TW201946649A - 以人工混合t輔助細胞抗原決定位以有限度的t細胞發炎反應促進目標抗體的生產 - Google Patents

以人工混合t輔助細胞抗原決定位以有限度的t細胞發炎反應促進目標抗體的生產 Download PDF

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Abstract

本發明係有關於可提供目標抗原位點最佳免疫原性的新型異源性混雜、人工T輔助細胞抗原決定位(Th抗原決定位)。當本揭露Th抗原決定位與胜肽免疫原結構中的B細胞抗原決定位共價連接時，可誘發針對目標抗原位點B細胞抗原決定位的強烈抗體反應。Th抗原決定位本身為免疫沉默的，即利用胜肽免疫原結構產生的抗體很少(如果有的話)是針對Th抗原決定位，因此允許產生針對目標抗原位點非常集中的免疫反應。異源性混雜的Th抗原決定位可提供有效且安全的胜肽免疫原，在給予後不會產生發炎、抗自身、細胞介導的免疫反應。

Description

以人工混合T輔助細胞抗原決定位以有限度的T細胞發炎反應促進目標抗體的生產
本揭露提供了混雜的人工T輔助細胞(Th)抗原決定位，其可用於製造胜肽免疫原，此胜肽免疫原可刺激針對功能性位點的抗體反應以提供療效。
免疫反應需要抗原呈現細胞和T輔助細胞之間的相互協同作用。誘發有效的抗體反應需要抗原呈現細胞辨識免疫原的目標抗原位點，且T輔助細胞辨識T輔助細胞抗原決定位。一般來說，免疫原上的T輔助細胞抗原決定位不同於其B細胞抗原決定位。B細胞抗原決定位是可被B細胞所辨識位於欲求目標上的位點，其造成產生針對欲求目標位點的抗體。目標的天然構型決定了抗體直接結合的位點。Th細胞反應的誘導需要Th細胞受體辨識抗原呈現細胞膜上的複合物，其形成於目標蛋白之加工的胜肽片段及聯合的第2類主要組織相容性複合體(MHC)之間。因此，Th細胞的反應需要目標蛋白的胜肽切割及三方辨識。由於(1) 關鍵的第2類MHC接觸殘基在不同的MHC結合胜肽(Th抗原決定位)內有不同的位置；(2) 不同的MHC結合胜肽具有多變的長度和不同的胺基酸序列；(3)依據宿主的遺傳組成，第2類MHC分子具高度多樣性，因此難以確認此三個部份的複合物。對特定Th抗原決定位的免疫反應部份是由宿主的MHC基因所決定，且族群個體之間的Th抗原決定位反應性不同。難以鑑別混雜的Th抗原決定位(即跨越物種與單一物種內之個體具反應性的Th抗原決定位)。
T細胞辨識的每個組成步驟需要多個因子，例如，抗原呈現細胞進行適當的胜肽加工，以遺傳性決定的第2類MHC分子呈現胜肽，以及由Th細胞上的受體辨識MHC分子或胜肽複合物。對用以提供廣泛反應性之混雜Th抗原決定位辨識的要求難以確定。
很明顯地，為了誘導抗體，免疫原必須包含B細胞抗原決定位與T細胞抗原決定位。通常，載體蛋白與目標耦接以提供Th反應，可增加目標的免疫原性。然而，此技術仍存在許多缺點。由於以下原因，難以製備明確、安全且有效的胜肽 - 載體蛋白共軛物：
(a)化學耦接為引入大小和組成異質性的隨機反應，例如與戊二醛結合(Borras-Cuesta等，Eur J Immunol，1987; 17：1213-1215)；
(b)載體蛋白可能會導入非所欲的免疫反應，例如過敏和自體免疫反應(Bixler等，WO 89/06974)；
(c)大型胜肽-載體蛋白引發無關的免疫反應，其主要地錯誤地針對載體蛋白而非目標位點(Cease等，Proc Natl Acad Sci USA，1987; 84：4249-4253)；以及
(d)在先前已經利用含有相同載體蛋白的免疫原進行免疫的宿主中，載體蛋白亦可能引入表位抑制。當隨後用另一種免疫原免疫宿主時，其中相同的載體蛋白與不同的半抗原(hapten)耦接，對載體蛋白而言所得的免疫反應是增強的，但對半抗原而言所得的免疫反應是抑制的(Schutze等，J Immunol，1985; 135：2319-2322)。
為了避免上述風險，欲在不使用傳統載體蛋白的情況下引發T細胞輔助。
本揭露提供了混雜的人工T輔助細胞(Th)抗原決定位，其可用於製造胜肽免疫原，此胜肽免疫原可刺激針對功能性位點的抗體反應以提供療效。本揭露人工Th抗原決定位可以透過任選的間隔子與合成的胜肽B細胞抗原決定位(“目標抗原位點”)連接，以產生免疫原性胜肽。免疫原性胜肽更可包含其他組成，包括一般免疫刺激序列。
人工Th抗原決定位賦予胜肽免疫原誘發強T輔助細胞介導的免疫反應的能力，產生針對“目標抗原位點”的高水平抗體。利用專門設計用於改善胜肽免疫原之免疫原性的人工Th抗原決定位，本發明進一步提供在建立的胜肽免疫原中對載體蛋白和病原體衍生的T輔助細胞位點的有利替代。含有本發明人工Th抗原決定位的短胜肽免疫原可引發針對特定目標抗原位點B細胞抗原決定位的高水平抗體，而不引起顯著發炎反應。
本發明的人工Th抗原決定位可以與目標抗原位點和任選的免疫刺激序列連接。本發明的免疫原性胜肽如下式表示:
(A)n -(目標抗原位點)-(B)o -(Th)m -X
或
(A)n -(B)o -(Th)m -(B)o -(目標抗原位點)-X
或
(A)n -(Th)m -(B)o -(目標抗原位點)-X
或
(目標抗原位點)-(B)o -(Th)m -(A)n -X
或
(Th)m -(B)o -(目標抗原位點)-(A)n -X
其中：
每個A獨立地為胺基酸；
每個B獨立地為胺基酸、-NHCH(X)CH2 SCH2 CO-、 -NHCH(X)CH2 SCH2 CO(εN)Lys-、-NHCH(X)CH2 S-琥珀醯亞胺基(εN)Lys-或 -NHCH(X)CH2 S-(琥珀醯亞胺基)-；
每個Th獨立地為人工Th細胞抗原決定位、其類似物或其片段；
目標抗原位點為B細胞抗原決定位、胜肽半抗原、或其免疫反應性類似物；
X為胺基酸的α-COOH或α-CONH2 ；
n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
m為1、2、3或4；以及
o為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
作為目標抗原位點的胜肽半抗原之實施例為β-澱粉樣(Aβ)蛋白的第1-14個胺基酸(Aβ1-14 ) (SEQ ID NO:56)。
本發明組合物包括可在免疫宿主中引發針對欲求目標抗原位點之抗體反應的胜肽。目標抗原位點可源自病原生物以及通常免疫沉默的自身抗原和腫瘤相關標靶。
因此，本發明組合物可使用於許多不同的醫學及獸醫學應用。這些應用包括提供傳染病保護性免疫的疫苗、治療因正常生理過程失常所引起之疾病的免疫療法、治療癌症的免疫療法，以及欲求地干預和改變正常生理過程的藥劑。
可與本發明Th抗原決定位共價連接的一些目標抗原包括以下抗原的部分：用於治療阿茲海默症的β-澱粉樣蛋白(Aβ)、用於治療帕金森氏症的α-突觸核蛋白(α-Syn)、用於治療過敏性疾病的膜結合IgE的細胞外膜近端結構域(或IgE EMPD)、用於治療tau蛋白病(包含阿茲海默症)的Tau，以及用於治療異位性皮膚炎的介白素-31 (IL-31)，僅舉幾例。更具體地，Aβ1-14 (如美國專利號9,102,752所述)、α-Syn126-135 (如美國臨時案申請號62/521,287所述)、IgE EMPD1-39 (如國際PCT申請案號PCT/US2017/069174所述)、Tau379-408 (如美國臨時案申請號62/578,124所述)和IL-3197-144 (如美國臨時案申請號62/597,130所述)。
在一些實施例中，本發明提供一種疾病治療方法，包括將胜肽投予有需要的個體，其中此胜肽包括T輔助細胞抗原決定位和抗原呈現抗原決定位，其中相較於陽性對照組的免疫發炎反應，此胜肽所產生之免疫發炎反應低至少約3倍。
本揭露提供了混雜的人工T輔助細胞(Th)抗原決定位，其可用於製造胜肽免疫原，此胜肽免疫原可刺激針對功能性位點的抗體反應以提供療效。本揭露人工Th抗原決定位可以透過任選的間隔子與合成的胜肽B細胞抗原決定位(“目標抗原位點”)連接，以產生免疫原性胜肽。
人工Th抗原決定位賦予胜肽免疫原誘發強T輔助細胞介導的免疫反應的能力，產生針對“目標抗原位點”的高水平抗體。利用專門設計用於改善胜肽免疫原之免疫原性的人工Th抗原決定位，本發明進一步提供在建立的胜肽免疫原中對載體蛋白和病原體衍生的T輔助細胞位點的有利替代。含有本發明人工Th抗原決定位的短胜肽免疫原可引發針對特定目標抗原位點B細胞抗原決定位的高水平抗體，而不引起顯著發炎反應。
本揭露胜肽免疫原可於接受免疫的宿主中引起針對欲求目標抗原位點的抗體反應。在一些實施例中，抗原位點取自病原菌(如FMDV VP1、PRRSV GP5等)。在一些實施例中，抗原位點取自通常免疫沉默的自身抗原或腫瘤相關標靶(如Aβ、Tau、Alpha突觸核蛋白、IgE EMPD、IL-31等)。
本揭露所描述之人工Th抗原決定位可用於提供誘導靶向特定蛋白質之抗體的胜肽免疫原。目標抗原位點可包括來自任何目標胜肽或蛋白質的任何胺基酸序列。在一些實施例中，本揭露所描述的人工Th抗原決定位可用於提供胜肽免疫原，此胜肽免疫原可誘發抗體，抗體靶向β澱粉樣蛋白(Aβ)、口蹄疫(FMD)衣殼蛋白、豬生殖和呼吸道綜合症病毒(PRRSV)的醣蛋白、促黃體激素釋放激素(LHRH)，以及任何其他胜肽或蛋白質序列。
本發明胜肽可用於醫學及獸醫學應用。在一些實施例中，本發明胜肽可作為疫苗以提供對傳染病或神經退化性疾病的保護性免疫、治療因正常生理過程失常引起的疾病、作為治療癌症的免疫療法，以及作為干預正常生理過程的藥劑。
