ／ｍｌの４×操作濃度；群あたりｎ＝３）。１０ｕｇ／ｍｌのｐＨｒｏｄｏ標識アルファ－シヌクレイン凝集物を、ＩｇＧ切断物（２５μｌ／試料）に１：１（２５μｌ／試料）で加えた。抗体／アルファ－シヌクレイン混合物を、室温で３０分間インキュベートした。

Ｂ１０３神経芽細胞腫細胞を、温めた無菌ＰＢＳで洗浄し、Ｖｅｒｓｅｎｅ／ＥＴＤＡインキュベーションで、３７℃、５％のＣＯ_２で５分間高めた。細胞を、２００×ｇで５分間遠心分離し、１，０００，０００個細胞／ｍｌで成長培地（５０μｌ／試料）に再懸濁した。５０μｌのＢ１０３細胞を、９６ウェルＶ底プレートにおいて、５０μｌの抗体／アルファ－シヌクレイン混合物に加えた。３７℃、５％のＣＯ_２での３時間のインキュベーション後、細胞を、成長培地で３回洗浄し（２００×ｇ；５分スピン）、３７℃、５％のＣＯ_２で１０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中１％ＦＢＳ；ＭｇまたはＣａなし）中で２回洗浄し、Ｂ１０３細胞による標識アルファ－シヌクレイン取り込みのフローサイトメトリー分析のために、１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。

図８は、タンデム構築物２（配列番号７９）および４（配列番号８１）が、Ｂ１０３細胞によるアルファ－シヌクレインの取り込みの阻害に最も効率的であったことを示す。

図１１は、再び、タンデム構築物２（配列番号７９）および４（配列番号８１）が、Ｂ１０３細胞によるアルファ－シヌクレインの取り込みの阻害に最も効率的であったことを示す。単一アルファ－シヌクレイン構築物１４（配列番号７７）は、この実験においてシヌクレイン結合を感知できるほどに阻害しなかった。

（実施例６）
フローサイトメトリー分析

Ｂ１０３ラット神経芽細胞腫細胞によるアルファ－シヌクレイン凝集物の取り込みを、ｐＨｒｏｄｏ蛍光標識活性化アルファ－シヌクレインに対して、フローサイトメトリーによって評価した。アルファ－シヌクレイン内部移行を、平均蛍光強度（ＭＦＩ；１００％に対して正規化）として測定した。１００％に対するＭＦＩの正規化は、バックグラウンドの細胞ＭＦＩシグナル（ｐＨｒｏｄｏタウ添加なし）の減算、および最も高いＭＦＩを１００％（アイソタイプ対照）に設定することを含んでいた。

本発明の種々の特定の実施形態を本明細書に記載したが、本発明はこれらの正確な実施形態に限定されず、当業者によって本発明の範囲および精神から逸脱することなく種々の変更または改変を本明細書に適用できることを理解されたい。

本明細書に記載したペプチドの実施形態のそれぞれにおいて、ペプチドは列挙された配列を含み得るか、それからなり得るか、または本質的にそれからなり得る。したがって、本明細書で開示したアルファ－シヌクレイン（ポリ）ペプチドを含む組成物の一部であってよい以下の配列は、本開示に組み込まれる（表８参照）。

Claims (56)

