CN114933640A - 以SARS-CoV-2病毒包膜E蛋白为靶点的新冠疫苗 - Google Patents

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Abstract

以SARS‑CoV‑2病毒包膜E蛋白为靶点的新冠疫苗，涉及DNA疫苗和病毒载体疫苗领域。解决S蛋白易变异从而引起S蛋白相关疫苗接种可能缺少持续有效性等问题。由作为免疫原的SARS‑CoV‑2病毒的E蛋白序列C端脂膜外段对应的多肽，和辅助刺激机体产生免疫应答的佐剂所组成。E蛋白作为新靶点用于疫苗的研发，该E蛋白脂膜外段具有较强的免疫原性，可诱导机体产生IgM和IgG抗体，并与抗体进行结合，抗体结合位于病毒表面，实现抑制病毒的生物学功能，预防病毒感染；该E蛋白脂膜外段可作为SARS‑CoV‑2病毒疫苗靶点。该疫苗还可以与现有针对其他靶点的疫苗联合使用，增强现有新冠疫苗预防新冠病毒感染的能力。

Description

以SARS-CoV-2病毒包膜E蛋白为靶点的新冠疫苗
技术领域
本发明涉及新型冠状病毒疫情防控疫苗领域，尤其是涉及一种以SARS-CoV-2病毒包膜E蛋白为靶点的新冠疫苗。
背景技术
自COVID-19流行以来进行的研究和临床实践已经证明，对新冠肺炎有效的防控手段是疫苗接种。截至目前，无论是对COVID-19发病机制的研究、抑或疫苗研发，重点均在于病毒表面的棘突蛋白(Spike蛋白，即S蛋白)；而同样暴露于病毒膜外的包膜蛋白E，则较少被关注。已知新冠病毒的亚种“进化”主要是由S蛋白的或变异引起，也常引起对S蛋白相关疫苗接种是否持续有效的担忧1，促使科学家寻找更加稳定、有效的疫苗。
申请人实验证明新冠病毒的E蛋白在病毒脂膜上的走向并证实其在膜外片段可以诱导中和性抗体产生，在此基础上进一步提出：E蛋白可以作为新靶点用于疫苗的研发。目前已有的数据表明E蛋白序列在不同亚株间更加保守2,3，可以克服S蛋白易突变、导致疫苗保护效力降低等问题；且免疫位点预测程序预测E蛋白的脂膜外段具有B细胞表位决定簇，为E蛋白作为新的疫苗靶点提供有力的理论支持。应用电镜观察到在病毒表面，S蛋白三聚体的拷贝数平均为24±9拷贝4，远低于原先估计的数量(100拷贝)5；根据可靠的观察和计算，E蛋白的拷贝数更高(E蛋白五聚体约20拷贝)，因此如果作为疫苗诱导的抗体分子与病毒结合，效价比可能高于S三聚体。总之，以E蛋白胞膜外段多肽为免疫原制备疫苗，是抗新冠病毒感染的途径之一。
目前，针对各种传染病的疫苗都是针对病原体蛋白，包括各种DNA类病毒或RNA类病毒等病原体引起的疾病。而具体实现疫苗抗原递送的方式则可以是灭活病毒疫苗、编码疫苗抗原的RNA疫苗、或者由其他非致病性病毒改造重组后携带编码抗原蛋白的病毒，如腺病毒。为抗御新冠肺炎，在西方国家使用的主要是针对S亚单位的RNA疫苗、腺病毒载体编码的S蛋白疫苗；在我国，使用的则主要是灭活的新冠病毒疫苗等。
疫苗研发成功关键在于能否诱导出针对靶抗原的T细胞反应和B细胞反应，因此对靶抗原的选择关键在于包括有效的T细胞和B细胞表位，一般还需要佐剂辅助、可以诱导特定的免疫反应。在抗病毒免疫中，辅助型CD4+T细胞可以辅助抗体产生，而CD8+T细胞则可以直接产生抗病毒效应。有效的疫苗则应该包括能够诱导出CD4+Th细胞和B细胞活化的不同表位的组合。