CN113633763A

CN113633763A - 一种新型冠状病毒s1-e疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN113633763A
Application number: CN202110717226.3A
Authority: CN
Inventors: 左建宏; 黄佳璐; 张豫; 张明慧
Original assignee: University of South China
Current assignee: University of South China
Priority date: 2021-06-28
Filing date: 2021-06-28
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2041-06-28
Also published as: CN113633763B

Abstract

本发明提供了一种新型冠状病毒S1‑E疫苗及其制备方法。该疫苗包括S1‑E蛋白，由两个独立的单一蛋白融合而成，其中S1是新型冠状病毒表面最凸起的结构，具有很强的免疫原性，而包膜蛋白E拥有高度的保守性。本发明的S1‑E疫苗，各组分相互协调补充，具有良好的免疫原性、安全性和生物学活性，能够诱导机体产生高滴度的中和抗体，有效抑制新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)的生长，可有效预防感染SARS‑CoV‑2。而且本发明的制备方法简单、易于纯化，安全性高，疫苗可较快的应用于临床试验。

Description

一种新型冠状病毒S1-E疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物制品领域，尤其涉及一种新型冠状病毒S1-E疫苗及其制备方法。

背景技术

SARS-COV-2具有高度传染性，主要通过黏膜传播。SARS-CoV-2与SARS 病毒相似，均属于冠状病毒，但其碱基序列和结构与SARS病毒不同。目前还没有治疗SARS-CoV-2感染的专门药物，而且只有一小部分患者可以从免疫系统的影响中恢复。面对找到治愈方法的困难，研制疫苗已成为当务之急。据世界卫生组织统计，目前共有200多个疫苗开发项目，包括传统疫苗(减毒活疫苗、灭活疫苗)、亚单位疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗等。其中，重组亚单位疫苗是利用微生物(抗原)的某种表面结构成分诱导机体产生不含核酸的抗体的一种疫苗。这些结构可以包括某些多糖、蛋白质或表位，但它们不包括整个病原体。在亚单位疫苗的基础上，负载纳米粒子形成纳米疫苗，这也是疫苗设计的一种流行方式。

PLGA是最成功的生物可降解聚合物之一。作为抗原交付系统,它有很多优点:(I)PLGA拥有良好的生物降解性和生物相容性,(Ⅱ)FDA和欧洲医疗机构批准的药物输送系统，用于肠外给药(Ⅲ)描述的充分的准备和生产方法适用于各种各样的药物，如亲水或疏水分子或大分子，(Ⅳ)可减少疫苗抗原的降解，(Ⅴ)可持续释放的可能性，(Ⅵ)可改变表面性质，提供隐形和/或与生物材料更好的相互作用等。

由于新型冠状病毒传染性极强，致病性高的问题。全病毒结构的疫苗并不能保证其安全性，可能使接种对象产生无效抗体。无效抗体的产生往往对应对病毒感染不能起到有利作用甚至会导致依赖性感染增强现象和增强呼吸系统疾病等副作用。而单一蛋白的亚单位疫苗可能没有很好的免疫原性，或者在一些新型冠状病毒突变株感染时面临失效的风险。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种新型冠状病毒S1-E 疫苗及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供的一种新型冠状病毒S1-E疫苗，包括S1-E蛋白，所述S1-E蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

进一步的，所述S1-E蛋白的浓度为0.1-0.2g/L。

进一步的，所述S1-E蛋白由新型冠状病毒突刺蛋白S1亚基位点的受体结合域融合包膜蛋白E而成，所述白S1亚基位点的受体结合域的氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示，所述包膜蛋白E的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述 S1-E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供上述新型冠状病毒S1-E疫苗的制备方法，包括以下步骤：

