JP2021510169A - アトピー性皮膚炎の治療及び／または予防のためのｉｌ−３１のペプチド免疫原ならびにその製剤 - Google Patents

Abstract

本開示は、掻痒性症状及び／またはアレルギー症状、例えばアトピー性皮膚炎の治療及び／または予防のための、インターロイキン３１（ＩＬ−３１）タンパク質の一部を標的とする個々のペプチド免疫原構築物に関する。本開示はまた、ペプチド免疫原構築物を含有する組成物、ペプチド免疫原構築物を製造及び使用する方法、ならびにペプチド免疫原構築物によって生成する抗体に関する。【選択図】図１

Description

本出願は、2017年12月11日に出願された米国仮特許出願第62/597,130号の利益を主張するＰＣＴ国際出願であり、参照によりその全体を本明細書に援用する。

発明の分野
本開示は、アトピー性皮膚炎の治療及び／または予防のための、インターロイキン３１（ＩＬ−３１）を標的とするペプチド免疫原構築物及び医薬組成物としてのその製剤に関する。

アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、アメリカ獣医皮膚科大学対策部によって「特徴的な臨床特性を有する遺伝的に罹患しやすい炎症性及び掻痒性のアレルギー性皮膚疾患」と定義されている（Olivry 2001）。委員会はさらに、イヌの疾患がアレルゲン特異的ＩｇＥに関連付けられたことを認めた（Olivry 2001, Marsella & Olivry 2003）。重度の掻痒症は、副次的な脱毛症及び紅斑と併せてペット所有者にとって最も顕著な懸念症候である（米国特許第８，７９０，６５１号）。

アトピー性皮膚炎の有病率は、疫学的データが乏しく一貫性を欠いているために正確には分からないが、イヌ個体群全体の１０％であると見積もられる（Marsella & Olivry 2003, Scott 2002, Hillier 2001）。世界的には約４５０万匹のイヌがこの慢性的な生涯にわたる症状に罹患する。発症率は上昇しているとみられる。血統及び性別の偏りが疑われてきたが、地理的地域によって大きく変化することがある（Hillier 2001, Picco 2008）。

アレルギー性皮膚炎に関与する潜在的因子はいくつもあり、あまり理解されていない。食物中成分（Picco, 2008）、ならびに環境中のアレルゲン、例えば、ハエ、チリダニ、ブタクサ、植物抽出物などがアトピー性皮膚炎の誘因となっている可能性がある。遺伝的因子も重要な役割を果たしている。血統による予測に確証はないが、ある遺伝様式がアトピー性皮膚炎に対する罹患しやすさを増大させると考えられる（Sousa & Marsella 2001, Schwartzman 1971）。

インターロイキン３１（ＩＬ−３１）は、２００４年にクローニングされたサイトカインである。それは主に、活性化されたＴヘルパー（Ｔｈ）２細胞によって産生されるが（Ｄｉｌｌｏｎ ２００４）、マスト細胞及びマクロファージでも産生される。ＩＬ−３１は、ＩＬ−３１受容体Ａ（ＩＬ−３１ＲＡ）及びオンコスタチンＭ受容体（ＯＳＭＲ）からなる共受容体に結合する（Dillon 2004、及びBilsborough 2006）。受容体活性化は、ＪＡＫ受容体（複数可）によるＳＴＡＴのリン酸化をもたらす。共受容体の発現はマクロファージ、角化細胞及び後根神経節において示されている。近年、ＩＬ−３１が皮膚炎、掻痒性皮膚病変、アレルギー及び気道過敏症に関与していることが判明した。

抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体によるＴ細胞の刺激はＩＬ−３１ ｍＲＮＡ発現を即座に上方制御する（Dillon 2004）。マイクロアレイ分析から、ＩＬ−３１が特定の走化性遺伝子、例えば、ＣＸＣＬ１、ＣＬＬ１７（胸腺及び活性化によって調節されるケモカイン（ＴＡＲＣ））、ＣＣＬ１９（マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）３β）、ＣＣＬ２２（単球由来ケモカイン（ＭＤＣ）、ＣＣＬ２３（ＭＩＰ３）及びＣＣＬ４（ＭＩＰβ））を誘導することが示された（Dillon 2004）。

ＩＬ−３１を過剰発現させる遺伝子導入マウスは、皮膚炎症、掻痒症、重度の皮膚炎及び脱毛症を示す（Dillon 2004）。マウスへのＩＬ−３１の皮下注射は、炎症性細胞、好中球、好酸球、リンパ球及びマクロファージによる炎症の誘因となり、表皮肥厚及び皮膚有棘層肥厚を生じさせる。自然の原因によるアトピー性皮膚炎（ＡＤ）を有するＮＣ／Ｎｇａマウスにおいて、ＩＬ−３１は皮膚病変部に過剰発現し、掻痒症と相関している（Takaoka 2005、Takaoka 2006）。また、マウスモデルにおいてＩＬ−３１は掻痒症の急速な発症を誘導することが示された（Raap 2008）。

さらなる試験は、ヒトにおいてＩＬ−３１がアトピー性皮膚炎誘発性皮膚炎症及び掻痒症に関連していることを示した。ヒトＡＤ患者では、ＩＬ−３１ ｍＲＮＡの発現が非病変皮膚よりも皮膚病変部においてかなり強く、非病変皮膚における発現は健常患者からの正常皮膚におけるよりも強い（Sonkoly 2006）。別の試験は、ＡＤ患者の皮膚においてＣＤ４５ＲＯ＋（メモリー）皮膚リンパ球抗原（ＣＬＡ）陽性Ｔ細胞がＩＬ−３１ ｍＲＮＡ及びタンパク質を発現させることを報告した（Bilsborough 2006）。また、患者の皮膚またはアレルギー性接触皮膚炎におけるＩＬ−３１ ｍＲＮＡ過剰発現はＩＬ−４及びＩＬ−１３ ｍＲＮＡ発現と相関しているがインターフェロン（ＩＦＮ）−γ ｍＲＮＡ発現とは相関していない、ということも報告された（Neis 2006）。さらに、慢性特発性蕁麻疹を有するヒト患者ではＩＬ−３１血清レベルが上昇すること、及びＡＤを有する患者ではよりいっそうこうなることが示された（Raap 2010）。また、ヒトにおいてＡＤの重症度と血清ＩＬ−３１レベルとの相関性が認められた（Rapp 2008）。アトピーの個体ではマスト細胞において、ＩｇＥ架橋後に、及びブドウ球菌スーパー抗原への応答として、ＩＬ−３１分泌が増強されることも示された。加えて、ＩＬ−３１はヒト腸筋線維芽細胞においてＩＬ−６、ＩＬ−８、ＣＸＣＬ１、ＣＣ１７及び複数のメタロプロテアーゼを含めたいくつかの炎症促進性伝達物質の産生を刺激することも示された（Yagi 2007）。

環境アレルゲンに対するＩ型過敏症はイヌＡＤの主要な機序であると考えられており、Ｔｈ２媒介性サイトカイン、例えばＩＬ−４のレベルは、ＡＤを有するイヌの皮膚病変部において上昇する（Nuttall 2002）。さらに、炎症性細胞、リンパ球及び好中球による浸潤は、皮膚病変部の悪化の根底にある重要な機序であり、走化性遺伝子、例えば、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＲ４及びＣＣＬ２８／粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）の過剰発現は、ＡＤを有するイヌにおける皮膚病変部の悪化の原因となる（Maeda 2005、Maeda 2002、及びMaeda 2008）。

近年の証拠は、アレルギー性炎症、及びアレルギー性喘息に特徴的な気道上皮応答の促進にＩＬ−３１が関与している可能性があることを示唆している（Chattopadhyay 2007、Wai 2007）。

これらの観察結果は、掻痒性及びアレルギー性症状の両方においてＩＬ−３１が重大な役割を果たしているという仮説を支持する。イヌ、ネコ及び／またはヒトにおける掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎を治療するのに有用な、ＩＬ−３１に対する抗体を誘発することができるペプチド免疫原を提供することが望ましかろう。

参考文献：
1. BAMMERT, et al., 米国特許第8,790,651号(2014年7月29日発行)
2. BILSBOROUGH, et al., J Allergy Clin Immunol., 117(2): 418-25(2006)
3. CHATTOPADHYAY, et al., J Biol Chem, 282: 3014-26(2007)
4. LENG, et al., 米国特許第8,426,163号(2013年4月23日発行)
5. DILLON, et al., Nat Immunol, 5:752-60(2004)
6. HILLIER, Veterinary Immunology and Immunopathology, 81: 147-151(2001)
7. MAEDA, et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 90, 145-154;(2002)
8. MAEDA, et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 103, 83-92;(2003)
9. MAEDA, et al., J. Vet. Med. Sci., 70, 51-55(2008)
10. MARSELLA & OLIVRY, Clinics in Dermatology, 21:122-133(2003)
11. NEIS, et al., J. Allergy Clin. Immunol., 118, 930-937(2006)
12. NUTTALL, et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 87, 379-384(2002)
13. OLIVRY, et al., Veterinary Immunology and Immunopathology, 81:143-146(2001)
14. PICCO, et al., Vet Dermatol., 19: 150-155(2008)
15. RAAP, et al., J Allergy Clin Immunol., 122(2):421-3(2008)
16. RAAP, et al., Exp Dermatol., 19(5): 464-6(2010)
17. SCHWARTZMAN, et al., Clin. Exp. Immunol., 9: 549-569(2971)
18. SCOTT, et al., Canadian Veterinary Journal, 43: 601-603(2002)
19. SONKOLY, et al., J Allergy Clin Immunol., 117: 411-7(2006)
20. SOUSA, et al., Veterinary Immunology and Immunopathology, 81:153-157(2001)
21. TAKAOKA, et al., Eur J. Pharmacol., 516, 180-181(2005)
22. TAKAOKA, et al., Exp. Dermatol., 15, 161-167(2006)
23. WAI, et al., Immunology, 122, 532-541(2007)
24. WALKER, et al., 米国特許第6,361,966号(2002年3月26日発行)
25. YAGI, et al., International Journal of Molecular Medicine, 19(6): 941-946(2007)
26. “Atopic Dermatitis”, Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address: en.wikipedia.org/wiki/Atopic_dermatitis (2017年12月8日アクセス)。
27. “Interleukin 31”, Wikipedia, The Free Encyclopedia, website address: en.wikipedia.org/wiki/Interleukin_31 (2017年12月8日アクセス)。

本開示は、掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎の治療及び／または予防のための、インターロイキン３１（ＩＬ−３１）タンパク質の一部を標的とする個々のペプチド免疫原構築物に関する。本開示はさらに、ペプチド免疫原構築物を含有する組成物、ペプチド免疫原構築物を製造及び使用する方法、ならびにペプチド免疫原構築物によって生成する抗体に関する。

本開示のペプチド免疫原構築物は、約２５アミノ酸以上を含有する。ペプチド免疫原構築物は、イヌＩＬ−３１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＨ９７７４２．１）の一部からのＢ細胞エピトープを含有する。イヌ及びｂヒトＩＬ−３１タンパク質の完全長アミノ酸配列を表１のそれぞれ配列番号１及び配列番号２に示す。Ｂ細胞エピトープは、病原体タンパク質に由来する異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに任意選択の異種スペーサーによって結合し得る。本開示のペプチド免疫原構築物は、ＩＬ−３１を指向する高特異性抗体の生成を刺激する。本開示のペプチド免疫原構築物は、掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎に罹患している動物のための免疫療法として使用され得る。

ペプチド免疫原構築物のＢ細胞エピトープ部分は、完全長イヌＩＬ−３１タンパク質（配列番号１）または完全長ヒトＩＬ−３１タンパク質（配列番号２）からのアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、表１に示される配列番号１〜１３及び配列番号９３〜９８のいずれかを含有する配列を有する。

本開示のペプチド免疫原構築物は、表２に示される、病原性タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープアミノ酸配列（例えば配列番号１４〜４２）を含有し得る。特定の実施形態では、異種Ｔｈエピトープは、天然の病原体、例えば、ジフテリア毒素（配列番号１８）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（配列番号１９）、コレラ毒素（配列番号２１）に由来するものである。他の実施形態では、異種Ｔｈエピトープは、麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ１〜５）またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ１〜３）に由来し単一の配列か組み合わせた配列かのどちらかの形態にある理想人工Ｔｈエピトープ（例えば配列番号２５、２４及び２６）である。

いくつかの実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、任意選択の異種スペーサーによって異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに結合された、ＩＬ−３１からのＢ細胞エピトープを含有する。特定の実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、病原性タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープ（配列番号１４〜４２）に任意選択の異種スペーサーによって結合された、ＩＬ−３１からのアミノ酸配列（例えば配列番号１〜１３及び配列番号９３〜９８）を有するＢ細胞抗原性部位を含有する。いくつかの実施形態では、任意選択の異種スペーサーは、２つのアミノ酸及び／またはペプチドを一緒に結合できる分子または化学構造である。特定の実施形態では、スペーサーは、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸またはその組合せである。具体的な実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、表３に示される配列番号４３〜９０及び配列番号９９〜１０５のアミノ酸配列を有する。

本開示はさらに、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を含有する組成物に関する。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、１つより多いＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を含有する。特定の実施形態では、組成物は、対象の広範な遺伝的背景を対象範囲に含めるためにＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の混合物（例えば、配列番号４３〜９０及び配列番号９９〜１０５の任意の組合せ）を含有する。ペプチド免疫原構築物の混合物を含有する組成物は、単一のペプチド免疫原構築物のみを含有する組成物と比較して、掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎の治療のために免疫したときの奏効者率のより高い百分率につながり得る。

本開示はさらに、掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎の治療及び／または予防のための医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＣｐＧオリゴマーと、ペプチド免疫原複合体を含有する組成物とを混合することで静電会合によって形成された安定化免疫刺激性複合体の形態で本開示のペプチド免疫原構築物を含有する。そのような安定化免疫刺激性複合体は、ペプチド免疫原構築物の免疫原性をさらに増強することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、アジュバント、例えば、ミョウバンゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）、リン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）を含めた無機塩、またはＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５０Ｖ２、ＩＳＡ５１もしくはＩＳＡ７２０を含めた油中水エマルションを含有する。

本開示はさらに、本開示のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を指向する抗体に関する。特に、本開示のペプチド免疫原構築物は、対象に投与されると、ＩＬ−３１アミノ配配列（配列番号１〜１３）に関して交差反応性である高特異性抗体の生成を刺激することができる。ペプチド免疫原構築物によって生成する高特異性抗体は、組換えＩＬ−３１含有タンパク質に関して交差反応性である。本開示の抗体は、免疫原性増強のために採用される異種Ｔｈエピトープを指向することがあったとしてもあまりなく、高い特異性でＩＬ−３１に結合するが、このことは、そのようなペプチド抗原性増強のために使用される従来のタンパク質または他の生物学的担体とは極めて対照的である。

本開示には、本開示のペプチド免疫原構築物及び／またはペプチド免疫原構築物を指向する抗体を使用して掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎を治療及び／または予防する方法も含まれる。いくつかの実施形態では、掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎を治療及び／または予防する方法は、本開示のペプチド免疫原構築物を含有する組成物を宿主に投与することを含む。特定の実施形態では、方法において利用される組成物は本開示のペプチド免疫原構築物を、ＣｐＧオリゴマーなどの負に帯電したオリゴヌクレオチドとの静電会合による安定な免疫刺激性複合体の形態で含有し、この複合体には任意選択的に、アジュバントとしての無機塩または油が、掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎を有する対象への投与のためにさらに補充されている。本開示の方法はさらに、投薬計画、剤形、ならびに掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎の危険性があるまたはそれを有する宿主にペプチド免疫原構築物を投与するための投与経路を含む。