SARS-CoV-2作为一种RNA病毒，共含有四种结构蛋白，即棘突蛋白(Spikeprotein，S蛋白)、核体蛋白(Nucleoprotein,N蛋白)、膜蛋白(Membrane protein，M蛋白)和包膜蛋白(Envelope protein，E蛋白)。在研发针对SARS-CoV-2的疫苗中，最常用的靶点为S蛋白，主要原因在于S蛋白在病毒表面以三聚体的形式存在，被认为是病毒接触宿主细胞的主要结构。S蛋白全长含1273氨基酸，存在一个Furin酶切位点，将全长切分为S1和S2两个亚基：S1亚基包含一个受体结合域(Receptor binding domain，RBD)，与宿主细胞受体血管紧张素转化酶ACE2结合；S2亚基则介导病毒和宿主细胞膜之间的融合过程，包括RBD与受体结合后整个三聚体分子立体结构的转型。在感染SARS-CoV-2期间，S蛋白诱导的中和抗体和T细胞反应在机体的保护性免疫中起着关键作用6,7。
除S蛋白外，学者们也分析或检测其他结构蛋白作为疫苗靶点的可能性。核衣壳蛋白N蛋白长419氨基酸，在SARS-CoV-1中每个病毒颗粒约含1000拷贝(在SARS-CoV-2中未知)，是冠状病毒的蛋白质中含量(质量)最高者之一8，具有高度免疫原性，其氨基酸序列在不同株系之间保守性高，可用以开发T辅助细胞疫苗成分，但因其存在于病毒内，难以被杀伤性T细胞和中和抗体接近，所以只能用于诱导辅助型(Th)细胞反应、协助效应性疫苗(杀伤性Tc疫苗或抗体疫苗)发挥作用9,10。
M蛋白长为222氨基酸，在病毒表面约2000个拷贝，所以总质量与N蛋白相近。与N蛋白在病毒内部不同，M蛋白分布在膜上，其中N段19个氨基酸位于病毒脂膜外侧，经过三个跨膜区，C段位于病毒内部。M蛋白的主要功能在于稳定病毒脂膜结构，并与E蛋白一道调控病毒在宿主细胞内的组装和释放。有证据表明M蛋白可以在免疫动物中诱导高滴度的抗体反应11,12。然而，目前尚无针对M蛋白的疫苗研发报道。
相对于上述三种蛋白，由于E蛋白较短(仅75氨基酸)，目前对SARS-CoV-2之E蛋白的生物学或免疫学特征研究的报道很少，但SARS-CoV-1与SARS-CoV-2的E蛋白之间同源性很高，所有部分关于SARS-CoV-2E蛋白的知识来自既往对SARS-CoV-1甚至其他冠状病毒的研究和认识。
基于以往对其他冠状病毒E蛋白的功能分析，提示E蛋白是病毒毒力因子的重要成分，对其进行突变或缺失可以降低病毒的毒力，主要机理在于E蛋白涉及病毒生命周期的多个方面，与其他三种结构蛋白(M、N和S)一起完成病毒脂膜构建、病毒颗粒组装和从宿主细胞释放13-17。对冠状病毒的基因组分析表明，所有SARS病毒的E蛋白都保留其关于发病机制的关键基序，相对于其他蛋白其保守性更强18；对包膜E蛋白的氨基酸组成序列进行生信分析，提示E蛋白为跨膜蛋白，含有单个跨膜区(第11-38位氨基酸，也有文献预测跨膜区为17-37位氨基酸)，但其在脂质膜上的走向即N端至C端的跨膜方向，不同的预测软件所预测的结果不同、甚至截然相反。特别是，多数软件是以细胞内的ER/GOLGI/ERGIC作为天然脂膜的模型进行预测19，部分研究工作则以人工双层脂膜为模型20-22，均无法反映完整SARS-CoV-2病毒的脂膜的真实情景。但至少有一点肯定的是，根据构像模拟或实验结果，目前一般认为E蛋白在脂膜上形成五聚体结构，作为一种离子通道Viroporin发挥作用23，并可以作为药物研发的靶点24；但在病毒的脂膜上，该五聚体的方向如何，尚没有报道；因此，依靠计算机模拟预测或从人工脂膜上筛选的能够干预五聚体的化合物，是否会对完整的病毒发挥作用，也不得而知。Abdelmageed曾应用VaxiJeN软件分析新冠病毒四种结构蛋白的抗原性，认为E蛋白同具抗原性、可以用于设计基于T细胞表位的疫苗25。但同样地，该五聚体在病毒脂膜上的方向，将决定E蛋白诱导的免疫效应分子(如抗体)或效应细胞(如CD8+细胞毒细胞)能否接触到E抗原并发挥阻断作用。迄今为止，未见任何采用E蛋白在病毒脂膜上的走向或进行疫苗研发的实验研究报道。