步骤S1，合成S1-E蛋白的编码基因的核苷酸序列；

步骤S2，将步骤S1得到的S1-E蛋白的编码基因克隆到质粒载体中；

步骤S3，将步骤S2的质粒载体转化到表达系统；

步骤S4，将步骤S3构建的表达系统的生物接种培养，进行重组S1-E蛋白表达，得到所述S1-E蛋白；

步骤S5，提取纯化步骤S4得到S1-E蛋白；

步骤S6，将步骤S5得到的高纯度的S1-E蛋白与佐剂混合孵育，形成稳定的混合物，沉淀、水洗和冻干，即得所述S1-E疫苗。

进一步的，步骤S2中，所述质粒载体包括质粒pET-28a。

进一步的，步骤S3中，所述宿主的表达系统包括原核表达系统、酵母表达系统、哺乳细胞和无细胞表达系统中的任意一种。

进一步的，步骤S3中，所述原核表达系统包括大肠杆菌；步骤S4中，将所述大肠杆菌的菌落接种于含卡那霉素的溶菌肉汤培养基中进行细菌培养，所述大肠杆菌的接种量为1～6％。

进一步的，步骤S5中的提取过程使用包涵体溶解液，所述包涵体溶解液包括Tris缓冲液、NaCl溶液和尿素，所述Tris缓冲液和NaCl溶液的摩尔浓度比为5:4，所述尿素的的摩尔浓度为8mol/L；所述纯化使用层析柱，所述层析柱为 Ni²⁺金属螯合层析柱。

进一步的，步骤S6中，所述佐剂包括PLGA，所述PLGA在所述S1-E纳米疫苗中的终浓度为1-2mg/mL。

本发明还提供上述新型冠状病毒S1-E疫苗在药物组合物中的应用，所述的药物组合物包含如权利要求1所述的S1-E疫苗。

本发明提供的技术方案带来的有益效果是：

(1)本发明提供的一种新型冠状病毒S1-E疫苗，S1-E蛋白是由两个独立的单一蛋白融合而成，其中新型冠状病毒突刺蛋白S1亚基位点的受体结合域是新型冠状病毒表面最凸起的结构，具有很强的免疫原性，而包膜蛋白E拥有高度的保守性。本发明将S1亚基位点的受体结合域与包膜蛋白E进行重组。该疫苗各组分相互协调补充，抗原性强，具有良好的免疫原性、安全性和生物学活性，能够诱导机体产生高滴度的中和抗体，有效抑制新型冠状病毒 (SARS-CoV-2)的生长，可有效预防感染新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。

(2)本发明疫苗制备方法简单、易于纯化，安全性高，疫苗可较快的应用于临床试验。

附图说明

图1为本发明的一种新型冠状病毒S1-E疫苗扫描电镜图；

图2为本发明实施例1提供的S1-E疫苗的体外释放度曲线；

图3为本发明实施例1提供的S1-E疫苗的粒径分布图；

图4为本发明实施例1提供的S1-E疫苗的Zeta电位图；

图5为本发明实施例1提供的S1-E疫苗免疫小鼠产生的抗S1蛋白抗体滴度图；

图6为本发明实施例1提供的S1-E疫苗免疫小鼠产生的抗E蛋白抗体滴度图；

图7为本发明实施例1提供的S1-E疫苗的假病毒中和试验结果图；

图8为本发明实施例1提供的S1-E疫苗免疫小鼠后第四周小鼠体内产生的免疫应答图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明实施方式作进一步地描述。

实施例1：

1、S1-E蛋白疫苗的制备

1.1合成S1-E蛋白的编码基因的核苷酸序列

在Uniprot蛋白质数据库中找到新型冠状病毒的S1、RBD、E蛋白的氨基酸序列。利用DNAMAN软件进行序列分析，并且根据每个蛋白在新型冠状病毒上的位置不同，留下抗原性大的膜外序列，以E蛋白为5’序列和S1亚基序列为3’序列用柔性Linker进行连接，合成S1-E蛋白的编码基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示。

1.2将步骤1.1得到的S1-E蛋白的编码基因克隆到质粒载体中

在S1-E蛋白的编码基因的5′端和3′端分别添加Ncol、Xhol酶切位点，与表达载体pET-28a质粒连接，获得编码S1-E蛋白的原核表达质粒pET-28a-S1-E。