胜 肽免疫原
本文使用術語“胜肽免疫原”是指包含透過常規胜肽鍵或透過他種共價鍵型式(例如硫酯)共價連接至目標抗原位點之Th抗原決定位的分子，藉此形成單一較大的胜肽。
本揭露提供胜肽免疫原及含胜肽免疫原的組合物。在一些實施例中，免疫原性胜肽包括人工異源性Th抗原決定位、含B細胞抗原決定位的目標抗原位點、以及任選的異源性間隔子。
在胜肽免疫原中存在人工Th抗原決定位可引發強Th細胞介導的免疫反應。在一些實施例中，在免疫原性胜肽中存在人工異源性Th抗原決定位可產生針對目標抗原位點的高水平抗體。在一些實施例中，本揭露描述利用設計用於改善免疫原性的人工異源性Th細胞抗原決定位在建立的胜肽免疫原中對載體蛋白和病原體衍生的Th細胞位點的有利替代。在一些實施例中，含有人工Th抗原決定位的胜肽免疫原可引發靶向B細胞抗原決定位(如，Aβ、Tau、Alpha突觸核蛋白、IgE EMPD、IL-31等)的高水平抗體產生。
在一些實施例中，本揭露免疫原性胜肽可以下式表示：
(A)n -(目標抗原位點)-(B)o -(Th)m -X
或
(A)n -(B)o -(Th)m -(B)o -(目標抗原位點)-X
或
(A)n -(Th)m -(B)o -(目標抗原位點)-X
或
(目標抗原位點)-(B)o -(Th)m -(A)n -X
或
(Th)m -(B)o -(目標抗原位點)-(A)n -X
其中：
每個A獨立地為胺基酸；
每個B獨立地為胺基酸、-NHCH(X)CH2 SCH2 CO-、 -NHCH(X)CH2 SCH2 CO(εN)Lys-、-NHCH(X)CH2 S-琥珀醯亞胺基(εN)Lys-或 -NHCH(X)CH2 S-(琥珀醯亞胺基)-；
每個Th獨立地為人工Th細胞抗原決定位、其類似物或其片段；
目標抗原位點為B細胞抗原決定位、胜肽半抗原、或其免疫反應性類似物；
X為胺基酸的α-COOH或α-CONH2 ；
n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
m為1、2、3或4；以及
o為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
本揭露胜肽免疫原包括約25、約30、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約95、或約100個胺基酸殘基。在一些實施例中，本揭露胜肽免疫原可包括約20、約30、約40、約50、約60、約70、或約80個胺基酸殘基。
A- 胺基酸
本揭露免疫原性胜肽中的每個A獨立地為異源性胺基酸序列。
本文使用術語“異源性”是指非目標抗原位點(B細胞抗原決定位)野生型胺基酸序列的一部分或與其同源的胺基酸序列。因此，A的異源性胺基酸序列含有在目標抗原位點蛋白質或胜肽中非天然存在的胺基酸序列。由於組分A的序列與目標抗原位點具異源性，當組分A與目標抗原位點共價連接時，目標抗原位點的天然胺基酸序列不會向胺基端或羧基端方向延伸。
在一些實施例中，每個A獨立地為非天然或天然的胺基酸。
天然胺基酸包括丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺酸、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。
非天然胺基酸包括，但不限於，ε-N離胺酸、β-丙胺酸、鳥胺酸、正白胺酸、正纈胺酸、羥脯胺酸、甲狀腺素、γ-胺基丁酸、高絲胺酸、瓜胺酸、胺基苯甲酸、6-胺基己酸(Aca; 6-胺基己酸)、巰基丙酸(MPA)、3-硝基-酪胺酸、焦麩胺酸及其類似物。
在一些實施例中，n為大於1，且每個A獨立地為相同的胺基酸。在一些實施例中，n為大於1，且每個A獨立地為不同的胺基酸。
B- 任選的異源性間隔子
本揭露免疫原性胜肽中的每個B為任選的異源性間隔子。
如以上討論，術語“異源性”是指非目標抗原位點(B細胞抗原決定位)野生型胺基酸序列的一部分或與其同源的胺基酸序列。因此，當間隔子為胺基酸時，間隔子包含在目標抗原位點蛋白質或胜肽中非天然存在的胺基酸序列。由於組分B的序列與目標抗原位點具異源性，當組分B與目標抗原位點共價連接時，目標抗原位點的天然胺基酸序列不會向胺基端或羧基端方向延伸。
組分B的任選的異源性間隔子獨立地為胺基酸、‑NHCH(X)CH2 SCH2 CO-、-NHCH(X)CH2 SCH2 CO(εN)Lys-、-NHCH(X)CH2 S-琥珀醯亞胺基(εN)Lys-、-NHCH(X)CH2 S-(琥珀醯亞胺基)-及/或其任意組合。間隔子可含有一或多個天然或非天然的胺基酸殘基，如同上述組分A的內容。
間隔子可以是柔性鉸鏈間隔子，以增強Th抗原決定位和目標抗原位點的分離。在一些實施例中，柔性鉸鏈序列可富含脯胺酸。在某些實施例中，柔性鉸鏈具有序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 55)，其模擬在免疫球蛋白重鏈中存在的柔性鉸鏈區域。其中Xaa可為任何胺基酸。在一些實施例中，Xaa為天門冬胺酸。在一些實施例中，間隔子提供的構象分離可以允許呈現的胜肽免疫原與適當的Th細胞和B細胞之間更有效的交互作用。可增強針對Th抗原決定位的免疫反應以提供更好的免疫反應性。
當o>1時，每個B獨立地為相同或不同。在一些實施例中，B為Gly-Gly、Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro (SEQ ID NO: 55)、εNLys、εNLys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO: 53)、Lys-Lys-Lys、-NHCH(X)CH2 SCH2 CO-、-NHCH(X)CH2 SCH2 CO(εNLys)-、-NHCH(X)CH2 S-琥珀醯亞胺基-εNLys-或-NHCH(X)CH2 S-(琥珀醯亞胺基)-及/或其任意組合。
異源性間隔子的示例如表2所示。
目標抗原位點
本揭露所描述之人工Th抗原決定位可用於提供誘導靶向特定蛋白質之抗體的胜肽免疫原。目標抗原位點可包括來自任何目標胜肽或蛋白質(包括外源或自身胜肽或蛋白質)的任何胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露描述可用以提供胜肽免疫原的人工Th抗原決定位，此胜肽免疫原可引發抗體，抗體靶向促黃體激素釋放激素(LHRH)(如美國專利號 6,025,468、6,228,987、6,559,282及美國專利公開號2017/0216418)；β澱粉樣蛋白(Aβ) (如美國專利號 6,906,169、7,951,909、8,232,373及9,102,752)；口蹄疫衣殼蛋白(如美國專利號6,048,538、6,107,021及美國專利公開號2015/0306203)；用於預防和治療HIV感染的HIV病毒顆粒抗原決定位(如美國專利號5,912,176、5,961,976及6,090,388)；來自豬第二型環狀病毒(PCV2)的衣殼蛋白(如美國專利公開號 2013/0236487)、來自豬生殖和呼吸道綜合症病毒(PRRSV)的醣蛋白(如美國專利公開號2014/0335118)、IgE (如美國專利號7,648,701及6,811,782)、alpha-突觸核蛋白(α-Syn) (美國臨時案申請號 62/521,287)、膜結合IgE的細胞外膜近端結構域(或IgE EMPD) (國際PCT申請案號PCT/US2017/069174)、Tau (美國臨時案申請號62/578,124)及介白素-31 (IL-31) (美國臨時案申請號62/597,130)、用於預防瘧疾的瘧原蟲CS抗原；用於預防及治療動脈硬化的CETP，及任何其他胜肽或蛋白序列。所有專利和專利公開案均透過引用整體併入本文。
目標抗原位點的示例如表3所示。
Th–T 輔助細胞抗原決定位
於胜肽免疫原結構中的Th抗原決定位可增強目標抗原位點的免疫原性，有利於透過合理設計產生針對優化的目標B細胞抗原決定位的特異性高力價抗體。
在一些實施例中，Th抗原決定位為異源性序列。如上所述，術語“異源性”是指胺基酸序列，其衍生自非目標抗原位點野生型序列的一部分或與其同源的胺基酸序列。因此，異源性Th抗原決定位是衍生自在目標抗原位點中非天然存在之胺基酸序列的Th抗原決定位。由於Th抗原決定位與目標抗原位點具異源性，當異源性Th抗原決定位與目標抗原位點共價連接時，目標抗原位點的天然胺基酸序列不會向胺基端或羧基端方向延伸。
Th抗原決定位可具有衍生自任何物種(例如人、豬、牛、狗、大鼠、小鼠、天竺鼠等)的胺基酸序列。Th抗原決定位還可具有針對多種物種第2類MHC分子的混雜結合基序。在某些實施例中，Th抗原決定位包含多個混雜的第2類MHC結合基序，以最大限度活化T輔助細胞，從而導致啟動及調控免疫反應。優選的Th抗原決定位本身為免疫沉默的，即利用胜肽免疫原結構產生的抗體很少(如果有的話)會針對Th抗原決定位，因此可產生針對目標抗原位點之非常集中的免疫反應。
Th抗原決定位的大小為約15至約50個胺基酸殘基。在一些實施例中，Th抗原決定位可具有約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45或約50個胺基酸殘基。Th抗原決定位可共享共同的結構特徵及特定特徵序列。在一些實施例中，Th抗原決定位具有兩性螺旋結構，即alpha-螺旋結構，其具有疏水性胺基酸殘基佔據螺旋的一面，而帶電和極性殘基佔據周圍各面。
