CN111565801B - 用于IgE介导过敏性疾病治疗的靶向膜结合型IgE的肽免疫原及其剂型 - Google Patents
用于IgE介导过敏性疾病治疗的靶向膜结合型IgE的肽免疫原及其剂型 Download PDFInfo
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Abstract
本公开关于用于IgE介导过敏性疾病治疗的IgE EMPD肽免疫原构建体及其剂型。IgE EMPD肽免疫原构建体具有超过20个氨基酸的B细胞表位肽,以环状为优选,其经任选间隔子连接衍生自病原体蛋白的异源性T辅助细胞(Th)表位。肽免疫原构建体及其剂型能够在接种的宿主中刺激高特异性抗体产生,其针对IgE EMPD肽,并与定向分化为分泌IgE的B淋巴细胞上的膜结合型IgE交叉反应。肽免疫原构建体及其剂型诱导的抗体在接种的宿主诱导表达IgE的B细胞凋亡,并介导抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC),导致接种的宿主抗体特异性IgE和总IgE水平下降以有效治疗IgE介导过敏性病理学。
Description
发明领域
本公开关于靶向膜结合型IgE之细胞外膜近侧结构域(或称IgE EMPD)的肽免疫原构建体及其剂型,其作为用以治疗和/或预防IgE介导过敏性疾病的通用疫苗。
发明背景
过敏症,也被称为免疫球蛋白E(IgE)介导过敏性疾病,是由免疫系统对环境中的某些物质高敏感性导致的许多疾病,通常在大多数人中很少或根本不会造成问题。这些疾病包括对药物、食物和昆虫过敏、过敏性鼻炎(花粉热)、异位性皮肤炎、过敏性气喘、结膜炎、湿疹、风疹块(荨麻疹)和急性过敏(网站:en.wikipedia.org/wiki/Allergy)。多种症状往往归因于过敏,且可能包括眼睛泛红、发痒性皮疹、打喷嚏、流鼻水、呼吸短促或肿胀。
过敏性疾病的流行率正在增加。在20世纪初,过敏被视为一种罕见疾病。然而,从那以后,有几个因素引发了过敏性疾病流行率的急遽上升。以呼吸道表征最为普遍,影响高达总人口的30%。根据世界卫生组织(WHO)统计,世界上有数亿人患有鼻炎,且估计有2.35亿人患有气喘(网址:www.who.int/mediacentre/factsheets/fs307/en/index.html)。过敏性疾病的社会成本相当可观,主要是因为过敏性鼻结膜炎的高度流行和与其相关的生产力损失。瑞典的研究估计,仅在瑞典,每年由鼻炎所引起的生产力损失达到27亿欧元,而美国的研究则证实疾病中以鼻炎对美国雇主造成的损失最大(Larsen JN,et al.,2016)。
过敏反应是一种异常剧烈的免疫反应,在此免疫系统抵御原先对人体无害的抗原(过敏原)的威胁(网站:en.wikipedia.org/wiki/Allergen)。具体而言,过敏原是能够通过IgE反应在特应性个体刺激I型过敏反应的抗原。过敏原可来自各处(例如:尘螨排泄物、花粉、宠物皮屑、某些食物,或化学/物理性刺激物质)。食物过敏症不像食物敏感症一样普遍,但某些食物(例如:花生(豆类)、坚果、海鲜和贝类)是造成许多人严重过敏的原因。
过敏是由针对常见过敏原的适应性免疫反应激活所引发的全身性免疫疾病。IgE在介导负责引起IgE介导过敏性疾病的I型过敏反应中扮演重要角色。IgE介导过敏性疾病的特征在于呈现过敏原特异性IgE抗体和嗜酸性粒细胞炎症。过敏反应是双相性的,在过敏原暴露后几分钟内发生立即型反应,且于几小时后发生晚期反应。立即型反应是当结合至位于细胞表面上高亲和力受体的IgE交联时由嗜碱性粒细胞和肥大细胞所释放出的现成媒介物(例如:组织胺、蛋白酶、趋化因子、肝素)所引起。晚期过敏反应则是由炎症细胞(例如:嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞)的动员和吸引所引起。
过敏原在有过敏倾向的个体中导致血清总游离免疫球蛋白E(IgE)和过敏原特异性IgE水平上升。过敏原特异性IgE介导的I型过敏反应对IgE介导过敏性疾病的致病机制是重要的(图1)。IgE藉由结合至位于那些效应细胞表面上高亲和力IgE受体(FcεRI)使肥大细胞和嗜碱性粒细胞致敏。抗原与已经与肥大细胞上的FcεRI结合的IgE结合,造成结合的IgE的交联,以及下面FcεRI的聚集。交联的受体启动信号传导级联与快速的去颗粒作用。肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放储存的组织胺,然后合成并释放缓激肽、前列腺素、白三烯素、细胞因子和其他炎症媒介物。它们进一步吸引和激活产生过敏症状的炎症细胞,并向上调节通过B细胞的IgE生合成,从而促进敏感性加剧。IgE-FcεRI相互作用和去颗粒作用对I型过敏反应和特应性哮喘的发展是重要的。
如同其他免疫球蛋白同种型,IgE以2种形式(分泌的血清免疫球蛋白形式和膜结合形式(mIgE))存在。针对编码小鼠和人类mIgEs的膜锚定肽的基因片段的研究显示,mIgE和分泌型IgE之间的区别在于mIgE包含三个额外的区域:(1)25个疏水性、不带电氨基酸残基的中心保守区段,其跨越细胞膜;(2)羧基端的胞质尾;以及(3)mIgE膜锚定片段的氨基端的细胞外部份。在人类中,位于B淋巴细胞表面的mIgE的epsilon链是以短和长的同种型存在。短的同种型包含位于mIgE细胞外膜近侧结构域的15个氨基酸,称为IgE EMPD,而长的同种型包含具有52个氨基酸残基的额外片段,在EMPD中总共有67个氨基酸。这两种同种型是由于位于CH4外显子3′端的供体位点与两个受体位点(两个受体位点间隔156bp且位于CH4外显子下游约2000个核苷酸处)之间进行选择性剪接所产生的结果。于利用IL-4加上CD40处理的产生IgE的骨髓瘤细胞和扁桃腺B细胞检测显示,长形式转录本水平较短形式转录本水平高100倍(Peng et al.1992and Zhang et al 1992);而于蛋白质层次未检测到短形式(Peng et al,1992)。IgE EMPD对mIgE形式具有特异性,在分泌型血清IgE则未发现此现象(图2)。
现行用于IgE介导过敏性疾病治疗的临床指引包含患者教育、过敏原预防、药物治疗、基于过敏原的免疫疗法和IgE的治疗标靶的组合,但是这些治疗选择具有其局限性。例如,尽管在实际上尽可能地指出过敏原以预防,单独利用过敏原预防仍难以达到足够的症状控制。此外,即使安全和廉价的药物可用于治疗过敏症状,许多患者报告使用这些药物并不足以控制症状。重要的是,药物治疗对疾病进程没有效果,且只要症状流行就必须反复投药进行治疗,这往往意味着终生的治疗。只有典型基于免疫原的免疫治疗具有改善疾病的潜力,被认为是最理想的治疗策略。
基于过敏原的免疫治疗(AIT)涉及以递增方式皮下注射增加的过敏原剂量,以便抑制后续再次暴露于此过敏原所引起的症状。在自然暴露条件下,呈现于粘膜中免疫系统的过敏原含量相对较低,但其可以在数分钟内有效刺激过敏反应并出现过敏症状。相反,当将过敏原作为免疫疗法投予时,过敏原的量相对较高,其中在免疫疗法所投予的一个剂量相当于通过自然暴露经估计的每年最大摄入量的约100倍。将数量上的差异与进入人体的不同途径相结合,对免疫系统展现深远的影响,通过引起对过敏原的免疫耐受使免疫系统作出反应。
AIT的原始给药形式是通过皮下注射,且此治疗方案传统上分成两个阶段进行:(1)起始的增量给药阶段和(2)后续的维持阶段。增量给药阶段是个别调整剂量,在此为了缓慢建立耐受性的目的而投予渐增的剂量并仔细评估患者的敏感性。以最大可耐受剂量或建议的最高剂量先到达者为准,然后在整个维持阶段给予此剂量。
两种机制被认为在AIT中起主要作用:(1)免疫偏离和(2)调节性T细胞的诱发。尚未确定免疫偏离和调节性T细胞的相对贡献,但最终结果是减少且在某些情况下甚至会消除于针对过敏原暴露的反应中引起过敏反应的能力。
免疫偏离是用以表示针对过敏原暴露的经修饰的免疫反应的术语,其中过敏原特异性的I型T辅助(Th1)细胞被动员和刺激但牺牲了Th2细胞。Th1细胞产生干扰素γ(IFN-γ),其刺激B细胞产生IgG而非IgE,且IgG无法引发过敏反应。
调节性T细胞是多群T细胞,其活跃于免疫反应调控中。已证明在AIT后于周边血液中过敏原特异性CD4+CD25+调节性T细胞的增加。这些细胞产生白介素(IL)-10和转化生长因子(TGF)-β,并具有潜力去抑制局部Th2细胞反应和重定向抗体种类转换,偏向IgG4(IL10同种型转换因子)和IgA(TGF-β同种型转换因子)。过敏原特异性IgG4抗体阻断对Th2细胞的过敏原呈递,另外阻断过敏原诱导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞的活化,从而显著地减弱过敏反应。
尽管基于抗原的免疫疗法可能是有效的,但是仍然存在严重的问题以及与IgE介导过敏性疾病的AIT有关的未满足的需求。首先,AIT的所有注射都要在诊所内进行,因为诱发过敏反应有轻微风险,若未及时且适当地治疗会变得严重甚至威胁生命。其次,仅只有少数过敏原产品已经在临床上证实可通过AIT进行疾病改善。第三,只有少数特定过敏原的结构已经被描述,且过敏原的定义主要是基于在易感个体中能够引发IgE反应的功能性标准。因此,过敏原通常由个别患者的免疫系统所定义,因此,即使大多数过敏症患者具有对相对有限数量的主要过敏原具特异性的IgE抗体,任何免疫原性蛋白质(抗原)都具有可诱致过敏症的潜能。第四,每个患者对过敏原分子和表位都有独特的致敏化作用模式。第五,所有市售的过敏原产品都是利用衍生自天然原料(例如:花粉、室尘螨培养物、动物毛发和/或皮屑,或昆虫毒液)的过敏症诱发物质的水溶液萃取而制造的,且此类天然原料在组成上是本质可变的。因此,用于AIT的过敏原产品不是通用的,且于其组成、IgE结合能力和制造商之间的质量控管程度具有差异性。没有生效的国际标准。这意味着来自不同制造商的产品在患者中的效果可能不同,因此临床结果不能直接地从一种过敏原产品推断至另一种过敏原产品。
最新研究回顾以过敏原为基础的免疫治疗:过敏治疗的未来(Drug DiscoveryToday Volume 21,Issue 1,January2016,Pages 26-37)通过引用包括于本文中。其中所有支持性文件可以在此背景部分所作的声明中发现。
除了AIT之外,于IgE介导过敏性疾病治疗中已经研究了IgE分子的治疗靶点。
在IgE介导过敏性疾病治疗中已经显示利用抗IgE单克隆抗体的血清可溶性IgE的治疗靶点是有效的。目前,Omalizumab(一种重组人源化单克隆抗体)已经被批准用于治疗成年人和青少年中度至重度持续性过敏性气喘。Omalizumab通过与循环的,未结合的游离IgE结合而阻止过敏级联,并预防其与免疫效应细胞表面上的IgE FcεRI结合。利用Omalizumab的治疗导致游离IgE水平的显著降低和细胞IgE受体的向下调节(Chang et al,2007)。虽然利用Omalizumab的治疗已被证明是有效的,但也有其局限性。具体而言,Omalizumab可中和血清中的游离IgE,但不影响IgE的产生。因此,必须频繁且长期地投予Omalizumab以维持足够的血清IgE抑制。
也已经研究了膜结合型IgE的细胞外膜近侧结构域(IgE EMPD)的治疗靶点,以治疗IgE介导过敏性疾病。在缺乏额外共刺激信号的情况下的B细胞受体(BCR)交联可导致B细胞凋亡。对于未成熟B细胞,通过BCR交联的B细胞凋亡耗竭已经被广泛描述以作为一种机制,藉其将自体反应性B细胞由B细胞库中移除。已经显示抗IgE EMPD单克隆抗体(例如47H4(Brightbill et al.2010)、4B12和26H2(Chen et al.2010))可交联IgE BCR并引起表达mIgE的B细胞凋亡(图2)。Brightbill等人还发现于体内的47H4治疗性递送可减少已确立的IgE反应,此结果如同在巴西诺卡氏菌感染和过敏性气喘模型中所观察到的结果(Chen etal.2010)。为了耗竭IgE谱系B细胞以降低血清IgE,已经研究和鉴定了一些靶向IgE-EMPD的抗体和表位,尤其是在额外52个氨基酸的长形式区域内(Chen et al.2010,Chang etal.2015,Chen et al.2002)。一个团队指出使用B型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)作为载体携带作为插入物的IgE EMPD片段,以于BALB/c小鼠中诱导特异性IgE EMPD抗体反应。此克隆构建体自发性地组装成类病毒颗粒(VPLs),其于VPLs的刺突蛋白(spike)顶端呈递各种IgEEMPD片段,以获得免疫原性。藉由利用纯化的小鼠脾脏NK细胞作为效应细胞,从接受免疫的小鼠的血清纯化出来的IgG抗体可通过BCR依赖型凋亡蛋白酶途径引起表达mIgE.FcL的Ramos细胞的细胞凋亡,以及于表达mIgE.FcL的A20细胞引起抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)(Lin,et al.2012)。上述方法已引起了过敏治疗疫苗开发的一些兴趣。然而,抗原表达系统是低效的,产生大多数靶向载体VLPs的抗体,且抗原和递送系统远不适用于用于工业和临床用途的有效疫苗的开发。
鉴于上述情况,需要开发用以治疗和/或预防IgE介导过敏性疾病的免疫治疗方法,其与过敏原无关,能够引发针对IgE的高度特异性免疫反应,易施用于患者,能够根据严格的优良药品制造作业标准(GMP)加以制造,并且在全世界的应用中具有成本效益,以取代实行百年历史的AIT。
参考文献:
1.LARSEN,J.N.,et al.“Allergy Immunotherapy:The Future of AllergyTreatment”,Drug Discovery Today,1:26-37(2016).
2.PENG,C.,et al.“A New Isoform of Human Membrane-Bound IgE”,J.Immunol.148:129-136(1992).
3.ZHANG,K.,et al.“Two unusual forms of human immunoglobulin E encodedby alternative RNA splicing of epsilon heavy chain membrane exons”,J.Exp.Med.,176:233-243(1992).
4.CHEN,J.B.,et al.“Unique epitopes on CεmX in IgE-B cell receptorsare potentially applicable for targeting IgE-committed B cells”,J.Immunol,184:1748-1756(2010).
5.LIN,C.J.,et al.“Cεm X peptide-carrying HBcAg virus-like particlesinduced antibodies that down-regulate mIgE-B lymphocytes”,Mol.Immunol.,52:190-199(2012).
6.CHANG,T.W.,et al.“C(Epsilon)m X Peptides for Inducing ImmuneResponses to Human mIgE on B Lymphocytes”,US Patent No.8,974,794 B2(2015).
7.CHEN,H.Y.,et al.“Monoclonal Antibodies against the CεmX Domain ofHuman Membrane-Bound IgE and Their Potential Use for Targeting IgE-ExpressingB Cells”,Immunol.,128:315-324.(2002).
8.BRIGHTBILL,H.D.,et al.“Antibodies specific for a segment of humanmembrane IgE deplete IgE-producing B cells in humanized mice”,J Clin.Invest.,120:2218-2229(2010).
9.LU,C.S.,et al.“Generating allergen-specific human IgEs forimmunoassays by employing humanεgene knockin mice”,Allergy,70:384-390(2015).
10.WU,P.C.,et al.“The IgE gene in primates exhibits extraordinaryevolutionary diversity”,Immunogenetics,64:279-287(2012).
11.CHANG,T.W.,et al.“Anti-IgE Antibodies for the Treatment of IgE-Mediated Allergic Diseases”,Advances in Immunology,93:63-119(2007).
12.TRAGGIAI,E.,et al.“An efficient method to make human monoclonalantibodies from memory Bcells:potent neutralization of SARS coronavirus”,Nature Medicine,10:871-875(2004).
13.“Asthma Fact Sheet”World Health Organization website,websiteaddress:www.who.int/mediacentre/factsheets/fs307/en/index.html(accessedAugust 18,2017).
14.“2016Appen dix to GINA Report”Global Initiative For Asthmawebsite,website address:ginasthma.org/wp-content/uploads/2016/04/GINA-Appendix-2016-final.pdf(accessed August 18,2017).
15.“Allergy”Wikipedia,The Free Encyclopedia,website address:en.wikipedia.org/wiki/Allergy(accessed August18,2017).