図１Ａ〜図１Ｂ− 構造的及び機能的特徴を強調したイヌＩＬ−３１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）（Ａ）、ならびに完全長イヌＩＬ−３１タンパク質に対する配列アラインメント及び本開示で使用される抗原性部位の位置特定（Ｂ）。 図２− アジュバントＩＳＡ５０Ｖ２中にＩＬ−３１ペプチド免疫原を含有する様々な製剤をモルモットに免疫した後の組換えイヌＩＬ−３１タンパク質に関する抗ＩＬ−３１ポリクローナル抗体価（Ｌｏｇ_１０）を示すグラフ。注射後週数（ｗｐｉ）３、６、９、１２及び１５の時に試料を分析した。 図３Ａ〜図３Ｄ− 哺乳動物細胞（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ）における発現のためのＣ末端にＨｉｓタグを有するイヌＩＬ−３１のプラスミドマップ（図３Ａ）、ならびに細胞溶解物及び培養培地から得られた、抗Ｈｉｓタグ抗体をプローブとするウェスタンブロット（図３Ｂ）。Ｈｉｓタグ付きＩＬ−３１タンパク質発現のクーマシーブルー染色、及び１２％ビストリスＳＤＳ ＰＡＧＥで行った精製（図３Ｃ）。抗Ｈｉｓタグ抗体をプローブとする、Ｃに示されるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロット（図３Ｄ）。 図３Ａ〜図３Ｄ− 哺乳動物細胞（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ）における発現のためのＣ末端にＨｉｓタグを有するイヌＩＬ−３１のプラスミドマップ（図３Ａ）、ならびに細胞溶解物及び培養培地から得られた、抗Ｈｉｓタグ抗体をプローブとするウェスタンブロット（図３Ｂ）。Ｈｉｓタグ付きＩＬ−３１タンパク質発現のクーマシーブルー染色、及び１２％ビストリスＳＤＳ ＰＡＧＥで行った精製（図３Ｃ）。抗Ｈｉｓタグ抗体をプローブとする、Ｃに示されるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロット（図３Ｄ）。 図３Ａ〜図３Ｄ− 哺乳動物細胞（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ）における発現のためのＣ末端にＨｉｓタグを有するイヌＩＬ−３１のプラスミドマップ（図３Ａ）、ならびに細胞溶解物及び培養培地から得られた、抗Ｈｉｓタグ抗体をプローブとするウェスタンブロット（図３Ｂ）。Ｈｉｓタグ付きＩＬ−３１タンパク質発現のクーマシーブルー染色、及び１２％ビストリスＳＤＳ ＰＡＧＥで行った精製（図３Ｃ）。抗Ｈｉｓタグ抗体をプローブとする、Ｃに示されるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロット（図３Ｄ）。 図４Ａ〜図４Ｂ− ＩＬ−３１抗体を使用した試験管内でのＩＬ−３１誘導シグナル伝達機能阻害アッセイを示す模式図（図４Ａ）。アッセイステップの拡大図を図４Ｂに示す。 図４Ａ〜図４Ｂ− ＩＬ−３１抗体を使用した試験管内でのＩＬ−３１誘導シグナル伝達機能阻害アッセイを示す模式図（図４Ａ）。アッセイステップの拡大図を図４Ｂに示す。 図５Ａ〜図５Ｂ− ｅｘｐｉ２９３細胞から産生されたイヌＩＬ−３１によって誘導されるイヌＤＨ８２単球におけるＳＴＡＴ３のリン酸化レベルを測定する試験管内での機能アッセイの確立を示すグラフ。図５Ａは、イヌＩＬ−３１によって用量依存的にｐＳＴＡＴ３が誘導されたことを示す。図５Ｂは、イヌＩＬ−３１によって時間依存的にｐＳＴＡＴ３が誘導されたことを示す。 図６Ａ〜図６Ｂ− 初回免疫後週数（ｗｐｉ）１２（図６Ａ）及び１５ｗｐｉ（図６Ｂ）のときに示す、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号４３、４７、５１、５５及び５９）から得られる抗ＩＬ−３１抗体によるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１（１μｇ／ｍＬ）誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達の阻害を示すグラフ。 図７− 注射後週数（ｗｐｉ）１５の時の、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物ｐ４７５１ｋｂ（配列番号４３）及びｐ４７５２（配列番号４７）から得られる抗ＩＬ−３１抗体によるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１（１μｇ／ｍＬ）誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達の阻害を示すグラフ。下のパネルは、組換えイヌＩＬ−３１タンパク質誘導ｐＳＴＡＴシグナル伝達に対する阻害（ＩＣ_５０）を報告する。 図８− アジュバントＩＳＡ５０Ｖ２中にＩＬ−３１ペプチド免疫原（配列番号６３、６８、７１、７６、８０、８４）を含有する製剤をモルモットに免疫した後の組換えイヌＩＬ−３１タンパク質に関する抗ＩＬ−３１ポリクローナル抗体価（Ｌｏｇ_１０）を示すグラフ。免疫後週数（ｗｐｉ）３、６、９、１２及び１５の時に試料を分析した。 図９Ａ〜図９Ｂ− 初回免疫後週数（ｗｐｉ）６及び１２のときに示す、本開示のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号６３、６８、７１、７６、８０及び８４）から得られる抗ＩＬ−３１抗体によるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１（１μｇ／ｍＬ）誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達のリン酸化率（図９Ａ）及び阻害率（図９Ｂ）を示すグラフ。 図９Ａ〜図９Ｂ− 初回免疫後週数（ｗｐｉ）６及び１２のときに示す、本開示のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号６３、６８、７１、７６、８０及び８４）から得られる抗ＩＬ−３１抗体によるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１（１μｇ／ｍＬ）誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達のリン酸化率（図９Ａ）及び阻害率（図９Ｂ）を示すグラフ。 図１０Ａ〜図１０Ｂ− 初回免疫後週数（ｗｐｉ）９及び１２のときに示す、本開示のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号６３、６８、７１及び６４）から得られる抗ＩＬ−３１抗体によるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１（１μｇ／ｍＬ）誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達のリン酸化率（図１０Ａ）及び阻害率（図１０Ｂ）を示すグラフ。 図１０Ａ〜図１０Ｂ− 初回免疫後週数（ｗｐｉ）９及び１２のときに示す、本開示のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号６３、６８、７１及び６４）から得られる抗ＩＬ−３１抗体によるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１（１μｇ／ｍＬ）誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達のリン酸化率（図１０Ａ）及び阻害率（図１０Ｂ）を示すグラフ。 図１１Ａ〜図１１Ｂ− 初回免疫後週数（ｗｐｉ）６、９及び１２の時の、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物ｐ４８５４ｋｂ（配列番号６３）及びｐ４８５９（配列番号８４）から得られる抗ＩＬ−３１抗体によるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１（１μｇ／ｍＬ）誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達のリン酸化率（図１１Ａ）及び阻害率（図１１Ｂ）を示す棒グラフ。 図１１Ａ〜図１１Ｂ− 初回免疫後週数（ｗｐｉ）６、９及び１２の時の、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物ｐ４８５４ｋｂ（配列番号６３）及びｐ４８５９（配列番号８４）から得られる抗ＩＬ−３１抗体によるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１（１μｇ／ｍＬ）誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達のリン酸化率（図１１Ａ）及び阻害率（図１１Ｂ）を示す棒グラフ。 図１２− 初回免疫後週数（ｗｐｉ）６、９及び１２の時の、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物ｐ４８５４ｋｂ（配列番号６３）及びｐ４８５９（配列番号８４）から得られる抗ＩＬ−３１抗体によるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１（１μｇ／ｍＬ）誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達のリン酸化率（Ａ）及び阻害率（Ｂ）を示す曲線グラフ。下のパネルは、組換えイヌＩＬ−３１タンパク質誘導ｐＳＴＡＴシグナル伝達に対する阻害（ＩＣ_５０）を報告する。 図１３− イヌＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号８４）を使用するビーグル犬の免疫付与プロトコール。 図１４− ビーグル犬におけるＢ細胞エピトープペプチドに対するヒトＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号８４）の免疫原性（Ｌｏｇ_１０）（第２Ａｂ：ヤギ抗イヌＩｇＧ ＨＲＰ）の評価。 図１５− 初回免疫後日数（ＤＰＩ）２１及び４１の時の、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号８４）を用いたｒｃＩＬ−３１タンパク質に対するイヌ血清抗体価（Ｌｏｇ１０）（第２Ａｂ：ウサギ抗イヌＩｇＧ ＨＲＰ）。 図１６− 初回免疫後日数（ＤＰＩ）２１及び４１の時の、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号８４）を用いたｒｃＩＬ−３１タンパク質に対するイヌ血清抗体価（Ｌｏｇ１０）（第２Ａｂ：プロテインＡ／Ｇ−ＨＲＰ）。 図１７Ａ〜図１７Ｂ− イヌ免疫血清（代表的試料１〜１０）からの精製ＩｇＧによるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１誘導ｐＳＴＡＴシグナル伝達のリン酸化率（図１７Ａ）及び阻害率（図１７Ｂ）を示すグラフ。 図１７Ａ〜図１７Ｂ− イヌ免疫血清（代表的試料１〜１０）からの精製ＩｇＧによるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１誘導ｐＳＴＡＴシグナル伝達のリン酸化率（図１７Ａ）及び阻害率（図１７Ｂ）を示すグラフ。 図１８Ａ〜図１８Ｂ− Ｃｙｔｏｐｏｉｎｔ（抗ＩＬ−３１ｍＡｂ）によるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１誘導ｐＳＴＡＴシグナル伝達のリン酸化率（図１８Ａ）及び阻害率（図１８Ｂ）を示すグラフ−ＩＣ_５０：３．２１μｇ／ｍＬ。 図１９Ａ〜図１９Ｃ− 様々なＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号８３及び配列番号８５）で免疫されるモルモットの免疫付与及び採血のスケジュールを示す模式図を図１９Ａに示す。それぞれ６及び１５ｗｐｉのモルモット免疫血清からの精製ＩｇＧによるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１誘導ｐＳＴＡＴシグナル伝達のリン酸化率（図１９Ｂ）及び阻害率（図１９Ｃ）を示すグラフ。 図１９Ａ〜図１９Ｃ− 様々なＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号８３及び配列番号８５）で免疫されるモルモットの免疫付与及び採血のスケジュールを示す模式図を図１９Ａに示す。それぞれ６及び１５ｗｐｉのモルモット免疫血清からの精製ＩｇＧによるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１誘導ｐＳＴＡＴシグナル伝達のリン酸化率（図１９Ｂ）及び阻害率（図１９Ｃ）を示すグラフ。 図２０Ａ〜図２０Ｂ− モルモットにおける様々なヒトＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号８７、９９、１００及び１０１）の免疫原性を示すグラフ（図２０Ａ）であり、併せて各構築物のＬｏｇＥＣ_５０のまとめ（図２０Ｂ）を示す。 図２１− ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号８７、９９、１００及び１０１）に対するモルモット免疫血清からのＩＬ−３１反応性ポリクローナル抗体による、ＩＬ−３１とＩＬ−３１Ｒαとの相互作用の阻害を示すグラフであり、併せて各構築物のＩＣ_５０のまとめを示す。 図２２− ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号８７及び１０１）に対するモルモット血清からのＩＬ−３１反応性ポリクローナル抗体による、Ｕ８７ＭＧ細胞でのＩＬ−３１誘導ＳＴＡＴ３リン酸化の抑制。 図２３− ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号８７及び１０１）に対するモルモット血清からのＩＬ−３１反応性ポリクローナル抗体による、ＨａＣａＴ細胞でのＩＬ−３１誘導ＩＬ−２０発現の抑制。 図２４Ａ〜図２４Ｂ− 様々な多成分製剤の中の代表的ヒトＩＬ−３１ペプチド構築物（配列番号１０１）の免疫原性を示すグラフ（図２４Ａ）であり、併せて各製剤のＬｏｇＥＣ_５０のまとめ（図２４Ｂ）を示す。 図２５Ａ〜図２５Ｂ− ヒトＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号１０１）に対するモルモット免疫血清からのＩＬ−３１反応性ポリクローナル抗体による、ＩＬ−３１とＩＬ−３１αとの相互作用の阻害を示すグラフ（Ａ）であり、併せて各製剤のＩＣ_５０のまとめ（Ｂ）を示す。 図２６− 様々な製剤の中のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号１０１）に対するモルモット血清からのＩＬ−３１反応性ポリクローナル抗体による、ＨａＣａＴ細胞でのＩＬ−３１誘導ＩＬ−２０発現の抑制。

本開示は、掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎の治療及び／または予防のための、インターロイキン３１（ＩＬ−３１）タンパク質の一部を標的とする個々のペプチド免疫原構築物に関する。本開示はまた、ペプチド免疫原構築物を含有する組成物、ペプチド免疫原構築物を製造及び使用する方法、ならびにペプチド免疫原構築物によって生成する抗体に関する。

本開示のペプチド免疫原構築物は約２５アミノ酸以上を含有する。ペプチド免疫原構築物は、イヌＩＬ−３１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＨ９７７４２．１）の一部からのＢ細胞エピトープを含有する。イヌ及びヒトＩＬ−３１タンパク質の完全長アミノ酸配列はそれぞれ表１中の配列番号１及び配列番号２に示される。Ｂ細胞エピトープは、病原体タンパク質に由来する異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに任意選択の異種スペーサーによって結合され得る。本開示のペプチド免疫原構築物は、ＩＬ−３１を指向する高特異性抗体の生成を刺激する。本開示のペプチド免疫原構築物は、掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎に罹患している動物のための免疫療法として使用され得る。

ペプチド免疫原構築物のＢ細胞エピトープ部分は、完全長イヌＩＬ−３１タンパク質（配列番号１）または完全長ヒトＩＬ−３１タンパク質（配列番号２）からのアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、表１に示される配列番号１〜１３及び配列番号９３〜９８のいずれかを含有する配列を有する。

本開示のペプチド免疫原構築物は、表２に示される、病原性タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープアミノ酸配列（例えば配列番号１４〜４２）を含有し得る。特定の実施形態では、異種Ｔｈエピトープは、天然の病原体、例えば、ジフテリア毒素（配列番号１８）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（配列番号１９）、コレラ毒素（配列番号２１）に由来するものである。他の実施形態では、異種Ｔｈエピトープは、麻疹ウイルス融合タンパク質（ＭＶＦ１〜５）またはＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ１〜３）に由来し単一の配列か組み合わせた配列かのどちらかの形態にある理想人工Ｔｈエピトープ（例えば配列番号２５、２４及び２６）である。

いくつかの実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、任意選択の異種スペーサーによって異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに結合された、ＩＬ−３１からのＢ細胞エピトープを含有する。特定の実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、病原性タンパク質に由来する異種Ｔｈエピトープ（配列番号１４〜４２）に任意選択の異種スペーサーによって結合された、ＩＬ−３１からのアミノ酸配列（例えば配列番号１〜１３及び配列番号９３〜９８）を有するＢ細胞抗原性部位を含有する。いくつかの実施形態では、任意選択の異種スペーサーは、２つのアミノ酸及び／またはペプチドを一緒に結合できる分子または化学構造である。特定の実施形態では、スペーサーは、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸またはその組合せである。具体的な実施形態では、ペプチド免疫原構築物は、表３に示される配列番号４３〜９０及び配列番号９９〜１０５のアミノ酸配列を有する。

本開示はさらに、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を含有する組成物に関する。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、１つより多いＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を含有する。特定の実施形態では、組成物は、対象の広範な遺伝的背景を対象範囲に含めるためにＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の混合物（例えば、配列番号４３〜９０及び配列番号９９〜１０５の任意の組合せ）を含有する。ペプチド免疫原構築物の混合物を含有する組成物は、単一のペプチド免疫原構築物のみを含有する組成物と比較して、掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎の治療のために免疫したときの奏効者率のより高い百分率につながり得る。

本開示はさらに、掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎の治療及び／または予防のための医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＣｐＧオリゴマーと、ペプチド免疫原複合体を含有する組成物とを混合することで静電会合によって形成された安定化免疫刺激性複合体の形態で本開示のペプチド免疫原構築物を含有する。そのような安定化免疫刺激性複合体は、ペプチド免疫原構築物の免疫原性をさらに増強することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、アジュバント、例えば、ミョウバンゲル（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）、リン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）を含めた無機塩、またはＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ５０Ｖ２、ＩＳＡ５１もしくはＩＳＡ７２０を含めた油中水エマルションを含有する。

本開示はさらに、本開示のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を指向する抗体に関する。特に、本開示のペプチド免疫原構築物は、対象に投与されると、ＩＬ−３１アミノ配配列（配列番号１〜１３及び配列番号９３〜９８）に関して交差反応性である高特異性抗体の生成を刺激することができる。ペプチド免疫原構築物によって生成する高特異性抗体は、組換えＩＬ−３１含有タンパク質に関して交差反応性である。本開示の抗体は、免疫原性増強のために採用される異種Ｔｈエピトープを指向することがあったとしてもあまりなく、高い特異性でＩＬ−３１に結合するが、このことは、そのようなペプチド抗原性増強のために使用される従来のタンパク質または他の生物学的担体とは極めて対照的である。

本開示には、本開示のペプチド免疫原構築物及び／またはペプチド免疫原構築物を指向する抗体を使用して掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎を治療及び／または予防する方法も含まれる。いくつかの実施形態では、掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎を治療及び／または予防する方法は、本開示のペプチド免疫原構築物を含有する組成物を宿主に投与することを含む。特定の実施形態では、方法において利用される組成物は本開示のペプチド免疫原構築物を、ＣｐＧオリゴマーなどの負に帯電したオリゴヌクレオチドとの静電会合による安定な免疫刺激性複合体の形態で含有し、この複合体には任意選択的に、アジュバントとしての無機塩または油が、掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎を有する対象への投与のためにさらに補充されている。本開示の方法はさらに、投薬計画、剤形、ならびに掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎の危険性があるまたはそれを有する宿主にペプチド免疫原構築物を投与するための投与経路を含む。

本明細書中で使用される節の見出しは、単なる構成上の目的のためのものにすぎず、記載されている主題を限定していると解釈すべきでない。本願中で引用される全ての参考文献または参考文献の一部は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために本明細書に明示的に援用される。

特に説明がない限り、本明細書中で使用する全ての科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には複数形の意味が含まれており、但し、そうでないことが文脈によって明らかに示されている場合を除く。同様に、「または」という単語には「及び」を含むことを意図しており、但し、そうでないことが文脈によって明らかに示されている場合を除く。したがって、「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、またはＢ、またはＡとＢを含むことを意味する。さらに、ポリペプチドに対して与えられる全てのアミノ酸サイズ及び全ての分子量または分子質量値がおおよそのものであり説明のために提供されていることは理解される。本明細書に記載のものと類似するまたは等価である方法及び材料を本開示の方法の実施または検査に使用することはできるが、以下では好適な方法及び材料が記載されている。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。対立がある場合には用語の説明を含めて本明細書が優先されることになる。加えて、材料、方法及び実施例は例示であるにすぎず、限定を意図していない。

ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物
本開示は、直接、または任意選択の異種スペーサーによって、異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに共有結合された、ＩＬ−３１からのアミノ酸配列を有するＢ細胞エピトープを含有する、ペプチド免疫原構築物を提供する。

「ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物」または「ペプチド免疫原構築物」という語句は、本明細書中で使用される場合、（ａ）イヌＩＬ−３１（配列番号１）またはヒトＩＬ−３１（配列番号２）の完全長配列からの約１５アミノ酸残基以上を有するＢ細胞エピトープ；（ｂ）異種Ｔｈエピトープ；及び（ｃ）任意選択の異種スペーサーを含有する、ペプチドを指す。

特定の実施形態では、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物は、式：
（Ｔｈ）_ｍ−（Ａ）_ｎ−（ＩＬ−３１断片）−Ｘ
または
（ＩＬ−３１断片）−（Ａ）_ｎ−（Ｔｈ）_ｍ−Ｘ
〔式中、
Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり、
Ａは異種スペーサーであり、
（ＩＬ−３１断片）は、配列番号１または配列番号２からの約１５〜約７５アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープであり、
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨまたはα−ＣＯＮＨ_２であり、
ｍは１〜約４であり、
ｎは０〜約１０である〕
で表すことができる。

