CN116783211A - 治疗突触核蛋白病之α-突触核蛋白疫苗 - Google Patents

Abstract

本公开提供包含α‑突触核蛋白肽的肽组合物及免疫疗法组合物。本公开亦提供治疗或实现防治受试者之具有α‑突触核蛋白沉积之神经变性疾病的方法，该等疾病诸如帕金森病(Parkinson’s disease)、路易氏体痴呆症(dementia with Lewy body；DLB)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)或其他突触核蛋白病，该等方法包括在患有含有α‑突触核蛋白积累之神经变性疾病或具有发展此类疾病之风险之受试者中清除沉积物、抑制或减少α‑突触核蛋白之聚集、阻断由神经元摄取以及抑制α‑突触核蛋白种子(alpha‑synuclein seed)之传播的方法。该等方法包括向此类患者施用包含α‑突触核蛋白肽之组合物。

Description

治疗突触核蛋白病之α-突触核蛋白疫苗

相关申请

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序列表声明

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技术领域

本发明涉及免疫学及医学之技术领域，且尤其涉及α-突触核蛋白病(alpha-synucleinopathy)之治疗。

背景技术

α-突触核蛋白病，包括帕金森病(Parkinson’s disease；PD)、路易氏体痴呆症(dementia with Lewy body；DLB)、多系统萎缩症(MSA)、阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease；AD)及其他引起各种神经变性损伤之进行性神经性疾病。α-突触核蛋白为存在于神经元及其他细胞中之蛋白，其为表征此等神经变性病症之病理学主要组分。对α-突触核蛋白之正常生理功能之了解有限，但有证据表明蛋白之可溶性形式可与其他蛋白及某些细胞内膜相互作用。在α-突触核蛋白病中，α-突触核蛋白似乎异常聚集于细胞内，此为疾病之病理。越来越多证据表明，某些聚集形式之α-突触核蛋白可自神经元传输至神经元，引起使得神经元功能异常及损失之病理扩散。在一些神经变性疾病中，包括阿尔茨海默病及帕金森病，α-突触核蛋白(SNCA)之错误折叠聚集通常可伴随有β-淀粉样沉积。

因此，需要用于预防或治疗α-突触核蛋白病之新颖疗法及试剂，尤其能够引起针对患者中存在之α-突触核蛋白之免疫应答的疗法及试剂。

发明内容

在一些实施例中，本发明涉及包括第一肽的肽或多肽，该第一肽包含来自SEQ IDNO:01之残基81至140的3至10个氨基酸，且在一些实施例中该第一肽包含5至10个氨基酸。举例而言，肽可包括SEQ ID NO:02至SEQ ID NO:72中之一者的氨基酸序列。在一些实施例中，肽来自α-突触核蛋白之C端(SEQ ID NO:01之残基111至131)，且举例而言，可包括SEQID NO:02至SEQ ID NO:37中之任一者。在一些实施例中，肽来自α-突触核蛋白之NAC区(SEQID NO:01之残基83至106)，且举例而言，可包括SEQ ID NO:38至SEQ ID NO:72中之任一者。在一些实施例中，本发明涉及包含选自由SEQ ID NO:73至SEQ ID NO:81中之任一者组成的组之氨基酸序列的肽。在一些实施例中，肽进一步包括N端半胱氨酸及C端半胱氨酸中之一者或多者。

在一些实施例中，肽可包括于肽之C端部分或肽之N端部分之接头(例如，连接至载剂)，该接头可为氨基酸序列。接头(若存在)之长度可为1至10个氨基酸。在一些实施例中，接头包含约1至10个氨基酸、约1至9个氨基酸、约1至8个氨基酸、约1至7个氨基酸、约1至6个氨基酸、约1至5个氨基酸、约1至4个氨基酸、约1至3个氨基酸、约2个氨基酸或一个(1个)氨基酸。在一些实施例中，接头为1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸或10个氨基酸。举例而言，接头可包括GG、GGG、AA、AAA、KK、KKK、SS、SSS、AGAG(SEQ ID NO:84)、GG、GAGA(SEQ ID NO:83)及KGKG(SEQ IDNO:85)之氨基酸序列。此外，若存在于C端，则连接至载剂之接头可包括C端半胱氨酸(C)，例如肽-XXC，其中XX可为GG、AA、KK、SS、GAGA(SEQ ID NO:83)、AGAG(SEQ ID NO:84)或KGKG(SEQ ID NO:85)。或者，若存在于N端，则连接至载剂之接头可包括N端半胱氨酸(C)。举例而言，序列可表示为CXX-肽，其中XX及C独立地为任选的，且若存在，则XX可为GG、AA、KK、SS、GAGA(SEQ ID NO:83)、AGAG(SEQ ID NO:84)或KGKG(SEQ ID NO:85)。举例而言，多肽可包括DPDNEAY(SEQ ID NO:12)之氨基酸序列，其中-XXC附接于C端上和/或附接于CXX-N端上，其中XX及C独立地为任选的，且若存在，则XX可为GG、AA、KK、SS、AGAG、GG、GAGA(SEQ ID NO:83)、AGAG(SEQ ID NO:84)、KGKG(SEQ ID NO:85)。在一些实施例中，肽在N端进一步包含封端胺。

在其他实施例中，本发明涉及一种包括本发明之多肽的免疫疗法组合物，其中该多肽可连接至载剂。载剂可包括血清白蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵白蛋白、破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、白喉毒素的经遗传修饰的交叉反应物质(CRM)、CRM197、脑膜炎球菌外膜蛋白复合物(OMPC)及流感嗜血杆菌蛋白D(H.influenzae protein D；HiD)、rEPA(铜绿假单胞菌外毒素A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A))、KLH(钥孔(keyhole limpet)血蓝蛋白)及鞭毛蛋白。

此外，本发明之实施例涉及包含本发明的肽和/或免疫疗法组合物且包括至少一种佐剂的药物组合物及配制剂。佐剂可为氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A(MPL)及其合成类似物、QS-21、QS-18、QS-17、QS-7、TQL1055、完全弗氏佐剂(CompleteFreund’s Adjuvant；CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)、水包油乳液(诸如角鲨烯或花生油)、CpG、聚谷氨酸、聚赖氨酸、AddaVax^TM、及其组合。此外，组合物及配制剂可包括脂质体配制剂、稀释剂和/或多重抗原呈递系统(MAP)。MAP可包括基于Lys之树突状架构、辅助型T细胞表位、免疫刺激亲脂性部分、细胞穿透肽、自由基诱导之聚合、自组装纳米粒子(作为抗原呈递平台)及金纳米粒子中之一者或多者。

此外，免疫疗法组合物可包括至少一种药学上可接受的稀释剂和/或多重抗原呈递系统(MAP)。MAP可包括基于Lys之树突状架构、辅助型T细胞表位、免疫刺激亲脂性部分、细胞穿透肽、自由基诱导之聚合、自组装纳米粒子(作为抗原呈递平台)及金纳米粒子中之一者或多者。

免疫疗法组合物可包括于药物组合物中，该药物组合物包括免疫疗法组合物及至少一种佐剂，诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A(MPL)、QS-21、TQL1055、QS-18、QS-17、QS-7、完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)、水包油乳液(诸如角鲨烯或花生油)、CpG、聚谷氨酸、聚赖氨酸、AddaVax^TM、及其组合。

本发明之实施例还涉及编码本发明之多肽及免疫疗法组合物之核酸序列。核酸可包括于包括核酸及至少一种佐剂之核酸免疫疗法组合物中。

此外，本发明之实施例涉及用于治疗或实现防治受试者之α-突触核蛋白病的方法，及用于在患有α-突触核蛋白病或具有发展α-突触核蛋白病之风险之受试者中阻断由神经元摄取α-突触核蛋白、抑制α-突触核蛋白种子(alpha-synuclein seed)之细胞-细胞间传输或抑制或减少α-突触核蛋白之聚集的方法，α-突触核蛋白病包括帕金森病(PD)、伴有痴呆症之帕金森病(PDD)、路易氏体痴呆症(DLB)、多系统萎缩症(MSA；包括MSA-帕金森型(MSA-parkinsonian；MSA-P)变异形式及MSA-小脑性(MSA-C)变异形式)、阿尔茨海默病(AD；包括AD之路易氏体变异形式及其他包含α-突触核蛋白相关病理之变异形式)及神经变性伴脑铁沉积(NBIA)。方法包括向受试者施用本发明之免疫疗法组合物、核酸免疫疗法组合物或药物配制剂。

本发明的方法可包括至少两次、至少三次、至少四次、至少五次或至少六次重复施用，且可包括以约半个月、约21至约28天、约一季、约半年或约一年的间隔重复施用。

此外，本发明的方法涉及在动物中诱导免疫应答。方法包括以有效产生免疫应答之方案向动物施用本发明之多肽、免疫疗法组合物、药物配制剂或核酸免疫疗法组合物，该免疫应答包括特异性结合于α-突触核蛋白之抗体。免疫应答可包括特异性结合于α-突触核蛋白之C端区和/或α-突触核蛋白之NAC区的抗体。

在其他实施例中，本发明涉及一种免疫接种试剂盒，其包括本发明之免疫疗法组合物且可包括佐剂，其中免疫疗法组合物可在第一容器中且佐剂可在第二容器中。

此外，本发明涉及一种试剂盒，其包括本发明之核酸免疫疗法组合物且可包括佐剂。核酸可在第一容器中且佐剂可在第二容器中。

附图说明

图1显示在四次注射之后，比较小鼠血清针对α突触核蛋白单肽免疫原CPDNEAYE(SEQ ID NO:73)、DPDNEAYC(SEQ ID NO:74)、及CGFVKKDQ(SEQ ID NO:75)之效价的实验结果。所有免疫原均包含用于与经顺丁烯二酰亚胺活化之CRM197载剂偶联的N端或C端半胱氨酸。使用含QS21之AddaVax基于角鲨烯之水包油纳米乳液作为佐剂。

图2显示在三次注射之后，测量天竺鼠血清针对α突触核蛋白单肽免疫原CPDNEAYE(SEQ ID NO:73)及DPDNEAYC(SEQ ID NO:74)之效价的实验结果。所有免疫原均包含用于与经顺丁烯二酰亚胺活化之CRM197载剂偶联的N端或C端半胱氨酸。使用含QS21之AddaVax基于角鲨烯之水包油纳米乳液作为佐剂。在第0天、第3周及第7天向天竺鼠注射免疫原，且在每次注射后一周(即第1周、第4周及第8周)收集血清。所有动物包括CRM对照样品，以确保正常的免疫应答。

图3显示比较小鼠血清针对以下之效价的实验结果：α突触核蛋白单肽免疫原“单个14号(Single#14)”(PDNEAYEGGC(SEQ ID NO:76))、“单个13号”(DPDNEAYEGGC(SEQ IDNO:77))、“串联1号(Tandem#1)”(PDNEAYERRDPDNEAYGGC(SEQ ID NO:78))、“串联2号”(DPDNEAYRRPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:79))、“串联3号”(PDNEAYERRTGFVKKDGGC(SEQ ID NO:80))或“串联4号”(TGFVKKDRRDPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:81))。结果显示针对串联α-突触核蛋白构建体效价较高，及针对单个α-突触核蛋白构建体效价较低。

图4显示在第二次注射SEQ ID NO:78(1行)、SEQ ID NO:79(2行)、SEQ ID NO:80(3行)、SEQ ID NO:81(4行)、SEQ ID NO:77(14行)、SEQ ID NO:76(13行)之免疫原之后，比较串联及单个α-突触核蛋白构建体对单体及可溶性聚集式α-突触核蛋白之效价的实验结果。

图5显示使用以1:300稀释之来自经SEQ ID NO:78疫苗接种之小鼠的血清，对新鲜冷冻人类帕金森病脑组织(A)与正常组织(B)中之突触核蛋白病理的染色情况。

图6显示使用以1:300稀释之来自经SEQ ID NO:79疫苗接种之小鼠的血清，对新鲜冷冻人类帕金森病脑组织(A)与正常组织(B)中之突触核蛋白病理的染色情况。

图7显示使用以1:300稀释之来自经SEQ ID NO:81疫苗接种之小鼠的血清，对新鲜冷冻人类帕金森病脑组织(A)与正常组织(B)中之突触核蛋白病理的染色情况。

图8显示在瑞士韦伯斯特小鼠(Swiss webster mouse)中抗体针对串联及单个α-突触核蛋白肽免疫原产生之阻断α-突触核蛋白与B103神经元细胞系之结合的能力。“13-x”样品为PDNEAYEGGC(SEQ ID NO:76)，“14-x”样品为DPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:77)，“1-x”样品为PDNEAYERRDPDNEAYGGC(SEQ ID NO:78)，“2-x”样品为DPDNEAYRRPDNEAYEGGC(SEQ IDNO:79)，“3-x”样品为PDNEAYERRTGFVKKDGGC(SEQ ID NO:80)，及“4-x”样品为TGFVKKDRRDPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:81)。

图9显示比较小鼠血清针对α突触核蛋白单肽免疫原DPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:77)及串联免疫原DPDNEAYRRPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:79)以及TGFVKKDRRDPDNEAYEGGC(SEQ IDNO:81)之效价的实验结果。与串联构建体相比，SEQ ID NO:77以2×浓度给药，以作为单个α-突触核蛋白免疫原对照物。

图10显示使用1:300稀释之来自经以下疫苗接种之小鼠的血清对新鲜冷冻人类帕金森病脑组织之突触核蛋白病理的染色情况：SEQ ID NO:79(A；“串联2号”)、SEQ ID NO:81(B；“串联4号”)或SEQ ID NO:77(C；“2×单个”)。对串联α-突触核蛋白样品之染色似乎更显著。

图11显示在B6小鼠中抗体针对串联及单个α-突触核蛋白肽免疫原产生之阻断α-突触核蛋白与B103神经元细胞系之结合的能力。“14-x”样品为DPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:77)，“2-x”样品为DPDNEAYRRPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:79)，“4-x”样品为TGFVKKDRRDPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:81)。

