BR112020013352A2

BR112020013352A2 - imunógenos de peptídeo e formulações dos mesmos direcionados a ige ligada a membrana para tratamento de doenças alérgicas mediadas por ige

Info

Publication number: BR112020013352A2
Application number: BR112020013352-3A
Authority: BR
Inventors: Chang Yi Wang; Feng Lin; Jiun Bo Chen
Original assignee: United Biomedical, Inc.
Priority date: 2017-12-31
Filing date: 2017-12-31
Publication date: 2020-12-01
Also published as: RU2020125383A3; KR20200115522A; JP7239203B2; WO2019133024A1; EP3731934A1; RU2769983C2; AU2017445171A1; RU2020125383A; TW201930346A; SG11202006215TA; MX2020006937A; US20230270848A1; JP2021515744A; TWI804553B; CA3087036A1; CN111565801B; CN111565801A

Abstract

A presente invenção é direcionada aos construtos de imunógeno de peptídeo IgE EMPD e formulações dos mesmos para o tratamento de doenças alérgicas mediadas por IgE. Os construtos de imunógeno de peptídeo IgE EMPD têm um peptídeo de epítopo de célula B com mais de 20 aminoácidos, de preferência cíclico, ligado através de um espaçador opcional a epítopos heterólogos de células T auxiliares (Th) derivados de proteínas patogênicas. Esses construtos de imunógeno de peptídeo e formulações dos mesmos podem estimular a geração de anticorpos altamente específicos em hospedeiros vacinados que são direcionados contra o peptídeo IgE EMPD e são reativos com IgE ligada à membrana nos linfócitos B comprometidos com a secreção de IgE. Os anticorpos induzidos pelos construtos de imunógeno de peptídeo e formulações dos mesmos em hospedeiros vacinados podem induzir a apoptose de células B que expressam IgE e mediar a citototoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC), resultando na redução dos níveis de IgE específica de antígeno e de IgE total em hospedeiros vacinados para efetivamente tratar a patologia alérgica mediada por IgE.

Description

"IMUNÓGENOS DE PEPTÍDEO E FORMULAÇÕES DOS MESMOS DIRECIONADOS A IGE LIGADA À MEMBRANA PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS ALÉRGICAS MEDIADAS POR IGE". CAMPO DA INVENÇÃO

[001] Esta descrição refere-se a construtos de imunógeno de peptídeo direcionados ao domínio proximal da membrana extracelular da IgE ligada à membrana (ou EMPD de IgE) e formulações dos mesmos como uma vacina universal para o tratamento e/ou prevenção de doenças alérgicas mediadas por IgE.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] As alergias, também conhecidas como doenças alérgicas mediadas por imunoglobulina E (IgE), são várias condições causadas pela hipersensibilidade do sistema imunológico a algo no ambiente que geralmente causa pouco ou nenhum problema na maioria das pessoas. Essas doenças incluem alergia à fármaco, a alimentos e a insetos, rinite alérgica (febre do feno), dermatite atópica, asma alérgica, conjuntivite, eczema, urticária (urticária) e anafilaxia (website: en.wikipedia.org/wiki/Allergy) Sintomas diversos são geralmente atribuídos a alergias e podem incluir olhos vermelhos, erupção cutânea com comichão, espirros, coriza, falta de ar ou inchaço.

[003] A prevalência de doenças alérgicas está aumentando. No início do século 20, a alergia era vista como uma doença rara. No entanto, desde então, vários fatores desencadearam um aumento dramático na prevalência de doenças alérgicas. As manifestações respiratórias são as mais prevalentes, afetando até 30% da população em geral. Segundo estatísticas da Organização Mundial da Saúde (WHO), centenas de milhões de pessoas no mundo têm rinite e estima- se que 235 milhões de pessoas tenham asma (website: www.who.int/mediacentre/factsheets/fs307/ en/index.html). O custo social das doenças alérgicas é considerável, principalmente devido à alta prevalência de rinoconjuntivite alérgica e à perda de produtividade associada. Um estudo sueco estimou o custo da perda de produtividade causada por rinite em 2,7 bilhões de euros por ano apenas na Suécia, e um estudo americano estabeleceu a rinite como a doença mais cara para os empregadores americanos (Larsen JN, et al., 2016).

[004] Uma reação alérgica é uma resposta imune anormalmente vigorosa, na qual o sistema imunológico combate uma ameaça percebida de um tipo de antígeno, um alérgeno, que seria inofensivo ao organismo (website: en.wikipedia.org/wiki/Allergen). Especificamente, um alérgeno é um antígeno capaz de estimular uma reação de hipersensibilidade tipo | em indivíduos atópicos através de respostas de IgE. Os alérgenos podem ser encontrados em uma variedade de fontes, como excreção de ácaros, pólen, pelos de animais, certos alimentos ou irritantes químicos/físicos. As alergias alimentares não são tão comuns quanto a sensibilidade alimentar, mas alguns alimentos como amendoim (leguminosa), nozes, frutos do mar e mariscos são a causa de alergias graves em muitas pessoas.

[005] A alergia é uma doença imunológica sistêmica iniciada pelo início de uma resposta imune adaptativa a alérgenos comuns. A IgE desempenha um papel central na mediação de reações de hipersensibilidade do tipo | responsáveis por causar doenças alérgicas mediadas por IgE. As doenças alérgicas mediadas por IgE são caracterizadas pela presença de anticorpos |gE específicos para alérgenos e inflamação eosinofílica. A reação alérgica é bifásica, com uma reação imediata ocorrendo poucos minutos após a exposição ao alérgeno e uma reação de fase tardia ocorrendo horas depois. A reação imediata é causada pela liberação de mediadores pré-formados (por exemplo, histamina, proteases, quimiocinas, heparina) de basófilos e mastócitos após a reticulação de IgE ligada a receptores de alta afinidade na superfície celular. A reação alérgica da fase tardia é causada pela mobilização e atração de células inflamatórias, como eosinófilos, basófilos, neutrófilos e células mononucleares.

[006] Os alérgenos resultam em níveis elevados de imunoglobulina E total livre no soro (IgE) e IgE específica para alérgenos em indivíduos propensos a alergias. A hipersensibilidade tipo | mediada por IgE específica para alérgenos é central para a patogênese das doenças alérgicas mediadas por IgE (Figura 1). A IgE sensibiliza mastócitos e basófilos pela ligação ao receptor IgE de alta afinidade, FceRI, na superfície dessas células efetoras. A ligação de antígenos à IgE que já está ligada ao FceRI nos mastócitos causa a reticulação da IgE ligada e a agregação do FceRI subjacente. Os receptores reticulados iniciam uma cascata de transdução de sinal e uma desgranulação rápida. Os mastócitos e os basófilos liberam histamina armazenada, seguida pela síntese e liberação de bradicinina, prostaglandinas, leucotrienos, citocinas e outros mediadores inflamatórios. Além disso, atraem e ativam células inflamatórias que produzem os sintomas da alergia e superregulam a biossíntese de IgE pelas células B para promover maior sensibilidade. As interações IgE- FceRI e o evento de degranulação são centrais nas reações alérgicas tipo | e no desenvolvimento de asma atópica.

[007] Como outros isótipos de imunoglobulina, a IgE é encontrada em 2 formas, uma forma de imunoglobulina sérica secretada e uma forma ligada à membrana (mIgE). Estudos sobre os segmentos genéticos que codificam o peptídeo de ancoragem à membrana de mlgEs de camundongo e humano mostram que a diferença entre mIlgE e IgE secretada é que o mIgE contém três regiões extras: (1) um trecho conservado centralmente de 25 resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e não carregados, que abrange a membrana plasmática; (2) uma cauda citoplasmática do C-terminal; e (3) uma porção extracelular N-terminal do segmento de ancoragem à membrana de mIgE. Em humanos, a cadeia epsilon de mIgE na superfície dos linfócitos B está presente como isoformas curtas e longas. A isoforma curta contém 15 aminoácidos no domínio proximal da membrana extracelular de mIgE, denominada EMPD de IgE, enquanto a isoforma longa contém um segmento adicional de 52 resíduos de aminoácidos, para um total de 67 aminoácidos na EMPD. Estas duas isoformas são geradas como uma consequência da junção alternativa entre um sítio doador na extremidade 3' do éxon CH4 e dois sítios aceitadores separados por 156 pb e localizados em torno de dois mil nucleotídeos a jusante do éxon CHA. A transcrição da forma longa foi detectada em um nível 100 vezes maior que a forma curta nas células de mieloma produtoras de IgE e nas células B das amígdalas tratadas com IL-4 mais CD40 (Peng et al. 1992 e Zhang et al. 1992); enquanto que a forma curta não era detectável no nível da proteína (Peng et al, 1992). O EMPD IgE é específico para a forma mIlgE e não é encontrado na IgE sérica secretada (Figura 2).

[008] As diretrizes clínicas atuais para o tratamento de doenças alérgicas mediadas por IgE incluem uma combinação de educação do paciente, prevenção de alérgenos, farmacoterapia, imunoterapia baseada em alérgenos e direcionamento terapêutico de IgE, mas essas opções de tratamento têm suas limitações. Por exemplo, a prevenção de alérgenos é indicada sempre que possível, embora, na prática, seja difícil obter um controle adequado dos sintomas apenas com a prevenção de alérgenos. Além disso, embora estejam disponíveis fármacos seguras e econômicas para o tratamento de sintomas alérgicos, muitos pacientes relatam um controle insuficiente dos sintomas com essas fármacos. É importante ressaltar que a farmacoterapia não tem efeito na progressão da doença e o tratamento deve ser administrado repetidamente, enquanto os sintomas prevalecerem, o que geralmente significa a vida inteira. Somente a imunoterapia clássica baseada em alérgenos tem potencial de modificação da doença e é considerada a melhor estratégia de tratamento.

[009] A imunoterapia baseada em alérgenos (AIT) envolve a injeção subcutânea de doses cada vez maiores de alérgeno, a fim de suprimir os sintomas na subsequente re-exposição a esse alérgeno. À quantidade de alérgeno apresentada ao sistema imunológico na mucosa sob condições de exposição natural é relativamente baixa, mas resulta em um estímulo eficiente da resposta alérgica e os sintomas da alergia aparecem em minutos. Por outro lado, quando um alérgeno é administrado como imunoterapia, a quantidade de alérgeno é relativamente alta, onde uma dose administrada em imunoterapia corresponde aproximadamente a 100 vezes a ingestão anual máxima estimada por exposição natural. A diferença quantitativa em combinação com a diferente via de entrada no corpo exerce um efeito profundo no sistema imunológico, que responde induzindo tolerância imune ao alérgeno.

[0010] A forma de administração original da AIT foi por injeção subcutânea e esse regime de tratamento é tradicionalmente realizado em duas fases: (1) uma fase inicial de dosagem e (2) uma fase subsequente de manutenção. A fase de dosagem é uma titulação individual, na qual doses crescentes são administradas com o objetivo de aumentar lentamente a tolerância e avaliar cuidadosamente a sensibilidade do paciente. A dose máxima tolerada ou a dose máxima recomendada, o que for atingido primeiro, é administrada durante toda a fase de manutenção.

[0011] Pensa-se que dois mecanismos desempenham um papel importante em AIT: (1) desvio imunológico e (2) indução de células T regulatórias. As contribuições relativas do desvio imunológico e das células T regulatórias não são estabelecidas, mas o resultado final é a redução e, em alguns casos, até a eliminação da capacidade de montar uma reação alérgica em resposta à exposição a alérgenos.

[0012] Desvio imune é um termo que significa uma resposta imune modificada à exposição a alérgenos, onde células T auxiliares tipo 1 (Th1) específicas a alérgenos são mobilizadas e estimuladas às custas das células Th2. As células Th1 produzem interferon gama (IFN-y), que estimula as células B a produzir IgG em vez de IgE, e a IgG não é capaz de desencadear uma reação alérgica.

[0013] As células T regulatórias são um grupo diversificado de células T que são ativas na regulação das respostas imunes. Foi demonstrado um aumento nas células T regulatórias CD4+CD25+ específicas do alérgeno no sangue periférico após AIT. Essas células produzem interleucina (IL)-10 e fator de crescimento transformador (TGF)-B e têm o potencial de suprimir as respostas locais das células Th2 e redirecionar a troca de classe de anticorpos em favor de IgG4 (fator de troca de isótipo IL10) e IgA (TGF- fator de troca do isótipo É). Os anticorpos IgG4 específicos para alérgenos interrompem a apresentação de alérgenos nas células Th2 e, além disso, bloqueiam a ativação induzida por alérgenos de mastócitos e basófilos, enfraquecendo significativamente a reação alérgica.

[0014] Embora a imunoterapia baseada em antígenos possa ser eficaz, ainda existem problemas sérios e necessidades não atendidas relacionadas à AIT de doenças alérgicas mediadas por IgE. Primeiro, todas as injeções para AIT são administradas no consultório médico, pois há um pequeno risco de induzir reações alérgicas, que podem se tornar graves ou até fatais se não forem tratadas prontamente e adequadamente. Segundo, o aspecto da modificação da doença através da AIT foi demonstrado clinicamente para apenas alguns produtos alérgenos. Terceiro, apenas algumas estruturas de alérgenos específicos foram descritas e a definição de alérgeno é baseada principalmente no critério funcional de ser capaz de obter uma resposta de IgE em indivíduos suscetíveis. Assim, os alérgenos são geralmente definidos pelo sistema imunológico de um paciente individual e, como tal, qualquer proteína imunogênica (antígeno) tem potencial alergênico, embora a maioria dos pacientes com alergia possua anticorpos IgE específicos para um número relativamente limitado de alérgenos principais. Quarto, todo paciente tem um padrão de sensibilização único em relação às moléculas e epítopos de alérgenos. Quinto, todos os produtos alergênicos comercializados são fabricados por extração aquosa de materiais de origem alergênica derivados de matérias-primas naturais, como pólens, culturas de ácaros, pelos de animais e/ou pelos, venenos de insetos e essas matérias-primas naturais são inerentemente variáveis na composição. Assim, os produtos alérgenos utilizados para a AIT não são genéricos e diferem em sua composição, potência de ligação à IgE e extensão do controle de qualidade entre os fabricantes. Nenhum padrão internacional está em vigor. Isso significa que produtos de diferentes fabricantes podem ter um desempenho diferente em pacientes e, como consequência, os resultados clínicos não podem ser extrapolados diretamente de um produto alergênico para outro.

[0015] Uma revisão atualizada sobre imunoterapia baseada em alérgenos: o futuro do tratamento para alergias é incluído aqui por referência (Drug Discovery Today Volume 21, Issue 1, January 2016, Pages 26-37), onde todos os documentos de suporte podem ser encontrados para declarações feitas nesta seção de fundamento.

[0016] Além da AIT, o direcionamento terapêutico da molécula de IgE foi estudado no tratamento de doenças alérgicas mediadas por IgE.

[0017] O direcionamento terapêutico da IgE solúvel no soro com um anticorpo monoclonal anti-lgE demonstrou ser eficaz no tratamento de doenças alérgicas mediadas por IgE. Atualmente, o Omalizumabe

(XOLAIRO), um anticorpo monoclonal humanizado recombinante, foi aprovado para o tratamento de asma alérgica persistente de moderada a grave em adultos e adolescentes. O Omalizumabe interrompe a cascata alérgica ao se ligar a IgE livre, circulante e livre, e impede que se ligue ao IgE FceRI na superfície das células efetoras imunológicas. O tratamento com Omalizumabe leva a uma diminuição acentuada dos níveis de IgE livre e a uma sobrerregulação dos receptores celulares de IgE (Chang et al, 2007). Embora o tratamento com omalizumabe tenha se mostrado eficaz, ele tem suas limitações. Especificamente, o omalizumabe é capaz de neutralizar IgE livre no soro, mas não afeta a produção de IgE. Portanto, o omalizumabe deve ser administrado com frequência e de forma crônica, a fim de manter a supressão suficiente da IgE sérica.

[0018] O direcionamento terapêutico do domínio proximal da membrana extracelular da IgE ligada à membrana (EMPD de IgE) também foi estudado para o tratamento de doenças alérgicas mediadas por IgE. A reticulação do receptor de células B (BCR) na ausência de sinais coestimulatórios adicionais pode levar à apoptose das células B. A depleção apoptótica de células B através da reticulação de BCR foi extensivamente descrita para células B imaturas como um mecanismo pelo qual as células B autorreativas são removidas do repertório de células B. Anticorpos monoclonais anticEMPD de IgE, como 47H4 (Brightbill et al. 2010), 4B12 e 26H2 (Chen et al. 2010), mostraram reticulação de IgE BCR e causam a apoptose de células B que expressam mligE (Figura 2). Brightbill et al. também descobriram que a administração terapêutica de 47H4 in vivo pode reduzir as respostas IgE estabelecidas, como observado nos modelos de infecção por N. brasiliensis e asma alérgica (Chen et al. 2010). Para esgotar as células da linhagem B de IgE, a fim de reduzir a IgE sérica, alguns anticorpos e epítopos para direcionar a EMPD de IgE, especialmente dentro da região da forma extra de 52 aminoácidos, foram estudados e identificados (Chen et al. 2010, Chang et al. 2015, Chen et al. 2002). Um grupo relatou o uso do antígeno do núcleo do vírus da hepatite B (HBcAg) como um transportador que abriga os fragmentos de EMPD de IgE como insertos para induzir resposta específica de anticorpos EMPD de IgE em camundongos BALB/c. Os construtos clonados reunidos espontaneamente em partículas semelhantes a vírus (VPLs) com vários fragmentos de EMPD de IgE apresentados na ponta do "pico" das VLPs para obter imunogenicidade. Os anticorpos IgG purificados a partir de soros de camundongos imunizados foram capazes de causar a apoptose de células Ramos que expressam mIgE.FcL através de uma via de caspase dependente de BCR, bem como Citotoxicidade mediada por Células dependente de Anticorpo (ADCC) em célA20 expressando mIgE.FcL usando células NK esplênicas de camundongo purificadas como células efetoras (Lin, et al. 2012). A abordagem acima gerou algum interesse no desenvolvimento de vacinas para tratamento de alergias. No entanto, o sistema de expressão de antígeno é complicado, gerando a maioria dos anticorpos direcionados às VLPs transportadoras com os antígenos e o sistema de distribuição longe do ideal para o desenvolvimento eficaz da vacina aplicável para usos industriais e clínicos.

[0019] Tendo em vista o exposto, existe uma necessidade não atendida de desenvolver uma abordagem imunoterapêutica para o tratamento e/ou prevenção de doenças alérgicas mediadas por IgE que seja: independente de alérgenos, capaz de provocar respostas imunes altamente específicas contra IgE, facilmente administrada aos pacientes, capaz de ser fabricada sob boas práticas de fabricação rigorosas (GMP) e seja econômica para aplicação em todo o mundo, substituindo a prática centenária da AIT. Referências:

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8. BRIGHTBILL, H.D,, et al. "Antibodies specific for a segment of human membrane IgE deplete IgE-producing B cells in humanized mice", J Clin. Invest., 120:2218-2229 (2010).

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14. "2016 Appendix to GINA Report" Global Initiative For Asthma website, website address: ginasthma.org/wp- content/uploads/2016/04/GINA-Appendix-2016-final.pdf (accessed August 18, 2017).

15. "Allergy" Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address: en.wikipedia.org/wiki/Allergy (accessed August 18, 2017).

16. website: en.wikipedia.org/wiki/Allergen)

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0020] A presente descrição é direcionada a construtos de imunógeno de peptídeo individuais direcionados ao domínio proximal da membrana extracelular da IgE ligada à membrana (EMPD de IgE) para o tratamento e/ou prevenção de doenças alérgicas mediadas por IgE. A presente descrição também é direcionada a composições contendo os construtos de imunógeno de peptídeo, métodos de produção e uso dos construtos de imunógeno de peptídeo e anticorpos produzidos pelos construtos de imunógeno de peptídeo.

[0021] Os construtos de imunógeno de peptídeo divulgados contêm cerca de 20 ou mais aminoácidos. Os construtos de imunógeno de peptídeo contêm um epítopo da célula B da sequência de 67 aminoácidos da EMPD de IgE de comprimento completo (SEQ ID NO: 1). O epítopo da célula B pode ser ligado a um epítopo heterólogo de células T (Th) derivado de proteínas patogênicas através de um espaçador heterólogo opcional. Os construtos de imunógeno de peptídeo divulgados estimulam a geração de anticorpos altamente específicos direcionados contra EMPD de IgE e podem se ligar a proteína contendo EMPD de IgE recombinante, EMPD de IgE em células B portadoras de mIgE e/ou uma proteína EMPD de IgE solúvel recombinante contendo a porção Fc de IgG1 humana e EMPD de IgE da IgE ligada à membrana humana (referida como "y1-em67"). Os construtos de imunógeno de peptídeo divulgados podem ser usados como uma imunoterapia universal, independente de alérgenos, econômica e para pacientes globais que sofrem de doenças alérgicas mediadas por IgE.

[0022] A porção do epítopo da célula B dos construtos de imunógeno de peptídeo possui sequências de aminoácidos da sequência de EMPD de IgE de comprimento completo (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, o epítopo da célula B tem uma sequência contendo a alça intramolecular interna formada por cisteínas endógenas (C18-C39), de acordo com a numeração da sequência EMPD de IgE de comprimento completo (SEQ ID NO: 1). Em certas modalidades específicas, o epítopo da célula B tem uma sequência de aminoácidos de EMPD de IgE-1-39 (SEQ ID NO: 5), EMPD de IgE-7-40 (SEQ ID NO: 6), EMPD de IgE-19-38 (SEQ ID NO: 8) ou EMPD de IgE-1-40 (SEQ ID NO: 9).

[0023] Os construtos de imunógeno de peptídeo da presente descrição podem conter uma sequência de aminoácidos heteróloga de epítopo Th derivada de uma proteína patogênica (por exemplo, SEQ ID NOs: 59 a 87). Em certas modalidades, o epítopo heterólogo de Th é derivado de patógenos naturais, como Toxina de Difteria (SEQ ID NO: 63), Plasmodium Falciparum (SEQ ID NO: 64), Toxina de Cólera (SEQ ID NO: 66). Em outras modalidades, o epítopo Th heterólogo é um epítopo Th idealizado artificial derivado da proteína de Fusão do Vírus do Sarampo (MVF 1 a 5) ou do antígeno de superfície da hepatite B (HBSAg 1 a 3) na forma de sequência única ou de sequências combinatórias (por exemplo, SEQ ID NOs: 70, 69 e 71).

[0024] Em algumas modalidades, os construtos de imunógeno de peptídeo contêm um epítopo da célula B de EMPD de IgE ligado a um epítopo heterólogo de célula T auxiliar (Th) através de um espaçador heterólogo opcional. Em certas modalidades, os construtos de imunógeno de peptídeo contêm um sítio antigênico da célula B com mais de cerca de 20 aminoácidos de EMPD de IgE-1-40 (SEQ ID NO: 9) ligado a um epítopo Th heterólogo derivado de uma proteína patogênica (por exemplo, SEQ ID NOs: 59 a 87) através de um espaçador heterólogo opcional. Em algumas modalidades, o espaçador heterólogo opcional é uma molécula ou estrutura química capaz de ligar dois aminoácidos e/ou peptídeos juntos. Em certas modalidades, o espaçador é um aminoácido de ocorrência natural, um aminoácido de ocorrência não natural ou uma combinação dos mesmos. Em modalidades específicas, os construtos de imunógeno de peptídeo têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 88-95, 98-124 e 130.

[0025] A presente descrição também é direcionada a composições contendo um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE. Em algumas modalidades, as composições divulgadas contêm mais de um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE. Em certas modalidades, as composições contêm uma mistura de construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE G1-C39 (por exemplo, qualquer combinação de SEQ ID NOs: 88-95, 98-124 e 130) para cobrir um amplo contexto genético em pacientes. As composições contendo uma mistura de construtos de imunógeno de peptídeo podem levar a uma porcentagem mais alta na taxa de resposta após a imunização da vacina para o tratamento de doenças alérgicas mediadas por IgE em comparação com composições contendo apenas um único construto de imunógeno de peptídeo.

[0026] A presente descrição também é direcionada a composições farmacêuticas, incluindo formulações de vacina, para o tratamento e/ou prevenção de doenças alérgicas mediadas por IgE. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm os construtos de imunógeno de peptídeo divulgados na forma de um complexo imunoestimulatório estabilizado formado através de associações eletrostáticas por mistura de um oligômero CpG com uma composição contendo um complexo de imunógeno de peptídeo. Tais complexos imunoestimulatórios estabilizados são capazes de aumentar ainda mais a imunogenicidade dos construtos de imunógeno de peptídeo Em algumas — modalidades, as composições farmacêuticas contêm adjuvantes como sais minerais, incluindo gel de alúmen (ALHYDROGEL), fosfato de alumínio (ADJUPHOS) ou emulsões de água em óleo, incluindo MONTANIDE ISA 51 ou 720.

[0027] A presente descrição também é direcionada a anticorpos direcionados contra os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE divulgados. Em particular, os construto de imunógeno de peptídeo da presente descrição são capazes de estimular a geração de anticorpos altamente específicos que são reativos cruzados com a sequência de aminoácidos 1-52 de EMPD de IgE (SEQ ID NO: 2) a sequência de aminoácidos 1-67 de EMPD de IgE (SEQ ID NO: 1) e fragmentos das mesmas (por exemplo, SEQ ID NOs: 5 e 6) quando administrados a um sujeito. Os anticorpos altamente específicos produzidos pelos construtos de imunógeno de peptídeo são reativos com a proteína recombinante contendo EMPD de IgE, y1-em67 e/ou EMPD de IgE em células B portadoras de IgE ligadas à membrana. Os anticorpos divulgados se ligam com alta especificidade a EMPD de IgE sem muito, se houver, direcionados aos epítopos Th heterólogos empregados para intensificação de imunogenicidade, que contrasta fortemente com a proteína convencional ou outros transportadores biológicos usados para essa intensificação de antigenicidade de peptídeo.

[0028] A presente descrição também inclui métodos para tratamento e/ou prevenção de doenças alérgicas mediadas por IgE, utilizando os construtos de imunógeno de peptídeo divulgados e/ou anticorpos direcionados contra os construto de imunógenos de peptídeo. Em algumas modalidades, os métodos para o tratamento e/ou prevenção de doenças alérgicas mediadas por IgE, incluindo administrar a um hospedeiro de uma composição contendo um construto de imunógeno de peptídeo divulgado. Em certas modalidades, as composições utilizadas nos métodos contêm um construto de imunógeno de peptídeo divulgado na forma de um complexo imunoestimulador — estável! com oligonucleotídeos carregados negativamente, como oligômeros CpG, por meio de associação eletrostática, cujos complexos são suplementados ainda mais, opcionalmente, com sais minerais ou como adjuvante, para administração a pacientes com doenças alérgicas mediadas por IgE. Os métodos divulgados também incluem regimes de dosagem, formas de dosagem e rotas para administrar os construtos de imunógeno de peptídeo a um hospedeiro em risco de, ou com, doenças alérgicas mediadas por IgE.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0029] A Figura 1 é uma ilustração que representa o mecanismo da via da doença alérgica mediada por IgE. As células B maduras naíve começam expressando IgM ligada à membrana (mIgE). Ao encontrar um alérgeno, essas células são ativadas com a ajuda de células T (TH) auxiliares cognatas que fornecem às células B os sinais e citocinas co- estimulatórios necessários. As células B específicas para alérgenos ativados, ajudadas por uma infinidade de citocinas, como IL-4 e IL-13, tornam-se células B comprometidas com IgE que expressam mIgE por meio de recombinação de troca de classe. Essas células B comprometidas com IgE se diferenciam terminalmente em células plasmáticas secretoras de IgE. A maioria das células plasmáticas secretoras de IgE tem vida curta e migra para o local da inflamação e depois morre; no entanto, algumas células de vida longa migram para seus nichos correspondentes na medula óssea. A IgE específica de alérgenos que é secretada pelas células plasmáticas se liga ao receptor de IgE .Fc de alta afinidade, FceRI, na superfície dos basófilos do sangue e mastócitos teciduais. A agregação de IgE induzida por alérgenos ligada ao FceRI estimula a desgranulação de basófilos ou mastócitos e a liberação de mediadores, como histamina, leucotrienos, PGD?2, triptase e várias citocinas, que desencadeiam hipersensibilidade imediata e promovem o recrutamento de vários tipos celulares, como células TH2 e eosinófilos.