本開示のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の様々な構成要素について以下に説明する。

ａ．ＩＬ−３１断片
本開示のペプチド免疫原構築物は、合計約２５アミノ酸以上を含有し、約１５アミノ酸がＩＬ−３１タンパク質からのものである。ペプチド免疫原構築物は、表１に示される配列番号１のアミノ酸配列を有するイヌＩＬ−３１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＨ９７７４２．１）または表１に示される配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＩＬ−３１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＳ８６４４８．１）からの、Ｂ細胞エピトープを含有する。Ｂ細胞エピトープは、病原体タンパク質に由来する異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに任意選択の異種スペーサーによって結合され得る。本開示のペプチド免疫原構築物は、ＩＬ−３１を指向する高特異性抗体の生成を刺激する。本開示のペプチド免疫原構築物は、掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎を有する対象のための免疫療法として使用され得る。

いくつかの実施形態では、Ｂ細胞エピトープは、表１に示される配列番号１〜１３及び配列番号９３〜９８のいずれかを含有する配列を有する。表１に示されるＩＬ−３１断片は例示的なものであり、本開示には、配列番号１及び配列番号２のそれぞれ完全長イヌＩＬ−３１タンパク質またはヒトＩＬ−３１タンパク質の他の任意の断片が含まれる。

ｂ．異種Ｔヘルパー細胞エピトープ（Ｔｈエピトープ）
本開示は、直接、または任意選択の異種スペーサーによって、異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに共有結合された、ＩＬ−３１からのＢ細胞エピトープを含有する、ペプチド免疫原構築物を提供する。

ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物中の異種ＴｈエピトープはＩＬ−３１断片の免疫原性を増強し、これが、合理的なデザインによって最適化された標的Ｂ細胞エピトープ（すなわち、ＩＬ−３１断片）を指向する特異的な高力価抗体の生成を促進する。

本明細書中で使用する「異種」という用語は、ＩＬ−３１の野生型配列の一部でないまたはそれと相同的でないアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を指す。したがって、異種Ｔｈエピトープは、ＩＬ−３１中に天然に認められないアミノ酸配列に由来するＴｈエピトープである（つまり、ＴｈエピトープはＩＬ−３１に対して自家ではない）。ＴｈエピトープはＩＬ−３１に対して異種であるため、異種ＴｈエピトープをＩＬ−３１断片に共有結合される場合にＩＬ−３１の天然アミノ酸配列はＮ末端側またはＣ末端側のどちらの方向にも伸長されない。

本開示の異種Ｔｈエピトープは、ＩＬ−３１中に天然に認められるアミノ酸配列を有さない任意のＴｈエピトープであり得る。Ｔｈエピトープは、任意の種（例えば、ヒト、ブタ、ウシ、イヌ、ラット、マウス、モルモットなど）に由来するアミノ酸配列を有し得る。Ｔｈエピトープは、複数の種のＭＨＣクラスＩＩ分子に対する無差別的結合モチーフを有する場合もある。特定の実施形態では、Ｔヘルパー細胞を最大限に活性化させて免疫応答の開始及び調節をもたらすべく、Ｔｈエピトープは複数の無差別的ＭＨＣクラスＩＩ結合モチーフを含む。Ｔｈエピトープは好ましくはそれ自体では免疫サイレントであり、つまり、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物によって生成した抗体のうちＴｈエピトープに向かって指向することになるものがあったとしてもほとんどなく、それゆえ、標的とするＩＬ−３１断片のＢ細胞エピトープを指向する非常に集中的な免疫応答が可能になる。

本開示のＴｈエピトープとしては、限定されないが、表２中に例示されているような外来病原体に由来するアミノ酸配列（配列番号１４〜４２）が挙げられる。さらに、エピトープには、理想人工Ｔｈエピトープ及び混成理想人工Ｔｈエピトープ（例えば配列番号１５及び配列番号２２〜２８）が含まれる。混成配列（例えば配列番号２３〜２６）として提示される異種Ｔｈエピトープペプチドは、その特定ペプチドの相同体の可変残基を基準としてペプチドの枠組み内での特定位置に表されるアミノ酸残基の混合物を含有する。混成ペプチドの組立体は、合成工程中に１つの特定のアミノ酸の代わりに指定の保護されたアミノ酸の混合物を特定位置に加えることによって１工程で合成され得る。そのような混成異種Ｔｈエピトープペプチド組立体は、多様な遺伝的背景を有する動物に対する広いＴｈエピトープ対象範囲を可能にすることができる。異種Ｔｈエピトープペプチドの代表的な混成配列としては、表２に示される配列番号２３〜２６が挙げられる。本発明のエピトープペプチドは、遺伝的に多様な個体群からの動物及び患者に対して広範な反応性及び免疫原性を示す。

Ｔｈエピトープを含むＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物は、ＩＬ−３１断片と一緒に単一の固相ペプチド合成において同時に製造される。Ｔｈエピトープには、Ｔｈエピトープの免疫学的類縁体も含まれる。免疫学的Ｔｈ類縁体としては、免疫増強性類縁体、交差反応性類縁体、及びＩＬ−３１断片に対する免疫応答を増強または刺激するのに十分なこれらのＴｈエピトープのいずれかのセグメントが挙げられる。

Ｔｈエピトープペプチドの機能性免疫学的類縁体も有効であり、本発明の一部として含まれる。機能性免疫学的Ｔｈ類縁体は、ＴｈエピトープのＴｈ刺激機能を本質的に変化させないＴｈエピトープにおける１〜約５アミノ酸残基の保存的置換、追加、欠失及び挿入を含み得る。保護的置換、追加及び挿入は、ＩＬ−３１断片について上述した天然または非天然アミノ酸を使用して成し遂げられ得る。表２には、Ｔｈエピトープペプチドの機能性類縁体の別の変形形態が特定されている。特にＭｖＦ１及びＭｖＦ２ Ｔｈの配列番号１５及び配列番号２２は、各々Ｎ及びＣ末端における２つのアミノ酸の欠失（配列番号１５及び配列番号２２）または包含（配列番号２５及び配列番号２７）によってアミノ酸フレームに差異があるという点で、ＭｖＦ４及びＭｖＦ５の配列番号２５及び配列番号２７の機能性類縁体である。これらの２つの類似配列系列間での差異は、これらの配列の中に含まれているＴｈエピトープの機能に影響を与えないものである。したがって、機能性免疫学的Ｔｈ類縁体には、麻疹ウイルス融合タンパク質ＭｖＦ１〜４ Ｔｈ（配列番号１５、２２、２３、２５及び２７）に由来する及び肝炎表面タンパク質ＨＢｓＡｇ１〜３ Ｔｈ（配列番号２４、２６及び２８）に由来するＴｈエピトープのいくつかの変異型が含まれる。

ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物中のＴｈエピトープは、ＩＬ−３１ペプチドのＮまたはＣ末端側において共有結合し得る。いくつかの実施形態では、ＴｈエピトープはＩＬ−３１ペプチドのＮ末端側に共有結合している。他の実施形態では、ＴｈエピトープはＩＬ−３１ペプチドのＣ末端側に共有結合している。特定の実施形態では、１つより多いＴｈエピトープがＩＬ−３１断片に共有結合している。１つより多いＴｈエピトープがＩＬ−３１断片に結合している場合、各Ｔｈエピトープは同じアミノ酸配列または異なるアミノ酸配列を有し得る。加えて、１つより多いＴｈエピトープがＩＬ−３１断片に結合している場合にＴｈエピトープは任意の順序で配置できる。例えば、Ｔｈエピトープが連続的にＩＬ−３１断片のＮ末端側に結合し得るか、もしくは連続的にＩＬ−３１断片のＣ末端側に結合し得るか、または１つのＴｈエピトープがＩＬ−３１断片のＮ末端側に共有結合し得るが、一方で別のＴｈエピトープがＩＬ−３１断片のＣ末端側に共有結合する。ＩＬ−３１断片と関連するＴｈエピトープの並び方に制限はない。

いくつかの実施形態では、Ｔｈエピトープは直接ＩＬ−３１断片に共有結合している。他の実施形態では、Ｔｈエピトープは、以下にさらに詳しく説明する異種スペーサーによってＩＬ−３１断片に共有結合している。

ｃ．異種スペーサー
本開示のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物は、任意選択で、ＩＬ−３１からのＢ細胞エピトープを異種Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープに共有結合する異種スペーサーを含有する。

上に述べたとおり、「異種」という用語は、ＩＬ−３１の野生型配列の一部でない、またはそれと相同的でないアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を指す。したがって、異種スペーサーをＩＬ−３１からのＢ細胞エピトープに共有結合する場合、スペーサーがＩＬ−３１配列に対して異種であるためＩＬ−３１の天然アミノ酸配列はＮ末端側またはＣ末端側のどちらの方向にも伸長されない。

スペーサーは、２つのアミノ酸及び／またはペプチド同士を結合することができる任意の分子または化学構造である。スペーサーは用途によって長さまたは極性が様々であり得る。スペーサーの結合は、アミドまたはカルボニル結合によるものであり得るが、他の官能性も同様に可能である。スペーサーは化合物、天然に存在するアミノ酸、または天然に存在しないアミノ酸を含み得る。

スペーサーはＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物に構造的特徴を提供することができる。構造的にスペーサーはＴｈエピトープとＩＬ−３１断片のＢ細胞エピトープとの物理的に分離する。スペーサーによる物理的分離は、ＴｈエピトープをＢ細胞エピトープと結合することによって作り出される何らかの人工的二次構造を妨害することができる。加えて、スペーサーによるエピトープの物理的分離はＴｈ細胞及び／またはＢ細胞応答間の干渉をなくすことができる。さらに、スペーサーを、ペプチド免疫原構築物の二次構造を作り出すまたは改変するように設計することができる。例えば、ＴｈエピトープとＢ細胞エピトープとの分離を強化するために、柔軟なヒンジとして機能するようにスペーサーを設計できる。柔軟なヒンジスペーサーは、提示されたペプチド免疫原と適切なＴｈ細胞及びＢ細胞とのより効率的な相互作用を可能にしてＴｈエピトープ及びＢ細胞エピトープに対する免疫応答を強化することもできる。屈曲性ヒンジをコードする配列の例は免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域にみられ、これはプロリンに富むことが多い。スペーサーとして使用することができる特に有用な１つの屈曲性ヒンジは、配列Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｐｒｏ（配列番号９２）によって提供され、式中、Ｘａａは任意のアミノ酸、好ましくはアスパラギン酸である。

スペーサーはＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物に機能的特徴も提供することができる。例えば、スペーサーは、ペプチド免疫原構築物の溶解性に影響を与え得るものであるＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の全体電荷を変更させるように設計され得る。加えて、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の全体電荷を変更させることで他の化合物及び試薬とのペプチド免疫原構築物の結合能力に影響を及ぼす可能性がある。以下にさらに詳しく述べているが、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物から静電結合によってＣｐＧオリゴマーなどの高荷電オリゴヌクレオチドとの安定な免疫刺激性複合体を形成することができる。ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の全体電荷は、これらの安定な免疫刺激性複合体の形成にとって重要である。

スペーサーとして使用することができる化合物としては、限定されないが、（２−アミノエトキシ）酢酸（ＡＥＡ）、５−アミノ吉草酸（ＡＶＡ）、６−アミノカプリン酸（Ａｈｘ）、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＡＥＥＡ、ミニ−ＰＥＧ１）、１２−アミノ−４，７，１０−トリオキサドデカン酸（ミニ−ＰＥＧ２）、１５−アミノ−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタ−デカン酸（ミニ−ＰＥＧ３）、トリオキサトリデカン−スクシンアミド酸（Ｔｔｄｓ）、１２−アミノ−ドデカン酸、Ｆｍｏｃ−５−アミノ−３−オキサペンタン酸（Ｏ１Ｐｅｎ）などが挙げられる。

天然に存在するアミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンが挙げられる。

天然に存在しないアミノ酸としては、限定されないが、ε−Ｎリジン、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サイロキシン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリン、アミノ安息香酸、６−アミノカプリン酸（Ａｃａ；６−アミノヘキサン酸）、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）、３−ニトロ−チロシン、ピログルタミン酸などが挙げられる。

ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物中のスペーサーは、Ｔｈエピトープ及びＩＬ−３１ペプチドのＮまたはＣ末端側のどちらかに共有結合し得る。いくつかの実施形態では、スペーサーはＴｈエピトープのＣ末端及びＩＬ−３１ペプチドのＮ末端側に共有結合している。他の実施形態では、スペーサーはＩＬ−３１ペプチドのＣ末端側及びＴｈエピトープのＮ末端側に共有結合している。特定の実施形態では、例えば１つ以上のＴｈエピトープがペプチド免疫原構築物中に存在する場合に、１つより多いスペーサーが使用され得る。１つより多いスペーサーを使用する場合、各スペーサーは互いに同じものまたは異なるものであってよい。加えて、１つより多いＴｈエピトープがペプチド免疫原構築物中に存在する場合、Ｔｈエピトープはスペーサーで分離することができ、Ｔｈエピトープは、ＴｈエピトープをＢ細胞エピトープから分離するために使用されるスペーサーと同じまたは異なるものであってよい。ＴｈエピトープまたはＩＬ−３１断片に関するスペーサーの配置に制限はない。特定の実施形態では、異種スペーサーは、天然に存在するアミノ酸または天然に存在しないアミノ酸である。他の実施形態では、スペーサーは天然に存在するまたは天然に存在しないアミノ酸を１つより多く含有する。具体的な実施形態では、スペーサーは、Ｌｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、またはε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号９１）である。

ｄ．ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の具体的な実施形態
特定の実施形態では、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物は、式：
（Ｔｈ）_ｍ−（Ａ）_ｎ−（ＩＬ−３１断片）−Ｘ
または
（ＩＬ−３１断片）−（Ａ）_ｎ−（Ｔｈ）_ｍ−Ｘ
〔式中、
Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり、
Ａは異種スペーサーであり、
（ＩＬ−３１断片）は、配列番号１または配列番号２からの約１５〜約７５アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープであり、
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨまたはα−ＣＯＮＨ_２であり、
ｍは１〜約４であり、
ｎは０〜約１０である〕
で表すことができる。

特定の実施形態では、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物中の異種Ｔｈエピトープは、表２に示される配列番号１４〜４２及びその組合せのいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。具体的な実施形態では、Ｔｈエピトープは、配列番号２２〜２８のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物は、１つより多いＴｈエピトープを含有する。

特定の実施形態では、任意選択の異種スペーサーは、Ｌｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、ε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号９１）及びその組合せのいずれかから選択される。具体的な実施形態では、異種スペーサーはε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号９１）である。

特定の実施形態では、ＩＬ−３１断片は配列番号１または配列番号２からの約１５〜約６５アミノ酸残基を有する。具体的な実施形態では、ＩＬ−３１断片は、表１に示される配列番号１〜１３及び配列番号９３〜９８で表されるアミノ酸配列を有する。

特定の実施形態では、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物は、表３に示される配列番号４３〜９０及び配列番号９９〜１０５のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する。

ｅ．変異体、相同体及び機能性類縁体
ＩＬ−３１タンパク質の望ましいエピトープに対する抗体を誘導する及び／またはそれと交差反応する上記免疫原性ペプチドの変異体及び類縁体を使用することもできる。対立形質に関する、種に関する及び誘導される変異体を含めて類縁体は、しばしば保存的置換によって、１つ、２つまたはいくつかの位置において天然に存在するペプチドとは異なっているのが典型的である。類縁体は典型的には天然ペプチドとの少なくとも８０％または９０％の配列同一性を呈する。いくつかの類縁体は、１つ、２つまたはいくつかの位置に非天然アミノ酸またはＮもしくはＣ末端アミノ酸の改変も含む。

機能性類縁体である変異体は、アミノ酸位置での保存的置換；全体電荷の変更；別の部分との共有結合；またはアミノ酸の付加、挿入もしくは欠失；及び／またはその任意の組合せを有し得る。

保存的置換とは、１つのアミノ酸残基が、類似する化学的性質を有する別のアミノ酸残基の代わりに用いられている場合をいう。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれ、極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが含まれ、正に帯電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれ、負に帯電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれる。

特定の実施形態では、機能性類縁体は、元のアミノ酸配列との少なくとも５０％の同一性を有する。別の実施形態では、機能性類縁体は、元のアミノ酸配列との少なくとも８０％の同一性を有する。さらに別の実施形態では、機能性類縁体は、元のアミノ酸配列との少なくとも８５％の同一性を有する。さらに別の実施形態では、機能性類縁体は、元のアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する。

変異体には、リン酸化された残基に対する変形形態も含まれる。例えば、変異体はリン酸化ペプチド内に異なる残基を含み得る。変異体である免疫原性ＩＬ−３１ペプチドには、偽リン酸化ペプチドも含まれ得る。偽リン酸化ペプチドは、ＩＬ−３１ペプチドのリン酸化されたセリン、スレオニン及びチロシン残基のうちの１つ以上を酸性アミノ酸残基、例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸で置き換えることによって生成する。

組成物
本開示はさらに、本開示のＩＬ−３１免疫原構築物を含む組成物を提供する。

ａ．ペプチド組成物
本開示のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を含有する組成物は、液体または固体の形態であり得る。液体組成物は、水、緩衝剤、溶媒、塩及び／またはＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の構造的もしくは機能的特性を変化させない他の任意の許容される試薬を含み得る。ペプチド組成物は、本開示のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の１つ以上を含有し得る。

ｂ．医薬組成物
本開示はさらに、本開示のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物に関する。

医薬組成物は、薬学的に許容される送達システムの中に担体及び／または他の添加物を含有し得る。したがって、医薬組成物は、薬学的有効量のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物と共に、薬学的に許容される担体、アジュバント及び／または他の賦形剤、例えば、希釈剤、添加剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤などを含有し得る。

医薬組成物は、何ら特異的抗原作用を自ら有することなくＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物に対する免疫応答を加速させる、延長するまたは増強させるように作用する１つ以上のアジュバントを含有し得る。医薬組成物に使用されるアジュバントには、油、油エマルション、アルミニウム塩、カルシウム塩、免疫刺激性複合体、細菌派生体及びウイルス派生体、ビロソーム、炭水化物、サイトカイン、ポリマー微粒子が含まれ得る。特定の実施形態では、アジュバントは、ミョウバン（リン酸アルミニウムカリウム）、リン酸アルミニウム（例えば、ＡＤＪＵ−ＰＨＯＳ（登録商標））、水酸化アルミニウム（例えばＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標））、リン酸カルシウム、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、フロイント完全アジュバント、ＭＦ５９、アジュバント６５、Ｌｉｐｏｖａｎｔ、ＩＳＣＯＭ、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ２１、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（登録商標）ＩＳＡ３５、ＩＳＡ５０Ｖ、ＩＳＡ５０Ｖ２、ＩＳＡ５１、ＩＳＡ２０６、ＩＳＡ７２０、リポソーム、リン脂質、ペプチドグリカン、リポ多糖（ＬＰＳ）、ＡＳＯ１、ＡＳＯ２、ＡＳＯ３、ＡＳＯ４、ＡＦ０３、親油性リン脂質（リピドＡ）、ガンマイヌリン、アルガムリン、グルカン、デキストラン、グルコマンノン、ガラクトマンナン、レバン、キシラン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）ならびにその他のアジュバント及び乳化剤から選択され得る。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＩＳＡ５１（油中水エマルションの製造のための植物油及びモノオレイン酸マンニドからなる油系アジュバント組成物）、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（ポリソルベート８０またはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートとしても知られる）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド及び／またはその任意の組合せを含有する。他の実施形態では、医薬組成物は、ＥＭＵＬＳＩＧＥＮまたはＥＭＵＬＳＩＧＥＮ Ｄをアジュバントとする水中油中水型（すなわちｗ／ｏ／ｗ）エマルションである。

医薬組成物は、薬学的に許容される添加剤または賦形剤を含むこともある。例えば、医薬組成物は、酸化防止剤、結合剤、緩衝剤、増量剤、担体、キレート剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、フィラー、ゲル化剤、ｐＨ緩衝剤、保存剤、可溶化剤、安定化剤などを含有し得る。

医薬組成物は、即放性または持続放出性製剤として製剤化され得る。加えて、医薬組成物は、免疫原捕捉及び微粒子との共投与によって全身の、または局所粘膜の免疫性を誘導するために製剤化され得る。そのような送達システムは当業者によって容易に決定される。

医薬組成物は、液体溶液か懸濁液かのどちらかとしての注射剤として調製され得る。ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を含有する液体ビヒクルを注射前に調製することもできる。医薬組成物は、任意の好適な適用様式、例えば、ｉ．ｄ．、ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．、ｉ．ｍ．、鼻腔内、経口、皮下などで、及び任意の好適な送達装置で投与され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内、皮下、皮内または筋肉内投与のために製剤化される。経口及び鼻腔内適用を含めた他の投与様式に適した医薬組成物を調製することもできる。

医薬組成物はまた、好適な単位剤形で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、体重１ｋｇあたり約０．５μｇ〜約１ｍｇのＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を含有する。医薬組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるのかまたは動物であるのか、投与される他の医薬、及び治療が予防的であるのかまたは治療的であるのかを含めた多種多様な因子によって様々である。通常、患者はヒトであるが、遺伝子導入哺乳動物を含めた非ヒト哺乳動物を治療することもできる。医薬組成物は、多回用量で送達される場合、便宜的に単位剤形ごとに適切な量に分割されてもよい。投与する投薬量は、治療分野でよく知られているように対象の年齢、体重及び全身の健康によって決まるであろう。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は１つより多いＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を含有する。１つより多いＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の混合物を含有する医薬組成物は、構築物の免疫効果の相乗的増強を可能にする。１つより多いＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ対象範囲が広いのでより大きな遺伝的個体群においてより有効であり得、したがってＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物に対する免疫応答の改善をもたらすことができる。

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、配列番号４３〜９０及び配列番号９９〜１０５（表３）ならびにその相同体、類縁体及び／または組合せから選択されるＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を含有する。具体的な実施形態では、医薬組成物は、配列番号４３〜９０及び配列番号９９〜１０５（表３）ならびにその組合せから選択されるＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を含有する。

ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物は、投与時に宿主において免疫応答を引き出し抗体を生成するために使用され得る。

ｃ．免疫刺激性複合体
本開示はさらに、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物をＣｐＧ１（配列番号１０８）、ＣｐＧ２（配列番号１０９）またはＣｐＧ３（配列番号１１０）などのＣｐＧオリゴヌクレオチドとの免疫刺激性複合体の形態で含有する医薬組成物に関する。そのような免疫刺激性複合体は、アジュバントとして及びペプチド免疫原安定化剤として作用するのに特に適合している。免疫刺激性複合体は微粒子の形態にあり、これがＩＬ−３１ペプチド免疫原を免疫系の細胞に効率的に提示して免疫応答を生むことができる。免疫刺激性複合体を非経口投与のための懸濁液として製剤化してもよい。また、非経口投与後に宿主の免疫系の細胞へＩＬ−３１ペプチド免疫原を効率的に送達するために、免疫刺激性複合体を、無機塩または系中でゲル化するポリマーと組み合わせた懸濁液としてのｗ／ｏエマルジョンの形態で製剤化してもよい。

ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物と、アニオン性分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはその組合せとを静電会合によって複合化させることによって、安定化免疫刺激性複合体を形成することができる。安定化免疫刺激性複合体を免疫原送達システムとしての医薬組成物の中に組み込んでもよい。

特定の実施形態では、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物は、５．０〜８．０の範囲のｐＨにおいて正に帯電しているカチオン性部分を含有するように設計される。ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物または構築物の混合物のカチオン性部分の正味の電荷は、配列内でリジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）の各々に電荷ａ＋１を割り当て、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）に電荷ａ−１を割り当て、他のアミノ酸に０の電荷を割り当てることによって算出される。電荷をＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物のカチオン性部分の中で加算し、正味の平均電荷として表す。好適なペプチド免疫原は、正味の平均正電荷が＋１であるカチオン性部分を有する。好ましくは、ペプチド免疫原は＋２よりも大きい範囲の正味の正電荷を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物のカチオン性部分は異種スペーサーである。特定の実施形態では、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物のカチオン性部分は、スペーサー配列が（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、ε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号９１）である場合に＋４の電荷を有する。

本明細書に記載の「アニオン性分子」は、５．０〜８．０の範囲のｐＨにおいて負に帯電している任意の分子を指す。特定の実施形態では、アニオン性分子はオリゴマーまたはポリマーである。オリゴマー上またはポリマー上の正味の負電荷は、オリゴマー中のホスホジエステルまたはホスホロチオエート基の各々に電荷ａ−１を割り当てることによって算出される。好適なアニオン性オリゴヌクレオチドは、８〜６４ヌクレオチド塩基を有する一本鎖ＤＮＡ分子であり、ＣｐＧモチーフの繰り返し回数が１〜１０の範囲である。好ましくは、ＣｐＧ免疫刺激性一本鎖ＤＮＡ分子は１８〜４８ヌクレオチド塩基を含有し、ＣｐＧモチーフの繰り返し回数が３〜８の範囲である。

より好ましくは、アニオン性オリゴヌクレオチドは式：５’Ｘ^１ＣＧＸ^２３’で表され、式中、Ｃ及びＧはメチル化されておらず、Ｘ^１は、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）及びＴ（チミン）からなる群から選択され、Ｘ^２はＣ（シトシン）またはＴ（チミン）である。あるいは、アニオン性オリゴヌクレオチドは式：５’（Ｘ^３）_２ＣＧ（Ｘ^４）_２３’で表され、式中、Ｃ及びＧはメチル化されておらず、Ｘ^３は、Ａ、ＴまたはＧからなる群から選択され、Ｘ^４はＣまたはＴである。

得られる免疫刺激性複合体は、大きさが典型的には１〜５０ミクロンの範囲である粒子の形態にあり、相対電荷化学量論及び相互作用種の分子量を含めた多くの因子の関数である。微粒子化された免疫刺激性複合体は、生体内での特異的免疫応答のアジュバント化及び上方制御をもたらすという利点を有する。加えて、安定化免疫刺激性複合体は、油中水エマルション、無機塩懸濁液及びポリマーゲルを含めて様々なプロセスで医薬組成物を調製するのに適している。

抗体
本開示はさらに、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物によって誘発される抗体を提供する。

ＩＬ−３１断片、異種Ｔｈエピトープ及び任意選択の異種スペーサーを含む、本開示のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物は、宿主に投与された場合に免疫応答及び抗体の産生を誘発することができる。ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物のデザインは、自己ＩＬ−３１に対する寛容を壊すことができ、線状エピトープではなく立体構造エピトープを認識する部位特異的な抗体の産生を誘発することができる。

ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物によって生成する抗体は、単量体、二量体、三量体及びオリゴマーの形態にあるＩＬ−３１を認識してそれに結合する。

本発明のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物で免疫された動物から得られる免疫応答は、ＩＬ−３１に応答する強力な部位特異的抗体を生成する構築物の能力を実証した。

方法
本開示はまた、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物、組成物及び医薬組成物を製造及び使用する方法に関する。

ａ．ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を製造する方法
本開示のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物は、当業者によく知られている化学合成法によって作ることができる（例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User’s Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, NY,1992, p.77を参照されたい）。ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓペプチド合成装置モデル４３０Ａまたは４３１において側鎖保護アミノ酸を使用して、ｔ−ＢｏｃかＦ−ｍｏｃかのどちらかの化学で保護されたα−ＮＨ_２による固相合成の自動Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ技術を用いて合成され得る。Ｔｈエピトープのためのコンビナトリアルライブラリーペプチドを含むＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の調製は、所与の可変位置での結合のための代替アミノ酸の混合物を提供することによって成し遂げられ得る。

所望のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の完全な組立て後に、樹脂からペプチドを切り離すための標準的手順に従って樹脂を処理することができ、アミノ酸側鎖上の官能基をデブロッキングすることができる。遊離ペプチドをＨＰＬＣで精製することができ、生化学的に、例えばアミノ酸分析または配列決定によって、特性評価することができる。ペプチドのための精製及び特性評価の方法は当業者によく知られている。

この化学プロセスによって生成するペプチドの質を制御及び規定することができ、その結果、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の再現性、免疫原性及び収率を保証することができる。固相ペプチド合成によるＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の製造についての詳細な説明は実施例１に示される。

意図する免疫学的活性の保持を可能にする構造可変性の範囲は、低分子薬による特異的薬物活性、または生物由来薬物と共に生成する大型分子に認められる所望の活性及び不要な毒性の保持のために許容される構造可変性の範囲よりもはるかに順応性があることが見出された。それゆえ、ペプチド類縁体は、意図的に設計されたものであっても、合成プロセスの誤りによって意図したペプチドに類似するクロマトグラフィー上及び免疫学上の特性を有する欠失配列副生成物の混合物として不可避的に生成したものであっても、所望のペプチドの精製された調製物と同じくらい有効であることが多い。設計された類縁体及び意図しない類縁体混合物は、これらのペプチドを採用する最終製品の再現性及び有効性を保証すべく製造プロセスと生成物評価プロセスとの両方を監視するために鑑識的品質管理手順が展開される限りにおいて、有効である。

核酸分子、ベクター及び／または宿主細胞を含む組換えＤＮＡ技術を用いてＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を作ることもできる。したがって、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物及びその免疫学的機能性類縁体をコードする核酸分子も本発明の一部として本開示に包含される。同様に、核酸分子を含んでいる発現ベクターを含めたベクター、及びベクターを含有する宿主細胞も本発明の一部として本開示に包含される。

様々な例示的実施形態は、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物及びその免疫学的機能性類縁体を製造する方法も包含する。例えば、方法は、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物及び／またはその免疫学的機能性類縁体をコードする核酸分子を含有する発現ベクターを含有する宿主細胞を、ペプチド及び／または類縁体が発現する条件の下でインキュベートするステップを含み得る。より長い合成ペプチド免疫原をよく知られている組換えＤＮＡ技術で合成することができる。そのような技術は、よく知られている標準的マニュアルに詳細なプロトコールと共に示されている。本発明のペプチドをコードする遺伝子を構築するには、アミノ酸配列を逆翻訳して、好ましくは遺伝子を発現させる生物に最適なコドンを有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を得る。次に、合成遺伝子を、典型的にはペプチド及び必要に応じた任意の調節エレメントをコードするオリゴヌクレオチドを合成することによって作る。合成遺伝子を好適なクローニングベクターに挿入し、宿主細胞にトランスフェクトする。その後、選択された発現システム及び宿主に適した好適な条件の下でペプチドを発現させる。ペプチドは、精製され、標準的方法で特徴づけられる。

いくつかの実施形態では、米国特許第８，４２６，１６３号に記載されているようにＩＬ−３１リポタンパク質を作るための脂質化を可能にする特定のＥ．ｃｏｌｉ株でＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を発現させることができ、参照によりその全体を本明細書に援用する。特定の実施形態では、使用するＥ．ｃｏｌｉ株は、外来タンパク質、特に膜タンパク質の過剰発現によって誘導される毒性作用に対して耐性である。そのようなＥ．ｃｏｌｉ株は、米国特許第６，３６１，９６６号に記載されている方法で同定／生成することができ、参照によりその全体を本明細書に援用する。脂質化形態のリポタンパク質を産生することができるＥ．ｃｏｌｉ株の例としては、限定されないが、Ｃ４３（ＤＥ３）（ＥＣＣＣ Ｂ９６０７０４４５）、Ｃ４１（ＤＥ３）（ＥＣＣＣ Ｂ９６０７０４４４）、Ｃ０２１４（ＤＥ３）、ＤＫ８（ＤＥ３）Ｓ（ＮＣＩＭＢ４０８８５）及びＣ２０１４（ＤＥ３）（ＮＣＩＭＢ４０８８４）が挙げられる。上記Ｅ．ｃｏｌｉ株の１つにおいてＩＬ−３１の脂質化形態を従来の組換え技術によって発現させることができる。手短に述べると、ＩＬ−３１をコードするＤＮＡ断片をその天然供給源から例えばＰＣＲ増幅によって得、任意選択的に改変してＥ．ｃｏｌｉにおけるコドン使用を最適化する。その後、ＤＮＡ断片をＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターに挿入して発現プラスミドを産生させる。好ましくは、例えばＩＰＴＧによって誘導可能となり得る強力なプロモーター、例えばＴ７、Ｔ５、Ｔ３またはＳＰ６によってＩＬ−３１リポタンパク質の発現を促す。その後、選択されたＥ．ｃｏｌｉ株に発現プラスミドを導入し、陽性形質転換体をタンパク質発現に適した条件の下で培養する。こうして発現したリポタンパク質はＥ．ｃｏｌｉ細胞から単離することができ、その脂質化状態を当技術分野で知られている方法、例えば抗リポタンパク質抗体によるイムノブロッティングまたは質量分析で確認することができる。

ｂ．免疫刺激性複合体を製造する方法
様々な例示的実施形態は、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物とＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）分子とを含んでいる免疫刺激性複合体を製造する方法も包含する。安定化免疫刺激性複合体（ＩＳＣ）は、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物のカチオン性部分とポリアニオン性ＣｐＧ ＯＤＮ分子とに由来する。自己組織化システムは電荷の静電中和によって推し進められる。アニオン性オリゴマーに対するＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物のカチオン性部分の分子電荷比率の化学量論によって会合の程度が決まる。ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物とＣｐＧ ＯＤＮとの非共有結合性静電会合は完全に再現可能なプロセスである。ペプチド／ＣｐＧ ＯＤＮ免疫刺激性複合体は凝集するが、これが免疫系の「プロフェッショナル」抗原提示細胞（ＡＰＣ）への提示を促し、かくして複合体の免疫原性がさらに増強される。これらの複合体は、製造中の品質管理のために特徴づけするのが簡単である。ペプチド／ＣｐＧ ＩＳＣは生体内で十分に許容される。ＣｐＧ ＯＤＮとＩＬ−３１断片由来のペプチド免疫原構築物とを含むこの新規微粒子システムは、ＣｐＧ ＯＤＮ使用に関連する全般的なＢ細胞分裂促進性を活用しながらも均衡のとれたＴｈ−１／Ｔｈ−２型応答を増進するように設計された。

本開示の医薬組成物の中のＣｐＧ ＯＤＮは、相反する電荷の静電中和によって媒介されるプロセスにおいて免疫原に１００％結合してミクロンサイズの微粒子を形成している。微粒子形態は、ＣｐＧ投薬量を従来のＣｐＧアジュバント使用と比較して著しく低減し、有害な自然免疫応答の可能性をより低くし、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む代替の免疫原プロセシング経路を促進する。結果としてそのような製剤は概念上新規なものであり、代替機序による免疫応答の刺激を促進することによる潜在的利点を提供する。

ｃ．医薬組成物を製造する方法
様々な例示的実施形態は、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物も包含する。特定の実施形態では、医薬組成物は、油中水エマルション及び無機塩との懸濁を使用する。

ＩＬ−３１凝集の防止も投与のための目標の一部としながら医薬組成物を大きな個体群によって使用されるものにするためには、安全性はもう１つの考慮すべき重要な因子となる。臨床試験中の多くの製剤のためにヒトにおいて油中水エマルションが使用されているとはいえ、ミョウバンはその安全性ゆえに製剤に使用するための主要なアジュバントであり続けている。それゆえ、ミョウバン及びその無機塩であるリン酸アルミニウム（ＡＤＪＵＰＨＯＳ）は臨床応用のための配合物においてアジュバントとして頻繁に使用される。