发明详述

本发明提供包含α-突触核蛋白肽的肽组合物及免疫疗法组合物。本发明亦提供治疗或实现防治受试者之α-突触核蛋白病(即，具有α-突触核蛋白积累或沉积之疾病)的方法，包括用于在患有α-突触核蛋白病或具有发展α-突触核蛋白病之风险之受试者中清除及防止沉积物形成、抑制或减少聚集或减少α-突触核蛋白之丰度、阻断由神经元结合和/或摄取α-突触核蛋白、抑制α-突触核蛋白物种细胞间之传输及抑制脑部区域之间的病理扩散的方法，α-突触核蛋白病包括帕金森病(PD)、伴有痴呆症之帕金森病(PDD)、路易氏体痴呆症(DLB)、多系统萎缩症(MSA；包括MSA-帕金森型(MSA-P)变异形式及MSA-小脑性(MSA-C)变异形式)、阿尔茨海默病(AD；包括AD之路易氏体变异形式及其他包含α-突触核蛋白相关病理之变异形式)及神经变性伴脑铁沉积以及含有α-突触核蛋白积累之其他疾病。方法包括向此类患者施用包含α-突触核蛋白肽之组合物。

以下为多个术语之定义。除非上下文另外明确规定，否则如本文所用之单数形式“一(a/an)”及“该(the)”包括复数个参照物。举例而言，术语“化合物”或“至少一种化合物”可包括复数种化合物，包括其混合物。

除非另外自上下文显而易见，否则术语“约”涵盖非实质性变化，诸如在所陈述之值之标准测量误差边际(例如SEM)内的值。举例而言，在提及诸如参数、量、持续时间之可测量值时，如本文所用之术语“约”可涵盖与指定值相差+/-10％或更少、+/-5％或更少，或+/-1％或更少或更小之变化。对值之范围的指定包括该范围内或界定该范围之所有整数，及由该范围内之整数界定的所有子范围。如本文所用，统计显著性意谓p≤0.05。

“包含”或“包括”一个或多个所叙述要素之组合物或方法可包括未具体叙述之其他要素。举例而言，“包含”或“包括”多肽序列之组合物可含有单独的或与其他序列或成分组合之序列。

若受试者具有至少一种已知风险因子(例如，年龄、遗传、生化、家族史及情境暴露)，则该个体患上疾病之风险增加，具有该风险因子之个体的发展该疾病之风险在统计学上显著比不具有该风险因子之个体更大。

术语“患者”包括接受防治性或治疗性治疗之人类及其他哺乳动物受试者，包括未经治疗之受试者。如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指需要治疗之任何单一受试者，包括其他哺乳动物受试者，诸如人类、牛、狗、天竺鼠、兔等。受试者亦意欲包括任何参与临床研究试验之未显示疾病之任何临床病征之受试者，或参与流行病学研究之受试者，或用作对照之受试者。

术语“疾病”是指损害生理功能之任何异常病状。该术语广泛地用于涵盖任何使生理功能受损之病症、疾患、异常、病变、病、病状或综合征，与病因之性质无关。

术语“症状”是指如受试者所感知之疾病的主观证据，诸如步态改变。“病征”是指如医师所观测之疾病的客观证据。

如本文所用，术语“治疗(treat/treatment)”是指缓解或缓和与疾病相关之一种或多种症状或影响；预防、抑制或推迟疾病之一种或多种症状或影响的发作；降低疾病之一种或多种症状或影响之严重性或发生率；和/或增加或引起如本文所描述之所需结果。

如本文所用，术语“预防(prevention/prevent/preventing)”是指在疾病发作之前，在已存在或不存在α-突触核蛋白病理之情况下(初级预防及次级预防)，使本发明的肽或免疫疗法组合物与受试者接触(例如施用)，藉此推迟临床症状之发作和/或在疾病发作之后缓解疾病之症状(与受试者未与肽或免疫疗法组合物接触时相比)，且并非指完全抑止疾病之发作。在一些情况下，可在施用本发明的肽或免疫疗法组合物之后的有限时间保持预防作用。在其他情况下，可在包含施用本发明的肽或免疫疗法组合物的治疗方案之持续时间内保持预防作用。

如本文所用，术语“减少(reduction/reduce/reducing)”是指减少在受试者或受试者之组织中存在之α-突触核蛋白之量，或抑止在受试者或受试者之组织中存在之α-突触核蛋白之量的增加，其涵盖减少或抑止在受试者或受试者之组织中存在、积累、聚集或沉积之α-突触核蛋白之量的增加(例如使增加速率降低)。在某些实施例中，减少或抑止在受试者中存在、积累、聚集或沉积之α-突触核蛋白之量的增加(例如，使增加速率降低)是指在受试者之中枢神经系统(CNS)中存在、积累、聚集或沉积之α-突触核蛋白之量。在某些实施例中，减少或抑止在受试者中存在、积累、聚集或沉积的α-突触核蛋白之量的增加(例如使增加速率降低)是指在受试者之外周(例如外周循环系统)中存在、积累、聚集或沉积的α-突触核蛋白之量。在某些实施例中，减少或抑止在受试者中存在、积累、聚集或沉积之α-突触核蛋白之量的增加(例如，使增加速率降低)是指在受试者之脑部中存在、积累、聚集或沉积之α-突触核蛋白之量。在一些实施例中，减少之α-突触核蛋白为α-突触核蛋白之病理形式(例如，寡聚或纤维状α-突触核蛋白堆积物或α-突触核蛋白寡聚物之前原纤维中间物)。在其他实施例中，神经变性疾病和/或突触核蛋白病之病理性指示物减少。

术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上之可使B细胞和/或T细胞对其起反应之位点，或抗原上之与抗体结合之位点。表位可由相邻的氨基酸或非相邻的氨基酸形成，该等氨基酸通过蛋白之三级折叠而并列。由相邻的氨基酸形成之表位通常在暴露于变性溶剂后保留，而通过三级折叠形成之表位通常在变性溶剂处理后消失。表位通常以独特的空间构形包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个或至少13个氨基酸。测定表位之空间构形的方法包括例如x射线结晶学及2维核磁共振。参见例如Epitope Mapping Protocols,Methods in Molecular Biology,第66卷,Glenn E.Morris编(1996)。

“免疫原性剂”或“免疫原”或“抗原”能够在向动物施用后诱导针对自身或针对自身之经修饰/处理之版本之免疫应答，该施用任选与佐剂结合。术语“免疫原性剂”或“免疫原”或“抗原”是指包含肽、多肽或蛋白之化合物或组合物，当以适当量(“免疫原性有效量”)施用时，该肽、多肽或蛋白为“抗原性”或“免疫原性”，即能够诱导、引发、增加或增强细胞和/或体液免疫应答且由该反应之产物(T细胞、抗体)识别。免疫原可为肽或两个或更多个相同或不同肽之组合，其包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个或至少13个呈线性或空间构形之氨基酸。

编码肽免疫原且用作疫苗之核酸(诸如DNA或RNA)称为“DNA[或RNA]免疫原”，因为经编码之多肽在施用该DNA或RNA之后在体内表达。肽或多肽可由疫苗载体以重组方式表达，该疫苗载体可为裸DNA或RNA，其包含可操作地连接于启动子(例如，如本文所描述之表达载体或盒)的肽或多肽编码序列。

免疫原在单独或以组合形式提供，或与另一物质(其可一次性或以若干间隔施用)连接或融合时可为有效的。免疫原性剂或免疫原可包括连接至如本文中所描述之载体的抗原肽或多肽。

编码抗原肽或多肽之核酸(诸如DNA或RNA)称为“DNA[或RNA]免疫原”，因为经编码的肽或多肽在施用该DNA或RNA之后在体内表达。肽或多肽可由疫苗载体以重组方式表达，该疫苗载体可为裸DNA或RNA，其包含可操作地连接于启动子(例如，如本文所描述之表达载体或盒)的肽或多肽编码序列。

术语“佐剂”是指当与抗原结合施用时增强对抗原之免疫应答，但当单独施用时不产生针对抗原之免疫应答的化合物。佐剂可通过若干机制来增强免疫应答，该等机制包括淋巴细胞募集、B细胞和/或T细胞之刺激及巨噬细胞之刺激。佐剂可为天然化合物、天然化合物之修饰版本或衍生物，或合成化合物。

术语“肽”、“多肽”及“(多)肽”在本文中可互换使用且是指两个或更多个连续氨基酸之链。若进行区分及当进行区分时，上下文应使其含义为清楚明晰的。举例而言，若使本文中所描述之两个或更多个肽接合以制备二聚肽或多聚肽，则可使用多肽指示“多”或“超过一个”肽。

术语“药学上可接受”意谓载剂、稀释剂、赋形剂、佐剂或助剂与药物配制剂之其他成分兼容且对其受体基本上无害。

术语“免疫疗法”或“免疫应答”是指产生针对受体中之α-突触核蛋白肽的有益的体液(抗体介导之)和/或细胞(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导之)应答。此类应答可为通过施用免疫原(例如α-突触核蛋白肽)诱导之活性应答。细胞免疫应答由多肽表位结合I类或II类MHC分子之呈现以活化抗原特异性CD4⁺T辅助细胞和/或CD8⁺细胞毒性T细胞来引发。应答亦可涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、嗜酸性粒细胞或先天性免疫之其他组分的活化。细胞介导之免疫应答的存在可通过增殖分析法(CD4⁺T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)分析法来测定。体液及细胞应答对免疫原之保护或治疗作用的相关贡献可通过自经免疫接种之同基因型动物单独地分离抗体及T细胞且在第二受试者中测量保护或治疗作用来区分。

α-突触核蛋白

在一些神经变性疾病(例如阿尔茨海默病及其亚型，诸如AD之路易氏体变异形式)中，α-突触核蛋白(SNCA)错误折叠及聚集通常可伴随有β-淀粉样蛋白沉积，且α-突触核蛋白存在于若干神经变性病症中，包括帕金森病(PD)、伴有痴呆症之帕金森病(PDD)、路易氏体痴呆症(DLB)、多系统萎缩症(MSA；包括MSA-帕金森型(MSA-P)变异形式及MSA-小脑性(MSA-C)变异形式)及神经变性伴脑铁沉积(NBIA)。

肽免疫原

用于主动免疫接种之药剂可在患者中诱导免疫应答且可充当免疫疗法。用于主动免疫接种之药剂可为例如用于在实验动物中产生单克隆抗体之相同类型之免疫原，且可包括来自α-突触核蛋白肽之一个区域之3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个或更多个相邻的氨基酸。本文中所描述的肽的各实施例中，肽可包含所叙述序列、由其组成或基本上由其组成。

在本发明之一些实施例中，免疫原可包括包含3至10个氨基酸的α-突触核蛋白肽，该等氨基酸来自α-突触核蛋白多肽(SEQ ID NO:01)之残基81至140，或来自α-突触核蛋白之C端区(SEQ ID NO:01之残基111至131)，或来自α-突触核蛋白之NAC区(SEQ ID NO:01之残基83至106)。在一些实施例中，肽片段为未磷酸化的。在一些实施例中，片段在丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和/或酪氨酸(Y)磷酸化位点处磷酸化。

在一些实施例中，α-突触核蛋白肽包含包括SEQ ID NO:02至SEQ ID NO:72中之任一者之氨基酸序列。在免疫原来自α-突触核蛋白之C端区(SEQ ID NO:01之残基111至131)的一些实施例中，肽可包括SEQ ID NO:02至SEQ ID NO:37中之任一者。在肽免疫原来自α-突触核蛋白之NAC区(SEQ ID NO:01之残基83至106)的一些实施例中，肽可包括SEQ ID NO:38至SEQ ID NO:72中之任一者。在一些实施例中，肽包含包括以下中之一者的氨基酸序列：DPDNEAYE(SEQ ID NO:11)、DPDNEAY(SEQ ID NO:12)、PDNEAYE(SEQ ID NO:18)、ATGFVKK(SEQ ID NO:41)、TGFVKKD(SEQ ID NO:48)、GFVKKDQ(SEQ ID NO:54)、DPDNEAYC(SEQ IDNO:74)、CPDNEAYE(SEQ ID NO:73)、CGFVKKDQ(SEQ ID NO:75)、PDNEAYEGGC(SEQ ID NO:76)、DPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:77)、PDNEAYERRDPDNEAYGGC(SEQ ID NO:78)、DPDNEAYRRPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:79)、PDNEAYERRTGFVKKDGGC(SEQ ID NO:80)或TGFVKKDRRDPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:81)。各α-突触核蛋白序列任选独立地进一步包括C端半胱氨酸和/或N端半胱氨酸。

在一些实施例中，两个或更多个α-突触核蛋白肽连接以形成α-突触核蛋白多肽。一个或多个α-突触核蛋白肽可通过肽内接头连接，该接头如上文及此处所描述。举例而言，多肽接头位于第一肽之C端与第二肽之N端之间。在存在或不存在肽内接头之情况下，α-突触核蛋白多肽可以任何次序排列。举例而言，特定α-突触核蛋白肽(“α-突触核蛋白1”)可位于双重α-突触核蛋白多肽之N端部分，及相同或不同的α-突触核蛋白肽(针对此实例，不同的α-突触核蛋白为“α-突触核蛋白2”)可位于双重多肽之C端部分。或者，在此实例中α-突触核蛋白肽可以相反方向排列(α-突触核蛋白2位于α-突触核蛋白1之N端)。本文中所提及第一肽或第二肽不意欲表明在包含超过一个免疫原之α-突触核蛋白肽的实施例中的α-突触核蛋白肽之次序。