16.website:en.wikipedia.org/wiki/Allergen)
发明概述
本公开关于靶向膜结合型IgE的细胞外膜近侧结构域(IgE EMPD)的个别肽免疫原构建体,其用以治疗和/或预防IgE介导过敏性疾病。本公开也关于包含此肽免疫原构建体的组合物、制备和使用此肽免疫原构建体的方法,以及利用此肽免疫原构建体产生的抗体。
公开的肽免疫原构建体包含约20个或更多个氨基酸。此肽免疫原构建体包含来自全长IgE EMPD(SEQ ID NO:1)的67个氨基酸序列的B细胞表位。此B细胞表位可通过任选的异源性间隔子连接至衍生自病原体蛋白的异源性T辅助细胞(Th)表位。公开的肽免疫原构建体可刺激针对IgE EMPD的高特异性抗体的产生,且此抗体可结合至重组含有IgE EMPD的蛋白质、在带有mIgE的B细胞上的IgE EMPD,和/或包含人类IgG1的Fc部分的重组可溶性IgEEMPD蛋白,以及人类膜结合型IgE的IgE EMPD(称为“γ1-em67”)。公开的肽免疫原构建体对IgE介导过敏性疾病的全球患者可作为与过敏原无关的、具有成本效益的、通用的免疫疗法。
肽免疫原构建体的B细胞表位部份具有来自全长IgE EMPD序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。在一些实施方案中,依据全长IgE EMPD序列(SEQ ID NO:1)的编号,B细胞表位具有包含由内源性半胱氨酸(C18-C39)所形成的内部的分子内环状结构的序列。在某些具体实施方案中,B细胞表位具有IgE EMPD-1-39(SEQ ID NO:5)、IgE EMPD-7-40(SEQ ID NO:6)、IgE EMPD-19-38(SEQ ID NO:8)或IgE EMPD-1-40(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列。
本公开的肽免疫原构建体可含有衍生自病原体蛋白的异源性Th表位氨基酸序列(例如:SEQ ID NO:59至87)。在某些实施方案中,异源性Th表位衍生自自然界的病原体,例如:白喉毒素(SEQ ID NO:63)、恶性疟原虫(SEQ ID NO:64)、霍乱毒素(SEQ ID NO:66)。在其他实施方案中,异源性Th表位为以单一序列或组合序列(例如SEQ ID NO:70、69和71)形式存在的衍生自麻疹病毒融合蛋白(MVF 1至5)或B型肝炎表面抗原(HBsAg 1至3)的理想化人工Th表位。
在一些实施方案中,肽免疫原构建体包含来自IgE EMPD的B细胞表位,其通过任选的异源性间隔子连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。在某些实施方案中,肽免疫原构建体包含来自IgE EMPD-1-40(SEQ ID NO:9)具有超过约20个氨基酸的B细胞抗原决定部位,其通过任选的异源性间隔子连接至衍生自病原体蛋白的异源性Th表位(例如:SEQ ID NOs:59至87)。在一些实施方案中,任选的异源性间隔子为能够将两个氨基酸和/或肽连接在一起的分子或化学结构。在某些实施方案中,间隔子是天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或其组合。在具体实施方案中,肽免疫原构建体具有SEQ ID NO:88-95、98-124和130的氨基酸序列。
本公开也关于包含IgE EMPD肽免疫原构建体的组合物。在一些实施方案中,公开的组合物包含超过一个的IgE EMPD肽免疫原构建体。在某些实施方案中,组合物包含IgEEMPD G1-C39肽免疫原构建体的混合物(例如:SEQ ID NO:88-95、98-124和130的任意组合),以涵盖患者的广泛遗传背景。相较于只包含单一肽免疫原构建体的组合物,包含肽免疫原构建体混合物的组合物在疫苗免疫接种后可导致较高百分比的反应率,以治疗IgE介导过敏性疾病。
本公开也关于用以治疗和/或预防IgE介导过敏性疾病的医药组合物,包含疫苗剂型。在一些实施方案中,医药组合物包含公开的肽免疫原构建体,肽免疫原构建体是以稳定化的免疫刺激复合物形式存在,此形式是藉由混合CpG寡聚合物和包含肽免疫原复合物的组合物以通过静电结合所形成。这种稳定化的免疫刺激复合物可进一步增强肽免疫原构建体的免疫原性。在一些实施方案中,医药组合物包含佐剂,例如矿物盐,其包括明矾凝胶(ALHYDROGEL)、磷酸铝(ADJUPHOS),或包括MONTANIDEISA 51或720的油包水乳液。
本公开也关于针对公开的IgE EMPD肽免疫原构建体的抗体。具体而言,当投予受试者时,本公开的肽免疫原构建体可刺激高特异性抗体的产生,此抗体可与IgE EMPD-1-52氨基酸序列(SEQ ID NO:2)、IgE EMPD 1-67氨基酸序列(SEQ ID NO:1)及其片段(例如SEQID NO:5和6)交叉反应。利用肽免疫原构建体制造的高特异性抗体可与重组含有IgE EMPD的蛋白质,γ1-em67,和/或带有膜结合型IgE的B细胞上的IgE EMPD交叉反应。公开的抗体利用高特异性结合至IgE EMPD,而没有多少(如果有的话)针对用于免疫原性增强的异源性Th表位,此与使用用于肽抗原性增强的常规蛋白或其他生物载体所制造的抗体形成鲜明对比。
本公开也包括利用公开的肽免疫原构建体和/或针对肽免疫原构建体的抗体以治疗和/或预防IgE介导过敏性疾病的方法。在一些实施方案中,用以治疗和/或预防IgE介导过敏性疾病的方法包含将包含公开的肽免疫原构建体的组合物投予宿主。在某些实施方案中,此方法所使用的组合物包含公开的肽免疫原构建体,此肽免疫原构建体是以稳定化的免疫刺激复合物形式存在,此稳定化的免疫刺激复合物是利用带负电的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)通过静电结合所形成,其可与进一步补充的佐剂(任选为矿物盐或油类以作为佐剂)复合,用以投予IgE介导过敏性疾病患者。公开的方法也包括将肽免疫原构建体投予具有IgE介导过敏性疾病风险或已患病的宿主的给药方案、剂型和途径。
附图说明
图1是描述IgE介导过敏性疾病途径机制的图示。初始的成熟B细胞始于表达膜结合型IgE(mIgE)。在遇到过敏原后,利用同源T辅助(TH)细胞的协助,其提供B细胞必需的共刺激信号和细胞因子,使这些细胞变得活化。藉由多种细胞因子(例如IL-4和IL-13)的协助,活化的过敏原特异性B细胞通过种类转换重组(class-switching recombination)转变成表达mIgE的IgE定向B细胞(IgE-committed B cell)。那些IgE定向B细胞最终分化成分泌IgE的浆细胞。大多数分泌IgE的浆细胞是短命的且在移动至炎症部位后死亡;然而,一些长寿细胞移动到骨髓中相对应的微环境。从浆细胞分泌的过敏原特异性IgE结合至位于血液嗜碱性粒细胞和组织肥大细胞表面上的高亲和性IgE.Fc受体(FcεRI)。由过敏原所引起与FcgRI结合的IgE的聚集刺激嗜碱性粒细胞或肥大细胞去颗粒作用,并释放媒介物(例如组织胺、白三烯素、PGD 2、类胰蛋白酶和各种细胞因子),其引发立即过敏反应,并促进各种细胞类型(例如TH2细胞和嗜酸性粒细胞)的动员。
图2A和2B是显示分泌型IgE和膜结合型IgE(mIgE)之间的结构差异以及通过靶向IgE EMPD耗竭mIgE B细胞的基本原理的图示。图2A显示IgE以两种形式表达:分泌型IgE和膜结合型IgE(mIgE)。分泌型IgE通过FcεRI被捕获在嗜碱性粒细胞和肥大细胞的细胞表面上,而mIgE仅存在于IgE定向B细胞上作为B细胞受体的一部分。mIgE的细胞外膜近侧结构域(EMPD)是仅在mIgE B细胞上发现的位于CH4结构域和跨膜区域之间的67个氨基酸肽片段(SEQ ID NO:1)。画有底线的氨基酸代表在EMPD短的同种型中发现的残基。IgE EMPD的独特性为靶向mIgE和mIgE B细胞提供了有吸引力的位点。图2B显示通过靶向IgE EMPD耗竭mIgEB细胞的机制,其在mIgE B细胞分化成新的分泌IgE的浆细胞之前造成过敏原特异性IgE产生的抑制。寿命有限的现有分泌IgE的浆细胞最终会相继死去,导致总IgE和过敏原特异性IgE逐渐下降。
图3为识别了根据本文公开的特定实施方案的疫苗剂型从发现到商业化(工业化)的发展过程流程图。如于此图所总结,本公开包括肽免疫原设计、肽组合物设计、疫苗剂型设计、体外功能上的抗原性研究设计、体内免疫原性和功效研究设计,以及临床试验计划书设计。每个步骤的详细评估和分析导向一系列实验,其导致安全且有效的疫苗剂型的商业化。
图4是说明在利用不同IgE EMPD肽免疫原构建体(SEQ ID NO:88至94、96和97)免疫的豚鼠中在8周期间的抗体反应动力学的曲线图。利用10倍连续稀释将血清从1∶100稀释至1∶100000。利用每孔洞0.5μg肽量的IgE EMPD 1-39肽(SEQ ID NO:5)涂覆ELISA盘。利用A450阀值设为0.5的A450的线性回归分析计算测试血清的效价,以Log10表示。
图5是说明利用不同IgE EMPD免疫原构建体(SEQ ID NO:88至94、96和97)所产生多种纯化的多克隆抗IgE EMPD抗体的滴定曲线的曲线图。利用重组含有IgE EMPD(SEQ IDNO:1)的蛋白质,γ1-em67(SEQ ID NO:1),涂覆ELISA盘。将通过蛋白质A层析从豚鼠血清纯化的多克隆抗IgE EMPD抗体利用4倍连续稀释从100μg/mL稀释至0.0238ng/mL。利用4-参数逻辑曲线拟合的非线性回归计算每种多克隆抗IgE EMPD抗体的EC50,以免疫原构建体SEQID No:89和93显示最佳结合效率。
图6A至6C包含说明来自利用IgE EMPD免疫原构建体免疫动物的汇集的豚鼠血清的纯化多克隆抗体对表达mIgE.FcL(左侧)或mIgE.Fcs(右侧)的Ramos细胞系细胞的结合的流式细胞柱状图(flow cytometry histograms)。利用蛋白质A层析从豚鼠血清纯化的多克隆抗IgE EMPD抗体的使用浓度为10μg/mL,相较于具有大小小于20个氨基酸残基的IgEEMPD B细胞表位肽的免疫原构建体96和97,具有从88至94的SEQ ID NO的免疫原构建体显示对mIgE.FcL B细胞相当的结合。图6A包含来自针对IgE EMPD免疫原构建体SEQ ID NO:88至90的多克隆抗体的柱状图。图6B包含来自针对IgE EMPD免疫原构建体SEQ ID NO:91至93的多克隆抗体的柱状图。图6C包含来自针对IgE EMPD免疫原构建体SEQ ID NO:94、96和97的多克隆抗体的柱状图。
图7为显示利用针对IgE EMPD免疫原构建体(SEQ ID NO:88至93)的各种多克隆抗IgE EMPD抗体所引发表达mIgE.FcL的之Ramos细胞的细胞凋亡图式。利用%膜联蛋白(Annexin)V+/PI-表示细胞凋亡的水平。将通过蛋白质A层析从豚鼠血清纯化的多克隆抗IgEEMPD抗体利用2倍连续稀释从1000稀释至62.5ng/mL。使用人源化抗IgE单克隆抗体作为阳性对照。将每组多克隆抗IgE EMPD抗体的EC50显示于图的下方,其是利用4-参数逻辑罗吉特曲线拟合的非线性回归所计算,以具有88、90和93序列辨识编号的SEQID NO的免疫原构建体显示引发mIgE.FcL B细胞细胞凋亡的最佳效力。
图8为显示以数值为1/30的效应细胞/目标细胞比率利用针对IgE EMPD免疫原构建体(SEQ ID NO:88至93)的多克隆抗IgE EMPD抗体所引发表达mIgE.FcL的Ramos细胞的抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)的直方图。以10μg/mL的浓度使用通过蛋白质A层析从豚鼠血清纯化的多克隆抗IgE EMPD抗体。将IL-2刺激的小鼠脾脏细胞作为效应细胞,而小鼠抗IgE单克隆抗体5D5作为阳性对照。
图9是说明用于精细特异性分析的表位鉴定的图式,其利用来自豚鼠的免疫血清使用涵盖IgE EMPD的氨基酸9-50的重叠的10-mer肽以ELISA进行分析。被血清样品中的抗体所辨识的主要表位对代表IgE EMPD的环状结构区域具有特异性。此图式说明由天然IgEEMPD中的氨基酸C18和C39之间的分子内双硫键所形成的内部环状结构。将血清以1∶1000比例稀释以用于表位鉴定。利用10-mer肽(每个孔洞0.5μg肽)涂覆ELISA盘。通过使用从先前利用具有SEQ ID NO:88、89、93、96和97的免疫原构建体免疫的豚鼠中所收集的免疫血清样品进行表位鉴定研究以识别出反应位点,并相应地进行标记。
图10是说明在利用本公开肽免疫原构建体免疫接种之后用以评估木瓜蛋白酶引发的初级和次级免疫反应的实验设计图式。在第0、3和5周利用IgE EMPD肽免疫原构建体肌肉内(im)免疫接种人类IGHE敲入杂交小鼠三次。在初级IgE反应模型中,在第10周利用木瓜蛋白酶/TiterMax Gold以皮下注射(sc)方式对小鼠进行攻毒,并于第12周测定木瓜蛋白酶特异性人类IgE(hIgE)(如图13所示)。在次级IgE反应中,在第16周再次利用木瓜蛋白酶/TiterMax Gold以皮下注射方式对小鼠进行攻毒,并于第18周测定木瓜蛋白酶特异性人类IgE(hIgE)(如图14所示)。在整个研究中,针对抗IgE抗体产生(图11)和血清IgE变化(图12)也测试了接受免疫接种的小鼠的血清。
图11是说明利用图10所述的实验设计在20周期间内抗IgE抗体产生动力学的图形。具体而言,此图形显示于人类IGHE敲入杂交小鼠(hIGHE x Balb/c,每组别n=8)中的抗体反应,其于第0、3和5周以指定剂量(每次免疫接种100μL)利用IgE EMPD免疫原构建体(SEQ ID NO:88或93)肌肉内免疫接种三次,并在第10和16周利用木瓜蛋白酶/TiterMax以皮下注射方式进行攻毒。利用4倍连续稀释将小鼠血清从1∶100稀释至1∶(4.19×108)。利用重组含有IgE EMPD的蛋白质γ1-em67涂覆ELISA盘。利用4-参数逻辑曲线拟合的非线性回归计算测试血清的效价,以稀释因子的Log(EC50)表示。
图12是说明利用图10所述的实验设计在20周期间内血清IgE变化的图形。具体而言,此图形显示于人类IGHE敲入杂交小鼠(hIGHE x Balb/c,每组别n=8)中的血清IgE水平,其于第0、3和5周以指定剂量(每次免疫接种100μL)利用IgE EMPD免疫原构建体(SEQ IDNO:88或93)肌肉内免疫接种三次,并在第10和16周利用木瓜蛋白酶/TiterMax以皮下注射方式进行攻毒。在人类IgE(hIgE)定量ELISA中测定血清IgE。以1∶20比例稀释小鼠血清。使用从U266骨髓瘤细胞纯化的hIgE产生标准曲线。通过将A450内插至利用4-参数逻辑曲线拟合通过非线性回归所产生的标准曲线中来计算IgE浓度。
图13是显示利用图10所述的实验设计在第12周所测定在初级IgE反应中木瓜蛋白酶特异性人类IgE(hIgE)产生的抑制的图形。具体而言,于第0、3和5周以指定剂量(每次免疫接种100μL)利用IgE EMPD免疫原构建体(SEQ ID NO:88或93)肌肉内免疫接种人类IGHE敲入杂交小鼠(hIGHE x Balb/c,每组别n=8)三次。在定量ELISA中测定血清木瓜蛋白酶特异性hIgE。以1∶10比例稀释小鼠血清。使用单克隆嵌合木瓜蛋白酶特异性hIgE产生标准曲线。通过将A450内插至利用4-参数逻辑曲线拟合通过非线性回归所产生的标准曲线中来计算木瓜蛋白酶特异性hIgE浓度。
图14是显示利用图10所述的实验设计在第18周所测定在次级IgE反应中木瓜蛋白酶特异性人类IgE(hIgE)产生的抑制的图形。具体而言,于第0、3和5周以指定剂量(每次免疫接种100μL)利用IgE EMPD免疫原构建体(SEQ ID NO:88或93)肌肉内免疫接种人类IGHE敲入杂交小鼠(hIGHE x Balb/c,每组别n=8)三次。在定量ELISA中测定血清木瓜蛋白酶特异性hIgE。以1∶10比例稀释小鼠血清。使用单克隆嵌合木瓜蛋白酶特异性hIgE产生标准曲线。通过将A450内插至利用4-参数逻辑曲线拟合通过非线性回归所产生的标准曲线中来计算木瓜蛋白酶特异性hIgE浓度。
图15是说明用以评估在利用本公开肽免疫原构建体免疫接种后的木瓜蛋白酶引发的致敏化作用和回忆免疫反应的实验设计示意图。先在第0周利用木瓜蛋白酶/TiterMaxGold皮下(sc)致敏人类IGHE敲入杂交小鼠,然后于第3、6和8周利用IgE EMPD肽免疫原构建体进行肌肉内免疫接种三次。在第12周利用配制于PBS溶液中的木瓜蛋白酶通过皮内的足垫注射引发木瓜蛋白酶特异性免疫回忆反应。在实验的第0至6周之间评估总IgE和木瓜蛋白酶特异性IgE/IgG的水平(图16),并在第12、13和14周评估木瓜蛋白酶特异性IgE水平(图17)。
图16包含显示利用图15所述的实验设计以木瓜蛋白酶致敏所有人类IGHE敲入杂交小鼠的结果图形。木瓜蛋白酶特异性小鼠IgG效价以Log(EC50)表示,并检测6周期间内的人类IgE(ng/mL)。此外,由于旁观者活化(bystander activation)造成总IgE水平(ng/mL)增加。
图17是显示利用图15所述的实验设计在第12、13和14周所测定木瓜蛋白酶特异性人类IgE(hIgE)产生的抑制的图形。具体而言,图形显示在于第3、6和8周三次利用剂量为400μg/mL(每次免疫接种100μL)的SEQ ID NO:88或93进行肌肉内免疫接种的致敏化的人类IGHE敲入杂交小鼠(hIGHE x Balb/c,每组别n=8)中的木瓜蛋白酶特异性回忆反应。在定量ELISA中测定血清木瓜蛋白酶特异性hIgE。以1∶10比例稀释小鼠血清。使用单克隆嵌合木瓜蛋白酶特异性hIgE(ng/mL)产生标准曲线。通过将A450内插至利用4-参数逻辑曲线拟合通过非线性回归所产生的标准曲线中来计算木瓜蛋白酶特异性hIgE浓度。
图18A和18B是显示以指定剂量在于第0、3和6周利用每剂量为30、100、300和1000μg的四种剂量的IgE EMPD免疫原构建体(SEQ ID NO:88)加上安慰剂对照剂型免疫的食蟹猴中原型免疫治疗过敏疫苗剂型的免疫原性并利用ELISA评估抗IgE EMPD效价的图形。图18A显示于利用含有MontanideTM ISA 51和CpG ODN的剂型免疫的食蟹猴中的抗体反应。图18B显示于利用含有ADJUPHOS和CpG ODN的剂型免疫的食蟹猴中的抗体反应。
图19是说明在于第0、3和6周利用剂量为300μg/mL(每次免疫接种500μL)的免疫原构建体(SEQ ID NO:125或126)肌肉内免疫接种3次的食蟹猴(每组别2只雄性和2只雌性)中在20周期间内抗体反应动力学的图形。利用4倍连续稀释将食蟹猴血清从1∶100稀释至1∶(4.19×108)。利用SEQ ID NO:5涂覆ELISA盘。利用4-参数逻辑曲线拟合的非线性回归计算测试血清的效价,以稀释因子的Log10表示。将阀值设定为1∶100稀释的所有血清样品的平均A450的2倍。
图20是说明在于第0、3和6周利用剂量为300μg/mL(每次免疫接种500μL)的IgEEMPD免疫原构建体(SEQ ID NO:125或126)肌肉内免疫接种3次的食蟹猴(每组别2只雄性和2只雌性)中在20周期间内IgG、IgA和IgM抗体反应的动力学。利用4倍连续稀释将食蟹猴血清从1∶100稀释至1∶(4.19×108)。利用IgE EMPD 1-39肽(SEQ ID NO:5)涂覆ELISA盘。通过将阀值内插至由每一测试血清数据所产生的4-参数逻辑曲线中来计算效价,以Log10表示。将阀值设定为1∶100稀释的所有血清样品的平均A450的2倍。
图21是说明在于第0、3和6周利用剂量为300μg/mL(每次免疫接种500μL)的IgEEMPD免疫原构建体(SEQ ID NO:125或126)肌肉内免疫接种3次的食蟹猴(每组别2只雄性和2只雌性)中在20周期间内血清IgE水平变化的图形。在食蟹猴IgE定量ELISA中测定血清IgE水平。以1∶20比例稀释食蟹猴血清。使用食蟹猴IgE产生标准曲线。通过将A450内捅至利用4-参数逻辑曲线拟合通过非线性回归所产生的标准曲线中来计算IgE浓度。结果为平均值±标准偏差。使用具有双尾假设的成对t检定来鉴定对比第0周的统计学上差异:*P<0.05,**P<0.01和***P<0.001。