他のアジュバント及び免疫刺激剤としては、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−ＤＭＰ、多量体型または単量体型アミノ酸、例えばポリグルタミン酸またはポリリジンが挙げられる。そのようなアジュバントは、他の特異的免疫刺激剤、例えばムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）Ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標）または他の細菌細胞壁成分と共に使用することもできるし、またはそれなしで使用することもできる。水中油エマルションとしては、５％のスクアレンと０．５％のＴＷＥＥＮ８０と０．５％のＳｐａｎ８５とを含有し（場合によって様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有し）マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化したものであるＭＦ５９（Ｖａｎ Ｎｅｓｔ ｅｔ ａｌ．のＷＯ９０／１４８３７を参照されたく、これをもって参照によりその全体を援用する）；１０％のスクアレンと０．４％のＴＷＥＥＮ８０と５％のプルロニックブロックポリマーＬ１２１とｔｈｒ−ＭＤＰとを含有しサブミクロンのエマルションに微小流体化したかあるいはボルテックスに掛けてより大きな粒径のエマルションを生成したものであるＳＡＦ；及び２％のスクアレンと０．２％のＴＷＥＥＮ８０と、モノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコラート（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））からなる群から選択される１つ以上の細菌細胞壁成分とを含有する、Ｒｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）が挙げられる。他のアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）ならびにサイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２及びＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。

アジュバントの選択は、アジュバントを含有する免疫原性製剤の安定性、投与経路、投薬スケジュール、ワクチン接種する種におけるアジュバントの有効性によって決まり、ヒトにおいて薬学的に許容されるアジュバントは、関係する規制機関によってヒトへの投与が承認されているまたは承認されるものである。例えば、ミョウバン、ＭＰＬまたは不完全フロイントアジュバント（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３２：１７３−１８６（１９９８）、これをもって参照によりその全体を援用する）は、単独で、または場合によってそのあらゆる組合せがヒト投与に適している。

組成物は、動物またはヒトへの投与のための医薬組成物を製剤化するために一般的に使用されるビヒクルとして定義される薬学的に許容される無毒性の担体または希釈剤を含み得る。希釈剤は、合剤の生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、生理リン酸緩衝食塩水、リンガー液、デキストロース溶液及びハンクス液である。加えて、医薬組成物または製剤は、他の担体、アジュバント、または無毒性の非治療的非免疫原性安定化剤などをさらに含んでもよい。

医薬組成物はさらに、大きなゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、キトサンのような多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸及びコポリマー（例えば、ラテックス官能化セファロース、アガロース、セルロースなど）、多量体型アミノ酸、アミノ酸コポリマー、ならびに脂質凝集物（例えば油滴またはリポソーム）を含み得る。加えて、これらの担体は免疫刺激剤（すなわちアジュバント）として機能し得る。

本発明の医薬組成物はさらに、好適な送達ビヒクルを含み得る。好適な送達ビヒクルとしては、限定されないが、ウイルス、細菌、生分解性微小球、微粒子、ナノ粒子、リポソーム、コラーゲン、ミニペレット及び渦巻体（cochleates）が挙げられる。

ｄ．医薬組成物を使用する方法
本開示には、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物を使用する方法も含まれる。

特定の実施形態では、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を含有する医薬組成物を掻痒性症状及び／またはアレルギー性症状、例えばアトピー性皮膚炎の治療及び／または予防のために使用することができる。

具体的な実施形態
（１）ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物は式：
（Ｔｈ）_ｍ−（Ａ）_ｎ−（ＩＬ−３１断片）−Ｘ
または
（ＩＬ−３１断片）−（Ａ）_ｎ−（Ｔｈ）_ｍ−Ｘ
〔式中、
Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり、
Ａは異種スペーサーであり、
（ＩＬ−３１断片）は、配列番号１または配列番号２からの約１５〜約７５アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープであり、
Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨまたはα−ＣＯＮＨ_２であり、
ｍは１〜約４であり、
ｎは０〜約１０である〕
で表すことができる。

（２）前記ＩＬ−３１断片が、配列番号１〜１３及び配列番号９３〜９８からなる群から選択される、（１）に記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。

（３）前記Ｔｈエピトープが、配列番号１４〜４２からなる群から選択される、（１）または（２）のいずれかに記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。

（４）前記ペプチド免疫原構築物が、配列番号４３〜９０及び配列番号９９〜１０５からなる群から選択される、（１）に記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。

（５）配列番号１または配列番号２の完全長ＩＬ−３１タンパク質配列からの約１５〜約７５アミノ酸残基を含むＢ細胞エピトープ、
配列番号１４〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴヘルパーエピトープ、ならびに
アミノ酸Ｌｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、及びε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号９１）からなる群から選択される任意選択の異種スペーサー
を含む、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物であって、
前記Ｂ細胞エピトープが直接、または前記任意選択の異種スペーサーによって、前記Ｔヘルパーエピトープに共有結合している、前記ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。

（６）前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号１〜１３及び配列番号９３〜９８からなる群から選択される、（５）に記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。

（７）前記Ｔヘルパーエピトープが、配列番号１４〜４２からなる群から選択される、（５）に記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。

（８）前記任意選択の異種スペーサーが、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、またはε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号９１）である、（５）に記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。

（９）前記Ｔヘルパーエピトープが前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端に共有結合している、（５）に記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。

（１０）前記Ｔヘルパーエピトープが前記任意選択の異種スペーサーによって前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端に共有結合している、（５）に記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。

（１１）（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド免疫原構築物を含む組成物。

（１２）ａ．（１）〜（４）のいずれかに記載のペプチド免疫原構築物と、
ｂ．薬学的に許容される送達ビヒクル及び／またはアジュバントと
を含む、医薬組成物。

（１３）ａ．前記ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物が、配列番号４３〜９０及び配列番号９９〜１０５からなる群から選択され、
ｂ．前記ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物が、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されて安定化免疫刺激性複合体を形成している、
（１２）に記載の医薬組成物。

（１４）（１）〜（１０）のいずれかに記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。

（１５）前記ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物に結合している、（１４）に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。

（１６）（１）〜（１０）のいずれかに記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。

（１７）（１４）〜（１６）のいずれかに記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片を含む、組成物。

実施例１
ＩＬ−３１関連ペプチドの合成及びその製剤の調製
ａ．ＩＬ−３１断片
ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の開発努力に含まれるデザイナーＩＬ−３１断片を合成する方法について記載する。ペプチドを血清学アッセイならびに実験室試験研究及び現場研究に有用な小スケール量で合成したが、これらは医薬組成物を分析するのに有用である。有効なＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物における使用に最も適するペプチド構築物のスクリーニング及び選択のために、長さ約１５〜約７５アミノ酸の配列を有する広いレパートリーのＩＬ−３１関連抗原性ペプチド（表１）を設計した。

完全長イヌＩＬ−３１（配列番号１）（図１のＡ）及びヒトＩＬ−３１（配列番号２）タンパク質からのアミノ酸配列を使用した。様々な血清学アッセイにおいてエピトープマッピングのために採用したＩＬ−３１断片は表１（配列番号３〜１３及び配列番号９３〜９８）で特定され、完全長配列のＩＬ−３１断片の相対配列アライメントは図１のＢに示される。選択されたＩＬ−３１断片（配列番号３〜１３及び配列番号９３〜９８）を、表２で特定されるＵＢＩＴｈ（登録商標）１及びＵＢＩＴｈ（登録商標）２（それぞれ配列番号２６及び２５）を含む病原体タンパク質に由来する注意深く設計されたヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）エピトープに合成的に結合することによってＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を作った。Ｔｈエピトープを単一配列（ＵＢＩＴｈ（登録商標）１）かコンビナトリアルライブラリー（ＵＢＩＴｈ（登録商標）３）かのどちらかに使用してそれらの各々のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の免疫原性を増強した。

代表的なＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物は表３（配列番号４３〜９０及び配列番号９９〜１０５）で特定される。合成及び評価したＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を、同定されるペプチドコードと共に表３に示す。

ｂ．ペプチドの典型的合成
抗ＩＬ−３１抗体の検出及び／または測定のための免疫原性試験または関連する血清学検査のために使用されるペプチドは、典型的にはＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌｓ ４３０Ａ、４３１及び／または４３３のペプチド合成装置によってＦ−ｍｏｃ化学を用いて小スケールで合成される。各ペプチドは独立した合成によって固相担体上で、Ｎ末端のＦ−ｍｏｃ保護及び三官能性アミノ酸の側鎖保護基を有して製造される。完成したペプチドを固体担体から切り離し、側鎖保護基を９０％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で除去する。合成ペプチド調製物をマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析で評価して、アミノ酸が正しく含まれていることを確認する。各合成ペプチドを逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）でも評価して合成プロファイル及び調製物の濃度を確認する。合成プロセスの厳密な制御（カップリング効率のステップごとの追跡を含む）にもかかわらず、アミノ酸の挿入、欠失、置換及び中途停止を含めた伸長サイクル中の意図しない事象のためにペプチド類縁体も生成する。このため、合成された調製物は典型的には目的とするペプチドと一緒に複数のペプチド類縁体を含む。そのような意図しないペプチド類縁体を含んでいるにもかかわらず、得られる合成されたペプチド調製物はなおも、免疫診断（抗体捕捉抗原として）及び医薬組成物（ペプチド免疫原として）を含めた免疫学的用途における使用に適している。典型的にはそのようなペプチド類縁体は、意図的に設計されたものであっても、副生成物の混合物として合成プロセスによって生成したものであっても、これらのペプチドを採用する最終製品の再現性及び有効性を保証すべく製造プロセスと生成物評価プロセスとの両方を監視するために鑑識的品質管理手順が展開される限りにおいて、所望のペプチドの精製された調製物と同じくらい有効であることが多い。数百〜数千グラム量での大スケールペプチド合成を、カスタマイズされた自動ペプチド合成装置ＵＢＩ２００３などで１５〜１５０ミリモルスケールで行う。活性成分が臨床試験のための最終医薬組成物に使用されるためには、ＩＬ−３１ペプチド構築物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって浅い溶離勾配の下で精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、アミノ酸分析及びＲＰ−ＨＰＬＣによって純度及び同一性に関して特性評価する。

実施例２
免疫原性評価のためのＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物によるモルモットの免疫付与
ａ．動物
モルモット（体重３００〜３５０ｇ）を免疫付与のために使用して代表的なデザイナーイヌＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号４３、４７、５１、５５及び５９）の免疫原性を評価した。表４にまとめるように、１５匹のモルモットを１群あたり動物３匹の群に分け、４００μｇのペプチドによる初回免疫を行い、続いて初回免疫後週数（ｗｐｉ）３、６、９及び１２の時に１００μｇの追加免疫を４回行った。０、３、６、９、１２及び１５ｗｐｉの時に血液試料を、抗ＩＬ−３１抗体価測定のため及び対応する免疫血清の中に存在する抗体の他の機能的特性の評価のために採取した。

ｂ．製剤
総じて、免疫付与のために使用した製剤は以下を含有していた：
１． ４００μｇのＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物
２． ０．７：１のペプチド：ＣｐＧ比でのＣｐＧ
３． ０．２％のＴＷＥＥＮ８０

ｃ．ＥＬＩＳＡによる血清抗ＩＬ−３１抗体の力価測定
ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物によって引き出される血清抗ＩＬ−３１抗体の力価測定を以下のプロトコールに従って評価した：

９６ウェルプレートのウェルを、イヌＩＬ−３１組換えタンパク質（ｒｃＩＬ−３１）１００μｌ（５０ｎｇ／ウェル）、または０．２μｇ／０．１ｍＬ／ウェルのＩＬ−３１ Ｂエピトープペプチド（配列番号３〜１３及び配列番号９３〜９８）で被覆してｐＨ９．６、５０ｍＭの炭酸−重炭酸緩衝液中１μｇ／ｍｌとして３７℃で１時間経過させた。

ｒｃＩＬ−３１被覆ウェルをＰＢＳ中１％のＢＳＡ２００μｌと共に３７℃で１時間インキュベートして非特異的なタンパク質結合をブロッキングし、続いて０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、その後乾燥させた。免疫されたモルモットからの段階希釈血清試料１００マイクロリットル（１００μｌ）を各ウェルに加えて３７℃で１時間反応させた。その後、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳでウェルを５回洗浄し、乾燥させた。１％のＢＳＡ及び０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳで調製した最適に希釈されたペルオキシダーゼ標識ヤギ抗モルモットＩｇＧの１００μｌを各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳでウェルを６回洗浄し、もう１５分間１００μｌのＴＭＢ基質と反応させた。２ＮのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度を決定した。

ＩＬ−３１ペプチド系ワクチン製剤を与えたモルモットにおける抗体価の決定では、代表的な標的「ＩＬ−３１」Ｂエピトープペプチドに対する初回スクリーニングのために１：１００以上からの血清の１０倍段階希釈を実施し、力価をＬｏｇ_１０で表した。組換えイヌＩＬ−３１と交差反応性である血清のさらなる分析では、ＥＬＩＳＡにおいて１：１００から１：５４，２４８，８００まで血清の２倍段階希釈を実施し、力価をＬｏｇＥＣ_５０で表した。

ｄ．結果
標的ＩＬ−３１ Ｂエピトープペプチド（配列番号４３、４７、５１、５５及び５９）に対する各々の力価に関する免疫原性評価からの結果を表５に示す。

各ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物について、組換えイヌＩＬ−３１に対する抗体価（Ｌｏｇ_１０ＥＣ_５０）を表６及び図２に示す。

これらの注意深く設計されたイヌＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物では高い免疫原性が認められ、１回の単回投与で３ｗｐｉの時に、配列番号３〜７が含んでいるＡＡ９０〜ＡＡ１４４（配列番号８）のＩＬ−３１領域に対する高力価抗体が引き出された。注意深く設計されたＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号４３、４７、５１、５５及び５９）によって誘発された抗体によるイヌｒＩＬ−３１に対する高い交差反応性が認められた。

実施例３
生物学的アッセイに使用するためのイヌＩＬ−３１の製造、精製及び特性評価
ａ．発現構築物
イヌＩＬ−３１の配列はＮＣＢＩｓゲノムリソース（ウェブサイト：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を用いて同定した。検出及び精製のためのＣ末端側の６−Ｈｉｓタグを含有する完全長イヌＩＬ−３１ゲノムによって発現構築物を作出した（図３のＡ及びＢを参照のこと）。配列が確認されたプラスミドを使用してＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトし、発現したＩＬ−３１は培養培地中に分泌されることとなった。トランスフェクションから７２時間後に培地を回収し、ニッケルコバルト樹脂を使用して組換えタンパク質の精製を行った。分泌形態のＩＬ−３１を含有する培地を樹脂に結合させた後、ｐＨ８．０、５０ｍＭのトリス緩衝液と５００ｍＭのＮａＣｌと２０ｍＭのイミダゾールとを含有する洗浄用緩衝液でカラムを３回、カラム容積の１０倍以内で洗浄した。ｐＨ８．０、５０ｍＭのトリス緩衝液と５００ｍＭのＮａＣｌと２５０ｍＭのイミダゾールとを含有する溶離用緩衝液で組換えＩＬ−３１をカラム容積の５倍で溶離させた。溶離画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び抗Ｈｉｓ抗体をプローブとするウェスタンブロットによって分析した。

ｂ．結果
Ｈｉｓタグ付きＩＬ−３１タンパク質発現のクーマシーブルー染色、及び１２％ビストリスＳＤＳ ＰＡＧＥで行った精製（図３のＣ）。抗Ｈｉｓタグ抗体をプローブとする、Ｃに示されるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウェスタンブロット（図３のＤ）。培地中に分泌されたこの２１．１ＫＤのタンパク質を、以下のアッセイでの使用、ならびに免疫原性及び交差反応性評価の基準タンパク質としての使用のために同定及び精製した。

実施例４
細胞に基づくアッセイにおけるＩＬ−３１媒介ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達
ａ．アッセイ
ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物によって引き出されたＩＬ−３１抗体を使用する試験管内でのＩＬ−３１誘導シグナル伝達機能阻害アッセイを図４Ａ及び図４Ｂならびに図５のＡ及びＢに示す。

ｂ．ＩＬ−３１媒介ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達
１５％の加熱不活化ウシ胎仔血清と２ｍｍｏｌ／ＬのＧｌｕｔａＭａｘと１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムと５０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンと２０ｎｇ／ｍＬのイヌインターフェロン−γとを含有するＭＥＭ成長培地の中のＤＨ−８２細胞を９６ウェル平底細胞培養プレートにウェル１つあたり１×１０^５細胞の密度で播種して、５％のＣＯ_２を補充した加湿空気の中で３７℃で１６時間経過させた。ＩＬ−３１受容体発現を増加させるために、ＩＬ−３１処理前に２時間、細胞を血清枯渇させた。前処理後、組換えイヌＩＬ−３１を種々の用量（０．０００１〜１０ｎｇ／ｍＬ）で添加して５分経過させたか（図５のＡ）または１μｇ／ｍＬで添加して０、３、５、１０及び１５分経過させた（図５のＢ）。播種後、細胞を２０％の最終体積のＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｍｉｘ（５Ｘ）で溶解させ、３００ｒｐｍで３７℃で１０分間振盪した。細胞溶解物５０μｌを使用してｐＳＴＡＴ３を評価した。ペルオキシダーゼ標識抗ｐＳＴＡＴ３（ｙ７０５）またはペルオキシダーゼ標識抗ＳＴＡＴ３抗体５０μｌを検査ウェルに加えて３７℃で１時間反応させた。その後、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳでウェルを５回洗浄し、もう１５分間１００μｌのＴＭＢ基質と反応させた。２ＮのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度を決定した。

ｃ．結果
図５のＡ及びＢは、ｅｘｐｉ２９３細胞から産生されたイヌＩＬ−３１によって誘導されるイヌＤＨ−８２単球におけるｐＳＴＡＴ３シグナル伝達のグラフを示す。図５のＡは、イヌＩＬ−３１によって用量依存的にｐＳＴＡＴ３のリン酸化が誘導されたことを示し、アッセイ評価のためのリン酸化レベルを評価するために１μｇ／ｍＬの最適濃度を選択した。図５のＢは、イヌＩＬ−３１によって時間依存的にｐＳＴＡＴ３が誘導されたことを示し、抗ＩＬ−３１抗体の阻害力価を評価するために以下の実施例に記載の阻害アッセイのための時間点として５分を選択した。

