TW201930346A - 用於ＩｇＥ介導過敏性疾病治療之靶向膜鑲嵌型ＩｇＥ的胜肽免疫原及其劑型 - Google Patents

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Abstract

本揭露關於用於IgE介導過敏性疾病治療之IgE EMPD胜肽免疫原構建及其劑型。IgE EMPD胜肽免疫原構建具有超過20個胺基酸的B細胞抗原決定位胜肽，以環狀為優選，其經任選間隔子連接衍生自病原菌蛋白的異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。胜肽免疫原構建及其劑型於接種的宿主刺激高特異性抗體產生，其針對IgE EMPD胜肽，並與定向分化為分泌IgE之B淋巴球上的膜鑲嵌型IgE交叉反應。胜肽免疫原構建及其劑型誘導的抗體於接種的宿主誘發表現IgE的B細胞凋亡，並介導抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)，導致接種的宿主抗體特異性IgE和總IgE水平下降以有效治療IgE介導過敏性病理學。

Description

用於IgE介導過敏性疾病治療之靶向膜鑲嵌型IgE的胜肽免疫原及其劑型
本揭露係關於靶向膜鑲嵌型IgE之細胞外膜近側功能區塊(或稱IgE EMPD)的胜肽免疫原構建及其劑型，其作為用以治療及/或預防IgE介導過敏性疾病的通用疫苗。
過敏症，也被稱為免疫球蛋白E(IgE)介導過敏性疾病，是由免疫系統對環境中的某些物質高敏感性導致的許多疾病，通常在大多數人中很少或根本不會造成問題。這些疾病包括對藥物、食物和昆蟲過敏、過敏性鼻炎(花粉熱)、異位性皮膚炎、過敏性氣喘、結膜炎、濕疹、風疹塊(蕁麻疹)和急性過敏(網站：en.wikipedia.org/wiki/Allergy)。多種症狀往往歸因於過敏，且可能包括眼睛泛紅、發癢性皮疹、打噴嚏、流鼻水、呼吸短促或腫脹。
過敏性疾病的流行率正在增加。在20世紀初，過敏被視為一種罕見疾病。然而，從那以後，有幾個因素引發了過敏性疾病流行率的急遽上升。以呼吸道表徵最為普遍，影響高達總人口的30%。根據世界衛生組織(WHO)統計，世 界上有數億人患有鼻炎，且估計有2.35億人患有氣喘(網址：www.who.int/mediacentre/factsheets/fs307/en/index.html)。過敏性疾病的社會成本相當可觀，主要是因為過敏性鼻結膜炎的高度流行和與其相關的生產力損失。瑞典的研究估計，僅在瑞典，每年由鼻炎所引起的生產力損失達到27億歐元，而美國的研究則證實疾病中以鼻炎對美國雇主造成的損失最大(Larsen JN,et al.,2016)。
過敏反應是一種異常劇烈的免疫反應，在此免疫系統抵禦原先對人體無害之抗原(過敏原)的威脅(網站：en.wikipedia.org/wiki/Allergen)。具體而言，過敏原是能夠透過IgE反應在特應性個體刺激第一型過敏反應的抗原。過敏原可來自各處(例如：塵蟎排泄物、花粉、寵物皮屑、某些食物，或化學/物理性刺激物質)。食物過敏症不像食物敏感症一樣普遍，但某些食物(例如：花生(豆類)、堅果、海鮮和貝類)是造成許多人嚴重過敏的原因。
過敏是由針對常見過敏原之適應性免疫反應激活所引發的全身性免疫疾病。IgE在介導負責引起IgE介導過敏性疾病之第一型過敏反應中扮演重要角色。IgE介導過敏性疾病的特徵在於呈現過敏原特異性IgE抗體和嗜酸性粒細胞炎症。過敏反應是雙相性的，在過敏原暴露後幾分鐘內發生立即型反應，且於幾小時後發生晚期反應。立即型反應是當結合至位於細胞表面上高親和力受體之IgE交聯時由嗜鹼性粒細胞和肥大細胞所釋放出之現成媒介物(例如：組織胺、蛋白酶、趨化因子、肝素)所引起。晚期過敏反應則是由發炎 細胞(例如：嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜中性粒細胞和單核細胞)的動員和吸引所引起。
過敏原在有過敏傾向的個體中導致血清總游離免疫球蛋白E(IgE)和過敏原特異性IgE水平上升。過敏原特異性IgE介導的第一型過敏反應對IgE介導過敏性疾病的致病機轉是重要的(第1圖)。IgE藉由結合至位於那些效應細胞表面上高親和力IgE受體(FcεRI)使肥大細胞和嗜鹼性粒細胞致敏。抗原與已經與肥大細胞上之FcεRI結合的IgE結合，造成結合的IgE的交聯，以及下面FcεRI的聚集。交聯的受體啟動訊息傳遞級聯與快速的去顆粒作用。肥大細胞和嗜鹼性粒細胞釋放儲存的組織胺，然後合成並釋放緩激肽、前列腺素、白三烯素、細胞因子和其他發炎媒介物。它們進一步吸引和激活產生過敏症狀的發炎細胞，並向上調節透過B細胞之IgE生合成，從而促進敏感性加劇。IgE-FcεRI交互作用和去顆粒作用對第一型過敏反應和特應性哮喘的發展是重要的。
如同其他免疫球蛋白同型，IgE以二種形式(分泌的血清免疫球蛋白形式和膜鑲嵌形式(mIgE))存在。針對編碼小鼠和人類mIgEs的膜錨定胜肽之基因片段的研究顯示，mIgE和分泌型IgE之間的區別在於mIgE包含三個額外的區域：(1)25個疏水性、不帶電胺基酸殘基的中心保留區段，其跨越細胞膜；(2)羧基端的胞質尾；以及(3)mIgE膜錨定片段之氨基端的細胞外部份。在人類中，位於B淋巴球表面之mIgE的epsilon鏈是以短和長的同型異構物存在。短的同型 異構物包含位於mIgE細胞外膜近側功能區塊的15個胺基酸，稱為IgE EMPD，而長的同型異構物包含具有52個胺基酸殘基之額外片段，在EMPD中總共有67個胺基酸。這兩種同型異構物是由於位於CH4外顯子3'端的供體位點與兩個受體位點(兩個受體位點間隔156bp且位於CH4外顯子下游約2000個核苷酸處)之間進行選擇性剪接所產生的結果。於利用IL-4加上CD40處理之產生IgE的骨髓瘤細胞和扁桃腺B細胞檢測顯示，長形式轉錄本水平較短形式轉錄本水平高100倍(Peng et al.1992 and Zhang et al 1992)；而於蛋白質層次未偵測到短形式(Peng et al,1992)。IgE EMPD對mIgE形式具有特異性，在分泌型血清IgE則未發現此現象(第2圖)。
現行用於IgE介導過敏性疾病治療的臨床指引包含患者教育、過敏原預防、藥物治療、基於過敏原的免疫療法和IgE的治療標靶的組合，但是這些治療選擇具有其侷限性。例如，儘管在實際上盡可能地指出過敏原以預防，單獨利用過敏原預防仍難以達到足夠的症狀控制。此外，即使安全和廉價的藥物可用於治療過敏症狀，許多患者報告使用這些藥物並不足以控制症狀。重要的是，藥物治療對疾病進程沒有效果，且只要症狀流行就必須反覆投藥進行治療，這往往意味著終生的治療。只有典型基於免疫原的免疫治療具有改善疾病的潛力，被認為是最理想的治療策略。
基於過敏原的免疫治療(AIT)涉及以遞增方式皮下注射增加的過敏原劑量，以便抑制後續再次暴露於此過敏原所引起的症狀。在自然暴露條件下，呈現於粘膜中免疫系 統的過敏原含量相對較低，但其可以在數分鐘內有效刺激過敏反應並出現過敏症狀。相反，當將過敏原作為免疫療法投予時，過敏原的量相對較高，其中在免疫療法所投予的一個劑量相當於透過自然暴露經估計的每年最大攝入量的約100倍。將數量上的差異與進入人體的不同途徑相結合，對免疫系統展現深遠的影響，透過引起對過敏原的免疫耐受使免疫系統作出反應。
AIT的原始給藥形式是透過皮下注射，且此治療方案傳統上分成兩個階段進行：(1)起始的增量給藥階段和(2)後續的維持階段。增量給藥階段是個別調整劑量，在此為了緩慢建立耐受性的目的而投予漸增的劑量並仔細評估患者的敏感性。以最大可耐受劑量或建議的最高劑量先到達者為準，然後在整個維持階段給予此劑量。
兩種機制被認為在AIT中起主要作用：(1)免疫偏離和(2)調節性T細胞的誘發。尚未確定免疫偏離和調節性T細胞的相對貢獻，但最終結果是減少且在某些情況下甚至會消除於針對過敏原暴露之反應中引起過敏反應的能力。
免疫偏離是用以表示針對過敏原暴露之經調整的免疫反應的術語，其中過敏原特異性的第一型T輔助(Th1)細胞被動員和刺激但犧牲了Th2細胞。Th1細胞產生干擾素γ(IFN-γ)，其刺激B細胞產生IgG而非IgE，且IgG無法引發過敏反應。
調節性T細胞是多群T細胞，其活躍於免疫反應調控中。已證明在AIT後於周邊血液中過敏原特異性 CD4+CD25+調節性T細胞的增加。這些細胞產生介白素(IL)-10和轉化生長因子(TGF)-β，並具有潛力去抑制局部Th2細胞反應和重定向抗體種類轉換，偏向IgG4(IL10同型轉換因子)和IgA(TGF-β同型轉換因子)。過敏原特異性IgG4抗體阻斷對Th2細胞的過敏原呈現，另外阻斷過敏原誘導的肥大細胞和嗜鹼性粒細胞的活化，從而顯著地減弱過敏反應。
儘管基於抗原的免疫療法可能是有效的，但是仍然存在嚴重的問題以及與IgE介導過敏性疾病之AIT有關的未滿足的需求。首先，AIT的所有注射都要在診所內進行，因為誘發過敏反應有輕微風險，若未及時且適當地治療會變得嚴重甚至威脅生命。其次，僅只有少數過敏原產品已經在臨床上證實可透過AIT進行疾病改善。第三，只有少數特定過敏原的結構已經被描述，且過敏原的定義主要是基於在易感個體中能夠引發IgE反應的功能性標準。因此，過敏原通常由個別患者的免疫系統所定義，因此，即使大多數過敏症患者具有對相對有限數量的主要過敏原具特異性的IgE抗體，任何免疫原性蛋白質(抗原)都具有可誘致過敏症的潛能。第四，每個患者對過敏原分子和抗原決定位都有獨特的，致敏化作用模式。第五，所有市售的過敏原產品都是利用衍生自天然原料(例如：花粉、室塵蟎培養物、動物毛髮及/或皮屑，或昆蟲毒液)的過敏症誘發物質的水溶液萃取而製造的，且此種天然原料在組成上是本質可變的。因此，用於AIT的過敏原產品不是通用的，且於其組成、IgE結合能力和製造商之間的品質控管程度具有差異性。沒有生效的國際標 準。這意味著來自不同製造商的產品在患者中的效果可能不同，因此臨床結果不能直接地從一種過敏原產品推斷至另一種過敏原產品。
最新研究回顧-以過敏原為基礎之免疫治療：過敏治療的未來(Drug Discovery Today Volume 21,Issue 1,January 2016,Pages 26-37)透過引用包括於本文中。其中所有支持性文件可以在此背景部分所作的聲明中發現。
除了AIT之外，於IgE介導過敏性疾病治療中已經研究了IgE分子的治療靶點。
在IgE介導過敏性疾病治療中已經顯示利用抗IgE單株抗體之血清可溶性IgE的治療靶點是有效的。目前，Omalizumab(XOLAIR®)(一種重組人源化單株抗體)已經被批准用於治療成年人和青少年中度至重度持續性過敏性氣喘。Omalizumab透過與循環的，未結合的游離IgE結合而阻止過敏級聯，並預防其與免疫效應細胞表面上的IgE FcεRI結合。利用Omalizumab的治療導致游離IgE水平的顯著降低和細胞IgE受體的向下調節(Chang et al,2007)。雖然利用Omalizumab的治療已被證明是有效的，但也有其侷限性。具體而言，Omalizumab可中和血清中的游離IgE，但不影響IgE的產生。因此，必須頻繁且長期地投予Omalizumab以維持足夠的血清IgE抑制。
也已經研究了膜鑲嵌型IgE之細胞外膜近側功能區塊(IgE EMPD)的治療靶點，以治療IgE介導過敏性疾病。在缺乏額外共刺激訊號之情況下的B細胞受體(BCR)交聯可 導致B細胞凋亡。對於未成熟B細胞，透過BCR交聯之B細胞凋亡耗竭已經被廣泛描述以作為一種機制，藉其將自體反應性B細胞由B細胞庫中移除。已經顯示抗IgE EMPD單株抗體(例如47H4(Brightbill et al.2010)、4B12和26H2(Chen et al.2010))可交聯IgE BCR並引起表現mIgE的B細胞凋亡(第2圖)。Brightbill等人還發現於體內的47H4治療性遞送可減少已確立的IgE反應，此結果如同在巴西諾卡氏菌感染和過敏性氣喘模型中所觀察到的結果(Chen et al.2010)。為了耗竭IgE譜系B細胞以降低血清IgE，已經研究和鑑定了一些靶向IgE-EMPD的抗體和抗原決定位，尤其是位在額外52個胺基酸的長形式區域內(Chen et al.2010,Chang et al.2015,Chen et al.2002)。一個團隊指出使用B型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)作為載體攜帶作為插入物之IgE EMPD片段，以於BALB/c小鼠中誘導特異性IgE EMPD抗體反應。此選殖構築自發性地組裝成類病毒顆粒(VPLs)，其於VPLs之刺突蛋白頂端呈現各種IgE EMPD片段，以獲得免疫原性。藉由利用純化的小鼠脾臟NK細胞作為效應細胞，從接受免疫的小鼠的血清純化出來的IgG抗體可透過BCR依賴型凋亡蛋白酶途徑引起表現mIgE.FcL的Ramos細胞的細胞凋亡，以及於表現mIgE.FcL的A20細胞引起抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)(Lin,et al.2012)。上述方法已引起了過敏治療疫苗開發的一些興趣。然而，抗原表現系統是低效的，產生大多數靶向載體VLPs的抗體，且抗原和遞送系統遠不適用於用於工業和臨床用途之有效疫苗的開發。
鑑於上述情況，需要開發用以治療及/或預防IgE介導過敏性疾病的免疫治療方法，其與過敏原無關，能夠引發針對IgE的高度特異性免疫反應，易施用於患者，能夠根據嚴格的優良藥品製造作業標準(GMP)加以製造，並且在全世界的應用中具有成本效益，以取代實行百年歷史的AIT。
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本揭露係關於靶向膜鑲嵌型IgE之細胞外膜近側功能區塊(IgE EMPD)的個別胜肽免疫原構建，其用以治療及/或預防IgE介導過敏性疾病。本揭露也關於包含此胜肽免疫原構建的組成物、製備和使用此胜肽免疫原構建的方法，以及利用此胜肽免疫原構建產生的抗體。
揭露的胜肽免疫原構建包含約20個或更多個胺基酸。此胜肽免疫原構建包含來自全長IgE EMPD(SEQ ID NO：1)之67個胺基酸序列的B細胞抗原決定位。此B細胞抗原決定位可透過任選的異源性間隔子連接至衍生自病原菌蛋白之異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。揭露的胜肽免疫原構建可刺激針對IgE EMPD之高特異性抗體的產生，且此抗體 可結合至重組含有IgE EMPD的蛋白質、位在帶有mIgE的B細胞上的IgE EMPD，及/或包含人類IgG1之Fc部分的重組可溶性IgE EMPD蛋白，以及人類膜鑲嵌型IgE的IgE EMPD(稱為“γ1-em67”)。揭露的胜肽免疫原構建對IgE介導過敏性疾病的全球患者可作為與過敏原無關的、具有成本效益的、通用的免疫療法。
胜肽免疫原構建的B細胞抗原決定位部份具有來自全長IgE EMPD序列(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列。在一些實施例中，依據全長IgE EMPD序列(SEQ ID NO：1)的編碼，B細胞抗原決定位具有包含由內源性半胱胺酸(C18-C39)所形成之內部的分子內環狀結構的序列。在某些具體實施例中，B細胞抗原決定位具有IgE EMPD-1-39(SEQ ID NO：5)、IgE EMPD-7-40(SEQ ID NO：6)、IgE EMPD-19-38(SEQ ID NO：8)或IgE EMPD-1-40(SEQ ID NO：9)的胺基酸序列。
本揭露的胜肽免疫原構建可含有衍生自病原菌蛋白之異源性Th抗原決定位胺基酸序列(例如：SEQ ID NOs：59至87)。在某些實施例中，異源性Th抗原決定位衍生自自然界的病原菌，例如：白喉毒素(SEQ ID NO：63)、惡性瘧原蟲(SEQ ID NO：64)、霍亂毒素(SEQ ID NO：66)。在其他實施例中，異源性Th抗原決定位為以單一序列，或組合序列(例如SEQ ID NOs：70、69和71)形式存在之衍生自麻疹病毒融合蛋白(MVF 1至5)或B型肝炎表面抗原(HBsAg 1至3)的理想化人工Th抗原決定位。
在一些實施例中，胜肽免疫原構建包含來自IgE EMPD的B細胞抗原決定位，其透過任選的異源性間隔子連接至異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。在某些實施例中，胜肽免疫原構建包含來自IgE EMPD-1-40(SEQ ID NO：9)具有超過約20個胺基酸的B細胞抗原決定部位，其透過任選的異源性間隔子連接至衍生自病原菌蛋白的異源性Th抗原決定位(例如：SEQ ID NOs：59至87)。在一些實施例中，任選的異源性間隔子為能夠將兩個胺基酸及/或胜肽連接在一起的分子或化學結構。在某些實施例中，間隔子是天然存在的胺基酸、非天然存在的胺基酸或其組合。在具體實施例中，胜肽免疫原構建具有SEQ ID NOs：88-95、98-124和130的胺基酸序列。
本揭露也關於包含IgE EMPD胜肽免疫原構建的組成物。在一些實施例中，揭露的組成物包含超過一個的IgE EMPD胜肽免疫原構建。在某些實施例中，組成物包含IgE EMPD G1-C39胜肽免疫原構建的混合物(例如：SEQ ID NOs：88-95、98-124和130的任意組合)，以涵蓋患者的廣泛遺傳背景。相較於只包含單一胜肽免疫原構建的組成物，包含胜肽免疫原構建混合物的組成物在疫苗免疫接種後可導致較高百分比的反應率，以治療IgE介導過敏性疾病。
本揭露也關於用以治療及/或預防IgE介導過敏性疾病的醫藥組成物，包含疫苗劑型。在一些實施例中，醫藥組成物包含揭露的胜肽免疫原構建，胜肽免疫原構建是以穩定化的免疫刺激複合物形式存在，此形式是藉由混合CpG寡聚合物和包含胜肽免疫原複合物的組成物以透過靜電結 合所形成。這種穩定化的免疫刺激複合物可進一步增強胜肽免疫原構建的免疫原性。在一些實施例中，醫藥組成物包含佐劑，例如礦物鹽，其包括明礬凝膠(ALHYDROGEL)、磷酸鋁(ADJUPHOS)，或包括MONTANIDE ISA 51或720的油包水乳液。
本揭露也關於針對揭露的IgE EMPD胜肽免疫原構建的抗體。具體而言，當投予受試者時，本揭露的胜肽免疫原構建可刺激高特異性抗體的產生，此抗體可與IgE EMPD-1-52胺基酸序列(SEQ ID NO：2)、IgE EMPD 1-67胺基酸序列(SEQ ID NO：1)及其片段(例如SEQ ID NOs：5和6)交叉反應。利用胜肽免疫原構建製造的高特異性抗體可與重組含有IgE EMPD的蛋白質，γ1-em67，及/或帶有膜鑲嵌型IgE之B細胞上的IgE EMPD交叉反應。揭露的抗體利用高特異性結合至IgE EMPD，沒有太多，如果有的話，則是針對用於免疫原性增強的異源性Th抗原決定位，此與使用用於胜肽抗原性增強的常規蛋白或其他生物載體所製造的抗體形成鮮明對比。
本揭露也包括利用揭露的胜肽免疫原構建及/或針對胜肽免疫原構建的抗體以治療及/或預防IgE介導過敏性疾病的方法。在一些實施例中，用以治療及/或預防IgE介導過敏性疾病的方法包含將包含揭露的胜肽免疫原構建的組成物投予宿主。在某些實施例中，此方法所使用的組成物包含揭露的胜肽免疫原構建，此胜肽免疫原構建是以穩定化的免疫刺激複合物形式存在，此穩定化的免疫刺激複合物是利 用帶負電的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)透過靜電結合所形成，其可與進一步補充的佐劑(任選為礦物鹽或油類以作為佐劑)複合，用以投予IgE介導過敏性疾病患者。揭露的方法也包括將胜肽免疫原構建投予具有IgE介導過敏性疾病風險或已患病之宿主的給藥方案、劑型和途徑。
第1圖是描述IgE介導過敏性疾病途徑機制的圖示。初始的成熟B細胞始於表現膜鑲嵌型IgE(mIgE)。在遇到過敏原後，利用同源T輔助(TH)細胞的協助，其提供B細胞必需的共刺激訊號和細胞因子，使這些細胞變得活化。藉由多種細胞因子(例如IL-4和IL-13)的協助，活化的過敏原特異性B細胞透過種類轉換重組(class-switching recombination)轉變成表現mIgE的IgE定向B細胞(IgE-committed B cell)。那些IgE定向B細胞最終分化成分泌IgE的漿細胞。大多數分泌IgE的漿細胞是短命的且在移動至炎症部位後死亡；然而，一些長壽細胞移動到骨髓中相對應的微環境。從漿細胞分泌的過敏原特異性IgE結合至位於血液嗜鹼性粒細胞和組織肥大細胞表面上的高親和性IgE.Fc受體(FcεRI)。由過敏原所引起與FcεRI結合之IgE的聚集刺激嗜鹼性粒細胞或肥大細胞去顆粒作用，並釋放媒介物(例如組織胺、白三烯素、PGD2、類胰蛋白酶和各種細胞因子)，其引發立即過敏反應，並促進各種細胞類型(例如TH2細胞和嗜酸性粒細胞)的動員。
第2A和2B圖是顯示分泌型IgE和膜鑲嵌型IgE(mIgE)之間的結構差異以及透過靶向IgE EMPD耗竭mIgE B細胞的基本原理的圖示。第2A圖顯示IgE以兩種形式表現：分泌型IgE和膜鑲嵌型IgE(mIgE)。分泌型IgE透過FcεRI被捕獲在嗜鹼性粒細胞和肥大細胞的細胞表面上，而mIgE僅存在於IgE定向B細胞上作為B細胞受體的一部分。mIgE之細胞外膜近側功能區塊(EMPD)是僅在mIgE B細胞上發現的位於CH4功能區塊和跨膜區域之間的67個胺基酸胜肽片段(SEQ ID NO：1)。畫有底線的胺基酸代表在EMPD短的同型異構物中發現的殘基。IgE EMPD的獨特性為靶向mIgE和mIgE B細胞提供了有吸引力的位點。第2B圖顯示透過靶向IgE EMPD耗竭mIgE B細胞的機制，其在mIgE B細胞分化成新的分泌IgE的漿細胞之前造成過敏原特異性IgE產生的抑制。壽命有限的現有分泌IgE的漿細胞最終會相繼死去，導致總IgE和過敏原特異性IgE逐漸下降。
第3圖為識別了根據本文揭露之特定實施例的疫苗劑型從發現到商業化(工業化)的發展過程流程圖。如於此圖所總結，本揭露包括胜肽免疫原設計、胜肽組成物設計、疫苗劑型設計、體外功能上的抗原性研究設計、體內免疫原性和功效研究設計，以及臨床試驗計畫書設計。每個步驟的詳細評估和分析導向一系列實驗，其導致安全且有效之疫苗劑型的商業化。
第4圖是說明在利用不同IgE EMPD胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：88至94、96和97)免疫的天竺鼠中在8週期間的抗 體反應動力學的曲線圖。利用10倍連續稀釋將血清從1：100稀釋至1：100000。利用每孔洞0.5μg胜肽量的IgE EMPD 1-39胜肽(SEQ ID NO：5)塗覆ELISA盤。利用A450閥值設為0.5之A450的線性回歸分析計算測試血清的效價，以Log10表示。
第5圖是說明利用不同IgE EMPD免疫原構建(SEQ ID NOs：88至94、96和97)所產生多種純化的多株抗IgE EMPD抗體的滴定曲線的曲線圖。利用重組含有IgE EMPD(SEQ ID NO：1)的蛋白質，γ1-em67(SEQ ID NO：1)，塗覆ELISA盤。將透過蛋白質A層析從天竺鼠血清純化的多株抗IgE EMPD抗體利用4倍連續稀釋從100μg/mL稀釋至0.0238ng/mL。利用4-參數羅吉特曲線擬合的非線性回歸計算每種多株抗IgE EMPD抗體的EC50，以免疫原構建SEQ ID Nos：89和93顯示最佳結合效率。
第6A至6C圖包含說明來自利用IgE EMPD免疫原構建免疫動物之匯集的天竺鼠血清的純化多株抗體對表現mIgE.FcL(左側)或mIgE.FcS(右側)之Ramos細胞株細胞的結合的流式細胞柱狀圖(flow cytometry histograms)。利用蛋白質A層析從天竺鼠血清純化之多株抗IgE EMPD抗體的使用濃度為10μg/mL，相較於具有大小小於20個胺基酸殘基之IgE EMPD B細胞抗原決定位胜肽的免疫原構建96和97，具有從88至94序列辨識編號之免疫原構建顯示對mIgE.FcL B細胞相當的結合。第6A圖包含來自針對IgE EMPD免疫原構建SEQ ID NOs：88至90之多株抗體的柱狀圖。第6B圖包含來自針對IgE EMPD免疫原構建SEQ ID NOs：91至93 之多株抗體的柱狀圖。第6C圖包含來自針對IgE EMPD免疫原構建SEQ ID NOs：94、96和97之多株抗體的柱狀圖。
第7圖為顯示利用針對IgE EMPD免疫原構建(SEQ ID NOs：88至93)之各種多株抗IgE EMPD抗體所引發表現mIgE.FcL之Ramos細胞的細胞凋亡圖式。利用%膜聯蛋白(Annexin)V+/PI-表示細胞凋亡的水平。將透過蛋白質A層析從天竺鼠血清純化的多株抗IgE EMPD抗體利用2倍連續稀釋從1000稀釋至62.5ng/mL。使用人源化抗IgE單株抗體Xolair®作為陽性對照。將每組多株抗IgE EMPD抗體的EC50顯示於圖的下方，其是利用4-參數羅吉特曲線擬合的非線性回歸所計算，以具有88、90和93序列辨識編號之免疫原構建顯示引發mIgE.FcL B細胞細胞凋亡的最佳效力。
第8圖為顯示以數值為1/30之效應細胞/標的細胞比值利用針對IgE EMPD免疫原構建(SEQ ID NOs：88至93)之多株抗IgE EMPD抗體所引發表現mIgE.FcL之Ramos細胞的抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的長條圖。以10μg/mL之濃度使用透過蛋白質A層析從天竺鼠血清純化的多株抗IgE EMPD抗體。將IL-2刺激的小鼠脾臟細胞作為效應細胞，而小鼠抗IgE單株抗體5D5作為陽性對照。
第9圖是說明用於精細特異性分析之抗原決定位鑑定的圖式，其利用來自天竺鼠的免疫血清使用涵蓋IgE EMPD之胺基酸9-50的重疊的10-mer胜肽以ELISA進行分析。被血清樣品中的抗體所辨識之主要抗原決定位對代表IgE EMPD之環狀結構區域具有特異性。此圖式說明由天然IgE EMPD 中的胺基酸C18和C39之間的分子內雙硫鍵所形成的內部環狀結構。將血清以1：1000比例稀釋以用於抗原決定位鑑定。利用10-mer胜肽(每個孔洞0.5μg胜肽)塗覆ELISA盤。透過使用從先前利用具有SEQ ID NOs：88、89、93、96和97之免疫原構建免疫的天竺鼠中所收集的免疫血清樣品進行抗原決定位鑑定研究以識別出反應位點，並相應地進行標記。