WO 1999/066957的Th抗原決定位和公開內容以及相對應的美國專利號6,713,301透過引用整體併入本文。
混雜的Th決定簇(Th determinant)可有效地增強低免疫原性的胜肽。精心設計的混雜Th/B細胞抗原決定位嵌合胜肽可在遺傳多樣性群體的大多數成員中誘發Th反應和針對B細胞位點的抗體反應。在一些實施例中，可透過將胜肽-載體共價連接至充分表徵的混雜Th抗原決定位來將Th細胞提供給目標抗原胜肽。
混雜的Th抗原決定位可含有額外的一級胺基酸模式。在一些實施例中，混雜的Th抗原決定位可含有Rothbard序列，其中混雜的Th抗原決定位含有一個帶電殘基(例如-Gly-)，接著是2至3個疏水性殘基，接著是一個帶電或極性殘基(Rothbard和Taylor，EMBO J，1988 ; 7：93-101)。混雜的Th抗原決定位遵守1、4、5、8規則，其中帶正電的殘基在第四、第五和第八位置跟著疏水性殘基，此與兩性螺旋1、4、5和8位置位於同一面的情形一致。在一些實施例中，疏水性、帶電及極性胺基酸的1、4、5、8模式可在單一Th抗原決定位內重複。在一些實施例中，混雜的T細胞抗原決定位包含Rothbard序列或遵守1、4、5、8規則的抗原決定位中的至少一種。在其它實施例中，Th抗原決定位含有一個以上的Rothbard序列。
衍生自病原體的混雜Th抗原決定位包括，但不限於：B型肝炎表面抗原Th細胞抗原決定位(HBsAg Th)、B型肝炎核心抗原Th細胞抗原決定位(HBc Th)、百日咳毒素Th細胞抗原決定位(PT Th)、破傷風毒素Th細胞抗原決定位(TT Th)、麻疹病毒F蛋白Th細胞抗原決定位(MVF Th)、砂眼衣原體主要外膜蛋白Th細胞抗原決定位(CT Th)、白喉毒素Th細胞抗原決定位(DT Th)、惡性瘧原蟲環子孢子蛋白Th細胞抗原決定位(PF Th)、曼氏血吸蟲磷酸丙糖異構酶Th細胞抗原決定位(SM Th)和大腸桿菌TraT Th細胞抗原決定位(TraT Th)、破傷風梭菌、百日咳桿菌、霍亂毒素、流行性感冒病毒MP1、流行性感冒病毒NSP1、Epstein-Barr病毒(EBV)、人類巨細胞病毒(HCMV)。本揭露所使用的Th抗原決定位例子如表1所示。
在一些實施例中，本揭露的Th抗原決定位可以是包含含有類似胺基酸序列之胜肽混合物的組合Th抗原決定位。結構合成抗原庫(SSALs)，又稱為組合人工Th抗原決定位，包含多個Th抗原決定位，以其胺基酸序列圍繞著一在特定位置具取代物之不變殘基的結構性架構而組成。透過保留相對不變的殘基和改變其他殘基來確定SSAL抗原決定位的序列，以提供對多種MHC限制性元素的辨識。SSAL抗原決定位的序列可以透過比對混雜Th的一級胺基酸序列、選擇和保留負責Th胜肽的獨特結構的殘基作為骨架，並根據已知的MHC限制性元素改變剩餘殘基來確定。具有MHC限制性元素之優選胺基酸的不變和可變位置可用於獲得MHC結合基序，其可用於設計Th抗原決定位的SSAL。
作為組合序列呈現的異源性Th抗原決定位胜肽包含基於此特定胜肽之同源物的可變殘基在胜肽框架內的特定位置處表示的胺基酸殘基的混合物。在一些實施例中，Th抗原決定位文庫序列被設計為維持混雜Th抗原決定位的結構基序並適應對更廣範圍單倍型的反應性。在一些實施例中，SSAL的成員可以是退化的Th抗原決定位SSAL1 Th1，其是以取自麻疹病毒F蛋白的混雜抗原決定位為模型(例如SEQ ID NOs: 1-5)。在其他實施例中，SSAL的成員可以是退化的Th抗原決定位SSAL2 Th2，其是以取自HBsAg1的混雜抗原決定位為模型(例如SEQ ID NOs: 19-24)。
合成後存在於組合人工Th抗原決定位(或SSAL)混合物中的胜肽總數可以透過將在每個可變位置之可用的選項數量相乘來計算。例如，SEQ ID NO：16代表32種不同胜肽的組合，因為它包含5個可變位置，其中每個可變位置具有2個不同殘基的選項(即，2x2x2x2x2 = 25 =32)。類似地，SEQ ID NO：5代表524,288種不同胜肽的組合(即，2x4x2x4x2x4x4x4x2x4x2x4 = 25 x47 = 524,288)。組合人工Th抗原決定位序列包括(a)可變序列涵蓋的所有胜肽混合物及(b)含有組合內單個序列的各個胜肽。
在一些實施例中，可在位置1加入帶電殘基Glu或Asp，以增加Th疏水面周圍的電荷。在一些實施例中，可以藉由在第2、5、8、9、10、13和16位置的疏水殘基保持兩性螺旋的疏水面。在一些實施例中，可以藉由改變第2、5、8、9、10及13位置的胺基酸殘基以提供具有可結合到各種MHC限制元素能力的表面。在一些實施例中，胺基酸殘基的變異可以擴大人工Th抗原決定位的免疫反應範圍。
人工Th抗原決定位可包含已知混雜Th抗原決定位的所有特性和特徵。在一些實施例中，人工Th抗原決定位是SSAL的一員。在一些實施例中，人工Th位點可與取自自身抗原和外源抗原的胜肽序列組合，以提供針對位點特異性目標的增強的抗體反應。在一些實施例中，人工Th抗原決定位免疫原可提供有效且安全的抗體反應，展現出高免疫效力，並表現出廣泛的反應性。
已提供了理想化的人工Th抗原決定位。這些理想化的人工Th抗原決定位是以WO 95/11998揭露的2種已知的天然Th抗原決定位和SSAL胜肽原型為模型。SSALs包含組合MHC分子結合基序(Meister等，1995)，旨在引起遺傳多樣性群體成員之間的廣泛免疫反應。SSAL胜肽原型是基於麻疹病毒和B型肝炎病毒抗原的Th抗原決定位設計，透過引入多個MHC結合基序進行修飾。其他Th抗原決定位的設計是以其他已知Th抗原決定位為模型，透過簡化、添加及/或修飾多個MHC結合基序以產生一系列新的人工Th抗原決定位。將混雜人工Th位點合併進入具有多種目標抗原位點的合成胜肽免疫原中。得到的嵌合胜肽能夠刺激針對目標抗原位點的有效抗體反應。
表1所示原型人工輔助T細胞(Th)抗原決定位“SSAL1 Th1”，為4種胜肽(SEQ ID NOs:1-4)的混合物，是以麻疹病毒F蛋白的混雜Th抗原決定位為模型的理想化Th抗原決定位(Partidos等，1991)。模型Th抗原決定位，如表1顯示之“MVF Th(UBITh®5)”(SEQ ID NO:6)對應麻疹病毒F蛋白第288-302位置的殘基。根據“Rothbard規則”，透過在位置1處添加帶電殘基Glu/Asp以增加抗原決定位之疏水面周圍的電荷；添加或保留位置4、6、12和14處的帶電殘基或Gly；以及在位置7和11處添加或保留帶電殘基或Gly，以將MVF Th (SEQ ID NO:6)修飾為SSAL1 Th1原型(SEQ ID NOs:1-4)。Th抗原決定位的疏水面包含位於第2、5、8、9、10、13和16位置的殘基。位於這些位置與混雜抗原決定位相關的疏水性殘基通常會被取代，以提供組合Th SSAL抗原決定位，SSAL1 Th1(SEQ ID NOs:1-4)。原型SSAL1 Th1(SEQ ID NOs:1-4)的另一個重要特徵是第1和4位置在第9位置另一側以迴文方式不完全地重複，以模擬MHC結合基序。在SEQ ID NO:2(表1)中進一步修飾SSAL1 Th1的這種“1、4、9”迴文模式，以更接近地反映原始MvF模型Th的序列(SEQ ID NO:6)。
組合人工Th抗原決定位可被簡化以提供一系列單一序列抗原決定位。例如，SEQ ID NO:5的組合序列可被簡化為SEQ ID NOs:1-4所代表的單一序列Th抗原決定位。這些單一序列Th抗原決定位可與目標抗原位點耦合，以提供增強的免疫原性。
在一些實施例中，以非極性和極性不帶電的胺基酸(例如Ile和Ser)延伸胺基端，並以帶電和疏水性的胺基酸(例如Lys和Phe)延伸羧基端，以改善Th抗原決定位的免疫原性。另外，向Th抗原決定位添加一個離胺酸殘基或多個離胺酸殘基(例如，KKK)可改善胜肽在水中的溶解度。進一步的修飾包括以共同的MHC結合基序AxTxIL進行羧基端取代(Meister等，1995)。
人工Th抗原決定位可以是已知的天然Th抗原決定位或SSAL胜肽原型。在一些實施例中，來自SSAL的Th抗原決定位可摻入組合MHC分子結合基序，以誘發遺傳多樣性群體成員間廣泛的免疫反應。在一些實施例中，可基於麻疹病毒和B型肝炎病毒抗原的Th抗原決定位設計SSAL胜肽原型，藉由引入多個MHC結合基序進行修飾。在一些實施例中，人工Th抗原決定位可以簡化、添加及/或修飾多個MHC結合基序以產生一系列新的人工Th抗原決定位。在一些實施例中，可將新改造的混雜人工Th位點合併進入帶有多種目標抗原位點的合成胜肽免疫原中。在一些實施例中，所獲得之嵌合胜肽可刺激針對目標抗原位點的有效抗體反應。
本揭露人工Th抗原決定位可以是包含第2類MHC分子結合位點之天然或非天然胺基酸的連續序列。在一些實施例中，人工Th抗原決定位可以增強或刺激針對目標抗原位點的抗體反應。在一些實施例中，Th抗原決定位可由連續或不連續的胺基酸片段組成。在一些實施例中，並非Th抗原決定位的每個胺基酸都與MHC的辨識有關。在一些實施例中，本發明Th抗原決定位可包含免疫功能同源物，例如免疫增強同源物、交叉反應同源物及其片段。在一些實施例中，功能性Th同源物可進一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸殘基的保守性取代、添加、缺失和插入，並提供Th抗原決定位的Th-刺激功能。