[0030] As Figuras 2A e 2B são ilustrações que mostram as diferenças estruturais entre IgE segregada e IgE ligada à membrana (mIgE) e a lógica de depleção de células B de mIgE B direcionando EMPD de IgE. A Figura 2A mostra que a IgE é expressa em duas formas: IgE secretora e IgE ligada à membrana (mIgE). A IgE secretora é capturada na superfície celular dos basófilos e mastócitos através do FceRI, enquanto a mIgE está presente exclusivamente nas células B comprometidas com IgE como parte do receptor da célula B. O domínio proximal da membrana extracelular (EMPD) da mIlgE é um segmento peptídico de 67 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) entre o domínio CH4 e a região transmembranar e é encontrado exclusivamente nas células B da mIlgE. Os aminoácidos sublinhados representam os resíduos encontrados na isoforma curta do EMPD. A singularidade da EMPD de IgE forneceu um sítio atraente para o direcionamento de células mIlgE e mlgE B. A Figura 2B mostra um mecanismo para esgotar as células B de mIgE B direcionando EMPD de IgE, que causa a supressão da produção de IgE específica de alérgeno antes que as células de mIlgE B se diferenciem em novas células plasmáticas secretoras de IgE. As células plasmáticas que secretam IgE existentes com sua vida útil limitada acabam morrendo, resultando no declínio gradual da IgE total e específica de alérgenos.

[0031] A Figura 3 é um fluxograma que identifica o processo de desenvolvimento desde a descoberta até a comercialização (industrialização) de uma formulação de vacina de acordo com uma modalidade específica divulgada aqui. A presente descrição inclui projeto de imunógeno de peptídeo, projeto de composição de peptídeo, projeto de formulação de vacina, projeto de estudo de antigenicidade funcional in vitro , projeto de estudo de imunogenicidade e eficácia in vivo e projeto de protocolo clínico, conforme resumido neste gráfico. À avaliação e análise detalhadas de cada uma das etapas levam a uma série de experimentos que resultam na comercialização de uma formulação de vacina segura e eficaz.

[0032] A Figura 4 é um gráfico que ilustra a cinética da resposta do anticorpo durante um período de 8 semanas em porquinhos-da-índia imunizados com diferentes construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE (SEQ ID NOs: 88 a 94, 96 e 97). O soro foi diluído de 1:100 a 1:100000 por uma diluição em série de 10 vezes. As placas ELISA foram revestidas com o peptídeo EMPD de IgE 1-39 (SEQ ID NO: 5) a 0,5 ug de peptídeo por poço. O título de um soro testado, expresso como Logo, foi calculado por análise de regressão linear do Asso com o corte Au4so definido em 0,5.

[0033] A Figura 5 é um gráfico que ilustra a curva de titulação de vários anticorpos policlonais anti-EMPD de IgE purificados criados por diferentes construtos de imunógeno EMPD de IgE (SEQ ID NOs: 88 a

94, 96 e 97). As placas ELISA foram revestidas com uma proteína recombinante EMPD de IgE- (SEQ ID NO: 1), y1-em67 (SEQ ID NO: 1). Os anticorpos policlonais anti-EMPD de IgE purificados a partir de soros de cobaias por cromatografia em proteína A foram diluídos de 100 ug/mL a 0,0238 ng/mL por uma diluição em série 4 vezes. A EC5o de cada anticorpo policlonal anti-EMPD de IgE foi calculada por regressão não linear com adequação de curva logística de quatro parâmetros com SEQ ID Nos: 89 e 93 de construtos de imunógeno mostrando a melhor eficácia de ligação.

[0034] As Figuras 6A a 6C contêm histogramas de citometria de fluxo que ilustram a ligação de anticorpos policlonais purificados de soros de cobaias reunidos de animais imunizados com construtos de imunógeno EMPD de IgE a células da linhagem celular de Ramos que expressam migE.FcL (lado esquerdo) ou mIgE.FcS (lado direito ) Anticorpos policlonais anti-EMPD de IgE purificados a partir de soros de cobaia por cromatografia em proteína A foram usados a 10 ug/mL com construtos de imunógeno com SEQ ID NOs de 88 a 94 mostrando ligação respeitável às células B mIigEL B quando comparados aos construtos de imunógeno 96 com 97 com tamanhos de peptídeo de epítopo B EMPD de IgE menores que 20 resíduos de aminoácidos. À Figura 6A contém os histogramas de anticorpos policlonais direcionados contra construtos de imunógeno EMPD de IgE de SEQ ID NOs: 88 a 90. A Figura 6B contém os histogramas de anticorpos policlonais direcionados contra construtos de imunógeno EMPD de IgE das SEQ ID NOs: 91 a 93. A Figura 6c contém os histogramas de anticorpos policlonais direcionados contra construtos de imunógeno EMPD de IgE das SEQ ID NOs: 94, 96 e 97.

[0035] A Figura 7 é um gráfico que mostra a apoptose de células Ramos que expressam mlIgE.FcL induzidas por vários anticorpos policlonais anti-EMPD de IgE dirigidos contra construtos de imunógeno

EMPD de IgE (SEQ ID NOs: 88 a 93). O nível de apoptose é expresso em % de Anexina V*/PI-. Os anticorpos policlonais anticEMPD de IgE purificados a partir de soros de cobaias por cromatografia em proteína A foram diluídos de 1000 a 62,5 ng/mL por uma diluição em série 2 vezes. XOLAIRO, um anticorpo monocional anti-lgE humanizado, foi usado como controle positivo. O EC5o de cada conjunto de anticorpos policlonais anti-EMPD de IgE é mostrado no gráfico e foi calculado por regressão não linear com ajuste de curva logística de quatro parâmetros com construtos de imunógeno com SEQ ID NOs de 88, 90 e 93 mostrando a melhor eficácia na indução de apoptose de células B de mIgEL.

[0036] A Figura 8 é um gráfico de barras que mostra a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC) de células Ramos que expressam mlgE.FcL induzidas por anticorpos policlonais anti-EMPD de IgE direcionados a construtos de imunógeno EMPD de IgE (SEQ ID NOs: 88 a 93) em uma razão efetor/alvo de 1/30. Anticorpos policlonais anti-EMPD de IgE purificados a partir de soros de cobaias por cromatografia em proteína A foram utilizados a 10 ug/mL. As células esplênicas de camundongo estimuladas por IL-2 foram usadas como células efetoras e 5D5, um anticorpo monoclonal anti-IgE de camundongo, foi usado como controle positivo.

[0037] A Figura 9 é um esquema que ilustra o mapeamento de epítopos para análise de especificidade fina por ELISA usando peptídeos de 10-mer sobrepostos que cobrem os aminoácidos 9-50 de EMPD de IgE por soros imunes de porquinhos-da-índia. O epítopo predominante reconhecido por anticorpos nas amostras de soro era específico da região que representa a estrutura em alça de EMPD de IgE. Este esquema ilustra uma alça interna formada por uma ponte dissulfeto intramolecular entre os aminoácidos C18 e C39 na EMPD de IgE nativa. O soro foi diluído 1:1000 para mapeamento de epítopos. As placas ELISA foram revestidas com peptídeos de 10-mer (0,5 ug de peptídeo por poço). Os sítios reativos foram identificados através de estudo de mapeamento de epítopos, utilizando amostras de soro imune coletadas de porquinhos-da-índia previamente imunizados com construtos de imunógeno com SEQ ID NOs: 88, 89, 93, 96 e 97 e marcadas de acordo.

[0038] A Figura 10 é um esquema que ilustra um projeto experimental para avaliar respostas imunes primárias e secundárias induzidas por papaína após imunização com construtos de imunógeno de peptídeo da presente descrição. Camundongos híbridos IGHE knockin humanos foram imunizados intramuscularmente (im) com um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE três vezes nas semanas O, 3 e 5. No modelo de resposta IgE primária, os camundongos foram desafiados subcutaneamente (sc) com papaína/TiterMax Gold na semana 10 e a IgE humana específica da papaína (hlgE) foi medida na semana 12 (mostrada na Fig. 13). Na resposta IgE secundária, os camundongos foram desafiados subcutaneamente com papaína/TiterMax Gold novamente na semana 16 e a IgE humana específica da papaína (hlgE) foi medida na semana 18 (mostrada na Fig. 14). O soro de camundongos imunizados também foi testado ao longo do estudo para a produção de anticorpos anti-lgE (Fig. 11) e alterações na IgE sérica (Fig. 12).

[0039] A Figura 11 é um gráfico que ilustra a cinética da produção de anticorpos anti-lgE durante um período de 20 semanas usando o projeto experimental descrito na Fig. 10. Especificamente, o gráfico mostra a resposta do anticorpo em camundongos híbridos IGHE knockin humanos (hlIGHE x Balb/crº n = 8 por grupo) imunizados intramuscularmente com um construto de imunógeno EMPD de IgE (SEQ ID NO: 88 ou 93) nas doses indicadas (100 uL por imunização) três vezes nas semanas 0, 3 e 5 e subcutaneamente desafiado com papaína/TiterMax nas semanas 10 e 16. O soro de camundongo foi diluído de 1:100 a 1:(4,19x10ºpor uma diluição em série 4 vezes. As placas ELISA foram revestidas com uma proteína recombinante contendo EMPD de IgE, y1-em67. O título de um soro testado, expresso como Log (ECso) do fator de diluição, foi calculado por regressão não linear com ajuste de curva logística de quatro parâmetros.

[0040] A Figura 12 é um gráfico que ilustra as alterações da IgE sérica durante um período de 20 semanas usando o projeto experimental descrito na Fig. 10.Especificamente, o gráfico mostra o nível de IgE sérica em camundongos híbridos IGHE knockin humanos (hIGHE x Balb/c, n = 8 por grupo) imunizados intramuscularmente com um construto de imunógeno EMPD de IgE (SEQ ID NO: 88 ou 93) nas doses indicadas (100 uL por imunização) três vezes nas semanas 0, 3 e 5 e subcutaneamente desafiado com papaína/TiterMax nas semanas e 16. A IgE sérica foi medida em um ELISA quantitativo de IgE humana (hlgE). O soro de camundongo foi diluído a 1:20. A hlgE purificada a partir de células de mieloma U266 foi usada para gerar uma curva padrão. A concentração de IgE foi calculada interpolando o Aaso para uma curva padrão gerada por regressão não linear usando quatro parâmetros de ajuste logístico da curva.

[0041] A Figura 13 é um gráfico que mostra a supressão da produção de IgE humana específica de papaína (hlgE) na resposta de IgE primária medida na semana 12, usando o projeto experimental descrito na Fig. 10. Especificamente, camundongos híbridos IGHE knockin humanos (hl!GHE x Balb/c, n = 8 por grupo) foram imunizados intramuscularmente com um construto de imunógeno EMPD de IgE (SEQ ID NO: 88 ou 93) nas doses indicadas (100 ul por imunização) três vezes nas semanas 0, 3 e 5. A hlgE específica da papaína no soro foi medida em um ELISA quantitativo. O soro de camundongo foi diluído 1:10. Uma hIgE quimérica monoclonal específica da papaína foi usada para gerar uma curva padrão. A concentração de hlgE específica de papaína foi calculada interpolando o As5o para uma curva padrão gerada por regressão não linear usando quatro parâmetros de ajuste logístico da curva.

[0042] A Figura 14 mostra a supressão da produção de IgE humana específica de papaína (hlgE) na resposta secundária de IgE medida na semana 18 usando o projeto experimental descrito na Fig. 10. Especificamente, camundongos híbridos IGHE knockin humanos (hIGHE x Balb/c, n = 8 por grupo) imunizados intramuscularmente com um construto de imunógeno EMPD de IgE (SEQ ID NO: 88 ou 93) nas doses indicadas (100 uL por imunização) três vezes nas semanas O, 3 e 5. A hlgE específica da papaína no soro foi medida em um ELISA quantitativo. O soro de camundongo foi diluído a 1:10. Uma hIlgE quimérica monoclonal específica da papaína foi usada para gerar uma curva padrão. A concentração de hlgE específica de papaína foi calculada interpolando o Asso para uma curva padrão gerada por regressão não linear usando quatro parâmetros de ajuste logístico da curva.

[0043] A Figura 15 é um esquema que ilustra um projeto experimental para avaliar a sensibilização induzida por papaína e recuperar respostas imunes primárias e secundárias induzidas por papaína após imunização com construtos de imunógeno de peptídeo da presente descrição. Os camundongos híbridos IGHE knockin humanos foram subcutaneamente (sc) sensibilizados com papaína/TiterMax Gold na semana O e, em seguida, imunizados intramuscularmente com um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE três vezes nas semanas 3, 6 e 8. A resposta de recuperação imune específica de papaína foi desencadeada por injeção intradérmica da pata com papaína em solução de PBS na semana 12. Os níveis de IgE total e IgE/IgG específica de papaína foram avaliados entre as semanas 0 a 6 do experimento (Fig. 16) e o nível de IgE específica de papaína foi avaliado nas semanas 12, 13 e 14 (Fig. 17).

[0044] A Figura 16 contém gráficos que mostram o resultado da sensibilização de todos os camundongos híbridos IGHE knockin humanos com papaína, usando o projeto experimental descrito na Fig.

15. O título de IgG de camundongo específico de papaína expresso em Log (EC5o) e IgE humana (ng/mL) foi detectado durante um período de 6 semanas. Além disso, o nível total de IgE (ng/mL) aumentou devido à ativação do espectador.

[0045] A Figura 17 é um gráfico que mostra a supressão da produção de IgE humana específica de papaína (hlgE) nas semanas 12, 13 e 14 usando o projeto experimental descrito na Fig. 15. Especificamente, o gráfico mostra a resposta de recuperação específica de papaína em camundongos híbridos IGHE knockin humanos sensibilizados (hiIGHE x Balb/c, n = 8 por grupo) imunizados intramuscularmente com SEQ ID NO: 88 ou 93 a 400 ug/mL (100 ul por imunização) três vezes nas semanas 3, 6 e 8. A hlgE específica da papaína no soro foi medida em um ELISA quantitativo. O soro de camundongo foi diluído a 1:10. Uma hIlgE quimérica monocional específica da papaína (ng/ mL) foi usada para gerar uma curva padrão. A concentração de hlgE específica de papaína foi calculada interpolando o Asso para uma curva padrão gerada por regressão não linear usando quatro parâmetros de ajuste logístico da curva.

[0046] As Figuras 18A e 18B são gráficos que mostram a imunogenicidade de formulações de prtótipo de vacinas contra alergias imunoterapêuticas em macacos cynomolgus imunizados com um construto de imunógeno EMPD de IgE (SEQ ID NO: 88) em quatro dosagens de 30, 100, 300 e 1000 ug por dose mais uma formulação de controle de placebo nas semanas O, 3 e 6 nas doses indicadas e testada para títulos de EMPD anti-lgE por ELISA. A Figura 18A mostra a resposta do anticorpo em macacos imunizados com uma formulação contendo Montanide'Y ISA 51 e CpG ODN. A Figura 18B mostra a resposta do anticorpo em macacos imunizados com uma formulação contendo ADJUPHOS e CpG ODN.

[0047] A Figura 19 são gráficos que ilustram a cinética da resposta de anticorpos durante um período de 20 semanas em macacos cynomolgus (2 machos e 2 fêmeas por grupo) imunizados intramuscularmente com um construto de imunógeno (SEQ ID NOs: 125 ou 126) a 300 pug/mL (500 uL por imunização) três vezes nas semanas 0,3 e 6. O soro de macaco foi diluído de 1:100 a 1:(4,19x108) por uma diluição em série 4 vezes. As placas ELISA foram revestidas com SEQ ID NO: 5. O título de um soro testado, expresso como Log10 do fator de diluição, foi calculado por regressão não linear com ajuste de curva logística de quatro parâmetros. Um ponto de corte foi estabelecido em 2 vezes a Asso média de todas as amostras de soro na diluição de 1:100.

[0048] A Figura 20 ilustra a cinética das respostas de anticorpo de IgG, IgA e IgM durante um período de 20 semanas em macacos cynomolgus (2 machos e 2 fêmeas por grupo) imunizados intramuscularmente com um construto de imunógeno EMPD de IgE (SEQ ID NO: 125 ou 126) a 300 ug/mL (500 uL por imunização) três vezes nas semanas O, 3 e 6. O soro de macaco foi diluído de 1:100 a 1:(4,19x108) por uma diluição em série 4 vezes. As placas ELISA foram revestidas com um peptídeo EMPD de IgE 1-39 (SEQ ID NO: 5). O título, expresso como Logao, foi calculado interoperando um ponto de corte para uma curva logística de quatro parâmetros gerada a partir dos dados de cada soro testado. Um ponto de corte foi estabelecido em 2 vezes a Asso média de todas as amostras de soro na diluição de 1:100.

[0049] A Figura 21 são gráficos que ilustram as alterações do nível de IgE sérica durante um período de 20 semanas em macacos cynomolgus (2 machos e 2 fêmeas por grupo) imunizados intramuscularmente com um construto de imunógeno EMPD de IgE (SEQ ID NO: 125 ou 126) a 300 ug/mL (500 uL por imunização) três vezes nas semanas O, 3 e 6. O nível de IgE sérica foi medido em um ELISA quantitativo de IgE para macacos. O soro de macaco foi diluído a 1:20. A IgE de macaco foi usada para gerar uma curva padrão. À concentração de IgE foi calculada interpolando o Asso para uma curva padrão gerada por regressão não linear usando quatro parâmetros de ajuste logístico da curva. Os resultados são média + SD. O teste t pareado com uma hipótese bicaudal foi utilizado para identificar a diferença estatística para a semana 0: * P <0,05, **P <0,01 e ***P <0,001.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0050] A presente descrição é direcionada a construtos de imunógeno de peptídeo direcionando o domínio proximal da membrana extracelular (EMPD) da IgE ligada à membrana (ou EMPD de IgE). À presente descrição também é direcionada a composições contendo os construtos de imunógeno de peptídeo, métodos de produção e uso dos construtos de imunógeno de peptídeo e anticorpos produzidos por um hospedeiro que é imunizado pelos construtos de imunógeno de peptídeo.

[0051] Os construtos de imunógeno de peptídeo divulgados contêm cerca de 20 ou mais aminoácidos. Os construtos de imunógeno de peptídeo contêm um epítopo da célula B da sequência de 67 aminoácidos da EMPD de IgE de comprimento completo (SEQ ID NO: 1). O epítopo da célula B pode ser ligado a um epítopo heterólogo de células T (Th) derivado de proteínas patogênicas através de um espaçador heterólogo opcional. Os construtos de imunógeno de peptídeo divulgados estimulam a geração de anticorpos altamente específicos direcionados contra EMPD de IgE e podem se ligar à proteína recombinante contendo EMPD de IgE, y1-em67 e/ou EMPD de IgE em células B portadoras de mIgE. Os construtos de imunógeno de peptídeo divulgados podem ser usados como uma imunoterapia universal, independente de alérgenos, econômica e para pacientes globais que sofrem de doenças alérgicas mediadas por IgE.

[0052] A porção do epítopo da célula B dos construtos de imunógeno de peptídeo possui sequências de aminoácidos da sequência de EMPD de IgE de comprimento completo (SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, o epítopo da célula B tem uma sequência contendo a alça intramolecular interna de EMPD de IgE formada por cisteínas endógenas (C18-C39), de acordo com a numeração da sequência EMPD de |gE de comprimento completo (SEQ ID NO: 1). Em certas modalidades específicas, o epítopo da célula B tem uma sequência de aminoácidos de EMPD de IgE-1-39 (SEQ ID NO: 5), EMPD de IgE-7-40 (SEQ ID NO: 6), EMPD de IgE-19-38 (SEQ ID NO: 8) ou EMPD de IgE-1-40 (SEQ ID NO: 9).

[0053] Os construtos de imunógeno de peptídeo da presente descrição podem conter uma sequência de aminoácidos heteróloga de epítopo Th derivada de uma proteína patogênica (por exemplo, SEQ ID NOs: 59 a 87). Em certas modalidades, o epítopo heterólogo de Th é derivado de patógenos naturais, como Toxina de Difteria (SEQ ID NO: 63), Plasmodium Falciparum (SEQ ID NO: 64), Toxina de Cólera (SEQ ID NO: 66). Em outras modalidades, o epítopo Th heterólogo é um epítopo Th idealizado artificial derivado da proteína de Fusão do Vírus do Sarampo (MVF 1 a 5) ou do antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg 1 a 3) na forma de sequência única (por exemplo, SEQ ID NOs: 60, 67, 72, e 73 ou de sequências combinatórias (por exemplo, SEQ ID NOs: 70, 69 e 71).

[0054] Em algumas modalidades, os construtos de imunógeno de peptídeo contêm um epítopo da célula B de EMPD de IgE ligado a um epítopo heterólogo de célula T auxiliar (Th) através de um espaçador heterólogo opcional. O espaçador heterólogo opcional pode ser uma molécula ou estrutura química capaz de ligar dois aminoácidos e/ou peptídeos juntos. Em certas modalidades, o espaçador é um aminoácido de ocorrência natural, um aminoácido de ocorrência não natural ou uma combinação dos mesmos.

[0055] Em certas modalidades, os construtos de imunógeno de peptídeo contêm um sítio antigênico da célula B com mais de cerca de aminoácidos de EMPD de IgE-1-40 (SEQ ID NO: 9) ligado a um epítopo Th heterólogo derivado de uma proteína patogênica (por exemplo, SEQ ID NOs: 59 a 87) através de um espaçador heterólogo opcional. Em modalidades específicas, os construtos de imunógeno de peptídeo têm a sequência de aminoácidos de SEQ ID NOs: 88-95, 98- 124 e 130.

[0056] A presente descrição também é direcionada a composições contendo um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE. Em algumas modalidades, as composições divulgadas contêm mais de um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE. Em certas modalidades, as composições contêm uma mistura de construtos de imunógeno de peptídeo contendo uma porção de epítopo da célula B de EMPD de IgE-1-39 ligada a diferentes epítopos de Th (por exemplo, qualquer combinação de SEQ ID NOs: 98-124) para cobrir um amplo contexto genético em pacientes. As composições contendo uma mistura de construtos de imunógeno de peptídeo podem levar a uma porcentagem mais alta na taxa de resposta após a imunização da vacina para o tratamento de doenças alérgicas mediadas por IgE em comparação com composições contendo apenas um único construto de imunógeno de peptídeo.

[0057] A presente descrição também é direcionada a composições farmacêuticas, incluindo formulações de vacina, para o tratamento e/ou prevenção de doenças alérgicas mediadas por IgE. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas contêm os construtos de imunógeno de peptídeo divulgados na forma de um complexo imunoestimulatório estabilizado formado através de associações eletrostáticas por mistura de um oligômero CpG com uma composição contendo um complexo de imunógeno de peptídeo. Tais complexos imunoestimulatórios estabilizados são capazes de aumentar ainda mais a imunogenicidade dos construtos de imunógeno de peptídeo Em algumas — modalidades, as composições farmacêuticas contêm adjuvantes como sais minerais, incluindo gel de alúmen (ALHYDROGEL), fosfato de alumínio (ADJUPHOS) ou emulsões de água em óleo, incluindo MONTANIDE ISA 51 ou 720.

[0058] A presente descrição também é direcionada a anticorpos direcionados contra os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE divulgados. Em particular, os construtos de imunógeno de peptídeo da presente descrição são capazes de estimular a geração de anticorpos altamente específicos que são reativos cruzados com a porção do epítopo da célula B de EMPD de IgE dos construtos de imunógeno de peptídeo. Os anticorpos divulgados se ligam com alta especificidade a EMPD de IgE sem muito, se houver, direcionados aos epítopos Th heterólogos empregados para intensificação de imunogenicidade, que contrasta fortemente com anticorpos produzidos usando proteínas convencionais ou outros transportadores biológicos usados para essa intensificação de antigenicidade de peptídeo. Assim, os construtos de imunógeno de peptídeo divulgados são capazes de quebrar a tolerância imune contra o autoantígeno, com uma alta taxa de resposta, em comparação com outros imunógenos peptídicos ou proteicos.

[0059] Em certas modalidades, os anticorpos são direcionados contra e se ligam especificamente à sequência de aminoácidos EMPD de IgE-1-52 (SEQ ID NO: 2), à sequência de aminoácidos EMPD de IgE- 1-67 (SEQ ID NO: 1) e fragmentos do mesmo (por exemplo, SEQ ID

NOs: 5 e 6) quando os construtos de imunógeno de peptídeo são administrados a um sujeito. Os anticorpos altamente específicos produzidos pelos construtos de imunógeno de peptídeo são reativos com peptídeos e proteínas solúveis em EMPD de IgE, peptídeos e proteínas de fusão contendo EMPD de IgE, y1-em67 e/ou EMPD de IgE em células B portadoras de IgE ligadas à membrana. Os anticorpos gerados são capazes de se ligar e reticular o receptor de células B da IgE (BCR) nos linfócitos B que expressam mlIgE. Essa reticulação induz efeitos citolíticos como apoptose e citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC), o que leva à redução da produção sérica de IgE.

[0060] Com base em suas características e propriedades únicas, os anticorpos divulgados são capazes de fornecer uma abordagem imunoterapêutica universal para o tratamento de doenças alérgicas mediadas por IgE, independentemente do(s) alérgeno(s) causador(es).

[0061] A presente descrição também é direcionada a métodos para fabricar os construtos, composições e anticorpos de imunógenos de peptídeo divulgados. Os métodos divulgados proporcionam a fabricação de baixo custo e controle de qualidade de construtos e composições de imunógenos de peptídeo contendo os construtos, que podem ser usados em métodos para o tratamento de doenças alérgicas mediadas por IgE, independentemente do(s) alérgeno(s) causador(es).

[0062] A presente descrição também inclui métodos para tratamento e/ou prevenção de doenças alérgicas mediadas por IgE, independentemente do alérgeno(s) causador(es) utilizando os construtos de imunógeno de peptídeo divulgados e/ou anticorpos direcionados contra os construto de imunógenos de peptídeo. Em algumas modalidades, os métodos para o tratamento e/ou prevenção de doenças alérgicas mediadas por IgE, incluindo administrar a um hospedeiro de uma composição contendo um construto de imunógeno de peptídeo divulgado. Em certas modalidades, as composições utilizadas nos métodos contêm um construto de imunógeno de peptídeo divulgado na forma de um complexo imunoestimulador estável com oligonucleotídeos carregados negativamente, como oligôêômeros CpG, por meio de associação eletrostática, que podem ainda ser suplementados com um adjuvante, para administração a pacientes com doenças alérgicas mediadas por IgE. Os métodos divulgados também incluem regimes de dosagem, formas de dosagem e rotas para administrar os construtos de imunógeno de peptídeo a um hospedeiro em risco de, ou com, doenças alérgicas mediadas por IgE.