此外，α-突触核蛋白肽或α-突触核蛋白多肽之C端部分和/或N端部分可包括例如用于使肽或多肽与载体结合之接头。可使肽或多肽与载体偶联之接头可包括例如在肽或多肽与载体之间的GG、GGG、KK、KKK、AA、AAA、SS、SSS、GAGA(SEQ ID NO:83)、AGAG(SEQ ID NO:84)、KGKG(SEQ ID NO:85)及本文其他地方所描述之其他接头(例如下文之“接头1”及“接头2”)，且可进一步包括接头之C端上之C端半胱氨酸(或在不存在接头之情况下，直接连接至肽或多肽序列之C端)或接头之N端上之N端半胱氨酸(或在不存在接头之情况下直接连接至肽或多肽序列之N端)。举例而言，(多)肽-G-G-C、(多)肽-K-K-C、(多)肽-A-A-C、(多)肽-S-S-C或C-G-G-多肽、C-K-K-(多)肽、C-A-A-(多)肽、C-S-S-(多)肽。在一些实施例中，免疫原肽进一步包括N端处之封端胺。

当α-突触核蛋白肽连接以形成α-突触核蛋白多肽时，接头可为可裂解接头。如本文所用，术语“可裂解接头”是指在抗原肽之间的任何接头，其促进或以其他方式使得α-突触核蛋白多肽比不具有此类可裂解接头之等效肽更易于通过裂解(例如，通过肽链内切酶、蛋白酶、低pH值或可在抗原呈递细胞内或周围进行的任何其他方法)来彼此分离且藉此更易于由抗原呈递细胞处理。在一些实施例中，可裂解接头为蛋白酶敏感型二肽或寡肽可裂解接头。在某些实施例中，可裂解接头对由蛋白酶之胰蛋白酶家族中之蛋白酶进行之裂解敏感。在一些实施例中，可裂解接头包含包括以下之氨基酸序列：精氨酸-精氨酸(Arg-Arg)、精氨酸-缬氨酸-精氨酸-精氨酸(Arg-Val-Arg-Arg；SEQ ID NO:82)、Gly-Ala-Gly-Ala(SEQ ID NO:83)、Ala-Gly-Ala-Gly(SEQ ID NO:84)、Lys-Gly-Lys-Gly(SEQ ID NO:85)、缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)、缬氨酸-精氨酸(Val-Arg)、缬氨酸-赖氨酸(Val-Lys)、缬氨酸-丙氨酸(Val-Ala)及苯丙氨酸-赖氨酸(Phe-Lys)。在一些实施例中，可裂解接头为精氨酸-精氨酸(Arg-Arg)。

在本发明之一些实施例中，α-突触核蛋白多肽包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：选自DPDNEAYE(SEQ ID NO:11)、DPDNEAY(SEQ ID NO:12)、PDNEAYE(SEQ ID NO:18)、ATGFVKK(SEQ ID NO:41)、TGFVKKD(SEQ ID NO:48)、GFVKKDQ(SEQ ID NO:54)、CPDNEAYE(SEQ ID NO:73)、DPDNEAYC(SEQ ID NO:74)或CGFVKKDQ(SEQ ID NO:75)、PDNEAYEGGC(SEQ ID NO:76)、DPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:77)、PDNEAYERRDPDNEAYGGC(SEQ IDNO:78)、DPDNEAYRRPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:79)、PDNEAYERRTGFVKKDGGC(SEQ ID NO:80)或TGFVKKDRRDPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:81)之氨基酸序列，其中XX任选附接至SEQ ID NO:11、12、18、41、48、54、73、74、75、76、77、78、79、80或81之C端和/或N端，及半胱氨酸任选附接至SEQ ID NO:11、12、18、41、48、54、73、74、75、76、77、78、79、80或81之C端和/或N端，或若XX存在，则半胱氨酸附接至C端XX之C端和/或N端XX之N端。XX可为GG、AA、KK、SS、GAGA(SEQ IDNO:83)、AGAG(SEQ ID NO:84)及KGKG(SEQ ID NO:85)。

在一些实施例中，双重α-突触核蛋白多肽如下：

[第一肽]-[接头1]-[第二肽]-[接头2]-[Cys]，

其中，[第一肽]为α-突触核蛋白肽，且[第二肽]为相同或不同的α-突触核蛋白肽，且[接头1]、[接头2]及[Cys]中之每一者为任选的，且存在之任何[Cys]为C端[Cys]。

在一些实施例中，双重α-突触核蛋白多肽如下：

[Cys]-[接头2]-[第一肽]-[接头1]-[第二肽]，

其中，[第一肽]为α-突触核蛋白肽，且[第二肽]为相同或不同的α-突触核蛋白肽，且[接头1]、[接头2]及[Cys]中之每一者为任选的，且存在之任何[Cys]为N端[Cys]。

在一些实施例中，双重α-突触核蛋白多肽如下：

[Cys]-[接头2]-[第一肽]-[接头1]-[第二肽]-[接头2]-[Cys]，

其中，[第一肽]为α-突触核蛋白肽，且[第二肽]为相同或不同的α-突触核蛋白肽，且[接头1]、[接头2]及[Cys]中之每一者为任选的，且存在之[Cys]可为C端和/或N端[Cys]。

α-突触核蛋白肽之实例包括SEQ ID NO:2-81中之任一者。[接头1]为任选的，且当存在时，其可为可裂解接头。可裂解接头(若存在)之长度可为1至10个氨基酸。在一些实施例中，接头包含约1至10个氨基酸、约1至9个氨基酸、约1至8个氨基酸、约1至7个氨基酸、约1至6个氨基酸、约1至5个氨基酸、约1至4个氨基酸、约1至3个氨基酸、约2个氨基酸或一个(1个)氨基酸。在一些实施例中，可裂解接头为1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸或10个氨基酸。在一些实施例中，接头可为具有选自由以下组成的组之氨基酸序列的可裂解接头：精氨酸-精氨酸(Arg-Arg)、精氨酸-缬氨酸-精氨酸-精氨酸(Arg-Val-Arg-Arg；SEQ ID NO:82)、缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)、缬氨酸-精氨酸(Val-Arg)、缬氨酸-赖氨酸(Val-Lys)、缬氨酸-丙氨酸(Val-Ala)、苯丙氨酸-赖氨酸(Phe-Lys)、甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala；SEQID NO:83)、丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸(Ala-Gly-Ala-Gly；SEQ ID NO:84)及赖氨酸-甘氨酸-赖氨酸-甘氨酸(Lys-Gly-Lys-Gly；SEQ ID NO:85)。

[接头2]为任选的，且当存在时，其为使多肽偶联至载剂之接头。接头(若存在)之长度可为1至10个氨基酸。在一些实施例中，接头包含约1至10个氨基酸、约1至9个氨基酸、约1至8个氨基酸、约1至7个氨基酸、约1至6个氨基酸、约1至5个氨基酸、约1至4个氨基酸、约1至3个氨基酸、约2个氨基酸或一个(1个)氨基酸。在一些实施例中，接头为1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸或10个氨基酸。在一些实施例中，接头之氨基酸组成可模拟在天然多域蛋白质中发现之接头的组成，其中某些氨基酸与其在完整蛋白质中之丰度相比，在天然接头中过度呈现、呈现不足或相同地呈现。举例而言，苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、精氨酸(Arg)、苯丙氨酸(Phe)、谷氨酸(Glu)及丙氨酸(Ala)在天然接头中过度呈现。相比之下，异亮氨酸(Ile)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)及半胱氨酸(Cys)呈现不足。通常，过度呈现之氨基酸为极性不带电或带电残基，其构成约50％之天然编码之氨基酸，且Pro、Thr及Gln为用于天然接头之最佳氨基酸。在一些实施例中，接头之氨基酸组成可模拟通常在重组蛋白中发现之接头(其通常可归类为柔性或刚性接头)之组成。举例而言，在重组蛋白中发现的柔性接头通常由小型、非极性(例如Gly)或极性(例如Ser或Thr)氨基酸构成，其小型尺寸提供柔性且允许连接功能域之移动。例如Ser或Thr之并入可通过与水分子形成氢键来维持接头在水性溶液中之稳定性，且因此可减少接头与免疫原之间的相互作用。在一些实施例中，接头包含Gly及Ser残基之延伸子(“GS”接头)。广泛使用之柔性接头之实例为(Gly-Gly-Ser)n、(Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO:86)或(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO:87)，其中n＝1-3。调整拷贝数“n”可使接头优化以实现功能性免疫原域之充分分离，以便例如使免疫原性反应最大化。已设计许多其他柔性接头以用于可在本文中使用之重组融合蛋白。在一些实施例中，接头可富含诸如Gly及Ser之小型或极性氨基酸，但亦含有诸如Thr及Ala之其他氨基酸以维持柔性，以及诸如Lys及Glu之极性氨基酸以改良溶解性。参见例如Chen,X.等人,“FusionProtein Linkers:Property,Design and Functionality”Adv Drug Deliv Rev.,15；65(10):1357-1369(203)。在某些实施例中，当存在时，接头可为选自由以下组成的组的氨基酸序列：GG、GGG、KK、KKK、AA、AAA、SS、SSS、G-A-G-A(SEQ ID NO:83)、A-G-A-G(SEQ ID NO:84)及K-G-K-G(SEQ ID NO:85)。

[Cys]为任选的且可有助于使多肽与载剂结合。当存在时，Cys可在多肽之C端部分，或在多肽之N端部分。

肽-载剂免疫原

α-突触核蛋白肽(及其多肽)为根据本发明之免疫原。在一些实施例中，肽可连接至适合的载剂以帮助引发免疫应答。因此，本发明之一种或多种肽及多肽可连接至载剂。举例而言，α-突触核蛋白(多)肽中之每一者可在存在或不存在间隔氨基酸之情况下连接至载剂(例如：Gly-Gly、Gly-Gly-Gly、Ala-Ala、Ala-Ala-Ala、Lys-Lys、Lys-Lys-Lys、Ser-Ser、Ser-Ser-Ser、Gly-Ala-Gly-Ala(SEQ ID NO:83)、Ala-Gly-Ala-Gly(SEQ ID NO:84)或Lys-Gly-Lys-Gly(SEQ ID NO:85))。在某些实施例中，α-突触核蛋白(多)肽可使用C端半胱氨酸连接至适合的载剂，以在(多)肽与载剂之间提供接头。在某些实施例中，α-突触核蛋白(多)肽可使用N端半胱氨酸连接至适合的载剂，以在(多)肽与载剂之间提供接头。

适合的载剂包括(但不限于)血清白蛋白、钥孔血蓝蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵白蛋白、破伤风类毒素或来自其他病原性细菌之类毒素，诸如白喉类毒素(例如CRM197)、大肠杆菌(E.coli)、霍乱或幽门螺旋杆菌(H.pylori)，或经灭毒之毒素衍生物。T细胞表位亦为适合的载剂分子。一些结合物可通过使本发明的肽免疫原连接至免疫刺激性聚合物分子(例如三棕榈酰基-S-甘油半胱氨酸(Pam3Cys)、甘露聚糖(甘露糖聚合物)或葡聚糖(β1-2聚合物))、细胞因子(例如IL-1、IL-1α肽及β肽、IL-2、γ-INF、IL-10、GM-CSF)及趋化因子(例如MIP1-α及MIP1-β以及RANTES)来形成。其他载剂包括类病毒颗粒。在一些组合物中，免疫原性肽亦可通过化学交联来连接至载剂。用于将免疫原连接至载剂之技术包括使用3-(2-吡啶基硫基)丙酸N-丁二酰亚胺酯(SPDP)及4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸丁二酰亚胺酯(SMCC)形成二硫键(若肽不具有巯基，则此可通过添加半胱氨酸残基来提供)。此等试剂产生其自身与一个蛋白上的肽半胱氨酸残基之间的二硫键，且经由赖氨酸上之ε-氨基或其他氨基酸中之其他游离氨基产生酰胺键。在一些实施例中，化学交联可包含使用SBAP(3-(溴乙酰氨基)丙酸丁二酰亚胺酯)，其为用于经由N-羟基丁二酰亚胺(NHS)酯及溴乙酰基反应性基团进行之胺-巯基结合的短(6.2埃)交联剂。各种此类二硫化物/酰胺形成剂描述于Jansen等人,“Immunotoxins:Hybrid Molecules Combining HighSpecificity and Potent Cytotoxicity”Immunological Reviews 62:185-216(1982年2月)中。其他双功能偶联剂形成硫醚而非二硫键。许多此等硫醚形成剂是可商购的，且包括6-顺丁烯二酰亚胺基己酸、2-溴乙酸及2-碘乙酸、4-(N-顺丁烯二酰亚胺基-甲基)环己烷-1-甲酸之反应性酯。羧基可通过将其与丁二酰亚胺或1-羟基-2-硝基-4-磺酸、钠盐合并来活化。类病毒颗粒(VLP)，亦称为假病毒颗粒或病毒衍生之颗粒，表示由能够在体内自行组装成具有所定义之球面对称性之VLP的病毒衣壳和/或包膜蛋白之多个拷贝构成的亚基结构(Powilleit等人,(2007)PLoS ONE 2(5):e415)。或者，肽免疫原可连接至至少一个能够结合MHC II类分子之大部分的人工T细胞表位，诸如泛DR表位(“PADRE”)。泛DR结合肽(PADRE)描述于US 5,736,142、WO 95/07707及Alexander等人,Immunity,1:751-761(1994)中。

活性免疫原可以多聚形式呈现，其中免疫原之多个拷贝(肽或多肽)以单一共价分子形式在载剂上呈现。在一些实施例中，载剂包括各种形式之α-突触核蛋白肽。举例而言，免疫原之α-突触核蛋白肽可包括具有不同次序之不同α-突触核蛋白抗原的多肽，或可在存在或不存在肽内接头和/或连接至载剂之接头的情况下呈现。

在一些组合物中，免疫原性肽亦可表达为与载剂之融合蛋白。在某些组合物中，免疫原性肽可在氨基端、羧基端或在内部连接至载剂。在一些组合物中，载剂为CRM197。在一些组合物中，载剂为白喉类毒素。