Th抗原決定位可直接連接到目標位點。在一些實施例中，Th抗原決定位可透過任選的異源性間隔子(例如胜肽間隔子(如Gly-Gly或(ε-N)Lys)連接至目標位點。間隔子物理性地將Th抗原決定位與B細胞抗原決定位分開，並可破壞由於Th抗原決定位或功能同源物與目標抗原位點連接所產生任何人工二級結構的形成，以消除對Th及/或B細胞反應的任何干擾。
Th抗原決定位包括理想化的人工Th抗原決定位與組合的理想化人工Th抗原決定位，如表1所示。在一些實施例中，Th抗原決定位是SEQ ID NOs:1-52的混雜Th細胞抗原決定位，其任何同源物，及/或其任何免疫類似物。Th抗原決定位還包括Th抗原決定位的免疫類似物。免疫Th類似物包括免疫增強類似物、交叉反應類似物及任何這些Th抗原決定位的片段，其足以增強或刺激針對目標抗原位點的免疫反應。
Th抗原決定位胜肽的功能性免疫類似物也是有效的且包含在本發明的一部分中。功能性免疫Th類似物包括Th抗原決定位中1至約5個胺基酸殘基的保守性取代、添加、缺失及插入，其基本上不改變Th抗原決定位的Th刺激功能。可以利用天然或非天然胺基酸完成保守性取代、添加和插入，如上文針對目標抗原位點所述。表1辨識了Th抗原決定位胜肽功能類似物的其他種變異體。特別是，MvF1和MvF2 Th的SEQ ID NOs:6和7是MvF4和MvF5 Th的SEQ ID NOs:16和17的功能類似物，其差異在於胺基酸框架中分別在胺基端和羧基端缺失(SEQ ID NOs:6和7)或添加(SEQ ID NOs:16和17)兩個胺基酸。在類似序列的這兩個系列之間的差異並不會影響包含於此些序列中之Th抗原決定位的功能。因此，功能性免疫Th類似物包括源自麻疹病毒融合蛋白MvF1-4 Ths(SEQ ID NOs:6-18)與源自肝炎表面蛋白HBsAg 1-3 Ths(SEQ ID NOs:19-31)之Th抗原決定位的各種形式。
胜肽免疫原結構中的Th抗原決定位可在目標抗原位點的胺基端或羧基端共價連接，以產生嵌合的Th/B細胞位點胜肽免疫原。在一些實施例中，Th抗原決定位可以透過化學耦合或直接合成的方式共價連接至目標抗原位點。在一些實施例中，Th抗原決定位與目標抗原位點的胺基端共價連接。在其他實施例中，Th抗原決定位與目標抗原位點的羧基端共價連接。在某些實施例中，一個以上的Th抗原決定位與目標抗原位點共價連接。當一個以上的Th抗原決定位與目標抗原位點連接時，每個Th抗原決定位可具有相同胺基酸序列或不同胺基酸序列。此外，當一個以上的Th抗原決定位與目標抗原位點連接時，Th抗原決定位可以任何順序排列。例如，Th抗原決定位可連續地連接到目標抗原位點的胺基端，或連續地連接到目標抗原位點的羧基端，或一Th抗原決定位可與目標抗原位點的胺基端共價連接，而另一Th抗原決定位與目標抗原位點的羧基端共價連接。Th抗原決定位相對於目標抗原位點的排列並無限制。
在一些實施例中，Th抗原決定位直接與目標抗原位點共價連接。在其他實施例中，Th抗原決定位透過下文進一步詳細描述的異源性間隔子與目標抗原位點共價連接。
合成方法
可使用化學方法合成本揭露胜肽免疫原。在一些實施例中，可使用固相胜肽合成法合成本揭露的胜肽免疫原。在一些實施例中，利用t-Boc或Fmoc以保護α-NH2 或側鏈胺基酸使用自動化美利弗德(Merrifield)固相胜肽合成法來合成本發明的胜肽。
作為組合序列呈現的異源性Th抗原決定位胜肽包含基於此特定胜肽之同源物的可變殘基在胜肽框架內的特定位置處表示的胺基酸殘基的混合物。藉由於合成過程中在指定位置添加指定受保護的胺基酸混合物，而非一種特定胺基酸，可在一個程序中合成組合胜肽的組裝。此種組合異源性Th抗原決定位胜肽組裝可允許對具有不同遺傳背景之動物的廣泛Th抗原決定位覆蓋。異源性Th抗原決定位胜肽的代表性組合序列包括SEQ ID NOs:5、10、13、16、24和27，如表1所示。本發明Th抗原決定位胜肽對來自遺傳多樣性群體之動物和病人提供廣泛的反應性和免疫原性。
有趣的是，在Th抗原決定位、B細胞抗原決定位及/或含有Th抗原決定位和B細胞抗原決定位的胜肽免疫原結構合成過程中可能引入的不一致性及/或錯誤於接受治療的動物中通常不會防礙或阻止欲求的免疫反應。事實上，在胜肽合成期間可能引入的不一致性/錯誤會伴隨目標胜肽合成產生多種胜肽類似物。這些類似物可包括胺基酸插入、缺失、取代和提前終止。如上所述，在用於免疫學應用時，這些胜肽類似物適合作為胜肽製劑中抗原性和免疫原性的提供者，或作為用於免疫診斷目的的固相抗原或作為用於疫苗接種目的的免疫原。
包含Th抗原決定位的胜肽免疫原結構在與目標抗原位點串聯的單一固相胜肽合成中同時產生。Th抗原決定位還包括Th抗原決定位的免疫類似物。免疫性Th類似物包括免疫增強類似物、交叉反應性類似物和任何這些Th抗原決定位的片段，其足以增強或刺激針對目標抗原位點的免疫反應。
在完成欲求胜肽免疫原的組裝後，可處理固相樹脂，以將胜肽從樹脂上切割下來，並除去胺基酸側鏈上的官能基。透過HPLC純化游離胜肽並分析生化特徵。在一些實施例中，以胺基酸分析來描繪游離胜肽的生化特徵。在一些實施例中，以胜肽序列來描繪游離胜肽的特徵。在一些實施例中，以質譜儀分析描繪游離胜肽的特徵。
本發明胜肽免疫原可以透過硫醚鍵的形成，使用鹵代乙醯化(haloacetylated)和半胱胺酸化(cysteinylated)胜肽進行合成。在一些實施例中，可將半胱胺酸加至含Th胜肽的羧基端，且半胱胺酸殘基的硫醇基可用於與親電子基團(例如Nα 氯乙醯-修飾基團或馬來醯亞胺(maleimide)衍生的離胺酸殘基的α-或ε-NH2 基團)形成共價鍵。所獲得的合成中間體可以連接到目標抗原位點胜肽的胺基端，
可使用核酸選殖技術合成更長的合成胜肽共軛物。在一些實施例中，本發明的Th抗原決定位可透過表現重組DNA和RNA來合成。為了構築表現本發明Th/目標抗原位點胜肽的基因，可將胺基酸序列反轉譯成核酸序列。在一些實施例中，使用對於其中具有待表現基因的生物體來說優化的密碼子將胺基酸序列反轉譯成核酸序列。可製備編碼胜肽的基因。在一些實施例中，編碼胜肽的基因可以透過合成編碼胜肽及必要調節因子的重疊寡核苷酸來製備。將合成的基因進行組裝並插入欲求的表現載體中。
本揭露的合成核酸序列包括多個核酸序列，其編碼本發明Th抗原決定位、包含Th抗原決定位的胜肽、其免疫學功能同源物、以及以於非編碼序列的變化為特徵的核酸結構(其未改變胜肽或編碼的Th抗原決定位的免疫學特性)。將合成的基因插入適合的選殖載體中，以獲得並分析重組體。然後在適合於所選表現系統及宿主的條件下表現Th抗原決定位及包含Th抗原決定位的胜肽。純化及表徵Th抗原決定位或胜肽。
醫藥組合物
本揭露更描述了包含本揭露胜肽免疫原的醫藥組合物。在一些實施例中，本揭露醫藥組合物可作為藥學上可接受的傳送系統，用於投予胜肽免疫原。在一些實施例中，本揭露醫藥組合物可包含一或多種胜肽免疫原的免疫有效劑量。
本發明的胜肽免疫原可配製成免疫原性組合物。在一些實施例中，免疫原性組合物可包含佐劑、乳化劑、藥學上可接受之載體或疫苗組合物中常規提供的其他成分。可用於本發明的佐劑或乳化劑包括明礬、不完全弗氏佐劑(IFA)、liposyn、皂苷、角鯊烯、L121、emulsigen、單磷酸脂質A(MPL)、二甲基雙十八烷基溴化銨(DDA)、QS21和ISA 720、ISA 51、ISA 35、ISA 206和其他有效的佐劑和乳化劑。在一些實施例中，本發明的組合物可以配製成立即釋放。在一些實施例中，本發明的組合物可以配製成持續釋放。
藥物組合物中使用的佐劑可包括油類、鋁鹽、仿病毒顆粒(virosomes)、磷酸鋁(例如ADJU-PHOS®)、氫氧化鋁(例如ALHYDROGEL®)、liposyn、皂苷、角鯊烯、L121、Emulsigen®，單磷酸脂質A(MPL)、QS21、ISA 35、ISA 206、ISA50V、ISA51、ISA 720及其他佐劑和乳化劑。
在一些實施例中，藥物組合物含有Montanide™ ISA 51(由植物油和二縮甘露醇油酸酯組成的油質佐劑組合物，用於生產油包水乳液)、TWEEN® 80(也稱為聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯)、CpG寡核苷酸及/或其任意組合。在其他實施例中，醫藥組合物是含有作為佐劑之EMULSIGEN或EMULSIGEN D的水包油包水(即w/o/w)乳液。
在一些實施例中，可配製組合物作為疫苗。疫苗組合物可以透過任何方便的途徑給藥，包括皮下、口服、肌肉內、腹膜內、腸胃外或腸內給藥。在一些實施例中，免疫原以單劑量給予。在一些實施例中，免疫原以多劑量給予。
藥物組合物可配製成注射劑型，為液體溶液或懸浮液。含有胜肽免疫原結構的液體載體也可在注射前製備。醫藥組合物可透過任何適合的用法給予，例如，i.d.、i.v.、i.p.、i.m.、鼻內、口服、皮下等，且可置於任何適合的傳送裝置中施用。在某些實施例中，配製的醫藥組合物可以靜脈、皮下、皮內或肌肉內給予。也可製備成適合其他給藥方式的醫藥組合物，包括口服和鼻內給予。