发明详述
本公开关于靶向膜结合型IgE的细胞外膜近侧结构域(EMPD)(或称IgE EMPD)的肽免疫原构建体。本公开也关于包含此肽免疫原构建体的组合物、制备和使用此肽免疫原构建体的方法,以及利用此肽免疫原构建体免疫的宿主所产生的抗体。
公开的肽免疫原构建体包含约20个或更多个氨基酸。此肽免疫原构建体包含来自全长IgE EMPD(SEQ ID NO:1)的67个氨基酸序列的B细胞表位。此B细胞表位可通过任选的异源性间隔子连接至衍生自病原体蛋白的异源性T辅助细胞(Th)表位。公开的肽免疫原构建体可刺激针对IgE EMPD的高特异性抗体的产生,且可结合至重组含有IgE EMPD的蛋白质γ1-em67,和/或带有mIgE的B细胞上的IgE EMPD。公开的肽免疫原构建体对IgE介导过敏性疾病的全球患者可作为与过敏原无关的、具有成本效益的、通用的免疫疗法。
肽免疫原构建体的B细胞表位部份具有来自全长IgE EMPD序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。在一些实施方案中,依据全长IgE EMPD序列(SEQ ID NO:1)的编号,B细胞表位具有包含由内源性半胱氨酸(C18-C39)所形成的内部的分子内环状结构的序列。在某些具体实施方案中,B细胞表位具有IgE EMPD-1-39(SEQ ID NO:5)、IgE EMPD-7-40(SEQ ID NO:6)、IgE EMPD-19-38(SEQ ID NO:8)或IgE EMPD-1-40(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列。
本公开的肽免疫原构建体可含有衍生自病原体蛋白的异源性Th表位氨基酸序列(例如SEQ ID NO:59至87)。在某些实施方案中,异源性Th表位衍生自自然界的病原体,例如:白喉毒素(SEQ ID NO:63)、恶性疟原虫(SEQ ID NO:64)、霍乱毒素(SEQ ID NO:66)。在其他实施方案中,异源性Th表位为以单一序列(例如SEQ ID NO:60、67、72和73)或组合序列(例如SEQ ID NO:70、69和71)形式的衍生自麻疹病毒融合蛋白(MVF 1至5)或B型肝炎表面抗原(HBsAg 1至3)的理想化人工Th表位。
在一些实施方案中,肽免疫原构建体包含来自IgE EMPD的B细胞表位,其通过任选的异源性间隔子连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。任选的异源性间隔子为能够将两个氨基酸和/或肽连接在一起的分子或化学结构。在某些实施方案中,间隔子是天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸或其组合。
在某些实施方案中,肽免疫原构建体包含来自IgE EMPD-1-40(SEQ ID NO:9)具有超过约20个氨基酸的B细胞抗原性位点,其通过任选的异源性间隔子连接至衍生自病原体蛋白的异源性Th表位(例如SEQ ID NO:59至87)。在具体实施方案中,肽免疫原构建体具有SEQ ID NO:88-95、98-124和130的氨基酸序列。
本公开也关于包含IgE EMPD肽免疫原构建体的组合物。在一些实施方案中,公开的组合物包含超过一个的IgE EMPD肽免疫原构建体。在某些实施方案中,组合物包含肽免疫原构建体的混合物,其包含连接至不同Th表位的IgEEMPD-1-39的B细胞表位部份(例如SEQ ID NO:98-124的任意组合),以涵盖患者的广泛遗传背景。相较于只包含单一肽免疫原构建体的组合物,包含肽免疫原构建体混合物的组合物在疫苗免疫接种后可导致较高百分比的反应率,以治疗IgE介导过敏性疾病。
本公开也关于用以治疗和/或预防IgE介导过敏性疾病的医药组合物,包含疫苗剂型。在一些实施方案中,医药组合物包含公开的肽免疫原构建体,肽免疫原构建体是以稳定化的免疫刺激复合物形式存在,此形式是藉由混合CpG寡聚合物和包含肽免疫原复合物的组合物以通过静电结合所形成。这种稳定化的免疫刺激复合物可进一步增强肽免疫原构建体的免疫原性。在一些实施方案中,医药组合物包含佐剂,例如矿物盐,其包括明矾凝胶(ALHYDROGEL)、磷酸铝(ADJUPHOS),或包括MONTANIDE ISA 51或720的油包水乳液。
本公开也关于针对公开的IgE EMPD肽免疫原构建体的抗体。具体而言,本公开的肽免疫原构建体可刺激高特异性抗体的产生,此抗体可与肽免疫原构建体的IgE EMPD B细胞表位部份交叉反应。公开的抗体以高特异性结合至IgE EMPD,而没有多少(如果有的话)针对用于免疫原性增强的异源性Th表位,此与使用用于肽免原性增强的常规蛋白或其他生物载体所制造的抗体形成鲜明对比。因此,相较于其他肽或蛋白质免疫原,公开的肽免疫原构建体可破坏针对自体抗原的免疫耐受,具有高反应率。
在某些实施方案中,当将肽免疫原构建体投予受试者时,抗体针对且特异性地结合至IgE EMPD-1-52氨基酸序列(SEQ ID NO:2)、IgE EMPD-1-67氨基酸序列(SEQ ID NO:1)及其片段(例如SEQ ID NOs:5和6)。利用肽免疫原构建体制造的高特异性抗体可与可溶性包含IgE EMPD的肽和蛋白质、包含IgE EMPD的融合肽和蛋白质、γ1-em67和/或带有膜结合型IgE之B细胞上的IgE EMPD交叉反应。产生的抗体能够与表达mIgE之B淋巴细胞上的IgE B细胞受体(BCR)结合并交联。此种交联可诱导细胞溶解效应,例如细胞凋亡和抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC),其造成血清IgE产量的降低。
基于其独特的特征和性质,公开的抗体能够提供通用的免疫治疗方法以治疗IgE介导过敏性疾病,而无需考虑致病过敏原种类。
本公开也关于制备公开的肽免疫原构建体、组合物和抗体的方法。公开的方法提供了肽免疫原构建体和含有此构建之组合物的低成本制造和质量控管,其可用于治疗IgE介导过敏性疾病的方法,而无需考虑致病过敏原种类。
本公开也包括用以治疗和/或预防IgE介导过敏性疾病的方法,而无需考虑致病过敏原种类,其使用公开的肽免疫原构建体和/或针对此肽免疫原构建体的抗体。在一些实施方案中,用以治疗和/或预防IgE介导过敏性疾病的方法包含将包含公开的肽免疫原构建体的组合物投予宿主。在某些实施方案中,此方法中所使用的组合物包含公开的肽免疫原构建体,此肽免疫原构建体是以稳定的免疫刺激复合物形式存在,此稳定化的免疫刺激复合物是利用带负电的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)通过静电结合所形成,其可进一步补充佐剂,用以投予IgE介导过敏性疾病患者。公开的方法也包括将肽免疫原构建体投予具有IgE介导过敏性疾病风险或已患病的宿主的给药方案、剂型和途径。
本文使用的章节标题仅用于组织的目的,不应被理解为限制所述主题。本申请中引用的所有参考文献或参考文献的部分出于任何目的在此通过引用明确地将整体并入本文。
除非特别说明,在此使用的所有技术和科学用语如本发明所属技术领域中具有通常知识者的通常理解具有相同意义。除非上下文清楚地指出,否则单数术语“一个”、“一种”和“该”包含复数形式。类似地,单词“或”是意指包括“和”,除非上下文另有明确说明。因此,“包含A或B”是指包括A,或B,或A和B。更应被理解的是,用于给定多肽的所有的氨基酸大小和所有分子量或分子质量值是近似的,并且被提供作为描述之用。然而类似或等同于在此描述者的方法和材料可被用于以下所述的公开的方法、合适的方法和材料的实践或测试中。在此提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入本文。在冲突的情况下,以本说明书(包括术语的解释)为准。此外,在此公开的材料、方法和实施方案仅是说明性的而非意指加以限制。
IgE EMPD肽免疫原构建体
本公开提供肽免疫原构建体,其包含具有来自IgE EMPD的氨基酸序列的B细胞表位,B细胞表位直接地或是通过任选的异源性间隔子共价连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。
本文使用术语“IgE EMPD肽免疫原构建体”或“肽免疫原构建体”是指包含(a)来自全长IgE EMPD(SEQ ID NO:1)的67个氨基酸序列的具有约20或更多氨基酸残基的B细胞表位;(b)异源性Th表位;以及(c)任选的异源性间隔子的肽。
在某些实施方案中,IgE EMPD肽免疫原构建体可以通过以下式表示:
(Th)m-(A)n-(IgE EMPD片段)-X
或
(IgE EMPD片段)-(A)n-(Th)m-X
或
(Th)m-(A)n-(IgE EMPD片段)-(A)n-(Th)m-X
其中
Th为异源性T辅助细胞表位;
A为异源性间隔子;
(IgE EMPD片段)为来自IgE EMPD具有约20至约40个氨基酸残基的B细胞表位;
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2;
m为1至约4;以及
n为0至约10。
基于许多基本原理设计和选择本公开的IgE EMPD肽免疫原构建体。其中几个基本原理包括使用IgE EMPD肽免疫原构建体:
i.本身为非免疫原性,因为其为自身分子;
ii.可通过蛋白质载体或有效的T辅助细胞表位以呈现免疫原性;
iii.当呈现免疫原性并投予宿主时:
a.引发针对IgE EMPD肽序列(B细胞表位)的高效价抗体,而非针对蛋白质载体或T辅助细胞表位;
b.于接受免疫的宿主中破坏免疫耐受,并产生可与IgE EMPD(SEQ ID NO:1)交叉反应的高特异性抗体,此IgE EMPD是由表达mI gE.FcL的CHO细胞纯化而来的重组蛋白,或是位于利用编码mIgE.FcL的重组DNA转染的带有mIgE的B细胞(例如Ramos)细胞膜上;
c.在体外产生高特异性抗体,其能够诱导表达IgE的B淋巴细胞的抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)和细胞凋亡(实施例6);以及
d.在以过敏原攻毒的初次免疫与加强免疫后,可产生高特异性抗体,其能够导致血液中基础水平IgE的体内降低,以及抗原特异性IgE水平的显著降低(实施例8至11)。
公开的IgE EMPD肽免疫原构建体及其剂型可有效地作为疫苗,以减少或消除于IgE介导过敏性疾病患者中的IgE介导过敏性病理学。
于下文进一步详细描述所公开IgE EMPD肽免疫原构建体的各种组分。
a.IgE EMPD的B细胞表位
本公开关于用以产生对IgE EMPD肽具有特异性的高效价多克隆抗体的新颖肽组合物,其与定向分化为分泌IgE的人类B细胞上表达的膜结合型IgE交叉反应。通过合理设计的努力,肽组合物的位点特异性使针对载体蛋白上不相关位点的抗体的产生降到最低。
本文使用术语“IgE”是指任何形式的免疫球蛋白E,包含分泌型IgE、膜结合型IgE及其片段。图2A说明IgE的分泌与膜结合形式。
本文使用术语“mIgE”特别地是指IgE的膜结合形式及其片段。在一些实施方案中,mIgE是于人类中IgE的膜结合形式,其具有如报导所述编号PH1215之的类Ig epsilon链C区形式2(片段)的氨基酸序列。图2A说明膜结合型IgE(右侧)。
本文使用术语“IgE EMPD”是指膜结合型IgE(mIgE)的细胞外膜近侧结构域(EMPD)及其片段。IgE EMPD也称为CεmX,其位于CH4结构域和羧基端膜锚定跨膜肽之间,并且仅存在于mIgE B细胞上。IgE的EMPD起因于“短”同种型所使用剪接受体位点上游156bp处的εRNA转录物的可变剪接。人类IgE的全长“长”EMPD同种型长度为67个氨基酸(SEQ ID NO:1),其包含不存在于“短”同种型中的52个氨基酸(SEQ ID NO:2)。图2A说明膜结合型IgE,其具有经放大的EMPD部分。全长IgE EMPD(SEQ ID NO:1)及其片段(SEQ ID NO:2-58和127)的氨基酸序列如表1所示。
基于IgE EMPD的67个氨基酸和52个氨基酸序列(分别为SEQ ID NO:1和2)的氨基酸编号,IgE EMPD包含位于内源性半胱氨酸(C18-C39)之间的分子内环状结构。IgE的内部的分子内环状结构于图9说明。
IgE EMP D肽免疫原构建体的B细胞表位包含IgE EMPD的分子内环状结构,或其部份。在某些实施方案中,B细胞表位包含IgE EMPD的约20至约40个氨基酸。
在一些实施方案中,IgE EMPD肽免疫原构建体的B细胞表位部份的氨基酸序列包含来自全长IgE EMPD(SEQ ID NO:1)的约20至约40个氨基酸残基。在某些实施方案中,依据全长IgE EMPD(SEQ ID NO:1)的编号,B细胞表位包含来自由内源性半胱氨酸(C18-C39)所形成的IgE EMPD的内部分子内环状结构的氨基酸序列。在具体实施方案中,B细胞表位的序列于IgE EMPD的分子内环状结构的羧基端是以位于第38个残基的精氨酸(R)、位于第39个残基的半胱氨酸(C)或位于第40个残基的组氨酸(H)作为结束。
在一些实施方案中,如表1所示,B细胞表位具有IgE EMPD-1-39(SEQ ID NO:5)、IgE EMPD-7-40(SEQ ID NO:6)、IgE EMPD-19-38(SEQ ID NO:8)或IgE EMPD-1-40(SEQ IDNO:9)的氨基酸序列。
本公开的IgE EMPD片段也包含IgE EMPD肽(SEQ ID NO:5、6、8和9)及其超过20个氨基酸片段的免疫功能类似物或同源物。IgE EMPD肽及其超过20个氨基酸片段的功能免疫类似物或同源物包括保留与原始肽实质性相同的免疫原性的变体。疫功能类似物可具有于氨基酸位置的保守取代、总电荷改变、与其他官能基共价连接或氨基酸的添加、插入或删除和/或其任意组合。
b.异源性T辅助细胞表位(Th表位)
本公开提供肽免疫原构建体,其包含来自IgE EMPD的B细胞表位,B细胞表位直接地或是通过任选的异源性间隔子共价连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。
IgE EMPD肽免疫原构建体中的异源性Th表位增强IgE EMPD片段的免疫原性,其通过合理设计促进针对优化目标B细胞表位(即IgE EMPD片段)的特异性高效价抗体的产生。
本文使用术语“异源性”是指衍生自并非IgE EMPD野生型序列的部分或与其同源的氨基酸序列的氨基酸序列。因此,异源性Th表位为衍生自非天然存在于IgE EMPD的氨基酸序列的Th表位(即Th表位对IgE EMPD而言不是自体衍生的)。因为Th表位对IgE EMPD而言是异源性的,当异源性Th表位共价连接至IgE EMPD片段时,IgE EMPD的天然氨基酸序列不会向氨基端或羧基端方向延伸。
本公开的异源性Th表位可为不具有天然存在于IgE EMPD的氨基酸序列的任何Th表位。Th表位还可具有针对多种物种的MHC II类分子的混杂结合基序。在某些实施方案中,Th表位包含多个混杂的MHC II类结合基序,以允许T辅助细胞的最大活化,从而导致免疫反应的启动和调节。优选的Th表位本身为非免疫原性的(即如果有的话,很少利用IgE EMPD肽免疫原构建体所产生的抗体是针对Th表位),因此允许针对IgE EMPD片段的目标B细胞表位的非常集中的免疫反应。
本公开的Th表位包括,但不限于,衍生自外来病原体的氨基酸序列,如表2(SEQ IDNO:59-87)所例示。此外,Th表位包括理想化人工Th表位和组合的理想化人工Th表位(例如:SEQ ID NO:60和67-73)。异源性Th表位肽以组合序列(例如SEQ ID NO:68-71)呈现,包含基于特定肽的同源物的可变残基在肽骨架内于特定位置处表示的氨基酸残基的混合物。可以利用在合成过程期间在特定位置添加选定受保护的氨基酸的混合物,而非一个特定的氨基酸,于单一过程中合成组合肽的集合。此类组合异源性Th表位肽集合可允许对具有不同遗传背景的动物广泛的Th表位覆盖。异源性Th表位肽的代表性组合序列包含如表2所示的SEQID NO:68-71。本发明的Th表位肽对来自基因多样性群体的动物和患者提供广泛的反应性和免疫原性。
包含Th表位的IgE EMPD肽免疫原构建体可于与IgE EMPD片段串联的单一固相肽合成中同时产生。Th表位也可包括Th表位的免疫类似物。免疫Th类似物包括免疫增强类似物、交叉反应类似物和任何这些Th表位的片段,其足以增强或刺激对IgE EMPD片段的免疫反应。
Th表位肽的功能免疫类似物也是有效的,且被包括作为本发明的一部分。功能免疫Th类似物可包含于Th表位中从1至约5个氨基酸残基的保守取代、添加、删除和插入,其实质上未改变Th表位的Th刺激功能。如上文针对IgE EMPD片段所描述的,可以利用天然或非天然氨基酸完成保守取代、添加和插入。表2鉴定了Th表位肽的功能类似物的另一种变体。具体而言,MvF1和MvF2 Th的SEQ ID NO:60和67是MvF4和MvF5的SEQ ID NO:70和72的功能类似物,因为利用在氨基端和羧基端将各两个氨基酸删除(SEQ ID NO:60和67)或插入(SEQID NO:70和72)而使其氨基酸骨架有所区别。在类似序列的这两个系列之间的差异并不会影响包含于此些序列中的Th表位的功能。因此,功能免疫Th类似物包括衍生自麻疹病毒融合蛋白MvF1-4 Ths(SEQ ID NO:60、67、68、70和72)和衍生自肝炎表面蛋白HBsAg 1-3 Ths(SEQ ID NO:69、71和73)的Th表位的多种版本。
在IgE EMPD肽免疫原构建体中的Th表位可共价连接于IgE EMPD肽片段的氨基端或羧基端。在一些实施方案中,Th表位共价连接至IgE EMPD肽片段的氨基端。在其他实施方案中,Th表位共价连接至IgE EMPD肽片段的羧基端。在某些实施方案中,超过一个的Th表位共价连接至IgE EMPD片段。当超过一个的Th表位连接至IgE EMPD片段时,每一个Th表位可具有相同氨基酸序列或不同氨基酸序列。另外,当超过一个的Th表位连接至IgE EMPD片段时,Th表位可以任何顺序排列。例如,Th表位可连续地连接至IgE EMPD片段的氨基端,或连续地连接至IgE EMPD片段的羧基端,或当不同的Th表位共价连接至IgE EMPD片段的羧基端时,Th表位可共价连接至IgE EMPD片段的氨基端。Th表位相对于IgE EMPD片段的排列并无限制。
在一些实施方案中,Th表位直接地共价连接至IgE EMPD片段。在其他实施方案中,Th表位通过于下文进一步详细描述的异源性间隔子共价连接至IgE EMPD片段。
c.异源性间隔子
公开的IgE EMPD肽免疫原构建体任选地包含异源性间隔子,其将来自IgE EMPD的B细胞表位共价连接至异源性T辅助细胞(Th)表位。
如上所述,术语“异源性”是指衍生自并非IgE EMPD天然形式序列的部分或与其同源的氨基酸序列的氨基酸序列。因此,当异源性间隔子共价连接至来自IgE EMPD的B细胞表位时,IgE EMPD的天然氨基酸序列不会向氨基端或羧基端方向延伸,因为间隔子对IgEEMPD序列而言是异源性的。
间隔子为能够将两个氨基酸和/或肽连接在一起的分子或化学结构。依据应用的不同,间隔子的长度或极性可能会有所不同。间隔子连接可通过酰胺或羧基连结,但是其他官能基也是可能的。间隔子可包括化学化合物、天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。
间隔子可为IgE EMPD肽免疫原构建体提供结构特征。结构上,间隔子提供Th表位与IgE EMPD片段的B细胞表位的物理分离。通过间隔子的物理分离可破坏通过将Th表位连接至B细胞表位所产生的任何人工二级结构。另外,通过间隔子的表位的物理分离可消除Th细胞和/或B细胞反应之间的干扰。此外,可设计间隔子以产生或修饰肽免疫原构建体的二级结构。例如,可设计间隔子以作为柔性铰链,用以增强Th表位和B细胞表位的分离。柔性铰链间隔子也可允许所呈递的肽免疫原与适当的Th细胞和B细胞之间更有效率的交互作用,以增强对Th表位和B细胞表位的免疫反应。编码柔性铰链的序列的例示见于通常富含脯氨酸的免疫球蛋白重链铰链区。利用序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO:128)提供了一种作为间隔子的特别有用的柔性铰链,其中Xaa是任何氨基酸,以天冬氨酸为优选。