1. 配列番号０１の残基８１～１４０由来の３～１０アミノ酸、および必要に応じてＣ末端システインを含むペプチド。
2. 配列番号０１の残基１１１～１３１、および必要に応じてＣ末端システイン由来である、請求項１に記載のペプチド。
3. 配列番号０２～配列番号３７のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のペプチド。
4. 配列番号０１の残基８３～１０６、および必要に応じてＣ末端システイン由来である、請求項１に記載のペプチド。
5. 配列番号３８～配列番号７２のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のペプチド。
6. 配列番号０２～配列番号７２のいずれか１つからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
7. ＤＰＤＮＥＡＹＥ（配列番号４８）、ＤＰＤＮＥＡＹ（配列番号４９）、ＰＤＮＥＡＹＥ（配列番号５５）、ＡＴＧＦＶＫＫ（配列番号４１）、ＴＧＦＶＫＫＤ（配列番号４８）、ＧＦＶＫＫＤＱ（配列番号５４）またはＤＰＤＮＥＡＹＣ（配列番号７４）のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
8. 必要に応じてＮ末端システインを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のペプチド。
9. ＣＰＤＮＥＡＹＥ（配列番号７３）またはＣＧＦＶＫＫＤＱ（配列番号７５）のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のペプチド。
10. ＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７６）、ＤＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７７）、ＰＤＮＥＡＹＥＲＲＤＰＤＮＥＡＹＧＧＣ（配列番号７８）、ＤＰＤＮＥＡＹＲＲＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号７９）、ＰＤＮＥＡＹＥＲＲＴＧＦＶＫＫＤＧＧＣ（配列番号８０）、またはＴＧＦＶＫＫＤＲＲＤＰＤＮＥＡＹＥＧＧＣ（配列番号８１）のアミノ酸配列を含むペプチド。
11. 前記ペプチドのＣ末端部分にリンカーをさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のペプチド。
12. 前記リンカーが、アミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
13. 前記リンカーが、ＧＧ、ＧＧＧ、ＡＡ、ＡＡＡ、ＫＫ、ＫＫＫ、ＳＳ、ＳＳＳ、ＡＧＡＧ（配列番号８４）、ＧＧ、ＧＡＧＡ（配列番号８３）およびＫＧＫＧ（配列番号８５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のペプチド。
14. 前記ポリペプチド、または存在する場合担体へのリンカーが、Ｃ末端システイン（Ｃ）をさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のペプチド。
15. Ｎ末端にブロックされたアミンをさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のペプチド。
16. 第２のペプチドが、５～１０アミノ酸を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
17. 請求項１～１６のいずれか一項に記載のペプチドのうちの１つまたは複数を含む、免疫療法組成物。
18. 前記１つまたは複数のペプチドが、前記ペプチドのＣ末端部分に担体へのリンカーをさらに含む、請求項１７に記載の免疫療法組成物。
19. 前記リンカーが、ＧＧ、ＧＧＧ、ＡＡ、ＡＡＡ、ＫＫ、ＫＫＫ、ＳＳ、ＳＳＳ、ＡＧＡＧ（配列番号８４）、ＧＧ、ＧＡＧＡ（配列番号８３）およびＫＧＫＧ（配列番号８５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の免疫療法組成物。
20. 前記担体が、血清アルブミン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、ジフテリア毒素の遺伝子改変された交差反応物質（ＣＲＭ）、ＣＲＭ１９７、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄ（ＨｉＤ）、ｒＥＰＡ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ外毒素Ａ）、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）、ならびにフラジェリンを含む、請求項１８または１９のいずれかに記載の免疫療法組成物。
21. 前記担体が、ＣＲＭ１９７である、請求項２０に記載の免疫療法組成物。
22. 前記担体が、ジフテリアトキソイドである、請求項２０に記載の免疫療法組成物。
23. 少なくとも１種の薬学的に許容される希釈剤をさらに含む、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の免疫療法組成物。
24. 多重抗原提示システム（ＭＡＰ）をさらに含む、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の免疫療法組成物。
25. 前記ＭＡＰが、Ｌｙｓ系樹状足場、ヘルパーＴ細胞エピトープ、免疫刺激性親油性部分、細胞透過性ペプチド、ラジカル誘導重合、抗原提示プラットフォームとしての自己組織化ナノ粒子、および金ナノ粒子のうちの１つまたは複数を含む、請求項２４に記載の免疫療法組成物。
26. （ａ）請求項１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチドのうちの１つもしくは複数、または（ｂ）請求項１７～２５のいずれかに記載の免疫療法組成物、および少なくとも１種のアジュバントを含む医薬組成物。