第10圖是說明在利用本揭露胜肽免疫原構建免疫接種之後用以評估木瓜蛋白酶引發之初級和次級免疫反應的實驗設計圖式。在第0、3和5週利用IgE EMPD胜肽免疫原構建肌肉內(im)免疫接種人類IGHE敲入雜交小鼠三次。在初級IgE反應模型中，在第10週利用木瓜蛋白酶/TiterMax Gold以皮下注射(sc)方式對小鼠進行攻毒，並於第12週測定木瓜蛋白酶特異性人類IgE(hIgE)(如第13圖所示)。在次級IgE反應中，在第16週再次利用木瓜蛋白酶/TiterMax Gold以皮下注射方式對小鼠進行攻毒，並於第18週測定木瓜蛋白酶特異性人類IgE(hIgE)(如第14圖所示)。在整個研究中，針對抗IgE抗體產生(第11圖)和血清IgE變化(第12圖)也測試了接受免疫接種之小鼠的血清。
第11圖是說明利用第10圖所述之實驗設計在20週期間內抗IgE抗體產生動力學的圖形。具體而言，此圖形顯示於人類IGHE敲入雜交小鼠(hIGHE x Balb/c，每組別n=8)中的抗體反應，其於第0、3和5週以指定劑量(每次免疫接種100μL)利用IgE EMPD免疫原構建(SEQ ID NO：88或93)肌肉內 免疫接種三次，並在第10和16週利用木瓜蛋白酶/TiterMax以皮下注射方式進行攻毒。利用4倍連續稀釋將小鼠血清從1：100稀釋至1：(4.19×108)。利用重組含有IgE EMPD的蛋白質，γ1-em67，塗覆ELISA盤。利用4-參數羅吉特曲線擬合的非線性回歸計算測試血清的效價，以稀釋因子的Log(EC50)表示。
第12圖是說明利用第10圖所述之實驗設計在20週期間內血清IgE變化的圖形。具體而言，此圖形顯示於人類IGHE敲入雜交小鼠(hIGHE x Balb/c，每組別n=8)中的血清IgE水平，其於第0、3和5週以指定劑量(每次免疫接種100μL)利用IgE EMPD免疫原構建(SEQ ID NO：88或93)肌肉內免疫接種三次，並在第10和16週利用木瓜蛋白酶/TiterMax以皮下注射方式進行攻毒。在人類IgE(hIgE)定量ELISA中測定血清IgE。以1：20比例稀釋小鼠血清。使用從U266骨髓瘤細胞純化的hIgE產生標準曲線。透過將A450內插至利用4-參數羅吉特曲線擬合透過非線性回歸所產生的標準曲線中來計算IgE濃度。
第13圖是顯示利用第10圖所述之實驗設計在第12週所測定在初級IgE反應中木瓜蛋白酶特異性人類IgE(hIgE)產生之抑制的圖形。具體而言，於第0、3和5週以指定劑量(每次免疫接種100μL)利用IgE EMPD免疫原構建(SEQ ID NO：88或93)肌肉內免疫接種人類IGHE敲入雜交小鼠(hIGHE x Balb/c，每組別n=8)三次。在定量ELISA中測定血清木瓜蛋白酶特異性hIgE。以1：10比例稀釋小鼠血清。使用單株嵌 合木瓜蛋白酶特異性hIgE產生標準曲線。透過將A450內插至利用4-參數羅吉特曲線擬合透過非線性回歸所產生的標準曲線中來計算木瓜蛋白酶特異性hIgE濃度。
第14圖是顯示利用第10圖所述之實驗設計在第18週所測定在次級IgE反應中木瓜蛋白酶特異性人類IgE(hIgE)產生之抑制的圖形。具體而言，於第0、3和5週以指定劑量(每次免疫接種100μL)利用IgE EMPD免疫原構建(SEQ ID NO：88或93)肌肉內免疫接種人類IGHE敲入雜交小鼠(hIGHE x Balb/c，每組別n=8)三次。在定量ELISA中測定血清木瓜蛋白酶特異性hIgE。以1：10比例稀釋小鼠血清。使用單株嵌合木瓜蛋白酶特異性hIgE產生標準曲線。透過將A450內插至利用4-參數羅吉特曲線擬合透過非線性回歸所產生的標準曲線中來計算木瓜蛋白酶特異性hIgE濃度。
第15圖是說明用以評估在利用本揭露胜肽免疫原構建免疫接種後之木瓜蛋白酶引發的致敏化作用和回憶免疫反應的實驗設計示意圖。先在第0週利用木瓜蛋白酶/TiterMax Gold皮下(sc)致敏人類IGHE敲入雜交小鼠，然後於第3、6和8週利用IgE EMPD胜肽免疫原構建進行肌肉內免疫接種三次。在第12週利用配製於PBS溶液中的木瓜蛋白酶透過皮內的足墊注射引發木瓜蛋白酶特異性免疫回憶反應。在實驗的第0至6週之間評估總IgE和木瓜蛋白酶特異性IgE/IgG的水平(第16圖)，並在第12、13和14週評估木瓜蛋白酶特異性IgE水平(第17圖)。
第16圖包含顯示利用第15圖所述之實驗設計以木瓜蛋白 酶致敏所有人類IGHE敲入雜交小鼠之結果圖形。木瓜蛋白酶特異性小鼠IgG效價以Log(EC50)表示，並偵測6週期間內之人類IgE(ng/mL)。此外，由於旁觀者活化(bystander activation)造成總IgE水平(ng/mL)增加。
第17圖是顯示利用第15圖所述之實驗設計在第12、13和14週所測定木瓜蛋白酶特異性人類IgE(hIgE)產生之抑制的圖形。具體而言，圖形顯示在於第3、6和8週三次利用劑量為400μg/mL(每次免疫接種100μL)之SEQ ID NO：88或93進行肌肉內免疫接種之致敏化的人類IGHE敲入雜交小鼠(hIGHE x Balb/c，每組別n=8)中的木瓜蛋白酶特異性回憶反應。在定量ELISA中測定血清木瓜蛋白酶特異性hIgE。以1：10比例稀釋小鼠血清。使用單株嵌合木瓜蛋白酶特異性hIgE(ng/mL)產生標準曲線。透過將A450內插至利用4-參數羅吉特曲線擬合透過非線性回歸所產生的標準曲線中來計算木瓜蛋白酶特異性hIgE濃度。
第18A和18B圖是顯示以指定劑量在於第0、3和6週利用每劑量為30、100、300和1000μg之四種劑量的IgE EMPD免疫原構建(SEQ ID NO：88)加上安慰劑對照劑型免疫之食蟹猴中原型免疫治療過敏疫苗劑型之免疫原性並利用ELISA評估抗IgE EMPD效價的圖形。第18A圖顯示於利用含有MontanideTM ISA 51和CpG ODN之劑型免疫的食蟹猴中的抗體反應。第18B圖顯示於利用含有ADJUPHOS和CpG ODN之劑型免疫的食蟹猴中的抗體反應。
第19圖是說明在於第0、3和6週利用劑量為300μg/mL (每次免疫接種500μL)之免疫原構建(SEQ ID NOs：125或126)肌肉內免疫接種3次的食蟹猴(每組別2隻雄性和2隻雌性)中在20週期間內抗體反應動力學的圖形。利用4倍連續稀釋將食蟹猴血清從1：100稀釋至1：(4.19×108)。利用SEQ ID NO：5塗覆ELISA盤。利用4-參數羅吉特曲線擬合的非線性回歸計算測試血清的效價，以稀釋因子的Log10表示。將閥值設定為1：100稀釋之所有血清樣品的平均A450的2倍。
第20圖是說明在於第0、3和6週利用劑量為300μg/mL(每次免疫接種500μL)之IgE EMPD免疫原構建(SEQ ID NO：125或126)肌肉內免疫接種3次的食蟹猴(每組別2隻雄性和2隻雌性)中在20週期間內IgG、IgA和IgM抗體反應的動力學。利用4倍連續稀釋將食蟹猴血清從1：100稀釋至1：(4.19×108)。利用IgE EMPD 1-39胜肽(SEQ ID NO：5)塗覆ELISA盤。透過將閥值內插至由每一測試血清數據所產生的4-參數羅吉特曲線中來計算效價，以Log10表示。將閥值設定為1：100稀釋之所有血清樣品的平均A450的2倍。
第21圖是說明在於第0、3和6週利用劑量為300μg/mL(每次免疫接種500μL)之IgE EMPD免疫原構建(SEQ ID NO：125或126)肌肉內免疫接種3次的食蟹猴(每組別2隻雄性和2隻雌性)中在20週期間內血清IgE水平變化的圖形。在食蟹猴IgE定量ELISA中測定血清IgE水平。以1：20比例稀釋食蟹猴血清。使用食蟹猴IgE產生標準曲線。透過將A450內插至利用4-參數羅吉特曲線擬合透過非線性回歸所產生的標準曲線中來計算IgE濃度。結果為平均值±標準差。使 用具有雙尾假設的成對t檢定來鑑定對比第0週的統計學上差異：*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001。
本揭露關於靶向膜鑲嵌型IgE之細胞外膜近側功能區塊(EMPD)(或稱IgE EMPD)的胜肽免疫原構建。本揭露也關於包含此胜肽免疫原構建的組成物、製備和使用此胜肽免疫原構建的方法，以及利用此胜肽免疫原構建免疫之宿主所產生的抗體。
揭露的胜肽免疫原構建包含約20個或更多個胺基酸。此胜肽免疫原構建包含來自全長IgE EMPD(SEQ ID NO：1)之67個胺基酸序列的B細胞抗原決定位。此B細胞抗原決定位可透過任選的異源性間隔子連接至衍生自病原菌蛋白之異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。揭露的胜肽免疫原構建可刺激針對IgE EMPD之高特異性抗體的產生，且可結合至重組含有IgE EMPD的蛋白質，γ1-em67，及/或帶有mIgE之B細胞上的IgE EMPD。揭露的胜肽免疫原構建對IgE介導過敏性疾病的全球患者可作為與過敏原無關的、具有成本效益的、通用的免疫療法。
胜肽免疫原構建的B細胞抗原決定位部份具有來自全長IgE EMPD序列(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列。在一些實施例中，依據全長IgE EMPD序列(SEQ ID NO：1)的編碼，B細胞抗原決定位具有包含由內源性半胱胺酸(C18-C39)所形成之內部的分子內環狀結構的序列。在某些具體實施例中，B細胞抗原決定位具有IgE EMPD-1-39(SEQ ID NO：5)、 IgE EMPD-7-40(SEQ ID NO：6)、IgE EMPD-19-38(SEQ ID NO：8)或IgE EMPD-1-40(SEQ ID NO：9)的胺基酸序列。
本揭露的胜肽免疫原構建可含有衍生自病原菌蛋白之異源性Th抗原決定位胺基酸序列(例如SEQ ID NOs：59至87)。在某些實施例中，異源性Th抗原決定位衍生自自然界的病原菌，例如：白喉毒素(SEQ ID NO：63)、惡性瘧原蟲(SEQ ID NO：64)、霍亂毒素(SEQ ID NO：66)。在其他實施例中，異源性Th抗原決定位為以單一序列(例如SEQ ID NOs：60、67、72和73)或組合序列(例如SEQ ID NOs：70、69和71)形式之衍生自麻疹病毒融合蛋白(MVF 1至5)或B型肝炎表面抗原(HBsAg 1至3)的理想化人工Th抗原決定位。
在一些實施例中，胜肽免疫原構建包含來自IgE EMPD的B細胞抗原決定位，其透過任選的異源性間隔子連接至異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。任選的異源性間隔子為能夠將兩個胺基酸及/或胜肽連接在一起的分子或化學結構。在某些實施例中，間隔子是天然存在的胺基酸、非天然存在的胺基酸或其組合。
在某些實施例中，胜肽免疫原構建包含來自IgE EMPD-1-40(SEQ ID NO：9)具有超過約20個胺基酸的B細胞抗原決定部位，其透過任選的異源性間隔子連接至衍生自病原菌蛋白的異源性Th抗原決定位(例如SEQ ID NOs：59至87)。在具體實施例中，胜肽免疫原構建具有SEQ ID NOs：88-95、98-124和130的胺基酸序列。
本揭露也關於包含IgE EMPD胜肽免疫原構建的 組成物。在一些實施例中，揭露的組成物包含超過一個的IgE EMPD胜肽免疫原構建。在某些實施例中，組成物包含胜肽免疫原構建的混合物，其包含連接至不同Th抗原決定位之IgE EMPD-1-39的B細胞抗原決定位部份(例如SEQ ID NOs：98-124的任意組合)，以涵蓋患者的廣泛遺傳背景。相較於只包含單一胜肽免疫原構建的組成物，包含胜肽免疫原構建混合物的組成物在疫苗免疫接種後可導致較高百分比的反應率，以治療IgE介導過敏性疾病。
本揭露也關於用以治療及/或預防IgE介導過敏性疾病的醫藥組成物，包含疫苗劑型。在一些實施例中，醫藥組成物包含揭露的胜肽免疫原構建，胜肽免疫原構建是以穩定化的免疫刺激複合物形式存在，此形式是藉由混合CpG寡聚合物和包含胜肽免疫原複合物的組成物以透過靜電結合所形成。這種穩定化的免疫刺激複合物可進一步增強胜肽免疫原構建的免疫原性。在一些實施例中，醫藥組成物包含佐劑，例如礦物鹽，其包括明礬凝膠(ALHYDROGEL)、磷酸鋁(ADJUPHOS)，或包括MONTANIDE ISA 51或720的油包水乳液。
本揭露也關於針對揭露的IgE EMPD胜肽免疫原構建的抗體。具體而言，本揭露的胜肽免疫原構建可刺激高特異性抗體的產生，此抗體可與胜肽免疫原構建之IgE EMPD B細胞抗原決定位部份交叉反應。揭露的抗體利用高特異性結合至IgE EMPD，沒有太多，如果有的話，則是針對用於免疫原性增強的異源性Th抗原決定位，此與使用用於胜肽免原 性增強的常規蛋白或其他生物載體所製造的抗體形成鮮明對比。因此，相較於其他胜肽或蛋白質免疫原，揭露的胜肽免疫原構建可破壞針對自體抗原的免疫耐受，具有高反應率。
在某些實施例中，當將胜肽免疫原構建投予受試者時，抗體針對且特異性地結合至IgE EMPD-1-52胺基酸序列(SEQ ID NO：2)、IgE EMPD-1-67胺基酸序列(SEQ ID NO：1)及其片段(例如SEQ ID NOs：5和6)。利用胜肽免疫原構建製造的高特異性抗體可與可溶性包含IgE EMPD的胜肽和蛋白質、包含IgE EMPD的融合胜肽和蛋白質、γ1-em67及/或帶有膜鑲嵌型IgE之B細胞上的IgE EMPD交叉反應。產生的抗體能夠與表現mIgE之B淋巴球上的IgE B細胞受體(BCR)結合並交聯。此種交聯可誘導細胞溶解效應，例如細胞凋亡和抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)，其造成血清IgE產量的降低。
基於其獨特的特徵和性質，揭露的抗體能夠提供通用的免疫治療方法以治療IgE介導過敏性疾病，而無需考慮致病過敏原種類。
本揭露也關於製備揭露的胜肽免疫原構建、組成物和抗體的方法。揭露的方法提供了胜肽免疫原構建和含有此構建之組成物的低成本製造和品質控管，其可用於治療IgE介導過敏性疾病的方法，而無需考慮致病過敏原種類。
本揭露也包括用以治療及/或預防IgE介導過敏性疾病的方法，而無需考慮致病過敏原種類，其使用揭露的胜肽免疫原構建及/或針對此胜肽免疫原構建的抗體。在一些 實施例中，用以治療及/或預防IgE介導過敏性疾病的方法包含將包含揭露的胜肽免疫原構建的組成物投予宿主。在某些實施例中，此方法中所使用的組成物包含揭露的胜肽免疫原構建，此胜肽免疫原構建是以穩定的免疫刺激複合物形式存在，此穩定化的免疫刺激複合物是利用帶負電的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)透過靜電結合所形成，其可進一步補充佐劑，用以投予IgE介導過敏性疾病患者。揭露的方法也包括將胜肽免疫原構建投予具有IgE介導過敏性疾病風險或已患病之宿主的給藥方案、劑型和途徑。
本文使用的章節標題僅用於組織的目的，不應被理解為限制所述主題。本申請中引用的所有參考文獻或參考文獻的部分出於任何目的在此透過引用明確地將整體併入本文。
除非特別說明，在此使用的所有技術和科學用語如本發明所屬技術領域中具有通常知識者的通常理解具有相同意義。除非上下文清楚地指出，否則單詞“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包含複數形式。類似地，單詞“或(or)”是意指包括“和(and)”，除非上下文另有明確說明。因此，“包含A或B”是指包括A，或B，或A和B。更應被理解的是，用於給定多胜肽之所有的胺基酸大小和所有分子量或分子質量值是近似的，並且被提供作為描述之用。然而類似或等同於在此描述者的方法和材料可被用於以下所述之揭露的方法、合適的方法和材料的實踐或測試中。在此提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻透過引用整體併入本 文。在衝突的情況下，以本說明書(包括術語的解釋)為準。此外，在此揭露的材料、方法和實施例僅是說明性的而非意指加以限制。
IgE EMPD胜肽免疫原構建
本揭露提供胜肽免疫原構建，其包含具有來自IgE EMPD之胺基酸序列的B細胞抗原決定位，B細胞抗原決定位直接地或是透過任選的異源性間隔子共價連接至異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。
本文使用術語“IgE EMPD胜肽免疫原構建”或“胜肽免疫原構建”是指包含(a)來自全長IgE EMPD(SEQ ID NO：1)之67個胺基酸序列之具有約20或更多胺基酸殘基的B細胞抗原決定位；(b)異源性Th抗原決定位；以及(c)任選的異源性間隔子的胜肽。
在某些實施例中，IgE EMPD胜肽免疫原構建可利用此分子式表示：(Th)m-(A)n-(IgE EMPD片段)-X或(IgE EMPD片段)-(A)n-(Th)m-X或(Th)m-(A)n-(IgE EMPD片段)-(A)n-(Th)m-X
其中Th為異源性T輔助細胞抗原決定位；A為異源性間隔子； (IgE EMPD片段)為來自IgE EMPD具有約20至約40個胺基酸殘基的B細胞抗原決定位；X為胺基酸的α-COOH或α-CONH2；m為1至約4；以及n為0至約10。
基於許多基本原理設計和選擇本揭露的IgE EMPD胜肽免疫原構建。其中幾個基本原理包括使用IgE EMPD胜肽免疫原構建：i. 本身為非免疫原性，因為其為自身分子；ii. 可透過蛋白質載體或有效的T輔助細胞抗原決定位以呈現免疫原性；iii. 當呈現免疫原性並投予宿主時：a. 引發針對IgE EMPD胜肽序列(B細胞抗原決定位)之高效價抗體，而非針對蛋白質載體或T輔助細胞抗原決定位；b. 可於接受免疫的宿主中破壞免疫耐受，並產生可與IgE EMPD(SEQ ID NO：1)交叉反應的高特異性抗體，此IgE EMPD是由表現mIgE.FcL之CHO細胞純化而來的重組蛋白，或是位於利用編碼mIgE.FcL之重組DNA轉染之帶有mIgE之B細胞(例如Ramos)細胞膜上；c. 在體外可產生高特異性抗體，其能夠誘導表現IgE之B淋巴球的抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)和細胞凋亡(實施例6)；以及d. 在以過敏原攻毒之初次免疫與加強免疫後，可 產生高特異性抗體，其能夠導致血液中基礎水平IgE的體內降低，以及抗原特異性IgE水平的顯著降低(實施例8至11)。
揭露的IgE EMPD胜肽免疫原構建及其劑型可有效地作為疫苗，以減少或消除於IgE介導過敏性疾病患者中的IgE介導過敏性病理學。
於下文進一步詳細描述所揭露IgE EMPD胜肽免疫原構建的各種組分。
a. IgE EMPD的B細胞抗原決定位
本揭露關於用以產生對IgE EMPD胜肽具有特異性之高效價多株抗體的新穎胜肽組成物，其與定向分化為分泌IgE之人類B細胞上表現的膜鑲嵌型IgE交叉反應。透過合理設計的努力，胜肽組成物的位點特異性使針對載體蛋白上不相關位點的抗體的產生降到最低。
本文使用術語“IgE”是指任何形式的免疫球蛋白E，包含分泌型IgE、膜鑲嵌型IgE及其片段。第2圖說明IgE的分泌與膜鑲嵌形式。
本文使用術語“mIgE”特別地是指IgE的膜鑲嵌形式及其片段。在一些實施例中，mIgE是於人類中IgE的膜鑲嵌形式，其具有如報導所述編號PH1215之人類Ig epsilon鏈C區形式2(片段)的胺基酸序列。第2A圖說明膜鑲嵌型IgE(右側)。
本文使用術語“IgE EMPD”是指膜鑲嵌型IgE(mIgE)之細胞外膜近側功能區塊(EMPD)及其片段。IgE EMPD也稱為CεmX，其位於CH4功能區塊和羧基端膜錨定跨膜胜肽之間，並且僅存在於mIgE B細胞上。IgE的EMPD起因於“短”異構物所使用剪接受體位點上游156bp處的ε RNA轉錄物的可變剪接。人類IgE之全長“長”EMPD異構物長度為67個胺基酸(SEQ ID NO：1)，其包含不存在於“短”異構物中的52個胺基酸(SEQ ID NO：2)。第2A圖說明膜鑲嵌型IgE，其具有經放大的EMPD部分。全長IgE EMPD(SEQ ID NO：1)及其片段(SEQ ID NOs：2-58和127)的胺基酸序列如表1所示。
基於IgE EMPD的67個胺基酸和52個胺基酸序列(分別為SEQ ID NOs：1和2)的胺基酸編碼，IgE EMPD包含位於內源性半胱胺酸(C18-C39)之間的分子內環狀結構。IgE之內部的分子內環狀結構於第9圖說明。
IgE EMPD胜肽免疫原構建的B細胞抗原決定位包含IgE EMPD的分子內環狀結構，或其部份。在某些實施例中，B細胞抗原決定位包含IgE EMPD的約20至約40個胺基酸。
在一些實施例中，IgE EMPD胜肽免疫原構建的B細胞抗原決定位部份的胺基酸序列包含來自全長IgE EMPD(SEQ ID NO：1)的約20至約40個胺基酸殘基。在某些實施例中，依據全長IgE EMPD(SEQ ID NO：1)的編碼，B細胞抗原決定位包含來自由內源性半胱胺酸(C18-C39)所形成之IgE EMPD的內部分子內環狀結構的胺基酸序列。在具體實施例中，B細胞抗原決定位的序列於IgE EMPD之分子內環狀結構 的羧基端是以位於第38個殘基的精胺酸(R)、位於第39個殘基的半胱胺酸(C)或位於第40個殘基的組胺酸(H)作為結束。
在一些實施例中，如表1所示，B細胞抗原決定位具有IgE EMPD-1-39(SEQ ID NO：5)、IgE EMPD-7-40(SEQ ID NO：6)、IgE EMPD-19-38(SEQ ID NO：8)或IgE EMPD-1-40(SEQ ID NO：9)的胺基酸序列。
本揭露的IgE EMPD片段也包含IgE EMPD胜肽(SEQ ID NOs：5、6、8和9)及其超過20個胺基酸片段的免疫功能類似物或同源物。IgE EMPD胜肽及其超過20個胺基酸片段的功能免疫類似物或同源物包括保留與原始胜肽實質性相同之免疫原性的變異物。免疫功能類似物可具有於胺基酸位置的保留性取代、總電荷改變、與其他官能基共價連接或胺基酸的添加、插入或刪除及/或其任意組合。
b. 異源性T輔助細胞抗原決定位(Th抗原決定位)
本揭露提供胜肽免疫原構建，其包含來自IgE EMPD的B細胞抗原決定位，B細胞抗原決定位直接地或是透過任選的異源性間隔子共價連接至異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。
於IgE EMPD胜肽免疫原構建的異源性Th抗原決定位可增強IgE EMPD片段的免疫原性，其透過合理設計促進針對優化目標B細胞抗原決定位(即IgE EMPD片段)之特異性高效價抗體的產生。
本文使用術語“異源性”是指衍生自並非IgE EMPD野生型序列之部分或與其同源之胺基酸序列的胺基酸序列。因此，異源性Th抗原決定位為衍生自非天然存在於IgE EMPD之胺基酸序列的Th抗原決定位(即Th抗原決定位對IgE EMPD而言不是自體衍生的)。因為Th抗原決定位對IgE EMPD而言是異源性的，當異源性Th抗原決定位共價連接至IgE EMPD片段時，IgE EMPD的天然胺基酸序列不會向氨基端或羧基端方向延伸。
本揭露的異源性Th抗原決定位可為不具有天然存在於IgE EMPD之胺基酸序列的任何Th抗原決定位。Th抗原決定位還可具有針對多種物種第2類MHC分子的混雜結合基序。在某些實施例中，Th抗原決定位包含多個混雜的第2類MHC結合基序，以允許T輔助細胞的最大活化，從而導致免疫反應的啟動和調節。優選的Th抗原決定位本身為非免疫原性的(即如果有的話，很少利用IgE EMPD胜肽免疫原構建所產生的抗體是針對Th抗原決定位)，因此允許針對IgE EMPD片段之目標B細胞抗原決定位的非常集中的免疫反應。
本揭露的Th抗原決定位包括，但不限於，衍生自外來病原菌之胺基酸序列，如表2(SEQ ID NOs：59-87)所例示。此外，Th抗原決定位包括理想化人工Th抗原決定位和組合的理想化人工Th抗原決定位(例如：SEQ ID NOs：60和67-73)。異源性Th抗原決定位胜肽以組合序列(例如SEQ ID NOs：68-71)呈現，包含基於特定胜肽之同源物的可變殘基在胜肽骨架內於特定位置處表示的胺基酸殘基的混合物。可以利用在合成過程期間在特定位置添加選定受保護之胺基酸 的混合物，而非一個特定的胺基酸，於單一過程中合成組合胜肽的集合。此種組合異源性Th抗原決定位胜肽集合可允許對具有不同遺傳背景之動物廣泛的Th抗原決定位覆蓋。異源性Th抗原決定位胜肽之代表性組合序列包含如表2所示的SEQ ID NOs：68-71。本發明的Th抗原決定位胜肽對來自基因多樣性群體的動物和患者提供廣泛的反應性和免疫原性。
包含Th抗原決定位之IgE EMPD胜肽免疫原構建可於與IgE EMPD片段串聯的單一固相胜肽合成中同時產生。Th抗原決定位也可包括Th抗原決定位的免疫類似物。免疫Th類似物包括免疫增強類似物、交叉反應類似物和任何這些Th抗原決定位的片段，其足以增強或刺激對IgE EMPD片段的免疫反應。
Th抗原決定位胜肽的功能免疫類似物也是有效的，且被包括作為本發明的一部分。功能免疫Th類似物可包含於Th抗原決定位中從1至約5個胺基酸殘基的保留性取代、添加、刪除和插入，其實質上未改變Th抗原決定位的Th刺激功能。如上文針對IgE EMPD片段所描述的，可以利用天然或非天然胺基酸完成保留性取代、添加和插入。表2辨識了Th抗原決定位胜肽之功能類似物的另一種變異物。具體而言，MvF1和MvF2 Th的SEQ ID NOs：60和67是MvF4和MvF5的SEQ ID NOs：70和72的功能類似物，因為利用在氨基端和羧基端將各兩個胺基酸刪除(SEQ ID NOs：60和67)或插入(SEQ ID NOs：70和72)而使其胺基酸骨架有所區別。在類似序列的這兩個系列之間的差異並不會影響包含於此些序列 中之Th抗原決定位的功能。因此，功能免疫Th類似物包括衍生自麻疹病毒融合蛋白MvF1-4 Ths(SEQ ID NOs：60、67、68、70和72)和衍生自肝炎表面蛋白HBsAg 1-3 Ths(SEQ ID NOs：69、71和73)之Th抗原決定位的多種版本。