核酸

本发明亦提供编码如本文中所揭示之α-突触核蛋白肽中之任一者的核酸。如本文中所揭示之核酸免疫疗法组合物包含编码一种或多种如本文中所揭示之α-突触核蛋白肽的核酸序列。举例而言，α-突触核蛋白肽包括长度为3至10个氨基酸残基且来自SEQ ID NO:01之残基81至140的序列。因此，编码本发明之SEQ ID NO:2-81中之任一者的核酸提供免疫原及本发明的药物组合物之组分。同样地，编码α-突触核蛋白序列中之任一者的一种或多种核酸可包括N端或C端二肽之密码子。肽序列可由同一或不同的核酸序列编码，该等核酸序列亦可编码如本文中所描述之连接至载剂之接头及N端或C端半胱氨酸。另外，当单个核酸序列编码超过一种α-突触核蛋白肽时，该序列亦可编码如本文中所描述的肽内接头或可裂解接头。

本文中所描述之核酸组合物(药物组合物)可用于治疗或实现防治和/或预防α-突触核蛋白病的方法中。在某些实施例中，如本文中所揭示之核酸免疫疗法组合物提供用于治疗或实现防治受试者之突触核蛋白病的组合物。在一些实施例中，如本文中所揭示之核酸免疫疗法组合物提供用于在受试者中阻断由神经元摄取α-突触核蛋白、抑制α-突触核蛋白种子之细胞-细胞间传输和/或抑制或减少α-突触核蛋白之聚集的组合物。在一些实施例中，核酸免疫疗法组合物提供用于减少受试者和/或受试者之组织中之α-突触核蛋白。在另一实施例中，如本文中所揭示之核酸免疫疗法组合物提供用于减少受试者之脑部中之α-突触核蛋白的组合物。在一些实施例中，由免疫疗法组合物减少之α-突触核蛋白为α-突触核蛋白之病理形式(例如，寡聚或纤维状α-突触核蛋白堆积物或α-突触核蛋白寡聚物之前原纤维中间物)。在其他实施例中，由免疫疗法组合物减少神经变性疾病和/或β-淀粉样蛋白沉积症之病理学指示物。

诸如编码免疫原且用作疫苗之DNA之核酸可称为“DNA免疫原”或“DNA疫苗”，因为经编码之多肽在施用该DNA之后在体内表达。DNA疫苗意欲通过以下方式在受试者中诱导针对其编码之感兴趣的蛋白的抗体：将编码感兴趣的蛋白之DNA整合至载体(质体或病毒)中；向受试者施用载体；及在已施用载体之受试者中表达感兴趣的蛋白以刺激受试者之免疫系统。DNA疫苗在施用之后长时间留存于受试者之体内，且继续缓慢产生经编码之蛋白。因此，可避免过度免疫应答。DNA疫苗亦可使用基因工程改造技术来修饰。任选，此类核酸进一步编码信号肽且可与连接至肽之信号肽一起表达。核酸之编码序列可与调节序列可操作地连接以确保编码序列之表达，诸如启动子、增强子、核糖体结合位点、转录终止信号及其类似物。编码α-突触核蛋白之核酸可以经分离之形式存在或可克隆至一个或多个载体中。核酸可通过例如固态合成或重叠寡核苷酸之PCR来合成。在存在及不存在接头和/或可裂解接头之情况下，及在存在或不存在基于蛋白之载剂的情况下，可将编码α-突触核蛋白肽或α-突触核蛋白多肽的核酸接合为一个相邻核酸，例如在表达载体内。

DNA比RNA更稳定，但涉及一些诸如诱导抗DNA抗体之潜在安全风险，因此在一些实施例中，核酸可为RNA。编码免疫原且用作疫苗之RNA核酸可称为“RNA免疫原”或“RNA疫苗”或“mRNA疫苗”，因为经编码之多肽在施用RNA之后在体内表达。核糖核酸(RNA)疫苗可安全地引导受试者之细胞机制产生一种或多种感兴趣的(多)肽。在一些实施例中，RNA疫苗可为非复制mRNA(信使RNA)或病毒衍生之自扩增RNA。基于mRNA之疫苗编码感兴趣的抗原且含有5’非翻译区及3’非翻译区(UTR)，而自扩增RNA不仅编码抗原，且亦编码实现细胞内RNA扩增及大量蛋白表达之病毒复制机制。经体外转录之mRNA可使用T7、T3或Sp6噬菌体RNA聚合酶自线形DNA模板产生。所得产物可含有编码如本文所揭示之感兴趣的肽的开放阅读框架、侧接的5’-UTR及3’-UTR序列、5’帽及poly(A)尾部。在一些实施例中，RNA疫苗可包含反式扩增RNA(例如，参见Beissert等人,Molecular Therapy 2020年1月28日(1):119-128)。在某些实施例中，RNA疫苗编码如本文中所揭示之α-突触核蛋白(多)肽，且能够表达α-突触核蛋白肽，尤其在转移至诸如不成熟的抗原呈递细胞之细胞中的情况下。RNA亦可含有编码诸如免疫刺激元件之其他多肽序列的序列。在一些实施例中，RNA疫苗之RNA可为经修饰之RNA。在RNA之情况下，术语“经修饰”可包括RNA之任何非天然存在于RNA中之修饰。举例而言，经修饰之RNA可指具有5’帽之RNA；然而，RNA可包含其他修饰。5’帽可经修饰以具有在附接至RNA时使其稳定的能力。在某些实施例中，另一修饰可为天然存在之poly(A)尾部之延伸或截短或5’非翻译区(UTR)或3’非翻译区之变化。在一些实施例中，RNA疫苗或例如mRNA疫苗以有效量配制以在受试者中产生抗原特异性免疫应答。举例而言，向受试者施用RNA疫苗配制剂以刺激受试者之体液和/或细胞免疫系统对抗α-突触核蛋白抗原，且因此可进一步包含一种或多种佐剂、稀释剂、载剂和/或赋形剂，且以任何适合的途径施用于受试者以引发针对α-突触核蛋白(多)肽抗原之保护性和/或治疗性免疫应答。

揭示分子生物学之通用方法的基础文献，其中所有通过引用并入，包括：Sambrook,J等人,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第2版,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；Ausubel,F M等人,Current Protocols inMolecular Biology,第2卷,Wiley-Interscience,New York,(当前版本)；Kriegler,GeneTransfer and Expression:ALaboratory Manual(1990)；Glover,D M编,DNACloning:APractical Approach,第I卷及第II卷,IRL Press,1985；Albers,B.等人,MolecularBiology of the Cell,第2版,Garland Publishing,Inc.,New York,N.Y.(1989)；Watson,J D等人,Recombinant DNA,第2版,Scientific American Books,New York,1992；及Old,RW等人,Principles of Gene Manipulation:An Introduction to Genetic Engineering,第2版,University of California Press,Berkeley,Calif.(1981)。

用于操作核酸之技术(诸如在序列中产生突变、亚克隆、标记探针、测序、杂交及其类似技术)充分描述于科学及专利文献中。参见例如Sambrook编,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL(第2版),第1卷至第3卷,Cold Spring Harbor Laboratory,(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Ausubel编,John Wiley&Sons,Inc.,NewYork(1997)；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY:HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES,第I部分,Tijssen编,Elsevier,N.Y.(1993)。

核酸、载体、衣壳、多肽及其类似物可通过本领域技术人员所熟知之多种通用方法中之任一者来分析及定量。此等方法包括例如分析性生化方法，诸如NMR、分光光度法、放射照像术、电泳法、毛细管电泳法、高效液相层析法(HPLC)、薄层层析法(TLC)及超扩散层析法；各种免疫方法，例如液体或凝胶沉淀素反应、免疫扩散法、免疫电泳法、放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附分析法(ELISA)、免疫荧光分析法、南方分析法(Southern analysis)、北方分析法(Northern analysis)、斑点印迹分析法、凝胶电泳法(例如SDS-PAGE)、RT-PCR、定量PCR；其他核酸或目标或信号放大方法、放射性标记、闪烁计数及亲和层析法。

药物组合物

本文中所描述的肽及免疫原中之每一者可以与药学上可接受的佐剂及药学上可接受的赋形剂一起施用的药物组合物形式呈现。与单独使用肽之情况相比，佐剂使所诱导之抗体之效价和/或所诱导之抗体之结合亲和力增加。多种佐剂可与本发明之免疫原组合使用以引发免疫应答。一些佐剂增强针对免疫原之固有应答，而不会引起影响反应之定性形式的免疫原之构形改变。佐剂可为天然化合物、天然化合物之修饰版本或衍生物，或合成化合物。

一些佐剂包括铝盐(诸如氢氧化铝及磷酸铝)、3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A(MPL^TM)(参见GB 2220211(RIBI ImmunoChem Research Inc.,Hamilton,Montana，现属于Corixa)。如本文所用，MPL是指MPL之天然及合成版本。合成版本之实例包括及/>(Avanti Polar Lipids，Alabaster，Alabama)。

QS-21为自在南美洲发现之莫利纳皂皮树(Quillaja saponaria Molina tree)之树皮中分离的三萜糖苷或皂素(参见Kensil等人,Vaccine Design:The Subunit andAdjuvant Approach(Powell及Newman编,Plenum Press,NY,1995))。QS-21产品包括(Antigenics,Inc.，New York，NY；现为Agenus,Inc.Lexington，MA)及QS-21疫苗佐剂(Desert King，San Diego，CA)。已于US5,057,540及US 8,034,348中揭示、表征及评估QS-21，其揭示内容以引用之方式并入本文中。另外，已在多种临床试验中以多种剂量评估QS-21。参见NCT00960531(clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT00960531)，Hüll等人,Curr Alzheimer Res.2017年7月；14(7):696-708(评估50mcg QS-21与不同剂量之疫苗ACC-001)；Gilman等人,“Clinical effects of Abeta immunization(AN1792)inpatients with AD in an interrupted trial”Neurology.2005年5月10日；64(9):1553-62；Wald等人,“Safety and immunogenicity of long HSV-2peptides complexed withrhHsc70 in HSV-2seropositive persons Vaccine”2011；29(47):8520-8529；及Cunningham等人,“Efficacy of the Herpes Zoster Subunit Vaccine in Adults70Years of Age or Older”.NEJM.2016年9月15日；375(11):1019-32。QS-21用于FDA批准之疫苗，包括SHINGRIX。SHINGRIX含有50mcg QS-21。在某些实施例中，QS-21之量为约10μg至约500μg。

TQL1055为QS-21之类似物(Adjuvance Technologies，Lincoln，NE)。与QS-21相比，半合成TQL1055之特征在于具有高纯度、提高之稳定性、降低之局部耐受性、降低之全身耐受性。已于US20180327436 A1、WO2018191598A1、WO2018200656 A1及WO2019079160 A1中揭示、表征及评估TQL1055，其揭示内容以引用之方式并入本文中。US20180327436 A1教示，与20μg QS-21相比，多2.5倍之TQ1055更优异，但超过50μg之TQ1055未显示改良。然而，与QS-21不同，随着TQL1055剂量增加，不会使体重减轻程度或RBC之溶血增加。WO2018200656A1教示，在最佳量之TQ1055下，可降低抗原量且达成优良的效价。在某些实施例中，TQL1055之量为约10μg至约500μg。

其他佐剂为水包油乳液(诸如角鲨烯或花生油)，任选与免疫刺激剂组合，该等免疫刺激剂诸如单磷酰基脂质A(参见Stoute等人,N.Engl.J.Med.336,86-91(1997))、普洛尼克聚合物(pluronic polymer)及灭毒分枝杆菌(killed mycobacteria)。Ribi佐剂为水包油乳液。Ribi含有用含Tween 80之生理盐水乳化之可代谢油(角鲨烯)。Ribi亦含有改进之分支杆菌产物，其充当免疫刺激剂及细菌单磷酰基脂质A。其他佐剂可为CpG寡核苷酸(参见WO 98/40100)、细胞因子(例如IL-1、IL-1α肽及β肽、IL-2、γ-INF、IL-10、GM-CSF)、趋化因子(例如MIP1-α及MIP1-β以及RANTES)、皂素、RNA和/或TLR激动剂(例如TLR4激动剂，诸如MPL及合成MPL分子)、氨基烷基氨基葡糖苷磷酸及其他TLR激动剂。佐剂可作为治疗组合物之组分与活性剂一起施用或可在施用治疗剂之前、同时或之后单独施用。

在本发明之各种实施例中，佐剂为QS-21(Stimulon^TM)。在一些组合物中，佐剂为MPL。在某些实施例中，MPL之量为约10μg至约500μg。在一些组合物中，佐剂为TQL1055。在某些实施例中，TQL1055之量为约10μg至约500μg。在一些组合物中，佐剂为QS21。在某些实施例中，QS21之量为约10μg至约500μg。在一些组合物中，佐剂为MPL与QS-21之组合。在一些组合物中，佐剂为MPL与TQL1055之组合。在一些组合物中，佐剂可在脂质体配制剂中。

另外，本发明之一些实施例可包含多重抗原呈递系统(MAP)。已研发出多重抗原呈递肽疫苗系统，以避免与常规疫苗(即，活灭毒、死毒或灭活病原体)、载剂蛋白及细胞毒性佐剂相关之不良作用。已使用两种主要方法来研发多重抗原呈递肽疫苗系统：(1)添加功能组分，例如T细胞表位、细胞穿透肽及亲脂性部分；及(2)使用具有既定尺寸之纳米材料，例如自组装肽、非肽树突状聚合物及金纳米粒子作为抗原呈递平台之合成方法。使用多重抗原肽(MAP)系统可改良次单位肽疫苗之有时存在之不良免疫原性。在MAP系统中，抗原肽之多个拷贝同时结合于非免疫原性基于Lys之树突状架构的α-氨基及ε-氨基，帮助赋予稳定性以避免降解，由此增强免疫细胞之分子识别，且与单独的小型抗原肽相比诱导更强的免疫应答。在一些组合物中，MAP包含基于Lys之树突状架构、辅助型T细胞表位、免疫刺激性亲脂性部分、细胞穿透肽、自由基诱导之聚合、自组装纳米粒子(作为抗原呈递平台)及金纳米粒子中之一者或多者。