间隔子也可为IgE EMPD肽免疫原构建体提供功能特征。例如,可设计间隔子以改变IgE EMPD肽免疫原构建体的总电荷,其可影响肽免疫原构建体的溶解度。此外,改变IgEEMPD肽免疫原构建体的总电荷可影响肽免疫原构建体与其他化合物和试剂结合的能力。如下文进一步详细讨论的,IgE EMPD肽免疫原构建体可通过静电结合与高度带电的寡核苷酸(例如CpG寡聚合物)形成稳定的免疫刺激复合物。IgE EMPD肽免疫原构建体的总电荷对于形成这些稳定的免疫刺激复合物而言是重要的。
可作为间隔子的化学化合物包括,但不限于,(2-胺乙氧基)乙酸(AEA)、5-氨基戊酸(AVA)、6-氨基己酸(Ahx)、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(AEEA,mini-PEG1)、12-氨基-4,7,10-三氧杂十二酸(mini-PEG2)、15-氨基-4,7,10,13-四氧杂十五烷酸(mini-PEG3)、trioxatridecan-succinamic acid(Ttds)、12-氨基十二烷酸、Fmoc-5-氨基-3-氧戊酸(O1Pen)等。
天然存在的氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。
非天然存在的氨基酸包括,但不限于,ε-N赖氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、甲状腺素、γ-氨基丁酸、高丝氨酸、瓜氨酸、氨基苯甲酸、6-氨基己酸(Aca;6-氨基己酸)、3-硫醇丙酸(MPA)、3-硝基酪氨酸、焦谷氨酸等。
IgE EMPD肽免疫原构建体中的间隔子可共价连接在Th表位和IgE EMPD肽的氨基端或羧基端。在一些实施方案中,间隔子共价连接至Th表位的羧基端和IgE EMPD肽的氨基端。在其他实施方案中,间隔子共价连接至IgE EMPD肽的羧基端和Th表位的氨基端。在某些实施方案中,可使用超过一个的间隔子,例如,当在肽免疫原构建体中存在超过一个的Th表位时。当使用超过一个的间隔子时,每个间隔子可以彼此相同或不同。此外,当肽免疫原构建体中存在超过一个的Th表位时,可利用间隔子分隔开Th表位,间隔子可为相同或不同,利用间隔子将Th表位与B细胞表位分开。间隔子相对于Th表位或IgE EMPD片段的排列没有限制。
在某些实施方案中,异源性间隔子是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。在其他实施方案中,间隔子包含超过一个的天然存在或非天然存在的氨基酸。在具体实施方案中,间隔子为Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ IDNO:129)。
d.IgE EMPD肽免疫原构建体的具体实施方案
在某些实施方案中,IgE EMPD肽免疫原构建体可利用以下式表示:
(Th)m-(A)n-(IgE EMPD片段)-X
或
(IgE EMPD片段)-(A)n-(Th)m-X
或
(Th)m-(A)n-(IgE EMPD片段)-(A)n-(Th)m-X
其中
Th为异源性T辅助细胞表位;
A为异源性间隔子;
(IgE EMPD片段)为来自IgE EMPD具有约20至约40个氨基酸残基的B细胞表位;
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2;
m为1至约4;以及
n为0至约10。
在某些实施方案中,IgE EMPD肽免疫原构建体中的异源性Th表位具有选自SEQ IDNO:59-87中的任一个及其组合的氨基酸序列,如表2所示。在一些实施方案中,IgE EMPD肽免疫原构建体包含超过一个的Th表位。
在某些实施方案中,任选的异源性间隔子是选自Lys-、Gly-、Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO:129)中的任一个及其组合。在具体实施方案中,异源性间隔子为ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO:129)。
在某些实施方案中,IgE EMPD片段具有来自SEQ ID NO:1或2的IgE EMPD的约20至约40个氨基酸残基。在具体实施方案中,依据全长IgE EMPD(SEQ ID NO:1)的编号,IgEEMPD片段包含来自由内源性半胱氨酸(C18-C39)所形成的IgE EMPD的内部分子内环状结构的氨基酸序列。在具体实施方案中,IgE EMPD片段具有IgE EMPD-1-39(SEQ ID NO:5)、IgEEMPD-7-40(SEQ ID NO:6)、IgE EMPD-19-38(SEQ ID NO:8)或IgE EMPD-1-40(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列,如表1所示。
在某些实施方案中,IgE EMPD肽免疫原构建体具有选自SEQ ID NO:88-130中任一个的氨基酸序列,如表3所示。在具体实施方案中,IgE EMP D肽免疫原构建体具有选自SEQID NO:88-95、98-124和130中任一个的氨基酸序列。
e.变体、同源物和功能类似物
也可使用上述免疫原肽的变体和类似物,其可诱导抗体和/或与抗体交叉反应,而此抗体是针对IgE EMPD的优选表位。类似物(包括等位基因、物种以及诱导变体),通常于一个、两个或几个位置上不同于天然存在的肽,通常是由于保守取代。类似物通常展现与天然肽至少80或90%的序列一致性。一些类似物还包括非天然氨基酸或在一个、两个或几个位置上的氨基端或羧基端氨基酸的修饰。
作为功能类似物的变体可具有于氨基酸位置上的保守取代、总电荷改变、与其他官能基共价连接或氨基酸的添加、插入或删除和/或其任意组合。
保守取代是指一个氨基酸残基被另一个具有相似化学性质的氨基酸残基所取代。例如,非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸;极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺;带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸;而带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
在一个特定实施方案中,功能类似物与原始氨基酸序列具有至少50%的一致性。在另一实施方案中,功能类似物与原始氨基酸序列具有至少80%的一致性。在又一实施方案中,功能类似物与原始氨基酸序列具有至少85%的一致性。在又一实施方案中,功能类似物与原始氨基酸序列具有至少90%的一致性。
变体还包括磷酸化残基的变化。例如,变体可包括在被磷酸化的肽内的不同残基。变体免疫原性IgE EMPD肽也可包括伪磷酸化肽。伪磷酸化肽是藉由用酸性氨基酸残基(例如谷氨酸和天冬氨酸)取代IgE EMPD肽的一个或多个磷酸化的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基所产生。
组合物
本公开还提供包含公开的IgE EMPD免疫原构建体的组合物。
a.肽组合物
包含公开的IgE EMPD肽免疫原构建体的组合物可为液体或固体形式。液体组合物可包括不改变IgE EMPD肽免疫原构建体的结构或功能特性的水、缓冲液、溶剂、盐和/或任何其他可接受的试剂。肽组合物可含有一种或多种公开的IgE EMPD肽免疫原构建体。
b.医药组合物
本公开还关于包含公开的IgE EMPD肽免疫原构建体的医药组合物。
医药组合物可含有在药学上可接受递送系统中的载体和/或其他添加剂。因此,医药组合物可含有IgE EMPD肽免疫原构建体的药学上有效剂量以及药学上可接受的载体、佐剂和/或其它赋形剂(例如稀释剂、添加剂、稳定剂、防腐剂、助溶剂、缓冲剂等)。
医药组合物可含有一种或多种佐剂,其作用是加速、延长或增强针对IgE EMPD肽免疫原构建体的免疫反应,而本身不具有任何特异性抗原作用。医药组合物中使用的佐剂可包括油、油乳液、铝盐、钙盐、免疫刺激复合物、细菌和病毒衍生物、仿病毒颗粒(virosomes)、碳水化合物、细胞因子、聚合物微粒。在某些实施方案中,佐剂可选自明矾(磷酸铝钾)、磷酸铝(例如ADJU-)、氢氧化铝(例如/>)、磷酸钙、弗氏不完全佐剂(IFA)、弗氏完全佐剂、MF59、佐剂65、Lipovant、ISCOM、liposyn、皂苷、角鲨烯、L121、/>单磷酸脂质A(MPL)、Quil A、QS21、/>ISA 35、ISA 50V、ISA 50V2、ISA 51、ISA 206、ISA 720、脂质体、磷脂质、肽聚糖、脂多醣(LPS)、ASO1、ASO2、ASO3、ASO4、AF03、亲脂性磷脂质(脂质A)、γ菊糖、藻类菊粉(algammulin)、葡聚糖、右旋糖酐、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、果聚醣、木聚糖、二甲基双十八烷基溴化铵(DDA),以及其他佐剂和乳化剂。
在一些实施方案中,医药组合物含有MontanideTM ISA 51(由植物油和二缩甘露醇油酸酯所组成的油质佐剂组合物,用以制造油包水乳液)、80(也称为聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯)、CpG寡核苷酸和/或其任意组合。在其他实施方案中,医药组合物是以Emulsigen或Emulsigen D作为佐剂的水包油包水(即w/o/w)乳液。
医药组合物还可包括药学上可接受的添加剂或赋形剂。例如,医药组合物可含有抗氧化剂、黏结剂、缓冲剂、增积剂、载剂、螫合剂、着色剂、稀释剂、崩散剂、乳化剂、填充剂、胶化剂、pH缓冲剂、防腐剂、助溶剂、稳定剂等。
医药组合物可配制成立即释放或缓续释放剂型。另外,可配制医药组合物用于通过免疫原包封和与微粒共同投予以诱导系统性或局部性黏膜免疫。所属技术领域中具有通常知识者很容易确定此类递送系统。
医药组合物可以以液体溶液或悬浮液形式配制成注射剂。含有IgE EMPD肽免疫原构建体的液体载体也可在注射前制备。医药组合物可利用任何适合的用法投予,例如i.d.、i.v.、i.p.、i.m.、鼻内、口服、皮下等,并且可在任何适合的递送装置中施用。在某些实施方案中,可配制医药组合物供静脉内、皮下、皮内或肌肉内投予。也可制备适用于其他给药方式的医药组合物,包括口服和鼻内应用。
医药组合物也可以适合的剂量单位形式配制。在一些实施方案中,医药组合物含有每公斤体重约0.1μg至约1mg的IgE EMPD肽免疫原构建体。医药组合物的有效剂量取决于许多不同的因素,包括投予方式、靶点、患者的生理状态、患者是人类或动物、投予的其它药物,以及处理是供预防还是治疗。通常,患者是人类,但也可治疗包括转基因哺乳类动物的非人类哺乳类动物。当以多剂量递送时,医药组合物可以方便地分成每个剂量单位形式的适当量。投予的剂量取决于治疗领域众所周知的受试者年龄,体重和一般健康状况。
在一些实施方案中,医药组合物含有超过一种的IgE EMPD肽免疫原构建体。含有超过一种IgE EMPD肽免疫原构建体的混合物的医药组合物允许协同性增强构建的免疫效力。含有超过一种IgE EMPD肽免疫原构建体的医药组合物可在更大的遗传群体中更为有效,这是由于广泛的MHC II类覆盖,因此提供针对IgE EMPD肽免疫原构建体的经改善的免疫反应。
在一些实施方案中,医药组合物含有选自SE Q ID NO:88-95、98-124和130(表3)的IgE EMPD肽免疫原构建体,以及其同源物、类似物和/或组合。
在某些实施方案中,将具有组合形式的衍生自MVF和HBsAg的异源性Th表位(SEQID NO:68和69)的IgE EMPD肽免疫原构建体(SEQ ID NO:107和108)以等摩尔比率混合,用于疫苗剂型,以允许对具有不同遗传背景的接受疫苗的宿主群体最大覆盖。在本发明肽组合物中观察到在IgE EMPD G1-C39和A7-C40免疫原构建体(SEQ ID NO:88至95)中的协同性增强,且藉由此种构建体(例如SEQ ID NO:95)所引发的抗体反应大部分(>90%)是集中在针对IgE EMPD的B细胞表位肽(SEQ ID NO:2)的所欲求的交叉反应性,而没有多少(如果有的话)针对用于免疫原性增强的异源性Th表位(实施例7,表7)。此与用于肽抗原性增强的常规蛋白(例如KLH)或其他生物蛋白载体所制造的抗体形成鲜明对比。
在其他实施方案中,包含肽组合物的医药组合物,例如IgE EMPD肽免疫原构建体与作为佐剂的矿物盐(包括明矾凝胶(ALHYDROGEL)或磷酸铝(ADJUPHOS))接触的混合物形成悬浮液疫苗剂型,用以投予疫苗宿主。
含有IgE EMPD肽免疫原构建体的医药组合物可用以于投予后在宿主中引发免疫反应并产生抗体。
c.免疫刺激复合物
本公开也关于含有与CpG寡核苷酸形成免疫刺激复合物的IgE EMPD肽免疫原构建体的医药组合物。此种免疫刺激复合物特别适合作为佐剂和肽免疫原稳定剂。免疫刺激复合物呈微粒形式,其可有效地将IgE EMPD肽免疫原呈递给免疫系统的细胞以产生免疫反应。免疫刺激复合物可配制成用于肠胃外投予的悬浮液。免疫刺激复合物还可配制成w/o乳液形式,作为与矿物盐或原位凝胶聚合物结合的悬浮液,用于在肠胃外投予后将IgE EMPD肽免疫原有效递送至宿主免疫系统的细胞。
稳定化的免疫刺激复合物可藉由通过静电结合将IgEEMPD肽免疫原构建体与阴离子型分子、寡核苷酸、多核苷酸或其组合复合而形成。稳定化的免疫刺激复合物可作为免疫原递送系统并入医药组合物中。
在某些实施方案中,将IgE EMPD肽免疫原构建体设计成包含阳离子部份,其于范围为5.0至8.0的pH下带有正电荷。IgE EMPD肽免疫原构建体或构建的混合物的阳离子部份净电荷计算是依据,每个赖氨酸(K)、精氨酸(R)或组氨酸(H)带有+1电荷,每个天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)带有-1电荷,以及序列中其他氨基酸所带的电荷为0。将在IgE EMPD肽免疫原构建体中的阳离子部份的电荷相加,并表示为净平均电荷。适合的肽免疫原具有净平均正电荷为+1的阳离子部份。优选地,肽免疫原具有范围大于+2的净正电荷。在一些实施方案中,IgE EMPD肽免疫原构建体的阳离子部份为异源性间隔子。在某些实施方案中,当间隔子序列为(α,ε-N)Lys、ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO:129)时,IgE EMPD肽免疫原构建体的阳离子部份具有+4的电荷。
如本文所述的“阴离子型分子”是指在范围为5.0至8.0的pH下带有负电荷的任何分子。在某些实施方案中,阴离子型分子是寡聚合物或聚合物。寡聚合物或聚合物上的净负电荷计算是依据,在寡聚合物中的每个磷酸二酯或硫代磷酸酯基团带有-1电荷。适合的阴离子型寡核苷酸是具有8至64个核苷酸碱基的单链DNA分子,CpG基序的重复数在1至10的范围内。优选地,CpG免疫刺激性单链DNA分子含有18至48个核苷酸碱基,CpG基序的重复数在3至8的范围内。
更优选地,阴离子型寡核苷酸可以式5′X1CGX23′表示,其中C和G是未甲基化的;且X1是选自由A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)和T(胸腺嘧啶)组成的群组;且X2是C(胞嘧啶)或T(胸腺嘧啶)。或者,阴离子型寡核苷酸可以式5′(X3)2CG(X4)23′表示,其中C和G是未甲基化的;且X3是选自由A、T或G组成的群组;且X4是C或T。
所得到的免疫刺激复合物呈颗粒形式,其大小通常在1-50微米的范围内,且是许多因素(包括相互作用成份的相对电荷化学计量和分子量)的函数。微粒免疫刺激复合物具有提供佐剂化和体内特异性免疫反应的向上调节的优点。此外,稳定化的免疫刺激复合物适用于通过各种方法(包括油包水乳液、矿物盐悬浮液和聚合凝胶)制备医药组合物。
本公开也关于用以治疗和预防IgE介导过敏性疾病的医药组合物,包含疫苗剂型。在一些实施方案中,医药组合物包含稳定化的免疫刺激复合物,其是藉由混合CpG寡聚合物和包含IgE EMPD肽免疫原构建体(例如SEQ ID NO:88-95、98-124和130)的混合物的肽组合物以通过静电结合所形成,以进一步增强IgE EMPD肽的免疫原性,并引发针对SEQ ID NO:1或2的IgE EMPD肽的抗体以结合表达mIgE的B细胞,且诱导其抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)和细胞凋亡(实施例6)。
在又一实施方案中,医药组合物含有IgE EMPD肽免疫原构建体的混合物(例如SEQID NO:8-90、94、95、98-124和130的任意结合),其与CpG寡聚合物形成稳定化的免疫刺激复合物,免疫刺激复合物与任选具有高安全系数的作为佐剂的矿物盐(包括明矾凝胶(ALHYDROGEL)或磷酸铝(ADJUPHOS))混合,以形成用以投予接受疫苗的宿主的悬浮液疫苗剂型。
抗体
本公开还提供利用IgE EMPD肽免疫原构建体所引发的抗体。
本公开提供IgE EMPD肽免疫原构建体及其剂型,其于制造中具有成本效益,其最佳设计可引发靶向膜结合型IgE的高效价抗体,此抗体可于免疫的宿主中利用高反应率破坏针对自体抗原的免疫耐受。利用IgE EMPD肽免疫原构建体所产生的抗体对IgE-EMPD蛋白,无论是可溶性肽、融合蛋白或带有IgE的B细胞上呈现的IgE,具有高亲和力。产生的抗体能够与表达mIgE的B淋巴细胞上的IgE BCR结合并交联,以诱导细胞溶解效应,例如细胞凋亡和ADCC。膜结合型IgE的B淋巴细胞的细胞凋亡耗竭可进一步造成血清IgE产生的降低。因此,以利用公开的IgE EMPD肽免疫原构建体及其制剂所产生的诱导细胞凋亡的IgE EMPD特异性抗体靶向人类mIgE B细胞,可提供针对IgE介导过敏性疾病的新颖疗法和疫苗。
在一些实施方案中,用以引发抗体的IgE EMPD肽免疫原构建体包含IgE EMPD肽的混合物,IgE EMPD肽具有涵盖衍生自IgE EMPD肽(SEQ ID NO:1)中央分子内环状结构的含有20至40个氨基酸的B细胞表位(例如IgE EMPD G1-C39(SEQ ID NO:5)、IgE EMPD A7-H40(SEQ ID NO:6)、IgE EMPD H19-R38(SEQ ID NO:8)和IgE EMPDG1-H40(SEQ ID NO:9)的IgEEMPD肽),IgE EMPD肽通过任选的间隔子连接至衍生自病原体蛋白的异源性Th表位,例如麻疹病毒融合(MVF)蛋白(SEQ ID NO:73)或其他(SEQ ID NO:59至87)。IgE EMPD肽免疫原构建体的B细胞表位和Th表位一起作用以刺激高特异性抗体的产生,此高特异性抗体可与IgEEMPD1-52肽(SEQ ID NO:2)、IgE EMPD 1-67蛋白(SEQ ID NO:1)交叉反应,无论是重组含有IgE EMPD的蛋白质(例如由利用编码人类IgG1之Fc部分和人类膜结合型IgE的IgE EMPD(γ1-em67)的重组DNA转染的稳定的Flp-In CHO细胞系所纯化而来)或位于带有膜结合型IgE的细胞的细胞膜上(例如利用编码mIgE.FcL,的重组DNA转染的Ramos细胞系)。
用以使肽免疫原性增强的传统方法,例如通过化学偶联载体蛋白(例如钥孔血蓝蛋白(KLH)或其他载体蛋白(例如白喉类毒素(DT)和破伤风类毒素(TT)蛋白)),通常导致产生大量针对载体蛋白的抗体。因此,此种肽-载体蛋白疫苗的主要缺陷在于利用此种免疫原所产生的大部分(>90%)抗体是针对可导致表位抑制的载体蛋白KLH、DT或TT的非功能性抗体。
有别于用以使肽免疫原性增强的传统方法,利用公开的IgE EMPD肽免疫原构建体所产生的抗体可以高特异性结合至IgE EMPD片段,而没有多少(如果有的话)抗体是针对异源性Th表位或任选的异源性间隔子。具体而言,在接种疫苗的动物中所引发的多克隆抗体可以高特异性结合至涵盖IgE EMPD的环状结构的中央区域,如图9所示。
方法
本公开也关于用以制备和使用IgE EMPD肽免疫原构建体、组合物和医药组合物的方法。
