CN113354740A - 一种猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒、制备方法及应用 - Google Patents

一种猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，旨在提供一种猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒、制备方法及应用。是将目的抗原SP‑E2和自组装分子的基因通过杆状病毒表达系统融合表达，形成SP‑E2‑mi3融合蛋白；然后进一步通过纳米组装，形成自组装蛋白纳米颗粒；所述目的抗原SP‑E2和自组装分子的基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过自组装分子基因融合CSFV E2，通过杆状病毒表达系统表达和纯化得到的融合蛋白，在体外可组装成SP‑E2‑mi3纳米颗粒。本发明用于疫苗制备时，较常规的亚单位疫苗免疫原性强，可通过鉴别诊断能够区分感染及免疫动物，能够从根本上净化猪瘟病毒。

Description

一种猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒、制备方法及应用
技术领域
本发明属于分子生物学及生物医学技术领域，涉及自组装蛋白纳米颗粒的制备方法，以及基因工程化的嵌合纳米颗粒在疫苗领域的应用。
背景技术
基于灭活的或减毒的病原体控制传染病的传统疫苗，其特点是具有有效的T细胞、B细胞反应和记忆免疫。尽管它们可以在宿主中诱导有效的免疫效力，但随着近来重要流行病的出现，对安全有效的疫苗策略的需求和关注日益增加。因此，考虑到与传统疫苗策略相比的优势，包括不存在完整病原体的致病因子，易于生产、生物安全和DIVA问题(受感染动物和接种疫苗的动物之间的区别)，基因工程亚单位疫苗已变得越来越流行。
通常，疫苗的免疫原性在很大程度上受到抗原的理化特性的影响。为了提高疫苗的免疫原性，具有出色免疫原性的经典灭活或减毒病原体可以提供关键参考，包括1)减毒病原体的复制能力2)高度重复和有序的表面抗原阵列3)微粒抗原的性质4)同时激活先天和适应性免疫的能力。基于这些发现，已提出了多种方法来增强亚基疫苗的免疫原性，其中包括通过与大型蛋白质载体或佐剂偶联来增加抗原大小，抗原多聚化以及在颗粒载体上表面高度重复的抗原表面展示。
具有生物活性的蛋白质分子相互作用并自我排列，形成与其自然状态下的功能密切相关的有序结构。这是自组织形成纳米颗粒的能力，在自组装蛋白纳米颗粒(SAPNs)中得到了很好的证明。SAPN通常由各种高度重复的基序组成，可以利用这些基元将外来抗原决定基或蛋白质整合到其结构中，因此可以将这些嵌入的分子表面展示在组装的颗粒上。这些嵌合的SAPN是在生物医学领域中抗原表位和蛋白质递送的理想载体。SAPN上外来抗原的空间排列类似于天然病原体上的病原体相关分子模式(PAMP)，其特征在于高抗原密度和高度有序的结构，从而增强了抗原与BCR之间的交联反应。这种多重相互作用与刺激有效免疫反应的关键步骤密切相关，并且它还为提高亚基疫苗的免疫原性提供了另一种解决方案。
对于疫苗递送，基于纳米粒子(NPs)的疫苗在引发适应性和先天免疫性方面，具有优于亚基可溶性抗原的许多改进特性。纳米级的颗粒可以改善抗原的吞噬作用，并通过抗原呈递细胞(APC)内在化。树突状细胞(DCs)作为最强大的APC，在启动有效的免疫反应中起关键作用，并且倾向于通过内吞作用内化纳米颗粒抗原，而不是可溶性抗原。与通常通过II类MHC途径呈递的可溶性蛋白抗原不同，NPs抗原内化到APC中可通过II类MHC和I类MHC途径促进交叉呈递和交叉启动，随后增强CD8+CTL免疫应答。而且，NP本身也作为递送系统发挥辅助作用。除了增强抗原内在化和呈递作用外，NP还可以促进先天免疫的激活，免疫刺激性细胞因子的分泌以及DC的成熟和迁移，这反过来又促进了免疫反应的初始化。
病毒样粒子(VLPs)是一种自组装的NP，已经在针对多种疾病的疫苗开发中取得了巨大成功，例如，基于许可的商用VLP疫苗，包括针对乙型肝炎，宫颈癌和戊型肝炎的疫苗，就是例证。疫苗在临床试验阶段针对不同的感染进行了评估。这些结果表明，基于NP的递送技术可增强适应性免疫和先天性免疫，从而产生强大的保护性免疫。
通常，各种各样的靶抗原通过基因工程融合表达或化学偶联与NPs连接并显示在表面上。在基于NPs的疫苗设计中，应考虑三个关键因素：插入片段大小(抗原/表位大小)，VLP形成能力，VLP稳定性和抗原/表位的表面展示。它们与基于NP的疫苗的免疫功效密切相关。先前的研究表明，基于二十面体纳米笼的计算设计，i301和mi3能够自我安排，自发形成高度有序的60个亚基十二面体NP，可作为基于NP的新型疫苗设计的有希望的替代品。尽管如此，包括插入能力和免疫效力等许多问题仍有待进一步验证。