[0063] Os títulos de seções usados aqui são para fins organizacionais apenas e não serão interpretados como limitando a matéria descrita. Todas as referências ou partes de referências citadas neste pedido são expressamente incorporados por referência aqui na íntegra para qualquer finalidade.

[0064] A menos que explicado de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado conforme comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Os termos singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Da mesma forma, a palavra "ou" deve incluir "e", a menos que o contexto indique claramente o contrário. Portanto, a frase "compreendendo A ou B" significa incluindo A, ou B ou A e B. Deve-se entender ainda que todos os tamanhos de aminoácidos e todos os valores de peso molecular ou massa molecular, dados para polipeptídeos, são aproximados, e são fornecidos para descrição. Embora os métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou teste do método divulgado, métodos e materiais adequados são descritos a seguir. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas para referência em suas totalidades. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo explicações de termos, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos descritos neste documento são ilustrativos apenas e não se destinam a ser um fator limitativo. Construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE

[0065] A presente descrição fornece construtos de imunógeno de peptídeo contendo um epítopo da célula B com uma sequência de aminoácidos de EMPD de IgE ligada covalentemente a um epítopo heterólogo de células T (Th) auxiliar diretamente ou através de um espaçador heterólogo opcional.

[0066] A frase "construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE" ou "construtos de imunógeno de peptídeo", como utilizada neste documento, refere-se a um peptídeo contendo (a) um epítopo da célula B com cerca de 20 ou mais resíduos de aminoácidos da sequência de 67 aminoácidos da EMPD de IgE de comprimento completo (SEQ ID NO: 1); (b) um epítopo Th heterólogo; e (c) um espaçador heterólogo opcional.

[0067] Em certas modalidades, o construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE pode ser representado pelas fórmulas:

[0068] O construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE pode ser representado pelas fórmulas: (Th)mnHA) (fragmento de EMPD de IgE)XX ou (fragmento de EMPD de IgE)-(A))>—HTh)mWX ou (Th)mn—>H(A))(fragmento de EMPD de IGgE)(A))(Th)nWX em que Th é um epítopo auxiliar T heterólogo; A é um espaçador heterólogo;

(fragmento de EMPD de IgE) é um epítopo da célula B com cerca de 20 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos de EMPD de IgE; X é um a-COOH ou a-CONH72 de um aminoácido; m é de 1 a cerca de 4; e n é de O a cerca de 10.

[0069] Os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE da presente descrição foram projetados e selecionados com base em uma série de razões. Várias dessas justificativas incluem o emprego de um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE que: ié não imunogênico por si só, uma vez que é uma automolécula; ii. pode ser tornado imunogênico por um transportador de proteína ou um epítopo auxiliar T potente; iii. quando tornado imunogênico e administrado a um hospedeiro: a. provoca anticorpos de alto título direcionados contra a sequência peptídica EMPD de IgE (epítopo da célula B) e não contra o(s) transportador(es) de proteína ou epíitopo(s) auxiliar(es) T; b. quebra a tolerância imune no hospedeiro imunizado e gera anticorpos altamente específicos com reatividade cruzada com a EMPD de IgE (SEQ ID NO: 1) como uma proteína recombinante purificada a partir de células CHO que expressam mIgE.FcL ou na membrana de uma célula B portadora de mIgE (por exemplo, Ramos) transfectada com DNA recombinante que codifica mlgE.FcL; c. gera anticorpos altamente específicos capazes de induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e apoptose de linfócitos B que expressam IgE in vitro (Exemplo 6); e d. gera anticorpos altamente específicos capazes de levar à redução in vivo do nível basal de IgE no sangue e também uma redução significativa do nível de IgE específico do antígeno no início e no aumento com desafios por alérgenos (Exemplos 8 a 11).

[0070] Os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE divulgados e formulações dos mesmos podem funcionar efetivamente como vacinas para reduzir ou eliminar a patologia alérgica mediada por IgE em pacientes que sofrem de doenças alérgicas mediadas por IgE.

[0071] Os vários componentes do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE divulgado são descritos em mais detalhes abaixo. a. Epítopo de células B de EMPD de IgE

[0072] A presente descrição é direcionada a uma nova composição de peptídeo para a geração de anticorpos policlonais de alto título com especificidade para o peptídeo EMPD de IgE, com reatividades cruzadas à IgE ligada à membrana expressa em células B humanas comprometidas com a secreção de IgE. A especificidade do sítio da composição de peptídeo através de esforços de projetos racionais minimiza a geração de anticorpos que são direcionados a sítios irrelevantes nas proteínas transportadoras.

[0073] O termo "IgE", como utilizado neste documento, refere-se à imunoglobulina E em qualquer forma, incluindo IgE segregada, IgE ligada à membrana e fragmentos dos mesmos. As formas de IgE secretadas e ligadas à membrana são ilustradas na Figura 2A.

[0074] O termo "mIgE", como utilizado neste documento, refere-se especificamente à forma de IgE ligada à membrana e fragmentos dos mesmos. Em algumas modalidades, o mIgE é a forma de IgE ligada à membrana em humanos tendo uma sequência de aminoácidos relatada como uma forma 2 da região C da cadeia épsilon de lg - humana (fragmento); Número de Acessão PH1215. A IgE ligada à membrana é ilustrada na Figura 2A (lado direito).

[0075] O termo "EMPD de IgE", como utilizado neste documento, refere-se ao domínio proximal da membrana extracelular (EMPD) da IgE ligada à membrana (mIgE) e fragmentos dos mesmos. EMPD de IgE também é referido como CemX, que está localizado entre o domínio CH4 e o peptídeo transmembranar de ancoragem à membrana C- terminal e é encontrado exclusivamente nas células mlgE B. O EMPD da IgE resulta de uma junção alternativa do transcrito de RNA e a 156- bp a montante do sítio aceitador de junção usado pela isoforma "curta". Aisoforma EMPD "longa" completa de IgE humana tem 67 aminoácidos de comprimento (SEQ ID NO: 1), que inclui 52 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) que não estão presentes na isoforma "curta". A IgE ligada à membrana é ilustrada na Figura 2A com a porção EMPD intensificada. A sequência de aminoácidos de EMPD de IgE de comprimento completo (SEQ ID NO: 1) e fragmentos dos mesmos (SEQ ID NOs: 2-58 e 127) são mostradas na Tabela 1.

[0076] A EMPD de IgE contém uma alça intramolecular entre cisteínas endógenas (C18-C39) com base na numeração de aminoácidos das sequências de 67 aminoácidos e 52 aminoácidos de EMPD de IgE (SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente). A alça intramolecular interna da IgE é ilustrada na Figura 9.

[0077] O epítopo da célula B dos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE contém a estrutura de alça intramolecular de EMPD de IgE, ou porções dos mesmos. Em certas modalidades, o epítopo da célula B contém de cerca de 20 a cerca de 40 aminoácidos de EMPD de IgE.

[0078] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos da porção do epítopo da célula B do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE contém cerca de 20 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos da EMPD de IgE de comprimento completo (SEQ ID NO:1). Em certas modalidades, o epítopo da célula B contém uma sequência de aminoácidos da alça intramolecular interna da EMPD de IgE formada por cisteínas endógenas (C18-C39) de acordo com a numeração da EMPD de IgE de comprimento completo (SEQ ID NO: 1). Em modalidades específicas, a sequência do epítopo da célula B termina com o resíduo Arg (R) em 38, Cys (C) em 39 ou His (H) em 40 no C- terminal da estrutura de alça intramolecular da EMPD de IgE.

[0079] Em algumas modalidades, o epítopo da célula B possui uma sequência de aminoácidos de EMPD de IgE-1-39 (SEQ ID NO: 5), EMPD de IgE-7-40 (SEQ ID NO: 6), EMPD de IgE-19-38 (SEQ ID NO: 8) ou EMPD de IgE-1-40 (SEQ ID NO: 9), como mostrado na Tabela 1.

[0080] O fragmento de EMPD de IgE da presente descrição também inclui análogos ou homólogos imunologicamente funcionais dos peptídeos de EMPD de IgE (SEQ ID NOs: 5, 6, 8 e 9) e mais de 20 fragmentos de aminoácidos dos mesmos. Análogos imunológicos funcionais ou homólogos do peptídeo EMPD de IgE e mais de 20 fragmentos de aminoácidos dos mesmos incluem variantes que retêm substancialmente a mesma imunogenicidade que o peptídeo original. Análogos imunologicamente funcionais podem ter uma substituição conservadora na posição de aminoácidos; uma mudança na carga geral; uma ligação covalente a outra fração; ou adições, inserções ou deleções de aminoácidos; e/ou qualquer combinação dos mesmos. b. Epítopos heterólogos de células T auxiliares (epítopos Th)

[0081] A presente descrição fornece construtos de imunógeno de peptídeo contendo um epítopo da célula B de EMPD de IgE ligada covalentemente a um epítopo heterólogo de células T (Th) auxiliar diretamente ou através de um espaçador heterólogo opcional.

[0082] O epítopo Th heterólogo no construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE aumenta a imunogenicidade do fragmento EMPD de IgE, o que facilita a produção de anticorpos específicos de alto título direcionados contra o epítopo da célula B alvo otimizado (isto é, o fragmento EMPD de IgE) através de um projeto racional.

[0083] O termo "heterólogo", como utilizado neste documento, refere-se a uma Sequência de aminoácidos que é derivada de uma

Sequência de aminoácidos que não faz parte ou é homóloga com a Sequência de tipo selvagem de EMPD de IgE. Assim, um epítopo Th heterólogo é um epítopo Th derivado de uma Sequência de aminoácidos que não é encontrada naturalmente em EMPD de IgE (isto é, o epítopo Th não é autólogo à EMPD de IgE). Uma vez que o epítopo Th é heterólogo ao EMPD de IgE, a sequência natural de aminoácidos do EMPD de IgE não é estendida nas direções N-terminal ou C-terminal quando o epítopo Th heterólogo está covalentemente ligado ao fragmento EMPD de IgE.

[0084] O epítopo Th heterólogo da presente descrição pode ser qualquer epítopo Th que não tenha uma sequência de aminoácidos naturalmente encontrada em EMPD de IgE. O epítopo Th também pode ter motivos de ligação promíscuos a moléculas de MHC classe Il de múltiplas espécies. Em certas modalidades, o epítopo Th compreende vários motivos promíscuos de ligação ao MHC classe || para permitir a ativação máxima de células T auxiliares levando à iniciação e regulação das respostas imunes. O epítopo Th é preferencialmente imunossilente por si só, isto é, poucos, se houverem, dos anticorpos gerados pelos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE serão direcionados para o epítopo Th, permitindo assim uma resposta imune muito focada direcionada ao epítopo da célula B alvo do fragmento EMPD de IgE.

[0085] Os epítopos da presente descrição incluem, mas não estão limitados a, sequências de aminoácidos derivadas de patógenos estranhos, como exemplificado na Tabela 2 (SEQ ID NOs: 59-87). Além disso, os epítopos Th incluem epítopos Th artificializados idealizados e epítopos Th combinados idealizados artificiais (por exemplo, SEQ ID NOs: 60 e 67-73). Os peptídeos heterólogos do epítopo Th, apresentados como uma sequência combinatória (por exemplo, SEQ ID NOs: 68-71), contêm uma mistura de resíduos de aminoácidos representados em posições específicas dentro da estrutura do peptídeo com base nos resíduos variáveis de homólogos para esse peptídeo em particular. Um conjunto de peptídeos combinatórios pode ser sintetizado em um processo adicionando uma mistura dos aminoácidos protegidos designados, em vez de um aminoácido particular, em uma posição especificada durante o processo de síntese. Tais conjuntos de peptídeos de epítopo Th heterólogos combinatórios podem permitir uma ampla cobertura de epítopo Th para animais com um fundo genético diverso. Sequências combinatórias representativas de peptídeos heterólogos do epítopo Th incluem SEQ ID NOs: 68-71, as quais são mostradas na Tabela 2. Os peptídeos epitópicos da presente invenção fornecem ampla reatividade e imunogenicidade para animais e pacientes de populações geneticamente diversas.

[0086] Os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE compreendendo epítopos Th são produzidos simultaneamente numa única síntese peptídica em fase sólida em conjunto com o fragmento EMPD de IgE. Os epítopos Th também incluem análogos imunológicos dos epítopos Th. Os análogos Th imunológicos incluem análogos de intensificação imunológica, análogos de reatividade cruzada e segmentos de qualquer um desses epítopos de Th que são suficientes para intensificar ou estimular uma resposta imune aos fragmentos de EMPD de IgE.

[0087] Os análogos imunologicamente funcionais dos peptídeos do epítopo Th também são eficazes e incluídos como parte da presente invenção. Os análogos imunológicos funcionais de Th podem incluir substituições, adições, deleções e inserções conservadoras de um a cerca de cinco resíduos de aminoácidos no epítopo Th que não modificam essencialmente a função estimulante de Th do epítopo Th. As substituições, adições e inserções conservativas podem ser realizadas com aminoácidos naturais ou não naturais, como descrito acima para os fragmentos de EMPD de IgE. A Tabela 2 identifica outra variação de um análogo funcional para o peptídeo do epítopo Th. Em particular, SEQ ID NOs: 60 e 67 de MvF1 e MvF2 Th são análogos funcionais de SEQ ID NOs: 70 e 72 de MvF4 e MvF5, pois diferem na estrutura de aminoácidos pela deleção (SEQ ID NOs: 60 e 67) ou a inclusão (SEQ ID NOs: 70 e 72) de dois aminoácidos cada um nos N e C-terminais. As diferenças entre essas duas séries de sequências análogas não afetariam a função dos epítopos Th contidos nessas sequências. Portanto, os análogos imunológicos funcionais de Th incluem várias versões do epítopo Th derivado da proteína MvF14 Ths do vírus do sarampo (SEQ ID NOs: 60, 67, 68, 70 e 72) e da proteína de superfície da hepatite HBsAg 1-3 Ths (SEQ ID NOs: 69, 71 e 73).

[0088] O epítopo Th no construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE pode ser ligado covalentemente na extremidade N ou C-terminal do fragmento de peptídeo EMPD de IgE. Em algumas modalidades, o epítopo Th está covalentemente ligado à extremidade N-terminal do fragmento de peptídeo EMPD de IgE. Em outras modalidades, o epítopo Th está covalentemente ligado à extremidade C-terminal do fragmento de peptídeo EMPD de IgE. Em certas modalidades, mais de um epítopo Th está covalentemente ligado ao fragmento de EMPD de IgE. Quando mais de um epítopo Th está ligado ao fragmento EMPD de IgE, cada epítopo Th pode ter a mesma sequência de aminoácidos ou diferentes sequências de aminoácidos. Além disso, quando mais de um epítopo Th está ligado ao fragmento EMPD de IgE, os epítopos Th podem ser organizados em qualquer ordem. Por exemplo, os epítopos Th podem ser ligados consecutivamente à extremidade N-terminal do fragmento EMPD de IgE ou consecutivamente ligados à extremidade C-terminal do fragmento EMPD de IgE ou um epítopo Th pode ser covalentemente ligado à extremidade N-terminal do fragmento EMPD de IgE enquanto um epítopo Th separado é covalentemente ligado à extremidade C- terminal do fragmento EMPD de IgE. Não há limitação no arranjo dos epítopos Th em relação ao fragmento EMPD de IgE.

[0089] Em algumas modalidades, o epítopo Th é covalentemente ligado ao fragmento de EMPD de IgE diretamente. Em outras modalidades, o epítopo Th é covalentemente ligado ao fragmento de EMPD de IgE através de um espaçador heterólogo descrito em mais detalhes abaixo. c. Espaçador heterólogo

[0090] Os construtos de imunógeno de peptídeo de EMPD de IgE divulgados contêm opcionalmente um espaçador heterólogo que liga covalentemente o epítopo da célula B do EMPD de IgE ao epítopo heterólogo da célula T (Th).

[0091] Como discutido acima, o termo "heterólogo" refere-se a uma sequência de aminoácidos que é derivada de uma sequência de aminoácidos que não faz parte ou é homóloga da sequência do tipo natural de EMPD de IgE. Assim, a sequência de aminoácidos natural de EMPD de IgE não é estendida nas direções N-terminal ou C-terminal quando o espaçador heterólogo está covalentemente ligado ao epítopo da célula B do EMPD de IgE porque o espaçador é heterólogo à sequência EMPD de IgE.

[0092] O espaçador é qualquer molécula ou estrutura química capaz de ligar dois aminoácidos e/ou peptídeos juntos. O espaçador pode variar em comprimento ou polaridade, dependendo da aplicação. A ligação do espaçador pode ser feita através de uma ligação amida ou carboxil, mas também são possíveis outras funcionalidades. O espaçador pode incluir um composto químico, um aminoácido de ocorrência natural ou um aminoácido de ocorrência não natural.

[0093] O espaçador pode fornecer características estruturais para a construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE. Estruturalmente, o espaçador fornece uma separação física do epítopo Th do epítopo da célula B do fragmento EMPD de IgE. A separação física pelo espaçador pode interromper quaisquer estruturas secundárias artificiais criadas pela união do epítopo Th ao epítopo da célula B. Além disso, a separação física dos epítopos pelo espaçador pode eliminar a interferência entre as respostas das células Th e/ou das células B. Além disso, o espaçador pode ser projetado para criar ou modificar uma estrutura secundária do construto de imunógeno de peptídeo. Por exemplo, um espaçador pode ser projetado para atuar como uma dobradiça flexível para melhorar a separação do epítopo Th e do epítopo da célula B. Um espaçador de dobradiça flexível também pode permitir interações mais eficientes entre o imunógeno de peptídeo apresentado e as células Th e células B apropriadas para intensificar as respostas imunes ao epítopo Th e ao epítopo da célula B. Exemplos de sequências que codificam dobradiças flexíveis são encontrados na região de dobradiça da cadeia pesada de imunoglobulina, que geralmente é rica em prolina. Uma dobradiça flexível particularmente útil que pode ser usada como espaçador é fornecida pela sequência Pro-Pro-Xaa-Pro- Xaa-Pro (SEQ ID NO: 128), em que Xaa é qualquer aminoácido e, de preferência, ácido aspártico.

[0094] O espaçador também pode fornecer características funcionais para a construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE. Por exemplo, o espaçador pode ser projetado para alterar a carga geral do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE, o que pode afetar a solubilidade do construto de imunógeno de peptídeo. Além disso, a alteração da carga geral do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE pode afetar a capacidade do construto de imunógeno de peptídeo de se associar a outros compostos e reagentes. Como discutido em mais detalhes abaixo, o construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE pode ser formado em um complexo imunoestimulatório estável! com um oligonucleotídeo altamente carregado, como oligêmeros CpG por associação eletrostática. A carga global do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE é importante para a formação desses complexos imunoestimulatórios estáveis.

[0095] Os compostos químicos que podem ser usados como espaçador incluem, mas não estão limitados a, ácido (2-aminoetoxi) acético (AEA), ácido 5-aminovalérico (AVA), ácido 6-aminocapróico (Ahx), ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanóico (AEEA, mini-PEG1), ácido 12- amino-4,7,10-trioxadodecanóico — (mini-PEG2), ácido —15-amino- 4,7,10,13-tetraoxapenta-decanóico (mini-PEG3), ácido trioxatridecano- succinâmico (Ttds), ácido 12-amino-dodecanóico, ácido Fmoc-5-amino- 3-oxapentanóico (O1Pen) e semelhantes.

[0096] Os aminoácidos de ocorrência natural incluem alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.

[0097] Os aminoácidos de ocorrência não natural incluem, mas não estão limitados a, e-N Lisina, B-alanina, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, tiroxina, ácido y-amino butírico, homoserina, citrulina, ácido aminobenzóico, ácido 6-aminocapróico (Aca; ácido 6-amino- hexanóico), hidroxiprolina, ácido mercaptopropiônico (MPA), 3-nitro- tirosina, ácido piroglutâmico e semelhantes.

[0098] O espaçador no construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE pode ser ligado covalentemente na extremidade N ou C-terminal do epítopo Th e no peptídeo EMPD de IgE. Em algumas modalidades, o espaçador é covalentemente ligado à extremidade C-terminal do epítopo Th e à extremidade N-terminal do peptídeo EMPD de IgE. Em outras modalidades, o espaçador é covalentemente ligado à extremidade C-terminal do peptídeo EMPD de IgE e à extremidade N- terminal do epítopo Th. Em certas modalidades, mais de um espaçador pode ser usado, por exemplo, quando mais de um epítopo Th está presente no construto de imunógeno de peptídeo. Quando mais de um espaçador é usado, cada espaçador pode ser igual ou diferente. Além disso, quando mais de um epítopo Th está presente no construto de imunógeno de peptídeo, os epítopos Th podem ser separados com um espaçador, que pode ser igual ou diferente do espaçador usado para separar o epítopo Th do epítopo da célula B. Não há limitação na disposição do espaçador em relação ao epítopo Th ou ao fragmento EMPD de IgE.

[0099] Em certas modalidades, o espaçador heterólogo é um aminoácido de ocorrência natural ou um aminoácido de ocorrência não natural. Em outras modalidades, o espaçador contém mais de um aminoácido de ocorrência natural ou não natural. Em modalidades específicas, o espaçador é Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys, (a, e-N)Lys ou e-N- Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 129). d. Modalidades específicas dos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE

[00100] Em certas modalidades, os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE pode ser representado pelas seguintes fórmulas: (Th)mnHA) (fragmento de EMPD de IgE)XX ou (fragmento de EMPD de IgE) (A)h—(Th)n=X ou (Th)n>HA)n(fragmento de EMPD de IgE)HA) (Th) X em que Th é um epítopo auxiliar T heterólogo; A é um espaçador heterólogo; (fragmento de EMPD de IgE) é um epítopo da célula B com cerca de 20 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos de EMPD de IgE; X é um a-COOH ou a-CONH>2 de um aminoácido; m é de 1 a cerca de 4; e n é de O a cerca de 10.

[00101] Em certas modalidades, o epítopo Th heterólogo no construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE tem uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 59-87 e combinações dos mesmos, mostradas na Tabela 2. Em algumas modalidades, o construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE contém mais de um epítopo Th.

[00102] Em certas modalidades, o espaçador heterólogo opcional é selecionado de qualquer um de Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys, (a, e-N)Lys, e- N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO : 129), e combinações dos mesmos. Em modalidades específicas, o espaçador heterólogo é e-N-Lys-Lys-Lys- Lys (SEQ ID NO: 129).

[00103] Em certas modalidades, o fragmento de EMPD de IgE tem cerca de 20 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos de EMPD de IgE da SEQ ID NO: 1 ou 2. Em modalidades específicas, o fragmento de EMPD de IgE contém uma sequência de aminoácidos da alça intramolecular interna da EMPD de IgE formada por cisteínas endógenas (C18-C39) de acordo com a numeração da EMPD de IgE de comprimento completo (SEQ ID NO: 1). Em modalidades específicas, o fragmento de EMPD de IgE possui uma sequência de aminoácidos de EMPD de IgE-1-39 (SEQ ID NO: 5), EMPD de IgE-7-40 (SEQ ID NO: 6), EMPD de IgE-19-38 (SEQ ID NO: 8) ou EMPD de IgE-1-40 (SEQ ID NO: 9), como mostrado na Tabela 1.

[00104] Em certas modalidades, o construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE tem uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 88-130, como mostrado na Tabela

3. Em modalidades específicas, o construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE tem uma sequência de aminoácidos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOs: 88-95, 98-124 e 130. e. Variantes, homólogos e análogos funcionais

[00105] Também podem ser utilizadas variantes e análogos dos peptídeos imunogênicos acima que induzem e/ou reagem de maneira cruzada com anticorpos para os epítopos preferidos de EMPD de IgE. Os análogos, incluindo alélicos, espécies e variantes induzidas, diferem tipicamente dos peptídeos que ocorrem naturalmente em uma, duas ou poucas posições, geralmente em virtude de substituições conservadoras. Os análogos exibem tipicamente pelo menos 80 ou 90% de identidade de sequência com peptídeos naturais. Alguns análogos também incluem aminoácidos não naturais ou modificações de aminoácidos N ou C-terminais em uma, duas ou algumas posições.

[00106] As variantes que são análogos funcionais podem ter uma substituição conservadora na posição de aminoácidos; uma mudança na carga geral; uma ligação covalente a outra fração; ou adições, inserções ou deleções de aminoácidos; e/ou qualquer combinação dos mesmos.

[00107] As substituições conservadoras são quando um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido com propriedades químicas similares. Por exemplo, os aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; os aminoácidos polares neutros incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; os aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e os aminoácidos carregados negativamente (acídicos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico.

[00108] Numa modalidade particular, o análogo funcional tem pelo menos 50% de identidade com a sequência de aminoácidos original. Em uma outra modalidade, o análogo funcional tem pelo menos 80% de identidade com a sequência de aminoácidos original. Em ainda outra modalidade, o análogo funcional tem pelo menos 85% de identidade com a sequência de aminoácidos original. Ainda em outra modalidade,

o análogo funcional tem pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos original.

[00109] As variantes também incluem variações nos resíduos fosforilados. Por exemplo, variantes podem incluir resíduos diferentes dentro dos peptídeos que são fosforilados. Os peptídeos IHgEEMPD imunogênicos variantes também podem incluir peptídeos pseudo- fosforilados. Os peptídeos pseudo-fosforilados são gerados substituindo um ou mais dos resíduos de serina, treonina e tirosina fosforilados dos peptídeos EMPD de IgE por resíduos de aminoácidos acídicos, como ácido glutâmico e ácido aspártico. Composições

[00110] A presente descrição também fornece composições compreendendo o construto de imunógeno EMPD de IgE divulgado. a. Composições de peptídeo

[00111] As composições contendo o construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE divulgada podem estar na forma líquida ou sólida. As composições líquidas podem incluir água, tampões, solventes, sais e/ou qualquer outro reagente aceitável que não altere as propriedades estruturais ou funcionais do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE. As composições de peptídeo podem conter um ou mais dos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE divulgados. b. Composições Farmacêuticas.

[00112] Apresente descrição também é direcionada a composições farmacêuticas contendo o construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE divulgado.

[00113] As composições farmacêuticas podem conter transortadores e/ou outros aditivos em um sistema de distribuição farmaceuticamente aceitável. Por conseguinte, as composições farmacêuticas podem conter uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE juntamente com transportador,

adjuvante e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável, como diluentes, aditivos, agentes estabilizadores, conservantes, agentes solubilizantes, tampões e semelhantes.