1.3将步骤1.2的质粒载体转入到表达系统

将表达质粒pET28a-S1-E构建到Rostta(DE3)感受态细胞中，涂板，挑取单菌落，筛选阳性克隆重组大肠杆菌Rostta(DE3)pET28a-S1-E。

1.4将步骤1.3构建的表达系统的生物接种培养，进行重组S1-E蛋白表达，得到所述S1-E蛋白

1.4.1挑取单个步骤3得到的Rostta(DE3)pET28a-S1-E基因工程菌菌落，将其接种于含50μg/ml卡那霉素的溶菌肉汤培养基(LB)中，20～37℃， 160～240rpm摇菌过夜，按1～6％的接种量将Rostta(DE3)pET28a-S1-E基因工程菌菌落接种于LB/kam培养液中，160～240rpm摇菌至OD600为0.5～0.7时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.1-1.0mM，诱导4～6小时后， 2000～4000g在2～6℃离心5～15min，去上清，沉淀用1xPBS洗涤，将Rosetta菌重悬于40ml 1xPBS中，加入四氢嘧啶至终浓度0.8-1.6mmol/L，和吐温20至终浓度0.5-1％，并于室温中振荡2-5分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，-80℃保存；

1.4.2将裂解液置于冰浴下50-55W超声5-20遍，超声20～40s、停20～40s，直至菌液不粘稠，10000～12000g 3～5℃离心10～20min，去上清，得Rostta (DE3)pET28a-S1-E基因工程菌包涵体。

1.5提取纯化步骤1.4得到S1-E蛋白

1.5.1在冰浴下，用100ml包涵体洗液1重悬沉淀上述Rostta(DE3)pET28a- S1-E基因工程菌包涵体，并磁力搅拌20～40min，10000～13000g 3～5℃离心 10～20min，去上清，再依次用包涵体洗液2和包涵体洗液3重悬，冰浴磁力搅拌，离心去上清，最后将沉淀溶于20ml包涵体溶解液中，10000～12000g离心 30min，弃沉淀，得含有S1-E蛋白的包涵体。其中包涵体洗液1为50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA；包涵体洗液2为50mmol/L PB PH8.0， 100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，2％Triton X-100；包涵体洗液3为50mmol/L PB PH8.0，100mmol/L Nacl，5mmol/L EDTA，4mol/L尿素；包涵体溶解液为50mmol/L PB PH8.0，300mmol/L Nacl，20mmol/L咪唑，6mol/L尿素。

1.5.2由于S1-E蛋白的N-端带有6-His标签，可以通过Ni²⁺金属螯合层析进行S1-E蛋白亲和层析纯化，得纯化的S1-E蛋白。

1.6制备S1-E蛋白疫苗

称取50mg PLGA溶于1ml二氯甲烷中，然后再加入100μl丙酮，混匀；取 S1-E蛋白溶液，S1-E蛋白含量10mg；将两溶液两相混合，在冰水浴中，超声细胞破碎仪，40W，间断超声(每5s间断5s)，20次，形成W1/O乳液；配制2ml 20g/L聚乙烯醇(PVA)水溶液(溶于超纯水)，形成外水相W2；将W1/O 注入W2相，再次超声，条件同第3步，形成W1/O/W2复乳；将W1/O/W2乳液转移至50ml超纯水中，室温搅拌3～4h，使有机溶剂完全挥发，12000g 4℃高速离心15min，收集沉淀，超纯水洗3次；真空冷冻干燥，得到纳米级别的S1-E 疫苗颗粒，即为S1-E疫苗纳米颗粒，于4℃保存。

2、将本实施例制备的S1-E疫苗进行表征分析试验

2.1将本实施例制备的S1-E疫苗纳米颗粒进行SDS-PAGE电泳、载药量(LC) 和包埋比(ER)测定。LC(％)＝纳米颗粒中蛋白质的重量/纳米颗粒的重量100％ ER(％)＝纳米颗粒中蛋白质的重量/饲养蛋白的重量100％。进行SEM检测。