猪瘟病毒(CSFV)的出现和反复流行构成持续的威胁，给养猪业造成巨大的经济损失。尽管毫无疑问，拉潘化减毒疫苗可以提供针对CSFV的全面保护，但它不具备DIVA特性。由于E2糖蛋白参与了免疫动物的中和抗体的诱导，因此有人提出将E2糖蛋白作为潜伏疫苗开发的主要目标。E2蛋白高度糖基化，这种糖基化与其免疫保护效率密切相关。仅真核生物来源的E2诱导有效的中和抗体，并且需要多次剂量才能获得足够的保护，阻碍了E2亚基疫苗在该领域的应用。因此，有必要进行改进以诱导亚单位疫苗更好和更广泛的保护功效。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒、制备方法及应用。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种猪瘟病毒(CSFV)自组装蛋白纳米颗粒，是将目的抗原SP-E2和自组装分子的基因通过杆状病毒表达系统融合表达，形成SP-E2-mi3融合蛋白；然后进一步通过纳米组装，形成自组装蛋白纳米颗粒；所述目的抗原SP-E2和自组装分子的基因(SP-E2-mi3基因)的编码序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了由前所述目的抗原SP-E2和自组装分子的基因(SP-E2-mi3基因)编码的SP-E2-mi3融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明进一步提供了前述猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建含有目标抗原SP-E2及自组装分子基因的穿梭质粒，将其转化DH10Bac感受态细胞；进一步使其发生转座，通过蓝白斑筛选，获得重组杆粒；
(2)将重组杆粒转染昆虫细胞，获得杆状病毒，并将杆状病毒在昆虫细胞上进行传代；
(3)将P3代病毒液感染足量的昆虫细胞，纯化获得SP-E2-mi3融合蛋白；
(4)通过透析的方式，将SP-E2-mi3融合蛋白的溶液环境替换为纳米颗粒组装液，在4℃条件下进行纳米组装，并使用透射电镜确认纳米颗粒的形成。
本发明进一步提供了利用前述猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒进一步制备猪瘟病毒自组装纳米颗粒疫苗的制备方法，是将SP-E2-mi3融合蛋白与Seppic 206水佐剂充分混合、乳化，制得纳米颗粒疫苗。
本发明进一步提供了前述方法制备获得的猪瘟病毒自组装纳米颗粒疫苗在防治猪瘟病毒感染中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明通过自组装分子基因融合CSFV E2，通过杆状病毒表达系统表达和纯化得到的融合蛋白，在体外可组装成SP-E2-mi3纳米颗粒。免疫小鼠后能够产生更高水平的猪瘟的特异性抗体和中和抗体水平，且IFN-γ水平明显高于单体E2免疫的小鼠；免疫猪后可诱导产生特异性抗体，且对致死剂量病毒攻击提供保护。这些结果表明，本发明的疫苗较常规的亚单位疫苗，免疫原性强，可通过鉴别诊断能够区分感染及免疫动物，能够从根本上净化猪瘟病毒。
附图说明
图1为重组病毒构建和蛋白表达和鉴定图；
图2-1至2-2为SP-E2-mi3 NPs的透射电镜分析和动态光散射分析图；
图3为SP-E2-mi3 NPs的储存稳定性分析图；
图4为巨噬细胞PAM/3D4细胞系对SP-E2-mi3 NPs内化效率分析；
图5为SP-E2-mi3 NPs的小鼠免疫反应分析图；
图6为SP-E2-mi3 NPs的猪体免疫反应分析和攻毒保护试验图。
具体实施方式
本发明致力于通过利用NPs技术提高亚基疫苗的免疫效力。为此，开发并探索了自组装肽纳米颗粒(mi3)作为疫苗输送支架的潜力。将大小达到354个氨基酸的靶蛋白融合到mi3的N末端，不会损害VLP的形成，并且SWISS-MODEL三维结构表明，靶蛋白位于mi3纳米颗粒的外表面。这是一种通过在遗传编码的NPs上展示抗原来开发疫苗的新策略。靶抗原和自组装肽支架是一种简单的融合蛋白。此外，本发明能够证明，使用该技术制备的CSFV E2疫苗引起了强烈的免疫反应和有效的保护，证明mi3 NPs可用作平台提高亚基疫苗免疫原性，并有潜力应用于CSFV疫苗以及其他传染性病原体疫苗的开发。
以下实施例用于说明本发明，而不意图限制本发明的范围。
实施例1-猪瘟SP-E2-mi3融合蛋白的表达
1)目的基因的合成
根据设计的序列，按照昆虫细胞密码子偏好性进行核苷酸序列优化，并交由基因合成公司合成(如图1所示)。
2)穿梭质粒的构建
pFastBac HTB质粒以EcoRⅠ和XhoⅠ限制性内切酶37℃酶切2h后回收，将酶切的载体与目的基因用同源重组酶37℃重组30min，转化E.coli感受态细胞Top10，挑斑鉴定，阳性菌送测序。