在IgE EMPD胜肽免疫原構建中的Th抗原決定位可共價連接於IgE EMPD胜肽片段的氨基端或羧基端。在一些實施例中，Th抗原決定位是共價連接至IgE EMPD胜肽片段的氨基端。在其他實施例中，Th抗原決定位是共價連接至IgE EMPD胜肽片段的羧基端。在某些實施例中，超過一個的Th抗原決定位共價連接至IgE EMPD片段。當超過一個的Th抗原決定位連接至IgE EMPD片段時，每一個Th抗原決定位可具有相同胺基酸序列或不同胺基酸序列。另外，當超過一個的Th抗原決定位連接至IgE EMPD片段時，Th抗原決定位可以任何順序排列。例如，Th抗原決定位可連續地連接至IgE EMPD片段的氨基端，或連續地連接至IgE EMPD片段的羧基端，或當不同的Th抗原決定位共價連接至IgE EMPD片段的羧基端時，Th抗原決定位可共價連接至IgE EMPD片段的氨基端。Th抗原決定位相對於IgE EMPD片段的排列並無限制。
在一些實施例中，Th抗原決定位直接地共價連接至IgE EMPD片段。在其他實施例中，Th抗原決定位透過於下文進一步詳細描述的異源性間隔子共價連接至IgE EMPD片段。
c. 異源性間隔子
揭露的IgE EMPD胜肽免疫原構建任選地包含異源性間隔子，其將來自IgE EMPD的B細胞抗原決定位共價連接至異源性T輔助細胞(Th)抗原決定位。
如上所述，術語“異源性”是指衍生自並非IgE EMPD天然形式序列之部分或與其同源之胺基酸序列的胺基酸序列。因此，當異源性間隔子共價連接至來自IgE EMPD的B細胞抗原決定位時，IgE EMPD的天然胺基酸序列不會向氨基端或羧基端方向延伸，因為間隔子對IgE EMPD序列而言是異源性的。
間隔子為能夠將兩個胺基酸及/或胜肽連接在一起的分子或化學結構。依據應用的不同，間隔子的長度或極性可能會有所不同。間隔子連接可透過酰胺或羧基連結，但是其他官能基也是可能的。間隔子可包括化學化合物、天然存在的胺基酸或非天然存在的胺基酸。
間隔子可為IgE EMPD胜肽免疫原構建提供結構特徵。結構上，間隔子提供Th抗原決定位與IgE EMPD片段的B細胞抗原決定位的物理分離。透過間隔子的物理分離可破壞透過將Th抗原決定位連接至B細胞抗原決定位所產生的任何人工二級結構。另外，透過間隔子之抗原決定位的物理分離可消除Th細胞及/或B細胞反應之間的干擾。此外，可設計間隔子以產生或修飾胜肽免疫原構建的二級結構。例如，可設計間隔子以作為柔性鉸鏈，用以增強Th抗原決定位和B細胞抗原決定位的分離。柔性鉸鏈間隔子也可允許所呈現之胜肽免疫原與適當的Th細胞和B細胞之間更有效率的交互作 用，以增強對Th抗原決定位和B細胞抗原決定位的免疫反應。編碼柔性鉸鏈之序列的例示見於通常富含脯胺酸的免疫球蛋白重鏈鉸鏈區。利用序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO：128)提供了一種作為間隔子的特別有用的柔性鉸鏈，其中Xaa是任何胺基酸，以天門冬胺酸為優選。
間隔子也可為IgE EMPD胜肽免疫原構建提供功能特徵。例如，可設計間隔子以改變IgE EMPD胜肽免疫原構建的總電荷，其可影響胜肽免疫原構建的溶解度。此外，改變IgE EMPD胜肽免疫原構建的總電荷可影響胜肽免疫原構建與其他化合物和試劑結合的能力。如下文進一步詳細討論的，IgE EMPD胜肽免疫原構建可透過靜電結合與高度帶電的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)形成穩定的免疫刺激複合物。IgE EMPD胜肽免疫原構建的總電荷對於形成這些穩定的免疫刺激複合物而言是重要的。
可作為間隔子的化學化合物包括，但不限於，(2-胺乙氧基)乙酸(AEA)、5-氨基戊酸(AVA)、6-氨基己酸(Ahx)、8-氨基-3,6-二氧雜辛酸(AEEA,mini-PEG1)、12-氨基-4,7,10-三氧雜十二酸(mini-PEG2)、15-氨基-4,7,10,13-四氧雜十五烷酸(mini-PEG3)、trioxatridecan-succinamic acid(Ttds)、12-氨基十二烷酸、Fmoc-5-氨基-3-氧戊酸(O1Pen)等。
天然存在的胺基酸包括丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸和纈胺酸。
非天然存在的胺基酸包括，但不限於，ε-N離胺酸、ß-丙胺酸、鳥胺酸、正白胺酸、正纈胺酸、羥脯胺酸、甲狀腺素、γ-氨基丁酸、高絲胺酸、瓜胺酸、氨基苯甲酸、6-胺基己酸(Aca；6-胺基己酸)、3-硫醇丙酸(MPA)、3-硝基酪胺酸、焦麩胺酸等。
IgE EMPD胜肽免疫原構建中的間隔子可共價連接在Th抗原決定位和IgE EMPD胜肽的氨基端或羧基端。在一些實施例中，間隔子共價連接至Th抗原決定位的羧基端和IgE EMPD胜肽的氨基端。在其他實施例中，間隔子共價連接至IgE EMPD胜肽的羧基端和Th抗原決定位的氨基端。在某些實施例中，可使用超過一個的間隔子，例如，當在胜肽免疫原構建中存在超過一個的Th抗原決定位時。當使用超過一個的間隔子時，每個間隔子可以彼此相同或不同。此外，當胜肽免疫原構建中存在超過一個的Th抗原決定位時，可利用間隔子分隔開Th抗原決定位，間隔子可為相同或不同，利用間隔子將Th抗原決定位與B細胞抗原決定位分開。間隔子相對於Th抗原決定位或IgE EMPD片段的排列沒有限制。
在某些實施例中，異源性間隔子是天然存在的胺基酸或非天然存在的胺基酸。在其他實施例中，間隔子包含超過一個的天然存在或非天然存在的胺基酸。在具體實施例中，間隔子為Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：129)。
d. IgE EMPD胜肽免疫原構建的具體實施例
在某些實施例中，IgE EMPD胜肽免疫原構建可利用以下分子式表示：(Th)m-(A)n-(IgE EMPD片段)-X或(IgE EMPD片段)-(A)n-(Th)m-X或(Th)m-(A)n-(IgE EMPD片段)-(A)n-(Th)m-X
其中Th為異源性T輔助細胞抗原決定位；A為異源性間隔子；(IgE EMPD片段)為來自IgE EMPD具有約20至約40個胺基酸殘基的B細胞抗原決定位；X為胺基酸的α-COOH或α-CONH2；m為1至約4；以及n為0至約10。
在某些實施例中，IgE EMPD胜肽免疫原構建中的異源性Th抗原決定位具有選自SEQ ID NOs：59-87中的任一個及其組合的胺基酸序列，如表2所示。在一些實施例中，IgE EMPD胜肽免疫原構建包含超過一個的Th抗原決定位。
在某些實施例中，任選的異源性間隔子是選自Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：129)中的任一個及其組合。在具體實施例中，異源性間隔子為ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：129)。
在某些實施例中，IgE EMPD片段具有來自SEQ ID NO：1或2之IgE EMPD的約20至約40個胺基酸殘基。在具體實施例中，依據全長IgE EMPD(SEQ ID NO：1)的編碼，IgE EMPD片段包含來自由內源性半胱胺酸(C18-C39)所形成之IgE EMPD的內部分子內環狀結構的胺基酸序列。在具體實施例中，IgE EMPD片段具有IgE EMPD-1-39(SEQ ID NO：5)、IgE EMPD-7-40(SEQ ID NO：6)、IgE EMPD-19-38(SEQ ID NO：8)或IgE EMPD-1-40(SEQ ID NO：9)的胺基酸序列，如表1所示。
在某些實施例中，IgE EMPD胜肽免疫原構建具有選自SEQ ID NOs：88-130中任一個的胺基酸序列，如表3所示。在具體實施例中，IgE EMPD胜肽免疫原構建具有選自SEQ ID NOs：88-95、98-124和130中任一個的胺基酸序列。
e. 變異物、同源物和功能類似物
也可使用上述免疫原胜肽的變異物和類似物，其可誘導抗體及/或與抗體交叉反應，而此抗體是針對IgE EMPD的優選抗原決定位。類似物(包括等位基因、物種以及誘導變異物)，通常於一個、兩個或幾個位置上有別於天然存在的胜肽，通常是由於保留性取代。類似物通常展現與天然胜肽至少80或90%的序列一致性。一些類似物還包括非天然胺基酸或在一個、兩個或幾個位置上之氨基端或羧基端胺基酸的修飾。
作為功能類似物的變異物可具有於胺基酸位置上的保留性取代、總電荷改變、與其他官能基共價連接或胺 基酸的添加、插入或刪除及/或其任意組合。
保留性取代是指一個胺基酸殘基被另一個具有相似化學性質的胺基酸殘基所取代。例如，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸和甲硫胺酸；極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天門冬醯胺酸和麩醯胺酸；帶正電的(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸和組胺酸；而帶負電的(酸性)胺基酸包括天門冬胺酸和麩胺酸。
在一個特定實施例中，功能類似物與原始胺基酸序列具有至少50%的一致性。在另一實施例中，功能類似物與原始胺基酸序列具有至少80%的一致性。在又一實施例中，功能類似物與原始胺基酸序列具有至少85%的一致性。在又一實施例中，功能類似物與原始胺基酸序列具有至少90%的一致性。
變異物還包括磷酸化殘基的變化。例如，變異物可包括在被磷酸化之胜肽內的不同殘基。變異物免疫原性IgE EMPD胜肽也可包括偽磷酸化胜肽。偽磷酸化胜肽是藉由用酸性胺基酸殘基(例如麩胺酸和天門冬胺酸)取代IgE EMPD胜肽之一個或多個磷酸化的絲胺酸、蘇胺酸和酪胺酸殘基所產生。
組成物
本揭露還提供包含揭露的IgE EMPD免疫原構建的組成物。
a. 胜肽組成物
包含揭露的IgE EMPD胜肽免疫原構建的組成物可為液體或固體形式。液體組成物可包括不改變IgE EMPD胜肽免疫原構建之結構或功能特性的水、緩衝液、溶劑、鹽及/或任何其他可接受的試劑。胜肽組成物可含有一種或多種揭露的IgE EMPD胜肽免疫原構建。
b. 醫藥組成物
本揭露還關於包含揭露的IgE EMPD胜肽免疫原構建的醫藥組成物。
醫藥組成物可含有在藥學上可接受遞送系統中的載體及/或其他添加劑。因此，醫藥組成物可含有IgE EMPD胜肽免疫原構建的藥學上有效劑量以及藥學上可接受的載體、佐劑及/或其它賦形劑(例如稀釋劑、添加劑、穩定劑、防腐劑、助溶劑、緩衝劑等)。
醫藥組成物可含有一種或多種佐劑，其作用是加速、延長或增強針對IgE EMPD胜肽免疫原構建的免疫反應，而本身不具有任何特異性抗原作用。醫藥組成物中使用的佐劑可包括油、油乳液、鋁鹽、鈣鹽、免疫刺激複合物、細菌和病毒衍生物、仿病毒顆粒(virosomes)、碳水化合物、細胞因子、聚合物微粒。在某些實施例中，佐劑可選自明礬(磷酸鋁鉀)、磷酸鋁(例如ADJU-PHOS®)、氫氧化鋁(例如ALHYDROGEL®)、磷酸鈣、弗氏不完全佐劑(IFA)、弗氏完 全佐劑、MF59、佐劑65、Lipovant、ISCOM、liposyn、皂苷、角鯊烯、L121、Emulsigen®、單磷酸脂質A(MPL)、Quil A、QS21、MONTANIDE® ISA 35、ISA 50V、ISA S0V2、ISA 51、ISA 206、ISA 720、脂質體、磷脂質、肽聚糖、脂多醣(LPS)、ASO1、ASO2、ASO3、ASO4、AF03、親脂性磷脂質(脂質A)、γ菊糖、藻類菊粉(algammulin)、葡聚糖、右旋糖酐、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、果聚醣、木聚糖、二甲基雙十八烷基溴化銨(DDA)，以及其他佐劑和乳化劑。
在一些實施例中，醫藥組成物含有MontanideTM ISA 51(由植物油和二縮甘露醇油酸酯所組成的油質佐劑組成物，用以製造油包水乳液)、Tween® 80(也稱為聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯)、CpG寡核苷酸及/或其任意組合。在其他實施例中，醫藥組成物是以Emulsigen或Emulsigen D作為佐劑的水包油包水(即w/o/w)乳液。
醫藥組成物還可包括藥學上可接受的添加劑或賦形劑。例如，醫藥組成物可含有抗氧化劑、黏結劑、緩衝劑、增積劑、載劑、螫合劑、著色劑、稀釋劑、崩散劑、乳化劑、填充劑、膠化劑、pH緩衝劑、防腐劑、助溶劑、穩定劑等。
醫藥組成物可配製成立即釋放或緩續釋放劑型。另外，可配製醫藥組成物用於透過免疫原包封和與微粒共同投予以誘導系統性或局部性黏膜免疫。所屬技術領域中具有通常知識者很容易判定此種遞送系統。
醫藥組成物可以以液體溶液或懸浮液形式配製 成注射劑。含有IgE EMPD胜肽免疫原構建的液體載體也可在注射前製備。醫藥組成物可利用任何適合的用法投予，例如i.d.、i.v.、i.p.、i.m.、鼻內、口服、皮下等，並且可在任何適合的遞送裝置中施用。在某些實施例中，可配製醫藥組成物供靜脈內、皮下、皮內或肌肉內投予。也可製備適用於其他給藥方式的醫藥組成物，包括口服和鼻內應用。
醫藥組成物也可以適合的劑量單位形式配製。在一些實施例中，醫藥組成物含有每公斤體重約0.1μg至約1mg的IgE EMPD胜肽免疫原構建。醫藥組成物的有效劑量取決於許多不同的因素，包括投予方式、靶點、患者的生理狀態、患者是人類或動物、投予的其它藥物，以及處理是供預防還是治療。通常，患者是人類，但也可治療包括基因轉殖哺乳類動物的非人類哺乳類動物。當以多劑量遞送時，醫藥組成物可以方便地分成每個劑量單位形式的適當量。投予的劑量取決於治療領域眾所周知的受試者年齡，體重和一般健康狀況。
在一些實施例中，醫藥組成物含有超過一種的IgE EMPD胜肽免疫原構建。含有超過一種IgE EMPD胜肽免疫原構建之混合物的醫藥組成物允許協同性增強構建的免疫效力。含有超過一種IgE EMPD胜肽免疫原構建的醫藥組成物可在更大的遺傳群體中更為有效，這是由於廣泛的第2類MHC覆蓋，因此提供針對IgE EMPD胜肽免疫原構建之經改善的免疫反應。
在一些實施例中，醫藥組成物含有選自SEQ ID NOs：88-95、98-124和130(表3)的IgE EMPD胜肽免疫原構建，以及其同源物、類似物及/或組合。
在某些實施例中，將具有組合形式之衍生自MVF和HBsAg的異源性Th抗原決定位(SEQ ID NOs：68和69)的IgE EMPD胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：107和108)以等莫耳比率混合，用於疫苗劑型，以允許對具有不同遺傳背景之接受疫苗的宿主群體最大覆蓋。在本發明胜肽組成物中觀察到在IgE EMPD G1-C39和A7-C40免疫原構建(SEQ ID NOs：88至95)中的協同性增強，且藉由此種構建(例如SEQ ID NO：95)所引發的抗體反應大部分(>90%)是集中在針對IgE EMPD之B細胞抗原決定位胜肽(SEQ ID NO：2)的所欲求的交叉反應性，沒有太多，如果有的話，則是針對用於免疫原性增強的異源性Th抗原決定位(實施例7，表7)。此與用於胜肽抗原性增強的常規蛋白(例如KLH)或其他生物蛋白載體所製造的抗體形成鮮明對比。
在其他實施例中，包含胜肽組成物的醫藥組成物，例如IgE EMPD胜肽免疫原構建與作為佐劑之礦物鹽(包括明礬凝膠(ALHYDROGEL)或磷酸鋁(ADJUPHOS))接觸的混合物形成懸浮液疫苗劑型，用以投予疫苗宿主。
含有IgE EMPD胜肽免疫原構建的醫藥組成物可用以於投予後在宿主中引發免疫反應並產生抗體。
c. 免疫刺激複合物
本揭露也關於含有與CpG寡核苷酸形成免疫刺 激複合物的IgE EMPD胜肽免疫原構建的醫藥組成物。此種免疫刺激複合物特別適合作為佐劑和胜肽免疫原穩定劑。免疫刺激複合物呈微粒形式，其可有效地將IgE EMPD胜肽免疫原呈現給免疫系統的細胞以產生免疫反應。免疫刺激複合物可配製成用於腸胃外投予的懸浮液。免疫刺激複合物還可配製成w/o乳液形式，作為與礦物鹽或原位凝膠聚合物結合的懸浮液，用於在腸胃外投予後將IgE EMPD胜肽免疫原有效遞送至宿主免疫系統的細胞。
穩定化的免疫刺激複合物可藉由透過靜電結合將IgE EMPD胜肽免疫原構建與陰離子型分子、寡核苷酸、多核苷酸或其組合複合而形成。穩定化的免疫刺激複合物可作為免疫原遞送系統併入醫藥組成物中。
在某些實施例中，將IgE EMPD胜肽免疫原構建設計成包含陽離子部份，其於範圍為5.0至8.0的pH下帶有正電荷。IgE EMPD胜肽免疫原構建或構建的混合物的陽離子部份淨電荷計算是依據，每個離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)帶有+1電荷，每個天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)帶有-1電荷，以及序列中其他胺基酸所帶的電荷為0。將在IgE EMPD胜肽免疫原構建中之陽離子部份的電荷相加，並表示為淨平均電荷。適合的胜肽免疫原具有淨平均正電荷為+1的陽離子部份。優選地，胜肽免疫原具有範圍大於+2之淨正電荷。在一些實施例中，IgE EMPD胜肽免疫原構建的陽離子部份為異源性間隔子。在某些實施例中，當間隔子序列為(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：129)時，IgE EMPD胜肽免 疫原構建的陽離子部份具有+4的電荷。
如本文所述的“陰離子型分子”是指在範圍為5.0至8.0的pH下帶有負電荷的任何分子。在某些實施例中，陰離子型分子是寡聚合物或聚合物。寡聚合物或聚合物上的淨負電荷計算是依據，在寡聚合物中的每個磷酸二酯或硫代磷酸酯基團帶有-1電荷。適合的陰離子型寡核苷酸是具有8至64個核苷酸鹼基的單鏈DNA分子，CpG基序的重複數在1至10的範圍內。優選地，CpG免疫刺激性單鏈DNA分子含有18至48個核苷酸鹼基，CpG基序的重複數在3至8的範圍內。
更優選地，陰離子型寡核苷酸可以分子式5' X1CGX2 3'表示，其中C和G是未甲基化的；且X1是選自由A(腺嘌呤)、G(鳥嘌呤)和T(胸腺嘧啶)組成的群組；且X2是C(胞嘧啶)或T(胸腺嘧啶)。或者，陰離子型寡核苷酸可以分子式5'(X3)2CG(X4)2 3'表示，其中C和G是未甲基化的；且X3是選自由A、T或G組成的群組；且X4是C或T。
所得到的免疫刺激複合物呈顆粒形式，其大小通常在1-50微米的範圍內，且是許多因素(包括相互作用成份的相對電荷化學計量和分子量)的函數。微粒免疫刺激複合物具有提供佐劑化和體內特異性免疫反應之向上調節的優點。此外，穩定化的免疫刺激複合物適用於透過各種方法(包括油包水乳液、礦物鹽懸浮液和聚合凝膠)製備醫藥組成物。
本揭露也關於用以治療和預防IgE介導過敏性疾病的醫藥組成物，包含疫苗劑型。在一些實施例中，醫藥組成物包含穩定化的免疫刺激複合物，其是藉由混合CpG寡聚 合物和包含IgE EMPD胜肽免疫原構建(例如SEQ ID NOs：88-95、98-124和130)之混合物的胜肽組成物以透過靜電結合所形成，以進一步增強IgE EMPD胜肽的免疫原性，並引發針對SEQ ID NOs：1或2之IgE EMPD胜肽的抗體以結合表現mIgE之B細胞，且誘導其抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)和細胞凋亡(實施例6)。
在又一實施例中，醫藥組成物含有IgE EMPD胜肽免疫原構建之混合物(例如SEQ ID NOs：8-90、94、95、98-124和130的任意結合)，其與CpG寡聚合物形成穩定化的免疫刺激複合物，免疫刺激複合物與任選具有高安全係數之作為佐劑的礦物鹽(包括明礬凝膠(ALHYDROGEL)或磷酸鋁(ADJUPHOS))混合，以形成用以投予接受疫苗之宿主的懸浮液疫苗劑型。
抗體
本揭露還提供利用IgE EMPD胜肽免疫原構建所引發的抗體。
本揭露提供IgE EMPD胜肽免疫原構建及其劑型，其於製造中具有成本效益，其最佳設計可引發靶向膜鑲嵌型IgE的高效價抗體，此抗體可於免疫的宿主中利用高反應率破壞針對自體抗原的免疫耐受。利用IgE EMPD胜肽免疫原構建所產生的抗體對IgE-EMPD蛋白，無論是可溶性胜肽、融合蛋白或帶有IgE之B細胞上呈現的IgE，具有高親和力。產生的抗體能夠與表現mIgE之B淋巴球上的IgE BCR結 合並交聯，以誘導細胞溶解效應，例如細胞凋亡和ADCC。膜鑲嵌型IgE之B淋巴球的細胞凋亡耗竭可進一步造成血清IgE產量的降低。因此，以利用揭露的IgE EMPD胜肽免疫原構建及其製劑所產生之誘導細胞凋亡的IgE EMPD特異性抗體靶向人類mIgE B細胞，可提供針對IgE介導過敏性疾病的新穎療法和疫苗。
在一些實施例中，用以引發抗體的IgE EMPD胜肽免疫原構建包含IgE EMPD胜肽的混合物，IgE EMPD胜肽具有涵蓋衍生自IgE EMPD胜肽(SEQ ID NO：1)中央分子內環狀結構之含有界於20至40個胺基酸的B細胞抗原決定位(例如IgE EMPD G1-C39(SEQ ID NO：5)、IgE EMPD A7-H40(SEQ ID NO：6)、IgE EMPD H19-R38(SEQ ID NO：8)和IgE EMPD G1-H40(SEQ ID NO：9)的IgE EMPD胜肽)，IgE EMPD胜肽透過任選的間隔子連接至衍生自病原菌蛋白之異源性Th抗原決定位，例如麻疹病毒融合(MVF)蛋白(SEQ ID NO：73)或其他(SEQ ID NOs：59至87)。IgE EMPD胜肽免疫原構建的B細胞抗原決定位和Th抗原決定位一起作用以刺激高特異性抗體的產生，此高特異性抗體可與IgE EMPD 1-52胜肽(SEQ ID NO：2)、IgE EMPD 1-67蛋白(SEQ ID NO：1)交叉反應，無論是重組含有IgE EMPD的蛋白質(例如由利用編碼人類IgG1之Fc部分和人類膜鑲嵌型IgE之IgE EMPD(γ1-em67)之重組DNA轉染的穩定的Flp-In CHO細胞株所純化而來)或位於帶有膜鑲嵌型IgE之細胞的細胞膜上(例如利用編碼mIgE.FcL之重組DNA轉染的Ramos細胞株)。
用以使胜肽免疫原性增強的傳統方法，例如透過化學偶聯載體蛋白(例如鑰孔血藍蛋白(KLH)或其他載體蛋白(例如白喉類毒素(DT)和破傷風類毒素(TT)蛋白))，通常導致產生大量針對載體蛋白的抗體。因此，此種胜肽-載體蛋白疫苗的主要缺陷在於利用此種免疫原所產生的大部分(>90%)抗體是針對可導致抗原決定位抑制之載體蛋白KLH、DT或TT的非功能性抗體。
有別於用以使胜肽免疫原性增強的傳統方法，利用揭露的IgE EMPD胜肽免疫原構建所產生的抗體可以高特異性結合至IgE EMPD片段，沒有太多，如果有的話，抗體則是針對異源性Th抗原決定位或任選的異源性間隔子。具體而言，在接種疫苗的動物中所引發的多株抗體可以高特異性結合至涵蓋IgE EMPD之環狀結構的中央區域，如第9圖所示。
方法
本揭露也關於用以製備和使用IgE EMPD胜肽免疫原構建、組成物和醫藥組成物的方法。
a. IgE EMPD胜肽免疫原構建的製造方法
本揭露的IgE EMPD胜肽免疫原構建可利用普通技術人員所熟知的化學合成方法加以製備(參見例如Fields et al.,Chapter 3 in Synthetic Peptides：A User’s Guide,ed.Grant,W.H.Freeman & Co.,New York,NY,1992,p.77)。IgE EMPD胜肽免疫原構建可利用自動化美利弗德(Merrifield)固 相合成法來合成，利用側鏈受保護之胺基酸，以t-Boc或F-moc化學保護α-NH2，在例如應用生物系統胜肽合成儀430A或431型(Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A或431)上進行。包含Th抗原決定位之組合資料庫胜肽的IgE EMPD胜肽免疫原構建的製備可透過提供用於在給定可變位置進行偶聯的替代性胺基酸的混合物而達成。
在欲求之IgE EMPD胜肽免疫原構建組裝完成後，依照標準程序處理樹脂，將胜肽從樹脂上切下，並將胺基酸側鏈上的官能基切除。可利用HPLC純化游離的胜肽，並利用例如胺基酸分析或定序以描述生化特性。胜肽的純化和表徵方法是本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知的。
可以控制和確定透過此化學過程所產生之胜肽的品質，且結果是IgE EMPD胜肽免疫原構建的再現性、免疫原性和產量可以獲得保證。透過固相胜肽合成之IgE EMPD胜肽免疫原構建的製造的詳細描述顯示於實施例1中。
已經發現允許保留欲求免疫活性之結構變異範圍，比起允許保留小分子藥物特定藥物活性或與生物來源藥品共同產生的大分子中存在欲求活性及非欲求毒性的結構變異範圍更具包容性。因此，與欲求胜肽具有相似的色層分析和免疫學特性的胜肽類似物，不論是刻意設計或因合成過程錯誤而無法避免地作為刪除序列副產物的混合物產生的，其通常如經純化之欲求的胜肽製劑具有相同的效果。只要建立嚴格的QC程序，以監控製造過程與產品評估過程，確 保使用這些胜肽之終產物的再現性與有效性，則經設計的類似物與非預期的類似物的混合物也是有效的。
也可利用包括核酸分子、載體及/或宿主細胞的重組DNA技術來製備IgE EMPD胜肽免疫原構建。因此，編碼IgE EMPD胜肽免疫原構建及其免疫功能類似物的核酸分子也包括在本揭露中作為本發明的一部分。類似地，包含核酸分子的載體(包括表現載體)以及含有載體的宿主細胞也包括在本揭露中作為本發明的一部分。
各種例示性實施例也包括製造IgE EMPD胜肽免疫原構建及其免疫功能類似物的方法。例如，方法可包括在表現胜肽及/或類似物的條件下培養宿主細胞之步驟，宿主細胞包含含有編碼IgE EMPD胜肽免疫原構建及/或其免疫功能類似物之核酸分子的表現載體。較長的合成胜肽免疫原可利用公知的重組DNA技術來合成。這些技術可於具有詳細實驗計畫之眾所周知的標準手冊中加以提供。為了構建編碼本發明胜肽的基因，將胺基酸序列反向轉譯以獲得編碼胺基酸序列的核酸序列，優選地利用對於其中具有待表現基因的生物體來說最適合的密碼子。接下來，通常透過合成編碼胜肽和任何調節因子(如有必要的話)的寡核苷酸以製造合成基因。將合成基因插入適合的選殖載體內並轉染到宿主細胞中。然後在適合所選表現系統和宿主的合適條件下表現胜肽。利用標準方法純化胜肽並描述其特性。