用于胃肠外施用的药物组合物较佳为无菌且实质上等张的，且在GMP条件下制造。药物组合物可以单位剂型(即，用于单次施用之剂量)提供。药物组合物可使用一种或多种生理学上可接受之载剂、稀释剂、赋形剂或助剂来配制。配制剂视所选择之施用途径而定。对于注射，本发明的肽可在水性溶液中，较佳在生理学上相容之缓冲液中配制，诸如汉克氏溶液(Hank’s solution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)或生理盐水或乙酸盐缓冲液(以减少注射部位之不适)。溶液可含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，肽组合物可呈冷冻干燥形式，以用于在使用之前用适合的媒剂(例如无菌无热原水)复原。

如本文中所描述的肽及多肽(及任选地与肽融合之载剂)亦可以编码肽且在受试者中原位表达之核酸形式施用。编码免疫原之核酸区段通常连接至调节元件，诸如实现DNA区段在受试者中之预期标靶细胞中之表达的启动子及增强子。对于血细胞中之表达，如诱导免疫应答所需，来自例如轻链或重链免疫球蛋白基因之启动子及增强子元件或CMV主要中间物早期启动子及增强子适用于引导表达。通常将所连接之调节元件及编码序列克隆至载体中。

DNA及RNA可以裸形式(即，不存在胶体或囊封材料)递送。或者，可使用多种病毒载体系统，包括反转录病毒系统(参见例如Boris-Lawrie及Teumin,Cur.Opin.Genet.Develop.3(1):102-109(1993))；腺病毒载体(参见例如Bett等人,J.Virol.67(10)；5911-21(1993))；腺相关病毒载体(参见例如Zhou等人,J.Exp.Med.179(6):1867-75(1994))；来自痘科之病毒载体，包括牛痘病毒及禽痘病毒；来自α病毒属之病毒载体，诸如来源于辛得比斯(Sindbis)及塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)之病毒载体(参见例如Dubensky等人,J.Virol.70(1):508-519(1996))；委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(参见US 5,643,576)及棒状病毒，诸如水泡性口炎病毒(参见WO 96/34625)及乳突状瘤病毒(WO 94/12629；Ohe等人,Human GeneTherapy 6(3):325-333(1995)；及Xiao及Brandsma,Nucleic Acids.Res.24(13):2620-2622(1996))。

编码免疫原之DNA及RNA或含有其之载体可封装于脂质体、纳米粒子或脂蛋白复合物中。其他适合的聚合物包括例如鱼精蛋白脂质体、多醣粒子、阳离子纳米乳液、阳离子聚合物、阳离子聚合物脂质体、阳离子脂质纳米粒子、阳离子脂质、胆固醇纳米粒子、阳离子脂质-胆固醇、PEG纳米粒子或树突状聚合物纳米粒子。其他适合的脂质及相关类似物由US 5,208,036、US 5,264,618、US 5,279,833及US 5,283,185描述，其各自以全文引用之方式并入本文中。编码免疫原之载体及DNA亦可吸附至微粒载剂或与微粒载剂结合，微粒载剂之实例包括聚甲基丙烯酸甲酯聚合物及聚乳酸及聚(乳酸交酯-共-乙交酯)(参见例如McGee等人,J.Micro Encap.1997年三月-四月；14(2):197-210)。

药学上可接受的载剂组合物亦可包括添加剂，包括(但不限于)水、药学上可接受的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性聚葡萄糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶(xanthan gum)、阿拉伯胶(gum arabic)、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘油、丙三醇、丙二醇、石蜡脂、石蜡硬酯醇、硬脂酸、人类血清白蛋白、甘露醇、山梨醇、乳糖及可接受作为药物添加剂之界面活性剂。

可接受治疗之受试者

已在若干疾病中发现非正常聚集之细胞内α-突触核蛋白之存在，该等疾病包括帕金森病(PD)、伴有痴呆症之帕金森病(PDD)、路易氏体痴呆症(DLB)、多系统萎缩症(MSA；包括MSA-帕金森型(MSA-P)变异形式及MSA-小脑性(MSA-C)变异形式)、阿尔茨海默病(AD；包括AD之路易氏体变异形式及其他包含α-突触核蛋白相关病理之变异形式)及神经变性伴脑铁沉积(NBIA)。

本发明之组合物及方法可用于治疗或防治此等疾病及其他突触核蛋白病中之任一者。由于神经性疾病与α-突触核蛋白之间的广泛相关性，因此本发明之组合物及方法可用于治疗或防治与未患有神经性疾病之个体之平均值相比，显示升高之α-突触核蛋白水平(例如在CSF中)的任何受试者。本发明之组合物及方法亦可用于治疗或防治个体中之神经性疾病，该等个体具有α-突触核蛋白中之与神经性疾病相关之突变。该等方法尤其适用于治疗或预防α-突触核蛋白病。

可接受治疗之受试者包括具有罹患疾病之风险但未显示症状之个体，以及当前显示症状之患者，包括先前尚未接受针对疾病之治疗之未经治疗的受试者。具有罹患疾病之风险之受试者包括年老群体中之受试者，患有α-突触核蛋白病之无症状受试者及具有已知之遗传疾病风险之受试者。此类个体包括具有已经历此疾病之亲属之个体，及通过基因或生化标记物之分析测定具有此风险之个体。风险之基因标记物包括α-突触核蛋白中之突变，以及与神经性疾病相关之其他基因中的突变。举例而言，杂合及甚至更多呈纯合形式之ApoE4等位基因与阿尔茨海默病(AD)之风险相关。阿尔茨海默病之风险之其他标记物包括APP基因中之突变，尤其分别在称为哈迪型(Hardy)及瑞典型(Swedish)突变之位置717及位置670及位置671处之突变，在早老素基因、PS1及PS2中之突变，AD之家族病史、高胆固醇症或动脉粥样硬化。当前患有阿尔茨海默病、帕金森病及涉及α-突触核蛋白之其他神经性病症之个体可通过PET成像、由一些(例如阿尔茨海默病)来自特征性痴呆症以及存在上文所描述之风险因子来识别。此外，存在许多可用于鉴别患有例如帕金森病或阿尔茨海默病之个体的诊断测试。对于阿尔茨海默病，此等测试包括CSF或血液α-突触核蛋白或磷酸化α-突触核蛋白及Aβ42水平之测量。升高之α-突触核蛋白或磷酸化α-突触核蛋白及降低之Aβ42水平表示AD之存在。与帕金森病相关之突变包括例如Ala30Pro或Ala53Thr，或其他基因之突变，诸如富含亮氨酸之重复激酶(LRRK2或PARK8)。亦可通过DSM IV TR之标准来诊断受试者是否患有上文所提及之任何神经性疾病。

在无症状受试者中，可在任何年龄开始治疗(例如，10岁、20岁、30岁或更大)。然而，通常直至受试者达到20、30、40、50、60、70、80或90岁才需要开始治疗。治疗通常在一个时段内需要多个剂量。可通过随时间推移而分析抗体水平来监测治疗。若反应下降，则指示施用加强剂量。对于潜在的唐氏综合征患者，可通过向母亲施用治疗剂而在产前开始或在出生后不久开始治疗。

治疗方法及用途

本发明提供在患有神经变性疾病或具有发展神经变性疾病之风险之受试者中抑制或减少α-突触核蛋白之聚集的方法，该等疾病例如帕金森病、阿尔茨海默病、路易氏体痴呆症(DLB)及类似疾病。方法包括向受试者施用如本文中所揭示之组合物。治疗有效量为在有效时段内提供时可实现所需免疫学或临床效果的剂量。可调节剂量方案以提供最佳治疗反应。举例而言，若干分次剂量可以所设定之间隔(例如，一周、一个月)施用，或可视治疗情况所需而按比例减少剂量。

在防治性应用中，可以有效降低疾病之至少一种病征或症状之风险、减轻其严重性或推迟其发作的方案(施用之剂量、频率及途径)向易患疾病或具有罹患疾病之风险的受试者施用本文中所描述之组合物，该等疾病例如帕金森病、路易氏体痴呆症(DLB)、阿尔茨海默病及类似疾病。特定言之，方案可在脑部中有效抑制或推迟α-突触核蛋白或磷酸化α-突触核蛋白之聚集(及由其形成之成对丝状物)，和/或抑制或推迟其毒性作用，和/或抑制或推迟行为缺陷之发展。在治疗性应用中，以可有效改善疾病之至少一种病征或症状或至少抑制其进一步恶化的方案(施用之剂量、频率及途径)向疑似患有疾病之受试者或已患有疾病之患者施用本文中所描述之组合物，该等疾病例如帕金森病、路易氏体痴呆症(DLB)阿尔茨海默病及类似疾病。特定言之，方案较佳有效减少α-突触核蛋白、磷酸化α-突触核蛋白或由其形成之成对丝状物、相关毒性和/或行为缺陷之水平或至少抑制其进一步增加。

若经治疗之个体所达成的结果比未通过本发明的方法治疗之可比较的受试者之对照群体中的平均结果更有利，或若在对照性临床试验(例如，II期、II/III期或III期试验)中，在p<0.05或0.01或甚至0.001水平下在经治疗之受试者中显示比对照性受试者更有利的结果，则方案可视为防治性或预防性有效。

有效剂量视许多不同因素而变化，诸如施用方式、目标部位、患者之生理学状态、患者是否为ApoE携带者、患者是否为人类或动物、所施用之其他药物及治疗是否为防治性或治疗性。

在一些实施例中，有效量为25μg至1000μg或50μg至1000μg之总剂量。在一些实施例中，有效量为100μg之总剂量。在一些实施例中，有效量为总计两次向受试者施用25μg之剂量。在一些实施例中，有效量为总计两次向受试者施用100μg之剂量。在一些实施例中，有效量为总计两次向受试者施用400μg之剂量。在一些实施例中，有效量为总计两次向受试者施用500μg之剂量。在一些实施例中，RNA(例如mRNA)疫苗通过皮内、肌肉内注射或通过鼻内施用来施用受试者。

在一些实施例中，用于主动免疫疗法之药剂的量在每名患者1至1,000微克(μg)，或0.1至500μg，或10至500μg，或50至250μg之范围内且对于人类施用，可为每次注射1至100或1至10μg。注射时机可在一天一次至一周一次、一个月一次、一年一次、十年一次之间显著变化。典型方案由免疫接种及随后按时间间隔(诸如6周间隔或两个月)进行之加强注射组成。另一方案由免疫接种及在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月后进行一次或多次加强注射组成。另一方案需要每两个月注射一次保持终身。或者，可如免疫应答之监测所指示进行不定期的加强注射。施用频率可为一次或多次，只要副作用在临床上可接受之范围内即可。

在一些实施例中，如本文中所揭示之组合物或方法包含向受试者施用核酸疫苗，该核酸疫苗包含一个或多个具有编码第一肽及第二肽之开放阅读框架的DNA或RNA聚核苷酸，其中向受试者施用介于10μg/kg与400μg/kg之间的剂量之核酸疫苗。在一些实施例中，RNA聚核苷酸之剂量为每剂量1至5μg、5至10μg、10至15μg、15至20μg、10至25μg、20至25μg、20至50μg、30至50μg、40至50μg、40至60μg、60至80μg、60至100μg、50至100μg、80至120μg、40至120μg、40至150μg、50至150μg、50至200μg、80至200μg、100至200μg、120至250μg、150至250μg、180至280μg、200至300μg、50至300μg、80至300μg、100至300μg、40至300μg、50至350μg、100至350μg、200至350μg、300至350μg、320至400μg、40至380μg、40至100μg、100至400μg、200至400μg或300至400μg。在一些实施例中，通过皮内或肌肉内注射向受试者施用核酸。在一些实施例中，在第零天向受试者施用核酸。在一些实施例中，在第七天，或第十四天，或第二十一天向受试者施用第二剂量之核酸。

本文中所描述之组合物较佳经由外周途径施用(即，使所施用之组合物引起稳定免疫应答和/或所诱导之抗体群穿过血脑障壁以到达脑部、脊髓或眼睛中之预期部位的途径)。对于外周疾病，所诱导之抗体离开血管系统以到达预期外周器官。施用途径包括经口、皮下、鼻内、皮内或肌肉内。主动免疫接种之一些途径为皮下及肌肉内。肌肉内施用及皮下施用可在单一部位或多个部位进行。肌肉内注射最通常在手臂或腿部肌肉中进行。在一些方法中，将药剂直接注射至其中已积累有沉积物之特定组织中。

可调节所施用之剂量之数量以产生更稳定的免疫应答(例如，更高效价)。对于急性病症或慢性病症之急性恶化而言，1个至10个剂量通常为足够的。有时候，任选呈分开形式的单一弹丸注射剂量对于急性病症或慢性病症之急性恶化而言为足够的。对于慢性病症，如本文中所揭示之疫苗/免疫疗法可以规则间隔施用，例如每周一次、每两周一次、每月一次、每季一次、每六个月一次，持续至少1、5或10年，或持续患者终生。

经DNA或RNA编码之免疫原的有效量可在每公斤受体体重约1奈克与约1公克之间，或大致在约0.1μg/kg与约10mg/kg之间，或大致在约1μg/kg与约1mg/kg之间。适合于内部施用之剂型较佳含有(对于后一剂量范围)每单元约0.1μg至100μg之活性成分。以组合物之总重量计，活性成分可在0.5至95重量％之范围内。或者，负载有抗原之树突状细胞的有效剂量在约10⁴个与10⁸个细胞之间。熟习免疫疗法技术者应能够在不进行不当实验的情况下调节此等剂量。