3)重组杆粒的获取
将阳性质粒转化DH10Bac感受态细胞，48h后挑选白斑，用M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO.3)和M13-R：CAGGAAACAGCTATGACC(SEQ ID NO.4)，进行PCR鉴定后抽提杆粒。
4)转染及杆状病毒的获取
按照Invitrogen说明书，用脂质体转染试剂
Figure BDA0002946560320000041
Ⅱ Reagent转染昆虫的SF9细胞；27℃培养96h，细胞出现病变，收集P1代病毒液，将P1代病毒液重新感染High Five细胞，27℃培养96h后收获P2代病毒液，同样的方法获取P3代病毒液。
5)蛋白的表达及纯化
用300mL培养基在250mL摇瓶里培养Sf9细胞，当细胞密度到达2.5×106个/ml时，以MOI＝5感染细胞，27℃，115rpm培养96h，超声破碎，然后4000rpm离心10min,收集上清，用镍柱纯化蛋白。
6)SP-E2-mi3的Western blot鉴定
将纯化的蛋白进行SDS-PAGE及Western Blot鉴定，一抗为CSFV E2单抗，二抗为HRP标记的羊抗鼠二抗，结果如图1所示。
7)SP-E2-mi3 NPs的透射电镜观察和动态光散射(DLS)检测
将纯化后得到的SP-E2-mi3蛋白，采用超滤管的方式，将原来的500mM咪唑替换为磷酸盐缓冲液(PBS)，2％磷钨酸负染后，用透射电镜观察纳米颗粒的形成。同时取样品用于DLS检测,测定纳米颗粒的粒径，结果如图2所示。
8)SP-E2-mi3纳米颗粒的储存稳定性
将得到的SP-E2-mi3纳米颗粒调整蛋白浓度为0.25mg/mL，无菌分装成小管，置于室温(25℃)，并且于特定时间点，取样TEM观察纳米颗粒，并且使用Image J对纳米颗粒的数目进行计数，随机计算5个视野中纳米颗粒的数目。将初始浓度时，纳米颗粒的数目定义为100％。结果如图3所示。
9)PAM/3D4细胞系对SP-E2-mi3 NPs的内化
使用间接免疫荧光(IFA)确定PAM/3D4细胞对SP-E2-mi3 NP的吞噬作用。简而言之，将细胞以2×105个细胞/mL预接种在96孔细胞培养板上，并培养过夜。用NP组装溶液稀释SP-E2或SP-E2-mi3 NPs，并调节至相同的摩尔浓度(50μM)。然后添加100μL SP-E2或SP-E2-mi3 NPs，放置8小时。随后，将细胞在25℃的4％(w/v)低聚甲醛中固定20分钟，然后用PBST冲洗两次。将细胞在25℃下用Triton X-100(在PBS缓冲液中为0.2％)通透15分钟。用PBST冲洗两次后，加入CSFV E2单克隆抗体3C12，然后加入FITC偶联的山羊抗小鼠IgG。在通过显微镜检测免疫荧光信号之前，使用DAPI溶液(1μg/mL)染色细胞核。分别计数FITC斑点阳性细胞(具有内在的SP-E2)和DAPI阳性细胞(总活细胞)的数量。SP-E2的内化率表示为(FITC点阳性细胞数)/(DAPI阳性细胞数)×100％。结果如图4所示。
实施例2-猪瘟SP-E2-mi3嵌合纳米颗粒疫苗的制备及动物免疫实验
将实施例1表达的SP-E2-mi3 NPs与Seppic 206水佐剂以1：1的比例350rpm混匀10min，成苗4℃保存。
试验例1
15只5周龄的昆明鼠随机分为三组，每组5只，第一组皮下注射SP-E2蛋白40μg,第二组皮下注射SP-E2-mi3 NPs 25μg，第三组皮下注射SP-E2-mi3 NPs 40μg，第四组皮下注射PBS，首免14天时进行二次免疫，分别于首免后的14天和28天采血，分别用间接ELISA和血清的中和实验，测定诱导的体液免疫水平、细胞免疫水平和CSFV特异性的IFN-γ水平。如图5所示，SP-E2-mi3 NPs接种组中的25μg或40μg比SP-E2接种组40μg产生更高的特异性抗体和中和抗体。值得注意的是，即使在28天时，即使低剂量的SP-E2-mi3 NPs也会比高剂量的SP-E2产生更强的E2特异性抗体和中和抗体(P<0.05)。IFN-γ分析显示，接种SP-E2-mi3NPs的40μg组的IFN-γ浓度最高，SP-E2-mi3 NPs 25μg组其次，而接种SP-E2 40μg组则干扰素-γ较低(P<0.05)。这些发现表明，SP-E2-mi3 NPs比单体SP-E2表现出更好的保护性免疫原性。
试验例2
12头仔猪，随机分为3组，第一组肌肉注射SP-E2-mi3 NPs 10μg,第二组肌肉注射PBS。于免疫0、7、14、21和28天采血,阻断ELISA检测E2特异性抗体水平，同时进行中和实验测定中和抗体水平。并且于免疫后第28天(攻毒0天)采血后，使用致死剂量的CSFV Shimen进行攻毒,攻毒后每天监测体温和临床症状。