a.IgE EMPD肽免疫原构建体的制造方法
本公开的IgE EMPD肽免疫原构建体可利用普通技术人员所熟知的化学合成方法加以制备(参见例如Fields et al.,Chapter 3in Synthetic Peptides:A User’s Guide,ed.Grant,W.H.Freeman&Co.,New York,NY,1992,p.77)。IgE EMPD肽免疫原构建体可利用自动化美利弗德(Merrifield)固相合成法来合成,利用侧链受保护的氨基酸,以t-Boc或F-moc化学保护α-NH2,在例如应用生物系统肽合成仪430A或431型(Applied BiosystemsPeptide Synthesizer Model 430A或431)上进行。包含Th表位的组合文库肽的IgE EMPD肽免疫原构建体的制备可通过提供用于在给定可变位置进行偶联的替代性氨基酸的混合物而完成。
在期望的IgE EMPD肽免疫原构建体组装完成后,依照标准程序处理树脂,将肽从树脂上切下,并将氨基酸侧链上的官能基切除。可利用HPLC纯化游离的肽,并利用例如氨基酸分析或测序以描述生化特性。肽的纯化和表征方法是本发明所属技术领域中具有通常知识者所熟知的。
可以控制和确定通过此化学过程所产生的肽的质量,且结果是IgE EMPD肽免疫原构建体的再现性、免疫原性和产量可以获得保证。通过固相肽合成的IgE EMPD肽免疫原构建体的制造的详细描述显示于实施例1中。
已经发现允许保留期望的免疫活性的结构变异范围,比起允许保留小分子药物特定药物活性或与生物来源药品共同产生的大分子中存在期望活性及不期望的毒性的结构变异范围更具包容性。因此,与期望的肽具有相似的色层分析和免疫学特性的肽类似物,不论是刻意设计或因合成过程错误而无法避免地作为缺失序列副产物的混合物产生的,其通常如经纯化的期望的肽制剂具有相同的效果。只要建立严格的QC程序,以监控制造过程与产品评估过程,确保使用这些肽的终产物的再现性与有效性,则经设计的类似物与非预期的类似物的混合物也是有效的。
也可利用包括核酸分子、载体和/或宿主细胞的重组DNA技术来制备IgE EMPD肽免疫原构建体。因此,编码IgE EMPD肽免疫原构建体及其免疫功能类似物的核酸分子也包括在本公开中作为本发明的一部分。类似地,包含核酸分子的载体(包括表达载体)以及含有载体的宿主细胞也包括在本公开中作为本发明的一部分。
各种例示性实施方案也包括制造IgE EMPD肽免疫原构建体及其免疫功能类似物的方法。例如,方法可包括在表达肽和/或类似物的条件下培养宿主细胞之步骤,宿主细胞包含含有编码IgE EMPD肽免疫原构建体和/或其免疫功能类似物的核酸分子的表达载体。较长的合成肽免疫原可利用公知的重组DNA技术来合成。这些技术可于具有详细实验计划的众所周知的标准手册中加以提供。为了构建编码本发明肽的基因,将氨基酸序列反向转译以获得编码氨基酸序列的核酸序列,优选地利用对于其中具有待表达基因的生物体来说最适合的密码子。接下来,通常通过合成编码肽和任何调节因子(如有必要的话)的寡核苷酸以制造合成基因。将合成基因插入适合的克隆载体内并转染到宿主细胞中。然后在适合所选表达系统和宿主的合适条件下表达肽。利用标准方法纯化肽并描述其特性。
b.免疫刺激复合物的制造方法
各种例示性实施方案还包括制造包含IgE EMPD肽免疫原构建体和CpG寡脱氧核苷酸(ODN)分子的免疫刺激复合物的方法。稳定化的免疫刺激复合物(ISC)衍生自IgE EMPD肽免疫原构建体的阳离子部份和聚阴离子CpG ODN分子。自行组合系统是由电荷的静电中和所驱动。IgE EMPD肽免疫原构建体的阳离子部分对阴离子寡聚合物的摩尔电荷比例的化学计量决定缔合的程度。IgE EMPD肽免疫原构建体和CpG ODN的非共价静电结合是完全可再现的过程。此肽/CpG ODN免疫刺激复合物聚集体有助于呈现至免疫系统中“专业的”抗原呈现细胞(APC),因此可进一步增强复合物的免疫原性。在制造过程中,可轻易地描绘此些复合物的特征以控制质量。肽/CpG ISC在体内具有良好的耐受性。设计这种包含CpG ODN和IgE EMPD片段衍生的肽免疫原构建体的新颖微粒系统,以利用与CpG ODN使用相关的广义B细胞促有丝分裂(mitogenicity),但促进平衡的Th-1/Th-2型反应。
在公开的医药组合物中的CpG ODN在由相反电荷静电中和所介导的过程中100%结合至免疫原,导致微米大小之微粒的形成。微粒形式允许来自CpG佐剂常规使用的CpG剂量的显著减少,不利的先天性免疫反应的可能性更低,且促进包括抗原呈现细胞(APC)在内的替代性免疫原处理途径。因此,此种剂型在概念上是新颖的,且通过替代的机制藉由促进免疫反应的刺激而提供潜在的优点。
c.医药组合物的制造方法
各种例示性实施方案还包括含有IgE EMPD肽免疫原构建体的医药组合物。在某些实施方案中,医药组合物是利用油包水乳液和具有矿物盐的悬浮液的剂型。
为了使医药组合物可被广大群体所使用,且避免IgE EMPD聚集也成为投药目标的一部分,安全性成为另一个需要考虑的重要因素。尽管在临床试验中对于许多剂型而言在人类使用油包水乳液,但基于其安全性,明矾仍然是制剂中使用的主要佐剂。因此,明矾或其矿物盐磷酸铝(ADJUPHOS)经常作为制剂中的佐剂供临床应用。
其他佐剂和免疫刺激剂包括3De-O-酰化单磷酰脂A(MPL)或3-DMP、聚合或单体氨基酸,例如聚谷氨酸或聚赖氨酸。此类佐剂可以与或不与其他特定的免疫刺激剂一起使用,免疫刺激剂例如胞壁酰肽(例如N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酰-2-(1′-2′二棕榈酰-sn-丙三基-3-羟基磷酰基氧)-乙胺(MTP-PE)、N-乙酰葡糖胺-N-乙酰胞壁酰-L-A1-D-isoglu-L-Ala-二棕榈酰丙氨酰(DTP-DPP)TheramideTM),或其他细菌细胞壁成份。水包油乳液包含MF59(参见Van Nest等人的专利申请案WO 90/14837,其通过引用整体并入本文),包含5%角鲨烯、0.5%Tween 80,以及0.5%Span 85(任选含有不同量的MTP-PE),利用微射流机配制成次微米颗粒;SAF,包含10%角鲨烯、0.4%Tween 80、5%pluronic-嵌段共聚合物L121,以及thr-MDP,利用微射流化形成次微米乳液或利用漩涡震荡以产生大颗粒乳液;以及RibiTM佐剂系统(RAS)(Ribi ImmunoChem,Hamilton,Mont.),其包含2%角鲨烯、0.2%Tween 80,以及一种或多种的细菌细胞壁成份,细菌细胞壁成份选自由单磷酰脂A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)以及细胞壁骨架(CWS)组成的群组,优选为MPL+CWS(DetoxTM)。其他佐剂包含弗氏完全佐剂(CFA)、弗氏不完全佐剂(IFA),以及细胞因子(例如白介素(IL-1、IL-2和IL-12)、巨噬细胞群落刺激因子(M-CSF),以及肿瘤坏死因子(TNF))。
佐剂的选择取决于含有佐剂的免疫原制剂的稳定性、给药途径、给药计划、佐剂对接种疫苗的物种的效力,且在人类是指已经被相关监管机构批准或可批准用于人类给药的药学上可接受的佐剂。例如单独明矾、MPL或弗氏不完全佐剂(Chang et al.,AdvancedDrug Delivery Reviews 32:173-186(1998),其通过引用整体并入本文)或其任选地所有组合适于人类投予。
组合物可包括药学上可接受的无毒载体或稀释剂,其被定义为通常用于配制供动物或人类给药的医药组合物的载体。选择稀释剂以免影响组合物的生物活性。此类稀释剂的范例是蒸馏水、生理磷酸缓冲盐水、林格氏液、葡萄糖溶液和Hank’s溶液。此外,医药组合物或剂型还可包含其他载体、佐剂或无毒的,非治疗性的,非免疫原性的稳定剂等。
医药组合物还可包括大的缓慢代谢的大分子(例如蛋白质、多醣类(例如甲壳素)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚合物(例如胶乳功能化琼脂糖(latex functionalizedsepharose)、琼脂糖(agarose)、纤维素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物,以及脂质聚集体(例如油滴或脂质体)。另外,这些载体可作为免疫刺激剂(即佐剂)。
本发明的医药组合物可进一步包含合适的递送载体。合适的递送载体包括,但不限于,病毒、细菌、可生物降解的微球体、微粒、纳米粒子、脂质体、胶原蛋白微球和螺旋体(cochleates)。
d.医药组合物的使用方法
本公开也包括使用包含IgE EMPD肽免疫原构建体的医药组合物的方法。
在某些实施方案中,包含IgE EMPD肽免疫原构建体的医药组合物可用以治疗和/或预防免疫球蛋白E(IgE)介导过敏性疾病,包括,但不限于,对药物、食物和昆虫过敏、过敏性鼻炎(花粉热)、异位性皮肤炎、过敏性气喘、结膜炎、湿疹、风疹块(荨麻疹)和急性过敏。
在一些实施方案中,方法包含投予包含IgE EMPD肽免疫原构建体的药学上有效剂量的医药组合物给有其需要的宿主。在某些实施方案中,方法包含投予包含IgE EMPD肽免疫原构建体的药学上有效剂量的医药组合物给温血动物(例如人类、食蟹猴、小鼠),以引发可与IgE EMPD 1-52肽(SEQ ID NO:2)、IgE EMPD 1-67蛋白(SEQ ID NO:1)交叉反应的高特异性抗体,无论是重组含有IgE EMPD的蛋白质(例如由利用编码人类IgG1的Fc部分和人类膜结合型IgE的IgEEMPD(γ1-em67)的重组DNA转染的稳定的Flp-In CHO细胞系所纯化而来)或位于带有膜结合型IgE之细胞的细胞膜上(例如利用编码mIgE.FcL的重组DNA转染的Ramos细胞系)。
在某些实施方案中,包含IgE EMPD肽免疫原构建体的医药组合物藉由引发针对IgE EMPD的抗体,可用以治疗和/或预防IgE介导疾病。此类抗体能够(a)结合至表达mIgE的B细胞,并诱发抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)和细胞凋亡;(b)导致血液中基础水平IgE的体内降低;(c)导致血液中抗原特异性IgE水平的体内降低;以及(d)减少或消除于IgE介导过敏性疾病患者中的IgE介导过敏性病理学。
e.体外功能检测和体内药效概念验证试验
利用IgE EMPD肽免疫原构建体产生的抗体可用于体外功能检测。这些功能检测包括,但不限于:
(a)体外结合至IgE EMPD 1-52肽(SEQ ID NO:1),其作为从表达mIgE.FcL的CHO细胞纯化的重组蛋白(实施例3);
(b)体外结合至来自B细胞系的带有膜结合型IgE的细胞(Ramos),其利用编码IgE.FcL的重组DNA转染(实施例3);
(c)体外抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)(实施例6);
(d)体外诱导带有IgE的B淋巴细胞的细胞凋亡(实施例6);
(e)通过显示于接受免疫的宿主血液中基础水平IgE的降低,以于体内验证药效(实施例8至10);
(f)通过在初次免疫和加强免疫后利用过敏原进行攻毒显示抗原特异性IgE水平的降低,以于体内验证药效(实施例8至10);
藉由本公开,IgE EMPD肽免疫原构建体及其剂型可有效地起到疫苗的作用,以减少或消除于IgE介导过敏性疾病患者中的IgE介导过敏性病理学。
具体实施方案
(1)一种以下式代表的IgE EMPD肽免疫原构建体:
(Th)m-(A)n-(IgE EMPD片段)-X
或
(IgE EMPD片段)-(A)n-(Th)m-X
或
(Th)m-(A)n-(IgE EMPD片段)-(A)n-(Th)m-X
其中
Th为异源性T辅助细胞表位;
A为异源性间隔子;
(IgE EMPD片段)为来自IgE EMPD的中央分子内环状结构的具有约20至约40个氨基酸残基的B细胞表位;
X为氨基酸的α-COOH或α-CONH2;
m为1至约4;以及
n为0至约10。
(2)依据(1)的IgE EMPD肽免疫原构建体,其中IgE EMPD片段选自由SEQ ID NO:5、6、8和9组成的群组。
(3)依据(1)或(2)任一项的IgE EMPD肽免疫原构建体,其中T辅助细胞表位选自由SEQ ID NO:59-87组成的群组。
(4)依据(1)的IgE EMPD肽免疫原构建体,其中肽免疫原构建体选自由SEQ ID NO:88-95、98-124和130组成的群组。
(5)一种IgE EMPD肽免疫原构建体,包含:
包含来自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的IgE EMPD序列约20至约40个氨基酸残基的B细胞表位;
包含选自由SEQ ID NO:59-87组成的群组的氨基酸序列的T辅助细胞表位;以及
选自由氨基酸、Lys-、Gly-,Lys-Lys-Lys-、(α,ε-N)Lys和ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO:129)组成的群组的任选的异源性间隔子;
其中B细胞表位是直接地或通过任选的异源性间隔子共价连接至T辅助细胞表位。
(6)(5)的IgE EMPD肽免疫原构建体,其中B细胞表位选自由SEQ ID NO:5、6、8和9组成的群组。
(7)(5)的IgE EMPD肽免疫原构建体,其中T辅助细胞表位选自由SEQ ID NO:59-87组成的群组。
(8)(5)的IgE EMPD肽免疫原构建体,其中任选的异源性间隔子为(α,ε-N)Lys或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO:129)。
(9)(5)的IgE EMPD肽免疫原构建体,其中T辅助细胞表位共价连接至B细胞表位的氨基端。
(10)(5)的IgE EMPD肽免疫原构建体,其中T辅助细胞表位通过任选的异源性间隔子共价连接至B细胞表位的氨基端。
(11)一种包含依据(1)至(10)任一项的肽免疫原构建体的组合物。
(12)一种医药组合物,包含:
a.依据(1)至(10)任一项的肽免疫原构建体;以及
b.药学上可接受的递送载体和/或佐剂。
(13)(12)的医药组合物,其中
a.IgE EMPD肽免疫原构建体选自由SEQ ID NO:88-95、98-124和130组成的群组;以及
b.IgE EMPD肽免疫原构建体与CpG寡脱氧核苷酸(ODN)混合以形成稳定化免疫刺激复合物。
(14)一种分离抗体或其表位结合片段,其特异性地结合至依据(1)至(10)任一项的IgE EMPD肽免疫原构建体的B细胞表位。
(15)依据(14)的分离抗体或其表位结合片段结合至IgE EMPD肽免疫原构建体。
(16)一种分离抗体或其表位结合片段,其特异性地结合至依据(1)至(10)任一项的IgE EMPD肽免疫原构建体的B细胞表位。
(17)一种包含依据(14)至(16)任一项的分离抗体或其表位结合片段的组合物。
以下实施例提供了所使用程序的详细说明。以下实施例是用以说明本发明,而非用以限制本发明的范围。
实施例1.IGE EMPD相关肽的合成及其剂型的制备
a.IgE EMPD相关肽的合成
描述了包含在IgE EMPD肽免疫原构建体开发计划中用以合成专门设计的IgEEMPD相关肽的方法。以小规模量合成的肽用于血清学分析、实验室试验和田间试验,大规模(千克)量合成的肽则用于医药组合物的工业/商业生产。为了筛选和选择用于有效基于IgE过敏疫苗的最佳肽构建体,设计了具有长度为约20至70个氨基酸的序列的大量IgE EMPD相关抗原性肽。
如表1所示(SEQ ID NO:1至58),代表性的全长IgE EMPD1-67(SEQ ID NO:1)、IgEEMPD 1-52(SEQ ID NO:2),以及IgE EMPD片段,包括IgE EMPD1-17(SEQ ID NO:7)、IgEEMPD 19-38(SEQ ID NO:8),以及各种10-mer肽(SEQ ID NO:10-58),供各种血清学分析中的表位鉴定的使用。
如表2所示(SEQ ID NO:59-87),通过以合成方法连接至衍生自病原体蛋白(包括麻疹病毒融合蛋白(MVF)、B型肝炎表面抗原蛋白(HBsAg)、流行性感冒病毒、破伤风梭菌,以及Epstein-Barr病毒(EBV))的经周密设计的T辅助细胞(Th)表位,将选择的IgE EMPD B细胞表位肽制成IgE EMPD肽免疫原构建体。Th表位是以单一序列(SEQ ID NO:59-67和72-87)或组合文库(SEQ ID NO:68-71)形式使用,以增强其各自IgE EMPD肽免疫原构建体的免疫原性。
由超过100种肽构建中所选出的具代表性的IgE EMP D肽免疫原构建体于表3中确认(SEQ ID NO:88-124和130)。
用于供抗IgE EMPD抗体检测和/或测量的免疫原性研究或相关血清学测试的所有肽是在应用生物系统肽合成仪430A、431和/或433型上利用F-moc化学小规模合成。每一种肽是通过在固相载体上的独立合成所制备,在三官能基氨基酸的氨基端与侧链保护基团具有F-moc保护。将完整的肽从固相载体上切下,并用90%三氟乙酸(TFA)移除侧链保护基团。利用基质辅助雷射脱附游离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)评估合成的肽以确定正确的氨基酸组成。利用反相HPLC(RP-HPLC)评估各个合成肽以确认产物的合成概况与浓度。尽管严格控制合成过程(包括逐步地监测偶合效率),由于在延长循环中某些意外事件,包括氨基酸的插入、删除、取代及提前终止,仍可能产生肽类似物。因此,合成产物一般包括多种肽类似物与目标肽。
尽管包括这些非预期的肽类似物,但最后的合成肽产物仍可用作免疫应用,包括免疫诊断(作为抗体捕捉抗原)与医药组合物(作为肽免疫原)。一般来说,只要开发严格的QC程序来监测制造过程及产品质量评估程序,以确保使用这些肽的最终产物的再现性与有效性,此肽类似物,包括刻意设计或合成程序中产生的副产物混合物,通常可如期望的肽的纯化产物同样有效。可利用客制的自动肽合成仪UBI2003或类似机型以15mmole至50mmole的规模合成数百至数千克的大量肽。
对于供临床试验的最终医药组合物使用的活性成分,可利用预备的RP-HPLC于浅洗脱梯度下纯化IgE EMPD相关肽构建体,利用MALDI-TOF质谱确定氨基酸组成,并以氨基酸分析与RP-HPLC评估纯度与一致性。
b.包含IgE EMPD肽免疫原构建体之组合物的制备
制备采用油包水乳液和具有矿物盐的悬浮液的剂型。为了设计医药组合物供广大族群使用,且预防亦成为给药目标的一部分,则安全性成为另一个需要考虑的重要因素。尽管在人类许多医药组合物的临床试验中使用油包水乳液,但基于其安全性,明矾仍然是用于医药组合物中的主要佐剂。因此,明矾或其矿物盐ADJUPHOS(磷酸铝)经常作为佐剂供临床应用。
简而言之,在以下描述的每个实验组中所指定的剂型通常包含所有类型专门设计的IgE EMPD肽免疫原构建体。利用代表免疫原B细胞表位肽的相对应IgE EMPD肽,针对其相对免疫原性,于豚鼠中起始评估超过100种专门设计的IgE EMPD肽免疫原构建体,且也利用涂覆选自SEQ ID NO:1-126的不同肽的孔盘以ELISA试验对各种同源性肽间血清学交叉反应进行评估。
(i)利用经核准供人类使用的油剂Seppic MontanideTMISA 51配制油包水乳液,或(ii)与矿物盐ADJUPHOS(磷酸铝)或ALHYDROGEL(明矾)混合,以配制IgE EMPD肽免疫原构建体,肽构建体如指定以不同量配制。通常利用将IgE EMPD肽免疫原构建体以约20至800μg/mL浓度溶解于水中,并与MontanideTM ISA 51配制成油包水乳液(1∶1体积)或者与矿物盐或ALHYDROGEL(明矾)(1∶1体积)配制成组合物。将组合物置于室温下约30分钟,并在免疫接种前利用漩涡震荡混合约10至15秒。利用2至3个剂量的特定组合物免疫接种一些动物,其在时间0(初次免疫)和初次免疫后(wpi)3周(加强免疫),任选5或6wpi进行第二次加强免疫,通过肌内途径投药。然后利用选定的B细胞表位肽测试这些接受免疫接种的动物,以评估存在于剂型中的各种IgE EMPD肽免疫原构建体的免疫原性,以及它们与相关目标肽或蛋白质的交叉反应性。之后,针对免疫流程所指定特定期间内的给药方案,将那些在豚鼠初始筛选中具有有效免疫原性的IgE EMPD肽免疫原构建体在灵长类动物中以油包水乳液、矿物盐和基于明矾的剂型作进一步测试。