[00114] As composições farmacêuticas podem conter um ou mais adjuvantes que atuam para acelerar, prolongar ou intensificar a resposta imune ao construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE sem ter qualquer efeito antigênico específico. Os adjuvantes utilizados na composição farmacêutica podem incluir óleos, emulsões oleosas, sais de alumínio, sais de cálcio, complexos imunoestimulantes, derivados bacterianos e viraisó, virossomas, carboidratos, citocinas, micropartículas poliméricas. Em certas modalidades, o adjuvante pode ser selecionado de alúmen (fosfato de alumínio e potássio), fosfato de alumínio (por exemplo, ADJU-PHOSO), hidróxido de alumínio (por exemplo, ALHYDROGELO), fosfato de cálcio, adjuvante de Freund incompleto (IFA), adjuvante completo de Freund, MF59 , adjuvante 65, Lipovant, ISCOM, liposina, saponina, esqualeno, L121, EmulsigenO, monofosforil lipídeo A (MPL), Quil A, QS21, MONTANIDEO ISA 35, ISA 50V, ISA 50V2, ISA 51, ISA 206, ISA 720, lipossomas, fosfolipídeos, peptidoglicano, lipopolissacarídeos (LPS), ASO1, ASO2, ASO3, ASOA4, AFO3, fosfolipídeo lipofílico (lipídio A), gama inulina, algamulina, glucanos, dextranos, glucomanônios, galactomanamidas, levanos, xilanos, brometo de dimetildioctadecilamônio (DDA), bem como outros adjuvantes e emulsificantes.

[00115] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém Montanide'Y |ISA 51 (uma composição adjuvante de óleo composta de óleo vegetal e oleato de maneto para produção de emulsões de água em óleo), Tween&O 80 (também conhecido como: Polissorbato 80 ou Polioxietileno (20) mono-oleato de sorbitano), um oligonucleotídeo CpG e/ou qualquer combinação dos mesmos. Em outras modalidades, a composição farmacêutica é uma emulsão de água em óleo em água (isto é, m/m/m) com Emulsigen ou Emulsigen D como adjuvante.

[00116] As composições farmacêuticas também podem incluir aditivos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Por exemplo, as composições farmacêuticas podem conter antioxidantes, aglutinantes, tampões, agentes de volume, transportadores, agentes quelantes, agentes corantes, diluentes, desintegrantes, agentes emulsificantes, enchimentos, agentes gelificantes, agentes tampão de pH, conservantes, agentes solubilizantes, estabilizadores e semelhantes.

[00117] As composições farmacêuticas podem ser formuladas como liberação imediata ou para formulações de liberação sustentada. Adicionalmente, as composições farmacêuticas podem ser formuladas para indução de imunidade sistêmica ou mucosa localizada através de aprisionamento de imunógeno e coadministração com micropartículas. Tais sistemas de distribuição são facilmente determinados por um versado na técnica.

[00118] As composições farmacêuticas podem ser preparadas como injetáveis, como soluções líquidas ou suspensões. Os veículos líquidos contendo o construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE também podem ser preparados antes da injeção. A composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer modo de aplicação adequado, por exemplo, i.d,, i.v., i.p., i.m., intranasal, oral, subcutâneo, etc. e em qualquer dispositivo de administração adequado. Em certas modalidades, a composição farmacêutica é formulada para administração intravenosa, subcutânea, intradérmica ou intramuscular. As composições farmacêuticas adequadas para outros modos de administração também podem ser preparadas, incluindo aplicações orais e intranasais.

[00119] As composições farmacêuticas também podem ser formuladas em uma forma de unidade de dosagem adequada. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém de cerca de 0,1 ug a cerca de 1 mg do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE por kg de peso corporal. As doses eficazes das composições farmacêuticas variam dependendo de muitos fatores diferentes, incluindo meios de administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente, se o paciente é humano ou animal, outros medicamentos administrados e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Geralmente, o paciente é um mamífero humano, mas não humano, incluindo mamíferos transgênicos, também pode ser tratado. Quando distribuídos em doses múltiplas, as composições farmacêuticas podem ser convenientemente divididas em uma quantidade apropriada por forma unitária de dosagem. A dosagem administrada dependerá da idade, peso e saúde geral do sujeito, como é bem conhecido nas técnica terapêuticas.

[00120] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém mais de um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE. Uma composição farmacêutica contendo uma mistura de mais de um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE para permitir a intensificação — sinérgica da imunoeficácia dos construtos. As composições farmacêuticas contendo mais de um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE podem ser mais eficazes em uma população genética maior devido a uma ampla cobertura de MHC classe Il, proporcionando assim uma resposta imune melhorada aos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE.

[00121] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE selecionado de SEQ ID NOs: 88-95, 98-124 e 130 (Tabela 3), bem como homólogos, análogos e/ou combinações dos mesmos.

[00122] Em certas modalidades, os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE (SEQ ID NOs: 107 e 108) com epítopos Th heterólogos derivados de MVF e HBsAg em uma forma combinatória (SEQ ID NOs: 68 e 69) foram misturadas em uma razão equimolar para uso em uma formulação de vacina para permitir a cobertura máxima da população hospedeira da vacina com um fundo genético diversificado. Observou-se uma intensificação sinérgica nos construtos de imunógeno EMPD de IgE G1-C39 e A7-C40 (SEQ ID NOs: 88 a 95) nas composições de peptídeo desta invenção e a resposta de anticorpo provocada por esses construtos (por exemplo, SEQ ID NO: 95) era principalmente (> 90%) concentrada na reatividade cruzada desejada contra o peptídeo do epítopo da célula B de EMPD de IgE (SEQ ID NO: 2) sem muito, se houver, direcionado aos epítopos Th heterólogos empregados para intensificação da imunogenicidade (Exemplo 7, Tabela 7). Isto está em nítido contraste com a proteína convencional, como KLH ou outros transportadores de proteína biológica utilizados para essa intensificação da antigenicidade do peptídeo.

[00123] Em outras modalidades, composições farmacêuticas compreendendo uma composição de peptídeo de, por exemplo, uma mistura de construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE em contato com sais minerais, incluindo gel de alúmen (ALHYDROGEL) ou fosfato de alumínio (ADJUPHOS) como adjuvante para formar uma formulação de suspensão da vacina foram usadas para administração aos hospedeiros da vacina.

[00124] As composições farmacêuticas contendo um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE podem ser usadas para provocar uma resposta imune e produzir anticorpos em um hospedeiro após a administração. c. Complexos imunoestimulatórios

[00125] Apresente descrição também é direcionada a composições farmacêuticas contendo um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE na forma de um complexo imunoestimulatório com um oligonucleotídeo CpG. Tais complexos imunoestimulatórios são especificamente adaptados para atuar como adjuvante e como estabilizador de imunógeno de peptídeo. Os complexos imunoestimulatórios estão na forma de um particulado, que pode apresentar de forma eficaz o imunógeno do peptídeo de EMPD de IgE às células do sistema imunológico para produzir uma resposta imune. Os complexos imunoestimulatórios podem ser formulados como uma suspensão —“para administração parenteral Os complexos imunoestimulatórios também podem ser formulados na forma de emulsões w/o, como uma suspensão em combinação com um sal mineral ou com um polímero gelificante in situ para a distribuição eficiente do imunógeno do peptídeo EMPD de IgE às células do sistema imunológico de um hospedeiro após administração parenteral.

[00126] O complexo imunoestimulatório estabilizado pode ser formado complexando um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE com uma molécula aniônica, oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou combinações dos mesmos via associação eletrostática. O complexo imunoestimulatório estabilizado pode ser incorporado em uma composição farmacêutica como um sistema de distribuição de imunógeno.

[00127] Em certas modalidades, o construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE é projetada para conter uma porção catiônica que é carregada positivamente a um pH na faixa de 5,0 a 8,0. A carga líquida na porção catiônica do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE, ou mistura de construtos, é calculada atribuindo uma carga +1 para cada lisina (K), arginina (R) ou histidina (H), uma carga - 1 para cada ácido aspártico (D) ou ácido glutâmico (E) e uma carga de O para o outro aminoácido dentro da sequência. As cargas são somadas na porção catiônica do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE e expressas como a carga média líquida. Um imunógeno de peptídeo adequado tem uma porção catiônica com uma carga positiva média líquida de +1. De preferência, o imunógeno de peptídeo possui uma carga líquida positiva na faixa que é maior que +2. Em algumas modalidades, a porção catiônica do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE é o espaçador heterólogo. Em certas modalidades, a porção catiônica do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE tem uma carga de +4 quando a sequência espaçadora é (a, e-N)Lys, e-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 129)

[00128] Uma "molécula aniônica", como descrita aqui, refere-se a qualquer molécula que é carregada negativamente a um pH na faixa de 5,0-8,0. Em certas modalidades, a molécula aniônica é um oligôêômero ou polímero. A carga negativa líquida no oligôêômero ou polímero é calculada atribuindo-se uma carga -1 para cada grupo fosfodiéster ou fosforotioato no oligômero. Um oligonucleotídeo aniônico adequado é uma molécula de DNA de fita simples com 8 a 64 bases nucleotídicas, com o número de repetições do motivo CpG na faixa de 1 a 10. De preferência, as moléculas de DNA de fita simples imunoestimulatórias de CpG contêm 18-48 bases de nucleotídeos, com o número de repetições do motivo de CpG na faixa de 3 a 8.

[00129] Mais preferencialmente, o oligonucleotídeo aniônico é representado pela fórmula: 5' X'CGX? 3' em que C e G são não metilados; e X' é selecionado do grupo que consiste em A (adenina), G (guanina) e T (timina); e Xº é C (citosina) ou T (timina). Ou, o oligonucleotídeo aniônico é representado pela fórmula: 5' (Xº)-CG(Xº) 3' em que C e G são não metilados; e Xº é selecionado do grupo que consiste em A, Tou G; e X é CouT.

[00130] O complexo imunoestimulatório resultante está na forma de partículas com um tamanho tipicamente na faixa de 1-50 mícrons e é uma função de muitos fatores, incluindo a estequiometria da carga relativa e o peso molecular das espécies que interagem. O complexo imunoestimulatório particulado tem a vantagem de proporcionar adjuvante e superregulação de respostas imunes específicas in vivo. Além disso, o complexo imunoestimulatório estabilizado é adequado para a preparação de composições farmacêuticas por vários processos, incluindo emulsões de água em óleo, suspensões de sal mineral e géis poliméricos.

[00131] Apresente descrição também é direcionada a composições farmacêuticas, incluindo formulações de vacina, para tratamento e prevenção de doenças alérgicas mediadas por IgE. Em algumas modalidades, composições farmacêuticas compreendendo um complexo imunoestimulatório estabilizado, que é formado através da mistura de um oligômero CpG com uma composição de peptídeo contendo uma mistura dos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE (por exemplo, SEQ ID NOs: 88-95, 98-124, e 130) por meio de associação eletrostática, para aumentar ainda mais a imunogenicidade do peptídeo EMPD de IgE e desencadear anticorpos contra o peptídeo EMPD de IgE das SEQ ID NOs: 1 ou 2 para se ligar a células B que expressam mlgE e induzir sua citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e Apoptose (Exemplo 6).

[00132] Em ainda outras modalidades, as composições farmacêuticas contêm uma mistura dos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE (por exemplo, qualquer combinação de SEQ ID NOs: 8-90, 94, 95, 98-124 e 130) na forma de um complexo imunoestimulatório estabilizado com oligômeros CpG que são, opcionalmente, misturados com sais minerais, incluindo gel de alúmen (ALHYDROGEL) ou fosfato de alumínio (ADJUPHOS) como um adjuvante com alto fator de segurança, para formar uma formulação de vacina em suspensão para administração em hospedeiros de vacina. Anticorpos

[00133] A presente descrição também fornece anticorpos desencadeados pelo construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE.

[00134] A presente descrição fornece construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE e formulações dos mesmos, com custo eficaz na fabricação, ideal em seu projeto que são capazes de provocar anticorpos de alto título direcionando a IgE ligada à membrana que é capaz de quebrar a tolerância imune contra o autoantígeno com uma alta taxa de resposta em hospedeiros vacinados. Os anticorpos gerados pelos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE têm alta afinidade para a proteína IHE-EMPD como um peptídeo solúvel, uma proteína de fusão ou IgE presente nas células B portadoras de IgE. Os anticorpos gerados são capazes de se ligar e reticular o IgE BCR nos linfócitos B que expressam mIgE para induzir efeitos citolíticos como apoptose e ADCC. A deleção apoptótica dos linfócitos IgE B ligados à membrana resulta ainda em redução da produção sérica de IgE. Portanto, o direcionamento de células B mlgE humanas com anticorpos específicos para EMPD de IgE indutores de apoptose gerados pelos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE divulgados e formulações dos mesmos fornece uma nova terapia para e vacina contra doenças alérgicas mediadas por IgE.

[00135] Em algumas modalidades, os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE para obter anticorpos compreendem um híbrido de um peptídeo EMPD de IgE com um epítopo da célula B contendo entre 20 a 40 aminoácidos que cobrem a estrutura de alça intramolecular central derivada do peptídeo EMPD de IgE (SEQ ID NO: 1 ) (por exemplo, peptídeos EMPD de IgE de EMPD de IgE G1-C39 (SEQ ID NO: 5), EMPD de IgE A7-H40 (SEQ ID NO: 6), EMPD de IgE H19-R38 (SEQ ID NO: 8) e EMPD de IgE G1-H40 (SEQ ID NO: 9)) ligado a um epítopo Th heterólogo derivado de proteínas patogênicas, como a proteína de Fusão do Vírus do Sarampo (MVF) (SEQ ID NO: 73) e outras (SEQ ID NOs: 59 a 87) através de um espaçador opcional. O epítopo da célula B e o epítopo Th dos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE agem juntos para estimular a geração de anticorpos altamente específicos reativos cruzados com o peptídeo EMPD de IgE 1-52 (SEQ ID NO: 2), proteína EMPD de IgE 1-67 ( SEQ ID NO: 1), como uma proteína recombinante contendo EMPD de IgE (por exemplo, purificada a partir de uma linhagem celular estável FIp-ln CHO transfectada com DNA recombinante que codifica a porção Fc da I9gG1 humana e a EMPD de IgE da IgE ligada à membrana humana, y1- em67) ou na membrana de uma célula portadora de IgE ligada à membrana (por exemplo, uma linhagem celular de Ramos transfectada com DNA recombinante que codifica mIgE.FcL).

[00136] Os métodos tradicionais de imunopotenciação de um peptídeo, como por meio do acoplamento químico a uma proteína transportadora, por exemplo, Hemocianina de lapa de buraco de fechadura (KLH) ou outras proteínas transportadoras, como as proteínas toxoide da Difteria (DT) e Toxoide do Tétano (TT), normalmente resultam na geração de uma grande quantidade de anticorpos direcionados contra a proteína transportadora. Assim, uma grande deficiência dessas vacinas de proteína transportadora de peptídeos é que a maioria (> 90%) dos anticorpos gerados pelo imunógeno são os anticorpos não funcionais direcionados contra a proteína transportadora KLH, DT ou TT, o que pode levar à supressão epitópica.

[00137] Ao contrário do método tradicional de imunopotenciação de um peptídeo, os anticorpos gerados pelos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE divulgados se ligam com alta especificidade ao fragmento EMPD de IgE com poucos, se houverem, anticorpos direcionados contra o epítopo Th heterólogo ou espaçador heterólogo opcional. Em particular, os anticorpos policlonais desencadeados em animais vacinados se ligam, com alta especificidade, à região central que cobre uma estrutura de alça da EMPD de IgE, mostrada na Figura

9. Métodos

[00138] Apresente descrição também é direcionada a métodos para fabricar e usar os construtos, composições e composições farmacêuticas de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE. a. Métodos para fabricar o construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE

[00139] Os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE desta descrição podem ser feitos por métodos de síntese química bem conhecidos do versado na técnica (ver, por exemplo, Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, p. 77). Os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE podem ser sintetizados usando as técnicas automatizadas Merrifield de síntese em fase sólida com o a- NH2 protegido pela química t-Boc ou F-moc usando aminoácidos protegidos de cadeia lateral em, por exemplo, um sintetizador de peptídeo Applied Biosystems Modelo 430A ou 431. A preparação de construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE compreendendo peptídeos de biblioteca combinatória para epítopos Th pode ser realizada fornecendo uma mistura de aminoácidos alternativos para acoplamento em uma determinada posição variável.

[00140] Após a montagem completa do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE desejada, a resina pode ser tratada de acordo com procedimentos padrão para separar o peptídeo da resina e os grupos funcionais nas cadeias laterais de aminoácidos podem ser desbloqueados. O peptídeo livre pode ser purificado por HPLC e caracterizado — bioquimicamente, por exemplo, por análise de aminoácidos ou por sequenciamento. Os métodos de purificação e caracterização de peptídeos são bem conhecidos dos versados na técnica.

[00141] A qualidade dos peptídeos produzidos por esse processo químico pode ser controlada e definida e, como resultado, a reprodutibilidade dos construtos de imunógeno do peptídeo EMPD de IgE, a imunogenicidade e o rendimento podem ser garantidos. À descrição detalhada da fabricação do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE através da síntese de peptídeos em fase sólida é mostrada no Exemplo 1.

[00142] Verificou-se que a faixa na variabilidade estrutural que permite a retenção de uma atividade imunológica pretendida é muito mais flexível do que a faixa na variabilidade estrutural permitida para a retenção de uma atividade específica de fármaco por um fármaco de molécula pequena ou as atividades desejadas e as toxicidades indesejadas encontradas em moléculas grandes que são coproduzidas com fármacos derivados biologicamente. Assim, análogos peptídicos, projetados intencionalmente ou inevitavelmente produzidos por erros do processo sintético como uma mistura de subprodutos da sequência de deleção que têm propriedades cromatográficas e imunológicas semelhantes ao peptídeo pretendido, são frequentemente tão eficazes quanto uma preparação purificada do peptídeo desejado. Análogos projetados e misturas análogas não intencionais são eficazes desde que um procedimento de QC exigente seja desenvolvido para monitorar o processo de fabricação e o processo de avaliação do produto, a fim de garantir a reprodutibilidade e a eficácia do produto final que emprega esses peptídeos.

[00143] Os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE também podem ser feitos usando a tecnologia de DNA recombinante, incluindo moléculas de ácido nucleico, vetores e/ou células hospedeiras. Como tal, as moléculas de ácido nucleico que codificam o construto de imunógenos de peptídeo EMPD de IgE e análogos imunologicamente funcionais dos mesmos também são abrangidos pela presente descrição como parte da presente invenção. Da mesma forma, vetores, incluindo vetores de expressão, compreendendo moléculas de ácido nucleico, bem como células hospedeiras contendo os vetores, também são abrangidos pela presente descrição como parte da presente invenção.

[00144] Várias modalidades exemplificativas também abrangem métodos para produzir o construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE e análogos imunologicamente funcionais dos mesmos. Por exemplo, os métodos podem incluir uma etapa de incubar uma célula hospedeira contendo um vetor de expressão contendo uma molécula de ácido nucleico que codifica um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE e/ou análogo imunologicamente funcional do mesmo sob tais condições em que o peptídeo e/ou análogo é expresso. Os imunógenos de peptídeo sintéticos mais longos podem ser sintetizados por técnicas bem conhecidas de DNA recombinante. Tais técnicas são fornecidas em manuais padrão conhecidos com protocolos detalhados. Para construir um gene que codifica um peptídeo desta invenção, a sequência de aminoácidos é traduzida inversamente para obter uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos, preferencialmente com códons que são ótimos para o organismo no qual o gene deve ser expresso. Em seguida, um gene sintético é produzido tipicamente sintetizando oligonucleotídeos que codificam o peptídeo e quaisquer elementos regulatórios, se necessário. O gene sintético é inserido num vetor de clonagem adequado e transfectado para uma célula hospedeira. O peptídeo é então expresso sob condições adequadas apropriadas para o sistema de expressão e hospedeiro selecionados. O peptídeo é purificado e caracterizado por métodos padrão. b. Métodos para a fabricação de complexos imunoestimulatórios

[00145] Várias modalidades exemplificativas também abrangem métodos de produção de complexos imunoestimulatórios compreendendo construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE e molécula de oligodesoxinucleotideco CpG (ODN). Os complexos imunoestimulatórios estabilizados (ISC) são derivados de uma porção catiônica do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE e de uma molécula polianiônica de CpG ODN. O sistema de montagem automática é acionado pela neutralização eletrostática da carga. À estequiometria da razão de carga molar da porção catiônica do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE para o oligômero aniônico determina a extensão da associação. A associação eletrostática não covalente do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE e CpG ODN é um processo completamente reprodutível. O complexo imunoestimulatório peptídeo/CpG ODN agrega, o que facilita a apresentação às células "profissionais" apresentadoras de antígeno (APC) do sistema imunológico, melhorando ainda mais a imunogenicidade dos complexos. Esses complexos são facilmente caracterizados para controle de qualidade durante a fabricação. O peptídeo/CpG ISC é bem tolerado in vivo. Este novo sistema de partículas compreendendo construtos de imunógeno de peptídeo derivados de fragmento CpG ODN e EMPD de IgE foi projetado para aproveitar a mitogenicidade generalizada de células B associada ao uso de CpG ODN, mas promover respostas equilibradas do tipo Th-1/Th-2.

[00146] O CpG ODN nas composições farmacêuticas divulgadas é 100% ligado ao imunógeno em um processo mediado pela neutralização eletrostática da carga oposta, resultando na formação de partículas do tamanho de mícron. A forma particulada permite uma dosagem significativamente reduzida de CpG a partir do uso convencional de adjuvantes CpG, menos potencial para respostas imunes inatas adversas e facilita vias alternativas de processamento de imunógeno, incluindo células apresentadoras de antígeno (APC). Consequentemente, essas formulações são inovadoras conceitualmente e oferecem vantagens potenciais ao promover a estimulação de respostas imunes por mecanismos alternativos. c. Métodos para a fabricação de composições farmacêuticas

[00147] Várias modalidades exemplificativas também abrangem composições farmacêuticas contendo construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE. Em certas modalidades, as composições farmacêuticas empregam água em emulsões de óleo e em suspensão com sais minerais.

[00148] Paraque uma composição farmacêutica seja usada por uma grande população e com a prevenção da agregação de EMPD de IgE também fazendo parte do objetivo da administração, a segurança se torna outro fator importante a ser considerado. Apesar do uso de emulsões de água em óleo em humanos para muitas formulações em ensaios clínicos, o Alúmen continua sendo o principal adjuvante para uso em formulações devido à sua segurança. O alúmen ou seus sais minerais fosfato de Alumínio (ADJUPHOS) é, portanto, frequentemente usado como adjuvante na preparação para aplicações clínicas.

[00149] Outros adjuvantes e agentes imunoestimulantes incluem monofosforil lipídico A (MPL) ou 3-De-O-acilados, aminoácidos poliméricos ou monoméricos 3-DMP, tais como ácido poliglutâmico ou polilisina. Tais adjuvantes podem ser utilizados com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos tais como péptidos de muramil (por exemplo, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N- acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil- L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2''/º— dipalmitoil-sn- /— -glicero-3- hidroxifosforilóxi)-etilamina (MTP-PE), N-acetilglucosaminil-N- acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitóxi propilamida (DTP-DPP) Teramide'"Y), ou outros componentes da parede celular bacteriana. As emulsões de óleo em água incluem MF59 (ver WO 90/14837 de Van Nest et al., que é aqui incorporado por referência na sua totalidade), contendo 5% de Esqualeno, 0,5% de Tween 80 e 0,5% de Span 85 (opcionalmente contendo várias quantidades de MTP-PE) formuladas em partículas submicrônicas usando um microfluidizador; SAF, contendo 10% de Esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero bloqueado por plurônico L121 e thr-MDP, microfluidizados em uma emulsão submicrônica ou agitados em vórtice para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior; e o sistema adjuvante Ribi"Y (RAS) (Ribi ImmunoChem, Hamilton, Mont.) contendo 2% de esqualeno, 0,2% de Tween 80 e um ou mais componentes bacterianos da parede celular selecionados do grupo que consiste em monofosforil-lipídeo A (MPL), dimerolato de trealose (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS), de preferência MPL+CWS (DetoxTY), Outros adjuvantes incluem Adjuvante Completo de Freund (CFA), Adjuvante Incompleto de Freund (IFA) e citocinas, tais como interleucinas (IL-1, IL-2, e 11-12), fator de estimulação de colônias de macrófagos (M-CSF), e fator de necrose tumoral (TNF).

[00150] A escolha de um adjuvante depende da estabilidade da formulação imunogênica que contém o adjuvante, a via de administração, o esquema de dosagem, a eficácia do adjuvante para as espécies que estão sendo vacinadas e, em humanos, um adjuvante farmaceuticamente aceitável é aquele que possui aprovado ou aprovado pela administração humana pelos órgãos regulatórios pertinentes. Por exemplo, alúmen, MPL ou adjuvante de Incompleto de Freund (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32: 173-186 (1998), que é incorporado por referência na sua totalidade) isoladamente ou, opcionalmente, todas as suas combinações são adequadas para administração humana.

[00151] As composições podem incluir transportadores de diluentes não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis, que são definidos como veículos comumente usados para formular composições farmacêuticas para administração animal ou humana. O diluente é selecionado para não afetar a atividade biológica da combinação. Exemplos de tais diluentes são água destilada, solução salina fisiológica tamponada com fosfato, soluções de Ringer, solução de dextrose e solução de Hank. Além disso, a composição ou formulação farmacêutica pode também incluir outros transportadores, adjuvantes ou estabilizadores não tóxicos, não terapêuticos, não imunogênicos e semelhantes.

[00152] As composições farmacêuticas também podem incluir macromoléculas grandes e metabolizadas lentamente, como proteínas, polissacarídeos como quitosana, ácidos poliláticos, ácidos poliglicólicos e copolímeros (por exemplo, sefarose funcionalizada com látex, agarose, celulose e semelhantes) aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, e agregados lipídicos (por exemplo, gotículas de óleo ou lipossomas). Além disso, esses transportadores podem funcionar como agentes imunoestimulantes (isto é, adjuvantes).

[00153] Ascomposições farmacêuticas da presente invenção podem ainda incluir um veículo de distribuição adequado. Os veículos de distribuição adequados incluem, mas não estão limitados a vírus, bactérias, microesferas biodegradáveis, micropartículas, nanopartículas, lipossomas, minipeletes de colágeno e cocleatos. d. Métodos usando composições farmacêuticas

[00154] A presente descrição também inclui métodos de uso de composições farmacêuticas contendo construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE.

[00155] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas contendo construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE podem ser usadas para o tratamento e/ou prevenção de doenças alérgicas mediadas por imunoglobulina E (IgE), incluindo, entre outras, alergia a fármacos, alimentos e insetos, rinite alérgica (febre do feno), dermatite atópica, asma alérgica, conjuntivite, eczema, urticária (urticária) e anafilaxia.

[00156] Em algumas modalidades, os métodos compreendem administrar uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade farmacologicamente eficaz de um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE a um hospedeiro em necessidade do mesmo. Em certas modalidades, os métodos compreendem administrar uma composição — farmacêutica — compreendendo “uma quantidade farmacologicamente eficaz de um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE a um animal de sangue quente (por exemplo, humanos, macacos Cynomolgus, camundongos) para obter anticorpos altamente específicos reativos cruzados com o peptídeo EMPD de IgE 1-52 (SEQ ID NO: 2), proteína EMPD de IgE 1-67 (SEQ ID NO: 1), como uma proteína contendo EMPD de IgE recombinante (por exemplo, purificada a partir de uma linhagem celular CHO estável de Flp-lh transfectada com DNA recombinante que codifica a porção Fc da IgG1 humana e EMPD de IgE da IgE ligada à membrana humana, y1-em67) ou na membrana de uma célula transportadora de IgE ligada à membrana (por exemplo, uma linhagem de células Ramos transfectada com DNA recombinante que codifica a mIgE.FcL).