结果显示，SP-E2-mi3 NPs疫苗接种组从21天出现阳性抗体水平(临界值＝40％)，并且在35天时阻断率达到最高水平(77.9％)。PBS疫苗接种组仅在临界线以下诱导了非特异性抗体水平(图6)。
为了确定中和抗体水平，将以0、7、14、21和28天收集的血清进行中和试验处理。在接种后的SP-E2-mi3 NPs中，在7天时可检测到抗CSFV的中和抗体，平均中和抗体效价为1:18。SP-E2-mi3 NPs疫苗接种组中和抗体滴度在28天(加强免疫后2周)达到峰值，其中1：5042。PBS疫苗接种组均未开发出针对CSFV的可检测中和抗体(图6)。
免疫后未观察到明显的副作用。PBS疫苗接种组表现出急性的发烧(40.7–42℃)，和其他CSFV诱导的典型临床症状，包括轻度腹泻，畏寒，食欲不振，虚脱和结膜炎。而且，有1头仔猪在攻毒后12天时死亡。在SP-E2-mi3 NPs接种组中未观察到发热反应和其他临床症状(图6)。这些发现表明，接种了10μg SP-E2-mi3 NPs的仔猪产生了高水平的抗体特异性抗体和中和抗体，还提供了针对致命病毒攻击的完全保守性。
以上所述仅是本发明的实施方式，应当指出，对于本技术邻域的技术人员，在不脱离本法名技术原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒、制备方法及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1755
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atgataaaag tattaagagg gcaggtcgtg caaggtataa tatggctgct gctggtgacc 60
ggggcacaag ggcggctgtc ctgtaaggaa gactacaggt atgcgatatc atcaaccaat 120
gagatagggc cgctaggggc tgaaggcctc accaccacct ggagagagta tagccatggt 180
ttgcagctgg atgacgggac tgtcagggcc atttgcactg cggggtcctt caaagttata 240
gcacttaatg tagtcagtag gaggtacctg gcatcattac acaagagggc tttgcccacc 300
tcagtaacat ttgaactcct atttgatggg actagcccaa caattgagga gatgggagat 360
gactttggat ttgggctgtg cccttttgac tcaaccccag tggtcaaagg gaagtacaat 420
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ctcccacact accccatagg caagtgcatc ctagcaaatg agacgggtta cagggtagtg 780
gattccacag actgcaatag agatggcgtc gttatcagca ctgaaggaga acacgagtgc 840
ttgattggta acaccaccgt caaggtgcac gcgttggatg gaagactggg ccctatgccg 900
tgcagaccca aagaaatcgt ctctagcgcg ggacctgtaa ggaaaacttc ctgtactttc 960
aattacacaa agacactaag aaacaagtac tatgagccca gggacagcta ttttcagcaa 1020
tatatgctta agggcgagta ccaatactgg tttgacctgg acgtgggtgg ttccggtggc 1080
tccggtggta gcggtggtag catgaagatg gaggagctct tcaagaagca caagatcgtg 1140
gctgtgttgc gtgctaactc cgtcgaggaa gctaagaaga aggctttggc tgtgttcctg 1200
ggtggtgtgc atttgatcga gatcaccttc accgtccctg acgccgacac cgtgatcaag 1260
gagctgtctt tcctgaagga gatgggagct atcatcggag ctggtactgt gacctctgtg 1320
gaacagtgcc gtaaggctgt ggaatccggc gctgaattca tcgtgagccc tcacctggat 1380
gaggagatca gtcagttctg caaggaaaag ggtgtgttct acatgcctgg cgtgatgacc 1440
cccaccgagc tggtgaaggc tatgaagctg ggacacacca tcctgaagct cttccctggt 1500