本發明組合物可含有一或多種胜肽免疫原的有效劑量和藥學上可接受的載體。在一些實施例中，合適劑量單位形式的組合物可含有每kg受試者體重約0.5μg至約1mg的胜肽免疫原。在一些實施例中，合適劑量單位形式的組合物可為每kg受試者體重含有約10μg、約20μg、約30μg、約40μg、約50μg、約60μg、約70μg、約80μg、約90μg、約100μg、約200μg、約300μg、約400μg、約500μg、約600μg、約700μg、約800μg、約900μg或約1000μg的胜肽免疫原。在一些實施例中，合適劑量單位形式的組合物可含有每kg受試者體重約100μg、約150μg、約200μg、約250μg、約300μg、約350μg、約400μg、約450μg或約500μg的胜肽免疫原。在一些實施例中，合適劑量單位形式的組合物可含有每kg受試者體重約0.5μg至約1mg的胜肽免疫原。在一些實施例中，合適劑量單位形式的組合物可含有約10μg、約20μg、約30μg、約40μg、約50μg、約60μg、約70μg、約80μg、約90μg、約100μg、約200μg、約300μg、約400μg、約500μg、約600μg、約700μg、約800μg、約900μg或約1000μg的胜肽免疫原。在一些實施例中，合適劑量單位形式的組合物可含有約100μg、約150μg、約200μg、約250μg、約300μg、約350μg、約400μg、約450μg或約500μg的胜肽免疫原。
當以多劑量傳送時，組合物可以依劑量分成適當的量。在一些實施例中，劑量為約0.2mg至約2.5mg。在一些實施例中，劑量為約1mg。在一些實施例中，劑量為約1mg並以注射給予。在一些實施例中，劑量為約1mg並經肌肉內給予。在一些實施例中，一劑之後可以是重複(加強)劑量。可根據受試者的年齡、體重和一般健康狀況優化劑量。
包含胜肽免疫原混合物的疫苗可在更廣泛的群體中提供增強的免疫效果。在一些實施例中，胜肽免疫原的混合物包含衍生自MVF Th和HBsAg Th的Th位點。在一些實施例中，包含胜肽免疫原混合物的疫苗可以提供針對目標抗原位點的改善的免疫反應。
針對Th/目標抗原位點結合物的免疫反應可以藉由透過包埋於生物降解微粒中或於其上進行遞送而加以改善。在一些實施例中，胜肽免疫原可以在有或無佐劑的狀況下進行包封，且這種微粒可以攜帶免疫刺激佐劑。在一些實施例中，可共同給予微粒與胜肽免疫原以增強免疫反應。
免疫刺激複合物
本揭露也關於含有與CpG寡核苷酸形成免疫刺激複合物的胜肽免疫原結構的醫藥組合物。CpG寡核苷酸的示例如表5所示。此種免疫刺激複合物特別適合作為佐劑及胜肽免疫原穩定劑。免疫刺激複合物呈顆粒形式，可有效地將胜肽免疫原呈現給免疫系統的細胞，產生免疫反應。免疫刺激複合物可配製成腸胃外給予的懸浮液。免疫刺激複合物也可以以w/o乳液的形式配製，作為與礦物鹽或原位凝膠聚合物結合的懸浮液，以在腸胃外給藥後，可將胜肽免疫原有效傳送至宿主免疫系統的細胞。
穩定化的免疫刺激複合物可藉由透過靜電結合將胜肽免疫原結構與陰離子型分子、寡核苷酸、多核苷酸或其組合複合而形成。穩定化的免疫刺激複合物可併入醫藥組合物中，作為免疫原傳送系統。
在某些實施例中，將胜肽免疫原結構設計為含有陽離子部分，其在pH5.0至8.0的範圍內帶正電荷。胜肽免疫原結構或結構混合物的陽離子部分的淨電荷計算是依據，序列中每個離胺酸(K)、精胺酸(R)或組胺酸(H)帶有+1電荷，每個天門冬胺酸(D)或麩胺酸(E)帶有-1電荷，以及其它胺基酸所帶的電荷為0。將在胜肽免疫原結構的陽離子部分內的電荷相加並表示為淨平均電荷。適合的胜肽免疫原具有具有淨平均正電荷為+1的陽離子部份。優選地，胜肽免疫原具有範圍大於+2的淨正電荷。在一些實施例中，胜肽免疫原結構的陽離子部分是異源性間隔子。在某些實施例中，當間隔子序列是(α, ε-N)Lys或ε-N-Lys-Lys-Lys-Lys(SEQ ID NO:53)時，胜肽免疫原結構的陽離子部分具有+4電荷。
如本文所述的“陰離子型分子”是指pH5.0-8.0範圍內帶負電荷的任何分子。在某些實施例中，陰離子型分子是寡聚合物或聚合物。寡聚合物或聚合物上的淨負電荷計算是依據，在寡聚合物中每個磷酸二酯或硫代磷酸酯基團帶有-1電荷。適合的陰離子型寡核苷酸是具有8至64個核苷酸鹼基的單股DNA分子，其CpG基序的重複數在1至10的範圍內。優選地，CpG免疫刺激性單股DNA分子含有18至48個核苷酸鹼基，其CpG基序的重複數在3至8的範圍內。
更優選地，陰離子型寡核苷酸可以分子式5'X1 CGX2 3'表示，其中C和G是未甲基化的；X1 選自由A(腺嘌呤)、G(鳥嘌呤)和T(胸腺嘧啶)組成的群組；且X2 為C(胞嘧啶)或T(胸腺嘧啶)。或者，陰離子型寡核苷酸可以分子式5'(X3 )2 CG(X4 )2 3'表示，其中C和G為未甲基化的；且X3 選自由A、T或G組成的群組；且X4 為C或T。
所獲得的免疫刺激複合物呈顆粒形式，其大小通常為1-50微米，且是許多因子(包括交互作用成份的相對電荷化學計量和分子量)的函數。顆粒狀免疫刺激複合物可提供佐劑化和在體內向上調節特異性免疫反應的優點。此外，穩定化的免疫刺激複合物適合透過各種方法(包括油包水乳液、礦物鹽懸浮液和聚合凝膠)製備醫藥組合物。
應用
本發明的胜肽可應用於醫學和獸醫學。在一些實施例中，本發明的胜肽可作為疫苗以提供對傳染病的保護性免疫、作為治療因正常生理過程失常所致疾病的免疫療法、作為治療癌症的免疫療法，以及作為干預或改變正常生理過程的藥劑。
當與各種微生物、蛋白質或胜肽的目標B細胞抗原決定位組合時，本揭露的人工Th抗原決定位可引發免疫反應。在一些實施例中，本揭露的人工Th抗原決定位可與一個目標抗原位點連接。在一些實施例中，本揭露的人工Th抗原決定位可與兩個目標抗原位點連接。
本揭露人工Th抗原決定位可與目標抗原位點連接以預防及/或治療各種疾病和病症。在一些實施例中，本發明組合物可用於預防及/或治療神經退化性疾病、傳染病、動脈硬化、前列腺癌、預防公豬臭、用於動物的免疫去勢、治療子宮內膜異位症、乳癌和受性腺類固醇激素影響的其他婦癌、以及作為男性和女性的避孕藥。例如，人工Th抗原決定位可連接下列蛋白質的抗原位點：
a. 體抑素以促進經濟動物的生長
b. IgE以治療過敏性疾病
c. Th細胞的CD4受體以治療及/或預防人類免疫缺陷病毒(HIV)感染和免疫失調
d. 口蹄疫(FMD)病毒衣殼蛋白以預防口蹄疫
e. HIV病毒顆粒抗原決定位以預防及治療HIV感染
f. 惡性瘧原蟲的環子孢子蛋白抗原以預防及治療瘧疾
g. CETP以預防及治療動脈硬化
h. Aβ以針對阿茲海默症進行治療或疫苗接種
i. α-突觸核蛋白以針對帕金森氏症進行治療或疫苗接種
j. Tau以針對包括阿茲海默症的tau蛋白病進行治療及疫苗接種
k. IL-31以治療異位性皮膚炎
已發現使用異源性人工Th抗原決定位對於靶向涉及神經退化性疾病的蛋白質(例如，Aβ、α-突觸核蛋白、Tau)特別重要。具體來說，含有靶向神經退化性蛋白質之內源性Th抗原決定位的胜肽免疫原在給予受試者時會引起腦炎。相反地，含有連接至神經退化性蛋白質之抗原位點的異源性人工Th抗原決定位的胜肽免疫原結構不會引起腦炎。
β 澱粉樣蛋白
Aβ胜肽被認為是阿茲海默症發生和發展的關鍵。Aβ寡聚體和Aβ纖維的毒性形式被認為是導致阿茲海默症和癡呆病理之突觸和神經元死亡的原因。針對阿茲海默症之成功改善病程進展的治療可包括影響腦中Aβ動向的產品。
本揭露的胜肽免疫原包含Th細胞抗原決定位和Aβ靶向胜肽。在一些實施例中，Th細胞抗原決定位為Th1或Th2。在一些實施例中，胜肽免疫原可包含Th1和Th2。Aβ靶向胜肽或B細胞抗原決定位可為Aβ1-14 、Aβ1-16 、Aβ1-28 、Aβ17-42 或Aβ1-42 。在一些實施例中，Aβ靶向胜肽是Aβ1-14 。如本文所用，術語“Aβx-y ”表示全長野生型Aβ蛋白的從胺基酸x至胺基酸y的Aβ序列。
本揭露胜肽免疫原可包含一種以上的Aβ靶向胜肽。在一些實施例中，胜肽免疫原可包含2種Aβ靶向胜肽。在一些實施例中，胜肽免疫原可包含一種Aβ1-14 和一種Aβ1-42 胜肽。在一些實施例中，胜肽免疫原可包含2種Aβ1-14 靶向胜肽。在一些實施例中，胜肽免疫原可包含2種Aβ1-14 靶向胜肽，每種胜肽可與不同的Th細胞抗原決定位連接作為嵌合胜肽。
本揭露還提供包含2種Aβ1-14 靶向胜肽的Aβ1-14 胜肽疫苗，每種Aβ1-14 靶向胜肽與不同的Th細胞抗原決定位連接作為嵌合胜肽。在一些實施例中，嵌合Aβ1-14 胜肽可配製於Th1偏向遞送系統中以使T細胞發炎反應最小化。在一些實施例中，嵌合Aβ1-14 胜肽可配製於Th2偏向傳遞系統中以使T細胞發炎反應最小化。
通則
本文使用的章節標題僅用於組織目的，不應被理解為限制所描述的主題。本申請中引用的所有參考文獻或其部分出於任何目的透過引用明確地將整體併入本文。
除非特別說明，在此使用的所有技術和科學用語與本發明所屬技術領域中具有通常知識者的通常理解具有相同意義。除非上下文清楚地指出，否則單詞“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”包含複數形式。類似地，單詞“或(or)”是意指包括“和(and)”，除非上下文另有明確說明。因此，“包含A或B”是指包括A，或B，或A和B。更應被理解的是，用於給定多胜肽之所有的胺基酸大小和所有分子量或分子質量值是近似的，並且被提供作為描述之用。然而類似或等同於在此描述者的方法和材料可被用於以下所述之揭露的方法、合適的方法和材料的實踐或測試中。在此提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻透過引用整體併入本文。在衝突的情況下，以本說明書(包括術語的解釋)為準。此外，材料、方法和實施例僅是說明性的而非意指加以限制。