[00157] Em certas modalidades, as composições farmacêuticas contendo construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE podem ser usadas para tratar e/ou prevenir doenças mediadas por IgE, provocando anticorpos direcionados contra EMPD de IgE. Tais anticorpos são capazes de (a) se ligar a células B que expressam mlgE e induzir citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e apoptose; (b) levar à redução in vivo do nível basal de IgE no sangue; (c) levar à redução in vivo do nível de IgE de antígeno específico no sangue; e (d) reduzir ou eliminar a patologia alérgica mediada por IgE em pacientes que sofrem de doenças alérgicas mediadas por IgE. e. Ensaios funcionais in vitro e estudos de provas de eficácia in vivo

[00158] Os anticorpos produzidos pelos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE podem ser utilizados em ensaios funcionais in vitro. Esses ensaios funcionais incluem, mas não estão limitados a: (a) ligação in vitro ao peptídeo EMPD de IgE 1-52 (SEQ ID NO: 1) como uma proteína recombinante purificada a partir de células CHO que expressam mIgE.FcL (Exemplo 3); (b) ligação in vitro a uma célula transportadora de IgE ligada a membrana a partir de uma linhagem celular B, Ramos, que foi transfectada com DNA recombinante que codifica IgE.FcL (Exemplo 3); (c) in vitro da citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) (Exemplo 6); (d) indução in vitro de apoptose de linfócitos B portadores de IgE (Exemplo 6); (e) prova de eficácia in vivo mostrando redução do nível basal de IgE no sangue de hospedeiros vacinados (Exemplos 8 a 10); (f) prova de eficácia in vivo, mostrando redução do nível de IgE específico do antígeno no início e reforço com desafios por alérgenos (Exemplos 8 a 10).

[00159] Pela presente descrição, os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE divulgados e formulações dos mesmos podem funcionar efetivamente como vacinas para reduzir ou eliminar a patologia alérgica mediada por IgE em pacientes que sofrem de doenças alérgicas mediadas por IgE. Modalidades específicas (1) Um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE representado pelas fórmulas: (Th)m—>H (A) (fragmento de EMPD de IgE)—X ou (fragmento de EMPD de IgE)-(A))=(Th)nWX ou (Th)n—H (A) (fragmento de EMPD de IGgE)(A))(Th)nX em que Th é um epítopo auxiliar T heterólogo; A é um espaçador heterólogo; (fragmento de EMPD de IgE) é um epítopo da célula B com cerca de 20 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos da alça intramolecular central de EMPD de IgE; X é um a-COOH ou a-CONH>2 de um aminoácido; m é de 1 a cerca de 4; e n é de O a cerca de 10. (2) O construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE, de acordo com (1), em que o fragmento de EMPD de IgE é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 5,6,8e9. (3) O construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE, de acordo com qualquer um de (1) ou (2), em que o epítopo Th é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 59-87. (4) O construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE, de acordo com (1), em que o construto de imunógeno de peptídeo é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 88-95, 98-124 e

130. (5) Um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE compreendendo: um epítopo da célula B compreendendo cerca de 20 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos da sequência EMPD de IgE da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; um epítopo auxiliar T compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 59-87; e um espaçador heterólogo opcional selecionado do grupo que consiste em um aminoácido, Lys-, GlIy-, Lys-Lys-Lys-, (a, e-N)Lys, e e-N-Lys-Lys- Lys-Lys (SEQ ID NO: 129), em que o epítopo da célula B está covalentemente ligado ao epítopo auxiliar T diretamente ou através do espaçador heterólogo opcional. (6) O construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE, de acordo com (5), em que o epítopo da célula B é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 5,6,8e9. (7) O construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE, de acordo com (5), em que o epítopo auxiliar T é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 59-87. (8) O construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE, de acordo com (5), em que o espaçador heterólogo opcional é (a, e-N)Lys ou e-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 129). (9) O construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE, de acordo com (5), em que o epítopo auxiliar T é covalentemente ligado ao terminal amino do epítopo da célula B. (10) O construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE, de acordo com (5), em que o epítopo auxiliar T é covalentemente ligado ao terminal amino do epítopo da célula B através do espaçador heterólogo opcional. (11) Uma composição compreendendo um construto de imunógeno de peptídeo de acordo com qualquer um de (1) a (10). (12) Uma composição farmacêutica compreendendo:

a. um construto de imunógeno de peptídeo, de acordo com qualquer um de (1) a (10); e b e um veículo e/ou adjuvante de distribuição farmaceuticamente aceitável. (13) A composição farmacêutica de (12), em que a. o construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 88-95, 98-124 e 130; e b. o construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE é misturado com um oligodesoxinucleotídeo CpG (ODN) para formar um complexo imunoestimulador estabilizado. (14) Um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao epítopo do mesmo que se liga especificamente ao epítopo da célula B do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE de acordo com qualquer um de (1) a (10). (15) O anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao epítopo do mesmo de acordo com (14), ligado ao construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE. (16) Um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao epítopo do mesmo que se liga especificamente ao epítopo da célula B do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE de acordo com qualquer um de (1) a (10). (17) Uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao epítopo do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações (14) a (16). Uma descrição detalhada dos procedimentos utilizados é fornecida nos exemplos a seguir. Os exemplos a seguir servem para ilustrar a presente invenção e não devem ser usados para limitar o escopo da invenção. EXEMPLO 1

SÍNTESE DE PEPTÍDEOS RELACIONADOS À EMPD DE IGE E

PREPARAÇÃO DAS FORMULAÇÕES DAS MESMAS a. Síntese de peptídeos relacionados à EMPD de IgE

[00160] São descritos métodos para sintetizar peptídeos projetados relacionados a EMPD de IgE que foram incluídos no esforço de desenvolvimento de construtos de imunógenos de peptídeo EMPD de

IgE. Os peptídeos foram sintetizados em quantidades em pequena escala que são úteis para ensaios sorológicos, piloto de laboratório e estudos de campo, bem como em quantidades em larga escala (quilograma), que são úteis para a produção industrial/comercial de composições farmacêuticas. Um grande repertório de peptídeos antigênicos relacionados a EMPD de IgE com sequências com comprimentos de aproximadamente 20 a 70 aminoácidos foi projetado para a triagem e seleção dos construtos de peptídeo mais ideais para uso em uma vacina eficaz contra alergia baseada em IgE.

[00161] Segmentos EMPD de IgE 1-67 de comprimento completo (SEQ ID NO: 1), EMPD de IgE 1-52 (SEQ ID NO: 2) e EMPD de IgE, incluindo EMPD de IgE 1-17 (SEQ ID NO: 7), EMPD de IgE 19-38 (SEQ ID NO: 8) e vários peptídeos de 10-mer (SEQ ID NOs: 10-58), empregados para o mapeamento de epítopos em vários ensaios sorológicos são mostrados na Tabela 1 (SEQ ID NOs: 1 a 58).

[00162] Os peptídeos do epítopo da célula B da EMPD de IgE foram transformados em construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE por ligação sintética a um epítopo de célula T auxiliar (Th) cuidadosamente projetado, derivado de proteínas patogênicas, incluindo a proteína de Fusão do Vírus do Sarampo (MVF), proteína do antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg), influenza, Clostridium tetani e vírus Epstein-Barr (EBV), como mostrado na Tabela 2 (SEQ ID NOs: 59-87). Os epítopos Th foram usados em uma única sequência (SEQ ID NOs: 59-67 e 72-87) ou em uma biblioteca combinatória (SEQ ID NOs: 68-71) para aumentar a imunogenicidade de seus respectivos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE.

[00163] Construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE representativos selecionados entre mais de 100 construtos de peptídeos são identificados na Tabela 3 (SEQ ID NOs: 88-124 e 130).

[00164] Todos os peptídeos utilizados para estudos de imunogenicidade ou testes sorológicos relacionados para detecção e/ou medição de anticorpos anti-EMPD de IgE foram sintetizados em pequena escala usando a química F-moc por sintetizadores de peptídeos dos modelos Applied BioSystems Modelos 430A, 431 e/ou

433. Cada peptídeo foi produzido por uma síntese independente em um suporte de fase sólida, com proteção de F-moc no N-terminal e grupos de proteção da cadeia lateral de aminoácidos trifuncionais. Os peptídeos completos foram clivados a partir do suporte sólido e os grupos protetores da cadeia lateral foram removidos com ácido trifluoroacético a 90% (TFA). As preparações de peptídeos sintéticos foram avaliadas por Espectrometria de Massa de Dessorção a Laser Assistida por Matriz/lonização em Tempo de Voo (MALDI-TOF) para garantir o conteúdo correto de aminoácidos. Cada peptídeo sintético foi também avaliado por HPLC de fase reversa (RP-HPLC) para confirmar o perfil de síntese e a concentração da preparação. Apesar do controle rigoroso do processo de síntese (incluindo o monitoramento gradual da eficiência do acoplamento), também foram produzidos análogos de peptídeos devido a eventos indesejados durante os ciclos de alongamento, incluindo inserção, deleção, substituição e terminação prematura de aminoácidos. Assim, as preparações sintetizadas incluem tipicamente múltiplos análogos peptídicos juntamente com o peptídeo direcionado.

[00165] Apesar da inclusão de tais análogos peptídicos não intencionais, as preparações peptídicas sintetizadas resultantes foram, no entanto, adequadas para uso em aplicações imunológicas, incluindo imunodiagnóstico (como antígenos de captura de anticorpos) e composições farmacêuticas (como imunógenos de peptídeos). Tipicamente, esses — análogos de peptídeos, projetados intencionalmente ou gerados por meio de processo sintético como uma mistura de subprodutos, são frequentemente tão eficazes quanto uma preparação purificada do peptídeo desejado, desde que um procedimento de QC criterioso seja desenvolvido para monitorar o processo de fabricação e o processo de avaliação do produto para garantir a reprodutibilidade e eficácia do produto final que emprega esses peptídeos. As sínteses de peptídeos em larga escala nas quantidades de cem a quilos de grama foram realizadas em um sintetizador de peptídeos automatizado personalizado UBI2003 ou similar na escala de 15 mmol a 50 mmol.

[00166] Para ingredientes ativos usados na composição farmacêutica final para ensaios clínicos, os construtos de peptídeo EMPD de IgE foram purificados por RP-HPLC preparativa sob um gradiente de eluição superficial e caracterizados por espectrometria de massa MALDI-TOF, análise de aminoácidos e RP-HPLC para pureza e identidade. b. Preparação de composições contendo construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE

[00167] As formulações empregando água em emulsões oleosas e em suspensão com sais minerais foram preparadas. Para que uma composição farmacêutica projetada para ser usada por uma grande população e com a prevenção também fazendo parte do objetivo da administração, a segurança se torna outro fator importante a ser considerado. Apesar do uso de emulsões de água em óleo em humanos para muitas composições farmacêuticas em ensaios clínicos, o Alúmen continua sendo o principal adjuvante para uso em composição farmacêutica devido à sua segurança. O alúmen ou seus sais minerais ADJUPHOS (fosfato de Alumínio) é, portanto, frequentemente usado como adjuvante na preparação para aplicações clínicas.

[00168] Resumidamente, as formulações especificadas em cada um dos grupos de estudo descritos abaixo geralmente continham todos os tipos de projetadores dos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE. Mais de 100 construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE projetados foram inicialmente avaliados em cobaias quanto à sua imunogenicidade relativa com o peptídeo EMPD de IgE correspondente representativo do peptídeo de epítopo da célula B de imunógeno e também para avaliação de reatividades cruzadas sorológicas entre os vários peptídeos homólogos por ensaios ELISA com placas revestidas com diferentes peptídeos selecionados das SEQ ID NOs: 1-126.

[00169] Os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE foram preparados (i) em uma emulsão de água em óleo com Seppic Montanide'Y ISA 51 como o óleo aprovado para uso humano, ou (ii) misturados com sais minerais ADJUPHOS (Fosfato de alumínio) ou ALHYDROGEL (Alum), em quantidades variáveis de construtos de peptídeo, conforme especificado. As composições foram tipicamente preparadas dissolvendo os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE em água a cerca de 20 a 800 pug/mL e formuladas com Montanide'Y ISA 51 em emulsões de água em óleo (1:1 em volume) ou com sais minerais ou ALHYDROGEL (Alúmen) (1:1 em volume). As composições foram mantidas à temperatura ambiente durante cerca de min e misturadas em vórtice durante cerca de 10 a 15 segundos antes da imunização. Alguns animais foram imunizados com 2 a 3 doses de uma composição específica, que foram administradas no tempo O (inicialização) e 3 semanas após a imunização inicial (wpi) (reforço), opcionalmente 5 ou 6 wpi para um segundo reforço, por via intramuscular. Esses animais imunizados foram então testados com peptídeo(s) de epítopo da célula B selecionado(s) para avaliar a imunogenicidade dos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE presentes na formulação, bem como sua reatividade cruzada com peptídeos ou proteínas-alvo relacionados. Os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE com imunogenicidade potente na triagem inicial em porquinhos-da-índia foram posteriormente testados em emulsão água em óleo, sais minerais e formulações à base de alúmen em primatas para regimes de dosagem durante um período especificado, conforme determinado pelos protocolos de imunizações.

[00170] Somente os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE mais promissores foram avaliados extensivamente antes de serem incorporados nas formulações finais para estudos de imunogenicidade, duração, toxicidade e eficácia em estudos pré-clínicos guiados por GLP, em preparação para a apresentação de uma aplicação de novo fármaco investigativa e ensaios clínicos em pacientes com doenças mediadas por IgE. EXEMPLO 2

ENSAIOS E REAGENTES SOROLÓGICOS

[00171] Ensaios e reagentes sorológicos para avaliar a imunogenicidade funcional dos construtos de peptídeo sintéticos e formulações dos mesmos são descritos em detalhes abaixo. a. testes ELISA baseados em peptídeos EMPD de IgE 1-52, EMPD de IgE 1-39, EMPD de IgE 1-17, EMPD de IgE 19-38, EMPD de IgE 7- 40 para análise de especificidade de anticorpos

[00172] Os ensaios ELISA para avaliar amostras de soro imune descritos nos exemplos a seguir foram desenvolvidos e descritos abaixo. Os poços das placas de 96 poços foram revestidos individualmente por 1 hora a 37ºC com 100 uL de peptídeo alvo de peptídeo EMPD de IgE 1-52, EMPD de IgE 1-39, EMPD de IgE 1-17, EMPD de IgE 19-38, EMPD de IgE 7 -40 etc. (por exemplo, SEQ ID NOs: 2 e 5a8), a 2 ug/mL (a menos que indicado de outra forma), em tampão 10mM NaHCO;, pH 9,5 (a menos que indicado de outra forma).

[00173] Os poços revestidos com peptídeo foram incubados com 250 ul de 3% em peso de gelatina em PBS a 37ºC por 1 hora para bloquear sítios de ligação a proteínas não específicos, seguidos por três lavagens com PBS contendo 0,05% em volume de TWEENQÔO 20 e secos. Os soros a serem analisados foram diluídos 1:20 (salvo indicação em contrário) com PBS contendo 20% em volume de soro normal de cabra, 1% em peso de gelatina e 0,05% em volume de TWEENQO 20. Cem microlitros (100 uL) das amostras diluídas (por exemplo, soro, plasma) foram adicionados a cada um dos poços e deixados reagir por 60 minutos a 37ºC. Os poços foram então lavados seis vezes com 0,05% em volume de TWEENQ 20 em PBS, a fim de remover anticorpos não ligados. Espécies conjugadas com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (por exemplo, camundongo, porquinho-da-índia ou humano) anti-IlgG, IgA ou IgM foram usadas como um marcador marcado para se ligar ao complexo de antígeno anticorpo/peptídeo formado em poços positivos. Cem microlitros de anti-lgG de cabra marcado com peroxidase, em uma diluição ideal pré-titulada e em 1% em volume de soro normal de cabra com 0,05% em volume de TWEENQO 20 em PBS, foram adicionados a cada poço e incubados a 37ºC por mais 30 minutos. Os poços foram lavados seis vezes com 0,05% em volume de TWEENQO 20 em PBS para remover o anticorpo não ligado e reagiram com 100 uL da mistura de substrato contendo 0,04% em peso de 3',3',5',5'-tetrametilbenzidina (TMB) e 0,12% em volume de peróxido de hidrogênio em tampão de citrato de sódio por mais 15 minutos. Esta mistura de substrato foi usada para detectar a marcação da peroxidase, formando um produto colorido. As reações foram interrompidas pela adição de 100 ul de 1,0M H2SO. e a absorbância a 450 nm (Au5o) foi determinada. Para a determinação dos títulos de anticorpos dos animais vacinados que receberam as várias formulações de vacinas de peptídeo EMPD de IgE, diluições em série de 10 vezes de soros de 1:100 a 1:10.000 ou diluições em série de 4 vezes de soros de 1:100 a 1:4,19x10º foram testados e o título de um soro testado, expresso como Log1o, foi calculado por análise de regressão linear do A4so com o corte Asso definido em 0,5.

b. Avaliação da reatividade do anticorpo em relação ao peptídeo Th por testes ELISA baseados em peptídeo Th

[00174] Os poços das placas ELISA de 96 poços foram revestidos individualmente por 1 hora a 37ºC com 100 uL de peptídeo Th a 2 ug/mL (a menos que indicado de outra forma), em tampão 10mM NaHCO;, pH 9,5 (a menos que indicado de outra forma) em método ELISA semelhante e realizado como descrito acima. Para a determinação dos títulos de anticorpos dos animais vacinados que receberam as várias formulações de vacinas de peptídeo EMPD de IgE, foram testadas diluições em série de 10 vezes de soros de 1:100 a 1:10.000 e o título de um soro testado, expresso como Log10, foi calculado por análise de regressão linear do A4so com o corte A-5o ajustado em 0,5. c. Avaliação da análise de especificidade fina e mapeamento de epítopos para EMPD de IgE e IgE CH4 (IgE CH4 humana para membrana) por testes de ELISA baseados em peptídeo de 10-mer de agrupamento de epítopo de célula B

[00175] As análises de especificidade fina de anticorpos EMPD anti- IgE em hospedeiros imunizados foram determinadas por mapeamento de epítopos. Resumidamente, os poços de placas de 96 poços foram revestidos com peptídeos individuais de 10-mer EMPD de IgE (SEQ ID NOs: 10 a 58) a 0,5 ug por 0,1 mL por poço e, em seguida, 100 uL de amostras de soro (diluição 1:100 em PBS) foram incubados em cavidades de placa de 10-meros em duplicado seguindo as etapas do método ELISA de anticorpo descrito acima. O epítopo da célula B do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE e as análises de especificidade fina relacionadas dos anticorpos anti-EMPD de IgE dos soros imunes dos hospedeiros imunizados foram testadas com o peptídeo EMPD de IgE 1-52 correspondente, sem o espaçador ou as sequências Th (SEQ ID NO: 1), ou com peptídeo de controle não relevante para confirmação adicional de reatividade e especificidade. d. Avaliação de imunogenicidade

[00176] Amostras de soro pré-imune e imune de animais ou seres humanos ou animais foram coletadas de acordo com protocolos experimentais de vacinação e aquecidas a 56ºC por 30 minutos para inativar os fatores de complemento sérico. Após a administração das formulações da vacina, foram obtidas amostras de sangue de acordo com os protocolos e sua imunogenicidade contra sítios alvo específicos avaliados. Os soros diluídos em série foram testados e os títulos positivos foram expressos como Logio da diluição recíproca. A imunogenicidade de uma formulação de vacina específica foi avaliada por sua capacidade de obter anticorpos de alto título direcionados contra a sequência do epítopo da célula B desejada dentro do antígeno alvo, mantendo uma reatividade do anticorpo baixa a desprezível em relação à sequência do epítopo da célula T auxiliar empregada para fornecer intensificação das respostas da célula B desejadas.

e. Imunoensaio para avaliação do nível de IgE humana em soros de camundongo

[00177] Os níveisdelgE humana em camundongos hulGHE knockin foram medidos por um ELISA sanduíche usando IgE anti-humano, HP6061 (Abcam), como anticorpo de captura e IgE anti-humano marcado com biotina, HP6029 (Abcam), como anticorpo de detecção. Resumidamente, o HP6061 foi imobilizado em placas de 96 poços a 100 ng/poço em tampão de revestimento (15 mM Na2CO;3, 35 mM NaHCO;, pH 9,6) e incubado a 4º C durante a noite. Os poços revestidos foram bloqueados por 200 ul/poço de diluentes de ensaio (0,5% de BSA, 0,05% de Tween-20, 0,02% de ProClin 300 em PBS) à temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com 200 ul/poço de tampão de lavagem (PBS com Tween-20 a 0,05%). Utilizou-se IgE U266 purificada para gerar uma curva padrão (intervalo de O a 800 ng/mL por diluição em série de 2 vezes) no diluente de ensaio com soros de camundongo a 5%. 50 uL dos soros diluídos (1:20) e os padrões foram adicionados aos poços revestidos. A incubação foi realizada à temperatura ambiente durante 1 hora. Todos os poços foram aspirados e lavados 6 vezes com 200 ul/poço de tampão de lavagem. A IgE humana capturada foi incubada com 100 uL de solução de anticorpo de detecção (50 ng/ml de HP6029 marcado com biotina em diluente de ensaio) à temperatura ambiente por 1 hora. Em seguida, a biotina- HP6029 ligada foi detectada usando estreptavidina poli-HRP (diluição 1:10.000, Thermo Pierce) por 1 hora (100 ul/poço). Todos os poços foram aspirados e lavados 6 vezes com 200 ul/poço de tampão de lavagem. Finalmente, os poços foram desenvolvidos por 100 ul/poço de substrato NeA-Blue TMB (Clinical Scientific Products) e a reação foi interrompida pela adição de 100 ul/poço de 1M H2SO.. A curva padrão foi criada usando o software SoftMax Pro (Molecular Devices) para gerar um ajuste de curva logística de quatro parâmetros e usado para calcular as concentrações de IgE em todas as amostras testadas. Os testes t de estudantes foram usados para comparar dados usando o software Prism.

f. Imunoensaio para avaliação do nível de IgE específico da papaína em soros de camundongo

[00178] AIlgE específica da papaína desenvolvida em camundongos hulGHE knockin foi medida por um ELISA direto usando papaína como material de revestimento e IgE anti-humana marcada com biotina, HP6029 (Abcam) como anticorpo de detecção. Resumidamente, a papaína foi imobilizada em placas de 96 poços a 500 ng/poço em tampão de revestimento (15 MM Na2CO;3, 35 mM NaHCO;, pH 9,6) e incubado a 4ºC durante a noite. Os poços revestidos foram bloqueados por 200 uL/poço de diluentes de ensaio (0,5% de BSA, 0,05% de Tween- 20, 0,02% de ProClin 300 em PBS) à temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com 200 ul/poço de tampão de lavagem (PBS com Tween-20 a 0,05%). Utilizou-se uma IgE quimérica monoclonal específica de papaína humana (AllerMAbs Co., Ltd.) para gerar uma curva padrão (faixa de O a 30 ng/mL por diluição em série de 2 vezes) em diluente de ensaio com soro de camundongo a 10%. 50 JL dos soros diluídos (1:10) e os padrões foram adicionados aos poços revestidos. A incubação foi realizada à temperatura ambiente durante 1 hora. Todos os poços foram aspirados e lavados 6 vezes com 200 ul/poço de tampão de lavagem. A IgE humana capturada foi incubada com 100 uL de solução de anticorpo de detecção (50 ng/ml de HP6029 marcado com biotina em diluente de ensaio) à temperatura ambiente por 1 hora. Em seguida, a biotina-HP6029 ligada foi detectada usando estreptavidina poli-HRP (diluição 1:10.000, Thermo Pierce) por 1 hora (100 uL/poço). Todos os poços foram aspirados e lavados 6 vezes com 200 ul/poço de tampão de lavagem. Finalmente, os poços foram desenvolvidos por 100 ul/poço de substrato NeA-Blue TMB (Clinical Science Products) e a reação foi interrompida pela adição de 100 ul/poço de 1M H2SO,. A curva padrão foi criada usando o software SoftMax Pro (Molecular Devices) para gerar um ajuste de curva logística de quatro parâmetros e usado para calcular as concentrações de IgE específica de papaína em todas as amostras testadas. Os testes t de estudantes foram usados para comparar dados usando o software Prism.

g. Imunoensaio para avaliação do nível de IgE em soros de macacos

[00179] Os níveisdelgEde macacoem macacos Cynomolus foram medidos por um ELISA sanduíche usando IgE anti-humano, MB10-5C4 (Miltenyi Biotec), como anticorpo de captura e IgE anti-macaco policlonal marcado com biotina (Alpha Diagnostic International Inc.), como anticorpo de detecção. Resumidamente, o MB10-5C4 foi imobilizado em placas de 96 poços a 100 ng/poço em tampão de revestimento (15 MM Na2CO;3, 35 mM NaHCO;, pH 9,6) e incubado a 4º

C durante a noite. Os poços revestidos foram bloqueados por 200 ul/poço de diluentes de ensaio (0,5% de BSA, 0,05% de Tween-20, 0,02% de ProClin 300 em PBS) à temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com 200 ulL/poço de tampão de lavagem (PBS com Tween-20 a 0,05%). Utilizou-se IgE de macaco purificada para gerar uma curva padrão (intervalo de O a 10.000 ng/mL por uma diluição em série de 2 vezes) em diluente de ensaio com soro de macaco a 10%. 100 uL dos soros diluídos (1:10) e os padrões foram adicionados aos poços revestidos. A incubação foi realizada à temperatura ambiente durante 1 hora. Todos os poços foram aspirados e lavados 6 vezes com 200 ul/poço de tampão de lavagem. A IgE humana capturada foi incubada com 100 uL de solução de anticorpo de detecção (50 ng/ml de HP6029 marcado com biotina em diluente de ensaio) à temperatura ambiente por 1 hora. Em seguida, a biotina- HP6029 ligada foi detectada usando estreptavidina poli-HRP (diluição 1:10.000, Thermo Pierce) por 1 hora (100 ul/poço). Todos os poços foram aspirados e lavados 6 vezes com 200 ul/poço de tampão de lavagem. Finalmente, os poços foram desenvolvidos por 100 ul/poço de substrato NeA-Blue TMB (Clinical Science Products) e a reação foi interrompida pela adição de 100 ul/poço de 1M H2SO.. A curva-padrão foi criada usando o software SoftMax Pro (Molecular Devices) para gerar um ajuste de curva logística de quatro parâmetros e usado para calcular as concentrações de IgE em todas as amostras testadas. Os testes t de estudantes foram usados para comparar dados usando o software Prism. EXEMPLO 3 AVALIAÇÃO — DAS PROPRIEDADES — FUNCIONAIS DOS

ANTICORPOS ELICADOS PELOS CONSTRUTOS E FORMULAÇÕES DE IMUNÓGENO DE PEPTÍDEO EMPD DE IGE DOS MESMOS EM ANIMAIS

[00180] Soros imunes ou anticorpos anti-EMPD de IgE purificados de hospedeiros imunizados foram testados quanto à sua capacidade de se ligar à proteína de IgE EMPD solúvel recombinante e linhagens celulares de Ramos que foram transfectadas com o DNA recombinante que codifica mIgE.Fc. (CH2 para CM incluindo o EMPD) ou mIgE.Fes (CH2 para CM sem o EMPD). a. Células