如图1所示，结果表明在3.6mm×10.0k SE下，S1-E疫苗呈椭圆形的胶囊样，完整的结构更能让抗原S1-E蛋白降解更缓慢。

2.2将本实施例制备的S1-E疫苗进行体外释放度检测

如图2所示，本实施例制备的S1-E疫苗纳米颗粒呈典型的双相释放模式。第一阶段为12h内的快速释放，释放率为27.2％；可能的原因是S1-E蛋白大多数附着在纳米颗粒表面或包裹在纳米表面蛋白中。在第二阶段，在12h后，扩散驱动的S1-E通过刚性PLGA核心不断释放。在48h时，S1-E疫苗的累积释放率达到66.98％的峰值，48h后，S1-E疫苗的累积释放率缓慢，但释放完全。结果表明，本发明制备的S1-E疫苗中的佐剂PLGA，有效降低了重组S1-E蛋白的降解速度。

2.3将本实施例制备的S1-E疫苗纳米颗粒进行粒径分布检测

如图3所示，本实施例制备的S1-E疫苗纳米颗粒大小为670±145nm，结果表明，本发明制备的S1-E疫苗的粒径较大，更容易引起免疫反应。

2.4将本实施例制备的S1-E蛋白疫苗颗粒进行Zeta电位检测

如图4所示，本实施例制备的S1-E疫苗纳米颗粒的Zeta电位值为-22.3± 6.89，Zeta电位的绝对值越大，颗粒粒子就越稳定。结果表明：本发明制备的 S1-E疫苗稳定性较高。

3、将本实施例制备的S1-E蛋白疫苗用于皮下免疫小鼠试验

将6-8周龄雌性BALB/c小鼠分为5组，每组8只小鼠。分别经鼻或肌注 40μg S1-E-PLGA疫苗颗粒、40μg S1-E蛋白、40μg S1-E弗氏佐剂、PBS+PLGA 40μg和200μL PBS免疫小鼠。将各种疫苗溶解在体积为200μL的PBS中。每次免疫前采集小鼠尾部静脉血样，分离血清进行抗体检测。血清样本在-20℃保存至使用。

间接ELISA法检测免疫小鼠血清中SARS-CoV-2特异性IgG抗体水平和抗体滴度和。以10μg/ml的S1或者E蛋白包被ELISA板，4℃过夜。用0.05％的 PBST洗三次，1％BSA-PBST封闭液封闭，室温孵育1h。0.05％PBST洗5遍，加入100μl稀释后的血清(1：1000稀释)，37℃孵育2h；PBST洗5遍，加入HRP- 羊抗小鼠IgG(1：100稀释)，100μl/孔，室温孵育1h；PBST洗5遍，加入200μl 底物液，室温避光孵育20分钟显色后，加50μl终止液终止，在OD 450nm读数。

如图5和图6所示：开始免疫时抗S1蛋白抗体和抗E蛋白抗体滴度。S1-E 蛋白疫苗组(P<0.05vs PBS)、S1-E-弗氏佐剂组(P<0.05)均产生抗S1抗体。初始免疫后0～6周，小鼠抗S1抗体和抗E抗体呈缓慢上升趋势。第6周(第三次接种)后，小鼠抗S1和抗E抗体均表现增加趋势。结果表明，本实施例提供的S1-E 疫苗免疫小鼠后，在小鼠体内诱生了高水平的SARS-CoV-2特异性血清IgG，显著高于S1-E蛋白组。

4、假病毒中和试验

将1.5×10⁴HEK-293T/ACE2细胞/well分离到培养板中，在37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养6h。血清在56℃水浴中灭活30min，用10％DMEM连续稀释样品血清。每个稀释度，60μl血清样本与相同的假病毒混合稀释MOI＝0.2和孵化的混合物在室温下60分钟。100μl孵化血清和假病毒添加到96孔细胞培养板,并设置-控制和空白的控制。72h后在荧光显微镜下观察细胞。采用 Reed-Muench法计算每个小鼠血清样品的EC50中和效价。