b. 免疫刺激複合物的製造方法
各種例示性實施例還包括製造包含IgE EMPD胜肽免疫原構建和CpG寡去氧核苷酸(ODN)分子的免疫刺激複合物的方法。穩定化的免疫刺激複合物(ISC)衍生自IgE EMPD胜肽免疫原構建的陽離子部份和聚陰離子CpG ODN分子。自行組合系統是由電荷的靜電中和所驅動。IgE EMPD胜肽免疫原構建之陽離子部分對陰離子寡聚合物的莫耳電價比例的化學計量決定締合的程度。IgE EMPD胜肽免疫原構建和CpG ODN的非共價靜電結合是完全可再現的過程。此胜肽/CpG ODN免疫刺激複合物聚集體有助於呈現至免疫系統中“專業的”抗原呈現細胞(APC)，因此可進一步增強複合物的免疫原性。在製造過程中，可輕易地描繪此些複合物的特徵以控制品質。胜肽/CpG ISC在體內具有良好的耐受性。設計這種包含CpG ODN和IgE EMPD片段衍生之胜肽免疫原構建的新穎微粒系統，以利用與CpG ODN使用相關的廣義B細胞促有絲分裂(mitogenicity)，但促進平衡的Th-1/Th-2型反應。
在揭露的醫藥組成物中的CpG ODN在由相反電荷靜電中和所介導的過程中100%結合至免疫原，導致微米大小之微粒的形成。微粒形式允許來自CpG佐劑常規使用之CpG劑量的顯著減少，不利的先天性免疫反應的可能性更低，且促進包括抗原呈現細胞(APC)在內的替代性免疫原處理途徑。因此，此種劑型在概念上是新穎的，且透過替代的機制藉由促進免疫反應的刺激而提供潛在的優點。
c. 醫藥組成物的製造方法
各種例示性實施例還包括含有IgE EMPD胜肽免疫原構建的醫藥組成物。在某些實施例中，醫藥組成物是利用油包水乳液和具有礦物鹽的懸浮液的劑型。
為了使醫藥組成物可被廣大群體所使用，且避免IgE EMPD聚集也成為投藥目標的一部分，安全性成為另一個需要考慮的重要因素。儘管在臨床試驗中對於許多劑型而言在人類使用油包水乳液，但基於其安全性，明礬仍然是製劑中使用的主要佐劑。因此，明礬或其礦物鹽磷酸鋁(ADJUPHOS)經常作為製劑中的佐劑供臨床應用。
其他佐劑和免疫刺激劑包括3 De-O-acylated monophosphoryl lipid A(MPL)或3-DMP、聚合或單體胺基酸，例如聚麩胺酸或聚離胺酸。此種佐劑可以與或不與其他特定的免疫刺激劑一起使用，免疫刺激劑例如muramyl peptides(例如N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamine(thr-MDP)、N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine(nor-MDP)、N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(1′-2′dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamine(MTP-PE)、N-acetylglucsaminyl-N-acetylmuramyl-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxy propylamide(DTP-DPP)TheramideTM)，或其他細菌細胞壁成份。水包油乳液包含MF59(參見Van Nest等人的 專利申請案WO 90/14837，其透過引用整體併入本文)，包含5%角鯊烯、0.5% Tween 80，以及0.5% Span 85(任選含有不同量的MTP-PE)，利用微射流機配製成次微米顆粒；SAF，包含10%角鯊烯、0.4% Tween 80、5% pluronic-嵌段共聚合物L121，以及thr-MDP，利用微射流化形成次微米乳液或利用漩渦震盪以產生大顆粒乳液；以及RibiTM佐劑系統(RAS)(Ribi ImmunoChem,Hamilton,Mont.)，其包含2%角鯊烯、0.2% Tween 80，以及一種或多種的細菌細胞壁成份，細菌細胞壁成份選自由monophosphoryl lipid A(MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)以及細胞壁骨架(CWS)組成的群組，優選為MPL+CWS(DetoxTM)。其他佐劑包含弗氏完全佐劑(CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)，以及細胞因子(例如介白素(IL-1、IL-2和IL-12)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)，以及腫瘤壞死因子(TNF))。
佐劑的選擇取決於含有佐劑之免疫原製劑的穩定性、給藥途徑、給藥計畫、佐劑對接種疫苗之物種的效力，且在人類是指已經被相關監管機構批准或可批准用於人類給藥的藥學上可接受的佐劑。例如單獨明礬、MPL或弗氏不完全佐劑(Chang et al.,Advanced Drug Delivery Reviews 32：173-186(1998)，其透過引用整體併入本文)或其任選地所有組合適於人類投予。
組成物可包括藥學上可接受的無毒載體或稀釋劑，其被定義為通常用於配製供動物或人類給藥的醫藥組成物的載體。選擇稀釋劑以免影響組成物的生物活性。此種稀 釋劑的範例是蒸餾水、生理磷酸緩衝鹽水、林格氏液、葡萄糖溶液和漢克溶液。此外，醫藥組成物或劑型還可包含其他載體、佐劑或無毒的，非治療性的，非免疫原性的穩定劑等。
醫藥組成物還可包括大的緩慢代謝的大分子(例如蛋白質、多醣類(例如甲殼素)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚合物(例如膠乳功能化瓊脂糖(latex functionalized sepharose)、瓊脂糖(agarose)、纖維素等)、聚合胺基酸、胺基酸共聚物，以及脂質聚集體(例如油滴或脂質體)。另外，這些載體可作為免疫刺激劑(即佐劑)。
本發明的醫藥組成物可進一步包含合適的遞送載體。合適的遞送載體包括，但不限於，病毒、細菌、可生物降解的微球體、微粒、奈米粒子、脂質體、膠原蛋白微球和螺旋體(cochleates)。
d. 醫藥組成物的使用方法
本揭露也包括使用包含IgE EMPD胜肽免疫原構建之醫藥組成物的方法。
在某些實施例中，包含IgE EMPD胜肽免疫原構建之醫藥組成物可用以治療及/或預防免疫球蛋白E(IgE)介導過敏性疾病，包括，但不限於，對藥物、食物和昆蟲過敏、過敏性鼻炎(花粉熱)、異位性皮膚炎、過敏性氣喘、結膜炎、濕疹、風疹塊(蕁麻疹)和急性過敏。
在一些實施例中，方法包含投予包含IgE EMPD胜肽免疫原構建之藥學上有效劑量的醫藥組成物給有其需 要的宿主。在某些實施例中，方法包含投予包含IgE EMPD胜肽免疫原構建之藥學上有效劑量的醫藥組成物給溫血動物(例如人類、食蟹猴、小鼠)，以引發可與IgE EMPD 1-52胜肽(SEQ ID NO：2)、IgE EMPD 1-67蛋白(SEQ ID NO：1)交叉反應之高特異性抗體，無論是重組含有IgE EMPD的蛋白質(例如由利用編碼人類IgG1之Fc部分和人類膜鑲嵌型IgE的IgE EMPD(γ1-em67)之重組DNA轉染的穩定的Flp-In CHO細胞株所純化而來)或位於帶有膜鑲嵌型IgE之細胞的細胞膜上(例如利用編碼mIgE.FcL之重組DNA轉染的Ramos細胞株)。
在某些實施例中，包含IgE EMPD胜肽免疫原構建之醫藥組成物藉由引發針對IgE EMPD的抗體，可用以治療及/或預防IgE介導疾病。此種抗體能夠(a)結合至表現mIgE的B細胞，並誘發抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)和細胞凋亡；(b)導致血液中基礎水平IgE的體內降低；(c)導致血液中抗原特異性IgE水平的體內降低；以及(d)減少或消除於IgE介導過敏性疾病患者中的IgE介導過敏性病理學。
e. 體外功能檢測和體內藥效概念驗證試驗
利用IgE EMPD胜肽免疫原構建產生的抗體可用於體外功能檢測。這些功能檢測包括，但不限於：(a)體外結合至IgE EMPD 1-52胜肽(SEQ ID NO：1)，其作為從表現mIgE.FcL之CHO細胞純化的重組蛋白(實施例3)；(b)體外結合至來自B細胞株之帶有膜鑲嵌型IgE的細胞(Ramos)，其利用編碼IgE.FcL之重組DNA轉染(實施例3)； (c)體外抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)(實施例6)；(d)體外誘導帶有IgE之B淋巴球的細胞凋亡(實施例6)；(e)透過顯示於接受免疫之宿主血液中基礎水平IgE的降低，以於體內驗證藥效(實施例8至10)；(f)透過在初次免疫和加強免疫後利用過敏原進行攻毒顯示抗原特異性IgE水平的降低，以於體內驗證藥效(實施例8至10)；藉由本揭露，IgE EMPD胜肽免疫原構建及其劑型可有效地起到疫苗的作用，以減少或消除於IgE介導過敏性疾病患者中的IgE介導過敏性病理學。
具體實施例
(1)一種以此分子式代表之IgE EMPD胜肽免疫原構建：(Th)m-(A)n-(IgE EMPD片段)-X或(IgE EMPD片段)-(A)n-(Th)m-X或(Th)m-(A)n-(IgE EMPD片段)-(A)n-(Th)m-X
其中Th為異源性T輔助細胞抗原決定位；A為異源性間隔子；(IgE EMPD片段)為來自IgE EMPD的中央分子內環狀 結構具有約20至約40個胺基酸殘基的B細胞抗原決定位；X為胺基酸的α-COOH或α-CONH2；m為1至約4；以及n為0至約10。
(2)依據(1)之IgE EMPD胜肽免疫原構建，其中IgE EMPD片段是選自由SEQ ID NOs：5、6、8和9組成的群組。
(3)依據(1)或(2)任一之IgE EMPD胜肽免疫原構建，其中T輔助細胞抗原決定位是選自由SEQ ID NOs：59-87組成的群組。
(4)依據(1)之IgE EMPD胜肽免疫原構建，其中胜肽免疫原構建是選自由SEQ ID NOs：88-95、98-124和130組成的群組。
(5)一種IgE EMPD胜肽免疫原構建包含：包含來自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之IgE EMPD序列約20至約40個胺基酸殘基的B細胞抗原決定位；包含選自由SEQ ID NOs：59-87組成之群組之胺基酸序列的T輔助細胞抗原決定位；以及選自由胺基酸、Lys-、Gly-,Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys和ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：129)組成之群組的任選的異源性間隔子；其中B細胞抗原決定位是直接地或透過任選的異源性間隔子共價連接至T輔助細胞抗原決定位。
(6)(5)的IgE EMPD胜肽免疫原構建，其中B細胞抗原決定位是選自由SEQ ID NOs：5、6、8和9組成的群組。
(7)(5)的IgE EMPD胜肽免疫原構建，其中T輔助細胞抗原決定位是選自由SEQ ID NOs：59-87組成的群組。
(8)(5)的IgE EMPD胜肽免疫原構建，其中任選的異源性間隔子為(α,ε-N)Lys或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：129)。
(9)(5)的IgE EMPD胜肽免疫原構建，其中T輔助細胞抗原決定位是共價連接至B細胞抗原決定位的氨基端。
(10)(5)的IgE EMPD胜肽免疫原構建，其中T輔助細胞抗原決定位是透過任選的異源性間隔子共價連接至B細胞抗原決定位的氨基端。
(11)一種包含依據(1)至(10)任一之胜肽免疫原構建的組成物。
(12)一種醫藥組成物包含：a. 依據(1)至(10)任一之胜肽免疫原構建；以及b. 藥學上可接受的遞送載體及/或佐劑。
(13)(12)的醫藥組成物，其中a. IgE EMPD胜肽免疫原構建是選自由SEQ ID NOs：88-95、98-124和130組成的群組；以及b. IgE EMPD胜肽免疫原構建與CpG寡去氧核苷酸(ODN)混合以形成穩定化免疫刺激複合物。
(14)一種分離抗體或其抗原決定位結合片段，其可特異性地結合至依據(1)至(10)任一之IgE EMPD胜肽免疫原構建的B細胞抗原決定位。
(15)依據(14)之分離抗體或其抗原決定位結合片段結 合至IgE EMPD胜肽免疫原構建。
(16)一種分離抗體或其抗原決定位結合片段，其可特異性地結合至依據(1)至(10)任一之IgE EMPD胜肽免疫原構建的B細胞抗原決定位。
(17)一種包含依據(14)至(16)任一之分離抗體或其抗原決定位結合片段的組成物。
以下實施例提供了所使用程序的詳細說明。以下實施例是用以說明本發明，而非用以限制本發明的範圍。
實施例1. IGE EMPD相關胜肽的合成及其劑型的製備
a. IgE EMPD相關胜肽的合成
描述了包含在IgE EMPD胜肽免疫原構建發展計畫中用以合成專門設計的IgE EMPD相關胜肽的方法。以小規模量合成的胜肽用於血清學分析、實驗室試驗和田間試驗，大規模(千克)量合成的胜肽則用於醫藥組成物的工業/商業生產。為了篩選和選擇用於有效基於IgE過敏疫苗的最佳胜肽構建，設計了具有長度為約20至70個胺基酸之序列的大量IgE EMPD相關抗原性胜肽。
如表1所示(SEQ ID NOs：1至58)，代表性的全長IgE EMPD 1-67(SEQ ID NO：1)、IgE EMPD 1-52(SEQ ID NO：2)，以及IgE EMPD片段，包括IgE EMPD 1-17(SEQ ID NO：7)、IgE EMPD 19-38(SEQ ID NO：8)，以及各種10-mer胜肽(SEQ ID NOs：10-58)，供各種血清學分析中之抗原決定位鑑定的使用。
如表2所示(SEQ ID NOs：59-87)，透過以合成方法連接至衍生自病原菌蛋白(包括麻疹病毒融合蛋白(MVF)、B型肝炎表面抗原蛋白(HBsAg)、流行性感冒病毒、破傷風梭菌，以及Epstein-Barr病毒(EBV))之經周密設計的T輔助細胞(Th)抗原決定位，將選擇的IgE EMPD B細胞抗原決定位胜肽製成IgE EMPD胜肽免疫原構建。Th抗原決定位是以單一序列(SEQ ID NOs：59-67和72-87)或組合資料庫(SEQ ID NOs：68-71)形式使用，以增強其各自IgE EMPD胜肽免疫原構建的免疫原性。
由超過100種胜肽構建中所選出之具代表性的IgE EMPD胜肽免疫原構建於表3中確認(SEQ ID NOs：88-124和130)。
用於供抗IgE EMPD抗體偵測及/或測量之免疫原性研究或相關血清學測試的所有胜肽是在應用生物系統胜肽合成儀430A、431及/或433型上利用F-moc化學小規模合成。每一個胜肽是透過在固相載體上的獨立合成所製備，在三官能基胺基酸的氨基端與側鏈保護基團具有F-moc保護。將完整的胜肽從固相載體上切下，並用90%三氟乙酸(TFA)移除側鏈保護基團。利用基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF)評估合成的胜肽以確定正確的胺基酸組成。利用反相HPLC(RP-HPLC)評估各個合成胜肽以確認產物的合成樣態與濃度。儘管嚴格控制合成過程(包括逐步地監測偶合效率)，由於在延長循環中某些意外事件，包括胺基酸的插入、刪除、取代及提前終止，仍可能產生胜肽類似物。 因此，合成產物一般包括多種胜肽類似物與目標胜肽。
儘管包括這些非預期的胜肽類似物，但最後的合成胜肽產物仍可用作免疫應用，包括免疫診斷(作為抗體捕捉抗原)與醫藥組成物(作為胜肽免疫原)。一般來說，只要開發一嚴格的QC程序來監測製造過程及產品品質評估程序，以確保使用這些胜肽之最終產物的再現性與有效性，此胜肽類似物，包括刻意設計或合成程序中產生的副產物混合物，通常可如欲求胜肽的純化產物同樣有效。可利用客製的自動胜肽合成儀UBI2003或類似機型以15mmole至50mmole的規模合成數百至數千克的大量胜肽。
對於供臨床試驗之最終醫藥組成物使用的活性成分，可利用預備的RP-HPLC於淺洗湜梯度下純化IgE EMPD相關胜肽構建，利用MALDI-TOF質譜確定胺基酸組成，並以胺基酸分析與RP-HPLC評估純度與一致性。
b. 包含IgE EMPD胜狀免疫原構建之組成物的製備
製備採用油包水乳液和具有礦物鹽之懸浮液的劑型。為了設計醫藥組成物供廣大族群使用，且預防亦成為給藥目標的一部分，則安全性成為另一個需要考慮的重要因素。儘管在人類許多醫藥組成物的臨床試驗中使用油包水乳液，但基於其安全性，明礬仍然是用於醫藥組成物中的主要佐劑。因此，明礬或其礦物鹽ADJUPHOS(磷酸鋁)經常作為佐劑供臨床應用。
簡而言之，在以下描述的每個實驗組中所指定的劑型通常包含所有類型專門設計的IgE EMPD胜肽免疫原構 建。利用代表免疫原B細胞抗原決定位胜肽之相對應IgE EMPD胜肽，針對其相對免疫原性，於天竺鼠中起始評估超過100種專門設計的IgE EMPD胜肽免疫原構建，且也利用塗覆選自SEQ ID NOs：1-126之不同胜肽的孔盤以ELISA試驗對各種同源性胜肽間血清學交叉反應進行評估。
(i)利用經核准供人類使用的油劑Seppic MontanideTM ISA 51配製油包水乳液，或(ii)與礦物鹽ADJUPHOS(磷酸鋁)或ALHYDROGEL(明礬)混合，以配製IgE EMPD胜肽免疫原構建，胜肽構建如指定以不同量配製。通常利用將IgE EMPD胜肽免疫原構建以約20至800μg/mL濃度溶解於水中，並與MontanideTM ISA 51配製成油包水乳液(1：1體積)或者與礦物鹽或ALHYDROGEL(明礬)(1：1體積)配製成組成物。將組成物置於室溫下約30分鐘，並在免疫接種前利用漩渦震盪混合約10至15秒。利用2至3個劑量的特定組成物免疫接種一些動物，其在時間0(初次免疫)和初次免疫後(wpi)3週(加強免疫)，任選5或6wpi進行第二次加強免疫，透過肌內途徑投藥。然後利用選定的B細胞抗原決定位胜肽測試這些接受免疫接種的動物，以評估存在於劑型中的各種IgE EMPD胜肽免疫原構建的免疫原性，以及它們與相關目標胜肽或蛋白質的交叉反應性。之後，針對免疫流程所指定特定期間內的給藥方案，將那些在天竺鼠初始篩選中具有有效免疫原性的IgE EMPD胜肽免疫原構建在靈長類動物中以油包水乳液、礦物鹽和基於明礬的劑型作進一步測試。
在試驗用新藥申請和於IgE介導疾病患者進行臨 床試驗的提交準備中，只有最有希望的IgE EMPD胜肽免疫原構建會在被納入供於GLP指導的臨床前研究中針對免疫原性、持續時間、毒性和功效研究之最終劑型之前會進行進一步廣泛的評估。
實施例2. 血清學試驗和試劑
以下詳細描述用以評估合成胜肽構建及其劑型之功能性免疫原性的血清學試驗和試劑。
a. 用於抗體特異性分析之基於IgE EMPD 1-52、IgE EMPD 1-39、IgE EMPD 1-17、IgE EMPD 19-38、IgE EMPD 7-40胜肽的ELISA試驗
開發並於下文描述於以下實施例所述用以評估免疫血清樣品的ELISA試驗。利用配製於pH 9.5之10mM碳酸氫鈉緩衝液(除非另有說明)中濃度為2μg/mL(除非另有說明)的目標胜肽IgE EMPD 1-52、IgE EMPD 1-39、IgE EMPD 1-17、IgE EMPD 19-38、IgE EMPD 7-40胜肽等(例如SEQ ID NOs：2和5至8)，將其以100μL體積於37℃下作用1小時，以分別地塗覆96孔盤的孔洞。
將以胜肽塗覆的孔洞與250μL配製於PBS中濃度為3重量百分比的明膠於37℃下反應1小時，以阻斷非特異性蛋白質結合位點，接著利用含有0.05體積百分比TWEEN® 20的PBS洗滌孔洞三次並乾燥。利用含有20體積百分比正常山羊血清、1重量百分比明膠和0.05體積百分比TWEEN® 20的PBS以1：20比例(除非另有說明)稀釋待測血清。將100μL稀釋 樣品(例如血清、血漿)加入每個孔洞並於37℃下反應60分鐘。然後利用配製於PBS中濃度為0.05體積百分比的TWEEN® 20洗滌孔洞6次，以移除未結合的抗體。使用辣根過氧化物酶(HRP)共軛物種(例如小鼠、天竺鼠或人類)特異性山羊抗IgG、IgA或IgM作為標記的示蹤劑，以在陽性孔洞中與形成的抗體/胜肽抗原複合物結合。將100微升過氧化物酶標記的山羊抗IgG以預滴定的最佳稀釋倍數配製於內含1體積百分比正常山羊血清與0.05體積百分比TWEEN® 20的PBS中，將其加到每個孔洞中，並在37℃下再反應30分鐘。利用內含0.05體積百分比TWEEN® 20的PBS洗滌孔洞6次以移除未結合的抗體，並與100μL包含0.04重量百分比3’,3’,5’,5’-四甲基聯苯胺(TMB)和0.12體積百分比過氧化氫於檸檬酸鈉緩衝液中的受質混合物再反應15分鐘。藉由形成有色產物利用受質混合物以偵測過氧化物酶標記。藉由加入100μL的1.0M硫酸終止反應並測定450nm處的吸光值(A450)。為了測定接受各種IgE EMPD胜肽疫苗劑型之疫苗接種動物的抗體效價，將從1：100至1：10,000之10倍連續稀釋的血清或從1：100至1：4.19x108之4倍連續稀釋的血清進行測試，且利用A450閥值設為0.5之A450的線性回歸分析計算測試血清的效價，以Log10表示。
b. 利用基於Th胜肽之ELISA試驗評估針對Th胜肽的抗體反應性
以如上所述類似的ELISA方法進行實驗，利用配製於pH 9.5之10mM碳酸氫鈉緩衝液(除非另有說明)中濃度 為2μg/mL(除非另有說明)的Th胜肽，以100μL體積於37℃下作用1小時，以分別地塗覆96孔ELISA盤的孔洞。為了測定接受各種IgE EMPD胜肽疫苗劑型疫苗接種動物的抗體效價，將從1：100至1：10,000之10倍連續稀釋的血清進行測試，且利用A450閥值設為0.5之A450的線性回歸分析計算測試血清的效價，以Log10表示。
c. 利用基於B細胞抗原決定位簇10-mer胜肽之ELISA試驗針對IgE EMPD和IgE CH4(人類IgE CH4到細胞膜)進行精細特異性分析和抗原決定位鑑定評估
利用抗原決定位鑑定測定於接受免疫的宿主中抗IgE EMPD抗體的精細特異性分析。簡而言之，依照上述抗體ELISA方法的步驟，以二重複方式，利用每孔洞每0.1mL含有0.5μg之個別IgE EMPD 10-mer胜肽(SEQ ID NOs：10至58)塗覆96孔盤的孔洞，然後將100μL血清樣品(配製於PBS中，稀釋倍數為1：100)於10-mer盤中進行反應。為了額外的反應性和特異性確認，利用無間隔子或Th序列之相對應IgE EMPD 1-52胜肽(SEQ ID NO：1)或非相關的對照胜肽，對IgE EMPD胜肽免疫原構建的B細胞抗原決定位和來自接受免疫的宿主之免疫血清的抗IgE EMPD抗體相關精細特異性分析進行測試。
d. 免疫原性評估
依照實驗的疫苗接種程序收集來自動物或人類受試者的免疫前和免疫血清樣品，並在56℃下加熱30分鐘以使血清補體因子失活。在投予疫苗劑型後，根據程序獲得血 液樣品並評估其針對特定靶點的免疫原性。測試了連續稀釋的血清，並將稀釋倍數之倒數取對數(Log10)以表示陽性效價。利用其引發針對目標抗原內所欲求B細胞抗原決定位序列之高效價抗體的能力來評估特定疫苗劑型的免疫原性，且同時將針對用以提供加強所欲求B細胞反應之T輔助細胞抗原決定位序列之抗體反應性維持在低至可忽略。
e. 用以評估小鼠血清中人類IgE水平的免疫分析
使用抗人類IgE，HP6061(Abcam)，作為捕獲抗體，而生物素標記的抗人類IgE，HP6029(Abcam)，作為檢測抗體，透過三明治ELISA測定huIGHE基因敲入小鼠中的人類IgE水平。簡而言之，將HP6061以100ng/孔洞的量配製於塗覆緩衝液(15mM碳酸鈉，35mM碳酸氫鈉，pH 9.6)中以固定在96孔盤上，並在4℃下隔夜反應。利用200μL/孔洞的測定稀釋液(含0.5%牛血清白蛋白，0.05% Tween-20，0.02%液體生物防腐劑ProClin 300的PBS)在室溫下反應1小時以封阻塗覆的孔洞。利用200μL/孔洞的洗滌緩衝液(內含0.05% Tween-20的PBS)洗滌微量盤3次。使用純化的U266 IgE在含有5%小鼠血清的測定稀釋液中產生標準曲線(透過2倍連續稀釋，範圍為0至800ng/mL)。將50μL的稀釋血清(1：20)和標準品加入塗覆的孔洞中。在室溫下反應1小時。將所有孔洞吸乾，並利用200μL/孔洞的洗滌緩衝液洗滌6次。將捕獲的人類IgE與100μL的偵測抗體溶液(在測定稀釋液中內含50ng/ml生物素標記的HP6029)在室溫下反應1小時。然後，使用鏈抗生物素蛋白(streptavidin)poly-HRP(1：10,000稀釋， Thermo Pierce)偵測結合的生物素-HP6029 1小時(100μL/孔洞)。將所有孔洞吸乾，並利用200μL/孔洞的洗滌緩衝液洗滌6次。最後，利用100μL/孔洞的NeA-Blue TMB受質(Clinical Scientific Products)使孔洞呈色，且透過加入100μL/孔洞的1M硫酸終止反應。藉由利用SoftMax Pro軟體(Molecular Devices)產生的4-參數羅吉特曲線擬合而產出標準曲線，並用其計算在所有試驗樣品中的IgE濃度。藉由Prism軟體使用司徒頓t檢驗(Student t tests)比較數據。
f. 用以評估小鼠血清中木瓜蛋白酶特異性IgE水平的免疫分析