[00181] —Alinhagem de células Ramos foi adquirida na American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e cultivada em meio RPM! 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 10% de FBS inativado pelo calor (Invitrogen), L-glutamina 4 mM, HEPES 25 mM e piruvato de sódio 1 MM (Invitrogen; meio RPMI completo). As células Ramos foram transfectadas com DNA recombinante que codifica mIgE.Fcr. ou mIgE.Fces. As células de Ramos que expressam mIgE.Fcer foram transfectadas com um segmento de DNA que codifica o segmento da isoforma longa da cadeia mIgE e que se estende do CH2 ao peptídeo citoplásmico , incluindo o EMPD. As células de Ramos que expressam mIgE.Fcs foram transfectadas com um segmento de DNA que codifica o segmento da isoforma curta ou convencional da cadeia mIgE e que se estende do CH2 ao peptídeo citoplasmático , excluindo o EMPD. Os transfectantes estáveis de células Ramos que expressam mIgE.Fcr ou mlIgE.Fcs foram mantidos em meio RMPI 1640 completo, suplementado com 400 mg/ml de Zeocina (Invitrogen). b. Preparação da proteína IgE EMPD solúvel recombinante para teste ELISA

[00182] As células Flp-lh CHO que expressam a proteína de IgE EMPD solúvel recombinante foram transfectadas com um segmento de DNA que codifica a porção Fc da IgG1 humana e o IgE EMPD da IgE ligada à membranahumana, y1i-em67. Os transfectantes estáveis de Flp-lh CHOforam mantidos em meio IMDM (Invitrogen, Carlsbad, CA)

suplementado com 10% de FBS inativado pelo calor (Invitrogen), L- glutamina 4 mM, HEPES 25 mM e piruvato de sódio 1 mM (Invitrogen; meio IMDM completo). A proteína y1-em67 foi purificada do meio de cultura usando a proteína A Sepharose (GE Healthcare) de acordo com as instruções do fabricante. c. Purificação de anticorpos policlonais a partir de soros imunes

[00183] IgGs policlonais de vários soros imunes foram purificadas usando a proteína A Sepharose (GE Healthcare) de acordo com as instruções do fabricante. d. Ligação por anticorpos policlonais à proteína IgE EMPD solúvel ou mIgE.Fc. em células B

[00184] Os anticorpos policlonais purificados de cada um dos animais imunizados foram examinados quanto às suas atividades relativas quanto à ligação a (a) proteína y1-em67 recombinante (descrita acima) por ELISA, ou (b) células Ramos que expressam mIgE.Fcer por análise citométrica de fluxo de fluorescência. A microplaca de 96 poços era da Nalge NUNC International, de fundo plano (Cat. 442404) para leitura óptica e fundo em V para incubação celular (Cat. 249570). À densidade óptica foi lida no leitor de microplacas VersaMax (Molecular Devices). Os corantes fluorescentes foram detectados pelo citômetro BD FACSCanto Il (DB Biosciences); e os dados resultantes foram adquiridos pelo software FACSDiva associado. Os dados de ligação do ELISA & FACS foram importados para o software Prism 6 para análise quantitativa. Mais especificamente, em microplacas de fundo V, alíquotas de 2 x 10º células em 0,1 mL por poço foram adicionadas, centrifugadas e descartadas com líquido. As células foram incubadas em gelo por 1 hora com alíquotas de 100 ul de amostra de anticorpo em várias concentrações. As células foram lavadas uma vez, centrifugadas a 300 g por 5 min e coradas em gelo por 30 min com 100 ul de IgG Fc-FITC específico para anti-espécies de F(ab)> de cabra

(250 ng/mL). As células foram lavadas uma vez e o líquido descartado após centrifugação. A cada poço, foram adicionadas alíquotas de 200 ul de tampão de ligação e transferidas para tubos de microdiluição para análise citométrica de fluxo. A intensidade de ligação (média geométrica de intensidade de fluorescência, GeoMFI), com base em uma entrada de 10.000 células por amostra, foi lida no FACS. e. Ensaios de apoptose

[00185] As células Ramos que expressam de forma estável o mIgE.Fer (5 x 10º células/mlL) foram incubadas com anticorpos purificados imunes ou de controle em meio RPMI 1640 completo por 1 h a 37ºC. As células foram então tratadas com o anticorposecundário, F(ab')2 de cabra específico para Fc de porquinho-da-índia IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), a uma concentração final de 10 ug/mL e incubadas por 24 horas adicionais a 37ºC. À extensão da apoptose das células foi analisada da seguinte maneira. Para ensaios com anexina V, a exposição à fosfatidilserina (PS) foi medida ressuspendendo as células em uma solução de coloração por 15 minutos no escuro, à temperatura ambiente. A solução de coloração continha anexina V marcada com FITC (Biovision, Mountain View, CA), diluída 1/200 e 2,5 ug/ml de iodeto de propídio (PI) em um tampão com mM HEPES/NaOH (pH 7,4), 140 mM NaCl, e 5 MM CaCl2. As células coradas foram analisadas em um citômetro de fluxo FACSCanto Il (BD Biosciences, San Jose, CA). A porcentagem de células apoptóticas, definidas como anexina V positiva e PI negativa, foi obtida em uma análise de representação de pontos. f. Ensaio de citotoxicidade celular dependente de anticorpo(ADCC)

[00186] Os linfócitos esplênicos foram isolados do baço de camundongos Balb / c (fêmea, 6 a 8 semanas) por choques hipotônicos repetidos de glóbulos vermelhos usando um tampão de lise de RBC (Thermo Fisher Scientific Inc.). Após remoção dos glóbulos vermelhos,

os linfócitos esplênicos foram cultivados a 3 x 10º células/mL por 3 dias em meio RPMI completo suplementado com 50 uM 2-ME e 100 U/mL de IL-2 humano recombinante (PeproTech, Inc). As células Ramos que expressam mIgE.FcL (células alvo) foram marcadas com CFSE (Invitrogen) em PBS/BSA a 0,1% por 10 minutos a 37ºC. Após três lavagens com meio RPMI 1640 completo frio, as células foram ajustadas para 10º células/mL. Alíquotas de 20.000 células marcadas em 200 ul de meio RPM! completo foram revestidas com anticorpos IgG policlonais purificados dos soros imunes correspondentes a 10 ug/mL por 30 min a 37ºC e, em seguida, combinados com linfócitos esplênicos ativados por IL-2 (células efetoras) a uma razão E/T de 30. Após 24 h de incubação, as células totais foram coradas com 7 amino actinomicina D (7-AAD, Invitrogen) a 2,5 ug /mL por 15 min em gelo e depois analisadas em um citômetro de fluxo Becton Dickinson FACS Canto Il (BD Biosciences). As células-alvo vivas foram definidas como CFSE-positivas e 7-AAD negativas em uma análise de pontos. A porcentagem de células-alvo lisadas em uma determinada razão E/T foi: 100 x [(porcentagem de células-alvo vivas no controle independente de anticorpos - porcentagem de células-alvo vivas na amostra)/porcentagem de células-alvo vivas no controle independente de anticorpos. EXEMPLO 4 ANIMAIS USADOS EM ESTUDOS DE SEGURANÇA, IMUNOGENICIDADE, TOXICIDADE E EFICÁCIA a. Porquinhos-da-índia:

[00187] Foram realizados estudos de imunogenicidade em porquinhos-da-índia maduros, puros, adultas, machos e fêmeas Duncan-Hartley (300-350 g/BW). Os experimentos utilizaram pelo menos 3 porquinhos-da-índia por grupo. Protocolos envolvendo porquinhos-da-índia Duncan-Hartley (8 a 12 semanas de idade; Covance Research Laboratories, Denver, PA, EUA), foram executados sob aplicações aprovadas pela IACUC nas instalações de animais contratadas e também na United Biomedical, Inc. (UBI), como patrocinador. b. Macacos Cynomolgus:

[00188] Os estudos de imunogenicidade e toxicidade de dose repetida em macacos adultos machos e fêmeas (Macaca fascicularis, aproximadamente 4 anos de idade; Joinn Laboratories, Suzhou, China) foram conduzidos sob aplicações aprovadas da IACUC nas instalações de animais contratadas, bem como na UBI, como patrocinador. c. Camundongos hIGHE Knockin:

[00189] Uma cepa de camundongo cujo gene IGHG1 é substituído pelo gene IGHE humano pelo gene homólogo direcionado no fundo genético C57BL/B6 expressa IgE secretora e ligada à membrana humana (Lu, el al., 2015). Os camundongos hlGHE expressam IgE humana sob o controle regulatórios dos elementos de transcrição de IGHG1 de murino e expressam IgE ligada à membrana humana por meio de junção alternativa de RNA de elementos regulatórios humanos. A IgE sérica foi detectada em 8 a 10 semanas de idade em circulação. Os filhotes jovens de um solo misto de hIGHE x Balb/c (10 — 12 semanas de idade) foram usados em um modelo de prevenção de uma resposta imune primária/memória e em um modelo terapêutico de uma resposta imune de sensibilização/recuperação. Ambos os estudos foram realizados sob solicitações aprovadas da IACUC nas instalações de animais contratadas (Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde, Taiwan), bem como na UBI, como patrocinador.

[00190] Os efeitos das vacinas intramusculares durante um período de 16 semanas foram observados para a resposta de anticorpos pelo ensaio ELISA de IgE sérica humana e para evidência de níveis reduzidos de IgE sérica total, bem como IgE específica de antígeno, após um desafio antigênico.

[00191] Antes da imunização, as amostras de soro de animais individuais foram testadas quanto à presença de IgE humana sérica, de acordo com os métodos descritos acima neste exemplo. Cada animal foi imunizado com construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE por dose das formulações de vacina, dependendo da espécie e protocolo. EXEMPLO 5

FORMULAÇÕES DE VACINAS PARA AVALIAÇÃO DE

IMUNOGENICIDADE DE CONSTRUTOS DE PEPTÍDEOS EMPD DE IgE EM PORQUINHOS-DA-ÍNDIA, CAMUNDONGOS KNOCK-IN

TRANSGÊNICOS E MACACOS CYNOMOLGUS PARA SELEÇÃO FINAL DE PRODUTOS

[00192] As composições farmacêuticas e formulações de vacina usadas em cada experimento são descritas em mais detalhes abaixo. Resumidamente, as formulações especificadas em cada um dos grupos de estudo geralmente continham todos os tipos de construtos de peptídeo EMPD de IgE projetados com um segmento do peptídeo EMPD de IgE ligado por diferentes tipos de espaçadores (por exemplo, eK ou KKK para aumentar a solubilidade do construto de peptídeo) e variações de epítopos promíscuos de células T auxiliares, incluindo dois conjuntos de epítopos auxiliares T artificiais derivados da proteína de fusão do vírus do Sarampo e do antígeno de superfície da Hepatite B com o(s) segmento(s) de peptídeo EMPD de IgE ligado(s) no N-termina dos construtos de peptídeo. Mais de 100 construtos de peptídeos EMPD de IgE projetados foram inicialmente avaliados em porquinhos-da-índia quanto à sua imunogenicidade relativa com a EMPD de IgE 1-52 e ainda pela reatividade cruzada com a membrana IgE em células B contendo IgE (linhagem celular de Ramos). Os construtos de peptídeo EMPD de IgE foram preparados em uma emulsão de água em óleo com Seppic Montanide'Y [ISA 51 como o óleo aprovado para uso em vacina humana,

ou misturados com sais minerais ADJUPHOS ou ALHYDROGEL (Alúmen), em quantidades variáveis de construtos de peptídeo, conforme especificado. As vacinas eram geralmente preparadas dissolvendo os construtos de peptídeo EMPD de IgE em água a cerca de 20 a 800 ug/mL e formuladas com Montanide'Y ISA 51 em emulsões de água em óleo (1:1 em volume) ou com sais minerais ADJUPHOS ou ALHYDROGEL (Alúmen) (1:1 em volume). As formulações de vacina foram mantidas à temperatura ambiente durante cerca de 30 min e misturadas em vórtice durante cerca de 10 a 15 segundos antes da imunização.

[00193] Os animais foram imunizados com 2 a 3 doses de uma formulação de vacina específica, que foram administradas no tempo O (inicialização) e 3 semanas após a imunização inicial (wpi) (reforço), opcionalmente 5 ou 6 wpi para um segundo reforço, por via intramuscular. Estes animais imunizados foram então testados para avaliar a imunogenicidade dos vários imunógenos de peptídeo EMPD de IgE sintéticos presentes na formulação da vacina, bem como sua reatividade cruzada com o EMPD de IgE 1-52. Os imunógenos de peptídeo EMPD de IgE com imunogenicidade potente na triagem inicial em porquinhos-da-índia foram posteriormente testados em emulsão água em óleo, sais minerais e formulações à base de alúmen em Macacos para regimes de dosagem durante um período especificado, conforme determinado pelos protocolos de imunizações.

[00194] Somente os candidatos mais promissores do imunógeno de peptídeo EMPD de IgE foram avaliados extensivamente pela capacidade do soro imune de mediar ADCC, apoptose de células B portadoras de mIgE e em camundongos transgênicos knock-in e Macacos por sua capacidade de quebrar a tolerância na mesma espécie com autoantígeno EMPD de IgE antes de ser incorporado nas formulações finais de vacina para estudos guiados por GLP, de imunogenicidade, duração, toxicidade e eficácia relacionada à prova, em preparação para a apresentação de um pedido de novo fármaco em investigação e ensaios clínicos em pacientes com doenças alérgicas mediadas por IgE. EXEMPLO 6 FUNDAMENTO DO PROJETO, TRIAGEM, IDENTIFICAÇÃO,

AVALIAÇÃO DE PROPRIEDADES FUNCIONAIS E OTIMIZAÇÃO DE

FORMULAÇÕES DE VACINAS COM COMPONENTES COMPLEMENTARES QUE INCORPORAM construtos de imunógeno DE PEPTÍDEOS EMPD de IgE 1-39 PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS ALÉRGICAS MEDIADAS POR IgE

[00195] As Figuras 2A e 2B ilustram a justificativa para a depleção de células B de mIgE direcionando EMPD de IgE. A IgE é expressa em duas formas: IgE secretora e IgE ligada à membrana (mIgE) (Figura 2A, esquerda e direita, respectivamente). A IgE secretora é capturada na superfície celular dos basófilos e mastócitos através do FCRI, enquanto a mlgE está presente exclusivamente nas células B comprometidas com IgE como parte do receptor da célula B (BCR). O domínio proximal da membrana extracelular (EMPD) da mIgE é um segmento peptídico de 67 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) entre o domínio CH4 e a região transmembranar, encontrado exclusivamente nas células B da mIgE. À singularidade da EMPD de IgE forneceu um sítio atraente para o direcionamento de células B portadoras de mIgE. A depleção de células B mIgE direcionado EMPD de IgE permite a supressão da produção de IgE específica de alérgenos antes de sua diferenciação para se tornarem novas células plasmáticas secretoras de IgE (Figura 2B). As células plasmáticas que secretam IgE existentes com sua vida útil limitada irão morrer gradualmente, resultando no declínio gradual da IgE total e específica de alérgenos.

[00196] A Figura3 é um fluxograma que identifica o processo de desenvolvimento desde a descoberta até a comercialização (industrialização) de uma formulação de vacina de acordo com uma modalidade específica divulgada aqui. A presente descrição inclui projeto de imunógeno de peptídeo, projeto de composição de peptídeo, projeto de formulação de vacina, projeto de estudo de antigenicidade funcional in vitro, projeto de estudo de imunogenicidade e eficácia in vivo e projeto de protocolo clínico, conforme resumido aqui. A avaliação detalhada de cada uma das etapas surpreendentemente leva a uma série de experimentos que resultam na comercialização final de uma formulação de vacina segura e eficaz.

[00197] Um resumo geral das etapas é descrito abaixo: a. Histórico do projeto

[00198] Cada construo de imunógeno de peptídeo ou produto imunoterapêutico requer seu próprio foco e abordagem de projeto com base em seu mecanismo específico da doença e na(s) proteína(s) alvo necessária(s) para a intervenção. O alvo no qual os projetos são modelados pode incluir proteínas celulares envolvidas em uma via de doença ou um agente infeccioso no qual várias proteínas do patógeno podem estar envolvidas. O processo, desde a pesquisa até a comercialização, é muito longo, normalmente leva uma ou mais décadas para ser realizado.

[00199] É necessário um extenso processo de validação sorológica após a seleção da molécula alvo. A identificação dos epítopos da célula B e da célula T e do(s) sítio(s) funcional(is) dentro da molécula alvo submetida à intervenção é importante para o projeto do construto de imunógeno. Uma vez reconhecido o epítopo da célula B alvo, são realizados estudos piloto consecutivos de imunogenicidade em pequenos animais que incorporam vários suportes auxiliares T (proteínas transportadoras ou peptídeos auxiliares T adequados) para avaliar as propriedades funcionais dos anticorpos desencadeados por composições farmacêuticas dos peptídeos projetados. Essa aplicação sorológica é então realizada em animais das espécies alvo para validação adicional da imunogenicidade e propriedades funcionais dos anticorpos desencadeados. Todos os estudos são realizados em vários grupos paralelos com soros coletados nos hospedeiros imunizados para avaliação. Também são realizados estudos iniciais de imunogenicidade nas espécies-alvo ou em primatas não humanos no caso de composições farmacêuticas humanas para validar ainda mais a imunogenicidade e a direção do projeto. Os peptídeos alvo são então preparados em misturas variadas para avaliar a diferença sutil na propriedade funcional relacionada às respectivas interações entre construtos de peptídeos quando usadas em combinações para preparar os respectivos projetos de formulação. Após avaliação adicional, os construtos finais do peptídeo, as composições de peptídeo e formulações dos mesmos, juntamente com os respectivos parâmetros físicos das formulações são assim estabelecidos, levando ao processo final de desenvolvimento do produto. b. Projeto e validação de construtos de imunógeno de peptídeo derivado de EMPD de IgE para composições farmacêuticas com potencial para tratar pacientes com doença alérgica mediada por IgE

[00200] Afim de gerar os construtos de peptídeos mais potentes para incorporação nas composições farmacêuticas, um grande repertório de peptídeos de epítopo da célula B de EMPD de IgE (SEQ ID NOs: 5-8) (Tabela 1) e epítopos auxiliares T promissores derivados de vários patógenos ou epítopos artificialmente auxiliares T projetados adicionalmente (SEQ ID NOs: 59-87) (Tabela 2) foram transformados em construtos de imunógeno de peptídeos EMPD de IgE para estudos de imunogenicidade em porquinhos-da-índia. i) Seleção de EMPD de IgE G1-H40 como a região alvo para o projeto de imunógenos.

[00201] AIgE é expressa em duas formas: IgE secretora e IgE ligada à membrana (mIgE). A IgE secretora é capturada na superfície celular dos basófilos e mastócitos através do FcRI, enquanto a mIgE está presente exclusivamente nas células B comprometidas com IgE como parte do receptor da célula B (BCR). O domínio proximal da membrana extracelular de comprimento completo (EMPD) da mIgE é um segmento peptídico de 67 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) entre o domínio CH4 e a região transmembranar, encontrado exclusivamente nas células B da MmIgE. As células plasmáticas que secretam IgE existentes com sua vida útil limitada irão morrer gradualmente, resultando no declínio gradual da IgE total e específica de alérgenos. De muitas construtos de imunógeno de peptídeo testados quanto à imunogenicidade em porquinhos-da- índia, os dados de uma série de construtos de imunógeno de peptídeo derivados de EMPD de IgE (SEQ ID NOs: 88-93) foram feitos incorporando peptídeos representativos de epítopo da célula B de EMPD de IgE derivados de EMPD de IgE 1- 52 (SEQ ID NO: 2) e um peptídeo representativo do epítopo Th UBIThO1 (SEQ ID NO: 72) para testes de imunogenicidade em porquinhos-da-índia usando o peptídeo EMPD de IgE 1-39 (SEQ ID NO: 5) para revestimento de placas, como mostrado na Tabela 4. Foi encontrada alta imunogenicidade com seis construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE com três orientações em que o peptídeo UBIThO1 Th foi ligado ao peptídeo epítopo da célula B de EMPD de IgE no C-terminal (SEQ ID NOs: 88 e 91) ou no N-terminal (SEQ ID NOs: 89, 90 e 92) ou nos C e N-terminais (SEQ ID NO: 93) do peptídeo de epítopo da célula B de EMPD de IgE com um ligante espaçador de eK. Também foram empregados construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE contendo o ligante mais longo eK-KKK (SEQ I|D NO: 129) para permitir alta imunogenicidade no projeto de construtos (por exemplo, SEQ ID NOs:

94-97).

[00202] Fragmentos mais curtos de peptídeos de epítopo da célula B de EMPD de IgE (SEQ ID NOs: 7 e 8) também foram potencializados pelo peptídeo de epítopo auxiliar T, como UBIThO1 (SEQ ID NOs: 96 e 97, respectivamente) para imunogenicidade. No entanto, esses construtos suscitaram anticorpos com fraca capacidade de ligação à EMPD de IgE (por exemplo, para fragmentos mais longos com SEQ ID NOs: 5, 6, 7 e 8), como mostrado na Tabela 5. Os construtos das SEQ ID NOs: 96 e 97 também provocaram anticorpos com perfis de ligação muito restritos, como mostrado por estudos de mapeamento de epítopos lineares, onde apenas peptídeos de 10mer com SEQ ID NO: 25 (aminoácidos 8-17) e SEQ ID NO: 39 (aminoácidos 22-31) foram reativos, respectivamente. Além disso, verificou-se que os anticorpos desencadeados dos construtos de SEQ ID NOs: 96 e 97 têm um efeito mínimo de ligação às células mIgE-B (como mostrado na Figura 6C), um pré-requisito para indução da apoptose das células mIgE-B. ii) Classificação dos epítopos auxiliares T heterólogos derivados de patógenos e sua inclusão no projeto de construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE para aumentar a imunogenicidade do peptídeo selecionado do epítopo da célula B de EMPD de IgE.

[00203] ATabela2 lista um total de 29 epítopos heterólogos Th (SEQ ID NOs: 59-87) que foram testados quanto à sua potência relativa em várias espécies, de camundongos, ratos, porquinhos-da-índia, babuínos, macacos etc., para melhorar a imunogenicidade do epítopo das células B.

[00204] Um estudo representativo dos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE contendo o peptídeo de epítopo da célula B de EMPD de IgE 1-39 (SEQ ID NO: 5) ligado por meio de um espaçador eK com epítopos auxiliares T promíscuos individuais(SEQ ID NOs: 88, 98-

124 e 130) foi realizado para estudo de imunogenicidade em porquinhos-da-índia para classificar a eficácia relativa dos respectivos epítopos auxiliares T heterólogos, como mostrado na Tabela 6. Devido às altas capacidades de intensificação do epítopo B de alguns epítopos Th, os resultados obtidos 3 semanas após a imunização inicial (3 wpi) após apenas a imunização única dos porquinhos-da-índia foram usados para classificar os 29 construtos diferentes de imunógeno do peptídeo EMPD de IgE. Embora todos os epítopos Th selecionados tenham a capacidade de intensificar a imunogenicidade do peptídeo de epítopo B EMPD de IgE, o construto mais potente foi o construto da SEQ ID NO: 88 e o menos foi o construto da SEQ ID NO: 101.

[00205] —Acalibração cuidadosa da imunogenicidade para cada um e todos os constructos de imunógeno do peptídeo EMPD de IgE em diferentes espécies, incluindo primatas, garantiria a seleção final do peptídeo Th e sucesso no desenvolvimento de formulações finais de vacina. iii) Avaliação da imunogenicidade de construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE G1-C39 para suas reatividades de anticorpos com os peptídeos EMPD de IgE G1-C39 e de comprimento completo correspondentes.

[00206] AFigurad4ilustra a cinética da resposta do anticorpo durante um período de 8 semanas em porquinhos-da-índia imunizados com diferentes construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE (SEQ ID NOs: 88 a 94, 96 e 97). O soro foi diluído de 1:100 a 1:10.000.000 por uma diluição em série de 10 vezes. As placas ELISA foram revestidas com peptídeo EMPD de IgE 1-39 (SEQ ID NO: 5) a 0,5 ug de peptídeo por poço. O título de um soro testado, expresso como Logo, foi calculado por análise de regressão linear do A450nm com o corte Aasso definido em 0,5.

[00207] A Figura 5 ilustra a curva de titulação de vários anticorpos policlonais anti-EMPD de IgE purificados criados por diferentes construtos de imunógeno EMPD de IgE (SEQ ID NOs: 88 a 94, 96 e 97). As placas ELISA foram revestidas com uma proteína recombinante contendo EMPD de IgE, y1-em67, que contém a sequência da SEQ ID NO: 1. Os anticorpos policlonais anti-EMPD de IgE purificados a partir de soros de cobaias por cromatografia em proteína A foram diluídos de 100 ug/mL a 0,0238 ng/mL por uma diluição em série 4 vezes. O EC50 de cada preparação de anticorpos policlonais anti-EMPD de IgE foi calculado por regressão não linear com ajuste de curva logística de quatro parâmetros.

[00208] Como mostrado nas Figuras 4 e 5, os construtos de imunógeno de peptídeo das SEQ ID NOs: 88 a 94, que foram selecionados de muitos outros projetos, demonstraram alta imunogenicidade com títulos Logio principalmente acima de 4. As medições mais precisas de EC5o usando anticorpos purificados de cada grupo, como mostrado na Figura 5, são de 0,02111 a 0,08892 ug/mL com construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE contendo peptídeos de epítopo de células B mais longos de EMPD de IgE 1-39 e EMPD de IgE 7-40 (SEQ ID NOs: 88-94) mostrando imunogenicidade consideravelmente maior em comparação com construtos de imunógeno de peptídeo contendo peptídeosde epítopo de células B mais curtos de EMPD de IgE (<20 resíduos de comprimento), como EMPD de IgE 1-17 ou EMPD de IlgE 19-38 (SEQ ID NOs: 96 e 97).

[00209] Os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE contendo um espaçador mais longo entre a célula B e os epítopos Th também reduziram significativamente a imunogenicidade, como no caso do projeto de peptídeo de epítopo da célula B de EMPD de IgE (SEQ ID NOs: 94 vs 89 para os respectivos ECsos de 0,08892 vs 0,02368). Entre os peptídeos de epítopo da célula B com mais de 20 resíduos de comprimento, o EMPD de IgE 1-39 foi considerado o mais ideal em projeto e, portanto, seria usado com mais frequência nos exemplos a seguir como o peptídeo de epítopo da célula B em projetos de imunógeno de peptídeo representativos para mais avaliação por vários ensaios funcionais in vitro e avaliação de eficácia in vivo. iv) Avaliação da imunogenicidade dos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE para sua ligação de anticorpo a células B portadoras de IgE que estão comprometidas com a diferenciação de células B na secreção de IgE.

[00210] As Figuras 6A a 6C ilustram a ligação a células B derivadas de linhagens de células Ramos que expressam mIgE.Fc. ou mIgE.Fes (ver Exemplo 2 para método de coloração por citoflurógrafo) por anticorpos policlonais purificados de soros de porquinho-da-índia reunidos para cada grupo de animais imunizados com construtos de imunógeno de EMPD de IgE (SEQ ID NOs: 88 a 97). Anticorpos policlonais anti-EMPD de IgE purificados a partir de soros de cobaias por cromatografia em proteína A foram utilizados a 10 ug/mL.