gaagtggtgg gcccccagtt cgtgaaggct atgaagggtc ctttccctaa cgtgaagttc 1560
gtgcctactg gtggtgtgaa cctggacaac gtgtgcgagt ggttcaaggc tggtgtgttg 1620
gctgtgggtg tgggttctgc tctggttaag ggtactcctg tggaggtggc tgagaaggct 1680
aaggctttcg tggagaagat caggggttgt actgagcacc accatcacca tcaccatcac 1740
catcaccatc actag 1755
<210> 2
<211> 584
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Met Ile Lys Val Leu Arg Gly Gln Val Val Gln Gly Ile Ile Trp Leu
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Gly Ala Gln Gly Arg Leu Ser Cys Lys Glu Asp Tyr
20 25 30
Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Pro Leu Gly Ala Glu
35 40 45
Gly Leu Thr Thr Thr Trp Arg Glu Tyr Ser His Gly Leu Gln Leu Asp
50 55 60
Asp Gly Thr Val Arg Ala Ile Cys Thr Ala Gly Ser Phe Lys Val Ile
65 70 75 80
Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Arg
85 90 95
Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Ser
100 105 110
Pro Thr Ile Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro
115 120 125
Phe Asp Ser Thr Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu
130 135 140
Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val
145 150 155 160
Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val
165 170 175
Lys Thr Tyr Lys Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg Val Asp Cys Val
180 185 190
Thr Thr Ile Val Glu Lys Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Trp Gly Gly
195 200 205
Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Asn Pro Val Thr Tyr Ile Gly Gly Gln
210 215 220
Val Lys Gln Cys Arg Trp Cys Gly Phe Asp Phe Lys Glu Pro Asp Gly
225 230 235 240
Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly
245 250 255
Tyr Arg Val Val Asp Ser Thr Asp Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile
260 265 270
Ser Thr Glu Gly Glu His Glu Cys Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys
275 280 285
Val His Ala Leu Asp Gly Arg Leu Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys
290 295 300
Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe
305 310 315 320