使用木瓜蛋白酶作為塗覆材料，而生物素標記的抗人類IgE，HP6029(Abcam)作為檢測抗體，利用直接ELISA測定huIGHE基因敲入小鼠中發展的木瓜蛋白酶特異性IgE。簡而言之，將木瓜蛋白酶以500ng/孔洞的量配製於塗覆緩衝液(15mM碳酸鈉，35mM碳酸氫鈉，pH 9.6)中以固定在96孔盤上，並在4℃下隔夜反應。利用200μL/孔洞的測定稀釋液(含0.5%牛血清白蛋白，0.05% Tween-20，0.02%液體生物防腐劑ProClin 300的PBS)在室溫下反應1小時以封阻塗覆的孔洞。利用200μL/孔洞的洗滌緩衝液(內含0.05% Tween-20的PBS)洗滌微量盤3次。使用單株人類嵌合木瓜蛋白酶特異性IgE(AllerMAbs Co.,Ltd.)在具有10%小鼠血清的測定稀釋液中產生標準曲線(透過2倍連續稀釋，範圍為0至30ng/mL)。將50μL的稀釋血清(1：10)和標準品加入塗覆的孔洞中。在室溫下反應1小時。將所有孔洞吸乾，並利用200μL/ 孔洞的洗滌緩衝液洗滌6次。將捕獲的人類IgE與100μL的偵測抗體溶液(在測定稀釋液中內含50ng/ml生物素標記的HP6029)在室溫下反應1小時。然後，使用鏈抗生物素蛋白poly-HRP(1：10,000稀釋，Thermo Pierce)偵測結合的生物素-HP6029 1小時(100μL/孔洞)。將所有孔洞吸乾，並利用200μL/孔洞的洗滌緩衝液洗滌6次。最後，利用100μL/孔洞的NeA-Blue TMB受質(Clinical Scientific Products)使孔洞呈色，且透過加入100μL/孔洞的1M硫酸終止反應。藉由利用SoftMax Pro軟體(Molecular Devices)產生的4-參數羅吉特曲線擬合而產出標準曲線，並用其計算在所有試驗樣品中的木瓜蛋白酶特異性IgE濃度。藉由Prism軟體使用司徒頓t檢驗比較數據。
g. 用以評估食蟹猴血清中IgE水平的免疫分析
使用抗人類IgE，MB10-5C4(Miltenyi Biotec)作為捕獲抗體，而生物素標記的多株抗食蟹猴IgE(Alpha Diagnostic International Inc.)作為檢測抗體，利用三明治ELISA測定在食蟹猴中的食蟹猴IgE水平。簡而言之，將MB10-5C4以100ng/孔洞的量配製於塗覆緩衝液(15mM碳酸鈉，35mM碳酸氫鈉，pH 9.6)中以固定在96孔盤上，並在4℃下隔夜反應。利用200μL/孔洞的測定稀釋液(含0.5%牛血清白蛋白，0.05% Tween-20，0.02%液體生物防腐劑ProClin 300的PBS)在室溫下反應1小時以封阻塗覆的孔洞。利用200μL/孔洞的洗滌緩衝液(內含0.05% Tween-20的PBS)洗滌微量盤3次。使用純化的食蟹猴IgE在具有10%食蟹猴血清的測定稀 釋液中產生標準曲線(透過2倍連續稀釋，範圍為0至10,000ng/mL)。將100μL的稀釋血清(1：10)和標準品加入塗覆的孔洞中。在室溫下反應1小時。將所有孔洞吸乾，並利用200μL/孔洞的洗滌緩衝液洗滌6次。將捕獲的人類IgE與100μL的偵測抗體溶液(在測定稀釋液中內含50ng/ml生物素標記的HP6029)在室溫下反應1小時。然後，使用鏈抗生物素蛋白poly-HRP(1：10,000稀釋，Thermo Pierce)偵測結合的生物素-HP6029 1小時(100μL/孔洞)。將所有孔洞吸乾，並利用200μL/孔洞的洗滌緩衝液洗滌6次。最後，利用100μL/孔洞的NeA-Blue TMB受質(Clinical Scientific Products)使孔洞呈色，且透過加入100μL/孔洞的1M硫酸終止反應。藉由利用SoftMax Pro軟體(Molecular Devices)產生的4-參數羅吉特曲線擬合而產出標準曲線，並用其計算在所有試驗樣品中的IgE濃度。藉由Prism軟體使用司徒頓t檢驗比較數據。
實施例3. 於動物中評估利用IgE EMPD胜肽免疫原構建及其劑型所誘發之抗體的功能特性
針對其結合重組可溶性IgE EMPD蛋白質和以編碼mIgE.FcL(由CH2至CM包含EMPD)或mIgE.FcS(由CH2至CM不包含EMPD)之重組DNA轉染的Ramos細胞株的能力，測試來自接受免疫之宿主的免疫血清或純化的抗IgE EMPD抗體。
a. 細胞
Ramos細胞株購自美國典型培養物保藏中心 (ATCC,Manassas,VA)，並在補充有10%熱滅活FBS(Invitrogen)、4mM L-麩醯胺酸、25mM HEPES和1mM丙酮酸鈉(Invitrogen；完全RPMI培養基)之RPMI 1640培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中生長。利用編碼mIgE.FcL或mIgE.FcS之重組DNA轉染Ramos細胞。利用編碼mIgE ε鏈長的同型異構物片段(從CH2延伸至細胞質胜肽，包含EMPD)的DNA片段轉染表現mIgE.FcL的Ramos細胞。利用編碼mIgE ε鏈短或常見的同型異構物片段(從CH2延伸至細胞質胜肽，不包含EMPD)的DNA片段轉染表現mIgE.FcS的Ramos細胞。將表現mIgE.FcL或mIgE.FcS之Ramos細胞的穩定轉染子維持在補充有400mg/ml吉歐黴素(Zeocin)(Invitrogen)的完全RMPI 1640培養基中。
b. 用於ELISA試驗之重組可溶性IgE EMPD蛋白的製備
利用編碼人類IgG1之Fc部分和人類膜鑲嵌型IgE之IgE EMPD(γ1-em67)的DNA片段轉染表現重組可溶性IgE EMPD蛋白的Flp-In CHO細胞。將穩定的Flp-In CHO轉染子維持在補充有10%熱滅活FBS(Invitrogen)、4mM L-麩醯胺酸、25mM HEPES和1mM丙酮酸鈉(Invitrogen；完全IMDM培養基)之IMDM培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。根據製造商的指示使用蛋白質A Sepharose(GE Healthcare)從培養基純化γ1-em67蛋白質。
c. 從免疫血清純化多株抗體
根據製造商的指示使用蛋白質A Sepharose(GE Healthcare)純化來自各種免疫血清的多株IgGs。
d. 利用多株抗體結合至可溶性IgE EMPD蛋白或位於B細胞上的mIgE.Fc L
針對其結合至(a)重組γ1-em67蛋白(如上所述)(利用ELISA)，或(b)表現mIgE.FcL之Ramos細胞(利用螢光流式細胞儀分析)的相對活性，檢測來自每隻接受免疫之動物的純化多株抗體。96孔微量盤來自Nalge NUNC International，平底(貨號442404)是供光學讀取，而V底(貨號249570)是供細胞培養。在VersaMax微量盤式分析儀(Molecular Devices)上讀取光學密度。利用BD FACSCanto II流式細胞儀(DB Biosciences)檢測螢光染色；並利用聯合的FACSDiva軟體獲取結果數據。將來自ELISA和FACS的結合數據輸入Prism 6軟體進行定量分析。更具體地說，在V底微量盤加入每孔洞0.1mL中具有2 x 105個細胞的溶液，將其離心並移除液體。利用不同濃度之100μL抗體樣品的溶液將細胞在冰上培養1小時。將細胞洗滌一次，以300g離心5分鐘，並利用100μL山羊F(ab)2抗物種特異性IgG Fc-FITC(250ng/mL)在冰上進行染色30分鐘。將細胞洗滌一次並於離心後移除液體。於每個孔洞中加入200μL結合緩衝液，並將其轉移至微量稀釋管進行流式細胞儀分析。在FACS上讀取基於每個樣品10,000個細胞進樣的結合強度(螢光強度的幾何平均值，GeoMFI)。
e. 細胞凋亡測定
將穩定表現mIgE.FcL的Ramos細胞(5 x 105細胞 /mL)於完全RPMI 1640培養基中與純化的免疫或對照抗體在37℃下培養1小時。然後利用最終濃度為10μg/mL的二級抗體，特異性針對天竺鼠IgG之Fc的山羊F(ab’)2(Jackson ImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)處理細胞，並於37℃下培養額外24小時。以以下方式分析細胞的凋亡程度。對於利用膜聯蛋白(annexin)V的分析，透過在室溫下於黑暗中將細胞再懸浮於染色溶液中15分鐘，以測定磷脂絲胺酸(PS)的暴露。染色溶液含有配製於具有10mM HEPES/氫氧化鈉(pH 7.4)、140mM氯化鈉和5mM氯化鈣之緩衝溶液中稀釋為1/200之FITC標記的膜聯蛋白V(Biovision,Mountain View,CA)和2.5μg/ml碘化丙啶(PI)。在FACSCanto II流式細胞儀(BD Biosciences,San Jose,CA)上分析染色的細胞。在點圖分析中獲得凋亡細胞的百分比，其定義為膜聯蛋白V陽性且PI陰性。
f. 抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)分析
透過使用RBC裂解緩衝液(Thermo Fisher Scientific Inc.)重複進行紅血球的低滲透休克反應，從Balb/c小鼠(雌性，6至8週齡)的脾臟分離出脾臟淋巴球。在移除紅血球後，在補充有50μM 2-ME和100U/mL重組人類IL-2(PeproTech,Inc)的完全RPMI培養基中以3 x 106細胞/mL的細胞濃度培養脾臟淋巴球3天。利用CFSE(Invitrogen)於37℃下在PBS/0.1%牛血清白蛋白中標記表現mIgE.FcL的Ramos細胞(標的細胞)10分鐘。在利用冷的完全RPMI 1640培養基洗滌三次之後，將細胞調整至105細胞/mL。在37℃下將在200μl 完全RPMI培養基中含有20,000個標記細胞的溶液與來自相對應免疫血清之純化多株IgG抗體(濃度為10μg/mL)塗覆30分鐘，然後以數值為30的E/T比值將其與IL-2活化的脾臟淋巴球(效應細胞)結合。在24小時培養之後，在冰上利用濃度為2.5μg/mL之7-氨基放線菌素D(7-AAD,Invitrogen)對總細胞染色15分鐘，然後在Becton Dickinson FACS Canto II流式細胞儀(BD Biosciences)上進行分析。在點圖分析中將活的標的細胞定義為CFSE陽性且7-AAD陰性。在給定的E/T比值下之裂解的標的細胞的百分比為：100 x[(在抗體非依賴性對照中活標的細胞的百分比-在樣品中活標的細胞的百分比)/在抗體非依賴性對照中活標的細胞的百分比]。
實施例4. 用於安全性、免疫原性、毒性和功效研究的動物
a. 天竺鼠：
在成熟，未與抗原接觸或未受抗原刺激的(naive)，成年雄性和雌性Duncan-Hartley天竺鼠(300-350g/BW)中進行免疫原性研究。實驗中每一組使用至少3隻天竺鼠。在簽訂合約的動物設施以及作為試驗委託者的聯合生物醫學公司(UBI)，依照經核准的IACUC申請，進行涉及Duncan-Hartley天竺鼠(8-12週齡；Covance Research Laboratories,Denver,PA,USA)的試驗計畫。
b. 食蟹猴：
在簽訂合約的動物設施以及作為試驗委託者的 UBI，依照經核准的IACUC申請，在成年雄性和雌性猴子(食蟹猴，約為4歲；Joinn Laboratories,Suzhou,China)進行免疫原性和重複劑量毒性研究。
c. hIGHE基因敲入小鼠：
利用靶向C57BL/B6遺傳背景的同源基因，以人類IGHE基因取代其IGHG1基因，使小鼠品系表現人類分泌型和膜鑲嵌型IgE(Lu,el al.,2015)。hIGHE小鼠在鼠源IGHG1轉錄元件的調控下表現人類IgE，並透過人類調控元件的選擇性RNA剪接表現人類膜鑲嵌型IgE。血清IgE早在8至10週齡時就於循環中被檢測到。將混合hIGHE x Balb/c遺傳背景的年輕後代(10~12週齡)用於初級/記憶免疫反應(primary/memory immune response)的預防模型，以及致敏化作用/回憶免疫反應(sensitization/recall immune response)的治療模型中。這兩項研究都是在簽訂合約的動物設施(National Health Research Institute,Taiwan)以及作為試驗委託者的UBI依照經核准的IACUC申請而進行。
利用血清人類IgE之ELISA分析，針對抗體反應，以及血清總IgE和抗原攻毒後抗原特異性IgE水平降低的證據，觀察在16週期間內肌肉內疫苗接種的效果。
在免疫之前，根據本實施例上述方法針對血清人類IgE的存在測試來自個別動物的血清樣品。取決於物種和試驗計畫，利用疫苗劑型之每劑量的IgE EMPD胜肽免疫原構建免疫每隻動物。
實施例5. 供最終產品選用用於在天竺鼠、轉殖基因敲入小鼠和食蟹猴進行IgE EMPD胜肽構建之免疫原性評估的疫苗劑型
以下更詳細地描述在每個實驗中使用的醫藥組成物和疫苗劑型。簡而言之，在每個試驗組中指定的劑型通常包含專門設計的IgE EMPD胜肽免疫原構建的所有類型，其具有經由不同種類的間隔子(例如εK或KKK以增強胜肽構建的溶解度)連接的IgE EMPD胜肽片段和混雜T輔助細胞抗原決定位的變異物(包含兩組衍生自麻疹病毒融合蛋白和B型肝炎表面抗原的人工T輔助細胞抗原決定位)，IgE EMPD胜肽片段連接於專門設計的胜肽構建的氨基端。針對其與IgE EMPD 1-52的相對免疫原性，以及進一步針對其與位於帶有IgE之B細胞(Ramos細胞株)上的細胞膜IgE的交叉反應性，最初在天竺鼠中評估了超過100種專門設計的IgE EMPD胜肽構建。如指定，在不同量胜肽構建的狀況下，使用Seppic MontanideTM ISA 51作為供人類疫苗使用之經批准的油類將IgE EMPD胜肽構建配製於油包水乳液中，或將IgE EMPD胜肽構建與礦物鹽ADJUPHOS或ALHYDROGEL(明礬)混合。疫苗製備通常透過將IgE EMPD胜肽構建以約20至800μg/mL之濃度溶解於水中，利用MontanideTM ISA 51配製成油包水乳液(1：1體積)，或利用礦物鹽ADJUPHOS或ALHYDROGEL(明礬)(1：1體積)進行配製。將疫苗劑型保持在室溫下約30分鐘，並在免疫之前利用漩渦震盪混合約10至15秒。
利用2至3個劑量的特定疫苗劑型免疫動物，其在 時間0(初次免疫)和初次免疫後(wpi)3週(加強免疫)，任選5或6wpi進行第二次加強免疫，透過肌內途徑投藥。然後測試這些接受免疫接種的動物，以評估存在於疫苗劑型中的各種合成IgE EMPD胜肽免疫原的免疫原性，以及其與IgE EMPD 1-52的交叉反應性。之後，針對免疫流程所指定特定期間內的給藥方案，將在天竺鼠初始篩選中具有有效免疫原性的IgE EMPD胜肽免疫原在食蟹猴中以油包水乳液、礦物鹽和基於明礬的劑型作進一步測試。
在試驗用新藥申請和於IgE介導過敏性疾病患者進行臨床試驗的提交準備中，在被納入供GLP指導的免疫原性、持續時間、毒性和功效驗證研究之最終疫苗製劑之前，針對其於具有自體IgE EMPD抗原之相同物種中破壞免疫耐受的能力，只有最有希望的IgE EMPD胜肽免疫原候選物會進一步透過介導ADCC之免疫血清能力、帶有mIgE的B細胞的細胞凋亡，以及在轉殖基因敲入小鼠和食蟹猴中被廣泛評估。
實施例6. 用於IgE介導過敏性疾病治療之納入IgE EMPD 1-39胜肽免疫原構建的多成分疫苗劑型的設計原理、篩選、識別、功能特性評估和優化
第2A和2B圖說明透過靶向IgE EMPD耗竭mIgE B細胞的基本原理。IgE以兩種形式表現：分泌型IgE和膜鑲嵌型IgE(mIgE)(分別為第2A圖左側和右側)。分泌型IgE透過FcεRI被捕獲在嗜鹼性粒細胞和肥大細胞的細胞表面上，而mIgE作為B細胞受體(BCR)的一部分僅存在於IgE定向B細 胞上。mIgE之細胞外膜近側功能區塊(EMPD)是僅在mIgE B細胞上發現的位於CH4功能區塊和跨膜區域之間的67個胺基酸胜肽片段(SEQ ID NO：1)。IgE EMPD的獨特性為靶向帶有mIgE的B細胞提供了有吸引力的位點。透過靶向IgE EMPD耗竭mIgE B細胞允許在其分化成新的分泌IgE的漿細胞之前抑制過敏原特異性IgE產生(第2B圖)。壽命有限的現有分泌IgE的漿細胞會逐漸相繼死去，導致總IgE和過敏原特異性IgE逐漸下降。
第3圖為識別了根據本文揭露之特定實施例的疫苗劑型從發現到商業化(工業化)的發展過程流程圖。如以此方式所總結，本揭露包括胜肽免疫原設計、胜肽組成物設計、疫苗劑型設計、體外功能上的抗原性設計、體內免疫原性和功效研究設計，以及臨床試驗計畫書設計。針對每個步驟的詳細評估令人驚訝地導向一系列實驗，其導致安全有效之疫苗劑型的最終商業化。
以下描述這些步驟的概括性摘要：
a. 設計歷史
每種胜肽免疫原構建或免疫治療產品都需要基於其特定疾病機制和對於干預所需目標蛋白的其自身設計重點和方法。模型設計的目標是之後可以包括涉及疾病途徑的細胞蛋白質或其中可能涉及來自病原體之多種蛋白質的感染劑。從研究到商業化的過程非常長，通常需要一個或更多個十年的時間才能完成。
一旦選擇目標分子，就需要廣泛的血清學驗證過 程。依照干預辨識位在目標分子內的B細胞和T細胞抗原決定位和功能位點對免疫原構建設計來說是重要的。一旦識別到目標B細胞抗原決定位，就進行納入各種T輔助支持物(載體蛋白或合適的T輔助胜肽)於小動物的連續先導免疫原性研究，以評估利用專門設計胜肽的醫藥組成物所引發之抗體的功能特性。然後在目標物種的動物中進行這種血清學應用，以進一步驗證免疫原性和所引發之抗體的功能特性。利用從接受免疫的宿主收集的血清進行評估，所有研究均在多個平行組別中進行。對於人類醫藥組成物而言，也進行在目標物種或非人類靈長類動物的早期免疫原性研究，以進一步驗證設計的免疫原性和方向。然後，當組合使用以製備個別的劑型設計時，將目標胜肽配製於不同的混合物中，以評估於與胜肽構建之間各自交互作用有關的功能特性的細微差異。在額外評估之後，以此建立最終胜肽構建、胜肽組成物及其劑型，以及劑型的各自物理參數，導向最終產品開發過程。
b. 作為具有潛力治療IgE介導過敏性疾病患者之醫藥組成物之IgE EMPD衍生的胜肽免疫原構建的設計和驗證
為了產生用於納入醫藥組成物中最有效的胜肽構建，將很多IgE EMPD B細胞抗原決定位胜肽(SEQ ID NOs：5-8)(表1)和衍生自各種病原菌之混雜T輔助細胞抗原決定位或進一步設計的人工T輔助細胞抗原決定位(SEQ ID NOs：59-87)(表2)製成用於天竺鼠免疫原性研究的IgE EMPD胜肽免疫原構建。
i)選擇IgE EMPD G1-H40作為免疫原設計的目標區域
IgE以兩種形式表現：分泌型IgE和膜鑲嵌型IgE(mIgE)。分泌型IgE透過FcεRI被捕獲在嗜鹼性粒細胞和肥大細胞的細胞表面上，而mIgE作為B細胞受體(BCR)的一部分僅存在於IgE定向B細胞上。mIgE之全長細胞外膜近側功能區塊(EMPD)是僅在mIgE B細胞上發現的位於CH4功能區塊和跨膜區域之間的67個胺基酸胜肽片段(SEQ ID NO：1)。壽命有限的現有分泌IgE的漿細胞會逐漸相繼死去，導致總IgE和過敏原特異性IgE逐漸下降。在天竺鼠中針對免疫原性測試許多胜肽免疫原構建，數據來自一系列IgE EMPD衍生的胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：88-93)，其是合併衍生自IgE EMPD 1-52(SEQ ID NO：2)之具代表性的IgE EMPD B細胞抗原決定位胜肽和具代表性Th抗原決定位胜肽UBITh®1(SEQ ID NO：72)而製成，提供利用IgE EMPD 1-39(SEQ ID NO：5)胜肽塗覆微量盤於天竺鼠測試免疫原性之使用，如表4所示。發現利用具有三種位向的六種IgE EMPD胜肽免疫原構建為具有高免疫原性的，其中利用εK的間隔子連接子將UBITh®1 Th抗原決定位胜肽連接至IgE EMPD B細胞抗原決定位胜肽，其連接至IgE EMPD B細胞抗原決定位胜肽的羧基端(SEQ ID NOs：88和91)或氨基端(SEQ ID NOs：89、90和92)或羧基端和氨基端二者(SEQ ID NO：93)。包含較長連接子εK-KKK(SEQ ID NO：129)的IgE EMPD胜肽免疫原構建也用以在構建設計中實現高免疫原性(例如SEQ ID NOs：94-97)。
IgE EMPD B細胞抗原決定位胜肽的較短片段(SEQ ID NOs：7和8)也可利用T輔助細胞抗原決定位胜肽(例 如UBITh®1)增強免疫原性(分別為SEQ ID NOs：96和97)。然而，如表5所示，這些構建引發針對IgE EMPD具有弱結合能力的抗體(例如對於具有SEQ ID NOs：5、6、7和8的較長片段)。SEQ ID NOs：96和97的構建也可引發如線性抗原決定位鑑定研究所示具有非常受限結合圖譜的抗體，其中分別發現具有SEQ ID NO：25(胺基酸8-17)和SEQ ID NO：39(胺基酸22-31)的僅10mer胜肽具有反應性。此外，發現SEQ ID NOs：96和97的構建所引發的抗體具有最小的mIgE-B細胞結合效應(如第6C圖所示)，此為誘導mIgE-B細胞凋亡的必要條件。
ii)設計用以增強所選IgE EMPD B細胞抗原決定位胜肽免疫原性之衍生自病原菌之異源性T輔助細胞抗原決定位以及位在IgE EMPD胜肽免疫原構建中之其內含物的排序
表2列出了總共29種異源性Th抗原決定位(SEQ ID NOs：59-87)，已經在小鼠、大鼠、天竺鼠、狒狒、食蟹猴等的多個物種中測試其用以增強B細胞抗原決定位免疫原性的相對效力。
在天竺鼠中針對免疫原性研究進行IgE EMPD胜肽免疫原構建的代表性試驗，IgE EMPD胜肽免疫原構建含有IgE EMPD 1-39 B細胞抗原決定位胜肽(SEQ ID NO：5)，其透過εK間隔子與個別混雜T輔助細胞抗原決定位(SEQ ID NOs：88、98-124和130)相連接，用以排序各自異源性T輔助細胞抗原決定位的相對效力，如表6所示。由於某些Th抗原決定位具有高B細胞抗原決定位增強能力，將在天竺鼠僅一次免疫接種後在初次免疫後3週(3wpi)所獲得的結果用於對29種不 同IgE EMPD胜肽免疫原構建進行排序。儘管所有選擇的Th抗原決定位都具有增強IgE EMPD B細胞抗原決定位胜肽之免疫原性的能力，但發現最有效的構建是SEQ ID NO：88的構建，而效力最低的是SEQ ID NO：101的構建。
對包括靈長類動物在內之於不同物種中的每種和所有IgE EMPD胜肽免疫原構建之免疫原性的仔細校驗將確保最終的Th胜肽選擇，並成功開發最終的疫苗劑型。
iii)IgE EMPD G1-C39胜肽免疫原構建之免疫原性評估(針對其與相對應全長和IgE EMPD G1-C39胜肽的抗體反應性)
第4圖說明在利用不同IgE EMPD胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：88至94、96和97)免疫的天竺鼠中在8週期間的抗體反應動力學。利用10倍連續稀釋將血清從1：100稀釋至1：10,000,000。利用每孔洞0.5μg胜肽的IgE EMPD 1-39胜肽(SEQ ID NO：5)塗覆ELISA盤。利用A450閥值設為0.5之A450的線性回歸分析計算測試血清的效價，以Log10表示。
第5圖說明利用不同IgE EMPD免疫原構建(SEQ ID NOs：88至94、96和97)所產生多種純化的多株抗IgE EMPD抗體的滴定曲線。利用包含SEQ ID NO：1序列之重組含有IgE EMPD的蛋白質，γ1-em67，塗覆ELISA盤。將透過蛋白質A層析從天竺鼠血清純化的多株抗IgE EMPD抗體利用4倍連續稀釋從100μg/mL稀釋至0.0238ng/mL。利用4-參數羅吉特曲線擬合的非線性回歸計算每種多株抗IgE EMPD抗體製劑的EC50。
如第4和5圖所示，來自SEQ ID NOs：88至94的胜肽免疫原構建是選自於許多其他設計，顯示具有Log10效價大部分高於4的高免疫原性。使用來自每一組別純化抗體之更精確的EC50測量如第5圖所示，相較於含有IgE EMPD較短B細胞抗原決定位胜肽(長度<20個殘基)的胜肽免疫原構建，例如IgE EMPD 1-17或IgE EMPD 19-38(SEQ ID NOs：96和97)，利用0.02111至0.08892μg/mL之包含IgE EMPD 1-39和IgE EMPD 7-40的較長B細胞抗原決定位胜肽的IgE EMPD胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：88-94)，顯示相當高的免疫原性。
如在IgE EMPD B細胞抗原決定位胜肽設計的情況下，含有位在B細胞和Th抗原決定位之間較長間隔子的IgE EMPD胜肽免疫原構建也顯著地降低免疫原性(SEQ ID NOs：94 vs 89對於各自的EC50s為0.08892 vs 0.02368)。在長度超過20個殘基的B細胞抗原決定位胜肽中，發現IgE EMPD 1-39在設計中是最佳的，因此其於以下實施例中將最常被作為在代表性胜肽免疫原設計中的B細胞抗原決定位胜肽，供利用各種體外功能試驗和體內效力評估之進一步評估的使用。
iv)IgE EMPD胜肽免疫原構建之免疫原性評估(針對其抗體結合至定向B細胞分化為IgE分泌之帶有IgE的B細胞)
第6A至6C圖說明利用來自以IgE EMPD免疫原構建(SEQ ID NOs：88至97)免疫動物之每一組別匯集的天竺鼠血清的純化多株抗體對表現mIgE.FcL或mIgE.FcS之衍生自Ramos細胞株的B細胞的結合(參見實施例2的細胞螢光染色方法)。利用蛋白質A層析從天竺鼠血清純化之多株抗IgE EMPD抗體使用濃度為10μg/mL。
利用來自細胞結合試驗高特異性之來自所有組別的純化抗體發現，抗體與來自缺失目標序列之EMPD片段的mIgE.FcS Ramos細胞株的細胞的低背景結合。如第6A至6C圖所示，利用SEQ ID NOs：88至94、96和97的IgE EMPD胜肽免疫原構建免疫的動物產生的抗體對mIgE.FcL Ramos細胞株細胞具有不同的結合親和性。具體而言，相較於由包含具有少於20個殘基之B細胞抗原決定位胜肽的IgE EMPD胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：96-97)產生的抗體，由包含長B細胞抗原決定位胜肽IgE EMPD 1-39的IgE EMPD胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：88-94)產生的抗體顯示mIgE.FcL Ramos細胞株細胞的較高mIgE結合。此外，相較於具有較長間隔子(εK-KKK；SEQ ID NO：129)之構建，由具有較短間隔子(εK)之IgE EMPD胜肽免疫原構建產生的抗體具有mIgE.FcL Ramos細胞株細胞的較高mIgE結合，此可以由第6A圖中SEQ ID NO：89的結果和第6C圖中SEQ ID NO：94的結果比較來看出。