[00211] Foi encontrada baixa ligação de fundo com células da linhagem de células Ramos mIgE.FCs sem o fragmento EMPD da sequência alvo com anticorpos purificados de todos os grupos, indicativos de alta especificidade deste ensaio de ligação celular. Como mostrado nas Figuras 6A a 6C, os anticorpos gerados a partir de animais imunizados com construtos de imunógeno de peptídeo de SEQ ID NOs: 88 a 94, 96 e 97 tinham diferentes afinidades de ligação às células da linhagem de células Ramos mIgE.Fcr. Em particular, os anticorpos gerados a partir de construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE contendo o peptídeo de epítopo longo da célula B de EMPD de IgE 1-39 (SEQ ID NOs: 88-94) demonstraram maior ligação à mlgE das células da linhagem de células Ramos mIgE.Fci em comparação aos anticorpos gerados pelos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE contendo peptídeos de epítopo da célula B com menos que 20 resíduos (SEQ ID NOs: 96-97). Além disso, os anticorpos gerados a partir do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE com um espaçador mais curto (eK) tinham uma ligação de mIgE mais alta de células da linhagem de células Ramos mIgE.FCL em comparação com construtos tendo um espaçador mais longo (eK-KKK; SEQ ID NO: 129), que pode ser visto comparando os resultados da SEQ ID NO: 89 na Figura 6A com os resultados da SEQ ID NO: 94 na Figura 6C.

[00212] —Foiencontrada uma correlação negativa entre os valores de EC5o dos anticorpos policlonais do grupo e a porcentagem (%) de ligação positiva das células portadoras de IgE. A porcentagem de ligação a células B portadoras de IgE é um parâmetro funcional importante para avaliação da reatividade cruzada de anticorpos e eficácia funcional da imunogenicidade de um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE. v) Avaliação da imunogenicidade dos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE quanto à sua capacidade de gerar anticorpos com alta potência para induzir apoptose de células B portadoras de IgE que estão comprometidas com a diferenciação de células B na secreção de IgE.

[00213] A Figura 7 mostra que a apoptose foi induzida por várias preparações de anticorpos policlonais anti-EMPD de IgE criados por construtos de imunógeno EMPD de IgE (SEQ ID NOs: 88 a 93) em um modo dependente da dose na superfície celular das células Ramos que expressam mIgE.Fcr. Os anticorpos policlonais anticEMPD de IgE purificados a partir de soros de cobaias por cromatografia em proteína A foram diluídos de 1000 a 62,5 ng/mL por uma diluição em série 2 vezes. Xolairê, um anticorpo monocilonal anti-lgE humanizado, foi usado como controle positivo. O EC5o de cada conjunto de anticorpos policlonais anti-EMPD de IgE foi calculado por regressão não linear com ajuste de curva logística de quatro parâmetros.

[00214] Como mostrado na Figura 7, enquanto o Xolairê (um anticorpo monoclonal anti-|lgE direcionando o domínio CH3 de ligação a um receptor Fc de uma molécula de IgE) é mostrado com o menor valor de ECso (121,4 ng/mL) indicativo de maior eficácia, sua presença no soro neutralizaria toda essa potência indutora de apoptose devido à neutralização pela IgE sérica. Entre os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE selecionados testados (SEQ ID NOs: 88-93), foram observados valores de ECr5o de 277,5 a 536 ng/mL, indicativos de alta potência indutora de apoptose sem interferência IgE sérica devido à sua ligação à sequência única da região alvo de EMPD. Estas células B portadoras de IgE são as células comprometidas com a diferenciação de células B na secreção de IgE.

[00215] A indução de apoptose dessas células por imunização do hospedeiro com construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE (por exemplo, SEQ ID NOs: 88-93) desencadearia a supressão da síntese de IgE, levando à redução sérica de IgE, uma das principais causas de doenças alérgicas. vi) Avaliação da imunogenicidade dos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE quanto à sua capacidade de gerar anticorpos com alta potência para desencadear citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo (ADCC) de células B portadoras de IgE que estão comprometidas com a diferenciação de células B na secreção de IgE.

[00216] A Figura8 mostra que várias preparações de anticorpos policlonais anticEMPD de IgE gerados por diferentes construtos de imunógeno EMPD de IgE (SEQ ID NO: 88 a 93) foram capazes de induzir ADCC contra células Ramos que expressam mIgE.Fci a uma razão de efetor/alvo de 30. Anticorpos policlonais anti-EMPD de IgE purificados a partir de soros de cobaias por cromatografia em proteína

A foram utilizados a 10 ug/mL. As células esplênicas de camundongo estimuladas por IL-2 foram usadas como células efetoras. Uma secreção de anticorpo monoclional anti-lgêE 5D5 de camundongo foi usada como controle positivo.

[00217] Como mostrado na Figura 8, todos os construtos de imunógeno de peptídeo com peptídeos longos de epítopo da célula B com mais de 20 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NOs: 88-93) induzindo ADCC de células B portadoras de IgE comprometidas com a diferenciação de células B na secreção de IgE indicativa de redução e supressão dos níveis séricos de IgE após imunização do hospedeiro com esses construtos de imunógeno de peptídeo. vii) Expansão da cobertura de MHC usando construtos de imunógeno de peptídeo derivados de EMPD de IgE com diferentes epítopos auxiliares T promíscuos.

[00218] Ao projetar uma composição farmacêutica para tratar pacientes com antecedentes genéticos diversos, é importante permitir que o projeto cubra a população máxima com antecedentes genéticos diversos. Uma vez que os epítopos auxiliares T promíscuos derivados de MVF ou HBsAg representam entre os mais potentes para proporcionar essa intensificação de imunogenicidade, a combinação de construtos de peptídeo contendo esses dois epítopos T auxiliares pode ser projetada para permitir um efeito sinergético da imunogenicidade. Espera-se que uma mistura de dois construtos de imunógeno de peptídeo com os mesmos epítopos de células B provoque uma resposta imune respeitável quando comparada com a provocada pelo respectivo construto individual de peptídeo. viii) Mapeamento de epítopos para análise de especificidade fina por soros imunes (9 wpi) desencadeados por vários construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE

[00219] O projeto de uma vacina IGgE-EMPD contendo um construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE foi focado na estrutura de alça especial de C18-C39 na região média de IGgE-EMPD como um alvo funcional e estrutural. Este projeto baseado em estrutura visa reter a estrutura de alça extracelular nativa como um alvo imunogênico.

[00220] Quatro fragmentos de peptídeos representativos de IgE- EMPD de 1-17 (SEQ ID NO: 7), 19-38 (SEQ ID NO: 8), 1-39 (SEQ ID NO: 5) e 7-40 (SEQ ID NO: 6) foram utilizados para projetar os peptídeos do epítopo da célula B que foram ligados ao UBIThO1 (SEQ ID NO: 72) ou UBIThO2 (SEQ ID NO: 73) no N ou C-terminal dos peptídeos do epítopo da célula B para formar o protótipo de imunógenos de peptídeo. O ligante eK ou espaçador eK-KKK (SEQ ID NO: 129) foi usado entre a célula B e os epítopos Th para formar os construtos de imunógeno de peptídeo mostrados na Tabela 3 (SEQ ID NOs: 88 a 97). Todos os fragmentos de peptídeo com aminoácidos (aa) 1-39 e 7-40 foram projetados com uma estrutura de alça restrita C18-C39 por ciclização.

[00221] Testes ELISA usando peptídeos de epítopo da célula B de IgE-EMPD individuais de 1-17 (SEQ ID NO: 7), 19-38 (SEQ ID NO: 8), 1-39 (SEQ ID NO: 5) e 7-40 (SEQ ID NO: 6) para revestimento de placa foi avaliada quanto à reatividade de anticorpos dos soros hiperimunes obtidos de porquinhos-da-índia imunizados com seus construtos de imunógeno de peptídeo correspondentes (SEQ ID NOs: 96, 97, 88, 89, 93). Os resultados mostraram que os construtos SEQ ID NOs: 88, 89 e 93 induzem anticorpos de alto título contra todos os quatro peptídeos do epítopo da célula B de EMPD de IgE enquanto os antissoros de porquinho-da-índia induzidos por construtos de imunógeno de peptídeo IgE-EMPD 1-17 (SEQ ID NO: 96) e IgE-EMPD 19-38 (SEQ ID NO: 97) tiveram apenas reatividade de anticorpo com seus peptídeos de epítopo da célula B correspondentes (por exemplo, SEQ ID NOs: 7 ou 8) enquanto não apresentaram reatividade cruzada com os peptídeos de epítopo da célula B de EMPD de IgE (SEQ ID NOs: 8 ou 7) do epítopo vizinho não correspondente, indicativo da alta especificidade da imunogenicidade, ou seja, os construtos de imunógeno projetados são capazes de evocar anticorpos específicos para reagir com os domínios do epítopo da célula B correspondentes a IHgE-EMPD (Tabela 5)

[00222] Em um estudo fino de mapeamento de epítopos (Tabela 5) para localizar o(s) sítio(s) de ligação ao(s) anticorpo(s) a resíduos específicos na região alvo, 50 peptídeos de 10-meros sobrepostos (SEQ ID NOs: 10 a 58) foram sintetizados que cobrem os primeiros 8 aminoácidos ácidos do C-terminal IgE CH4 e região de sequência de 1 a 50 aminoácidos de IgE-EMPD. Estes peptídeos de 10 mer foram revestidos individualmente em poços de placas de microtitulação de 96 poços como imunoabsorventes em fase sólida. Os antissoros agrupados de porquinhos-da-índia foram adicionados a uma diluição de 1:100 em tampão de diluente de amostra aos poços da placa revestidos com peptídeo de 10-mer a 2,0 ug/mL, seguido de incubação por uma hora a 37ºC. Após lavagem dos poços da placa com tampão de lavagem, a rProteína A/G conjugada com peroxidase de rábano silvestre foi adicionada e incubada por 30 min. Após lavagem com PBS novamente, o substrato foi adicionado aos poços para medição da absorbância a 450 nm pelo leitor de placas ELISA, quando as amostras foram analisadas em duplicado. A ligação do imunógeno de peptídeo IgE- EMPD desencadeou soros imunes aos poços revestidos do peptídeo do epítopo da célula B de EMPD de IgE, representam o sinal máximo de ligação ao anticorpo.

[00223] Os resultados do mapeamento do epítopo fino mostraram que os soros combinados de porquinhos-da-índia da construto de imunógeno de peptídeo derivado de IGgE-EMPD 19-38 (SEQ ID NO: 97, com um epítopo da célula B linear não ciclizado, H19-R38) reconhecem o peptídeo EMPD de IgE 22-31 (SEQ ID NO: 39) localizado na região média de IgE-EMPD. Também reagiu com o peptídeo EMPD de IgE 19-

38 (SEQ ID NO: 8), 1-39 (SEQ ID NO: 5) e 7-40 (SEQ ID NO: 6), mas não 1-17 (SEQ ID NO: 7)

[00224] Oantissoro induzido por EMPD de IgE 1-17 (SEQID NO: 96, um epítopo da célula B linear não ciclizado, G1-L17) reconheceu EMPD de IgE 8-17 (SEQ ID NO: 25) na região N-terminal de IgE- EMPD, bem como EMPD de IgE 1-17 (SEQ ID NO: 7), 1-39 (SEQ ID NO: 5) e 7-40 (SEQ ID NO: 6), mas não o peptídeo 19-38 (SEQ ID NO: 8). Os antissoros induzidos pelos construtos de imunógeno EMPD de IgE1-17 (SEQ ID NO: 96) e EMPD de IgE 19-38 (SEQ ID NO: 97) não apresentaram reatividade cruzada.

[00225] “Curiosamente, dois construtos de imunógenos IgE-EMPD 1- 39 com o epítopo UBIThO1 ligado ao peptídeo de epítopo da célula B de EMPD de IgE no N-terminal (SEQ ID NO: 89) ou no C-terminal (SEQ ID NO: 88) geraram soros imunes que reconhecem padrões de ligação a epítopos distintamente diferentes. Os soros imunes induzidos pelo construto de imunógeno (SEQ ID NO: 89, UBTh1, localizada no N- terminal do peptídeo) reagiram fortemente com apenas um peptídeo de 10-mer de (SEQ ID NO: 47) em aa 30-39, próximo à região C-terminal de IgE-EMPD. Também reagiu fracamente com EMPD de IgE 9-18 na região N-terminal (SEQ ID NO: 27).

[00226] No entanto, para outro construto de imunógeno IgE-EMPD 1-39 (SEQ ID NO: 88, UBTh1 localizado no C-terminal), o antissoro induzido reagiu fortemente com três epítopos lineares descontínuos representados por EMPD de IgE 9-19 (SEQ ID NO: 27 e 28); EMPD de IgE 19-31 (SEQ ID NO: 37, 38, 39 e 40) e EMPD de IgE 30-43 (SEQ ID NO: 48, 49, 50, 51 e 52). O construto de imunógeno de peptídeo (SEQ ID NO: 88) demonstrou imunogenicidade muito mais forte e reagiu com uma superfície muito mais ampla que o construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE (SEQ ID NO: 89). Esta descoberta de imunogenicidade muito mais forte associada ao construto de imunógeno de peptídeo (SEQ ID NO: 88) também exibiu atividades ADCC e apoptose muito mais fortes em linfócitos que expressam IgE do que o construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE (SEQ ID NO: 89).

[00227] Quanto ao construto de imunógeno IgE-EMPD 7-40 (SEQ ID NO: 93, com dois UBTh1 localizados nos N e C terminais do peptídeo de epítopo da célula B de EMPD de IgE), seus antissoros induzidos reconheceram duas regiões antigênicas principais semelhantes aos reconhecidos por IgE-EMPD 1-39 por reagirem fortemente com peptídeos na região de EMPD de IgE 18-33 cobertos por peptídeos de SEQ ID NOs: 35-41; EMPD de IgE 29-43 (SEQ ID NOs: 45-51). O construto de imunógeno IGgE-EMPD 7-40 (SEQ ID NO: 93) compartilha regiões determinantes antigênicas semelhantes com o construto de imunógeno IgE-EMPD 1-39 (SEQ ID NO: 88, o UBTh1 no C-terminal do peptídeo de epítopo da célula B de EMPD de IgE). O IgE-EMPD 1-39 (SEQ ID NO: 88) exibiu a melhor eficácia entre todos os construtos de imunógeno de peptídeo projetados, como mostrado por vários ensaios funcionais que se correlacionaram com os resultados mostrados em seu mapeamento de epítopo fino, em que esse construto de imunógeno provocou anticorpos policlonais de alta ligação que reconhecem uma ampla superfície coberta por três ou mais peptídeos de epítopo de célula B na proteína da membrana extracelular de IgE-EMPD. A região do epítopo de EMPD de IgE 30-43 (SEQ ID NOs: 47-51) representa uma região do epítopo da célula B muito importante, localizada na região C- terminal de uma estrutura em alça com proximidade à membrana basal da célula B portadora de IgE, suscetível à apoptose mediada por anticorpos e ADCC. Além disso, uma estrutura em alça ciclizada apresenta um construto de imunógeno de melhor qualidade do que sua contraparte não cíclica (Tabela 5 SEQ ID NO: 88 vs SEQ ID NO: 88 não ciclizada).

[00228] Em resumo, os construtos de imunógeno de peptídeo sintéticos I8E-EMPD projetados (EMPD de IgE 1-39, SEQ ID NO: 88) e (EMPD de IgE 7-40, SEQ ID NO: 93) ambos com um peptídeo de epítopo de célula B representado por uma estrutura de alça dentro da EMPD de IgE que está ligada ao peptídeo de epítopo UBIThO1 que induziu uma resposta imune robusta gerando anticorpos policlonais direcionados para uma nova região de epítopo (aa 29-43) na proteína IgE-EMPD que possui proximidade próxima à membrana celular devido à sua localização na região C-terminal da estrutura de alça central, permitindo a reticulação do maior número possível de IgE de membrana para induzir ADCC e apoptose para depleção de linfócitos B que expressam IgE (Tabela 5). EXEMPLO 7

RESPOSTA DE ANTICORPOS FOCADA ENCONTRADA

EXCLUSIVAMENTE PARA O EPÍTOPO DE CÉLULAS B DO CONSTRUTO DE IMUNÓGENO DE PEPTÍDEO EMPD de IGE

[00229] É sabido que todas as proteínas transportadoras (por exemplo, Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) ou outras proteínas transportadoras, como as proteínas de toxoide da Difteria (DT) e Toxoide do Tétano (TT)) usadas para potenciar uma resposta imune direcionada contra um peptídeo de célula B alvo por conjugação química desse peptídeo de epítopo de célula B com a respectiva proteína transportadora provocará mais que 90% dos anticorpos direcionados contra a proteína transportadora potenciadora e menos que 10% dos anticorpos direcionam novamente o epítopo de célula B direcionado em hospedeiros imunizados.

[00230] Por conseguinte, é de interesse avaliar a especificidade dos anticorpos desencadeados pelos construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE da presente invenção. Um construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE representativo (SEQ ID NO: 94) com epítopo de célula B (SEQ ID NO: 5) ligado através de uma sequência espaçadora eK-KKK (SEQ ID NO: 129) ao epítopo heterólogo de células T UBIThO1 (SEQ ID NO: 72) foi preparado para avaliação da imunogenicidade. O UBIThO1 (peptídeo auxiliar T utilizado para imunopotenciação do epítopo B) foi revestido nas placas e os soros de porquinhos-da-índia imunizados foram empregados para testar a reatividade cruzada com o peptídeo UBITh&O1 usado para imunopotenciação. A Tabela 7 mostra que os anticorpos gerados a partir do construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE (SEQ ID NO: 94) tinham alta imunogenicidade em relação ao epítopo B alvo correspondente da EMPD de IgE (SEQ ID NO: 5); considerando que a maioria, se não todos, dos soros imunes foram considerados não reativos ao peptídeo UBIThO1 (SEQ ID NO: 72).

[00231] Emresumo, o projeto de imunógeno que incorpora o epítopo da célula B alvo ligado ao epítopo auxiliar T cuidadosamente selecionado resulta na geração de uma resposta imune limpa e focada que provoca anticorpos direcionados apenas ao epítopo da célula B da EMPD de IgE e não ao epítopo Th usado para potencializar a resposta imune. Para o projeto da composição farmacêutica, quanto mais específica a resposta imune que um imunógeno gera, maior operfil de segurança que ele fornece para a composição. O construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE desta invenção instantânea é assim altamente específico, mas altamente potente contra o seu alvo. EXEMPLO 8

EFEITOS DA VACINA DE ALERGIA IMUNOTERAPÊUTICA EM

AMBOS OS MODELOS PREVENTIVOS E TERAPÊUTICOS NOS NÍVEIS DE SORO DE IgE DE CAMUNDONGOS KNOCKIN

GENETICAMENTE MODIFICADOS

[00232] Os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE da SEQ ID NO: 88 e SEQ ID NO: 93 foram selecionados para avaliar a produção de IgE na resposta primária e secundária/de memória em um estudo de prova de conceito usando a IgE humana que expressa camundongos geneticamente modificados, uma prole F1 de camundongos knock-in HulGHE x Balb/c.

[00233] Inicialmente, as imunizações de iniciaisde reforço de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE foram realizadas antes da sensibilização por desafio de alérgenos (por exemplo, Papaína). Oito animais (n=8) foram designados para cada um dos seis grupos de tratamento e um grupo placebo, com um total de 7 grupos. Para cada um dos dois imunógenos de peptídeo, três subgrupos com doses diferentes foram projetados em 9 (baixa), 18 (média) e 40 (alta) ug/dose por via i.m. nas semanas O, 3 e 5. Os imunógenos de peptídeo foram formulados com adjuvantes de ISA 51VG e CpG para intensificar as respostas imunes. Os camundongos no grupo placebo foram injetados apenas com veículo da solução de formulação nas semanas O, 3 e 5 por via intramuscular. Nas semanas 10 e 16, todos os grupos de animais, incluindo o grupo placebo, foram sensibilizados com 50 ug de papaína com adjuvante TiterMax Gold por via subcutânea (Figura 10).

[00234] —Aresposta do anticorpo (títulos de IgG contra a proteína de fusão y1-em67) pelos dois imunógenos de peptídeo foi determinada pelo ensaio ELISA, como descrito no Exemplo 2. Todos os camundongos desenvolveram respostas robustas de anticorpos nos seis grupos de tratamento imunizados com doses diferentes nas semanas O, 3, 5. Os dados de ELISA mostram que as amostras de soro de todos os grupos de tratamento com altos títulos de anticorpos se ligam especificamente à proteína de fusão recombinante yi-em67 a partir da semana 3 e permaneceram em altos títulos até a semana 20 (Figura 11). Por outro lado, os camundongos do grupo placebo não geraram anticorpos específicos contra a proteína de fusão yi-em67 recombinante. Estes resultados indicam que todos os grupos de tratamento geraram anticorpos anti-lgE-EMPD com a capacidade potencial de direcionar linfócitos B que expressam IgE, resultando na inibição da produção de IgE. A Figura 11 ilustra que altos títulos de anticorpos foram mantidos durante todo o período de estudo de 20 semanas. Esses resultados também indicam que os imunógenos de peptídeo (SEQ ID NO: 88 e SEQ ID NO: 93) são muito imunogênicos na indução de resposta imune específica, gerando anticorpos EMPD anti- IgE de altos títulos, mesmo no grupo de baixa dose (9 ug/dose) de cada um dos dois imunógenos da vacina.

[00235] Os efeitos de imunização na produção de IgE nas respostas primárias e de memória de camundongos imunizados foram investigados medindo os níveis séricos de IgE basal e os níveis de IgE específicos de alérgenos, com os procedimentos de ensaio descritos no Exemplo 2. Os níveis séricos de IgE basal para pré e pós-vacinação são mostrados na Figura 12, que demonstrou que os níveis séricos de IgE basal em camundongos em todos os grupos de tratamento diminuíram gradualmente em comparação com o ponto de tempo correspondente no grupo placebo. Na semana 10, antes da sensibilização, os níveis basais de IgE diminuíram para o nível mais baixo nos seis grupos de tratamento, enquanto os níveis séricos basais de IgE no grupo placebo não se alteraram consideravelmente. Este resultado indica que, na semana 10, a produção basal de IgE em todos os grupos de tratamento foi significativamente suprimida em animais que receberam uma formulação de vacina contendo um construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE (SEQ ID NO: 88 ou 93) quando comparados ao grupo placebo. A Figura 12 também mostra que os níveis séricos basais de IgE em todos os grupos de tratamento foram suprimidos ao longo do período de estudo de 20 semanas, mesmo após duas sensibilizações de alérgenos nas semanas 10 e 16.

[00236] A produção de lgE específica de alérgenos induzida por papaína com a inicialização na semana 12 e a segunda sensibilização na semana 18 é mostrada nas Figuras 13 e 14, respectivamente. Estes resultados indicam que ambos os construtos de imunógeno de peptídeo (SEQ ID NOs: 88 e 93) foram capazes de suprimir significativamente os níveis de IgE específicos de papaína após sensibilização primária e secundária ao alérgeno quando comparados ao grupo placebo. Não foram observadas diferenças substanciais entre os três níveis de dose em nenhum dos dois imunógenos peptídicos. Após a geração de IgE específica do alérgeno na resposta primária na semana 12, o imunógeno de peptídeo (SEQ ID NO: 88) teve um desempenho ligeiramente melhor que (SEQ ID NO: 93) neste estudo, como mostrado na Figura 13. Ambos os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE exibiram supressão significativa da produção de IgE específica de alérgeno quando comparadas com o grupo placebo nas respostas primária e de memória (Figuras 13 e 14).

[00237] Para investigação adicional sobre o potencial efeito terapêutico dos construtos de imunógeno de peptídeo IgE-EMPD (SEQ ID NO: 88 e SEQ ID NO: 93) direcionando a célula B que expressa IgE para suprimir a produção de IgE e tratar a doença alérgica mediada por IgE, um protocolo adicional foi concebido para avaliar o efeito destes dois construtos de imunógeno de peptídeo numa resposta de sensibilização/recuperação em camundongos knock-in HulGHE. Seis animais foram designados para cada um dos dois grupos de tratamento (N = 6) e quatro animais para o grupo placebo (N = 4), com um total de três grupos. Os camundongos de todos os grupos receberam sensibilização duas vezes, vacinas pré e pós-peptídicas, respectivamente, com 50 ug de papaína/adjuvante TiterMax Gold por via subcutânea na semana O e pela pata na semana 12. Um regime de imunização de inicialização-reforço com 40 ug/0,1 mL de formulação contendo um do dois construtos de imunógeno de peptídeo nas semanas 3, 6 e 8 foi avaliado em ambos os grupos de tratamento, com o grupo placebo administrado apenas com veículo adjuvante (ver Figura 15).

[00238] Os resultados mostraram que todos os grupos, incluindo o placebo, sensibilizaram com papaína, provocaram altos títulos de IgGs específicas para papaína em todos os três grupos após a semana 2 e permaneceram altos até a semana 6 (o último período observado). Os níveis séricos totais de IgE e IgE específicos de papaína atingiram os níveis mais altos na semana 2 e depois diminuíram gradualmente a partir da semana 3 e voltaram à linha de base na semana 6 (Figura 16).

[00239] A vacinação com os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE desencadeou anticorpos de alto título que reconhecem especificamente a proteína de fusão y1-em67. Após três injeções de imunógenos peptídicos nas semanas 3, 6 e 8, os títulos de anticorpos IgG desencadeados (contra anti-vyli-cm67 ou anti-lgE-EMPD) aumentaram constantemente e atingiram o nível mais alto na semana (dados não mostrados) Na semana 12, após a segunda sensibilização à papaína, nenhum dos dois grupos de tratamento apresentou níveis elevados de IgE específicos da papaína; no entanto, o nível de IgE específico da papaína aumentou significativamente no grupo placebo nas semanas 12 e 13 e depois caiu para o nível mais baixo na semana 14 (dados não mostrados).