在试验用新药申请和于IgE介导疾病患者进行临床试验的提交准备中,只有最有希望的IgE EMPD肽免疫原构建体会在被纳入供于GLP指导的临床前研究中针对免疫原性、持续时间、毒性和功效研究的最终剂型之前会进行进一步广泛的评估。
实施例2.血清学试验和试剂
以下详细描述用以评估合成肽构建体及其剂型的功能性免疫原性的血清学试验和试剂。
a.用于抗体特异性分析的基于IgE EMPD 1-52、IgE EMPD 1-39、IgE EMPD 1-17、IgE EMPD 19-38、IgE EMPD7-40肽的ELISA试验
开发并于下文描述于以下实施例所述用以评估免疫血清样品的ELISA试验。利用配制于pH9.5的10mM碳酸氢钠缓冲液(除非另有说明)中浓度为2μg/mL(除非另有说明)的目标肽IgE EMPD1-52、IgE EMPD 1-39、IgE EMPD 1-17、IgE EMPD 19-38、IgE EMPD 7-40肽等(例如SEQ ID NO:2和5至8),将其以100μL体积于37℃下作用1小时,以分别地涂覆96孔盘的孔洞。
将以肽涂覆的孔洞与250μL配制于PBS中浓度为3重量百分比的明胶于37℃下反应1小时,以阻断非特异性蛋白质结合位点,接着利用含有0.05体积百分比20的PBS洗涤孔洞三次并干燥。利用含有20体积百分比正常山羊血清、1重量百分比明胶和0.05体积百分比/>20的PBS以1∶20比例(除非另有说明)稀释待测血清。将100μL稀释样品(例如血清、血浆)加入每个孔洞并于37℃下反应60分钟。然后利用配制于PBS中浓度为0.05体积百分比的/>20洗涤孔洞6次,以移除未结合的抗体。使用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的物种(例如小鼠、豚鼠或人类)特异性山羊抗IgG、IgA或IgM作为标记的示踪剂,以在阳性孔洞中与形成的抗体/肽抗原复合物结合。将100微升过氧化物酶标记的山羊抗IgG以预滴定的最佳稀释倍数配制于内含1体积百分比正常山羊血清与0.05体积百分比20的PBS中,将其加到每个孔洞中,并在37℃下再反应30分钟。利用内含0.05体积百分比/>20的PBS洗涤孔洞6次以移除未结合的抗体,并与100μL包含0.04重量百分比3’,3’,5’,5’-四甲基联苯胺(TMB)和0.12体积百分比过氧化氢于柠檬酸钠缓冲液中的底物混合物再反应15分钟。藉由形成有色产物利用底物混合物以检测过氧化物酶标记。藉由加入100μL的1.0M硫酸终止反应并测定450nm处的吸光值(A450)。为了测定接受各种IgE EMPD肽疫苗剂型的疫苗接种动物的抗体效价,将从1∶100至1∶10,000的10倍连续稀释的血清或从1∶100至1∶4.19x108的4倍连续稀释的血清进行测试,且利用A450阀值设为0.5的A450的线性回归分析计算测试血清的效价,以Log10表示。
b.利用基于Th肽的ELISA试验评估针对Th肽的抗体反应性
以如上所述类似的ELISA方法进行实验,利用配制于pH9.5的10mM碳酸氢钠缓冲液(除非另有说明)中浓度为2μg/mL(除非另有说明)的Th肽,以100μL体积于37℃下作用1小时,以分别地涂覆96孔ELISA盘的孔洞。为了测定接受各种IgE EMPD肽疫苗剂型疫苗接种动物的抗体效价,将从1∶100至1∶10,000的10倍连续稀释的血清进行测试,且利用A450阀值设为0.5的A450的线性回归分析计算测试血清的效价,以Log10表不。
c.利用基于B细胞表位簇10-mer肽的ELISA试验针对IgE EMPD和IgE CH4(人类IgECH4到细胞膜)进行精细特异性分析和表位鉴定评估
利用表位鉴定测定于接受免疫的宿主中抗IgE EMPD抗体的精细特异性分析。简而言之,依照上述抗体ELISA方法的步骤,以二重复方式,利用每孔洞每0.1mL含有0.5μg的个别IgE EMPD 10-mer肽(SEQ ID NO:10至58)涂覆96孔盘的孔洞,然后将100μL血清样品(配制于PBS中,稀释倍数为1∶100)于10-mer盘中进行反应。为了额外的反应性和特异性确认,利用无间隔子或Th序列的相对应IgE EMPD 1-52肽(SEQ ID NO:1)或非相关的对照肽,对IgE EMPD肽免疫原构建体的B细胞表位和来自接受免疫的宿主的免疫血清的抗IgE EMPD抗体相关精细特异性分析进行测试。
d.免疫原性评估
依照实验的疫苗接种程序收集来自动物或人类受试者的免疫前和免疫血清样品,并在56℃下加热30分钟以使血清补体因子失活。在投予疫苗剂型后,根据程序获得血液样品并评估其针对特定靶点的免疫原性。测试了连续稀释的血清,并将稀释倍数的倒数取对数(Log10)以表示阳性效价。利用其引发针对目标抗原内所期望的B细胞表位序列的高效价抗体的能力来评估特定疫苗剂型的免疫原性,且同时将针对用以提供加强所期望的B细胞反应的T辅助细胞表位序列的抗体反应性维持在低至可忽略。
e.用以评估小鼠血清中人类IgE水平的免疫分析
使用抗人类IgE,HP6061(Abcam),作为捕获抗体,而生物素标记的抗人类IgE,HP6029(Abcam),作为检测抗体,通过三明治ELISA测定huIGHE基因敲入小鼠中的人类IgE水平。简而言之,将HP6061以100ng/孔洞的量配制于涂覆缓冲液(15mM碳酸钠,35mM碳酸氢钠,pH9.6)中以固定在96孔盘上,并在4℃下过夜反应。利用200μL/孔洞的测定稀释液(含0.5%BSA,0.05%Tween-20,0.02%液体生物防腐剂ProClin 300的PBS)在室温下反应1小时以封闭涂覆的孔洞。利用200μL/孔洞的洗涤缓冲液(内含0.05%Tween-20的PBS)洗涤微量盘3次。使用纯化的U266 IgE在含有5%小鼠血清的测定稀释液中产生标准曲线(通过2倍连续稀释,范围为0至800ng/mL)。将50μL的稀释血清(1∶20)和标准品加入涂覆的孔洞中。在室温下反应1小时。将所有孔洞吸干,并利用200μL/孔洞的洗涤缓冲液洗涤6次。将捕获的人类IgE与100μL的检测抗体溶液(在测定稀释液中内含50ng/ml生物素标记的HP6029)在室温下反应1小时。然后,使用链霉亲和素(streptavidin)poly-HRP(1∶10,000稀释,ThermoPierce)检测结合的生物素-HP6029 1小时(100μL/孔洞)。将所有孔洞吸干,并利用200μL/孔洞的洗涤缓冲液洗涤6次。最后,利用100μL/孔洞的NeA-Blue TMB底物(ClinicalScientific Products)使孔洞显色,且通过加入100μL/孔洞的1M硫酸终止反应。藉由利用SoftMax Pro软件(Molecular Devices)产生的4-参数逻辑曲线拟合而生成标准曲线,并用其计算在所有试验样品中的IgE浓度。藉由Prism软件使用Student t检验比较数据。
f.用以评估小鼠血清中木瓜蛋白酶特异性IgE水平的免疫分析
使用木瓜蛋白酶作为涂覆材料,而生物素标记的抗人类IgE,HP6029(Abcam)作为检测抗体,利用直接ELISA测定huIGHE基因敲入小鼠中形成的木瓜蛋白酶特异性IgE。简而言之,将木瓜蛋白酶以500ng/孔洞的量配制于涂覆缓冲液(15mM碳酸钠,35mM碳酸氢钠,pH9.6)中以固定在96孔盘上,并在4℃下过夜反应。利用200μL/孔洞的测定稀释液(含0.5%BSA,0.05%Tween-20,0.02%液体生物防腐剂ProClin300的PBS)在室温下反应1小时以封闭涂覆的孔洞。利用200μL/孔洞的洗涤缓冲液(内含0.05%Tween-20的PBS)洗涤微量盘3次。使用单克隆人类嵌合木瓜蛋白酶特异性IgE(AllerMAbs Co.,Ltd.)在具有10%小鼠血清的测定稀释液中产生标准曲线(通过2倍连续稀释,范围为0至30ng/mL)。将50μL的稀释血清(1∶10)和标准品加入涂覆的孔洞中。在室温下反应1小时。将所有孔洞吸干,并利用200μL/孔洞的洗涤缓冲液洗涤6次。将捕获的人类IgE与100μL的检测抗体溶液(在测定稀释液中内含50ng/ml生物素标记的HP6029)在室温下反应1小时。然后,使用链霉亲和素poly-HRP(1∶10,000稀释,Thermo Pierce)检测结合的生物素-HP60291小时(100μL/孔洞)。将所有孔洞吸干,并利用200μL/孔洞的洗涤缓冲液洗涤6次。最后,利用100μL/孔洞的NeA-Blue TMB底物(Clinical Scientific Products)使孔洞显色,且通过加入100μL/孔洞的1M硫酸终止反应。藉由利用SoftMax Pro软件(Molecular Devices)产生的4-参数逻辑曲线拟合而生成标准曲线,并用其计算在所有试验样品中的木瓜蛋白酶特异性IgE浓度。藉由Prism软件使用Student t检验比较数据。
g.用以评估食蟹猴血清中IgE水平的免疫分析
使用抗人类IgE,MB10-5C4(Miltenyi Biotec)作为捕获抗体,而生物素标记的多克隆抗食蟹猴IgE(Alpha Diagnostic International Inc.)作为检测抗体,利用三明治ELISA测定在食蟹猴中的食蟹猴IgE水平。简而言之,将MB10-5C4以100ng/孔洞的量配制于涂覆缓冲液(15mM碳酸钠,35mM碳酸氢钠,pH 9.6)中以固定在96孔盘上,并在4℃下隔夜反应。利用200μL/孔洞的测定稀释液(含0.5%BSA,0.05%Tween-20,0.02%液体生物防腐剂ProClin 300的PBS)在室温下反应1小时以封闭涂覆的孔洞。利用200μL/孔洞的洗涤缓冲液(内含0.05%Tween-20的PBS)洗涤微量盘3次。使用纯化的食蟹猴IgE在具有10%食蟹猴血清的测定稀释液中产生标准曲线(通过2倍连续稀释,范围为0至10,000ng/mL)。将100μL的稀释血清(1∶10)和标准品加入涂覆的孔洞中。在室温下反应1小时。将所有孔洞吸干,并利用200μL/孔洞的洗涤缓冲液洗涤6次。将捕获的人类IgE与100μL的检测抗体溶液(在测定稀释液中内含50ng/ml生物素标记的HP6029)在室温下反应1小时。然后,使用链霉亲和素poly-HRP(1∶10,000稀释,Thermo Pierce)检测结合的生物素-HP60291小时(100μL/孔洞)。将所有孔洞吸干,并利用200μL/孔洞的洗涤缓冲液洗涤6次。最后,利用100μL/孔洞的NeA-Blue TMB底物(Clinical Scientific Products)使孔洞显色,且通过加入100μL/孔洞的1M硫酸终止反应。藉由利用SoftMax Pro软件(Molecular Devices)产生的4-参数逻辑曲线拟合而产出标准曲线,并用其计算在所有试验样品中的IgE浓度。藉由Prism软件使用Studentt检验比较数据。
实施例3.于动物中评估利用IgE EMPD肽免疫原构建体及其剂型所诱发的抗体的功能特性
针对其结合重组可溶性IgE EMPD蛋白质和以编码mIgE.FcL(由CH2至CM包含EMPD)或mIgE.FcS(由CH2至CM不包含EMPD)的重组DNA转染的Ramos细胞系的能力,测试来自接受免疫的宿主的免疫血清或纯化的抗IgE EMPD抗体。
a.细胞
Ramos细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA),并在补充有10%热灭活FBS(Invitrogen)、4mM L-谷氨酰胺、25mM HEPES和1mM丙酮酸钠(Invitrogen;完全RPMI培养基)的RPMI 1640培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中生长。利用编码mIgE.FcL或mIgE.FcS的重组DNA转染Ramos细胞。利用编码mIgE ε链长的同种型片段(从CH2延伸至细胞质肽,包含EMPD)的DNA片段转染表达mIgE.FcL的Ramos细胞。利用编码mIgE ε链短或常见的同种型片段(从CH2延伸至细胞质肽,不包含EMPD)的DNA片段转染表达mIgE.FcS的Ramos细胞。将表达mIgE.FcL或mIgE.FcS的Ramos细胞的稳定转染子维持在补充有400mg/ml吉欧霉素(Zeocin)(Invitrogen)的完全RMPI 1640培养基中。
b.用于ELISA试验的重组可溶性IgE EMPD蛋白的制备
利用编码人类IgG1的Fc部分和人类膜结合型IgE的IgE EMPD(γ1-em67)的DNA片段转染表达重组可溶性IgE EMPD蛋白的Flp-In CHO细胞。将稳定的Flp-In CHO转染子维持在补充有10%热灭活FBS(Invitrogen)、4mM L-谷氨酰胺、25mM HEPES和1mM丙酮酸钠(Invitrogen;完全IMDM培养基)的IMDM培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。根据制造商的指示使用蛋白质A Sepharose(GE Healthcare)从培养基纯化γ1-em67蛋白质。
c.从免疫血清纯化多克隆抗体
根据制造商的指示使用蛋白质A Sepharose(GE Healthcare)纯化来自各种免疫血清的多克隆IgG。
d.利用多克隆抗体结合至可溶性IgE EMPD蛋白或位于B细胞上的mIgE.FcL
针对其结合至(a)重组γ1-em67蛋白(如上所述)(利用ELISA),或(b)表达mIgE.FcL的Ramos细胞(利用荧光流式细胞仪分析)的相对活性,检测来自每只接受免疫的动物的纯化多克隆抗体。96孔微量盘来自Nalge NUNC International,平底(货号442404)是供光学读取,而V底(货号249570)是供细胞培养。在VersaMax微量盘式分析仪(MolecularDevices)上读取光学密度。利用BD FACSCanto II流式细胞仪(DB Biosciences)检测荧光染色;并利用联合的FACSDiva软件获取结果数据。将来自ELISA和FACS的结合数据输入Prism 6软件进行定量分析。更具体地说,在V底微量盘加入每孔洞0.1mL中具有2x105个细胞的溶液,将其离心并移除液体。利用不同浓度的100μL抗体样品的溶液将细胞在冰上培养1小时。将细胞洗涤一次,以300g离心5分钟,并利用100μL山羊F(ab)2抗物种特异性IgG Fc-FITC(250ng/mL)在冰上进行染色30分钟。将细胞洗涤一次并于离心后移除液体。于每个孔洞中加入200μL结合缓冲液,并将其转移至微量稀释管进行流式细胞仪分析。在FACS上读取基于每个样品10,000个细胞进样的结合强度(荧光强度的几何平均值,GeoMFI)。
e.细胞凋亡测定
将稳定表达mIgE.FcL的Ramos细胞(5x105细胞/mL)于完全RPMI 1640培养基中与纯化的免疫或对照抗体在37℃下培养1小时。然后利用最终浓度为10μg/mL的二级抗体,特异性针对豚鼠IgG的Fc的山羊F(ab’)2(Jackson ImmunoResearch Laboratories,WestGrove,PA)处理细胞,并于37℃下培养额外24小时。以以下方式分析细胞的凋亡程度。对于利用膜联蛋白(annexin)V的分析,通过在室温下于黑暗中将细胞再悬浮于染色溶液中15分钟,以测定磷脂丝氨酸(PS)的暴露。染色溶液含有配制于具有10mM HEPES/氢氧化钠(pH7.4)、140mM氯化钠和5mM氯化钙的缓冲溶液中稀释为1/200的FITC标记的膜联蛋白V(Biovision,Mountain View,CA)和2.5μg/ml碘化丙啶(PI)。在FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA)上分析染色的细胞。在点图分析中获得凋亡细胞的百分比,其定义为膜联蛋白V阳性且PI阴性。
f.抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)分析
通过使用RBC裂解缓冲液(Thermo Fisher Scientific Inc.)重复进行红血球的低渗透休克反应,从Balb/c小鼠(雌性,6至8周龄)的脾脏分离出脾脏淋巴细胞。在移除红血球后,在补充有50μM 2-ME和100U/mL重组人类IL-2(PeproTech,Inc)的完全RPMI培养基中以3x106细胞/mL的细胞浓度培养脾脏淋巴细胞3天。利用CFSE(Invitrogen)于37℃下在PBS/0.1%BSA中标记表达mIgE.FcL的Ramos细胞(目标细胞)10分钟。在利用冷的完全RPMI1640培养基洗涤三次之后,将细胞调整至105细胞/mL。在37℃下将在200μl完全RPMI培养基中含有20,000个标记细胞的溶液与来自相对应免疫血清的纯化多克隆IgG抗体(浓度为10μg/mL)涂覆30分钟,然后以数值为30的E/T比值将其与IL-2活化的脾脏淋巴细胞(效应细胞)结合。在24小时培养之后,在冰上利用浓度为2.5μg/mL的7-氨基放线菌素D(7-AAD,Invitrogen)对总细胞染色15分钟,然后在Becton Dickinson FACS Canto II流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。在点图分析中将活的目标细胞定义为CFSE阳性且7-AAD阴性。在给定的E/T比值下的裂解的目标细胞的百分比为:100x[(在抗体非依赖性对照中活目标细胞的百分比-在样品中活目标细胞的百分比)/在抗体非依赖性对照中活目标细胞的百分比]。
实施例4.用于安全性、免疫原性、毒性和功效研究的动物
a.豚鼠:
在成熟,未与抗原接触或未受抗原刺激的成年雄性和雌性Duncan-Hartley豚鼠(300-350g/BW)中进行免疫原性研究。实验中每一组使用至少3只豚鼠。在签订合约的动物设施以及作为试验委托者的联合生物医学公司(UBI),依照经核准的IACUC申请,进行涉及Duncan-Hartley豚鼠(8-12司龄;Covance Research Laboratories,Denver,PA,USA)的试验计划。
b.食蟹猴:
在签订合约的动物设施以及作为试验委托者的UBI,依照经核准的IACUC申请,在成年雄性和雌性猴子(食蟹猴,约为4岁;Joinn Laboratories,Suzhou,China)进行免疫原性和重复剂量毒性研究。
c.hIGHE基因敲入小鼠:
利用靶向C57BL/B6遗传背景的同源基因,以人类IGHE基因取代其IGHG1基因,使小鼠品系表达人类分泌型和膜结合型IgE(Lu,el al.,2015)。hIGHE小鼠在鼠源IGHG1转录组件的调控下表达人类IgE,并通过人类调控组件的选择性RNA剪接表达人类膜结合型IgE。血清IgE早在8至10周龄时就于循环中被检测到。将混合hIGHE x Balb/c遗传背景的年轻后代(10~12周龄)用于初级/记忆免疫反应(primary/memory immune response)的预防模型,以及致敏化作用/回忆免疫反应(sensitization/recall immune response)的治疗模型中。这两项研究都是在签订合约的动物设施(National Health Research Institute,Taiwan)以及作为试验委托者的UBI依照经核准的IACUC申请而进行。
利用血清人类IgE的ELISA分析,针对抗体反应,以及血清总IgE和抗原攻毒后抗原特异性IgE水平降低的证据,观察在16周期间内肌肉内疫苗接种的效果。
在免疫之前,根据本实施例上述方法针对血清人类IgE的存在测试来自个别动物的血清样品。取决于物种和试验计划,利用疫苗剂型的每剂量的IgE EMPD肽免疫原构建体免疫每只动物。
实施例5.供最终产品选用用于在豚鼠、转基因敲入小鼠和食蟹猴进行IgE EMPD肽构建体的免疫原性评估的疫苗剂型