如图7所示，在第10周血清稀释10000倍仍然能检测到中和抗体。结果表明本实施例提供的S1-E疫苗产生了高滴度的中和抗体。

5、细胞因子检测

BALB/c小鼠脾细胞经70μm细胞滤器推脾，红细胞裂解，多次冲洗制备脾细胞。在37℃下，加入或不加入覆盖S1-E蛋白的15-氨基酸重叠肽，并加入 BD GolgiStopTM和BDgolgiplugtm以阻断细胞因子分泌，刺激细胞6h。在培养皿中刺激后，用FITC HamsterAnti-Mouse CD3e(克隆145-2C11,1:200稀释)、 APC Rat An-ti-Mouse CD4(克隆RM4-5，1:200稀释)和PE Rat Anti-Mouse CD8a (克隆53-6.7，1:200稀释)混合抗体对脾细胞进行洗涤和染色。用PBS洗一次后，细胞被Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)固定和渗透，用Perm/wash缓冲液洗涤(BD Biosciences，USA)，并用PerCP-CyTM5.5大鼠抗小鼠IL-2(克隆JES6-5H4,1:200稀释)和PerCP-CyTM5.5大鼠抗小鼠TNF(克隆MP6-XT22,1:200 稀释)染色。用Perm/Wash缓冲液和PBS依次洗涤细胞，并在PBS中重悬。每个样本至少收集了10000个事件。CD8⁺和CD4⁺T细胞依次由单细胞(FSC-A vs FSC-H)、淋巴细胞(FSC-A vs SSC-A)和活CD3⁺T细胞(CD3⁺vs近红外-)门控，检测结果定义为细胞因子阳性细胞占CD8⁺或CD4⁺T细胞的百分比。

如图8所示，在4周的独立小鼠S1-E、S1-E-PLGA、S1-E弗氏佐剂三组中，脾脏细胞CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞有TNF-α和IL-2显著变化。与PBS-PLGA 组相比，其他三组TNF-α+CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞(％)显著升高(P<0.001)。与PBS-PLGA组相比，其余三组IL-2⁺CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞显著升高(％)(P ≤0.001)。结果表明，在本发明的S1-E疫苗的刺激下，小鼠产生了强烈的细胞免疫应答。

综上所述，本实施例制备的S1-E疫苗能有效抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2 的生长，该疫苗能够有效预防感染新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，还可应用于药物组合。

在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南华大学

<120> 一种新型冠状病毒S1-E疫苗及其制备方法

<141> 2021-06-25

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1737

<212> DNA

<213> S1-E蛋白

<400> 1

atgtactcat tcgtttcgga agagacaggt acgttaatag ttaatagcgt acttcttttt 60

cttgctttcg tggtattctt gctagttaca ctagccatcc ttactgcgct tggtggtggt 120

ggttctggtg gtggtggttc tggtggtggt ggttctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 180