實施例
實施例 1. 胜 肽和胜肽免疫原結構的製備
使用自動化固相合成法合成胜肽(包括胜肽免疫原結構)，以預備的HPLC進行純化，並使用基質輔助雷射脫附游離飛行時間(MALDI-TOF)質譜儀、胺基酸分析和反相HPLC描繪特性。
Aβ疫苗(UB-311)包含2種胜肽免疫原，每種都具有胺基端Aβ1-14 胜肽，其透過胺基酸間隔子合成地連接至衍生自2種病原體蛋白質(B型肝炎表面抗原及麻疹病毒融合蛋白)的不同Th細胞抗原決定位胜肽(UBITh®抗原決定位)。具體來說，與麻疹病毒融合蛋白連接的胜肽免疫原是Aβ1-14 -εK-KKK-MvF5 Th(SEQ ID NO:67)，而與B型肝炎表面抗原連接的胜肽免疫原是Aβ1-14 -εK-HBsAg3 Th(SEQ ID NO:68)。
UB-311配製於含有明礬的Th2偏向遞送系統中，並含有等莫耳比值的Aβ1-14 -εK-HBsAg3 Th與Aβ1-14 -εK-KKK-MvF5 Th胜肽。將2種Aβ免疫原與聚陰離子CpG寡去氧核苷酸(ODN)混合以形成微米級顆粒的穩定免疫刺激複合物。將鋁礦物鹽(ADJU-PHOS®)加入到最終劑型中，同時加入氯化鈉調整滲壓性及0.25%的2-苯氧基乙醇作為防腐劑。
幾個例示性的目標抗原位點(B細胞抗原決定位)的序列顯示於表3中。幾種例示性胜肽免疫原結構(含有Aβ1-14 作為目標抗原位點以與Th抗原決定位共價連接)的序列如表4所示。
實施例 2. 胜 肽免疫原結構在天竺鼠中的獨特免疫原性，其靶向 Aβ 胜肽，而非 Th 抗原決定位
利用以等莫耳比值配製在一起的胜肽免疫原結構Aβ1-14 -εK-KKK-MvF5 Th (SEQ ID NO: 67)和Aβ1-14 -εK-HBsAg3 Th (SEQ ID NO: 68)在第0週和第4週免疫接種六隻天竺鼠。在第8週，將動物放血並收集血清樣品，以ELISA分析測定抗Aβ胜肽和抗Th抗原決定位抗體的力價(log10 )。所有6隻天竺鼠的抗體反應特異性地靶向Aβ1-42 胜肽，而非2種人工Th抗原決定位(MvF5 Th和HBsAg3 Th)，如表6所示。
實施例 3. 狒狒和獼猴周邊血液單核細胞 (PBMC) 培養物中的細胞免疫反應
透過Ficoll-hypaque梯度離心分離來自狒狒和食蟹獼猴的周邊血液單核細胞(PBMC)。對於胜肽誘導之增生和細胞因子生成，將細胞(每孔洞2×105 個細胞)單獨培養或與加入的個別胜肽結構域(包括Aβ1-14 、Aβ1-42 、UBITh®和非相關胜肽)一起培養。以有絲分裂原(PHA、PWM、Con A)作為陽性對照組(於培養物中體積百分比為1% (v/v)，濃度為10 µg/ mL)。在第6天，將1μCi的3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)加入三重複培養孔洞中的每一個孔洞內。培養18小時後，收集細胞並分析3H-TdR嵌合。刺激指數(S.I.)表示為抗原存在下的平均每分鐘計數(cpm)除以不存在抗原時的cpm；S.I.> 3.0被認為具有顯著差異。
來自食蟹獼猴PMBC培養物的細胞因子(IL-2、IL-6、IL-10、IL-13、TNFα、IFNγ)分析是在僅有培養基或在胜肽結構域或有絲分裂原存在下之培養基的等分樣本上進行。根據試劑盒說明將猴特異性細胞因子三明治ELISA試劑盒(U-CyTech Biosciences，Utrecht，The Netherlands)用於測定個別細胞因子的濃度。
由在第15、21和25.5週從獼猴收集的全血中分離PMBCs。在各種Aβ胜肽(Aβ1-14 和Aβ1-42 )存在下培養分離的PBMCs。
當加入Aβ1-14 胜肽至培養基時，未觀察到淋巴細胞的增生反應。然而，當將Aβ1-42 胜肽添加至PBMC培養物時，可發現陽性增生反應。
還在Aβ胜肽或PHA有絲分裂原存在下分析在第15、21和25.5週所收集PBMC樣本之細胞因子的分泌。如表7所示，三種細胞因子(IL-2、IL-6、TNFα)顯示出對於全長Aβ1–42 胜肽而非Aβ1–14 胜肽反應之可檢測的分泌；與安慰劑疫苗樣本相比，在UBITh®AD疫苗處理的樣品中未檢測到細胞因子分泌的向上調節。於Aβ胜肽存在下，測試的其它3種細胞因子(IL-10、IL-13、IFNγ)在所有PBMC培養物中低於偵測極限。
使用僅具有具有外源T輔助細胞抗原決定位的胺基端Aβ1-14 胜肽免疫原之UB-311疫苗免疫食蟹獼猴，其沒有Aβ17-42 胜肽結構域，顯示在Aβ1-42 胜肽存在下於PBMC培養物中所注意到的陽性增生結果與UB-311疫苗反應無關，而是對天然Aβ的背景反應。
此結果支持僅具有Aβ1-14 和外源T輔助細胞抗原決定位之UB-311疫苗的安全性，證明其不會對正常食蟹獼猴中Aβ胜肽產生潛在的發炎性抗自身細胞介導的免疫反應。相反地，在AN-1792疫苗的臨床試驗研究中與腦炎相關的不良事件部分可歸因於在疫苗的纖維/聚集Aβ1-42 免疫原中包含T細胞抗原決定位。
實施例 4. 淋巴細胞增生分析及細胞因子分析
透過Ficoll-hypaque梯度離心分離阿茲海默症患者的周邊血液單核細胞(PBMC)。對於胜肽誘導之增生和細胞因子產生，以三重複的方式，將細胞(每孔洞2.5×105 個細胞)單獨培養，或將細胞與加入的個別胜肽結構域(最終濃度為10μg/ mL)一起培養，胜肽結構域包括Aβ1-14 (SEQ ID NO:56)、Aβ1-16 (SEQ ID NO:57)、Aβ1-28 (SEQ ID NO:59)、Aβ17-42 (SEQ ID NO:58)、Aβ1-42 (SEQ ID NO:60)和非相關的38-mer胜肽(p1412)。將培養物在37°C下於5%CO2 環境中培養72小時，然後從每個孔洞中取出100μL上清液並冷凍於-70°C供細胞因子分析使用。於每個孔洞中添加10μL含有0.5μCi的3 H-胸腺嘧啶核苷(3 H-TdR，Amersham，Cat No. TRK637)的培養基，並培養18小時，然後以液體閃爍計數器檢測嵌入的放射性同位素。以有絲分裂原植物血凝素(PHA)作為淋巴細胞增生的陽性對照組。以沒有Aβ胜肽之單獨培養的細胞或PHA有絲分裂原分別作為陰性及陽性對照組。刺激指數(SI)的計算為具有Aβ胜肽的三重複實驗培養物的平均每分鐘計數(cpm)除以三重複陰性對照組培養物的平均cpm；SI> 3.0被認為是有顯著的增生反應。
a . 增生分析
由於第0週(基線)和第16週(接種第三劑後4週)收集的全血中分離出周邊血液單核細胞樣品，然後在不存在或存在各種Aβ胜肽的情況下進行培養。如表8所示，當在培養基中加入Aβ1-14 、其他Aβ胜肽或p1412(非相關對照胜肽)時，未觀察到淋巴細胞的顯著增生反應。如所預期的，當將PHA有絲分裂原添加至培養基中時，有陽性增生反應。在UB-311免疫前、後觀察到與對PHA類似的反應(p=0.87)表示研究受試者的免疫功能沒有顯著改變(表8)。
統計分析。以配對t檢測分析第0週和第16週之間淋巴細胞增生的差異。以雙尾檢測確定統計顯著性水平(p >0.05)。使用R version 2.14.1進行所有的統計分析。
b . 細胞因子分析
來自PBMC培養物的細胞因子分析(IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ)是在培養基(只具有細胞的培養基，或在Aβ胜肽結構域或PHA存在下之具有細胞的培養基)的等分試樣上進行。根據製造商的說明書，使用人類特異性細胞因子三明治ELISA套組(U-CyTech Biosciences，Utrecht，The Netherlands)檢測各細胞因子的濃度(pg/mL)(Clin Diag Lab Immunol.5(1):78-81)(1998))。
將在第0週和第16週收集的PBMC樣本也用於測試細胞因子分泌，其在單獨細胞(陰性對照組)或細胞在Aβ胜肽、p1412 (非相關胜肽)或PHA有絲分裂原(陽性對照組)存在下培養3天後進行測試。套組的可量化範圍介於5至320 pg/mL之間。低於5 pg/mL或高於320 pg/mL的任何測量濃度分別以低於定量極限(BQL)或高於定量極限(AQL)表示。然而，出於統計考量，BQL或AQL分別用較低(5 pg/mL)或較高(320 pg/mL)的可量化極限值替換。在第0週和第16週的每種細胞因子平均濃度如表9所示。如預期，除了IL-2之外，在PHA存在下(陽性對照組)細胞因子的產生顯著增加。在基線(第0週)和第16週可觀察到對利用Aβ1-14 或其他Aβ胜肽刺激反應的細胞因子生成，但出現的大多數數值與相對應的陰性對照組(僅有細胞)相似。
為了評估免疫後細胞介導的免疫反應的變化，將從基線到第16週的平均細胞因子濃度變化與陰性對照組進行比較，並以配對Wilcoxon符號等級檢定(Wilcoxon signed-rank test)進行檢驗。在對全長Aβ1–42 胜肽反應中顯示出4種細胞因子(IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α)的分泌顯著增加；此觀察結果可能是由於Aβ1-42 聚集體的構型抗原決定位。在Aβ1-14 或其他Aβ胜肽中未檢測到細胞因子分泌的向上調節。