以下更详细地描述在每个实验中使用的医药组合物和疫苗剂型。简而言之,在每个试验组中指定的剂型通常包含专门设计的IgE EMPD肽免疫原构建体的所有类型,其具有经由不同种类的间隔子(例如εK或KKK以增强肽构建体的溶解度)连接的IgE EMPD肽片段和混杂T辅助细胞表位的变体(包含两组衍生自麻疹病毒融合蛋白和B型肝炎表面抗原的人工T辅助细胞表位),IgE EMPD肽片段连接于专门设计的肽构建的氨基端。针对其与IgE EMPD1-52的相对免疫原性,以及进一步针对其与位于带有IgE的B细胞(Ramos细胞系)上的细胞膜IgE的交叉反应性,最初在豚鼠中评估了超过100种专门设计的IgE EMPD肽构建体。如指定,在不同量肽构建体的状况下,使用Seppic MontanideTM ISA 51作为供人类疫苗使用的经批准的油类将IgE EMPD肽构建体配制于油包水乳液中,或将IgE EMPD肽构建体与矿物盐ADJUPHOS或ALHYDROGEL(明矾)混合。疫苗制备通常通过将IgE EMPD肽构建体以约20至800μg/mL的浓度溶解于水中,利用MontanideTM ISA 51配制成油包水乳液(1∶1体积),或利用矿物盐ADJUPHOS或ALHYDROGEL(明矾)(1∶1体积)进行配制。将疫苗剂型保持在室温下约30分钟,并在免疫之前利用漩涡震荡混合约10至15秒。
利用2至3个剂量的特定疫苗剂型免疫动物,其在时间0(初次免疫)和初次免疫后(wpi)3周(加强免疫),任选5或6wpi进行第二次加强免疫,通过肌内途径投药。然后测试这些接受免疫接种的动物,以评估存在于疫苗剂型中的各种合成IgE EMPD肽免疫原的免疫原性,以及其与IgE EMPD 1-52的交叉反应性。之后,针对免疫流程所指定特定期间内的给药方案,将在豚鼠初始筛选中具有有效免疫原性的IgE EMPD肽免疫原在食蟹猴中以油包水乳液、矿物盐和基于明矾的剂型作进一步测试。
在试验用新药申请和于IgE介导过敏性疾病患者进行临床试验的提交准备中,在被纳入供GLP指导的免疫原性、持续时间、毒性和功效验证研究的最终疫苗制剂之前,针对其于具有自体IgE EMPD抗原的相同物种中破坏免疫耐受的能力,只有最有希望的IgE EMPD肽免疫原候选物会进一步通过介导ADCC之免疫血清能力、带有mIgE的B细胞的细胞凋亡,以及在转基因敲入小鼠和食蟹猴中被广泛评估。
实施例6.用于IgE介导过敏性疾病治疗的纳入IgE EMPD 1-39肽免疫原构建体的多成分疫苗剂型的设计原理、筛选、识别、功能特性评估和优化
图2A和2B说明通过靶向IgE EMPD耗竭mIgE B细胞的基本原理。IgE以两种形式表达:分泌型IgE和膜结合型IgE(mIgE)(分别为图2A左侧和右侧)。分泌型IgE通过FcεRI被捕获在嗜碱性粒细胞和肥大细胞的细胞表面上,而mIgE作为B细胞受体(BCR)的一部分仅存在于IgE定向B细胞上。mIgE的细胞外膜近侧结构域(EMPD)是仅在mIgE B细胞上发现的位于CH4结构域和跨膜区域之间的67个氨基酸肽片段(SEQ ID NO:1)。IgE EMPD的独特性为靶向带有mIgE的B细胞提供了有吸引力的位点。通过靶向IgE EMPD耗竭mIgE B细胞允许在其分化成新的分泌IgE的浆细胞之前抑制过敏原特异性IgE产生(图2B)。寿命有限的现有分泌IgE的浆细胞会逐渐相继死去,导致总IgE和过敏原特异性IgE逐渐下降。
图3为识别了根据本文公开的特定实施方案的疫苗剂型从发现到商业化(工业化)的发展过程流程图。如以此方式所总结,本公开包括肽免疫原设计、肽组合物设计、疫苗剂型设计、体外功能上的抗原性设计、体内免疫原性和功效研究设计,以及临床试验计划书设计。针对每个步骤的详细评估令人惊讶地导向一系列实验,其导致安全有效的疫苗剂型的最终商业化。
以下描述这些步骤的概括性摘要:
a.设计历史
每种肽免疫原构建体或免疫治疗产品都需要基于其特定疾病机制和对于干预所需目标蛋白的其自身设计重点和方法。模型设计的目标是之后可以包括涉及疾病途径的细胞蛋白质或其中可能涉及来自病原体的多种蛋白质的感染剂。从研究到商业化的过程非常长,通常需要一个或更多个十年的时间才能完成。
一旦选择目标分子,就需要广泛的血清学验证过程。依照干预辨识位在目标分子内的B细胞和T细胞表位和功能位点对免疫原构建体设计来说是重要的。一旦识别到目标B细胞表位,就进行纳入各种T辅助支持物(载体蛋白或合适的T辅助肽)于小动物的连续先导免疫原性研究,以评估利用专门设计肽的医药组合物所引发的抗体的功能特性。然后在目标物种的动物中进行这种血清学应用,以进一步验证免疫原性和所引发的抗体的功能特性。利用从接受免疫的宿主收集的血清进行评估,所有研究均在多个平行组别中进行。对于人类医药组合物而言,也进行在目标物种或非人类灵长类动物的早期免疫原性研究,以进一步验证设计的免疫原性和方向。然后,当组合使用以制备个别的剂型设计时,将目标肽配制于不同的混合物中,以评估于与肽构建体之间各自相互作用有关的功能特性的细微差异。在额外评估之后,以此建立最终肽构建体、肽组合物及其剂型,以及剂型的各自物理参数,导向最终产品开发过程。
b.作为具有潜力治疗IgE介导过敏性疾病患者的医药组合物的IgE EMPD衍生的肽免疫原构建体的设计和验证
为了产生用于纳入医药组合物中最有效的肽构建体,将很多IgE EMPD B细胞表位肽(SEQ ID NO:5-8)(表1)和衍生自各种病原体的混杂T辅助细胞表位或进一步设计的人工T辅助细胞表位(SEQ ID NO:59-87)(表2)制成用于豚鼠免疫原性研究的IgE EMPD肽免疫原构建体。
i)选择IgE EMPD G1-H40作为免疫原设计的目标区域
IgE以两种形式表达:分泌型IgE和膜结合型IgE(mIgE)。分泌型IgE通过FcεRI被捕获在嗜碱性粒细胞和肥大细胞的细胞表面上,而mIgE作为B细胞受体(BCR)的一部分仅存在于IgE定向B细胞上。mIgE的全长细胞外膜近侧结构域(EMPD)是仅在mIgE B细胞上发现的位于CH4结构域和跨膜区域之间的67个氨基酸肽片段(SEQ ID NO:1)。寿命有限的现有分泌IgE的浆细胞会逐渐相继死去,导致总IgE和过敏原特异性IgE逐渐下降。在豚鼠中针对免疫原性测试许多肽免疫原构建体,数据来自一系列IgE EMPD衍生的肽免疫原构建体(SEQ IDNO:88-93),其是合并衍生自IgE EMPD 1-52(SEQ ID NO:2)的具代表性的JgE EMPD B细胞表位肽和具代表性Th表位肽(SEQ ID NO:72)而制成,提供利用IgE EMPD 1-39(SEQ ID NO:5)肽涂覆微量盘于豚鼠测试免疫原性的使用,如表4所示。发现利用具有三种定向的六种IgE EMPD肽免疫原构建体为具有高免疫原性的,其中利用εK的间隔子接头将Th表位肽连接至IgE EMPD B细胞表位肽,其连接至IgE EMPD B细胞表位肽的羧基端(SEQ ID NO:88和91)或氨基端(SEQ ID NO:89、90和92)或羧基端和氨基端二者(SEQID NO:93)。包含较长接头εK-KKK(SEQ ID NO:129)的IgE EMPD肽免疫原构建体也用以在构建设计中实现高免疫原性(例如SEQ ID NO:94-97)。
IgE EMPD B细胞表位肽的较短片段(SEQ ID NO:7和8)也可利用T辅助细胞表位肽(例如)增强免疫原性(分别为SEQ ID NO:96和97)。然而,如表5所示,这些构建体引发针对IgE EMPD具有弱结合能力的抗体(例如对于具有SEQ ID NO:5、6、7和8的较长片段)。SEQ ID NO:96和97的构建体也可引发如线性表位鉴定研究所示具有非常受限结合图谱的抗体,其中分别发现具有SEQ ID NO:25(氨基酸8-17)和SEQ ID NO:39(氨基酸22-31)的仅10mer肽具有反应性。此外,发现SEQ ID NO:96和97的构建体所引发的抗体具有最小的mIgE-B细胞结合效应(如图6C所示),此为诱导mIgE-B细胞凋亡的必要条件。
ii)设计用以增强所选IgE EMPD B细胞表位肽免疫原性的衍生自病原体的异源性T辅助细胞表位以及位在IgE EMPD肽免疫原构建体中的其内含物的排序
表2列出了总共29种异源性Th表位(SEQ ID NO:59-87),已经在小鼠、大鼠、豚鼠、狒狒、食蟹猴等的多个物种中测试其用以增强B细胞表位免疫原性的相对效力。
在豚鼠中针对免疫原性研究进行IgE EMPD肽免疫原构建体的代表性试验,IgEEMPD肽免疫原构建体含有IgE EMPD 1-39B细胞表位肽(SEQ ID NO:5),其通过εK间隔子与个别混杂T辅助细胞表位(SEQ ID NO:88、98-124和130)相连接,用以排序各自异源性T辅助细胞表位的相对效力,如表6所示。由于某些Th表位具有高B细胞表位增强能力,将在豚鼠仅一次免疫接种后在初次免疫后3周(3wpi)所获得的结果用于对29种不同IgE EMPD肽免疫原构建体进行排序。尽管所有选择的Th表位都具有增强IgE EMPD B细胞表位肽的免疫原性的能力,但发现最有效的构建体是SEQ ID NO:88的构建体,而效力最低的是SEQ ID NO:101的构建体。
对包括灵长类动物在内的于不同物种中的每种和所有IgE EMPD肽免疫原构建体的免疫原性的仔细校验将确保最终的Th肽选择,并成功开发最终的疫苗剂型。
iii)IgE EMPD G1-C39肽免疫原构建体的免疫原性评估(针对其与相对应全长和IgE EMPD G1-C39肽的抗体反应性)
图4说明在利用不同IgE EMPD肽免疫原构建体(SEQ ID NO:88至94、96和97)免疫的豚鼠中在8周期间的抗体反应动力学。利用10倍连续稀释将血清从1∶100稀释至1∶10,000,000。利用每孔洞0.5μg肽的IgE EMPD 1-39肽(SEQ ID NO:5)涂覆ELISA盘。利用A450阀值设为0.5的A450的线性回归分析计算测试血清的效价,以Log10表示。
图5说明利用不同IgE EMPD免疫原构建体(SEQ ID NO:88至94、96和97)所产生多种纯化的多克隆抗IgE EMPD抗体的滴定曲线。利用包含SEQ ID NO:1序列的重组含有IgEEMPD的蛋白质,γ1-em67,涂覆ELISA盘。将通过蛋白质A层析从豚鼠血清纯化的多克隆抗IgE EMPD抗体利用4倍连续稀释从100μg/mL稀释至0.0238ng/mL。利用4-参数逻辑曲线拟合的非线性回归计算每种多克隆抗IgE EMPD抗体制剂的EC50。
图4和图5所示,来自SEQ ID NO:88至94的肽免疫原构建体是选自于许多其他设计,显示具有Log10效价大部分高于4的高免疫原性。使用来自每一组别纯化抗体的更精确的EC50测量如第5图所示,相较于含有IgE EMPD较短B细胞表位肽(长度<20个残基)的肽免疫原构建体,例如IgE EMPD1-17或IgE EMPD 19-38(SEQ ID NO:96和97),利用0.02111至0.08892μg/mL的包含IgE EMPD 1-39和IgE EMPD 7-40的较长B细胞表位肽的IgE EMPD肽免疫原构建体(SEQ ID NO:88-94),显示相当高的免疫原性。
如在IgE EMPD B细胞表位肽设计的情况下,含有位在B细胞和Th表位之间较长间隔子的IgE EMPD肽免疫原构建体也显著地降低免疫原性(SEQ ID NO:94vs 89对于各自的EC50为0.08892vs 0.02368)。在长度超过20个残基的B细胞表位肽中,发现IgE EMPD 1-39在设计中是最佳的,因此其于以下实施例中将最常被作为在代表性肽免疫原设计中的B细胞表位肽,供利用各种体外功能试验和体内效力评估的进一步评估的使用。
iv)IgE EMPD肽免疫原构建体的免疫原性评估(针对其抗体结合至定向B细胞分化为IgE分泌的带有IgE的B细胞)
图6A至6C说明利用来自以IgE EMPD免疫原构建体(SEQ ID NO:88至97)免疫动物的每一组别汇集的豚鼠血清的纯化多克隆抗体对表达mIgE.FcL或mIgE.FcS的衍生自Ramos细胞系的B细胞的结合(参见实施例2的细胞荧光染色方法)。利用蛋白质A层析从豚鼠血清纯化的多克隆抗IgE EMPD抗体使用浓度为10μg/mL。
利用来自细胞结合试验高特异性的来自所有组别的纯化抗体发现,抗体与来自缺失目标序列的EMPD片段的mIgE.Fcs Ramos细胞系的细胞的低背景结合。如图6A至6C所示,利用SEQ ID NO:88至94、96和97的IgE EMPD肽免疫原构建体免疫的动物产生的抗体对mIgE.FcL Ramos细胞系细胞具有不同的结合亲和性。具体而言,相较于由包含具有少于20个残基的B细胞表位肽的IgE EMPD肽免疫原构建体(SEQ ID NO:96-97)产生的抗体,由包含长B细胞表位肽IgE EMPD 1-39的IgE EMPD肽免疫原构建体(SEQ ID NO:88-94)产生的抗体显示mIgE.FcL Ramos细胞系细胞的较高mIgE结合。此外,相较于具有较长间隔子(εK-KKK;SEQ ID NO:129)的构建体,由具有较短间隔子(εK)的IgE EMPD肽免疫原构建体产生的抗体具有mIgE.FcL Ramos细胞系细胞的较高mIgE结合,此可以由图6A中SEQ ID NO:89的结果和图6C中SEQ ID NO:94的结果比较来看出。
发现在组别多克隆抗体EC50数值与带有IgE细胞的阳性结合百分比(%)之间呈负相关。带有IgE的B细胞结合的百分比是用于评估IgE EMPD肽免疫原构建体的免疫原性的抗体交叉反应和功能效力的重要功能参数。
v)IgE EMPD肽免疫原构建体的免疫原性评估(针对其产生具有高效力以引发定向B细胞分化为IgE分泌的带有IgE的B细胞的细胞凋亡的抗体的能力)
图7显示利用由IgE EMPD免疫原构建体(SEQ ID NO:88至93)产生的多克隆抗IgEEMPD抗体的多种制剂在表达mIgE.FcL Ramos细胞的细胞表面上以剂量依赖性模式引发细胞凋亡。将通过蛋白质A层析从豚鼠血清纯化的多克隆抗IgE EMPD抗体利用2倍连续稀释从1000稀释至62.5ng/mL。使用人源化抗IgE单克隆抗体作为阳性对照。利用4-参数逻辑曲线拟合的非线性回归计算每组多克隆抗IgE EMPD抗体的EC50。
如图7所示,尽管(靶向IgE分子的Fc受体结合CH3结构域的抗IgE单克隆抗体)显示具有表示最高功效的最低EC50数值(121.4ng/mL),但其存在于血清中因为会被血清IgE所中和而会中和掉所有此种诱导细胞凋亡的能力。在测试的所选IgE EMPD肽免疫原构建体(SEQ ID NO:88-93)中,观察到从277.5至536ng/mL的EC50数值表明由于它们与独特EMPD目标区域序列结合而无血清IgE干扰的高诱导细胞凋亡的能力。这些带有IgE的B细胞为定向B细胞分化成IgE分泌的细胞。
利用以IgE EMPD肽免疫原构建体(例如SEQ ID NO:88-93)免疫宿主来诱导这些细胞的细胞凋亡将引发IgE合成的抑制,导致IgE的血清减少,而IgE是过敏性疾病的主要原因。
vi)IgE EMPD肽免疫原构建体的免疫原性评估(针对其产生具有高效力以引发定向B细胞分化为IgE分泌的带有IgE的B细胞的抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)的抗体的能力)
图8显示利用不同IgE EMPD免疫原构建体(SEQ ID NO:88至93)所产生的多克隆抗IgE EMPD抗体的各种制剂能够以数值为30的效应细胞/目标细胞比值针对表达mIgE.FcLRamos细胞引发ADCC。以10μg/mL的浓度使用通过蛋白质A层析从豚鼠血清纯化的多克隆抗IgE EMPD抗体。将IL-2刺激的小鼠脾脏细胞作为效应细胞。以小鼠抗IgE单克隆抗体5D5分泌作为阳性对照。
如图8所示,具有超过20个氨基酸残基的长B细胞表位肽的所有肽免疫原构建体(SEQ ID NO:88-93)引发定向B细胞分化为IgE分泌的带有IgE的B细胞的ADCC,表示以此类肽免疫原构建体免疫宿主后可降低和抑制IgE血清水平。
vii)通过使用具有不同混杂T辅助细胞表位的IgE EMPD衍生肽免疫原构建体以扩大MHC覆盖
在设计用以治疗不同遗传背景患者的医药组合物时,重要的是允许设计覆盖具有不同遗传背景的最大人群。因为衍生自MVF或HBsAg的混杂T辅助细胞表位代表提供此类免疫原性增强的最有效力的T辅助细胞表位之一,因此可设计含有这两种T辅助细胞表位的肽构建体的组合以允许协同免疫原性效应。与由相应的单独肽构建体所引发的免疫反应相比,预期具有相同B细胞表位的两种肽免疫原构建体的混合物可引发可观的免疫反应。
viii)利用由各种IgE EMPD肽免疫原构建体所引发免疫血清(9wpi)针对精细特异性分析进行表位鉴定
包含IgE EMPD肽免疫原构建体的IgE-EMPD疫苗设计是针对作为功能和结构目标的位于IgE-EMPD中间区域的C18-C39特殊环状结构。这种基于结构的设计目的在于保留天然的细胞外环状结构作为免疫原性标靶。
使用1-17(SEQ ID NO:7)、19-38(SEQ ID NO:8)、1-39(SEQ ID NO:5)和7-40(SEQID NO:6)四种代表性IgE-EMPD肽片段以设计B细胞表位肽,其在B细胞表位肽的氨基端或羧基端与(SEQ ID NO:72)或/>(SEQ ID NO:73)连接,以形成原型肽免疫原。在B细胞和Th表位之间使用εK接头或εK-KKK(SEQ ID NO:129)间隔子以形成表3所示的肽免疫原构建体(SEQ ID NO:88至97)。通过环化将具有氨基酸(aa)1-39和7-40的所有肽片段设计为具有C18-C39受拘束的环状结构。
针对由利用其相对应肽免疫原构建体(SEQ ID NO:96、97、88、89、93)免疫的豚鼠所提供高度免疫血清的抗体反应性,使用1-17(SEQ ID NO:7)、19-38(SEQ ID NO:8)、1-39(SEQ ID NO:5)和7-40(SEQ ID NO:6)的个别IgE-EMPD B细胞表位肽以涂覆微量盘的ELISA试验进行评估。结果显示构建体SEQ ID NO:88、89和93引发针对所有四种IGE EMPD B细胞表位肽的高效价抗体,而由IgE-EMPD 1-17(SEQ ID NO:96)和IgE-EMPD 19-38(SEQ ID NO:97)肽免疫原构建体所引发的豚鼠抗血清只具有与其相对应B细胞表位肽(例如SEQ ID NO:7或8)的抗体反应性,其对来自非相对应邻近表位的IgE EMPD B细胞表位肽(SEQ ID NO:8或7)没有交叉反应性,表示免疫原性的高专一性,即设计的免疫原构建体能够引起特异性抗体以与IgE-EMPD相对应B细胞表位结构域反应(表5)。
在用以定位对目标区域内特定残基的抗体结合位点的精细表位鉴定试验中,合成了50个重叠的10-mer肽(SEQ ID NO:10至58),其涵盖来自IgE CH4羧基端前8个氨基酸和IgE-EMPD的1至50个氨基酸序列区域。将这些10-mer肽作为固相免疫吸附物分别涂覆至96孔微量盘上。将以1∶100稀释比例配制于样品稀释缓冲液中的汇集的豚鼠抗血清加到利用2.0μg/mL的10-mer肽涂覆的微量盘孔洞中,随后在37℃下培养1小时。在利用洗涤缓冲液洗涤微量盘孔洞后,加入辣根过氧化物酶(HRP)缀合重组蛋白A/G并培养30分钟。利用PBS再次洗涤后,将底物加入孔洞中,利用ELISA微量盘式分析仪测量450nm处的吸光值,以二重复方式分析样品。IgE-EMPD肽免疫原所引发免疫血清与相对应IgE EMPD B细胞表位肽涂覆孔洞的结合代表最大的抗体结合信号。
精细表位鉴定结果显示来自IgE-EMPD 19-38衍生的肽免疫原构建体(SEQ ID NO:97,具有非环化的线性B细胞表位,H19-R38)的汇集的豚鼠血清识别位于IgE-EMPD中间区域的IgE EMPD 22-31肽(SEQ ID NO:39)。它也与IgE EMPD肽19-38(SEQ ID NO:8)、1-39(SEQID NO:5)和7-40(SEQ ID NO:6)反应,而不是1-17(SEQ ID NO:7)。
利用IgE EMPD 1-17(SEQ ID NO:96,非环化的线性B细胞表位,G1-L17)引发的抗血清识别位于IgE-EMPD氨基端区域的IgE EMPD 8-17(SEQ ID NO:25),以及IgE EMPD1-17(SEQ ID NO:7)、1-39(SEQ ID NO:5)和7-40(SEQ ID NO:6),而不是19-38(SEQ ID NO:8)肽。利用IgE EMPD1-17(SEQ ID NO:96)和IgE EMPD 19-38(SEQ ID NO:97)免疫原构建体引发的抗血清不具有交叉反应性。