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 240

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 300

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 360

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 420

ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 480

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 540

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 600

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 660

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 720

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 780

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 840

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 900

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 960

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 1020

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 1080

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1140

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1200

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1260

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1320

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1380

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1440

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1500

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1560

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1620

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1680

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgttag 1737

<210> 2

<211> 673

<212> PRT

<213> S1亚基序列

<400> 2

Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr

1 5 10 15

Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg

20 25 30

Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser

35 40 45

Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr

50 55 60

Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe

65 70 75 80

Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr

85 90 95

Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr

100 105 110

Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe

115 120 125

Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu

130 135 140

Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser

145 150 155 160

Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn

165 170 175

Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr

180 185 190

Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe

195 200 205

Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr

210 215 220

Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly

225 230 235 240

Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly

245 250 255

Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr

260 265 270

Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys

275 280 285

Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser

290 295 300

Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile

305 310 315 320

Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala

325 330 335

Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp

340 345 350

Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr

355 360 365

Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr

370 375 380

Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro

385 390 395 400

Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp

405 410 415

Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys

420 425 430

Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn

435 440 445

Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly

450 455 460

Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu

465 470 475 480

Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr

485 490 495

Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val

500 505 510

Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn

515 520 525

Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn

530 535 540

Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr

545 550 555 560

Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr

565 570 575

Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr

580 585 590

Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val

595 600 605

Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr

610 615 620

Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly

625 630 635 640

Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala

645 650 655

Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala

660 665 670

Arg

<210> 3

<211> 75

<212> PRT

<213> E蛋白序列

<400> 3

Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser

1 5 10 15

Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala

20 25 30

Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn

35 40 45

Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn

50 55 60

Leu Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu Val

65 70 75

<210> 4

<211> 578

<212> PRT

<213> S1-E蛋白序列

<400> 4

Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser

1 5 10 15

Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala

20 25 30

Ile Leu Thr Ala Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

35 40 45

Gly Gly Gly Ser Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu

50 55 60

Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp

65 70 75 80

Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu

85 90 95

Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly

100 105 110

Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp

115 120 125

Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp

130 135 140

Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val

145 150 155 160

Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys

165 170 175

Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp

180 185 190

Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe

195 200 205

Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly

210 215 220

Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr

225 230 235 240

Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu

245 250 255

Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly

260 265 270

Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr

275 280 285

Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala

290 295 300

Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn

305 310 315 320

Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu

325 330 335

Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile

340 345 350

Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg

355 360 365

Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala

370 375 380

Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn

385 390 395 400

Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr

405 410 415

Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe

420 425 430

Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg

435 440 445

Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys

450 455 460

Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn

465 470 475 480

Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe

485 490 495

Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile

500 505 510

Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys

515 520 525

Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly

530 535 540

Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala

545 550 555 560

Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn

565 570 575

Lys Cys

Claims

1.一种新型冠状病毒S1-E疫苗，其特征在于：包括S1-E蛋白，所述S1-E蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒S1-E疫苗，其特征在于：所述S1-E蛋白的浓度为0.1-0.2mg/mL。

3.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒S1-E疫苗，其特征在于：所述S1-E蛋白由新型冠状病毒突刺蛋白S1亚基位点的受体结合域融合包膜蛋白E而成，所述S1亚基位点的受体结合域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述包膜蛋白E的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述S1-E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

4.一种如权利要求1所述的新型冠状病毒S1-E疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、合成S1-E蛋白的编码基因的核苷酸序列；

S2、将步骤S1得到的S1-E蛋白的编码基因克隆到质粒载体中；

S3、将步骤S2的质粒载体转化到表达系统；

S4、将步骤S3构建的表达系统的生物接种培养，进行重组S1-E蛋白表达，得到所述S1-E蛋白；

S5、提取纯化步骤S4得到S1-E蛋白；

S6、将步骤S5得到的高纯度的S1-E蛋白与佐剂混合孵育，形成稳定的混合物，沉淀、水洗和冻干，即得所述S1-E疫苗。

5.如权利要求3所述的一种新型冠状病毒S1-E疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述质粒载体包括质粒pET-28a。

6.如权利要求3所述的一种新型冠状病毒S1-E疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述表达系统包括原核表达系统、酵母表达系统、哺乳细胞和无细胞表达系统中的任意一种。

7.如权利要求6所述的一种新型冠状病毒S1-E疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述原核表达系统包括大肠杆菌；步骤S4中，将所述大肠杆菌的菌落接种于含卡那霉素的溶菌肉汤培养基中进行细胞培养，所述大肠杆菌的接种量为1～6％。

8.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒S1-E疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S5中的提取过程使用包涵体溶解液，所述包涵体溶解液包括Tris缓冲液、NaCl溶液和尿素，所述Tris缓冲液和NaCl溶液的摩尔浓度比为5:4，所述尿素的的摩尔浓度为8mol/L；所述纯化使用层析柱，所述层析柱为Ni²⁺金属螯合层析柱。

9.如权利要求1所述的一种新型冠状病毒S1-E疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S6中，所述佐剂包括PLGA，所述PLGA在所述S1-E疫苗中的终浓度为1-2mg/mL。