実施例５
細胞に基づくアッセイにおけるＩＬ−３１媒介ＰＳＴＡＴ３シグナル伝達の阻害
ａ．ＩＬ−３１媒介ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達
１５％の加熱不活化ウシ胎仔血清と２ｍｍｏｌ／ＬのＧｌｕｔａＭａｘと１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムと５０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンと２０ｎｇ／ｍＬのイヌインターフェロン−γとを含有するＭＥＭ成長培地の中のＤＨ−８２細胞を９６ウェル平底細胞培養プレートにウェル１つあたり１×１０^５細胞の密度で播種して、５％のＣＯ_２を補充した加湿空気の中で３７℃で１６時間経過させた。ＩＬ−３１受容体発現を増加させるために、ＩＬ−３１処理前に２時間、細胞を血清枯渇させた。枯渇中に、モルモット免疫血清からのプロテインＡ樹脂で精製した段階希釈抗体試料１００μｌと、１μｇ／ｍＬのイヌＩＬ−３１とをよく混合し、３７℃で１時間、共インキュベートした。前処理後、組換えイヌＩＬ−３１と精製血清試料との混合物５０μｌを添加して５分経過させた。播種後、細胞を２０％の最終体積のＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｍｉｘ（５Ｘ）で溶解させ、３００ｒｐｍで３７℃で１０分間振盪した。細胞溶解物５０μｌを使用してｐＳＴＡＴ３を評価した。ペルオキシダーゼ標識抗ｐＳＴＡＴ３（ｙ７０５）またはペルオキシダーゼ標識抗ＳＴＡＴ３抗体５０μｌを検査ウェルに加えて３７℃で１時間反応させた。その後、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳでウェルを５回洗浄し、もう１５分間１００μｌのＴＭＢ基質と反応させた。２ＮのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度を決定した。

ｂ．結果
図６Ａ及び図６Ｂは、初回免疫後週数（ｗｐｉ）１２（図６Ａ）及び１５ｗｐｉ（図６Ｂ）の時に示される、本開示のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号４３、４７、５１、５５及び５９）から得られる抗ＩＬ−３１抗体によるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達の阻害を示すグラフである。

図７は、初回免疫後週数（ｗｐｉ）１５の時の、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物ｐ４７５１ｋｂ（配列番号４３）及びｐ４７５２（配列番号４７）から得られる抗ＩＬ−３１抗体によるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達の阻害に関する追加の詳細を示すグラフを含む。図７はさらに、組換えイヌＩＬ−３１タンパク質誘導ｐＳＴＡＴシグナル伝達に対する阻害（ＩＣ_５０）を報告する。

実施例６
モルモットにおける免疫原性評価のためのイヌＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物のさらなる改良
ａ．動物
合計１８匹のモルモット（体重３００〜３５０ｇ）を免疫付与のために使用した。表７に示すように、１８匹のモルモットを１群あたり動物３匹の６群に分け、４００μｇのペプチド（配列番号６３、６８、７１、７６、８０及び８４）による初回免疫を行い、続いて初回免疫後週数（ｗｐｉ）３、６、９及び１２の時に追加免疫を４回行った。それらに対応するＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物による抗ＩＬ−３１抗体の力価のために０、３、６、９、１２及び１５ｗｐｉの時に血液試料を採取した。

ｂ．製剤
総じて、免疫付与のために使用した製剤は以下を含有していた：
１． ４００μｇのＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物
２． ０．７：１のペプチド：ＣｐＧ比でのＣｐＧ
３． ０．２％のＴＷＥＥＮ８０

ｃ．ＥＬＩＳＡによる血清抗ＩＬ−３１抗体の力価測定
ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物によって引き出される血清抗ＩＬ−３１抗体の力価測定を以下のプロトコールに従って評価した：

９６ウェルプレートのウェルを、イヌＩＬ−３１組換えタンパク質１００μｌ（５０ｎｇ／ウェル）、またはそれぞれのＩＬ−３１ Ｂエピトープペプチド（０．２μｇ／１００μＬ／ウェル）で被覆してｐＨ９．６、５０ｍＭの炭酸−重炭酸緩衝液中１μｇ／ｍｌとして３７℃で１時間経過させた。

ｒｃＩＬ−３１またはそれぞれのＩＬ−３１ Ｂエピトープペプチド（配列番号９または１２）で被覆されたウェルをＰＢＳ中１％のＢＳＡ２００μｌと共に３７℃で１時間インキュベートして非特異的なタンパク質結合をブロッキングし、続いて０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、その後乾燥させた。免疫されたモルモットからの段階希釈血清試料１００マイクロリットル（１００μｌ）を各ウェルに加えて３７℃で１時間反応させた。その後、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳでウェルを５回洗浄し、乾燥させた。１％のＢＳＡ及び０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳで調製した最適に希釈されたペルオキシダーゼ標識ヤギ抗モルモットＩｇＧの１００μｌを各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳでウェルを６回洗浄し、もう１５分間１００μｌのＴＭＢ基質と反応させた。２ＮのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度を決定した。

ＩＬ−３１ペプチド系ワクチン製剤を与えたモルモットにおける抗体価の決定では、代表的な標的「ＩＬ−３１」Ｂエピトープペプチドに対する初回スクリーニングのために１：１００以上からの血清の１０倍段階希釈を実施し、力価をＬｏｇ_１０で表した。組換えイヌＩＬ−３１と交差反応性である血清のさらなる分析では、ＥＬＩＳＡにおいて１：１００から１：５４，２４８，８００まで血清の２倍段階希釈を実施し、力価をＬｏｇ_１０ＥＣ_５０で表した。

ｄ．結果
免疫原性評価からの結果を表８に示す。

各ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号６３、６８、７１、７６、８０及び８４）について、組換えＩＬ−３１に対する抗体価（ＬｏｇＥＣ_５０）を表９及び図８に示す。

これらの注意深く設計されたイヌＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物では高い免疫原性が認められ、１回の単回投与でさえ３ｗｐｉの時に高力価抗体が誘発された。注意深く設計されたＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号６３、６８、７１、７６、８０及び８４）によって誘発された抗体によるイヌｒＩＬ−３１に対する高い交差反応性が認められた。

実施例７
細胞に基づくアッセイにおけるモルモット免疫血清からの抗ＩＬ−３１抗体によるＩＬ−３１媒介ＰＳＴＡＴ３シグナル伝達の阻害
ａ．ＩＬ−３１媒介ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達
１５％の加熱不活化ウシ胎仔血清と２ｍｍｏｌ／ＬのＧｌｕｔａＭａｘと１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムと５０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンと２０ｎｇ／ｍＬのイヌインターフェロン−γとを含有するＭＥＭ成長培地の中のＤＨ−８２細胞を９６ウェル平底細胞培養プレートにウェル１つあたり１×１０^５細胞の密度で播種して、５％のＣＯ_２を補充した加湿空気の中で３７℃で１６時間経過させた。ＩＬ−３１受容体発現を増加させるために、ＩＬ−３１処理前に２時間、血清枯渇させた。その間に、６及び１２ＷＰＩの免疫されたモルモットからのプロテインＡ樹脂で精製した段階希釈血清試料１００μｌと、１μｇ／ｍＬのイヌＩＬ−３１とをよく混合し、３７℃で１時間、共インキュベートした。前処理後、組換えイヌＩＬ−３１と精製血清試料との混合物５０μｌを添加して５分経過させた。播種後、細胞を２０％の最終体積のＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｍｉｘ（５Ｘ）で溶解させ、３００ｒｐｍで３７℃で１０分間振盪した。細胞溶解物５０μｌを使用してｐＳＴＡＴ３を評価した。ペルオキシダーゼ標識抗ｐＳＴＡＴ３（ｙ７０５）またはペルオキシダーゼ標識抗ＳＴＡＴ３抗体５０μｌを検査ウェルに加えて３７℃で１時間反応させた。その後、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳでウェルを５回洗浄し、もう１５分間１００μｌのＴＭＢ基質と反応させた。２ＮのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度を決定した。

ｂ．結果
図９のＡ及びＢは、初回免疫後週数（ｗｐｉ）６及び１２の時に示される、本開示のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号６３、６８、７１、７６、８０及び８４）によってモルモット免疫血清から得られる抗ＩＬ−３１抗体の存在下でのイヌＤＨ８２単球でのイヌＩＬ−３１誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達によるリン酸化％（図９のＡ）及びＳＴＡＴ３リン酸化の阻害（図９のＢ）を示すグラフを含んでいる（図９のＡ）。

図１０のＡ及びＢは、初回免疫後週数（ｗｐｉ）９及び１２の時に示される、本開示のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号６３、６８、７１、８４）によって得られたモルモット免疫血清から得られる抗ＩＬ−３１抗体によるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達のリン酸化％（図１０のＡ）及びＳＴＡＴ３リン酸化の阻害（図１０のＢ）を示すグラフを含んでいる。

総じて、これらの注意深く設計されたＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物によって引き出された抗ＩＬ−３１反応性抗体について用量依存的に、イヌＤＨ８２単球におけるＩＬ−３１誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達の顕著な阻害が認められた。

実施例８
細胞に基づくアッセイにおけるＩＬ−３１媒介ＰＳＴＡＴ３シグナル伝達の阻害
ａ．ＩＬ−３１媒介ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達
１５％の加熱不活化ウシ胎仔血清と２ｍｍｏｌ／ＬのＧｌｕｔａＭａｘと１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムと５０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンと２０ｎｇ／ｍＬのイヌインターフェロン−γとを含有するＭＥＭ成長培地の中のＤＨ−８２細胞を９６ウェル平底細胞培養プレートにウェル１つあたり１×１０^５細胞の密度で播種して、５％のＣＯ_２を補充した加湿空気の中で３７℃で１６時間経過させた。ＩＬ−３１受容体発現を増加させるために、ＩＬ−３１処理前に２時間、血清枯渇させた。その間に、６、９及び１２ＷＰＩの免疫されたモルモットからのプロテインＡ樹脂で精製した段階希釈血清試料１００μｌと、１μｇ／ｍＬのイヌＩＬ−３１とをよく混合して３７℃で１時間、共インキュベートした。前処理後、組換えイヌＩＬ−３１と精製血清試料との混合物５０μｌを添加して５分経過させた。播種後、細胞を２０％の最終体積のＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｍｉｘ（５Ｘ）で溶解させ、３００ｒｐｍで３７℃で１０分間振盪した。細胞溶解物５０マイクロリットル（５０μｌ）を使用してｐＳＴＡＴ３を評価した。ペルオキシダーゼ標識抗ｐＳＴＡＴ３（ｙ７０５）またはペルオキシダーゼ標識抗ＳＴＡＴ３抗体５０マイクロリットル（５０μｌ）を検査ウェルに加えて３７℃で１時間反応させた。その後、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳでウェルを５回洗浄し、もう１５分間１００μｌのＴＭＢ基質と反応させた。２ＮのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度を決定した。

ｂ．結果
図１１Ａ及び図１１Ｂは、初回免疫後週数（ｗｐｉ）６、９及び１２の時の、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物ｐ４８５４ｋｂ（配列番号６３）及びｐ４８５９（配列番号８４）によって得られたモルモット免疫血清から得られる抗ＩＬ−３１抗体の存在下でのイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達のリン酸化率（図１１Ａ）及び阻害率（図１１Ｂ）を示す棒グラフを含む。

図１２は、初回免疫後週数（ｗｐｉ）６、９及び１２の時の、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物ｐ４８５４ｋｂ（配列番号６３）及びｐ４８５９（配列番号８４）によって得られたモルモット免疫血清から得られる抗ＩＬ−３１抗体によるイヌＤＨ８２単球におけるイヌＩＬ−３１誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達のリン酸化率を示す曲線近似のグラフを示す。下のパネルは、組換えイヌＩＬ−３１タンパク質誘導ｐＳＴＡＴシグナル伝達に対する対応する阻害（ＩＣ_５０）を報告する。

総じて、これらの注意深く設計されたＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物によって引き出された抗ＩＬ−３１反応性抗体について用量依存的に、イヌＤＨ８２単球におけるＩＬ−３１誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達の顕著な阻害が認められた。

実施例９
Ｅ．ＣＯＬＩにおける脂質化タンパク質の産生
脂質化を可能とする特定のＥ．ｃｏｌｉ株においてＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を発現させてリポタンパク質を作ることができ、アトピー性皮膚炎の治療のための免疫原として使用することができる。

このプロセスは米国特許第８，４２６，１６３号に記載されており、参照によりその全体を本明細書に援用する。

実施例１０
概念実証治験における機能的免疫原性評価のための選択されたＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号８４）によるイヌの免疫付与
ａ．動物
合計１５匹のビーグル犬を免疫付与のために使用した。イヌを２つの群に分け、イヌ８匹の１群を油中水エマルション製剤で試験し、他方のイヌ７匹の群をサポニン混合ミョウバン製剤について試験した。配列番号８４を有するＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物１００μｇによる初回免疫に続いて、初回免疫後日数（ＤＰＩ）２１の時に別の追加免疫を同じ用量の同じ製剤で行った。０、２１及び４１ＤＰＩの時に血液試料を、抗ＩＬ−３１抗体の力価の測定のため及び対応する免疫血清の中に存在する抗体の他の機能的特性の評価のために採取した。免疫付与プロトコールを図１３に示す。

ｂ．ＩＬ−３１ Ｂエピトープペプチドまたは組換えイヌＩＬ−３１タンパク質に対する血清抗ＩＬ−３１抗体のＥＬＩＳＡによる力価測定
ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号８４）によって引き出された血清抗ＩＬ−３１抗体の力価測定を以下のプロトコールに従って評価した：

９６ウェルプレートのウェルを、イヌＩＬ−３１組換えタンパク質１００μｌ（５０ｎｇ／ウェル）または０．２μｇ／０．１ｍＬ／ウェルのＩＬ−３１ Ｂエピトープペプチド（配列番号８４）で被覆してｐＨ９．６、５０ｍＭの炭酸−重炭酸緩衝液中１μｇ／ｍｌとして３７℃で１時間経過させた。抗原被覆ウェルをＰＢＳ中１％のＢＳＡ２００μｌと共に３７℃で１時間インキュベートして非特異的なタンパク質結合をブロッキングし、続いて０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄し、その後乾燥させた。免疫されたイヌからの段階希釈血清試料１００マイクロリットル（１００μｌ）を各ウェルに加えて３７℃で１時間反応させた。その後、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳでウェルを５回洗浄し、乾燥させた。１％のＢＳＡ及び０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳで調製した最適に希釈されたペルオキシダーゼ標識ウサギ抗イヌＩｇＧまたはペルオキシダーゼ標識組換えプロテインＡ／Ｇ（Ｐｉｅｒｃｅ（商標））１００マイクロリットル（１００μｌ）を各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳでウェルを６回洗浄し、もう１５分間１００μｌのＴＭＢ基質と反応させた。２ＮのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度を決定した。ＩＬ−３１ペプチド系ワクチン製剤を与えたビーグル犬における抗体価の決定では、ＥＬＩＳＡにおいて１：１００から１：５４，２４８，８００まで血清の２倍段階希釈を実施し、力価をＬｏｇ_１０で表した。

ｃ．細胞に基づくアッセイにおけるＩＬ−３１媒介ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達の阻害
１５％の加熱不活化ウシ胎仔血清と２ｍｍｏｌ／ＬのＧｌｕｔａＭａｘと１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムと５０μｇ／Ｌのゲンタマイシンと２０ｎｇ／ｍＬのイヌインターフェロン−γとを含有するＭＥＭ成長培地の中のＤＨ−８２細胞を９６ウェル平底細胞培養プレートにウェル１つあたり１×１０^５細胞の密度で播種して、５％のＣＯ_２を補充した加湿空気の中で３７℃で１６時間経過させた。ＩＬ−３１受容体発現を増加させるために、ＩＬ−３１処理前に２時間、血清枯渇させた。枯渇中に、免疫されたビーグルからのプロテインＡ樹脂で精製した段階希釈抗体試料１００μｌと、１μｇ／ｍＬのイヌＩＬ−３１とをよく混合して３７℃で１時間、共インキュベートした。前処理後、組換えイヌＩＬ−３１と精製血清試料との混合物５０μｌを添加して５分経過させた。播種後、ＳＴＡＴ３リン酸化を市販のキット（ＩｎｓｔａｎｔＯｎｅ（商標）ＥＬＩＳＡキット、Ｔｈｅｒｍｏ）で決定した。細胞を２０％の最終体積のＣｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｍｉｘ（５Ｘ）で溶解させ、３００ｒｐｍで３７℃で１０分間振盪した。細胞溶解物５０μｌを使用してｐＳＴＡＴ３を評価し、調製したペルオキシダーゼ標識抗ｐＳＴＡＴ３（ｙ７０５）またはペルオキシダーゼ標識抗ＳＴＡＴ３抗体５０μｌを検査ウェルに加えて３７℃で１時間反応させた。その後、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０を含有するＰＢＳでウェルを５回洗浄し、もう１５分間１００μｌのＴＭＢ基質と反応させた。２ＮのＨ_２ＳＯ_４で反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度を決定した。

ｄ．結果
標的ＩＬ−３１ Ｂエピトープペプチド（配列番号８４）に対するそれぞれの力価を有する種々の製剤による免疫原性評価からの結果を図１４に示す。各イヌについて２１ＤＰＩ及び４１ＤＰＩの時の組換えイヌＩＬ−３１に対する抗体価（Ｌｏｇ_１０ＥＣ_５０）を図１５及び図１６に示すが、第２追跡子としてはウサギ抗イヌＩｇＧ ＨＲＰ（図１５）またはプロテインＡ／Ｇ ＨＲＰ（図１６）を使用した。

配列番号８４を有する代表的なイヌＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物によって高い免疫原性が認められ、単回投与によって２１ＤＰＩの時にＩＬ−３１ Ｂエピトープペプチドに対する高力価抗体が引き出され（図１４）、これはイヌｒＩＬ−３１に対する交差反応性が高かった（図１５及び図１６）。