有趣的是,利用表位连接至IgE EMPD B细胞表位肽的氨基端(SEQID NO:89)或羧基端(SEQ ID NO:88)的两个对应IgE-EMPD 1-39免疫原构建体产生识别明显不同表位结合模式的免疫血清。由免疫原构建体(SEQ ID NO:89,UBTh1位于肽的氨基端)所诱发的免疫血清只与IgE-EMPD的羧基端区域附近位于aa 30-39的一个10-mer肽(SEQ IDNO:47)强烈反应。它也与位在氨基端区域的IgE EMPD 9-18(SEQ ID NO:26)有微弱反应。
然而,对于其他IgE-EMPD 1-39免疫原构建体(SEQ ID NO:88,UBTh1位于羧基端),诱导的抗血清与以IgE EMPD9-19(SEQ ID NO:27和28)、IgE EMPD 19-31(SEQ ID NO:37、38、39和40)和IgE EMPD 30-43(SEQ ID NO:48、49、50、51和52)作为代表的三个不连续线性表位强烈反应。肽免疫原构建体(SEQ ID NO:88)显示出比IgE EMPD肽免疫原构建体(SEQID NO:89)更强的免疫原性且与更宽广的表面反应。比起IgE EMPD肽免疫原构建体(SEQ IDNO:89),发现与肽免疫原构建体(SEQ ID NO:88)相关的强大的多的免疫原性也显示出在IgE表达淋巴细胞更强的ADCC和细胞凋亡活性。
就IgE-EMPD 7-40免疫原构建体(SEQ ID NO:93,具有位于IgE EMPD B细胞表位肽的氨基端和羧基端的两个UBTh1)而言,其诱发的抗血清识别两个主要抗原性区域,这些区域与由IgE-EMPD 1-39所识别的相似,因为它可与由肽SEQ ID NO:35-41、IgE EMPD 29-43(SEQ ID NO:45-51)所涵盖的位在IgE EMPD 18-33区域内的肽强烈反应。IgE-EMPD 7-40免疫原构建体(SEQ ID NO:93)与IgE-EMPD1-39免疫原构建体(SEQ ID NO:88,UBTh1位于IgEEMPD B细胞表位肽的羧基端)共享相似的表位区域。IgE-EMPD 1-39(SEQ ID NO:88)在所有设计的肽免疫原构建体中显示出最佳功效,如通过与于其精细表位鉴定中所示结果相关的多个功能试验所显示的,因为此免疫原构建体引发可识别位在IgE-EMPD的细胞外膜蛋白质上由三种或更多种B细胞表位肽所涵盖的宽广表面的高结合性多克隆抗体。IgE EMPD30-43(SEQ ID NO:47-51)表位区域代表非常重要的B细胞表位区域,其位于环状结构的羧基端区域,邻近带有IgE的B细胞的基底膜,对抗体介导的细胞凋亡和ADCC敏感。此外,环化的环状结构比起其非环状对应物可呈现更优质的免疫原构建体(表5,SEQ ID NO:88vs SEQ IDNO:88非环化)。
综上所述,设计的合成IgE-EMPD肽免疫原构建体(IgE EMPD 1-39,SEQ ID NO:88)和(IgE EMPD 7-40,SEQ ID NO:93)均具有以IgE EMPD内环状结构作为代表的B细胞表位肽,其连接可引发旺盛免疫反应的表位肽,所产生的多克隆抗体针对位于IgE-EMPD蛋白质上新的表位区域(aa29-43),其因为位置位于中央环状结构的羧基端区域而接近细胞膜,允许尽可能交联多个细胞膜IgE以诱导ADCC和细胞凋亡,以耗竭表达IgE的B淋巴细胞(表5)。
实施例7.被认为是仅针对IgE EMPD肽免疫原构建体的B细胞表位的集中抗体反应
众所周知,用以加强针对标靶B细胞表位肽的免疫反应的所有载体蛋白(例如钥孔血蓝蛋白(KLH)或其他载体蛋白(例如白喉类毒素(DT)和破伤风类毒素(TT)蛋白)),通过将这种B细胞表位肽与各自载体蛋白化学缀合可引发超过90%的抗体是针对增强载体蛋白,而少于10%的抗体是针对免疫宿主中的目标B细胞表位。
因此评估由本发明IgE EMPD肽免疫原构建体所引发的抗体的特异性是重要的。代表的IgE EMPD肽免疫原构建体(SEQ ID NO:94)具有B细胞表位(SEQ ID NO:5),B细胞表位通过间隔子序列εK-KKK(SEQ ID NO:129)连接至异源性T辅助细胞表位(SEQID NO:72),被制备用于抗原性评估。将/>(用于B细胞表位免疫增强作用的T辅助细胞表位肽)涂覆在微量盘上,并将来自接受免疫接种的豚鼠的血清用于测试与用于免疫增强作用的/>肽的交叉反应性。表7显示由IgE EMPD肽免疫原构建体(SEQ IDNO:94)所产生的抗体对相对应之IgE EMPD的标靶B细胞表位(SEQ ID NO:5)具有高度免疫原性;然而,发现大多数(如果不是全部的话)的免疫血清对/>肽(SEQ ID NO:72)没有反应性。
综上所述,引入与仔细选择的T辅助细胞表位连接的目标B细胞表位的免疫原设计导致产生集中且纯粹的免疫反应,其引发仅针对IgE EMPD B细胞表位的抗体,而不是针对用以增强免疫反应的Th表位。对于医药组合物设计,免疫原所产生的免疫反应越具有特异性,其为组合物所提供的安全性越高。因此,本发明IgE EMPD肽免疫原构建体除了对其标靶具有高度特异性以外还高度有效。
实施例8.免疫治疗过敏疫苗对遗传修饰敲入小鼠血清IgE水平的预防和治疗模型的影响
选择SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:93的IgE EMPD肽免疫原构建体以使用表达人类IgE的基因工程小鼠(HuIGHE x Balb/c敲入小鼠的F1后代)在概念验证研究中评估于初级和次级/记忆反应中的IgE产生。
最初,在利用过敏原(例如木瓜蛋白酶)攻毒的致敏化作用之前进行IgE EMPD肽免疫原初次-加强免疫。将八只动物(n=8)分配给六个治疗组别和一个安慰剂组别中的每一个,共7组。针对两种肽免疫原中的每一种,设计在第0、3和5周以i.m.途径利用9(低)、18(中)和40(高)μg/剂的不同剂量的3个次组别。利用ISA 51VG和CpG佐剂配制肽免疫原以增强免疫反应。在安慰剂组别中的小鼠以肌内注射方式在第0、3和5周时仅注射制剂溶液的载体。在第10和16周,所有动物组别,包括安慰剂组别,通过皮下注射途径利用50μg木瓜蛋白酶和TiterMax Gold佐剂致敏(图10)。
如实施例2所述,利用ELISA试验测定两种肽免疫原的抗体反应(针对γ1-em67融合蛋白的IgG效价)。在第0、3、5周利用不同剂量免疫接种的六个实验组别中,所有小鼠均产生强烈的抗体反应。ELISA数据显示来自具有高抗体效价的所有实验组别的血清样品从第3周开始可特异性地结合重组γ1-em67融合蛋白,且直到第20周保持在高效价(图11)。相反地,安慰剂组别中的小鼠不产生针对重组γ1-em67融合蛋白的特异性抗体。这些结果表明,所有治疗组别可产生具有靶向表达IgE的B淋巴细胞的潜力的抗IgE-EMPD抗体,导致IgE生成的抑制。图11说明高抗体效价持续了整个20周的试验期间。这些结果也表明,即使在来自两种疫苗免疫原中的每一种的低剂量组别(9μg/剂)中,肽免疫原(S EQ ID NO:88和SEQ IDNO:93)具有免疫原性以诱导特异性免疫反应,从而产生高效价的抗IgE EMPD抗体。
利用实施例2所述的分析程序,通过测定血清基础IgE水平和过敏原特异性IgE水平来研究对于免疫小鼠的初级和记忆反应中的IgE产生的免疫效果。疫苗接种前和后的血清基础IgE水平如图12所示,其证明了相较于安慰剂组别中相对应时间点的血清基础IgE水平,在所有治疗组别中小鼠血清基础IgE水平逐渐地下降。在第10周,在致敏作用之前,在所有六个治疗组别中基础IgE水平降至最低水平,而安慰剂组别的基础血清IgE水平没有明显改变。此结果表明,与安慰剂组别相比,在第10周,在接受含有IgE EMPD肽免疫原构建体(SEQ ID NO:88或93)疫苗剂型的动物中,所有治疗组别中的基础IgE产生被显著地抑制。图12也显示,即使在第10和16周以过敏原致敏两次之后,所有治疗组别中的基础血清IgE水平在整个20周试验期间都被抑制。
图13和14分别显示利用木瓜蛋白酶在第12周第一次致敏和在第18周第二次致敏所引发过敏原特异性IgE产生。这些结果表明,与安慰剂组别相比,这两种肽免疫原构建体(SEQ ID NO:88和93)可显著地抑制在第一次和第二次过敏原致敏后的木瓜蛋白酶特异性IgE水平。在两种肽免疫原的任何一种中观察到在三种剂量水平之间没有实质差异。如图13所示,在第12周于初次反应中产生过敏原特异性IgE后,在此研究中肽免疫原(SEQ ID NO:88)表达较(SEQ ID NO:93)略好。与安慰剂组别相比,两种IgE EMPD肽免疫原构建体在初级和记忆反应中展现过敏原特异性IgE产生的显著抑制(图13和14)。
为了进一步研究靶向表达IgE的B细胞的IgE-EMPD肽免疫原构建体(SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:93)用以抑制IgE产生和治疗IgE介导过敏性疾病的潜在治疗效果,设计额外的实验计划以评估这两种肽免疫原构建体于HuIGHE敲入小鼠中对致敏化作用/回忆(recall)反应的影响。将六只动物分配给两个治疗组别的每一组(N=6),而四只动物用于安慰剂组别(N=4),总共三组。所有组别的小鼠接受两次致敏,分别是在肽疫苗接种前和后,是于第0周通过皮下途径而于第12周通过足垫途径,利用50μg木瓜蛋白酶/TiterMaxGold佐剂致敏。在两个治疗组别中评估初免-加强免疫方案,此初免-加强免疫方案是在第3、6和8周利用包含两种肽免疫原构建体之一的剂型的40μg/0.1mL的剂量,而安慰剂组别则仅投予佐剂载体(参见图15)。
结果显示,包括安慰剂组别在内利用木瓜蛋白酶致敏的所有组别,在第2周之后在所有的三个组别中均引发了高效价的木瓜蛋白酶特异性IgGs,并且直到第6周(观察的最后期间)仍保持高效价。总血清IgE和木瓜蛋白酶特异性IgE水平在第2周达到最高,然后在第3周开始逐渐下降,并在第6周回归到基线(图16)。
利用IgE EMPD肽免疫原构建体疫苗接种引发可特异性地辨识γ1-em67融合蛋白的高效价抗体。在第3、6和8周三次肽免疫原注射后,引发的抗体IgG效价(针对抗γ1-em67或抗IgE-EMPD)稳定地上升并在第10周达到最高水平(数据未显示)。在第12周,在第二次木瓜蛋白酶致敏后,两个治疗组别都没有显示升高的木瓜蛋白酶特异性IgE水平;然而,在第12和13周于安慰剂组别中的木瓜蛋白酶特异性IgE水平显著地增加,然后在第14周下降到较低水平(数据未显示)。
研究结果表明,相较于安慰剂组别,SEQ ID NO:88和93的IgE EMPD肽免疫原在生物体内能够诱发特异性体液免疫反应以预防记忆B细胞的回忆增殖反应,其于第12周完全阻断由木瓜蛋白酶回忆(recall)所引起的木瓜蛋白酶特异性IgE产生(图17)。整体而言,此研究指出本公开IgE EMPD肽免疫原构建体诱导的抗体反应不仅抑制来自初次致敏作用的过敏原特异性血清IgE产生,而且还稳定抑制来自第二次过敏原攻毒的回忆的过敏原特异性血清IgE。此研究结果证明本公开的发明提供了用以治疗IgE介导过敏性疾病(例如哮喘)的潜在有效的治疗性疫苗。在仔细研究用以减弱过敏原特异性IgE的疗效后,两种肽免疫原(SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:93)在抑制过敏原特异性IgE产生方面表现出相似的功效。
实施例9.于食蟹猴中通过原型免疫治疗过敏疫苗剂型的免疫原性评估进行剂量和剂型研究
a.整体目标:
本研究的目的是评估在20周期间内利用选择的IgE EMPD肽免疫原构建体SEQ IDNO:88进行肌肉内免疫对免疫原性的效果。在进行人体试验之前,选择食蟹猴作为用以评估原型IgE-EMPD肽疫苗制剂和给药方案的免疫原性的动物模型。将代表性肽免疫原构建体(SEQ ID NO:88)配制成两种常用剂型。在第一种剂型中,在与MontanideTMISA51混合形成油包水乳液之前,将SEQ ID NO:88的IgE EMPD肽免疫原构建体与CpG制成稳定化的免疫刺激复合物(A部分研究)。在第二种制剂中,在与ADJUPHOS形成悬浮液剂型之前,将SEQ ID NO:88的IgE EMPD肽免疫原构建体与CpG制成稳定化的免疫刺激复合物(B部分)。在此全面的免疫原性研究中,在每种剂型中评估了每剂从30μg、100μg、300μg至1000μg的四种剂量。
b.计划书摘要
选择2.5-4.0kg的成年食蟹猴以评估IgE EMPD肽免疫原对免疫原性和血清食蟹猴IgE水平的影响。将总共20只食蟹猴分成10组:安慰剂对照动物(n=2)仅利用佐剂(MontanideTMISA 51加CpG寡脱氧核苷酸)或(ADJUPHOS加CpG寡脱氧核苷酸)注射。对实验动物注射IgE EMPD肽免疫原(SEQ ID NO:88),每组别剂量为30、100、300和1,000μg(每只动物总共500μL疫苗体积;每组别n=2,雄性1只和雌性1只)。在第0、3和6周投予总共三次肌肉内免疫接种。在第0、3、6、8、10、12、14、16、20和24周针对免疫原性和血清IgE水平监测所有食蟹猴。
c.抗IgE EMPD抗体效价的测定
在第0、3、6、8、10、12、14、16、20和24周时对所有动物采血。分离每次采血的血清,以使用γ1-cyno em67 ELISA测定抗IgE EMPD抗体效价。安慰剂处理的动物几乎没有可检测到的抗IgE EMPD抗体效价(图18A和18B)。然而,接受三次免疫的所有动物都具有针对IgEEMPD B细胞表位的可检测到的IgG抗体效价,其在第8至12周存在峰值效价。这种特异性反应性以剂量依赖性方式维持了整个24周研究期间(图18A和18B)。发现所有动物对γ1-cynoem67重组蛋白具有高的抗血清效价,其中以每剂于0.5mL中含有300μg的剂量对于两种剂型而言都是最理想的,因为1,000μg剂量制剂会导致在各自的制剂中相对于ISA51V或ADJUPHOS佐剂而言过量的肽免疫原。相较于利用ADJUPHOS/CpG ODN的制剂,结果显示含有ISA51/CpG ODN的制剂具有更高的免疫原性结果。针对IgE EMPD B细胞表位的抗体反应随着每次肽免疫原加强免疫而增强,然后抗IgE EMPD效价随时间逐渐下降。在整个24周的研究中持续显著高的抗血清效价(图18A和18B)。
实施例10.于食蟹猴中具有替代性免疫治疗过敏疫苗效力的证明
a.整体目标:
这项研究的目的是评估于食蟹猴中在20周期间内利用IgE EMPD肽免疫原(其中此序列衍生自自体mIgE)进行肌肉内免疫对免疫原性和血清IgE水平的影响,食蟹猴为接近地模拟人类IgE产生的动物模型。mIgE的IgE EMPD在非人类灵长类动物(例如新和旧世界的猴子和猿类)中于进化上是保守的,并且在其他物种(例如啮齿动物、兔子和犬科动物)中未发现这种IgE EMPD对应物序列。食蟹猴IgE EMPD的氨基酸序列(SEQ ID NO:127)与人类IgEEMPD的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)具有高度的序列一致性(90%)。
b.计划书摘要
选择2.5-4.0kg的成年食蟹猴以评估IgE EMPD肽免疫原对免疫原性和血清食蟹猴IgE水平的影响。将总共12只食蟹猴分成3组:安慰剂对照动物(n=4,2只雄性和2只雌性)仅利用佐剂(MontanideTMISA 51加CpG寡脱氧核苷酸)注射;以300μg的剂量利用IgE EMPD肽免疫原(SEQ ID NO:125或126)注射实验动物(每只动物总共500μL疫苗体积;每组别n=4,2只雄性和2只雌性)。在第0、3和6周投予总共三次肌肉内免疫接种。在第0、3、6、8、10、12、14、16、18和20周针对免疫原性和血清IgE水平监测所有食蟹猴。
c.抗IgE EMPD抗体效价的测定
在第0、3、6、8、10、12、14、16、18和20周时对所有动物采血。分离每次采血的血清,以使用γ1-cyno em67ELISA测定抗IgE EMPD抗体效价。安慰剂处理的动物没有可检测到的抗IgE EMPD抗体效价(图19)。然而,接受利用SEQ ID NO:125或SEQ ID NO:126三次免疫的所有动物都具有针对IgE EMPD B细胞表位的可检测到的IgG抗体效价,其在第8至12周存在峰值效价(图19)。这种特异性反应性维持了整个20周的研究期间。此外,所有接受免疫的动物在整个20周期间内都产生了特异性IgM和IgA抗体效价(图20)。
d.血清IgE水平的测定
在第0、3、6、8、10、12、14、16、18和20周时对所有动物采血。分离每次采血的血清,以使用定量食蟹猴IgE ELISA测定血清IgE。安慰剂组别的基础IgE水平在存活期期间变化。在投予SEQ ID NO:125的组别中所观察到的IgE减少在统计学上是显著的,而在投予SEQ IDNO:126的组别中也显示在监测期间IgE减少的趋势(图19)。
e.结果
评估在替代模型中IgE EMPD肽免疫原对成年食蟹猴血清样品中针对白体mIgE之免疫原性和血清IgE浓度的影响。在此概念验证研究中,利用CpG ODN和MontanideTM ISA 51混合物投予每组别中的四只动物作为安慰剂对照,并且利用300μg食蟹猴IgE EMPD肽免疫原,SEQ ID NO:125或126,与CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)复合形成专利的免疫刺激复合物(ISC),并与MontanideTMISA 51佐剂配制,在第0、3和6周免疫接种8只成年食蟹猴(每组别n=4)。SEQ ID NO:125和126分别是人类IgE EMPD免疫原SEQ ID NO:93和88的对应物。与CpGODN/MontanideTM ISA 51配制的两种食蟹猴衍生的免疫原在所有动物中产生强烈抗IgEEMPD IgG抗体反应(图19)。此外,所有动物产生了针对IgE EMPD的IgM和IgA抗体(图20)。还观察到基础食蟹猴血清IgE的下降趋势(图21)。未记录有不良的注射部位反应。此研究证明具有增强的T细胞表位之合成的IgE EMPD肽免疫原(SEQ ID NO:125和126)(其序列衍生自自体)能够引发强烈的抗IgE EMPD抗体反应,导致IgE生成的抑制,以及基础食蟹猴血清IgE水平降低的趋势。
f.结论
利用IgE EMPD肽免疫原(SEQ ID NO:125和126)或安慰剂对照在20周期间内通过肌肉内途径注射食蟹猴3次。动物具有良好的整体耐受性并且发生免疫耐受。所有接受免疫的食蟹猴均产生短暂的特异性IgM抗体,同时产生针对IgE EMPD构建相对应B细胞表位的有效且持续的IgG(高达105)和IgA(高达104)抗体效价。在每个和所有反应者中观察到基础IgE水平降低。这些结果支持抗IgE-EMPD抗体的作用模式,凭此抗体靶向表达膜结合型IgE的B细胞,导致后续IgE生成的抑制。
表1
血清学分析使用的IgE-EMPD肽及其片段
表1.(续)
表2
在IgE-EMPD衍生的肽免疫原构建体设计中所使用经选择的混杂T辅助细胞表位
表3
在IgE-EMPD肽免疫原构建体设计中用以引发特异性抗体的利用病原体蛋白质衍生Th表位(包括理想人工Th表位)的IgE-EMPD肽片段的抗原性增强
表3.(续)
通过半胱氨酸二硫键使肽环化,半胱氨酸下方划有底线.
表4
IgE-EMPD衍生的肽免疫原构建体于豚鼠中的免疫原性评估
a第1-6组:在0、2、4、6、8和10wpi接受免疫接种:在0、4、6、8、10、12和14wpi采血。
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Claims (4)
1.一种IgE EMPD肽免疫原构建体,其中该肽免疫原构建体选自由SEQ ID NO:88-90、94、95、98-124和130组成的群组。
2.一种包含如权利要求1所述的肽免疫原构建体的组合物。
3.一种医药组合物,包含:
a.如权利要求1所述的肽免疫原构建体;以及
b.药学上可接受的递送载体和/或佐剂。
4.如权利要求3所述的医药组合物,其中
该IgE EMPD肽免疫原构建体与CpG寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotide,ODN)混合以形成稳定化免疫刺激复合物。
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