發現在組別多株抗體EC50數值與帶有IgE細胞之陽性結合百分比(%)之間呈負相關。帶有IgE之B細胞結合的百分比是用於評估IgE EMPD胜肽免疫原構建之免疫原性的抗體交叉反應和功能效力的重要功能參數。
v)IgE EMPD胜肽免疫原構建之免疫原性評估(針對其產生具有高效力以引發定向B細胞分化為IgE分泌之帶有IgE的B細胞的細胞凋亡的抗體的能力)
第7圖顯示利用由IgE EMPD免疫原構建(SEQ ID NOs：88至93)產生之多株抗IgE EMPD抗體的多種製劑在表現mIgE.FcL Ramos細胞的細胞表面上以劑量依賴性模式引發細胞凋亡。將透過蛋白質A層析從天竺鼠血清純化的多株抗IgE EMPD抗體利用2倍連續稀釋從1000稀釋至62.5ng/mL。使用人源化抗IgE單株抗體Xolair®作為陽性對照。利用4-參數羅吉特曲線擬合的非線性回歸計算每組多株抗IgE EMPD抗體的EC50。
如第7圖所示，儘管Xolair®(靶向IgE分子之Fc受體結合CH3功能區塊的抗IgE單株抗體)顯示具有表示最高功效的最低EC50數值(121.4ng/mL)，但其存在於血清中因為會被血清IgE所中和而會中和掉所有此種誘導細胞凋亡的能力。在測試的所選IgE EMPD胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：88-93)中，觀察到從277.5至536ng/mL的EC50數值表明由於它們與獨特EMPD目標區域序列結合而無血清IgE干擾之高誘導細胞凋亡的能力。這些帶有IgE的B細胞為定向B細胞分化成IgE分泌的細胞。
利用以IgE EMPD胜肽免疫原構建(例如SEQ ID NOs：88-93)免疫宿主來誘導這些細胞的細胞凋亡將引發IgE合成的抑制，導致IgE的血清減少，而IgE是過敏性疾病的主要原因。
vi)IgE EMPD胜肽免疫原構建之免疫原性評估(針對其產生具有高效力以引發定向B細胞分化為IgE分泌之帶有IgE的B細胞的抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的抗體的 能力)
第8圖顯示利用不同IgE EMPD免疫原構建(SEQ ID NO：88至93)所產生之多株抗IgE EMPD抗體的各種製劑可以數值為30之效應細胞/標的細胞比值針對表現mIgE.FcL Ramos細胞引發ADCC。以10μg/mL之濃度使用透過蛋白質A層析從天竺鼠血清純化的多株抗IgE EMPD抗體。將IL-2刺激的小鼠脾臟細胞作為效應細胞。以小鼠抗IgE單株抗體5D5分泌作為陽性對照。
如第8圖所示，具有超過20個胺基酸殘基之長B細胞抗原決定位胜肽的所有胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：88-93)引發定向B細胞分化為IgE分泌之帶有IgE的B細胞的ADCC，表示以此種胜肽免疫原構建免疫宿主後可降低和抑制IgE血清水平。
vii)透過使用具有不同混雜T輔助細胞抗原決定位的IgE EMPD衍生胜肽免疫原構建以擴大MHC覆蓋
在設計用以治療不同遺傳背景患者的醫藥組成物時，重要的是允許設計覆蓋具有不同遺傳背景的最大人群。因為衍生自MVF或HBsAg的混雜T輔助細胞抗原決定位代表提供此種免疫原性增強之最有效力的T輔助細胞抗原決定位之一，因此可設計含有這兩種T輔助細胞抗原決定位的胜肽構建的組合以允許協同免疫原性效應。與由相應的單獨胜肽構建所引發的免疫反應相比，預期具有相同B細胞抗原決定位的兩種胜肽免疫原構建的混合物可引發可觀的免疫反應。
viii)利用由各種IgE EMPD胜肽免疫原構建所引發免疫血清(9wpi)針對精細特異性分析進行抗原決定位鑑定
包含IgE EMPD胜肽免疫原構建的IgE-EMPD疫苗設計是針對作為功能和結構目標之位於IgE-EMPD中間區域的C18-C39特殊環狀結構。這種基於結構的設計目的在於保留天然的細胞外環狀結構作為免疫原性標靶。
使用1-17(SEQ ID NO：7)、19-38(SEQ ID NO：8)、1-39(SEQ ID NO：5)和7-40(SEQ ID NO：6)四種代表性IgE-EMPD胜肽片段以設計B細胞抗原決定位胜肽，其在B細胞抗原決定位胜肽的氨基端或羧基端與UBITh®1(SEQ ID NO：72)或UBITh®2(SEQ ID NO：73)連接，以形成原型胜肽免疫原。在B細胞和Th抗原決定位之間使用εK連接子或εK-KKK(SEQ ID NO：129)間隔子以形成表3所示的胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：88至97)。透過環化將具有胺基酸(aa)1-39和7-40的所有胜肽片段設計為具有C18-C39受拘束的環狀結構。
針對由利用其相對應胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：96、97、88、89、93)免疫之天竺鼠所提供高度免疫血清的抗體反應性，使用1-17(SEQ ID NO：7)、19-38(SEQ ID NO：8)、1-39(SEQ ID NO：5)和7-40(SEQ ID NO：6)之個別IgE-EMPD B細胞抗原決定位胜肽以塗覆微量盤的ELISA試驗進行評估。結果顯示構建SEQ ID NOs：88、89和93引發針對所有四種IGE EMPD B細胞抗原決定位胜肽的高效價抗體，而由IgE-EMPD 1-17(SEQ ID NO：96)和IgE-EMPD 19-38 (SEQ ID NO：97)胜肽免疫原構建所引發的天竺鼠抗血清只具有與其相對應B細胞抗原決定位胜肽(例如SEQ ID NOs：7或8)的抗體反應性，其對來自非相對應鄰近抗原決定位之IgE EMPD B細胞抗原決定位胜肽(SEQ ID NOs：8或7)沒有交叉反應性，表示免疫原性的高專一性，即設計的免疫原構建能夠引起特異性抗體以與IgE-EMPD相對應B細胞抗原決定位功能區塊反應(表5)。
在用以定位對目標區域內特定殘基之抗體結合位點的精細抗原決定位鑑定試驗中，合成了50個重疊的10-mer胜肽(SEQ ID NOs：10至58)，其涵蓋來自IgE CH4羧基端前8個胺基酸和IgE-EMPD的1至50個胺基酸序列區域。將這些10-mer胜肽作為固相免疫吸附物分別塗覆至96孔微量盤上。將以1：100稀釋比例配製於樣品稀釋緩衝液中的匯集的天竺鼠抗血清加到利用2.0μg/mL的10-mer胜肽塗覆的微量盤孔洞中，隨後在37℃下培養1小時。在利用洗滌緩衝液洗滌微量盤孔洞後，加入辣根過氧化物酶(HRP)共軛重組蛋白A/G並培養30分鐘。利用PBS再次洗滌後，將受質加入孔洞中，利用ELISA微量盤式分析儀測量450nm處的吸光值，以二重複方式分析樣品。IgE-EMPD胜肽免疫原所引發免疫血清與相對應IgE EMPD B細胞抗原決定位胜肽塗覆孔洞的結合代表最大的抗體結合信號。
精細抗原決定位鑑定結果顯示來自IgE-EMPD 19-38衍生的胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：97，具有非環化的線性B細胞抗原決定位，H19-R38)之匯集的天竺鼠血清可辨 識位於IgE-EMPD中間區域的IgE EMPD 22-31胜肽(SEQ ID NO：39)。它也與IgE EMPD胜肽19-38(SEQ ID NO：8)、1-39(SEQ ID NO：5)和7-40(SEQ ID NO：6)反應，而不是1-17(SEQ ID NO：7)。
利用IgE EMPD 1-17(SEQ ID NO：96，非環化的線性B細胞抗原決定位，G1-L17)引發的抗血清可辨識位於IgE-EMPD氨基端區域的IgE EMPD 8-17(SEQ ID NO：25)，以及IgE EMPD 1-17(SEQ ID NO：7)、1-39(SEQ ID NO：5)和7-40(SEQ ID NO：6)，而不是19-38(SEQ ID NO：8)胜肽。利用IgE EMPD1-17(SEQ ID NO：96)和IgE EMPD 19-38(SEQ ID NO：97)免疫原構建引發的抗血清不具有交叉反應性。
有趣的是，利用UBITh®1抗原決定位連接至IgE EMPD B細胞抗原決定位胜肽的氨基端(SEQ ID NO：89)或羧基端(SEQ ID NO：88)之兩個對應IgE-EMPD 1-39免疫原構建產生可辨識明顯不同抗原決定位結合模式的免疫血清。由免疫原構建(SEQ ID NO：89，UBTh1位於胜肽的氨基端)所誘發的免疫血清只與IgE-EMPD之羧基端區域附近位於aa 30-39的一個10-mer胜肽(SEQ ID NO：47)強烈反應。它也與位在氨基端區域之IgE EMPD 9-18(SEQ ID NO：26)有微弱反應。
然而，對於其他IgE-EMPD 1-39免疫原構建(SEQ ID NO：88，UBTh1位於羧基端)，誘導的抗血清與以IgE EMPD 9-19(SEQ ID NO：27和28)、IgE EMPD 19-31(SEQ ID NO：37、38、39和40)和IgE EMPD 30-43(SEQ ID NO：48、49、50、51和52)作為代表的三個不連續線性抗原決定位強烈反 應。胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：88)顯示出比IgE EMPD胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：89)更強的免疫原性且與更寬廣的表面反應。比起IgE EMPD胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：89)，發現與胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：88)相關之強大的多的免疫原性也顯示出在IgE表現淋巴球更強的ADCC和細胞凋亡活性。
就IgE-EMPD 7-40免疫原構建(SEQ ID NO：93，具有位於IgE EMPD B細胞抗原決定位胜肽之氨基端和羧基端的兩個UBTh1)而言，其誘發的抗血清可辨識兩個主要抗原性區域，此些區域與由IgE-EMPD 1-39所辨識者相似，因為它可與由胜肽SEQ ID NOs：35-41、IgE EMPD 29-43(SEQ ID NOs：45-51)所涵蓋之位在IgE EMPD 18-33區域內的胜肽強烈反應。IgE-EMPD 7-40免疫原構建(SEQ ID NO：93)與IgE-EMPD 1-39免疫原構建(SEQ ID NO：88，UBTh1位於IgE EMPD B細胞抗原決定位胜肽的羧基端)共享相似的抗原決定位區域。IgE-EMPD 1-39(SEQ ID NO：88)在所有設計的胜肽免疫原構建中顯示出最佳功效，如透過與於其精細抗原決定位鑑定中所示結果相關之多個功能試驗所顯示的，因為此免疫原構建引發可識別位在IgE-EMPD之細胞外膜蛋白質上由三種或更多種B細胞抗原決定位胜肽所涵蓋的寬廣表面的高結合性多株抗體。IgE EMPD 30-43(SEQ ID NOs：47-51)抗原決定位區域代表非常重要的B細胞抗原決定位區域，其位於環狀結構的羧基端區域，鄰近帶有IgE的B細胞的基底膜，對抗體介導的細胞凋亡和ADCC敏感。此外，環化的環狀結構 比起其非環狀對應物可呈現更優質的免疫原構建(表5，SEQ ID NO：88 vs SEQ ID NO：88非環化)。
綜上所述，設計的合成IgE-EMPD胜肽免疫原構建(IgE EMPD 1-39,SEQ ID NO：88)和(IgE EMPD 7-40,SEQ ID NO：93)均具有以IgE EMPD內環狀結構作為代表的B細胞抗原決定位胜肽，其連接可引發旺盛免疫反應的UBITh®1抗原決定位胜肽，所產生的多株抗體針對位於IgE-EMPD蛋白質上新的抗原決定位區域(aa 29-43)，其因為位置位於中央環狀結構之羧基端區域而接近細胞膜，允許盡可能交聯多個細胞膜IgE以誘導ADCC和細胞凋亡，以耗竭表現IgE的B淋巴球(表5)。
實施例7. 被認為是僅針對IgE EMPD胜肽免疫原構建之B細胞抗原決定位的集中抗體反應
眾所周知，用以加強針對標靶B細胞抗原決定位胜肽之免疫反應的所有載體蛋白(例如鑰孔血藍蛋白(KLH)或其他載體蛋白(例如白喉類毒素(DT)和破傷風類毒素(TT)蛋白))，透過將這種B細胞抗原決定位胜肽與各自載體蛋白化學共軛可引發超過90%的抗體是針對增強載體蛋白，而少於10%的抗體是針對免疫宿主中的標靶B細胞抗原決定位。
因此評估由本發明IgE EMPD胜肽免疫原構建所引發之抗體的特異性是重要的。代表的IgE EMPD胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：94)具有B細胞抗原決定位(SEQ ID NO：5)，B細胞抗原決定位透過間隔子序列εK-KKK(SEQ ID NO： 129)連接至異源性T輔助細胞抗原決定位UBITh®1(SEQ ID NO：72)，被製備用於抗原性評估。將UBITh®1(用於B細胞抗原決定位免疫增強作用之T輔助細胞抗原決定位胜肽)塗覆在微量盤上，並將來自接受免疫接種之天竺鼠的血清用於測試與用於免疫增強作用之UBITh®1胜肽的交叉反應性。表7顯示由IgE EMPD胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：94)所產生的抗體對相對應之IgE EMPD的標靶B細胞抗原決定位(SEQ ID NO：5)具有高度免疫原性；然而，發現大多數(如果不是全部的話)的免疫血清對UBITh®1胜肽(SEQ ID NO：72)沒有反應性。
綜上所述，引入與仔細選擇的T輔助細胞抗原決定位連接的標靶B細胞抗原決定位的免疫原設計導致產生集中且純粹的免疫反應，其引發僅針對IgE EMPD B細胞抗原決定位的抗體，而不是針對用以增強免疫反應的Th抗原決定位。對於醫藥組成物設計，免疫原所產生的免疫反應越具有特異性，其為組成物所提供的安全性越高。因此，本發明IgE EMPD胜肽免疫原構建除了對其標靶具有高度特異性以外還高度有效。
實施例8. 免疫治療過敏疫苗對遺傳修飾敲入小鼠血清IgE水平之預防和治療模型的影響
選擇SEQ ID NO：88和SEQ ID NO：93之IgE EMPD胜肽免疫原構建以使用表現人類IgE的基因工程小鼠(HuIGHE x Balb/c敲入小鼠的F1後代)在概念驗證研究中評 估於初級和次級/記憶反應中的IgE產生。
最初，在利用過敏原(例如木瓜蛋白酶)攻毒的致敏化作用之前進行IgE EMPD胜肽免疫原初次-加強免疫。將八隻動物(n=8)分配給六個治療組別和一個安慰劑組別中的每一個，共7組。針對兩種胜肽免疫原中的每一種，設計在第0、3和5週以i.m.途徑利用9(低)、18(中)和40(高)μg/劑之不同劑量的3個次組別。利用ISA 51VG和CpG佐劑配製胜肽免疫原以增強免疫反應。在安慰劑組別中的小鼠以肌內注射方式在第0、3和5週時僅注射製劑溶液的載體。在第10和16週，所有動物組別，包括安慰劑組別，透過皮下注射途徑利用50μg木瓜蛋白酶和TiterMax Gold佐劑致敏(第10圖)。
如實施例2所述，利用ELISA試驗測定兩種胜肽免疫原的抗體反應(針對γ1-em67融合蛋白的IgG效價)。在第0、3、5週利用不同劑量免疫接種的六個實驗組別中，所有小鼠均產生強烈的抗體反應。ELISA數據顯示來自具有高抗體效價之所有實驗組別的血清樣品從第3週開始可特異性地結合重組γ1-em67融合蛋白，且直到第20週保持在高效價(第11圖)。相反地，安慰劑組別中的小鼠不產生針對重組γ1-em67融合蛋白的特異性抗體。這些結果表明，所有治療組別可產生具有靶向表現IgE之B淋巴球的潛力的抗IgE-EMPD抗體，導致IgE生成的抑制。第11圖說明高抗體效價持續了整個20週的試驗期間。這些結果也表明，即使在來自兩種疫苗免疫原中的每一種的低劑量組別(9μg/劑)中，胜肽免疫原(SEQ ID NO：88和SEQ ID NO：93)具有免疫原性以誘導特異性免疫反 應，從而產生高效價的抗IgE EMPD抗體。
利用實施例2所述的分析程序，透過測定血清基礎IgE水平和過敏原特異性IgE水平來研究對於免疫小鼠之初級和記憶反應中的IgE產生的免疫效果。疫苗接種前和後的血清基礎IgE水平如第12圖所示證明了，相較於安慰劑組別中相對應時間點的血清基礎IgE水平，在所有治療組別中小鼠血清基礎IgE水平逐漸地下降。在第10週，在致敏作用之前，在所有六個治療組別中基礎IgE水平降至最低水平，而安慰劑組別的基礎血清IgE水平沒有明顯改變。此結果表明，與安慰劑組別相比，在第10週，在接受含有IgE EMPD胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：88或93)疫苗劑型的動物中，所有治療組別中的基礎IgE產生被顯著地抑制。第12圖也顯示，即使在第10和16週以過敏原致敏兩次之後，所有治療組別中的基礎血清IgE水平在整個20週試驗期間都被抑制。
第13和14圖分別顯示利用木瓜蛋白酶在第12週第一次致敏和在第18週第二次致敏所引發過敏原特異性IgE產生。這些結果表明，與安慰劑組別相比，這兩種胜肽免疫原構建(SEQ ID NOs：88和93)可顯著地抑制在第一次和第二次過敏原致敏後的木瓜蛋白酶特異性IgE水平。在兩種胜肽免疫原的任何一種中觀察到在三種劑量水平之間沒有實質差異。如第13圖所示，在第12週於初次反應中產生過敏原特異性IgE後，在此研究中胜肽免疫原(SEQ ID NO：88)表現較(SEQ ID NO：93)略好。與安慰劑組別相比，兩種IgE EMPD胜肽免疫原構建在初級和記憶反應中展現過敏原特異性IgE 產生的顯著抑制(第13和14圖)。
為了進一步研究靶向表現IgE的B細胞的IgE-EMPD胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：88和SEQ ID NO：93)用以抑制IgE產生和治療IgE介導過敏性疾病的潛在治療效果，設計額外的實驗計畫以評估這兩種胜肽免疫原構建於HuIGHE敲入小鼠中對致敏化作用/回憶(recall)反應的影響。將六隻動物分配給兩個治療組別的每一組(N=6)，而四隻動物用於安慰劑組別(N=4)，總共三組。所有組別的小鼠接受兩次致敏，分別是在胜肽疫苗接種前和後，是於第0週透過皮下途徑而於第12週透過足墊途徑，利用50μg木瓜蛋白酶/TiterMax Gold佐劑致敏。在兩個治療組別中評估初次-加強免疫方案，此初次-加強免疫方案是在第3、6和8週利用包含兩種胜肽免疫原構建之一的劑型的40μg/0.1mL的劑量，而安慰劑組別則僅投予佐劑載體(參見第15圖)。
結果顯示，包括安慰劑組別在內利用木瓜蛋白酶致敏的所有組別，在第2週之後在所有的三個組別中均引發了高效價的木瓜蛋白酶特異性IgGs，並且直到第6週(觀察的最後期間)仍保持高效價。總血清IgE和木瓜蛋白酶特異性IgE水平在第2週達到最高，然後在第3週開始逐漸下降，並在第6週回歸到基線(第16圖)。
利用IgE EMPD胜肽免疫原構建疫苗接種引發可特異性地辨識γ1-em67融合蛋白的高效價抗體。在第3、6和8週三次胜肽免疫原注射後，引發的抗體IgG效價(針對抗γ1-em67或抗IgE-EMPD)穩定地上升並在第10週達到最高水 平(數據未顯示)。在第12週，在第二次木瓜蛋白酶致敏後，兩個治療組別都沒有顯示升高的木瓜蛋白酶特異性IgE水平；然而，在第12和13週於安慰劑組別中的木瓜蛋白酶特異性IgE水平顯著地增加，然後在第14週下降到較低水平(數據未顯示)。
研究結果表明，相較於安慰劑組別，SEQ ID NOs：88和93的IgE EMPD胜肽免疫原在生物體內能夠誘發特異性體液免疫反應以預防記憶B細胞的回憶增生反應，其於第12週完全阻斷由木瓜蛋白酶回憶(recall)所引起的木瓜蛋白酶特異性IgE產生(第17圖)。整體而言，此研究指出本揭露IgE EMPD胜肽免疫原構建誘導的抗體反應不僅抑制來自初次致敏作用的過敏原特異性血清IgE產生，而且還穩定抑制來自第二次過敏原攻毒的回憶的過敏原特異性血清IgE。此研究結果證明本揭露的發明提供了用以治療IgE介導過敏性疾病(例如哮喘)之潛在有效的治療性疫苗。在仔細研究用以減弱過敏原特異性IgE的療效後，兩種胜肽免疫原(SEQ ID NO：88和SEQ ID NO：93)在抑制過敏原特異性IgE產生方面表現出相似的功效。
實施例9. 於食蟹猴中透過原型免疫治療過敏疫苗劑型的免疫原性評估進行劑量和劑型研究
a. 整體目標：
本研究的目的是評估在20週期間內利用選擇的IgE EMPD胜肽免疫原構建SEQ ID NO：88進行肌肉內免疫對 免疫原性的效果。在進行人體試驗之前，選擇食蟹猴作為用以評估原型IgE-EMPD胜肽疫苗製劑和給藥方案的免疫原性的動物模型。將代表性胜肽免疫原構建(SEQ ID NO：88)配製成兩種常用劑型。在第一種劑型中，在與MontanideTM ISA51混合形成油包水乳液之前，將SEQ ID NO：88的IgE EMPD胜肽免疫原構建與CpG製成穩定化的免疫刺激複合物(A部分研究)。在第二種製劑中，在與ADJUPHOS形成懸浮液劑型之前，將SEQ ID NO：88的IgE EMPD胜肽免疫原構建與CpG製成穩定化的免疫刺激複合物(B部分)。在此全面的免疫原性研究中，在每種劑型中評估了每劑從30μg、100μg、300μg至1000μg的四種劑量。
b. 計畫書摘要
選擇2.5-4.0kg的成年食蟹猴以評估IgE EMPD胜肽免疫原對免疫原性和血清食蟹猴IgE水平的影響。將總共20隻食蟹猴分成10組：安慰劑對照動物(n=2)僅利用佐劑(MontanideTM ISA 51加CpG寡去氧核苷酸)或(ADJUPHOS加CpG寡去氧核苷酸)注射。對實驗動物注射IgE EMPD胜肽免疫原(SEQ ID NO：88)，每組別劑量為30、100、300和1,000μg(每隻動物總共500μL疫苗體積；每組別n=2，雄性1隻和雌性1隻)。在第0、3和6週投予總共三次肌肉內免疫接種。在第0、3、6、8、10、12、14、16、20和24週針對免疫原性和血清IgE水平監測所有食蟹猴。
c. 抗IgE EMPD抗體效價的測定
在第0、3、6、8、10、12、14、16、20和24週時 對所有動物採血。分離每次採血的血清，以使用γ1-cyno em67 ELISA測定抗IgE EMPD抗體效價。安慰劑處理的動物幾乎沒有可檢測到的抗IgE EMPD抗體效價(第18A和18B圖)。然而，接受三次免疫的所有動物都具有針對IgE EMPD B細胞抗原決定位的可檢測到的IgG抗體效價，其在第8至12週存在峰值效價。這種特異性反應性以劑量依賴性方式維持了整個24週研究期間(第18A和18B圖)。發現所有動物對γ1-cyno em67重組蛋白具有高的抗血清效價，其中以每劑於0.5mL中含有300μg的劑量對於兩種劑型而言都是最理想的，因為1,000μg劑量製劑會導致在各自的製劑中相對於ISA51V或ADJUPHOS佐劑而言過量的胜肽免疫原。相較於利用ADJUPHOS/CpG ODN的製劑，結果顯示含有ISA51/CpG ODN的製劑具有更高的免疫原性結果。針對IgE EMPD B細胞抗原決定位的抗體反應隨著每次胜肽免疫原加強免疫而增強，然後抗IgE EMPD效價隨時間逐漸下降。在整個24週的研究中持續顯著高的抗血清效價(第18A和18B圖)。
實施例10. 於食蟹猴中具有替代性免疫治療過敏疫苗效力的證明
a. 整體目標：
這項研究的目的是評估於食蟹猴中在20週期間內利用IgE EMPD胜肽免疫原(其中此序列衍生自自體mIgE)進行肌肉內免疫對免疫原性和血清IgE水平的影響，食蟹猴為接近地模擬人類IgE產生的動物模型。mIgE的IgE EMPD在 非人類靈長類動物(例如新和舊世界的猴子和猿類)中於進化上是保守的，並且在其他物種(例如囓齒動物、兔子和犬科動物)中未發現這種IgE EMPD對應物序列。食蟹猴IgE EMPD的胺基酸序列(SEQ ID NO：127)與人類IgE EMPD的胺基酸序列(SEQ ID NO：2)具有高度的序列一致性(90%)。
b. 計畫書摘要
選擇2.5-4.0kg的成年食蟹猴以評估IgE EMPD胜肽免疫原對免疫原性和血清食蟹猴IgE水平的影響。將總共12隻食蟹猴分成3組：安慰劑對照動物(n=4，2隻雄性和2隻雌性)僅利用佐劑(MontanideTM ISA 51加CpG寡去氧核苷酸)注射；以300μg之劑量利用IgE EMPD胜肽免疫原(SEQ ID NOs：125或126)注射實驗動物(每隻動物總共500μL疫苗體積；每組別n=4，2隻雄性和2隻雌性)。在第0、3和6週投予總共三次肌肉內免疫接種。在第0、3、6、8、10、12、14、16、18和20週針對免疫原性和血清IgE水平監測所有食蟹猴。
c. 抗IgE EMPD抗體效價的測定
在第0、3、6、8、10、12、14、16、18和20週時對所有動物採血。分離每次採血的血清，以使用γ1-cyno em67 ELISA測定抗IgE EMPD抗體效價。安慰劑處理的動物沒有可檢測到的抗IgE EMPD抗體效價(第19圖)。然而，接受利用SEQ ID NO：125或SEQ ID NO：126三次免疫的所有動物都具有針對IgE EMPD B細胞抗原決定位的可檢測到的IgG抗體效價，其在第8至12週存在峰值效價(第19圖)。這種特異性反應性維持了整個20週的研究期間。此外，所有接受免疫的動物在整 個20週期間內都產生了特異性IgM和IgA抗體效價(第20圖)。
d. 血清IgE水平的測定
在第0、3、6、8、10、12、14、16、18和20週時對所有動物採血。分離每次採血的血清，以使用定量食蟹猴IgE ELISA測定血清IgE。安慰劑組別的基礎IgE水平在存活期期間變化。在投予SEQ ID NO：125的組別中所觀察到的IgE減少在統計學上是顯著的，而在投予SEQ ID NO：126的組別中也顯示在監測期間IgE減少的趨勢(第19圖)。
e. 結果