c . 摘要
UB-311疫苗含有2種胜肽免疫原，每種都具有分別與MvF5 Th和HBsAg3 Th抗原決定位合成連接的胺基端Aβ1-14 胜肽。以體外淋巴細胞增生和細胞因子分析評估UB-311疫苗接種對細胞免疫反應的影響。當將Aβ1-14 胜肽或任何其他Aβ胜肽添加到培養基時，未觀察到淋巴細胞的增生反應，如表8所示。除了Aβ1–42 以外，在利用Aβ1–14 和其他Aβ胜肽處理後未檢測到UB-311疫苗接種患者淋巴細胞之細胞因子分泌的向上調節，當與處理前第0週的水平相比時，Aβ1–42 在UB-311免疫接種後於第16週引起4種細胞因子(IFN-γ、IL-6、IL-10、TNF-α)明顯增加(表9)。因為單獨使用Aβ1-14 未檢測到細胞因子向上調節，所以透過Th2型T細胞反應導致的細胞因子釋放增加更可能與UB-311疫苗反應無關。對Aβ1-42 的反應被懷疑是對天然Aβ的背景反應，其可能與Aβ1-42 上鑑定的天然T輔助細胞抗原決定位有關。觀察到在對PHA的反應中缺乏IL-2產生，這與利用正常人PBMC在相似的實驗條件下於Clin Diagn Lab Immunol 1998; 5:78-81中由Katial RK等人報導的結果一致。總而言之，此些結果顯示UB-311疫苗在參與第I期臨床試驗的輕至中度阿茲海默症患者中未產生可能的發炎性抗自身、細胞介導免疫反應，因此進一步證明UB-311疫苗的安全性。
實施例 5. 相較於陰性對照組在具有中度免疫發炎反應的正常 血液供體中的幼稚周邊血液單核細胞 (PBMC) 內 可檢測到混雜的人工 Th 反應細胞
ELISpot分析可用於檢測正常血液供體中之幼稚周邊血液單核細胞內的混雜人工Th反應細胞，以評估當與強效有絲分裂原植物血凝素(PHA)和陰性對照組相比時其引發發炎反應的能力。
ELISpot測定使用三明治酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)技術。為了分析T細胞的活化，檢測IFN-γ或相關細胞因子作為分析物。將對所選分析物具有特異性的單株或多株抗體預先塗覆在以PVDF (聚偏氟乙烯)膜為底的微孔板上。將適當刺激的細胞移到孔洞中，並將微孔板置於加濕的37°C CO2 培養箱中一段特定的時間。在培養期間，固定化的抗體緊鄰分泌細胞，與分泌的分析物結合。在洗去任何細胞和未結合的物質後，於孔洞中加入對所選分析物具有特異性的生物素化多株抗體。清洗除去任何未結合的生物素化抗體後，加入與鏈黴抗生物素蛋白共軛連接的鹼性磷酸酶。接著清洗去除未結合的酵素，並加入基質溶液(BCIP/NBT)。形成藍黑色沉澱並在細胞因子定位的位點處出現斑點，每個單獨的斑點代表個別分析物分泌細胞。使用自動ELISpot圖像分析儀系統或立體顯微鏡手動計數計算斑點的數目。
在進行的體外研究中，將PHA濃度為10µg/mL的培養物作為陽性對照組。針對呈現於定期正常血液供體中周邊血液單核細胞內的反應細胞數目，測試UBITh®1 (SEQ ID NO:17)和UBITh®5 (SEQ ID NO:6)胜肽。製備具有SEQ ID NOs: 33至52混雜人工Th抗原決定位胜肽的混合物作為另一陽性對照組。以單獨培養基作為標準T細胞刺激細胞培養條件中的陰性對照組。簡單來說，將利用有絲分裂原(濃度為10µg/mL的PHA)或Th抗原(UBITh®1、UBITh®5或多個Ths混合物，濃度為10µg/mL)刺激的PBMCs (體積為100µL/孔洞，含2x105 個細胞)在CO2 培養箱中於37°C反應48小時。收集孔洞/微孔盤的上清液。清洗並處理微孔盤上的細胞以檢測目標分析物，IFN-γ。
如第1圖所示，針對其對混雜人工UBITh®1或UBITh®5抗原決定位胜肽的反應細胞，將代表性供體1、2和3進行測試。利用與PHA培養的幼稚供體PBMCs總是偵測到壓倒性的IFN-γ ELISPOT數目(數量太多而不能計數)，而用對照培養基培養的PBMCs給出介於5到50之間的背景IFN-γ ELISPOT數目。對於使用UBITh®1或UBITh®5培養的幼稚供體PBMCs檢測到介於20到約120的中等ELISPOT數值。具有SEQ ID NOs: 33-52之多種Th胜肽的混合物也可與幼稚供體PBMCs進行培養以比較ELISPOT數值(如同預期，其數目為20至約300)。與陰性對照組相比，由UBITh®1或UBITh®5胜肽引發的刺激反應為約3至5倍。
綜上所述，在幼稚供體PBMCs中可輕易地檢測到混雜人工Th反應細胞，其隨時準備引發免疫反應以協助B細胞抗體產生，並透過分泌特徵性細胞因子以協助相對應的效應T細胞反應。在此使用IFN-γ作為實例說明這些Th抗原決定位胜肽的刺激特性。然而，此種刺激性發炎反應足夠適度的去引發適合的效應細胞反應(產生抗體的B細胞，可殺死目標抗原細胞的細胞毒性T細胞)，使疫苗接種過程中不會引起不利的發炎病理生理反應。

表1、用於胜肽免疫原結構設計包括理想化人工Th抗原決定位之病原體蛋白質衍生的Th抗原決定位的胺基酸序列








































表2、任選的異源性間隔子的例子
表3、目標抗原位點(B細胞抗原決定位)的例子

表4、例示性胜肽免疫原結構
表5、例示性CpG寡核苷酸
表6、Aβ1-14 免疫原在天竺鼠中靶向Aβ胜肽而非Th抗原決定位的獨特免疫原性
表7、經Aβ1-14 、Aβ1-42 胜肽或PHA(植物血凝素)有絲分裂原刺激於食蟹獼猴周邊血液單核細胞(PBMCs)中之細胞因子濃度的分析
a 結果以平圴值 ± 標準偏差顯示
b BDL，低於偵測水平
表8、評估19名阿茲海默症患者周邊血液單核細胞的刺激指數
表9、Aβ胜肽或PHA有絲分裂原刺激後人類周邊血液單核細胞(PBMC)中的細胞因子濃度1
1 偵測的可量化範圍介於5至320 pg/mL
2 > 90%受試者的濃度高於量化限制上限(AQL>320 pg/mL)
3 1名患者具AQL值
4 6名患者具AQL值
5 8名患者具AQL值
6 4名患者具AQL值
7 在對PHA有絲分裂原反應中所觀察到的缺乏IL-2產生與在類似實驗條件下報導的數據一致
無
第1圖顯示在正常供體幼稚周邊血液單核細胞中混雜人工Th胜肽反應性T細胞的檢測。
無

Claims (63)

  1. 一種治療一疾病的方法，包括給予有此需要的一個體一胜肽，其中該胜肽包括一T輔助細胞抗原決定位及一抗原呈現抗原決定位，其中該胜肽產生比一陽性對照組低至少約3倍的一免疫發炎反應。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該抗原呈現抗原決定位為一B細胞抗原決定位。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該抗原呈現抗原決定位為一胜肽半抗原。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該抗原呈現抗原決定位為β澱粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該抗原呈現抗原決定位選自由Aβ1-14 、Aβ1-16 、Aβ1-28 、Aβ17-42 及Aβ1-42 組成的群組。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該抗原呈現抗原決定位為Aβ1-14 。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該抗原呈現抗原決定位為Aβ1-42 。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該T輔助細胞抗原決定位為一Th1抗原決定位。
  9. (缺)
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該T輔助細胞抗原決定位為一Th2抗原決定位。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該T輔助細胞抗原決定位與該抗原呈現抗原決定位共價連結。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該T輔助細胞抗原決定位與該抗原呈現抗原決定位的一胺基端或一羧基端共價連結。
  13. 如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該T輔助細胞抗原決定位與該抗原呈現抗原決定位以一硫酯鍵共價連結。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該T輔助細胞抗原決定位透過一間隔子與該抗原呈現抗原決定位連接。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該間隔子為Gly-Gly。
  16. 如申請專利範圍第14項所述之方法，其中該間隔子為(ε-N)Lys。
  17. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該胜肽更包括一免疫刺激序列。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之方法，其中該免疫刺激序列為一侵襲素蛋白(invasin protein)的一結構域。