この製剤試験では、アジュバントサポニンの存在下でミョウバンが油中水エマルション製剤に比べてより良好な免疫増強を示したことが明らかである。どちらの追跡子も類似する結合プロファイル及び同程度の力価を示した。イヌにおけるこの免疫原性試験の別の重要な知見は、自己ＩＬ−３１配列が自己タンパク質の大部分に本来備わっている免疫寛容を突破する／またはそれに打ち克つのを専売薬ＵＢＩＴｈ（登録商標）−Ｔヘルパーペプチドが支援することができたということである。

総じて、ミョウバン／サポニン製剤を含んでいるどちらの製剤でも、この注意深く設計されたＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物によって引き出された抗イヌＩＬ−３１反応性抗体について（５００ｕｇから２５０、１００、７５、５０、１２．５、６．２５ｕｇまで）用量依存的に、イヌＤＨ８２単球におけるＩＬ−３１誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達の顕著な阻害が認められ、ＩＬ−３１誘導ｐＳＴＡＴ３シグナル伝達リン酸化の約４０〜６０％の阻害を示し、エマルジョン製剤では約３５〜５０％の阻害を示し、これと比較してモノクローナル抗ＩＬ−３１（Ｃｙｔｏｐｏｉｎｔ）は同程度に５０〜７５％の阻害を示した。図１８のＡ及びＢに示すように、イヌＩＬ−３１に対するモノクローナル抗体「Ｃｙｔｏｐｏｉｎｔ」は、ＩＣ_５０＝３．２１μｇ／ｍＬのシグナル伝達阻害力価を有する。

関連するモルモット免疫原性試験では、２回の免疫付与の後の６ｗｐｉの免疫血清からの抗体はそのようなｐＳＴＡＴ３シグナル伝達においてよりはるかに低い阻害％を有し、１５ｗｐｉの免疫血清からの抗体はより高い用量依存的総シグナル伝達阻害％を示した（図１９のＡ〜Ｃを参照のこと）。これらのデータは、２回より多い注射によるイヌの免疫付与がよりいっそう良好なシグナル伝達阻害をもたらすことを示唆している。かくして、そのようなイヌＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物は、イヌにおいて有効なポリクローナル抗体を誘導してイヌにおけるアトピー性皮膚炎を引き起こし得るＩＬ−３１の刺激の影響を軽減／抑制／阻害するその可能性及び能力を実証した。

実施例１１
モルモットにおける機能的免疫原性評価のためのヒトＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の設計のさらなる改良
ａ．イヌＩＬ−３１類縁体の拡張としてのヒトＩＬ−３１関連ペプチド免疫原構築物の設計
ＩＬ−３１は、ＩＬ−６サイトカインファミリーに属する４ヘリックスバンドルサイトカインである。ＩＬ−３１は、活性化ＣＤ４＋ ＴＨ２細胞によって、及び皮膚リンパ球関連抗原陽性皮膚帰巣性ＣＤ４５ＲＯ＋（メモリー）Ｔ細胞によって、優先的に産生される。ＩＬ−４は、ヒトＴＨ２細胞からのＩＬ−３１タンパク質の遺伝子発現及び放出を誘導し、ＩＬ−３３はＩＬ−４誘導ＩＬ−３１放出をさらに強める。

ＩＬ−３１受容体（ＩＬ−３１Ｒ）は、ＩＬ−３１受容体α鎖（ＩＬ−３１Ｒα）とオンコスタチンＭ受容体β（ＯＳＭＲβ）との異種二量体からなる。異種二量体型ＩＬ−３１Ｒは、マクロファージ、樹状細胞、好塩基球、皮膚ニューロン、及び角化細胞を含めた上皮細胞において発現する。ＩＬ−３１Ｒαは、皮膚感覚ニューロンの細胞体が位置している後根神経節において最も豊富に発現する。近年の研究は、ＩＬ−３１がＩＬ−３１Ｒによって感覚神経に直接連絡している可能性があり、Ｔ細胞媒介炎症性掻痒感を生じさせるためのＴｈ２細胞と感覚ニューロンとの間の極めて重要な神経免疫連結としての役割を果たしている可能性があることを示唆している。ＯＳＭＲβは、ＩＬ−３１Ｒのサブユニットであるだけでなく、ｇｐ１３０との相互作用もして、ＯＳＭに結合したＩＩ型受容体複合体を形成する。ＯＳＭＲβは脈管系、心臓、肺、脂肪組織、皮膚、膀胱、乳腺組織、副腎及び前立腺に広範囲にわたって発現する。

ＩＬ−３１は主としてＩＬ−３１Ｒαに結合するが、ＩＬ−３１Ｒ複合体中のＯＳＭＲβには結合しない。しかしながら、結合時にＯＳＭＲβはＩＬ−３１Ｒを高親和性受容体に転換し、ＩＬ−３１結合を増強する。ＩＬ−３１とＩＬ−３１Ｒα／ＯＳＭＲβ受容体複合体との相互作用は、Ｊａｋ／シグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴシグナル伝達及びマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路の活性化を誘導する。

ＩＬ−３１またはＩＬ−３１／ＩＬ−３１Ｒα複合体のＸ線構造データは未だ入手可能でない。しかしながら、部位特異的変異導入法は、ヒトＩＬ−３１の部位ＩＩとＩＬ−３１Ｒαとの相互作用及び部位ＩＩＩとＯＳＭＲβとの相互作用を示唆している。特に、ヘリックスＡ中のＥ２２及びヘリックスＣ中のＥ８３／Ｈ８７が部位ＩＩを形成し、ヘリックスＤのＮ末端にあるＫ１１１は部位ＩＩＩの必須部分である。Ｉ−ＴＡＳＳＥＲによって生成されたヒトＩＬ−３１のＡｂ ｉｎｉｔｉｏモデリングは、上−上下−下のトポロジーを有するＩＬ−３１サイトカインファミリーの古典的な４ヘリックスバンドルフォールドを示した。ＩＬ−３１Ｒα相互作用に肝要な３つの残基、Ｅ２２、Ｅ８３及びＨ８７は、予測される部位ＩＩを示して空間的に塊になっている。

ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物のヒトＩＬ−３１Ｂ細胞エピトープは、ＩＬ−３１分子上のＩＬ−３１Ｒα結合領域を標的とするようにさらに設計された。溶媒に曝露されるＥ８３及びＨ８７の側鎖の立体配座を維持するために、ヘリックスＣを近傍のヘリックスによって３つの異なる方法で拘束した：（１）ヘリックスＣ−ループ−ヘリックスＤ（配列番号１３）、（２）ヘリックスＢ−ループ−ヘリックスＣ（配列番号９５）、及び（３）ヘリックスＢ−Ｃ−Ｄ（配列番号９３）。３１〜６４アミノ酸残基のＢ細胞エピトープペプチドは、Ｌ７５−Ｓ１２２、Ｓ６２−Ｉ９２またはＡ６４−Ｌ１２７に由来していた。Ｅ８３及びＨ８７の側鎖は同一方向を向いており、ｐ５０９５ｋｂ（配列番号１０１）内のヘリックスＣエピトープをヘリックスＢでヘリックス−ヘリックス相互作用及び人工ジスルフィド結合の導入によって拘束した。Ｂエピトープとして単なるヘリックスＣ（配列番号９４）を有するペプチド構築物ｐ５０９４ｋｂ（配列番号１００）も試験した。

ｂ．抗体特異性分析のためのＩＬ−３１に基づくＥＬＩＳＡ試験
被覆用緩衝液（１．５ｇ／ＬのＮａ_２ＣＯ_３、２．９ｇ／ＬのＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．６）中の組換えヒトＩＬ−３１タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｘ．）または個々のヒトＩＬ−３１Ｂエピトープペプチド（配列番号１３、９４、９５及び９３）を、組換えヒトＩＬ−３１タンパク質については５０ｎｇ／ウェルとして、または各ヒトＩＬ−３１ Ｂエピトープペプチドについては２００ｎｇ／ウェルとしてマイクロタイタープレート上に固定し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液（０．０５％のＴＷＥＥＮ−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。被覆されたウェルを２００μＬ／ウェルのアッセイ用希釈剤（ＰＢＳ中０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴＷＥＥＮ−２０、０．０１％のＰｒｏＣｌｉｎ３００）で室温で１時間ブロッキングした。プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液で３回洗浄した。１００μＬの抗血清（１：１００から１：４．１９×１０^８まで４倍段階希釈、合計１２回希釈）または抗体希釈液（１００ｍｇ／ｍＬから０．０２３８ｎｇ／ｍＬまで４倍段階希釈、合計１２回希釈）を被覆ウェルに加えた。インキュベーションを室温で１時間行った。全てのウェルを吸引し、２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液で５回洗浄した。プレートをＨＲＰ複合ヤギ抗モルモットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１：１０，０００希釈液と共に１時間インキュベートした（１００μＬ／ウェル）。その後、全てのウェルを２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液で５回洗浄した。最後に、ウェルを１００μＬ／ウェルのＮｅＡ−Ｂｌｕｅ ＴＭＢ基質（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で発色させ、１００μＬ／ウェルの１ＭのＨ_２ＳＯ_４の添加によって反応を停止させた。吸光度をＯＤ_４５０でＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。Ｌｏｇ_１０力価またはＬｏｇ_１０（ＥＣ_５０）として表した抗血清の固有力価を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）において非線形回帰解析を用いることによって４パラメータ曲線に対する最大吸光度の５０％を与えるｌｏｇ表示での試料希釈度として決定した。精製したポリクローナルＩｇＧ抗体の反応性を、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて非線形回帰解析を用いることによって４パラメータ曲線に対する半数効果濃度（ＥＣ_５０）として表した。

ｃ．ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物及びその製剤によって引き出された抗体の機能的特性の動物における評価
免疫血清、または免疫するワクチンの中の精製抗ＩＬ−３１ポリクローナル抗体を、それらが（１）ＩＬ−３１とその受容体ＩＬ−３１Ｒαとの相互作用を遮断する、（２）Ｕ８７ＭＧ神経膠腫でのＩＬ−３１誘導ＳＴＡＴ３リン酸化を抑制する、及び（３）ＩＬ−３１ＲαをトランスフェクトされたＨａＣａＴ細胞株でのＩＬ−２０発現を阻害する能力についてさらに検査した。

１．細胞
５％のＣＯ_２を含む加湿された３７℃のインキュベータの中でＵ８７ＭＧ細胞株を、１０％の仔ウシ血清と１％のペニシリン／ストレプトマイシンとが補充されたＥＭＥＭの中に維持した。

５％のＣＯ_２を含む加湿された３７℃のインキュベータの中で、ＩＬ−３１Ｒαを過剰発現させるＨａＣａＴトランスフェクタントを、１０％のＦＢＳと１％のペニシリン／ストレプトマイシンと１ｍＭのピルビン酸ナトリウムと２００μｇ／ｍＬのヒグロマイシンＢ（Ｇｉｂｃｏ）とが補充されたＤＭＥＭ培地（高グルコース、Ｇｉｂｃｏ）の中に維持した。

２．ＩＬ−３１Ｒα鎖に対するＩＬ−３１の結合
先に種々のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を免疫したモルモットのプールした免疫血清からの精製ＩｇＧポリクローナル抗体を、ＩＬ−３１Ｒαに対するＩＬ−３１の結合を阻害するそれらの相対的能力についてＥＬＩＳＡで検査した。９６ウェルプレートのウェルを個々に、被覆用緩衝液（１５ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３、３５ｍＭのＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．６）中の５０ｎｇの抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。被覆したウェルを２００μＬ／ウェルのアッセイ用希釈剤（ＰＢＳ中１％のＢＳＡ、０．０５％のＴＷＥＥＮ−２０及び０．０１％のＰｒｏＣｌｉｎ３００）で室温で１時間ブロッキングした。プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液（０．０５％のＴＷＥＥＮ−２０及び０．０１％のＰｒｏＣｌｉｎ３００を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。１００ｎｇの組換えＨｉｓタグ付きヒトＩＬ−３１Ｒαタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を抗Ｈｉｓ表面に室温で１時間固定した。洗浄後、１０ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−３１（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）と種々の濃度の精製モルモットＩｇＧポリクローナル抗体との混合物１００μＬを室温で１時間、予備インキュベートし、その後、被覆ウェルに加えた。インキュベーションを室温で１時間行った。全てのウェルを吸引し、２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液で３回洗浄した。捕捉されたＩＬ−３１を１００μＬ／ウェルの０．２５μｇ／ｍＬのビオチン標識ウサギ抗ＩＬ−３１抗体（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ Ｉｎｃ．）で室温で１時間検出した。その後、結合しているビオチン標識抗体を、ストレプトアビジンポリ−ＨＲＰ（１：１０，０００希釈、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して１時間検出した（１００μＬ／ウェル）。全てのウェルを吸引し、２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液で３回洗浄した。最後に、ウェルを１００μＬ／ウェルのＯｐｔＥＩＡ ＴＭＢ基質（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で発色させ、１００μＬ／ウェルの１ＭのＨ_２ＳＯ_４の添加によって反応を停止させた。比色吸光度をＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定し、Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で半数阻害濃度（ＩＣ_５０）を算出するための４パラメータロジスティック曲線近似を用いて反応性曲線を生成した。

３．ＩＬ−３１誘導ＳＴＡＴ３リン酸化アッセイ
精製ＩｇＧがＵ８７ＭＧ細胞におけるＩＬ−３１誘導ＳＴＡＴ３リン酸化を阻害することができるか否かを調査するために、細胞を１２ウェルプレートに播種し（２×１０^５／ウェル）、低血清培地（ＥＭＥＭ中１％の仔ウシ血清）中で１６時間枯渇させた。その後、総体積５００μＬの低血清培地の中でモルモットポリクローナル抗体の存在下で細胞を１０ｎｇ／ｍＬの終濃度のＩＬ−３１と共に同時に３７℃、５％ＣＯ_２で３０分間インキュベートした。抗ＩＬ−３１モノクローナル抗体ＭＴ３１３（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ）も試験対照として含めた。リン酸化ＳＴＡＴ３レベルをＰａｔｈＳｃａｎ ｐ−Ｓｔａｔ３ ＥＬＩＳＡキット（細胞シグナル伝達）で測定した。手短に述べると、１％のホスファターゼ阻害薬カクテル３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充された３０μＬの細胞溶解用緩衝液（細胞シグナル伝達）中に細胞を懸濁させるとともに細胞残屑を１２，０００ｘｇで４℃で１０分間の遠心分離によって除去することによって細胞溶解物を調製した。透明な細胞溶解物のうちの１０マイクログラム（１０μ）を使用してリン酸化ＳＴＡＴ３の含有量を販売者の説明書に従って測定した。比色吸光度をＶｅｒｓａＭａｘ ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって測定した。

４．ＩＬ−３１誘導ＩＬ−２０発現
ＨａＣａＴは、成人皮膚由来の自発的に形質転換される異数性不死化角化細胞株である。ＩＬ−３１誘導ＩＬ−２０発現の検査を容易にするために、ヒトＩＬ−３１Ｒαを過剰発現させる安定なＨａＣａＴクローンを作製した。ＩＬ−３１依存性ＩＬ−２０発現は、本開示のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物によって引き出される抗ＩＬ−３１抗体によって調節される可能性がある。アッセイは、４×１０^５個の細胞と、１０ｎｇ／ｍＬの終濃度のヒト組換えＩＬ−３１と、種々の濃度の精製モルモットＩｇＧポリクローナル抗体とをウェル１つあたり総体積１，０００μＬの培養培地の中で３７℃、５％ＣＯ_２で１時間インキュベートすることによって実施した。抗ＩＬ−３１モノクローナル抗体ＭＴ３１３（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ）も試験対照として含めた。ＲＮＡをＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡミニキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）によって製造者の説明に従って抽出し、残存するゲノムＤＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ／ＲＮａｓｅＯＵＴ酵素ミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｅｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）によって除去した。合計１μｇのＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｅｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）によってｃＤＮＡに逆転写し戻し、得られたｃＤＮＡを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｅｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して定量的リアルタイムＰＣＲによって分析した。リアルタイムＰＣＲ反応をＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｅｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）で実施した。ＩＬ−２０のためのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔプライマー対（Ｈｓ＿ＩＬ２０＿１＿ＳＧ）をＱｕｉａｇｅｎから購入し、ＨＰＲＴのためのプライマー対（順方向：５’−ＴＧＡＣＡＣＴＧＧＣＡＡＡＡＣＡＡＴＧＣＡ−３’（配列番号１０６）、逆方向：５’−ＧＧＴＣＣＴＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴ−３’（配列番号１０７））を合成した。全ての測定は二重化して実施した。相対的定量は、比較サイクル閾値法を用いることで計算し、ＨＰＲＴに対して正規化した。各抗体処理群の相対ＩＬ−２０発現レベルを未処理群のそれに対して正規化した。

ｄ．結果
設計、スクリーニング、同定、機能特性の評価、及び代表的なヒトＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物を組み込んだ他成分ワクチン製剤の最適化

１．ヒトＩＬ−３１ Ｂ細胞エピトープペプチド配列の選択
ＩＬ−３１のヘリックスＣをＢ細胞エピトープペプチド設計のために選択した、というのも、２つの肝要な残基Ｅ８３及びＨ８７はこの領域においてＩＬ−３１Ｒαと相互作用することが分かっているからである。モルモットにおける４００μｇ／１ｍＬでの初回免疫及び１００μｇ／０．２５ｍＬでの追加免疫（３、６及び９ｗｐｉ）のために、ＵＢＩＴｈ１ Ｔヘルパーペプチド（配列番号２７）と、短いリンカーεＫとに連結されたヘリックスＣに基づくペプチド構築物をＩＳＡ５１及びＣｐＧと共に製剤化した。モルモットにおける免疫原性を検査するために、ＥＬＩＳＡアッセイを１：１００から１：４．１９×１０^８まで４倍段階希釈したモルモット免疫血清と共に用いた。ＥＬＩＳＡプレートをウェル１つあたり５０ｎｇの組換えヒトＩＬ−３１タンパク質で被覆した。検査した血清のＬｏｇＥＣ_５０として表される力価をＡ４５０ｎｍの４パラメータ非線形回帰解析によって算出した。ＥＬＩＳＡ結果は４つのペプチド免疫原構築物が対応するＩＬ−３１ Ｂエピトープペプチド（表１０（配列番号８７）、表１１（配列番号１００及び１０１；及び表１３の群３（配列番号９９）に対する高い免疫原性力価を誘導しただけでなく、ヒトＩＬ−３１タンパク質に対する中等度〜高度の交差反応性を誘導したことを示した（図２０のＡ及びＢ）。