[00240] Os resultados do estudo indicam que os imunógenos de peptídeo EMPD de IgE das SEQ ID NOs: 88 e 93 são capazes de induzir resposta imune humoral específica para impedir respostas proliferativas de recuperação de células B de memória in vivo, que bloqueiam completamente a produção de IgE específica de papaína evocada pela recuperação de papaína na semana 12, quando comparados ao grupo placebo (Figura 17). No geral, este estudo indica que os construtos de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE divulgado induziram respostas de anticorpos induzidas não apenas inibem a geração de IgE sérica específica de alérgeno a partir da sensibilização primária, mas também suprimem constantemente a IgE sérica específica de alérgeno recuperada do desafio secundário de alérgeno. Este resultado do estudo demonstra que a invenção divulgada fornece uma vacina terapêutica eficaz potencial para o tratamento de doenças alérgicas mediadas por IgE, como a asma. Após um exame atento da eficácia terapêutica para atenuar IgE específica de alérgeno, ambos os imunógenos de peptídeo (SEQ ID NO: 88 e SEQ ID NO: 93) exibiram eficácia semelhante na inibição da produção de IgE específica para alérgenos. EXEMPLO 9

ESTUDOS DE DOSAGEM E FORMULAÇÃO ATRAVÉS DA AVALIAÇÃO DA IMUNOGENICIDADE DAS FORMULAÇÕES DE VACINA CONTRA ALERGIA IMUNOTERAPÊUTICA EM MACACOS

CYNOMOLGUS a. Objetivo geral:

[00241] O objetivo deste estudo foi aos efeitos de imunizações intramusculares com um construto de imunógeno de peptídeo IgE EMPD selecionado SEQ ID NO: 88 durante um período de 20 semanas na imunogenicidade. Os macacos Cynomolgus foram selecionados como modelo animal para avaliação da imunogenicidade da formulação da vacina protótipo de IgE-EMPD e regime de dosagem antes da realização de estudos em humanos. Um construto de imunógeno de peptídeo representativo (SEQ ID NO: 88) foi formulada em duas formulações comumente usadas. Na primeira formulação, o construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE da SEQ ID NO: 88 foi transformado em um complexo imunoestimulatório estabilizado com CpG antes de formar uma emulsão água em óleo misturada com Montanide'y |SA51 (estudo Parte A). Na segunda formulação, o construto de imunógeno de peptídeo EMPD de IgE da SEQ ID NO: 88 foi transformado em um complexo imunoestimulatório estabilizado com CpG antes de formar uma formulação de suspensão com ADJUPHOS (Parte B). Quatro doses de 30 ug, 100 ug, 300 ug a 1000 ug por dose foram avaliadas em cada uma das formulações neste estudo abrangente de imunogenicidade. b. Sumário do Protocolo

[00242] “Macacos adultos cynomolgus de 2,5-4,0 kg foram selecionados para avaliar os efeitos dos imunógenos de peptídeo IgE EMPD na imunogenicidade e no nível de IgE sérica do macaco. Um total de 20 macacos foram separados em 10 grupos: animais de controle placebo (n = 2) foram injetados apenas com o adjuvante (MontanideTv ISA 51 mais oligodesoxinucleotídeo CpG) ou (oligodesoxinucleotídeo ADJUPHOS mais CpG). Os animais experimentais foram injetados com o imunógeno de peptídeo IgE EMPD (SEQ ID NO: 88) nas doses de 30, 100, 300 e 1.000 ug por grupo ( uvolume total de vacina de 500 uL por animal; n = 2 por grupo, 1 macho e 1 fêmea). Um total de três imunizações intramusculares foram administradas nas semanas 0, 3 e

6. Todos os macacos foram monitorados quanto à imunogenicidade e nível de IgE sérica nas semanas O, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, e 24. c. Determinação de títulos de anticorpos Anti-EMPD de IgE

[00243] “Todos os animais foram sangrados nas semanas 0, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 e 24. O soro foi separado para cada sangramento para determinar os títulos de anticorpos anti-EMPD de IgE usando o ELISA yi-cyno em67. Os animais tratados com placebo tinham pouco ou nenhum título de anticorpo anti-EMPD de IgE detectável (Figuras 18A e 18B). No entanto, todos os animais que receberam três imunizações tiveram títulos de anticorpo IgG detectáves contra epítopos B EMPD de IgEcom títulos de pico obtidos nas semanas 8 a 12. Tais reatividades específicas foram mantidas durante o estudo de 24 semanas de uma maneira dependente da dose (Figuras 18A e 18B).

Todos os animais foram encontrados com altos títulos antissoro contra a proteína recombinante y1-cyno eEm67 com 300 ug em 0,5 mL por dose, sendo o mais ideal para ambas as formulações, uma vez que a formulação em dose de 1.000 ug resultaria em excesso de imunógeno de peptídeo versus adjuvante ISAS1IV ou ADJUPHOS nas respectivas formulações. Os resultados mostram que as formulações contendo ISAS1/CpG ODN apresentaram maiores resultados de imunogenicidade em comparação com as formulações com ADJUPHOS/CpG ODN. À resposta do anticorpo contra o epítopo da célula B de EMPD de IgE foi aumentada juntamente com cada aumento do imunógeno de peptídeo e, em seguida, os títulos de anti-EMPD de IgE diminuem gradualmente ao longo do tempo. Títulos antissoro significativamente altos foram mantidos durante o estudo de 24 semanas (Figuras 18A e 18B). EXEMPLO 10

PROVA DE EFICÁCIA COM A VACINA DE ALERGIA

IMUNOTERAPÊUTICA SUBSTITUTA EM MACACOS CYNOMOLGUS a. Objetivo geral:

[00244] O objetivo deste estudo foiavaliar os efeitos de imunizações intramusculares com os imunógenos de peptídeo IgE EMPD, dos quais a sequência foi derivada do auto-mIlgE, durante um período de 20 semanas na imunogenicidade e nível de IgE sérica na resposta de recuperação imune específica de papaína. A IgE EMPD de mlgE é conservada evolutivamente em primatas não humanos (por exemplo, macacos do novo e do velho mundo e símios) e essas sequências de homólogos de EMPD de IgE não foram encontradas em outras espécies (por exemplo, roedores, coelhos e caninos) A sequência de aminoácidos do macaco cynomolgus IgE EMPD (SEQ ID NO: 127) tem alta identidade de sequência (90%) à da EMPD de IgE humana (SEQ ID NO: 2). b. Sumário do Protocolo

[00245] “Macacos adultos cynomolgus de 2,5-4,0 kg foram selecionados para avaliar os efeitos dos imunógenos de peptídeo IgE EMPD na imunogenicidade e no nível de IgE sérica do macaco. Um total de 12 macacos foram separados em 3 grupos: animais controle placebo (n = 4, 2 machos e 2 fêmeas) foram injetados apenas com o adjuvante (Montanide'yv ISA 51 mais oligodeoxinucleotídeo CpG); animais experimentais foram injetados com os imunógenos de peptídeo IgE EMPD (SEQ ID NOs: 125 ou 126) a uma dose de 300 ug ( uvolume total de vacina de 500 uL por animal; n = 4 por grupo, 2 machos e 2 fêmeas). Um total de três imunizações intramusculares foram administradas nas semanas O, 3 e 6. Todos os macacos foram monitorados quanto à imunogenicidade e nível de IgE sérica nas semanas O, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20. c. Determinação de títulos de anticorpos Anti-EMPD de IgE

[00246] Todos os animais foram sangrados nas semanas 0, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20. O soro foi separado para cada sangramento para determinação dos títulos de anticorpos EMPD anti-IgE usando o ELISA yi-cyno em67. Os animais tratados com placebo não apresentaram títulos de anticorpos EMPD anti-lgE detectáveis (Figura 19). No entanto, todos os animais que receberam três immunizações com SEQ ID NO: 125 ou SEQ ID NO: 126 tiveram títulos de anticorpo IgG detectáveis contra epítopos B EMPD de IgE com títulos de pico obtidos nas semanas 8 a 12 (Figura 19). Tais reatividades específicas foram mantidas durante o estudo de 20 semanas. Além disso, todos os animais imunizados desenvolveram títulos específicos de anticorpos IgM e IgA durante o período de 20 semanas (Figura 20). d. Medição do nível de IgE sérica

[00247] Todos os animais foram sangrados nas semanas O, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20. O soro foi separado para cada sangramento para medição da IgE sérica usando um ELISA quantitativo de IgE para macacos. Os níveis basais de IgE no grupo placebo variaram durante o período da fase da vida. A redução de IgE observada no grupo administrado com SEQ ID NO: 125 foi estatisticamente significativa, enquanto no grupo administrado com SEQ ID NO: 126 também mostrou uma tendência de redução de IgE durante o período monitorado (Figura 19).

e. Resultados

[00248] Foram avaliados os efeitos dos imunógenos de peptídeo IgE EMPD em um modelo substituto na imunogenicidade contra concentrações de auto-mlgE e IgE sérica em amostras de soro de macacos adultos cynomolgus. Neste estudo de prova de conceito, quatro animais em cada grupo foram administrados com uma mistura de CpG ODN e Montanide'" ISA 51 como um controle placebo e 8 macacos adultos cynomolgus (n=4 por grupo) foram imunizados às O, 3 e 6 semanas com 300 ug de imunógenos de peptídeolgE EMPD de macaco, ou a SEQ ID NO: 125 ou 126, complexados em complexos imunoestimulatórios proprietários (ISC) com oligodesoxinucleotídeos CpG (CpG ODN) e formulado com adjuvante Montanide!Y ISA51.As SEQ ID NO: 125 e 126 são as contrapartes dos imunógenos EMPD de IgE humanos, as SEQ ID NO: 93 e 88, respectivamente. Os dois imunógenos derivados de macaco com a formulação CpG ODN/Montanide'"Y ISA 51 resultaram em fortes respostas de anticorpo anti-lgE EMPD IgG em todos os animais (Figura 19). Além disso, todos os animais desenvolveram anticorpos IgM e IgA contra IgE EMPD (Figura 20). Umatendênciadecrescente na IgE no soro de macaco basal foi observada (Figura 21). Não foram observadas reações adversas no local da injeção. O estudo demonstrou que os imunógenos sintéticos peptídicos IgE EMPD (SEQ ID NOs: 125 e 126), dos quais a sequência é derivada do próprio, com epítopo de célula T UBIThO intensificado, foram capazes de provocar respostas profundas de anticorpos anti-IlgE

EMPD resultando na supressão da produção de IgE e uma tendência na redução do nível de IgE sérica no macaco. f. Conclusões

[00249] Os macacos Cynomolgus foram injetados 3 vezes por via intramuscular durante um período de 20 semanas com os imunógenos de peptídeo IgE EMPD (SEQ ID NOs: 125 e 126) ou um controlo placebo. Os animais apresentaram boa tolerabilidade geral e romperam a tolerância imune. Todos os macacos imunizados desenvolveram anticorpos IgM específicos transitórios juntamente com o desenvolvimento de títulos de anticorpos potentes e sustentáveis de IgG (até 105) e IgA (up to 10º) s contra o epítopo de célula B correspondente dos construtos de EMPD de IgE. Níveis basais reduzidos de IgE foram observados em cada um e todos os que responderam. Estes resultados suportam o modo de ação do anticorpo anti-lgE-EMPD pelo qual os anticorpos direcionam células B que expressam IgE ligada à membrana, levando à supressão da produção de IgE subsequentemente. Tabela 1. Peptídeo IgE-remwen fragmentos dos mesmos empregados em ensaios sorológicos Código de Posições de Sequência peptídeo aminoácidos na IgE-EMPD IgEemPD1-67 1 GLAGG SAQSQ RAPDR VLCHS

GQAQQG LPRAA GGSVP HPRCH CGAGR ADWPG PPELD VCVEE

AEGEA PW IgEemPD1-s2 2 GLAGG SAQSQ RAPDR VLCHS

GQAQAG LPRAA GGSVP HPRCH

CGAGR ADWPG PP IgEemPD 152 | 127 GLAGG SAQSQ RAPDR VLCHS (macaco) EQQOG LPRAA RGSVP DHRCH

CGAGR ADWPG LP IgEemPD-10-67 3 TVORA VSVNP GLAGG SAQSQ

RAPDR VLCHS GQQQOG LPRAA GGSVP HPRCH CGAGR ADWPG

PPELD VCVEE AEGEA PW IgEemPD-10-52 4 TVORA VSVNP GLAGG SAQSQ

RAPDR VLCHS GQQAG LPRAA GGSVP HPRCH CGAGR ADWPG PP

GQAQQG LPRAA GGSVP HPRC e o tao em

PRAAG GSVPH PRCH [Pagvoa TlgEamanss 18 | HSGaGaGIPRANGESVPHAR — |

GQOQQG LPRAA GGSVP HPRCH

Tabela 1 (continuação) Código de Posições de Sequência peptídeo aminoácidos na IgE-EMPD EMPD [pasta [lgEmeonss — do — — [aaerPRARGE pa413 — | IgEsveD2A Ss QGLPR AAGGS

GLPRA AGGSV p4416 IgEemPo 27-86 PRAAG GSVPH pa418 IgEemPD 29:38 AAGGS VPHPR p4423 IgEEmPD 34.43 VPHPR CHCGA p4424 IgEEMPD 35-44 PHPRC HCGAG

HPRCH CGAGR p4426 IgEemPo 37-46 PRCHC GAGRA p4428 IgEemPD 39-48 CHCGA GRADW pagão CGAGR ADWPG Tabela 2 Epítopos promíscuos selecionados de auxiliares T para emprego no projetode Construtos de Imunógeno de Peptídeo derivados de IgE-emPD Descrição SEQ ID Sequência NO: Clostridium tetani1 Th 59 KKQYIKANSKFIGITEL MvF1 Th 60 —LSEIKGVIVHRLEGV Bordetella pertussis Th 61 —|[GAYARCPNGTRALTVAELRGNAEL Clostridium tetani2 Th 62 WVRDIIDDFTNESSQOKT Difteria Th 63 DSETADNLEKTVAALSILPGHGC Plasmodium falciparum Th 64 DHEKKHAKMEKASSVFNVVNS Schistosoma mansoni Th KWFKTNAPNGVDEKHRH

KKKMvF3 Th 68 —|KKKISISEIKGVIVHKIEGILF ua HBsAg1 Th 69 —|KKKLFLLTKLLTLPQSLD

RRRIKII RI LR VRW WV IV FFFFFFVF

F MvF4 Th 70 —[ISISEIKGVIVHKIETILF HBsAg2 Th 71 |KKKIITITRITIPOSLD nu Clostridium tetani TT1 Th Clostridium tetani TT3 Th

Tabela 3 Intensificação da imunogenicidade de fragmentos de peptídeo IgE- EMPDpor epítopos Th derivados de proteínas patogênicas, incluindo epítopos Th artificiais idealizados para elicitação de anticorpos específicos no projeto de construtos de imunógeno de peptídeo IgE-emPD Códi-go Descrição SEQ Sequência de ID peptí- NO: deo P4160Kkb | IgEemPD 1.39€K- | 88 | GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGAQAGLPRAAGGSVPHPRC UBITh1 -eK-UBITh1 P4161kb | UBITh1-eK-IgEemPO 1- UBITh1-eK-

E GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQAQAGLPRAAGESVPHPRC P4162kb | UBITh1-eK-IgEemPo 1- UBITh1-eK- 39-eK-UBITh1 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQAQAGLPRAAGGSVPHPRC -egK-UBITh1 P4166Kkb | IgEemPo 7-40-eK- AQSQAQRAPDRVLCHSGAQAGLPRAAGGSVPHPRCH-eK- UBITh1 UBITh1 P4167kb | UBITh1-eK-lgEemPD 7-| 92 | UBITh1-eK- ao AQSQRAPDRVLCHSGAQQAGLPRAAGGSVPHPRCH p4168kb | UBITh1-eK-IgEevmeo 7-| 93 |UBITh1-eK- a4o-eK-UBITh1 AQSQRAPDRVLCHSGQAQAGLPRAAGGSVPHPRCH-eK- UBITh1 P4372kb | UBITh1-eK-KKK- 94 | UBITh1-eK-KKK- IgEevmPD 1-39 GLAGGSAQSQARAPDRVLCHSGAQAGLPRAAGGSVPHPRC p4373kb | UBITh2-eK-KKK- 95 | UBITh2-eK-KKK- IgEeMPD 1-39 GLAGGSAQSQARAPDRVLCHSGAQAGLPRAAGGSVPHPRC P4374kb | UBITh1-eK-KKK- UBITh1-eK-KKKk-GLAGGSAQSQRAPDRVL IgEevPD 1-17 p4375kb | UBITh1-eK-KKK- 97 | UBITh1-eK-KKK-HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR IgEeMmPD 19-38 B. pertussis Th-eK- KKQYIKANSKFIGITEL-eK- IgEevmPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGAQAGLPRAAGGSVPHPRC MvF1 Th-eK-IgEcmeo LSEIKGVIVHRLEGV-eK- 1-39 GLAGGSAQSQARAPDRVLCHSGAQQAGLPRAAGGSVPHPRC B. pertussis Th-eK-| 100 | GAYARCPNGTRALTVAELRGNAEL-sK- IgEevmPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQQAGLPRAAGGSVPHPRC C. tetani2 Th-eK-| 101 | WRDIIDDFTNESSOKT-sK- IgEeMPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQAQAGLPRAAGGSVPHPRC Diphtheria — Th-eK-| 102 | DSETADNLEKTVAALSILPGHGC-eK- IgEemPD 1-39 GLAGGSAQSQARAPDRVLCHSGAQAGLPRAAGGSVPHPRC P. falciparum Th-eK- | 103 | DHEKKHAKMEKASSVFNVVNS-eK- IgEevmPD 1-39 GLAGGSAQSQARAPDRVLCHSGAQAGLPRAAGGSVPHPRC S. mansoni Th-eK-| 104 | KWFKTNAPNGVDEKHRH-sK- IgEeMmPD 1-39 GLAGGSAQSQARAPDRVLCHSGQAQAGLPRAAGGSVPHPRC Cholera Toxin Th-eK- | 105 | ALNIWDRFDVFCTLGATTGYLKGNS-eK- IgEemPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGAQAGLPRAAGGSVPHPRC MvF2 Th-eK-IgEcmeo | 106 | ISEIKGVIVHKIEGI-sK- 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQAQAGLPRAAGGSVPHPRC

KKKMvF3 Th-eK- | 107 | KKKISISEIKGVIVHKIEGILF-eK- IgEeMmPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQAQAGLPRAAGGSVPHPRC

TRT TRT HBsAg1 Th-eK- | 108 | KKKLFLLTKLLTLPOSLD-eK- IgEeMmPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQQAGLPRAAGGSVPHPRC

RRRIKII RIVLIL IR VRVW VWVIV FFF FFFVF

F MvF4 Th-eK-IgEemPo | 109 | ISISEIKGVIVHKIETILF-eK- 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQAQAGLPRAAGGSVPHPRC

TRT TR HBsAg2 Th-eK- | 110 | KKKIITITRIITIPOSLD-eK- IgEemPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQQAGLPRAAGGSVPHPRC

FFLL L ITTI Influenza MP1 1 Th-| 111 | FVFTLTVPSER-eK- EK-IgEeMPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGAQAGLPRAAGGSVPHPRC Influenza MP1 2 Th-| 112 | SGPLKAEIAQRLEDV-eK- eK-lgEemPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQAQAGLPRAAGGSVPHPRC Influenza NSP1 Th-| 113 | DRLRRDOKS-eK- eK-IgEEMPD 1-39 GLAGGSAQSQARAPDRVLCHSGAQAGLPRAAGGSVPHPRC EBV BHRF1 Th-eK-| 114 | AGLTLSLLVICSYLFISRG-eK- IgEeMmPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQAQAGLPRAAGGSVPHPRC C. tetani TT1 Th-eK- | 115 | QYIKANSKFIGITEL-eK- IgEeMPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGAQAGLPRAAGGSVPHPRC EBV EBNA-1 Th-eK- | 116 | PGPLRESIVCYFMVFLOTH|I-eK- IgEeMmPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQAQAGLPRAAGGSVPHPRC C. tetani TT2 Th-eK- | 117 | FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-sK- IgEeMmPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGAQAGLPRAAGGSVPHPRC C. tetani TT3 Th-eK- | 118 | KFIKRYTPNNEIDSF-eK- IgEEMPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGAQAGLPRAAGGSVPHPRC C. tetani TT4 Th-eK- | 119 | VSIDKFRIFCKALNPK-eK- IgEEMPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQAQAGLPRAAGGSVPHPRC EBV CP Th-eK-| 120 |VPGLYSPCRAFFNKEELL-eK- IgEEMPD 1-39 GLAGGSAQSARAPDRVLCHSGAQAGLPRAAGGSVPHPRC HCMV IE1 Th-eK-| 121 | DKREMWMACIKELH-eK- IgEEMPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQAQAGLPRAAGGSVPHPRC EBV GP340 Th-eK-| 122 | TGHGARTSTEPTTDY-eK- IgEeMPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGAQAGLPRAAGGSVPHPRC Tabela 3 (continuação) Código Descrição Sequência de peptí- deo EBV BPLF1 Th-eK-|123 | KELKRQYEKKLRO-eK- IgEEeMPD 1-39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGAQAGLPRAAGGSVPHPRC EBV EBNA-2 Th-eK- | 124 | TVFYNIPPMPL-eK- IgEeMPD 1-39 GLAGGSAQSQARAPDRVLCHSGAQAGLPRAAGGSVPHPRC UBITh2-eK-IgEemPo 1- | 130 | UBITh2-eK- 39 GLAGGSAQSQRAPDRVLCHSGQAQAGLPRAAGGSVPHPRC p4668kb | UBITh1-ecK-Macaque | 125 | UBTh1-eK- IgEemPo 74aeK- AQSQRAPDRVLCHSEQQAGLPRAARGSVPDHRCH-eK- UBITh1 UBTh1 P4670kb | Macaque IgEemPo 1-/ 126 | GLAGGSAQSARAPDRVLCHSEQQAGLPRAARGSVPDHRC 39-eK-UBITh1 -eK-UBTh1 IP Espaçador 1 PPXPXP Il Espaçador 2 EK-KKK * Os peptídeos são ciclizados por ligações dissulfeto de cisteína com as cisteínas sublinhadas.

Tabela 4 Avaliação da imunogenicidade em porquinhos-da-índia de construtos de imunógeno de peptídeo derivados de IgE-emPD Constru- Títulos de IgE-EMPD (1-39) ELISA Logs, por Soro Imune dirigidos to de contra imunó- Construtos EMPD de IgE coletados em vários wpi geno de peptídeo IgE-EMPD na formula- ção de vacina esa 4,938 | 0,046 | 7,132 [| 6,873 | 7,093 | 6,775 | 6,688 | 6,617 | 6,579 4939 | 0,049 | 6,738 | 7,014 | 6,932 | 6,668 | 6,649 | 6,497 | 6472 | Média | 0,050 | 6,968 | 7,085 | 7,202 | 6,918 | 6,821 | 6,692 | 6,646 2 | uBmThn- | 89 [ 4940 | 0,053 | 6,870 | 6815 | 6,938 | 6,748 | 6,044 | 6,598 | 6,695 | 62 a 4941 | 0,049 | 6,904 | 7,110 | 7,243 | 6,986 | 6,994 | 6,712 | 6,805 39) 4942 | 0,046 | 7,006 | 7,192 | 7,220 | 6,967 | 6,921 | 6,791 | 6,864 | Média | 0,049 | 6,927 | 7,039 | 7,134 | 6,900 | 6,953 | 6,700 | 6,788 3 | uBmTAT- 4943 | 0,064 | 6,684 | 6,941 | 6,946 | 6,636 | 6,726 | 6,523 | 6,585 es a 4944 | 0,046 | 6,771 | 6,665 | 6,729 | 6,449 | 6,463 | 6,063 | 6,170 SEA a945 | 0,046 | 6,726 | 6,843 | 6,937 | 6,659 | 6,549 | 6,225 | 6,321 UBITH1 0,052 | 6,727 | 6,816 | 6,871 | 6,581 | 6,579 | 6,270 | 6,359 4 figemeo(7 | 91 | 4946 | 0,049 | 6,997 | 6,887 | 6,962 | 6,765 | 6,905 | 6,531 | 6,510 40)-eK- dB 4947 | 0,047 | 7,454 | 6,949 | 6,772 | 6,542 | 6,204 | 6,468 | 6,194 | 4948 | 0,048 | 6,719 | 6487 | 6,459 | 6,175 | 6,189 | 5,834 | 6,062 | Média | 0,048 | 7,057 | 6,774 | 6,731 | 6,494 | 6,433 | 6278 | 6,255 | uBsmh- | 92 | 4049 | 0,048 | 6,658 | 5,905 | 5,992 | 5,682 | 5,761 | 5,629 | 5,523 e 4950 | 0,047 | 6,959 | 6,659 | 6,635 | 6,545 | 6,506 | 6417 | 6,369 IgEevmeo (7- 40) 4951 | 0,047 | 6,731 | 6,565 | 6,583 | 6,241 | 5,890 | 5,884 | 6,120 | Média | 0,047 | 6,783 | 6,376 | 6,403 | 6,156 | 6,052 | 5,977 | 6,004 uBITh1- | oa | 4952 | 0,047 | 6,622 | 6,841 | 7,011 | 7,016 | 6,984 | 6,006 | 6,945 62 7 4953 | 0,045 | 6,632 | 6,872 | 7,213 | 6,931 | 6,980 | 6,846 | 6,830 40) -eK- 4954 | 0,046 | 6,860 | 6,886 | 6,732 | 6,725 | 6,578 | 6,656 | 6,690 UBITHI 0,046 | 6,705 | 6,866 | 6,985 | 6,891 | 6,847 | 6,803 | 6,822 º Grupo 1-6: Vacinado em O, 2, 4, 6,8 e 10 wpi; sangrar em O, 4, 6, 8, 10, 12€ 14 wpi

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Construto de imunógeno de peptídeo IgE EMPD, caracterizado por ser representado pelas fórmulas: (Th)n—(A)) (fragmento de IgE EMPD)X ou (fragmento de IgE EMPD)(A))HTh)n="X ou (Th)m—(A) (fragmento de I9gE EMPD)HA)—(Th)n=X em que Th é um epítopo auxiliar T heterólogo; A é um espaçador heterólogo; (fragmento de IgE EMPD) é um epítopo de célula B com cerca de 20 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos da alça intramolecular central de IgE EMPD; X é um a-COOH ou a-CONH> de um aminoácido; m é de 1 a cerca de 4; e n é de O a cerca de 10.

2. Construto de imunógeno de peptídeo IgE EMPD, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o fragmento de IgE EMPD é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 5,6,8e9.

3. Construto de imunógeno de peptídeo IgE EMPD, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o epítopo Th é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 59-

87.

4. Construto de imunógeno de peptídeo IgE EMPD, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o construto de imunógeno de peptídeo é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 88-95, 98-124 e 130.

5. Construto de imunógeno de peptídeo IgE EMPD,

caracterizado pelo fato de que compreende: um epítopo de célula B compreendendo cerca de 20 a cerca de 40 resíduos de aminoácidos da sequência IgE EMPD da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2; um epítopo auxiliar T compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 59- 87;e um espaçador heterólogo opcional selecionado do grupo que consiste em um aminoácido, Lys-, Gly-, Lys-Lys-Lys-, (a, Ee-N)Lys, e e-N- Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 129), em que o epítopo de célula B está covalentemente ligado ao epítopo auxiliar T diretamente ou através do espaçador heterólogo opcional.

6. Construto de imunógeno de peptídeo IgE EMPD, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o epítopo de célula B é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 5,6, 8eo.

7. Construto de imunógeno de peptídeo IgE EMPD, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o epítopo auxiliar T é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 59-87.

8. Construto de imunógeno de peptídeo IgE EMPD, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o espaçador heterólogo opcional é (a, e-N)Lys ou e-N-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 129).

9. Construto de imunógeno de peptídeo IgE EMPD, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o epítopo auxiliar T é covalentemente ligado ao terminal amino do epítopo de célula B.

10. Construto de imunógeno de peptídeo IgE EMPD, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o epítopo auxiliar T é covalentemente ligado ao terminal amino do epítopo de célula B através do espaçador heterólogo opcional.

11. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um construto de imunógeno de peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: a. um construto de imunógeno de peptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1a 10;e b. e um veículo e/ou adjuvante de distribuição farmaceuticamente aceitável.

13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a. o construto de imunógeno de peptídeo IgE EMPD é selecionado do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 88-95, 98-124 e 130; e b. o construto de imunógeno de peptídeo IgE EMPD é misturado com um oligodesoxinucleotídeo CpG (ODN) para formar um complexo imunoestimulador estabilizado.

14. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao epítopo do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao epítopo de célula B do construto de imunógeno de peptídeo IgE EMPD como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

15. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao epítopo do mesmo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que é ligado ao construto de imunógeno de peptídeo IgE EMPD.

16. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao epítopo do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente ao epítopo de célula B do construto de imunógeno de peptídeo IgE EMPD como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

17. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao epítopo do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 16.