  19. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該疾病為阿茲海默症。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該疾病為早期阿茲海默症。
  21. 如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該疾病為輕度阿茲海默症。
  22. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該免疫發炎反應是於周邊血液單核細胞中進行偵測。
  23. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該免疫發炎反應是於分離的周邊血液單核細胞中進行偵測。
  24. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該免疫發炎反應為細胞因子濃度增加。
  25. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該細胞因子濃度增加為IL-2、IL-6、IL-10、INF-γ或TNF-α濃度增加。
  26. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該給予為靜脈給予。
  27. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該給予為肌肉內給予。
  28. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該陽性對照組為植物血凝素有絲分裂原(phytohaemagglutinin mitogen)。
  29. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該給予包括給予約150 µg的該胜肽。
  30. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該給予包括給予約750 µg的該胜肽。
  31. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該胜肽如下式： (A)n -(目標抗原位點)-(B)o -(Th)m -X或(A)n -(B)o -(Th)m -(B)o -(目標抗原位點)-X或(A)n -(Th)m -(B)o -(目標抗原位點)-X或(目標抗原位點)-(B)o -(Th)m -(A)n -X或(Th)m -(B)o -(目標抗原位點)-(A)n -X其中:A為一胺基酸或一免疫刺激序列；B為至少一胺基酸、-NHCH(X)CH2 SCH2 CO-、-NHCH(X)CH2 SCH2 CO(εN)Lys-、-NHCH(X)CH2 S-琥珀醯亞胺基(εN)Lys-或-NHCH(X)CH2 S-(琥珀醯亞胺基)-；Th為輔助T細胞抗原決定位、其類似物、或其片段；目標抗原位點是B細胞抗原決定位或其免疫反應性類似物；X為一胺基酸的α-COOH或-CONH2 ；n為1至約10；m為1至約4；以及o為0至約10。
  32. 如申請專利範圍第1至31項任一項所述之方法，其中該T細胞抗原決定位為一人工T細胞抗原決定位。
  33. 一種治療一疾病的方法，包括給予有此需要的一個體一胜肽，其中該胜肽包括一T輔助細胞抗原決定位及一抗原呈現抗原決定位，其中該胜肽於該個體中產生比一陰性對照組高小於約3倍的一免疫發炎反應。
  34. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該抗原呈現抗原決定位為一B細胞抗原決定位。
  35. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該抗原呈現抗原決定位為一胜肽半抗原。
  36. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該抗原呈現抗原決定位為β澱粉樣蛋白(Aβ)。
  37. 如申請專利範圍第36項所述之方法，其中該抗原呈現抗原決定位選自由Aβ1-14 、Aβ1-16 、Aβ1-28 、Aβ17-42 及Aβ1-42 組成的群組。
  38. 如申請專利範圍第37項所述之方法，其中該抗原呈現抗原決定位為Aβ1-14 。
  39. 如申請專利範圍第37項所述之方法，其中該抗原呈現抗原決定位為Aβ1-42 。
  40. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該T輔助細胞抗原決定位為一Th1抗原決定位。
  41. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該T輔助細胞抗原決定位為一Th2抗原決定位。
  42. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該T輔助細胞抗原決定位與該抗原呈現抗原決定位共價連結。
  43. 如申請專利範圍第42項所述之方法，其中該T輔助細胞抗原決定位與該抗原呈現抗原決定位的一胺基端或一羧基端共價連結。
  44. 如申請專利範圍第42項所述之方法，其中該T輔助細胞抗原決定位與該抗原呈現抗原決定位以一硫酯鍵共價連結。
  45. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該T輔助細胞抗原決定位透過一間隔子與該抗原呈現抗原決定位連接。
  46. 如申請專利範圍第45項所述之方法，其中該間隔子為Gly-Gly。
  47. 如申請專利範圍第45項所述之方法，其中該間隔子為(ε-N)Lys。
  48. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該胜肽更包括一免疫刺激序列。
  49. 如申請專利範圍第48項所述之方法，其中該免疫刺激序列為一侵襲素蛋白(invasin protein)的一結構域。
  50. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該疾病為阿茲海默症。
  51. 如申請專利範圍第50項所述之方法，其中該疾病為早期阿茲海默症。
  52. 如申請專利範圍第50項所述之方法，其中該疾病為輕度阿茲海默症。
  53. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該免疫發炎反應是於周邊血液單核細胞中進行偵測。
  54. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該免疫發炎反應是於分離的周邊血液單核細胞中進行偵測。
  55. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該免疫發炎反應為細胞因子濃度增加。
  56. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該細胞因子濃度增加為IL-2、IL-6、IL-10、INF-γ或TNF-α濃度增加。
  57. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該給予為靜脈給予。
  58. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該給予為肌肉內給予。
  59. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該陽性對照組為植物血凝素有絲分裂原。
  60. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該給予包括給予約150 µg的該胜肽。
  61. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該給予包括給予約750 µg的該胜肽。
  62. 如申請專利範圍第33項所述之方法，其中該胜肽如下式： (A)n -(目標抗原位點)-(B)o -(Th)m -X或(A)n -(B)o -(Th)m -(B)o -(目標抗原位點)-X或(A)n -(Th)m -(B)o -(目標抗原位點)-X或(目標抗原位點)-(B)o -(Th)m -(A)n -X或(Th)m -(B)o -(目標抗原位點)-(A)n -X其中:A為一胺基酸或一免疫刺激序列；B為至少一胺基酸、-NHCH(X)CH2 SCH2 CO-、 -NHCH(X)CH2 SCH2 CO(εN)Lys-、-NHCH(X)CH2 S-琥珀醯亞胺基(εN)Lys-或-NHCH(X)CH2 S-(琥珀醯亞胺基)-；Th為該輔助T細胞抗原決定位、其類似物、或其片段；目標抗原位點是該B細胞抗原決定位或其免疫反應性類似物；X為一胺基酸的α-COOH或-CONH2 ；n為1至約10；m為1至約4；以及o為0至約10。
  63. 如申請專利範圍第33-62項之任一項所述之方法，其中該T細胞抗原決定位為一人工T細胞抗原決定位。
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