可以便利的方式施用核酸组合物，例如通过便利且有效之途径注射。途径可包括(但不限于)皮内“基因枪”递送或肌肉内注射。通过皮下、静脉内或肌肉内途径施用经修饰之树突状细胞。其他可能的途径包括经口施用、鞘内腔、吸入、经皮施用或直肠施用。

视施用途径而定，可使组合物包覆于材料中以保护化合物免受酶、酸及其他可能使化合物失活之天然条件的作用。因此，可能需要用材料包覆组合物或将组合物与材料共同施用以防止组合物失活。举例而言，核酸酶或蛋白酶(例如，胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸酯及抑肽酶)之酶抑制剂或在诸如脂质体(包括水包油包水乳液)以及常规脂质体(Strejan等人,J.Neuroimmunol7(1):27-41,1984)之适当载剂中。

本文中所揭示之免疫治疗组合物亦可与其他针对与α-突触核蛋白之积累和/或聚集相关之疾病的治疗组合使用，该等治疗例如抗α-突触核蛋白抗体，诸如特异性结合于本文中所揭示之α-突触核蛋白表位中之任一者的抗体、ABBV-8E12、高苏拉内单抗(gosuranemab)、泽格特奈单抗(zagotenemab)、RG-6100、BIIB076，或WO2014/165271、US10,501,531、WO2017/191559、WO2017/191560、WO2017/191561、US 20190330314、US20190330316及WO2018/204546中所揭示之任何抗体。在一些组合疗法方法中，患者在本文中所揭示之主动免疫疗法方法之前接受被动免疫疗法。在其他方法中，患者在相同的治疗时段期间接受被动及主动免疫疗法。或者，患者可在被动免疫疗法之前接受主动免疫疗法。组合亦可包括小型分子疗法及非免疫原性疗法，诸如(加兰他敏(galantamine))、/>(雷司替明(rivastigmine))及/>(多奈派齐(donepezil))以及改良脑部中之神经细胞功能之其他组合物。

本发明之组合物可用于制造供本文中所描述之治疗方案用之药剂。

治疗方案

如本文中所揭示之治疗方法的所需结果根据疾病及患者概况而变化，且可由本领域技术人员测定。所需结果包括患者健康状况之改良。通常，所需结果包括可测量之指数，诸如病理性α突触核蛋白聚集物之减少或清除、α突触核蛋白聚集之减少或抑制及对病理性和/或聚集式之α突触核蛋白聚集物之免疫应答增加。所需结果亦包括改善α-突触核蛋白病性疾病特异性症状。如本文所用，诸如“改良”、“增加”或“减少”之相对术语指示相对于对照物(诸如在开始本文中所描述之治疗之前在同一个体中之测量值，或在对照性个体或组中之测量值)之值。对照性个体为罹患与经治疗之个体相同的α突触核蛋白病性疾病之个体，其年龄与经治疗之个体大致相同(以保证经治疗之个体及对照性个体之疾病阶段类似)，但尚未接受使用所揭示之免疫疗法/疫苗配制剂进行之治疗。或者，对照性个体为健康个体，其年龄与经治疗之个体大致相同。治疗反应之变化或改良通常为统计显著的，且在由小于或等于0.1、小于0.05、小于0.01、小于0.005或小于0.001之p值描述时可视为显著的。

用于治疗受试者之如本文所揭示之组合物的有效剂量视许多不同因素而变化，包括施用方式、目标部位、患者之生理状态、患者是否为人类或动物、所施用之其他药物(若存在)及治疗是否为防治性或治疗性。可以滴定方式分析治疗剂量以使安全性及功效优化。免疫原之量亦可视是否亦施用佐剂而定，其中在不存在佐剂之情况下需要较高剂量。用于施用之免疫原之量有时在每名患者1至500μg之范围内且对于人类施用，更通常在每次注射5至500μg范围内。偶尔，使用每剂量1至2mg之较高剂量。通常，每个体类剂量使用约10、20、50或100μg。剂量之时机可在一日一次至一年一次、十年一次之间显著变化。在任何提供免疫原之剂量的既定日，若亦施用佐剂，则剂量大于1微克/患者且通常大于10微克/患者，且在不存在佐剂之情况下大于10微克/患者且通常大于100微克/患者。典型方案由免疫接种及随后以6周间隔施用之加强剂量组成。另一方案由免疫接种及在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月后施用加强剂量组成。另一方案需要每两个月施用剂量，保持终身。或者，可如由免疫应答监测所指示不定期地施用加强剂量。

当与例如用于阿尔茨海默病或伴有痴呆症之帕金森病(PDD)之第二治疗组合施用时，诸如(加兰他敏)、/>(雷司替明)及/>(多奈派齐)，可根据产品标记或视需要根据用本发明之组合物之治疗来施用第二治疗。

试剂盒

本发明亦提供试剂盒(例如容器)，其包含本文中所揭示之组合物及相关材料，诸如使用说明书(例如药品说明书)。使用说明书可含有例如组合物及任选地一种或多种其他药剂之施用之说明书。肽和/或核酸组合物之容器可为单位剂量、散装封装(例如多剂量封装)或次单位剂量。

药品说明书是指市售治疗产品封装中通常所包括之说明，其含有关于适应症、用法、剂量、施用、与此类治疗产品之使用有关之禁忌和/或警告之信息。试剂盒亦可包括第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，诸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲生理盐水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其亦可包括就商业及使用者观点而言所需之其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针及注射器。

用途

本文中所描述的肽、多肽、免疫原及药物组合物中之每一者可用于治疗一种或多种如本文中所描述之疾病。另外，本文中所描述的肽、多肽、免疫原及药物组合物中之每一者可用于用以治疗一种或多种如本文中所描述之疾病的方法中。本文中所描述的肽、多肽、免疫原及药物组合物中之每一者可用于用以制造药剂的方法中，该药剂是治疗或用于治疗一种或多种如本文中所描述之疾病。

以下仅出于例示目的而提供，且不意欲限制上文以广义含义描述之本发明之范畴。

本文中识别之所有美国及国际专利申请均以全文引用之方式并入本文中。

实例

实例1：动物免疫接种

对于图1及图2中所示之实验，在第0天、第14天、第42天及第70天，用100μl测试品对雌性瑞士韦伯斯特小鼠之两个部位进行皮下注射。对于图3至图8中所示之实验，在第0天及第4周以及第8周，用100μl测试品对雌性瑞士韦伯斯特小鼠之两个部位进行皮下注射。对于图9至图11中所示之实验，在第0天及第4周以及第8周，用100μl测试品对雌性B6小鼠之两个部位进行皮下注射。通过在200μl磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中合并25μg测试免疫原及25μg QS21佐剂来制备测试品，但图9至图11中所示之实验除外，其中使用2×(50μg)测试免疫原(SEQ ID NO:77)。在第21天、第49天及第77天，通过切尾对图1及图2中所示之实验中所用之小鼠进行放血且收集50μl血液，随后处理成血清。在第5周及第8周，对图3至图11中所示之实验中所用之小鼠进行放血。所测试的肽包括CPDNEAYE(SEQ ID NO:73)、DPDNEAYC(SEQID NO:74)、CGFVKKDQ(SEQ ID NO:75)、PDNEAYEGGC(SEQ ID NO:76)、DPDNEAYEGGC(SEQ IDNO:77)、PDNEAYERRDPDNEAYGGC(SEQ ID NO:78)、DPDNEAYRRPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:79)、PDNEAYERRTGFVKKDGGC(SEQ ID NO:80)或TGFVKKDRRDPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:81)。免疫原含有一个α-突触核蛋白(多)肽、C端接头及C端半胱氨酸(即，-Gly-Gly-Cys-；在SEQ ID NO:76至SEQ ID NO:81(而非SEQ ID NO:73至SEQ ID NO:75)中由C端“-GGC”特定指示)，且经由C端半胱氨酸与具有顺丁烯二酰亚胺键之CRM-197偶联。

在第0天、第21天、第49天及第77天，向天竺鼠肌肉内注射50μg测试免疫原、含25μgQS21之200μl Addavax。在免疫接种后7天进行放血。所测试的肽包括CPDNEAYE(SEQ ID NO:73)及DPDNEAYC(SEQ ID NO:74)。免疫原含有一个α-突触核蛋白肽、C端接头及C端半胱氨酸(即，-Gly-Gly-Cys-)且经由C端半胱氨酸与具有顺丁烯二酰亚胺键之CRM-197偶联。

在研究开始时，雌性天竺鼠为至少5周龄，其体重为约350-500g。根据美国农业部(U.S.Department of Agriculture’s)(USDA)及国际实验室动物护理评估及认证(Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)(AAALAC)的指南，在经认可之设施中进行适用于动物饲养及护理之动物圈养及研究程序。

免疫原浓度为0.5mg/ml。在每次施用测试免疫原之前，对各后肢上之约3cm²区域进行刮毛且用乙醇清洗以观测注射部位。各动物接受之测试免疫原剂量为200微升(0.25微克/微升)，分为两个单独的部位，每个部位每次注射100微升(即，动物接受含50μg免疫原之100μl PBS+含25μg QS-21之100μl Addavax)。将25G-27G针肌肉内插入后肢中达到约0.25至0.5cm之深度，且以每个部位100微升进行注射。对于每次施用，注射部位在每条后肢上之四个独立部位之间轮换且相隔至少2cm。

实例2：抗体效价之测量

在第1周、第4周、第8周及第12周经由颈静脉每次收集250-350微升的天竺鼠全血样品且在第1周、第3周、第7周及第11周通过对小鼠进行切尾每次收集50微升全血样品至血块活化剂试管中。在最终收集周结束时经由心脏穿刺将最大体积之全血收集至血块活化剂试管中。使所有血液样品在室温下凝结超过30分钟，在环境温度(约20至25℃)下以3,000RPM离心10至15分钟，且将血清上清液单独转移至干净的冷冻小瓶中。将血清上清液在-80℃(±12℃)下冷冻储存。

天竺鼠血液针对α-突触核蛋白肽之效价

在PBS中将2μg/ml之α-突触核蛋白以每孔100μl涂布于板上，且在室温下温育隔夜。用含1％ BSA之PBS阻断板1小时。对板进行抽吸且向A列中添加200μl含0.1％ BSA之PBSTween。在第1行中，以1/100稀释度添加阴性天竺鼠血清，而该列之其余部分含有1/100之测试血清。每一步骤均将板中之各列连续稀释50％，得到1/100至1/12800之稀释度范围。在室温下温育各孔2小时，接着洗涤。制备抗天竺鼠IgG HRP于含0.1％ BSA之PBS Tween中之1/5000稀释物，且随后向经洗涤之孔中添加100μl。将样品温育1小时且随后洗涤。使用Thermo-Fisher OPD锭剂以每10毫升1个锭剂来制备OPD底物。以1/10添加Thermo-fisher底物缓冲液，且向各孔中添加100μl且温育15分钟。添加50μl 2N H₂SO₄以停止反应，且用Molecular Devices Spectromax在490nM下读取板。效价定义为提供50％最大OD之稀释度，且若其介于各稀释度之间，则进行外推。

小鼠针对α-突触核蛋白之效价

在PBS中将2μg/ml之重组型α-突触核蛋白以每孔100μl涂布于板上，且在室温下温育隔夜。用含1％ BSA之PBS阻断板1小时。对板进行抽吸且向A列中添加200μl含0.1％ BSA之PBS Tween。在第1行中，以1/100添加阴性小鼠血清，而该列之其余部分含有1/100之测试血清。将板中之各列连续稀释1/2，得到1/100至1/12800之稀释度。在室温下温育各孔2小时，接着洗涤。制备抗小鼠IgG HRP于含0.1％ BSA之PBS Tween中之1/5000稀释物，且随后向经洗涤之孔中添加100μl。将反应混合物温育1小时且随后洗涤。使用Thermo-Fisher OPD锭剂以每10毫升1个锭剂来制备OPD底物。以1/10稀释度添加Thermo-fisher底物缓冲液(向各孔中添加100μl)，且将混合物温育15分钟。添加50μl 2N H₂SO₄以停止反应，且用Molecular Devices Spectromax在490nM下读取板。效价定义为提供50％最大OD之稀释度，且若其介于各稀释度之间，则进行外推。

在如上文所描述之经免疫接种之天竺鼠中观测到的抗体效价显示于表1中。用含QS21之Addavax进行免疫接种。所报导之效价涉及第三次注射后之血液。此等结果呈现于图1中。

表1经α-突触核蛋白表位免疫接种之天竺鼠(GP)中之抗体效价。

在如上文中所描述之经免疫接种之小鼠中所观测到的抗体效价显示于表2、表3、表4及表5中。用QS21进行免疫接种。除非另外指出，否则所报导之效价涉及在第三次注射后之血液。表2结果呈现于图2中；表3结果呈现于图3中；表4结果呈现于图4中；及表5结果呈现于图9中。

表2经α-突触核蛋白表位免疫接种之小鼠中之抗体效价。

表3经α-突触核蛋白表位免疫接种之小鼠中之抗体效价。

/>

表4.

在经α-突触核蛋白表位免疫接种之小鼠中针对单体或可溶性聚集式α-突触核蛋白之抗体效价。第二次注射后采集血液。

/>

表5

在经α-突触核蛋白表位免疫接种之小鼠中之抗体效价包括与串联序列之两个肽相比，单体α-突触核蛋白肽(SEQ ID NO:77)之2×剂量，以补偿所具有之单α-突触核蛋白肽。

/>

实例3：用来自经如本文所揭示之疫苗免疫接种之动物的血清对帕金森病脑部组织进行染色.