２．ヒトＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の免疫原性の、ＩＬ−３１とＩＬ−３１Ｒαとの相互作用を阻害するそれらの抗体に関する評価
モルモットにおいて生成したＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物からの抗体が、ＩＬ−３１とＩＬ−３１Ｒαとの相互作用を遮断すべくＩＬ−３１を中和することができるか否かを判定する試験を実施した。具体的には、４つの各々の候補ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号８７、９９、１００及び１０１）によって免疫したモルモットの免疫血清からの精製モルモットＩｇＧをＥＬＩＳＡアッセイに採用したが、これに関して、抗Ｈｉｓ抗体で被覆された固相上にヒトＩＬ−３１Ｒαタンパク質を固定した。図２１に示すように、各々のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの免疫血清から精製した代表的な抗体は、競合的にＩＬ−３１とＩＬ−３１Ｒαとの相互作用を用量依存的に（１０Ｅ−３〜１０Ｅ２μｇ／ｍＬ）阻害した。

３．抗ＩＬ−３１抗体によるＩＬ−３１誘導ＳＴＡＴ３リン酸化の抑制
ＩＬ−３１シグナル伝達経路は、最初に細胞膜上でのＩＬ−３１Ｒα／ＯＳＭＲβの複合体形成、及びそれに続く下流での細胞質におけるタンパク質ＳＴＡＴ３リン酸化に関与する。Ｕ８７ＭＧ細胞株を使用して、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物で免疫したモルモットの免疫血清に由来する精製抗ＩＬ−３１抗体の能力を、ＩＬ−３１誘導ＳＴＡＴ３リン酸化を抑制するそれらの能力に関して評価した。

まず、培養細胞をＩＬ−３１（１０ｎｇ／ｍＬ）及び種々の濃度の精製ＩｇＧで同時に処理した。抗ＩＬ−３１モノクローナル抗体ＭＴ３１３を陽性対照として含めた。図２２にみられるように、ＭＴ３１３に加えて、代表的な免疫原（配列番号８７及び配列番号１０１）によって引き出された抗ＩＬ−３１ ＩｇＧは、ＳＴＡＴ３リン酸化を用量依存的に低減することができた。

４．ＩＬ−３１誘導ＩＬ−２０発現の抑制
ＩＬ−２０は構造的に、ＩＬ−１０、及び炎症への自身の関与を調節する角化細胞のオートクリン因子に関係する。ＩＬ−３１は角化細胞の細胞株ＨａＣａＴにおいてＩＬ−２０発現を誘導することができる。ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物によってモルモットにおいて引き出された抗ＩＬ−３１抗体が、ＩＬ−３１Ｒα過剰発現ＨａＣａＴトランスフェクタントにおけるＩＬ−３１依存性ＩＬ−２０発現を抑制することができるか否かを調査するために、全ての細胞培養群を１０ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＬ−３１で３０分間、ＩＬ−２０遺伝子転写の誘導のために処理した。候補ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号８７及び配列番号１０１）によって引き出されたモルモットの免疫血清からの精製ＩｇＧの代表的調製物を検査群に種々の濃度で添加し、陽性対照としてＭＴ３１３も含めた。抗体を添加せずＩＬ−３１のみの存在下での細胞培養物を陰性対照として用意した。図２３に示すように、配列番号８７及び配列番号１０１を有する代表的候補ペプチド構築物によって引き出された精製ＩｇＧ抗体で処理した群においてＩＬ−２０発現の抗体濃度依存的抑制が認められた。

上記の生体外での機能試験は、ヘリックス−ヘリックス相互作用及び人工ジスルフィド結合の導入によってヘリックスＢで束縛されたヘリックスＣからなるＩＬ−３１ペプチド免疫原がＩＬ−３１−ＩＬ−３１Ｒα相互作用の遮断及びＩＬ−３１誘導シグナル伝達カスケードの抑制を実証したことを示唆している。

５．種々の他成分製剤の中の代表的ヒトＩＬ−３１ペプチド構築物（配列番号１０１）の機能的免疫原性の評価
合計２７匹のモルモット（体重３００〜３５０ｇ）を免疫付与のために使用した。表１５に示すとおり、２７匹のモルモットを、群１つあたり動物３匹の９つの群に分け、４００μｇのペプチドによる初回免疫ならびにそれに続く２回の初回免疫後週数（ｗｐｉ）３及び６の時の追加免疫を行った。対応するＩＬ−３１ Ｂエピトープペプチド（配列番号９５）による抗ＩＬ−３１抗体の力価のために０、３、６、９、１２及び１５ｗｐｉの時に血液試料を採取した。９つの群は、表１５に示すように、（ＰＢＳによる）プラセボ、ＣＰＧ１、ＣｐＧ３、ＩＳＡ５１ＶＧ、ＡＤＪＵＰＨＯＳ、ＩＳＡ５１ＶＧ＋ＣｐＧ１、ＡＤＪＵＰＨＯＳ＋ＣｐＧ１、ＩＳＡ５１ＶＧ＋ＣｐＧ３、及びＡＤＪＵＰＨＯＳ＋ＣｐＧ３であった。血清抗ＩＬ−３１抗体の力価測定を、上記のようにＩＬ−３１ Ｂエピトープペプチド（配列番号９５）を使用してＥＬＩＳＡによって実施し、力価は表１５に示すように（０、３、６、９、１２及び１５ｗｐｉでの）Ｌｏｇ_１０で表した。０、３、６及び９ｗｐｉでの免疫原性データを図２４の上パネルにプロットした。各製剤群についての詳細な平均力価を図２４の下パネルにＬｏｇ_１０で示した。

この免疫原性試験の結果は、油中水エマルションとしてのＩＳＡ５１及びＣｐＧを使用する製剤の高い力価が、アジュバントとしてＡＤＪＵＰＨＯＳを使用するものよりも良い成績であったことを示す。したがって、デザイナーＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の免疫原性は最適な製剤化によってさらに増強された。

図２５に示すように、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号１０１）に対するこれらの９ｗｐｉのモルモット免疫血清からの精製ポリクローナル抗体を様々な配合組成でＩＬ−３１とＩＬ−３１Ｒαとの結合相互作用のアッセイにおいてさらに検査した。図２５に示すように、各製剤について詳細なＩＣ_５０（μｇ／ｍＬ）値を算出した。またしても、これらの抗体のうちで最も強力な阻害剤はＩＳＡ５１／ＣｐＧ１またはＩＳＡ５１／ＣｐＧであり、ＩＣ_５０がそれぞれ０．２０３６及び０．１９６５μｇ／ｍＬであった。

さらに、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号１０１）に対するこれらの９ｗｐｉのモルモット免疫血清からの精製ポリクローナル抗体を、これらの抗ＩＬ−３１抗体によってＩＬ−３１誘導ＩＬ−２０発現及びＩＬ−３１誘導ＳＴＡＴ３リン酸化を抑制するそれらの能力について、様々な配合組成で生体外モードで検査した。

図２５及び図２６に示すとおり、代表的製剤中の代表的候補ペプチド免疫原構築物（配列番号１０１）によって引き出された精製抗体による処置群では抗体濃度に依存した抑制が認められた（群１〜９）。またしても、油エマルションとしてのＩＳＡ５１＋ＣＰＧ１またはＣｐＧ３での配合組成は、図２５に示すとおりＩＬ−２０発現の最も強い抑制を生じ（１μｇ／ｍＬのときの対照の０．３または０．４倍から、１０及び１００μｇ／ｍＬで検査したときのゼロまで）、ＳＴＡＴ３リン酸化についても同様であった（図２６）。

実施例１２
イヌ、マウス及びヒトＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の中での異なる種をまたいだ免疫原性の交差反応性のさらなる評価
ａ．抗体特異性分析のためのＩＬ−３１に基づくＥＬＩＳＡ検査
被覆用緩衝液（１．５ｇ／ＬのＮａ_２ＣＯ_３、２．９ｇ／ＬのＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９．６）中の個々のイヌ、マウス及びヒトＩＬ−３１Ｂエピトープペプチド（配列番号１２、９３、９６、９７または９８）を、各ＩＬ−３１ Ｂエピトープペプチドについて２００ｎｇ／ウェルとしてマイクロタイタープレート上に固定し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液（０．０５％のＴＷＥＥＮ−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。被覆されたウェルを室温で１時間、２００μＬ／ウェルのアッセイ用希釈剤（ＰＢＳ中０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴＷＥＥＮ−２０、０．０１％のＰｒｏＣｌｉｎ３００）でブロッキングした。プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液で３回洗浄した。抗体希釈剤中の抗血清（１０倍段階希釈）１００μＬを被覆ウェルに加えた。インキュベーションを室温で１時間行った。全てのウェルを吸引し、２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液で５回洗浄した。プレートをＨＲＰ複合ヤギ抗モルモットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１：１０，０００希釈液と共に１時間インキュベートした（１００μＬ／ウェル）。その後、全てのウェルを２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液で５回洗浄した。最後に、ウェルを１００μＬ／ウェルのＮｅＡ−Ｂｌｕｅ ＴＭＢ基質（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で発色させ、１００μＬ／ウェルの１ＭのＨ２ＳＯ４の添加によって反応を停止させた。吸光度をＯＤ４５０でＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。Ｌｏｇ_１０力価として表した抗血清の固有力価を決定した。

ｂ．結果
免疫原性評価試験からの結果を表１３及び表１４に示す。

表１３に示すとおり、モルモット免疫血清のなかではＩＬ−３１ Ｂエピトープペプチド（配列番号１２及び９３）との妥当な交差反応性がイヌ（配列番号８３及び配列番号８５）及びヒト種（配列番号９９）のどちらからの対応ペプチド類縁体に対しても認められた。しかしながら、イヌ種からの対応ペプチド免疫原構築物類縁体（配列番号１０２及び配列番号１０３）と併せてマウスＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号１０４及び配列番号１０５）に対してモルモット免疫血清を差し向ける場合、それらと対応するＩＬ−３１ Ｂエピトープペプチド（イヌでは配列番号９６、これに対してマウスでは配列番号９７及び配列番号９８）との結合の交差反応性に限りがあることが認められた。イヌＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物（配列番号１０２及び１０３）と併せてそれらの対応マウスＩＬ−３１ Ｂエピトープペプチド類縁体（配列番号９７及び配列番号９８）に対してモルモット免疫血清を差し向ける場合、表１４に示すように、交差反応性は認められなかった。したがって、イヌモデルをヒトへの適用のための概念実証試験のために使用することができる。

実施例１３
アジュバントを含むまたは含まない様々な配合組成での組換えイヌＩＬ−３１タンパク質及びＵＢＩＴＨ１結合を含有するリポタンパク質のモルモットにおける免疫原性評価
組換え完全長イヌＩＬ−３１タンパク質（ＦＬ−イヌＩＬ−３１）、及び免疫原性増強のためのＩＬ−３１タンパク質のＮ末端側に配置されたＵＢＩＴｈ（登録商標）１配列を含む組換え完全長イヌＩＬ−３１タンパク質（ＦＬ−イヌＩＬ−３１リポタンパク質）をどちらも相対免疫原性の比較のためのアジュバントを含まないものとＡＤＪＵＰＨＯＳを含むものとの２種類の製剤として調製し、アジュバント不含製剤は５０μｇ／０．５ｍＬ／用量／ＩＭと２５μｇ／０．５ｍＬ／用量／ＩＭとの２つの高及び低投薬量で検査した一方、ＡＤＪＵＰＨＯＳをアジュバント製剤として含むものは５０μｇ／０．５ｍＬ／用量／ＩＭの高投薬量でのみ検査し、プロトコールは表１２に示す。

ａ．抗体特異性分析のためのＩＬ−３１に基づくＥＬＩＳＡ検査
被覆用緩衝液（１．５ｇ／ＬのＮａ２ＣＯ３、２．９ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）中の組換え完全長（ＦＬ）イヌＩＬ−３１タンパク質を、５０ｎｇ／ウェルとしてマイクロタイタープレート上に固定し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液（０．０５％のＴＷＥＥＮ−２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。被覆されたウェルを室温で１時間、２００μＬ／ウェルのアッセイ用希釈剤（ＰＢＳ中０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴＷＥＥＮ−２０、０．０１％のＰｒｏＣｌｉｎ３００）でブロッキングした。プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液で３回洗浄した。抗体希釈剤中の抗血清（１０倍段階希釈）１００μＬを被覆ウェルに加えた。インキュベーションを室温で１時間行った。全てのウェルを吸引し、２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液で５回洗浄した。プレートをＨＲＰ複合ヤギ抗モルモットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１：１０，０００希釈液と共に１時間インキュベートした（１００μＬ／ウェル）。その後、全てのウェルを２００μＬ／ウェルの洗浄用緩衝液で５回洗浄した。最後に、ウェルを１００μＬ／ウェルのＮｅＡ−Ｂｌｕｅ ＴＭＢ基質（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）で発色させ、１００μＬ／ウェルの１ＭのＨ２ＳＯ４の添加によって反応を停止させた。吸光度をＯＤ４５０でＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。Ｌｏｇ_１０力価として表した抗血清の固有力価を決定した。

ｂ．結果
上記２つの組換えタンパク質の免疫原性評価試験からの結果を表１２に示す。

イヌＩＬ−３１リポタンパク質（群１〜３）及び通常のイヌＩＬ−３１タンパク質（群４〜６）はどちらも、そのようなタンパク質の免疫原性がＮ末端側に結合したＵＢＩＴｈ（登録商標）１によって増強される場合、アジュバントの非存在下（群１、２、４及び５）においてさえ免疫原性であることが分かった。全体的にＩＬ−３１リポタンパク質（群１〜３）の免疫原性は、同じ製剤の並列比較で通常のＩＬ−３１非リポタンパク質（群４〜６）よりも良好であることが分かり、それらのリポタンパク質群はたった１度の免疫付与で大いに免疫原性であることが分かった。通常のタンパク質で免疫した群（群４〜６）は、さらなる追加免疫によって、それらの対応する免疫原性に追い付き始め、８ｗｐｉの免疫血清採血によって示されるように２回の追加免疫の後に等価な免疫原性に到達した。

Claims (17)

1. 式：
   （Ｔｈ）_ｍ−（Ａ）_ｎ−（ＩＬ−３１断片）−Ｘ
   または
   （ＩＬ−３１断片）−（Ａ）_ｎ−（Ｔｈ）_ｍ−Ｘ
   〔式中、
   Ｔｈは異種Ｔヘルパーエピトープであり、
   Ａは異種スペーサーであり、
   （ＩＬ−３１断片）は、配列番号１または配列番号２からの約１５〜約７５アミノ酸残基を有するＢ細胞エピトープであり、
   Ｘはアミノ酸のα−ＣＯＯＨまたはα−ＣＯＮＨ_２であり、
   ｍは１〜約４であり、
   ｎは０〜約１０である〕
   で表すことができるＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。
2. 前記ＩＬ−３１断片が、配列番号１〜１３及び配列番号９３〜９８からなる群から選択される、請求項１に記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。
3. 前記Ｔｈエピトープが、配列番号１４〜４２からなる群から選択される、請求項１または請求項２のいずれかに記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。
4. 前記ペプチド免疫原構築物が、配列番号４３〜９０及び配列番号９９〜１０５からなる群から選択される、請求項１に記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。
5. 配列番号１または配列番号２の完全長ＩＬ−３１タンパク質配列からの約１５〜約７５アミノ酸残基を含むＢ細胞エピトープ、
   配列番号１４〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＴヘルパーエピトープ、ならびに
   アミノ酸Ｌｙｓ−、Ｇｌｙ−、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、及びε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号９１）からなる群から選択される任意選択の異種スペーサー
   を含む、ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物であって、
   前記Ｂ細胞エピトープが直接、または前記任意選択の異種スペーサーによって、前記Ｔヘルパーエピトープに共有結合している、前記ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。
6. 前記Ｂ細胞エピトープが、配列番号１〜１３及び配列番号９３〜９８からなる群から選択される、請求項５に記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。
7. 前記Ｔヘルパーエピトープが、配列番号１４〜４２からなる群から選択される、請求項５に記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。
8. 前記任意選択の異種スペーサーが、（α，ε−Ｎ）Ｌｙｓ、またはε−Ｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号９１）である、請求項５に記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。
9. 前記Ｔヘルパーエピトープが前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端に共有結合している、請求項５に記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。
10. 前記Ｔヘルパーエピトープが前記任意選択の異種スペーサーによって前記Ｂ細胞エピトープのアミノ末端に共有結合している、請求項５に記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物。
11. 請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド免疫原構築物を含む組成物。
12. ａ．請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド免疫原構築物と、
    ｂ．薬学的に許容される送達ビヒクル及び／またはアジュバントと
    を含む、医薬組成物。
13. ａ．前記ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物が、配列番号４３〜９０及び配列番号９９〜１０５からなる群から選択され、
    ｂ．前記ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物が、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）と混合されて安定化免疫刺激性複合体を形成している、
    請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 請求項１〜１０のいずれかに記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。
15. 前記ＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物に結合している、請求項１４に記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。
16. 請求項１〜１０のいずれかに記載のＩＬ−３１ペプチド免疫原構築物の前記Ｂ細胞エピトープに特異的に結合する、単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片。
17. 請求項１４〜１６のいずれかに記載の単離された抗体またはそのエピトープ結合性断片を含む、組成物。
    
    
    

Images