Asn Tyr Thr Lys Thr Leu Arg Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser
325 330 335
Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp
340 345 350
Leu Asp Val Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met
355 360 365
Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu Arg
370 375 380
Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Lys Lys Lys Ala Leu Ala Val Phe Leu
385 390 395 400
Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp
405 410 415
Thr Val Ile Lys Glu Leu Ser Phe Leu Lys Glu Met Gly Ala Ile Ile
420 425 430
Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val Glu
435 440 445
Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile Ser
450 455 460
Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met Thr
465 470 475 480
Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Thr Ile Leu Lys
485 490 495
Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met Lys
500 505 510
Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn Leu
515 520 525
Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly Val
530 535 540
Gly Ser Ala Leu Val Lys Gly Thr Pro Val Glu Val Ala Glu Lys Ala
545 550 555 560
Lys Ala Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu His His His His
565 570 575
His His His His His His His His
580
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
caggaaacag ctatgacc 18

Claims (5)

1.一种猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒，其特征在于，是将目的抗原SP-E2和自组装分子的基因通过杆状病毒表达系统融合表达，形成SP-E2-mi3融合蛋白；然后进一步通过纳米组装，形成自组装蛋白纳米颗粒；所述目的抗原SP-E2和自组装分子的基因的编码序列如SEQID NO.1所示。
2.由权利要求1所述目的抗原SP-E2和自组装分子的基因编码的SP-E2-mi3融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建含有目标抗原SP-E2及自组装分子基因的穿梭质粒，将其转化DH10Bac感受态细胞；进一步使其发生转座，通过蓝白斑筛选获得重组杆粒；
(2)将重组杆粒转染昆虫细胞，获得杆状病毒，并将杆状病毒在昆虫细胞上进行传代；
(3)将P3代病毒液感染足量的昆虫细胞，纯化获得SP-E2-mi3融合蛋白；
(4)通过透析的方式，将SP-E2-mi3融合蛋白的溶液环境替换为纳米颗粒组装液，在4℃条件下进行纳米组装，并使用透射电镜确认纳米颗粒的形成。
4.利用权利要求1所述猪瘟病毒自组装蛋白纳米颗粒进一步制备猪瘟病毒自组装纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，是将SP-E2-mi3融合蛋白与Seppic 206水佐剂充分混合、乳化，制得纳米颗粒疫苗。
5.权利要求4所述方法制备获得的猪瘟病毒自组装纳米颗粒疫苗在防治猪瘟病毒感染中的应用。
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