将来自解剖之帕金森病供体或非疾病对照物之新鲜冷冻人类脑部组织嵌入最佳切割温度化合物(OCT化合物)中，且在低温恒温器中切割以产生10μm冷冻切片。在存在叠氮化钠之情况下，将该等组织切片在葡萄糖氧化酶及βD-葡萄糖之溶液中温育以阻断内源性过氧化酶。随后在自动化Leica Bond Rx染色机(Leica Biosystems)中，以1:1000稀释度用来自经疫苗接种之小鼠或对照性小鼠的血清进行染色。使用Bond聚合物优化侦测试剂盒(DS9800，Leica Biosystems)来侦测抗体结合，该试剂盒基于抗小鼠聚合物侦测、DAB显色及苏木精核对比染色。在盖玻片之后，用Hamamatsu NanoZoomer 2.0HT幻灯片扫描仪(Hamamatsu Corporation)及NDP.scan(软件2.5.85)对经染色之组织玻片进行数字成像。查看数字化影像且使用NDP.view(软件2.7.43.0)进行分析。

结果表明α-突触核蛋白病理基于其典型的组织病理学特征来鉴别。在与对照性小鼠血清一起温育之组织中不存在此类病理。此外，在与来自经疫苗接种之小鼠的血清一起温育之后，正常的非疾病组织不具有此类病理性染色。图5(A)显示使用以1:300稀释之来自经SEQ ID NO:78疫苗接种之小鼠的血清，对新鲜冷冻人类帕金森病脑组织与正常组织结构6(B)之突触核蛋白病理的染色情况。图6(A)显示使用以1:300稀释之来自经SEQ ID NO:79疫苗接种之小鼠的血清，对新鲜冷冻人类帕金森病脑组织与正常组织结构6(B)之突触核蛋白病理的染色情况。图7(A)显示使用以1:300稀释之来自经SEQ ID NO:81疫苗接种之小鼠的血清，对新鲜冷冻人类帕金森病脑组织与正常组织结构7(B)之突触核蛋白病理的染色情况。表6概述使用来自经指定肽疫苗接种之动物的小鼠血清进行突触核蛋白病理染色之结果。

表6小鼠血清样品之免疫组织化学染色及效价结果

用SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79及SEQ ID NO:81重复进行实验。图10(A)、图10(B)及图10(C)分别显示用SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81及SEQ ID NO:77对新鲜冷冻人类帕金森病脑组织中之突触核蛋白病理的染色情况，包括与串联序列之两个肽相比，针对单体α-突触核蛋白肽(SEQ ID NO:77)之2×给药，以补偿所具有之单α-突触核蛋白肽。所有样品均与(染色)α-突触核蛋白病理相关，其中SEQ ID NO:79及SEQ ID NO:81之多肽在此实验中染色更有效。表7概述使用来自经指定肽疫苗接种之动物的小鼠血清进行突触核蛋白病理染色之结果。

表7小鼠血清样品之免疫组织化学染色结果

/>

实例4：制备突触核蛋白

突触核蛋白之制造

使用含有开放阅读框架(ORF)之人类α-突触核蛋白(GenBank ID：BC108275.1)之细菌表达载体(pET21d)以进行表达，且通过定序确认身分。为了表达及纯化重组型α-突触核蛋白，用0.5mM IPTG诱导BL21大肠杆菌细胞中之表达，且通过音波处理或微流化床使细胞裂解。通过煮沸清除裂解物，以产生富含裂解物之热稳定α-突触核蛋白，且通过阴离子交换层析来使此裂解物溶解。将汇集之α-突触核蛋白-纯溶离份透析至PBS中以供储存。

突触核蛋白之聚集

通过向含2.6mg/ml之纯化突触核蛋白之PBS中添加2.5％(v/v)HFIP(Sigma)来诱导单体突触核蛋白之聚集。将α-突触核蛋白与HFIP一起在37℃下在设定成1000rpm之恒温混匀仪(thermomixer)中温育4天以诱导聚集。在进一步使用之前，使样品中在通风橱中蒸发出HFIP，且使用硫代黄素T(ThT)分析法检验淀粉样蛋白含量。

突触核蛋白之pHrodo标记

在室温下在黑暗中使用pHrodo红色(Invitrogen)标记聚集式及单体α-突触核蛋白样品1小时。经由对单体样品进行大量透析及经由对聚集式突触核蛋白之超速离心以及反复冲洗所得集结粒来移除游离染料。将聚集式α-突触核蛋白以初始体积再悬浮于PBS中，且以10％功率进行水浴音波处理(QSonica)，音波处理持续3分钟，每进行10秒间隔休息5秒。根据制造商之说明，针对单体与聚集式α突触核蛋白定量标记程度，且测定为2染料:1蛋白。

实例5：B103阻断分析法

评估寡克隆及多克隆血清阻断突触核蛋白与B103神经元细胞系之结合的能力。

在使用之前，将纯化之经pHrodo标记之α-突触核蛋白再悬浮于生长培养基中以达成10ug/mL之4×工作浓度，随后与IgG馏份结合。

在生长培养基中稀释IgG馏份(1,200ug/ml之4×工作浓度；每组n＝3)。将10ug/mL之经pHrodo标记之α-突触核蛋白聚集物以1:1(25微升/样品)添加至IgG馏份(25微升/样品)中。将抗体/α-突触核蛋白混合物在室温下温育30分钟。

用温热的无菌PBS洗涤B103神经母细胞瘤细胞且提起，在37℃下在5％CO₂下与Versene/ETDA一起温育5分钟。细胞在200×g下离心5分钟，且在生长培养基(50微升/样品)中再悬浮至1,000,000个细胞/毫升。在96孔V形底板中向50μl抗体/α-突触核蛋白混合物中添加50μl B103细胞。在37℃下在5％ CO₂下温育3小时之后，细胞用生长培养基洗涤三次(200×g；旋转5分钟)，在37℃下在5％ CO₂下温育10分钟，在FACS缓冲液(含1％ FBS之PBS；不含Mg或Ca)中洗涤两次，且再悬浮于100μl FACS缓冲液中，以对由B103细胞摄取之经标记之α-突触核蛋白进行流式细胞分析。

图8显示串联构建体2(SEQ ID NO:79)及4(SEQ ID NO:81)在抑制B103细胞对α-突触核蛋白之摄取方面最有效。

图11亦显示串联构建体2(SEQ ID NO:79)及4(SEQ ID NO:81)在抑制B103细胞对α-突触核蛋白之摄取方面最有效。在此实验中，单个α-突触核蛋白构建体14(SEQ ID NO:77)未明显抑制突触核蛋白结合。

实例6：流式细胞测量术分析

通过对经pHrodo标记之荧光活化α-突触核蛋白进行流式细胞测量术，来评估B103大鼠神经母细胞瘤细胞对α-突触核蛋白聚集物之摄取。以平均荧光强度(MFI；标准化至100％)之形式来测量α-突触核蛋白内化。将MFI标准化至100％，涉及减去背景细胞MFI信号(未添加pHrodo Tau)，且将最高MFI信号设定为100％(同型对照)。

尽管已在本文中描述本发明之各种特定实施例，但应理解，本发明不限于彼等明确实施例且在不偏离本发明之范畴及精神的情况下，本领域技术人员可实现各种改变或修改。

本文中所描述的肽的各实施例中，肽可包含所叙述序列、由其组成或基本上由其组成。因此，并入本发明中(参见表8)之以下序列可作为包含如本文中所揭示之α-突触核蛋白(多)肽之组合物的一部分。

表8.序列

SEQ ID NO:01

α-突触核蛋白同功异型物NACP140[智人]

NCBI参考序列：NP_000336.1

C端区：

VDPDNEAYEM(SEQ ID NO:02)，

VDPDNEAYE(SEQ ID NO:03)，

VDPDNEAY(SEQ ID NO:04)，

VDPDNEA(SEQ ID NO:05)，

VDPDNE(SEQ ID NO:06)，

VDPDN(SEQ ID NO:07)，

VDPD(SEQ ID NO:08)，

VDP(SEQ ID NO:09)，

DPDNEAYEM(SEQ ID NO:10)，

DPDNEAYE(SEQ ID NO:11)，

DPDNEAY(SEQ ID NO:12)，

DPDNEA(SEQ ID NO:13)，

DPDNE(SEQ ID NO:14)，

DPDN(SEQ ID NO:15)，

DPD(SEQ ID NO:16)，

PDNEAYEM(SEQ ID NO:17)，

PDNEAYE(SEQ ID NO:18)，

PDNEAY(SEQ ID NO:19)，

PDNEA(SEQ ID NO:20)，

PDNE(SEQ ID NO:21)，

PDN(SEQ ID NO:22)，

DNEAYEM(SEQ ID NO:23)，

DNEAYE(SEQ ID NO:24)，

DNEAY(SEQ ID NO:25)，

DNEA(SEQ ID NO:26)，

DNE(SEQ ID NO:27)，

NEAYEM(SEQ ID NO:28)，

NEAYE(SEQ ID NO:29)，

NEAY(SEQ ID NO:30)，

NEA(SEQ ID NO:31)，

EAYEM(SEQ ID NO:32)，

EAYE(SEQ ID NO:33)，

EAY(SEQ ID NO:34)，

AYEM(SEQ ID NO:35)，

AYE(SEQ ID NO:36)，

YEM(SEQ ID NO:37)，

NAC区：

ATGFVKKDQL(SEQ ID NO:38)，ATGFVKKDQ(SEQ ID NO:39)，ATGFVKKD(SEQ ID NO:40)，ATGFVKK(SEQ ID NO:41)，ATGFVK(SEQ ID NO:42)，ATGFV(SEQ ID NO:43)，ATGF(SEQID NO:44)，ATG(SEQ ID NO:45)，TGFVKKDQL(SEQ ID NO:46)，TGFVKKDQ(SEQ ID NO:47)，TGFVKKD(SEQ ID NO:48)，TGFVKK(SEQ ID NO:49)，

TGFVK(SEQ ID NO:50)，

TGFV(SEQ ID NO:51)，

TGF(SEQ ID NO:52)，

GFVKKDQL(SEQ ID NO:53)，

GFVKKDQ(SEQ ID NO:54)，

GFVKKD(SEQ ID NO:55)，

GFVKK(SEQ ID NO:56)，

GFVK(SEQ ID NO:57)，

GFV(SEQ ID NO:58)，

FVKKDQL(SEQ ID NO:59)，

FVKKDQ(SEQ ID NO:60)，

FVKKD(SEQ ID NO:61)，

FVKK(SEQ ID NO:62)，

FVK(SEQ ID NO:63)，

VKKDQL(SEQ ID NO:64)，

VKKDQ(SEQ ID NO:65)，

VKKD(SEQ ID NO:66)，

VKK(SEQ ID NO:67)，

KKDQL(SEQ ID NO:68)，

KKDQ(SEQ ID NO:69)，

KKD(SEQ ID NO:70)，

KDQL(SEQ ID NO:71)，

KDQ(SEQ ID NO:72)，

CPDNEAYE(SEQ ID NO:73)，

DPDNEAYC(SEQ ID NO:74)，

CGFVKKDQ(SEQ ID NO:75)，

PDNEAYEGGC(SEQ ID NO:76)，

DPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:77)，

PDNEAYERRDPDNEAYGGC(SEQ ID NO:78)，

DPDNEAYRRPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:79)，

PDNEAYERRTGFVKKDGGC(SEQ ID NO:80)，

TGFVKKDRRDPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:81)，

Arg-Val-Arg-Arg(RVRR；SEQ ID NO:82)，

Gly-Ala-Gly-Ala(GAGA；SEQ ID NO:83)，

Ala-Gly-Ala-Gly(AGAG；SEQ ID NO:84)，

Lys-Gly-Lys-Gly(KGKG；SEQ ID NO:85)，

Gly-Gly-Gly-Ser(GGGS；SEQ ID NO:86)，和

Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS；SEQ ID NO:87)。

序列表

<110> 普罗塞纳生物科学有限公司

<120> 治疗突触核蛋白病之α-突触核蛋白疫苗

<130> 20-1087-WO (769-PCT)

<150> US 63/079,819

<151> 2020-09-17

<160> 87

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 140

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Asp Val Phe Met Lys Gly Leu Ser Lys Ala Lys Glu Gly Val Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Glu Lys Thr Lys Gln Gly Val Ala Glu Ala Ala Gly Lys

20 25 30

Thr Lys Glu Gly Val Leu Tyr Val Gly Ser Lys Thr Lys Glu Gly Val

35 40 45

Val His Gly Val Ala Thr Val Ala Glu Lys Thr Lys Glu Gln Val Thr

50 55 60

Asn Val Gly Gly Ala Val Val Thr Gly Val Thr Ala Val Ala Gln Lys

65 70 75 80

Thr Val Glu Gly Ala Gly Ser Ile Ala Ala Ala Thr Gly Phe Val Lys

85 90 95

Lys Asp Gln Leu Gly Lys Asn Glu Glu Gly Ala Pro Gln Glu Gly Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Met Pro Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met Pro