27. 前記アジュバントが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、３脱－Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＱＳ－２１、ＴＱＬ１０５５、ＱＳ－１８、ＱＳ－１７、ＱＳ－７、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、水中油型エマルジョン（スクアレンまたはピーナッツ油など）、ＣｐＧ、ポリグルタミン酸、ポリリシン、ＡｄｄａＶａｘ（商標）、ＭＦ５９（登録商標）、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
28. 前記アジュバントが、ＱＳ－２１またはＴＱＬ１０５５である、請求項２７に記載の医薬組成物。
29. 前記アジュバントが、ＭＰＬである、請求項２７に記載の医薬組成物。
30. 前記アジュバントが、ＭＰＬおよびＱＳ－２１の組合せまたはＭＰＬおよびＴＱＬ１０５５の組合せである、請求項２７に記載の医薬組成物。
31. 前記アジュバントが、リポソーム製剤を含む、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
32. 前記組成物が、少なくとも１種の薬学的に許容される希釈剤を含む、請求項２６～３１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
33. 多重抗原提示システム（ＭＡＰ）を含む、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
34. 前記ＭＡＰが、Ｌｙｓ系樹状足場、ヘルパーＴ細胞エピトープ、免疫刺激性親油性部分、細胞透過性ペプチド、ラジカル誘導重合、抗原提示プラットフォームとしての自己組織化ナノ粒子、および金ナノ粒子のうちの１つまたは複数を含む、請求項３３に記載の医薬組成物。
35. 請求項１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１７～２５のいずれか一項に記載の免疫療法組成物をコードする核酸配列を含む核酸。
36. 請求項３５に記載の核酸、および少なくとも１種のアジュバントを含む核酸免疫療法組成物。
37. 対象におけるアルファ－シヌクレイノパチーを処置するまたはその予防をもたらす方法であって、請求項１７～２５のいずれか一項に記載の免疫療法組成物または請求項２６～３４のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
38. アルファ－シヌクレイノパチーを有するか、もしくはそれを発生するリスクがある対象における、ニューロンによるアルファ－シヌクレインの取り込みを遮断する、アルファ－シヌクレインシードの細胞間の伝達を阻害する、またはアルファ－シヌクレインの凝集を阻害もしくは低減する方法であって、請求項１７～２５のいずれか一項に記載の免疫療法組成物または請求項２６～３４のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
39. 対象におけるアルファ－シヌクレイノパチーを処置するまたはその予防をもたらす方法であって、請求項３６に記載の核酸免疫療法組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
40. アルファ－シヌクレイノパチーを有するか、もしくはそれを発生するリスクがある対象における、ニューロンによるアルファ－シヌクレインの取り込みを遮断する、アルファ－シヌクレインシードの細胞間の伝達を阻害する、またはアルファ－シヌクレインの凝集を阻害もしくは低減する方法であって、請求項３６に記載の核酸免疫療法組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
41. 前記アルファ－シヌクレイノパチーが、パーキンソン病、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、アルツハイマー病および脳の鉄蓄積を伴う神経変性（ＮＢＩＡ）からなる群から選択される、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記多系統萎縮症（ＭＳＡ）が、ＭＳＡパーキンソン病型（ＭＳＡ－Ｐ）バリアントおよびＭＳＡ小脳型（ＭＳＡ－Ｃ）バリアントからなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
43. 前記パーキンソン病が、認知症を伴うパーキンソン病（ＰＤＤ）である、請求項４１に記載の方法。
44. 前記アルツハイマー病が、アルツハイマー病のレビー小体バリアントである、請求項４１に記載の方法。
45. 前記投与することを、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回または少なくとも６回繰り返すことをさらに含む、請求項３７～４４のいずれかに記載の方法。
46. 約１４日、または約２１日～約２８日、または約３か月ごと、または約半年ごと、または約１年ごとの間隔で前記投与することを繰り返すことをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
47. 動物における免疫応答を誘導する方法であって、アルファ－シヌクレインに特異的に結合する抗体を含む免疫応答を生成するのに有効なレジメンで、請求項１～１６に記載のポリペプチド、請求項１７～２５に記載の免疫療法組成物、請求項２６～３４に記載の医薬組成物、または請求項３６に記載の核酸免疫療法組成物のうちのいずれか１つを前記動物に投与することを含む、方法。
48. 前記免疫応答が、アルファ－シヌクレインに特異的に結合する抗体を含む、請求項４７に記載の方法。
49. 前記免疫応答を前記誘導することが、アルファ－シヌクレインのＣ末端領域に特異的に結合する抗体を含む、請求項４７～４８のいずれかに記載の方法。
50. 前記免疫応答を前記誘導することが、アルファ－シヌクレインのＮＡＣ領域に特異的に結合する抗体を含む、請求項４７～４８のいずれかに記載の方法。
51. 請求項１７～２５のいずれかに記載の免疫療法組成物を含む免疫キット。
52. アジュバントをさらに含む、請求項５１に記載のキット。
53. 前記免疫療法組成物が、第１の容器中にあり、前記アジュバントが、第２の容器中にある、請求項５２に記載のキット。
54. 請求項３６に記載の核酸免疫療法組成物を含むキット。
55. アジュバントをさらに含む、請求項５４に記載のキット。
56. 前記核酸が、第１の容器中にあり、前記アジュバントが、第２の容器中にある、請求項５５に記載のキット。