評估在替代模型中IgE EMPD胜肽免疫原對成年食蟹猴血清樣品中針對自體mIgE之免疫原性和血清IgE濃度的影響。在此概念驗證研究中，利用CpG ODN和MontanideTM ISA 51混合物投予每組別中的四隻動物作為安慰劑對照，並且利用300μg食蟹猴IgE EMPD胜肽免疫原，SEQ ID NO：125或126，與CpG寡去氧核苷酸(CpG ODN)複合形成專利的免疫刺激複合物(ISC)，並與MontanideTM ISA 51佐劑配製，在第0、3和6週免疫接種8隻成年食蟹猴(每組別n=4)。SEQ ID NO：125和126分別是人類IgE EMPD免疫原SEQ ID NO：93和88的對應物。與CpG ODN/MontanideTM ISA 51配製的兩種食蟹猴衍生的免疫原在所有動物中產生強烈抗IgE EMPD IgG抗體反應(第19圖)。此外，所有動物產生了針對IgE EMPD的IgM和IgA抗體(第20圖)。還觀察到基礎食蟹猴血清IgE的下降趨勢(第21圖)。未記錄有不良的注射部位反應。此研究證明具有增強的UBITh® T細胞抗原決定位之合成的IgE EMPD胜肽 免疫原(SEQ ID NOs：125和126)(其序列衍生自自體)能夠引發強烈的抗IgE EMPD抗體反應，導致IgE生成的抑制，以及基礎食蟹猴血清IgE水平降低的趨勢。
f. 結論
利用IgE EMPD胜肽免疫原(SEQ ID NOs：125和126)或安慰劑對照在20週期間內透過肌肉內途徑注射食蟹猴3次。動物具有良好的整體耐受性並且發生免疫耐受。所有接受免疫的食蟹猴均產生短暫的特異性IgM抗體，同時產生針對IgE EMPD構建相對應B細胞抗原決定位的有效且持續的IgG(高達105)和IgA(高達104)抗體效價。在每個和所有反應者中觀察到基礎IgE水平降低。這些結果支持抗IgE-EMPD抗體的作用模式，憑此抗體靶向表現膜鑲嵌型IgE的B細胞，導致後續IgE生成的抑制。
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<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 5-14
<400> 22
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 6-15
<400> 23
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 7-16
<400> 24
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 8-17
<400> 25
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 9-18
<400> 26
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 10-19
<400> 27
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 11-20
<400> 28
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 12-21
<400> 29
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 13-22
<400> 30
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 14-23
<400> 31
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 15-24
<400> 32
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 16-25
<400> 33
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 17-26
<400> 34
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 18-27
<400> 35
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 19-28
<400> 36
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 20-29
<400> 37
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 21-30
<400> 38
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 22-31
<400> 39
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 23-32
<400> 40
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 24-33
<400> 41
<210> 42
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 25-34
<400> 42
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 26-35
<400> 43
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 27-36
<400> 44
<210> 45
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 28-37
<400> 45
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 29-38
<400> 46
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 30-39
<400> 47
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 31-40
<400> 48
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 32-41
<400> 49
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 33-42
<400> 50
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 34-43
<400> 51
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 35-44
<400> 52
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 36-45
<400> 53
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 37-46
<400> 54
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 38-47
<400> 55
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 39-48
<400> 56
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 40-49
<400> 57
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<223> IgE-EMPD 41-50
<400> 58
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 破傷風梭菌
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(17)
<223> 破傷風梭菌1 Th
<400> 59
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> 麻疹病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(15)
<223> MvF1 Th
<400> 60
<210> 61
<211> 24
<212> PRT
<213> 百日咳桿菌
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(24)
<223> 百日咳桿菌Th
<400> 61
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 破傷風梭菌
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(17)
<223> 破傷風梭菌2 Th
<400> 62
<210> 63
<211> 23
<212> PRT
<213> 白喉桿菌
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(23)
<223> 白喉Th
<400> 63
<210> 64
<211> 21
<212> PRT
<213> 惡性瘧原蟲
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(21)
<223> 惡性瘧原蟲Th
<400> 64
<210> 65
<211> 17
<212> PRT
<213> 曼氏血吸蟲
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(17)
<223> 曼氏血吸蟲Th
<400> 65
<210> 66
<211> 25
<212> PRT
<213> 霍亂毒素
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(25)
<223> 霍亂毒素Th
<400> 66
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> 麻疹病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(15)
<223> MvF 2 Th
<400> 67
<210> 68
<211> 22
<212> PRT
<213> 麻疹病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(22)
<223> KKKMvF 3 Th
<220>
<221> 位點
<222> (7)..(7)
<223> S或T
<220>
<221> 位點
<222> (10)..(10)
<223> K或R
<220>
<221> 位點
<222> (11)..(11)
<223> G或T
<220>
<221> 位點
<222> (15)..(15)
<223> H或T
<220>
<221> 位點
<222> (16)..(16)
<223> K或R
<220>
<221> 位點
<222> (19)..(19)
<223> G或T
<400> 68
<210> 69
<211> 18
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(18)
<223> HBsAg 1 Th
<220>
<221> 位點
<222> (1)..(1)
<223> K或R
<220>
<221> 位點
<222> (2)..(2)
<223> K或R
<220>
<221> 位點
<222> (3)..(3)
<223> K或R
<220>
<221> 位點
<222> (4)..(4)
<223> L或I或V或F
<220>
<221> 位點
<222> (5)..(5)
<223> F或K或R
<220>
<221> 位點
<222> (6)..(6)
<223> L或I或V或F
<220>
<221> 位點
<222> (7)..(7)
<223> L或I或V或F
<220>
<221> 位點
<222> (9)..(9)
<223> K或R
<220>
<221> 位點
<222> (10)..(10)
<223> L或I或V或F
<220>
<221> 位點
<222> (11)..(11)
<223> L或I或V或F
<220>
<221> 位點
<222> (13)..(13)
<223> L或I或V或F
<220>
<221> 位點
<222> (15)..(15)
<223> Q或L或I或V或F
<220>
<221> 位點
<222> (17)..(17)
<223> L或I或V或F
<220>
<221> 位點
<222> (18)..(18)
<223> D或R
<400> 69
<210> 70
<211> 19
<212> PRT
<213> 麻疹病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(19)
<223> MvF 4 Th
<220>
<221> 位點
<222> (4)..(4)
<223> S或T
<220>
<221> 位點
<222> (7)..(7)
<223> K或R
<220>
<221> 位點
<222> (8)..(8)
<223> G或T
<220>
<221> 位點
<222> (12)..(12)
<223> H或T
<220>
<221> 位點
<222> (13)..(13)
<223> K或R
<400> 70
<210> 71
<211> 18
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(18)
<223> HBsAg 2 Th
<220>
<221> 位點
<222> (4)..(4)
<223> I或F
<220>
<221> 位點
<222> (5)..(5)
<223> I或F
<220>
<221> 位點
<222> (6)..(6)
<223> T或L
<220>
<221> 位點
<222> (7)..(7)
<223> I或L
<220>
<221> 位點
<222> (11)..(11)
<223> I或L
<220>
<221> 位點
<222> (14)..(14)
<223> P或I
<220>
<221> 位點
<222> (15)..(15)
<223> Q或T
<220>
<221> 位點
<222> (16)..(16)
<223> S或T
<220>
<221> 位點
<222> (17)..(17)
<223> L或I
<400> 71
<210> 72
<211> 19
<212> PRT
<213> 麻疹病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(19)
<223> MvF 5 Th
<400> 72
<210> 73
<211> 18
<212> PRT
<213> B型肝炎病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(18)
<223> HBsAg 3 Th
<400> 73
<210> 74
<211> 11
<212> PRT
<213> 流行性感冒病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(11)
<223> 流行性感冒病毒基質蛋白1_1 Th
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(11)
<223> 流行性感冒病毒基質蛋白1_1 Th
<400> 74
<210> 75
<211> 15
<212> PRT
<213> 流行性感冒病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(15)
<223> 流行性感冒病毒基質蛋白1_2 Th
<400> 75
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 流行性感冒病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(9)
<223> 流行性感冒病毒非結構蛋白1 Th
<400> 76
<210> 77
<211> 19
<212> PRT
<213> Epstein-Barr病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(19)
<223> Epstein-Barr病毒BHRF1 Th
<400> 77
<210> 78
<211> 15
<212> PRT
<213> 破傷風梭菌
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(15)
<223> 破傷風梭菌TT1 Th
<400> 78
<210> 79
<211> 20
<212> PRT
<213> Epstein-Barr病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(20)
<223> Epstein-Barr病毒EBNA-1 Th
<400> 79
<210> 80
<211> 21
<212> PRT
<213> 破傷風梭菌
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(21)
<223> 破傷風梭菌TT2 Th
<400> 80
<210> 81
<211> 16
<212> PRT
<213> 破傷風梭菌
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(16)
<223> 破傷風梭菌TT3 Th
<400> 81
<210> 82
<211> 16
<212> PRT
<213> 破傷風梭菌
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(16)
<223> 破傷風梭菌TT4 Th
<400> 82
<210> 83
<211> 18
<212> PRT
<213> Epstein-Barr病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(18)
<223> Epstein-Barr病毒CP Th
<400> 83
<210> 84
<211> 14
<212> PRT
<213> 人類巨細胞病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(14)
<223> 人類巨細胞病毒IE1 Th
<400> 84
<210> 85
<211> 15
<212> PRT
<213> Epstein-Barr病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(15)
<223> Epstein-Barr病毒GP340 Th
<400> 85
<210> 86
<211> 13
<212> PRT
<213> Epstein-Barr病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(13)
<223> Epstein-Barr病毒BPLF1 Th
<400> 86
<210> 87
<211> 11
<212> PRT
<213> Epstein-Barr病毒
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(11)
<223> Epstein-Barr病毒EBNA-2 Th
<400> 87
<210> 88
<211> 59
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(39)
<223> IgE-EMPD 1-39
<220>
<221> 位點
<222> (40)..(40)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (41)..(59)
<223> UBITh®1
<400> 88
<210> 89
<211> 59
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(19)
<223> UBITh®1
<220>
<221> 位點
<222> (20)..(20)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (21)..(59)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 89
<210> 90
<211> 79
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(19)
<223> UBITh®1
<220>
<221> 位點
<222> (20)..(20)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (21)..(59)
<223> IgE-EMPD 1-39
<220>
<221> 位點
<222> (60)..(60)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (61)..(79)
<223> UBITh®1
<400> 90
<210> 91
<211> 54
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(34)
<223> IgE-EMPD 7-40
<220>
<221> 位點
<222> (35)..(35)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (36)..(54)
<223> UBITh®1
<400> 91
<210> 92
<211> 54
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(19)
<223> UBITh®1
<220>
<221> 位點
<222> (20)..(20)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (21)..(54)
<223> IgE-EMPD 7-40
<400> 92
<210> 93
<211> 74
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(19)
<223> UBITh®1
<220>
<221> 位點
<222> (20)..(20)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (21)..(54)
<223> IgE-EMPD 7-40
<220>
<221> 位點
<222> (55)..(55)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (56)..(74)
<223> UBITh®1
<400> 93
<210> 94
<211> 62
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(19)
<223> UBITh®1
<220>
<221> 胜肽
<222> (20)..(23)
<223> epsilon K-KKK作為間隔子
<220>
<221> 位點
<222> (20)..(20)
<223> epsilon-K
<220>
<221> 胜肽
<222> (24)..(62)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 94
<210> 95
<211> 61
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(18)
<223> UBITh®2
<220>
<221> 胜肽
<222> (19)..(22)
<223> epsilon K-KKK作為間隔子
<220>
<221> 位點
<222> (19)..(19)
<223> epsilon-K
<220>
<221> 胜肽
<222> (23)..(61)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 95
<210> 96
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(19)
<223> UBITh®1
<220>
<221> 胜肽
<222> (20)..(23)
<223> epsilon K-KKK作為間隔子
<220>
<221> 位點
<222> (20)..(20)
<223> epsilon-K
<220>
<221> 胜肽
<222> (24)..(40)
<223> IgE-EMPD 1-17
<400> 96
<210> 97
<211> 43
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(19)
<223> UBITh®1
<220>
<221> 胜肽
<222> (20)..(23)
<223> epsilon K-KKK作為間隔子
<220>
<221> 位點
<222> (20)..(20)
<223> epsilon-K
<220>
<221> 胜肽
<222> (24)..(43)
<223> IgE-EMPD 19-38
<400> 97
<210> 98
<211> 57
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(17)
<223> 破傷風梭菌1 Th