115 120 125

Ser Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Tyr Glu Pro Glu Ala

130 135 140

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 2

Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met

1 5 10

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 3

Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

Val Asp Pro Asp Asn Glu Ala

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 6

Val Asp Pro Asp Asn Glu

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 7

Val Asp Pro Asp Asn

1 5

<210> 8

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 8

Val Asp Pro Asp

1

<210> 9

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 9

Val Asp Pro

1

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 10

Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met

1 5

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 11

Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu

1 5

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 12

Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr

1 5

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 13

Asp Pro Asp Asn Glu Ala

1 5

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 14

Asp Pro Asp Asn Glu

1 5

<210> 15

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 15

Asp Pro Asp Asn

1

<210> 16

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 16

Asp Pro Asp

1

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 17

Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met

1 5

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 18

Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu

1 5

<210> 19

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 19

Pro Asp Asn Glu Ala Tyr

1 5

<210> 20

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 20

Pro Asp Asn Glu Ala

1 5

<210> 21

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 21

Pro Asp Asn Glu

1

<210> 22

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 22

Pro Asp Asn

1

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 23

Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Met

1 5

<210> 24

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 24

Asp Asn Glu Ala Tyr Glu

1 5

<210> 25

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 25

Asp Asn Glu Ala Tyr

1 5

<210> 26

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 26

Asp Asn Glu Ala

1

<210> 27

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 27

Asp Asn Glu

1

<210> 28

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 28

Asn Glu Ala Tyr Glu Met

1 5

<210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 29

Asn Glu Ala Tyr Glu

1 5

<210> 30

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 30

Asn Glu Ala Tyr

1

<210> 31

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 31

Asn Glu Ala

1

<210> 32

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 32

Glu Ala Tyr Glu Met

1 5

<210> 33

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 33

Glu Ala Tyr Glu

1

<210> 34

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 34

Glu Ala Tyr

1

<210> 35

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 35

Ala Tyr Glu Met

1

<210> 36

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 36

Ala Tyr Glu

1

<210> 37

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 37

Tyr Glu Met

1

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 38

Ala Thr Gly Phe Val Lys Lys Asp Gln Leu

1 5 10

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 39

Ala Thr Gly Phe Val Lys Lys Asp Gln

1 5

<210> 40

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 40

Ala Thr Gly Phe Val Lys Lys Asp

1 5

<210> 41

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 41

Ala Thr Gly Phe Val Lys Lys

1 5

<210> 42

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 42

Ala Thr Gly Phe Val Lys

1 5

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 43

Ala Thr Gly Phe Val

1 5

<210> 44

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 44

Ala Thr Gly Phe

1

<210> 45

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 45

Ala Thr Gly

1

<210> 46

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 46

Thr Gly Phe Val Lys Lys Asp Gln Leu

1 5

<210> 47

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 47

Thr Gly Phe Val Lys Lys Asp Gln

1 5

<210> 48

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 48

Thr Gly Phe Val Lys Lys Asp

1 5

<210> 49

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 49

Thr Gly Phe Val Lys Lys

1 5

<210> 50

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 50

Thr Gly Phe Val Lys

1 5

<210> 51

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 51

Thr Gly Phe Val

1

<210> 52

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 52

Thr Gly Phe

1

<210> 53

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 53

Gly Phe Val Lys Lys Asp Gln Leu

1 5

<210> 54

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 54

Gly Phe Val Lys Lys Asp Gln

1 5

<210> 55

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 55

Gly Phe Val Lys Lys Asp

1 5

<210> 56

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 56

Gly Phe Val Lys Lys

1 5

<210> 57

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 57

Gly Phe Val Lys

1

<210> 58

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 58

Gly Phe Val

1

<210> 59

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 59

Phe Val Lys Lys Asp Gln Leu

1 5

<210> 60

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 60

Phe Val Lys Lys Asp Gln

1 5

<210> 61

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 61

Phe Val Lys Lys Asp

1 5

<210> 62

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 62

Phe Val Lys Lys

1

<210> 63

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 63

Phe Val Lys

1

<210> 64

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 64

Val Lys Lys Asp Gln Leu

1 5

<210> 65

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 65

Val Lys Lys Asp Gln

1 5

<210> 66

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 66

Val Lys Lys Asp

1

<210> 67

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 67

Val Lys Lys

1

<210> 68

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 68

Lys Lys Asp Gln Leu

1 5

<210> 69

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 69

Lys Lys Asp Gln

1

<210> 70

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 70

Lys Lys Asp

1

<210> 71

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 71

Lys Asp Gln Leu

1

<210> 72

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 72

Lys Asp Gln

1

<210> 73

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 73

Cys Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu

1 5

<210> 74

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 74

Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Cys

1 5

<210> 75

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 75

Cys Gly Phe Val Lys Lys Asp Gln

1 5

<210> 76

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 76

Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Gly Gly Cys

1 5 10

<210> 77

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 77

Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Gly Gly Cys

1 5 10

<210> 78

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 78

Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Arg Arg Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr

1 5 10 15

Gly Gly Cys

<210> 79

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 79

Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Arg Arg Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu

1 5 10 15

Gly Gly Cys

<210> 80

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 80

Pro Asp Asn Glu Ala Tyr Glu Arg Arg Thr Gly Phe Val Lys Lys Asp

1 5 10 15

Gly Gly Cys

<210> 81

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 81

Thr Gly Phe Val Lys Lys Asp Arg Arg Asp Pro Asp Asn Glu Ala Tyr

1 5 10 15

Glu Gly Gly Cys

20

<210> 82

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 82

Arg Val Arg Arg

1

<210> 83

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 83

Gly Ala Gly Ala

1

<210> 84

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 84

Ala Gly Ala Gly

1

<210> 85

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 85

Lys Gly Lys Gly

1

<210> 86

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 86

Gly Gly Gly Ser

1

<210> 87

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 87

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

Claims (56)

1.一种肽，其包含来自SEQ ID NO:01之残基81至140的3至10个氨基酸及任选地C端半胱氨酸。

2.如权利要求1的肽，其中所述肽来自SEQ ID NO:01之残基111至131及任选地C端半胱氨酸。

3.如权利要求2的肽，其中所述肽包含选自由SEQ ID NO:02至SEQ ID NO:37中之任一者组成的组的氨基酸序列。

4.如权利要求1的肽，其中所述肽来自SEQ ID NO:01之残基83至106及任选地C端半胱氨酸。

5.如权利要求4的肽，其中所述肽包含选自由SEQ ID NO:38至SEQ ID NO:72中之任一者组成的组的氨基酸序列。

6.如权利要求1的肽，其中所述肽包含选自由SEQ ID NO:02至SEQ ID NO:72中之任一者组成的组的氨基酸序列。

7.如权利要求1的肽，其包含以下中之任一者的氨基酸序列：DPDNEAYE(SEQ ID NO:48)、DPDNEAY(SEQ ID NO:49)、PDNEAYE(SEQ ID NO:55)、ATGFVKK(SEQ ID NO:41)、TGFVKKD(SEQ ID NO:48)、GFVKKDQ(SEQ ID NO:54)或DPDNEAYC(SEQ ID NO:74)。

8.如权利要求1至7中任一项的肽，其任选地包含N端半胱氨酸。

9.如权利要求8的肽，其包含CPDNEAYE(SEQ ID NO:73)或CGFVKKDQ(SEQ ID NO:75)的氨基酸序列。

10.一种肽，其包含以下的氨基酸序列：PDNEAYEGGC(SEQ ID NO:76)、DPDNEAYEGGC(SEQID NO:77)、PDNEAYERRDPDNEAYGGC(SEQ ID NO:78)、DPDNEAYRRPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:79)、PDNEAYERRTGFVKKDGGC(SEQ ID NO:80)或TGFVKKDRRDPDNEAYEGGC(SEQ ID NO:81)。

11.如权利要求1至10中任一项的肽，其进一步包含在所述肽之C端部分的接头。

12.如权利要求11之多肽，其中所述接头包含氨基酸序列。

13.如权利要求12的肽，其中所述接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：GG、GGG、AA、AAA、KK、KKK、SS、SSS、AGAG(SEQ ID NO:84)、GG、GAGA(SEQ ID NO:83)及KGKG(SEQID NO:85)。

14.如权利要求1至13中任一项的肽，其中所述多肽或若存在的话连接至载剂之接头进一步包含C端半胱氨酸(C)。

15.如权利要求1至14中任一项的肽，其中所述肽进一步包含在N端处的封端胺。

16.如权利要求1至15中任一项的多肽，其中第二肽包含5至10个氨基酸。

17.一种免疫疗法组合物，其包含如权利要求1至16中任一项的肽中之一者或多者。

18.如权利要求17的免疫疗法组合物，其中所述一种或多种肽进一步包含在所述肽之C端部分处连接至载剂的接头。

19.如权利要求18的免疫疗法组合物，其中所述接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：GG、GGG、AA、AAA、KK、KKK、SS、SSS、AGAG(SEQ ID NO:84)、GG、GAGA(SEQ ID NO:83)及KGKG(SEQ ID NO:85)。

20.如权利要求18或19的免疫疗法组合物，其中所述载剂包含血清白蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵白蛋白、破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、白喉毒素的经遗传修饰的交叉反应物质(CRM)、CRM197、脑膜炎球菌外膜蛋白复合物(OMPC)及流感嗜血杆菌(H.influenzae)蛋白D(HiD)、rEPA(铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A)、KLH(钥孔血蓝蛋白)及鞭毛蛋白。

21.如权利要求20的免疫疗法组合物，其中所述载剂为CRM197。

22.如权利要求20的免疫疗法组合物，其中所述载剂为白喉类毒素。

23.如权利要求17至22中任一项的免疫疗法组合物，其进一步包含至少一种药学上可接受的稀释剂。

24.如权利要求17至23中任一项的免疫疗法组合物，其进一步包含多重抗原呈递系统(MAP)。

25.如权利要求24的免疫疗法组合物，其中所述MAP包含基于Lys之树突状架构、辅助型T细胞表位、免疫刺激亲脂性部分、细胞穿透肽、自由基诱导之聚合、作为抗原呈递平台之自组装纳米粒子及金纳米粒子中之一者或多者。

26.一种药物组合物，其包含：(a)如权利要求1至16中任一项的多肽中之一者或多者，或(b)如权利要求17至25中任一项的免疫疗法组合物，及至少一种佐剂。

27.如权利要求26的药物组合物，其中所述佐剂选自由以下组成的组：氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A(MPL)、QS-21、TQL1055、QS-18、QS-17、QS-7、完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)、水包油乳液(诸如角鲨烯或花生油)、CpG、聚谷氨酸、聚赖氨酸、AddaVax^TM、及其组合。

28.如权利要求27的药物组合物，其中所述佐剂为QS-21或TQL1055。

29.如权利要求27的药物组合物，其中所述佐剂为MPL。

30.如权利要求27的药物组合物，其中所述佐剂为MPL与QS-21之组合，或MPL与TQL1055之组合。

31.如权利要求26至30中任一项的药物组合物，其中所述佐剂包含脂质体配制剂。

32.如权利要求26至31中任一项的药物组合物，其中所述组合物包含至少一种药学上可接受的稀释剂。

33.如权利要求26至32中任一项的药物组合物，其包含多重抗原呈递系统(MAP)。

34.如权利要求33的药物组合物，其中所述MAP包含基于Lys之树突状架构、辅助型T细胞表位、免疫刺激亲脂性部分、细胞穿透肽、自由基诱导之聚合、作为抗原呈递平台之自组装纳米粒子及金纳米粒子中之一者或多者。

35.一种核酸，其包含编码如权利要求1至16中任一项的多肽或如权利要求17至25中任一项的免疫疗法组合物的核酸序列。

36.一种核酸免疫疗法组合物，其包含如权利要求35的核酸及至少一种佐剂。

37.一种治疗或实现防治受试者的α-突触核蛋白病的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求17至25中任一项的免疫疗法组合物或如权利要求26至34中任一项的药物组合物。

38.一种在患有α-突触核蛋白病或具有发展α-突触核蛋白病之风险之受试者中阻断由神经元摄取α-突触核蛋白、抑制α-突触核蛋白种子之细胞-细胞间传输、或抑制或减少α-突触核蛋白之聚集的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求17至25中任一项的免疫疗法组合物或如权利要求26至34中任一项的药物组合物。

39.一种治疗或实现防治受试者的α-突触核蛋白病的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求36的核酸免疫疗法组合物。

40.一种在患有α-突触核蛋白病或具有发展α-突触核蛋白病之风险之受试者中阻断由神经元摄取α-突触核蛋白、抑制α-突触核蛋白种子之细胞-细胞间传输、或抑制或减少α-突触核蛋白之聚集的方法，其包括向所述受试者施用如权利要求36的核酸免疫疗法组合物。

41.如权利要求37至40中任一项的方法，其中所述α-突触核蛋白病选自由以下组成的组：帕金森病、路易氏体痴呆症(DLB)、多系统萎缩症(MSA)、阿尔茨海默病和神经变性伴脑铁沉积(NBIA)。

42.如权利要求41的方法，其中所述多系统萎缩症(MSA)选自由MSA-帕金森型(MSA-P)变异形式及MSA-小脑性(MSA-C)变异形式组成的组。

43.如权利要求41的方法，其中所述帕金森病为伴有痴呆症之帕金森病(PDD)。

44.如权利要求41的方法，其中所述阿尔茨海默病为阿尔茨海默病之路易氏体变异形式。

45.如权利要求37至44中任一项的方法，其进一步包括至少两次、至少三次、至少四次、至少五次或至少六次重复所述施用。

46.如权利要求45的方法，其进一步包括以约14天，或约21至约28天，或约一季，或约半年，或约一年之间隔重复所述施用。

47.一种在动物中诱导免疫应答的方法，其包括以有效产生免疫应答之方案向所述动物施用以下中之任一者：如权利要求1至16的多肽、如权利要求17至25的免疫疗法组合物、如权利要求26至34的药物组合物或如权利要求36的核酸免疫疗法组合物，所述免疫应答包含特异性结合至α-突触核蛋白之抗体。

48.如权利要求47的方法，其中所述免疫应答包含特异性结合至α-突触核蛋白之抗体。

49.如权利要求47至48中任一项的方法，其中所述诱导免疫应答包含特异性结合至α-突触核蛋白之C端区之抗体。

50.如权利要求47至48中任一项的方法，其中所述诱导免疫应答包含特异性结合至α-突触核蛋白之NAC区之抗体。

51.一种免疫接种试剂盒，其包含如权利要求17至25中任一项的免疫疗法组合物。

52.如权利要求51的试剂盒，其进一步包含佐剂。

53.如权利要求52的试剂盒，其中所述免疫疗法组合物在第一容器中且所述佐剂在第二容器中。

54.一种试剂盒，其包含如权利要求36的核酸免疫疗法组合物。

55.如权利要求54的试剂盒，其进一步包含佐剂。

56.如权利要求55的试剂盒，其中所述核酸在第一容器中且所述佐剂在第二容器中。