<220>
<221> 位點
<222> (18)..(18)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (19)..(57)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 98
<210> 99
<211> 55
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(15)
<223> MvF1 Th
<220>
<221> 位點
<222> (16)..(16)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (17)..(55)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 99
<210> 100
<211> 64
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(24)
<223> 百日咳桿菌Th
<220>
<221> 位點
<222> (25)..(25)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (26)..(64)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 100
<210> 101
<211> 57
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(17)
<223> 破傷風梭菌2 Th
<220>
<221> 位點
<222> (18)..(18)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (19)..(57)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 101
<210> 102
<211> 63
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(23)
<223> 白喉Th
<220>
<221> 位點
<222> (24)..(24)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (25)..(63)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 102
<210> 103
<211> 61
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(21)
<223> 惡性瘧原蟲Th
<220>
<221> 位點
<222> (22)..(22)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (23)..(61)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 103
<210> 104
<211> 57
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(17)
<223> 曼氏血吸蟲Th
<220>
<221> 位點
<222> (18)..(18)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (19)..(57)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 104
<210> 105
<211> 65
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(25)
<223> 霍亂毒素Th
<220>
<221> 位點
<222> (26)..(26)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (27)..(65)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 105
<210> 106
<211> 55
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(15)
<223> MvF 2 Th
<220>
<221> 位點
<222> (16)..(16)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (17)..(55)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 106
<210> 107
<211> 62
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(22)
<223> KKKMvF 3 Th
<220>
<221> 位點
<222> (7)..(7)
<223> S或T
<220>
<221> 位點
<222> (10)..(10)
<223> K或R
<220>
<221> 位點
<222> (11)..(11)
<223> G或T
<220>
<221> 位點
<222> (15)..(15)
<223> H或T
<220>
<221> 位點
<222> (16)..(16)
<223> K或R
<220>
<221> 位點
<222> (19)..(19)
<223> G或T
<220>
<221> 位點
<222> (23)..(23)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (24)..(62)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 107
<210> 108
<211> 58
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(18)
<223> HBsAg 1 Th
<220>
<221> 位點
<222> (1)..(1)
<223> K或R
<220>
<221> 位點
<222> (2)..(2)
<223> K或R
<220>
<221> 位點
<222> (3)..(3)
<223> K或R
<220>
<221> 位點
<222> (4)..(4)
<223> L或I或V或F
<220>
<221> 位點
<222> (5)..(5)
<223> F或K或R
<220>
<221> 位點
<222> (6)..(6)
<223> L或I或V或F
<220>
<221> 位點
<222> (7)..(7)
<223> L或I或V或F
<220>
<221> 位點
<222> (9)..(9)
<223> K或R
<220>
<221> 位點
<222> (10)..(10)
<223> L或I或V或F
<220>
<221> 位點
<222> (11)..(11)
<223> L或I或V或F
<220>
<221> 位點
<222> (13)..(13)
<223> L或I或V或F
<220>
<221> 位點
<222> (15)..(15)
<223> Q或L或I或V或F
<220>
<221> 位點
<222> (17)..(17)
<223> L或I或V或F
<220>
<221> 位點
<222> (18)..(18)
<223> D或R
<220>
<221> 位點
<222> (19)..(19)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (20)..(58)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 108
<210> 109
<211> 59
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(19)
<223> MvF 4 Th
<220>
<221> 位點
<222> (4)..(4)
<223> S或T
<220>
<221> 位點
<222> (7)..(7)
<223> K或R
<220>
<221> 位點
<222> (8)..(8)
<223> G或T
<220>
<221> 位點
<222> (12)..(12)
<223> H或T
<220>
<221> 位點
<222> (13)..(13)
<223> K或R
<220>
<221> 位點
<222> (20)..(20)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (21)..(59)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 109
<210> 110
<211> 58
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(18)
<223> HBsAg 2 Th
<220>
<221> 位點
<222> (4)..(4)
<223> I或F
<220>
<221> 位點
<222> (5)..(5)
<223> I或F
<220>
<221> 位點
<222> (6)..(6)
<223> T或L
<220>
<221> 位點
<222> (7)..(7)
<223> I或L
<220>
<221> 位點
<222> (11)..(11)
<223> I或L
<220>
<221> 位點
<222> (14)..(14)
<223> P或I
<220>
<221> 位點
<222> (15)..(15)
<223> Q或T
<220>
<221> 位點
<222> (16)..(16)
<223> S或T
<220>
<221> 位點
<222> (17)..(17)
<223> L或I
<220>
<221> 位點
<222> (19)..(19)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (20)..(58)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 110
<210> 111
<211> 51
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(11)
<223> 流行性感冒病毒MP1_1 Th
<220>
<221> 位點
<222> (12)..(12)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (13)..(51)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 111
<210> 112
<211> 55
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(15)
<223> 流行性感冒病毒MP1_2 Th
<220>
<221> 位點
<222> (16)..(16)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (17)..(55)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 112
<210> 113
<211> 49
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(9)
<223> 流行性感冒病毒NSP1 Th
<220>
<221> 位點
<222> (10)..(10)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (11)..(49)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 113
<210> 114
<211> 59
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(19)
<223> Epstein-Barr病毒BHRF1 Th
<220>
<221> 位點
<222> (20)..(20)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (21)..(59)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 114
<210> 115
<211> 55
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(15)
<223> 破傷風梭菌TT1 Th
<220>
<221> 位點
<222> (16)..(16)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (17)..(55)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 115
<210> 116
<211> 60
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(20)
<223> Epstein-Barr病毒EBNA-1 Th
<220>
<221> 位點
<222> (21)..(21)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (22)..(60)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 116
<210> 117
<211> 61
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(21)
<223> 破傷風梭菌TT2 Th
<220>
<221> 位點
<222> (22)..(22)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (23)..(61)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 117
<210> 118
<211> 56
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(16)
<223> 破傷風梭菌TT3 Th
<220>
<221> 位點
<222> (17)..(17)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (18)..(56)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 118
<210> 119
<211> 56
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(16)
<223> 破傷風梭菌TT4 Th
<220>
<221> 位點
<222> (17)..(17)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (18)..(56)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 119
<210> 120
<211> 58
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(18)
<223> Epstein-Barr病毒CP Th
<220>
<221> 位點
<222> (19)..(19)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (20)..(58)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 120
<210> 121
<211> 54
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(14)
<223> 人類巨細胞病毒IE1 Th
<220>
<221> 位點
<222> (15)..(15)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (16)..(54)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 121
<210> 122
<211> 55
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(15)
<223> Epstein-Barr病毒GP340 Th
<220>
<221> 位點
<222> (16)..(16)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (17)..(55)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 122
<210> 123
<211> 53
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(13)
<223> Epstein-Barr病毒BPLF1 Th
<220>
<221> 胜肽
<222> (14)..(14)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (15)..(53)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 123
<210> 124
<211> 51
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(11)
<223> Epstein-Barr病毒EBNA-2 Th
<220>
<221> 位點
<222> (12)..(12)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (13)..(51)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 124
<210> 125
<211> 74
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(19)
<223> UBITh®1
<220>
<221> 位點
<222> (20)..(20)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (21)..(54)
<223> IgE-EMPD 7-40(食蟹猴)
<220>
<221> 位點
<222> (55)..(55)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (56)..(74)
<223> UBITh®1
<400> 125
<210> 126
<211> 59
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(39)
<223> IgE-EMPD 1-39(食蟹猴)
<220>
<221> 位點
<222> (40)..(40)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 胜肽
<222> (41)..(59)
<223> UBITh®1
<400> 126
<210> 127
<211> 52
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(52)
<223> IgE-EMPD 1-52(食蟹猴)
<400> 127
<210> 128
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(6)
<223> 間隔子1
<400> 128
<210> 129
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(4)
<223> 間隔子2
<220>
<221> 位點
<222> (1)..(1)
<223> epsilon K
<400> 129
<210> 130
<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成胜肽
<220>
<221> 位點
<222> (1)..(19)
<223> UBITh®2
<220>
<221> 位點
<222> (20)..(20)
<223> epsilon K作為間隔子
<220>
<221> 位點
<222> (21)..(58)
<223> IgE-EMPD 1-39
<400> 130

Claims (17)

  1. 一種以分子式代表之IgE EMPD胜肽免疫原構建：(Th) m-(A) n-(IgE EMPD片段)-X或(IgE EMPD片段)-(A) n-(Th) m-X或(Th) m-(A) n-(IgE EMPD片段)-(A) n-(Th) m-X其中Th為一異源性T輔助細胞抗原決定位；A為一異源性間隔子；(IgE EMPD片段)為來自IgE EMPD的該中央分子內環狀結構具有約20至約40個胺基酸殘基的一B細胞抗原決定位；X為一胺基酸的一α-COOH或α-CONH 2；m為1至約4；以及n為0至約10。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之IgE EMPD胜肽免疫原構建，其中該IgE EMPD片段係選自由SEQ ID NOs：5、6、8和9組成的群組。
  3. 如申請專利範圍第1或2項任一所述之IgE EMPD胜肽免疫原構建，其中該T輔助細胞抗原決定位係選自由SEQ ID NOs：59-87組成的群組。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之IgE EMPD胜肽免疫原構建，其中該胜肽免疫原構建係選自由SEQ ID NOs：88-95、 98-124和130組成的群組。
  5. 一種IgE EMPD胜肽免疫原構建包含：包含來自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之該IgE EMPD序列約20至約40個胺基酸殘基的一B細胞抗原決定位；包含選自由SEQ ID NOs：59-87組成之群組之一胺基酸序列的一T輔助細胞抗原決定位；以及選自由一胺基酸、Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys和ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：129)組成之群組的一任選的異源性間隔子，其中該B細胞抗原決定位係直接地或透過該任選的異源性間隔子共價連接至該T輔助細胞抗原決定位。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之IgE EMPD胜肽免疫原構建，其中該B細胞抗原決定位係選自由SEQ ID NOs：5、6、8和9組成的群組。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之IgE EMPD胜肽免疫原構建，其中該T輔助細胞抗原決定位係選自由SEQ ID NOs：59-87組成的群組。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之IgE EMPD胜肽免疫原構建，其中該任選的異源性間隔子為(α,ε-N)Lys或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO：129)。
  9. 如申請專利範圍第5項所述之IgE EMPD胜肽免疫原構建，其中該T輔助細胞抗原決定位係共價連接至該B細胞抗原決定位的該氨基端。
  10. 如申請專利範圍第5項所述之IgE EMPD胜肽免疫原構建，其中該T輔助細胞抗原決定位係透過該任選的異源性間隔子共價連接至該B細胞抗原決定位的該氨基端。
  11. 一種包含如申請專利範圍第1至10項任一所述之一胜肽免疫原構建的組成物。
  12. 一種醫藥組成物包含：a. 如申請專利範圍第1至10項任一所述之一胜肽免疫原構建；以及b. 一藥學上可接受的遞送載體及/或佐劑。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之醫藥組成物，其中a. 該IgE EMPD胜肽免疫原構建係選自由SEQ ID NOs：88-95、98-124和130組成的群組；以及b. 該IgE EMPD胜肽免疫原構建與一CpG寡去氧核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN)混合以形成一穩定化免疫刺激複合物。
  14. 一種分離抗體或其抗原決定位結合片段，其可特異性地結合至如申請專利範圍第1至10項任一所述之該IgE EMPD胜肽免疫原構建的該B細胞抗原決定位。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之分離抗體或其抗原決定位結合片段結合至該IgE EMPD胜肽免疫原構建。
  16. 一種分離抗體或其抗原決定位結合片段，其可特異性地結合至如申請專利範圍第1至10項任一所述之該IgE EMPD胜肽免疫原構建的該B細胞抗原決定位。
  17. 一種包含如申請專利範圍第14至16項任一所述之該分 離抗體或其抗原決定位結合片段的組成物。
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