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发明内容
本发明的目的在于寻找现有疫苗之外的新靶点和新技术。解决现有技术对COVID-19发病机制的研究、疫苗研发的重点均在于病毒表面的棘突蛋白即S蛋白，而S蛋白易变异从而引起S蛋白相关疫苗接种可能缺少持续有效性等问题，提供一种以SARS-CoV-2病毒包膜E蛋白为靶点的新冠疫苗。
一种SARS-CoV-2病毒的E蛋白脂膜外段的多肽，其特征在于该多肽截取于SARS-CoV-2病毒的E蛋白序列C端脂膜外段38氨基酸，该脂膜外段具有B细胞表位决定簇；
所述脂膜外段对应的多肽序列为：RLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV。
一种SARS-CoV-2病毒的E蛋白脂膜外段的多肽作为SARS-CoV-2病毒疫苗靶点的应用。
一种SARS-CoV-2病毒的E蛋白脂膜外段的多肽在制备预防COVID-19新型冠状病毒肺炎疫苗中的应用。
一种以SARS-CoV-2病毒包膜E蛋白为靶点的新冠疫苗，由作为免疫原的SARS-CoV-2病毒的E蛋白序列C端脂膜外段对应的多肽和辅助刺激机体产生免疫应答的佐剂所组成。
所述佐剂包括但不限于含CpG基序的的寡核苷酸、非完全弗氏佐剂、铝佐剂、油乳佐剂或壳聚糖中的一种或多种结合使用。
所述含CpG基序的寡核苷酸佐剂成分包括但不限于：
CpG-1826：5-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3
CpG-1018：5-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3
GP-CpG-2018A：5-TCGTCGTTTGTCGTTTGACGTT-3
GP-CpG-2018B：5-TCGTCGTTTGACGTTTCGTTTG-3。
一种以SARS-CoV-2病毒包膜E蛋白为靶点的新冠疫苗的制备方法，具体步骤为：依次加入溶剂、10～200uL佐剂、10～100μmoL E多肽，利用超声波粉碎器反复乳化至完全乳化。
所述溶剂包括但不限于PBS或0.9％生理盐水。
实验表明，该E蛋白脂膜外段具有较强的免疫原性，可诱导机体产生IgM和IgG抗体，并与抗体进行结合，抗体结合位于病毒表面，实现抑制病毒的生物学功能，预防病毒感染；因此，该E蛋白脂膜外段可作为SARS-CoV-2病毒疫苗靶点。
与现有技术相比，本发明具有以下突出的技术效果和优点：
目前无论是对COVID-19发病机制的研究、抑或疫苗研发，重点均在于病毒表面的棘突蛋白即S蛋白；而S蛋白的变异常引起对S蛋白相关疫苗接种是否持续有效的担忧。本发明实验证明新冠病毒的E蛋白可以在动物和人体诱导抗体产生，并证明E蛋白在病毒脂膜上的走向，证实其在包膜外片段可以诱导中和性抗体产生，在此基础上进一步提出E蛋白可以作为新靶点用于疫苗的研发，即以E蛋白胞膜外段多肽为免疫原制备疫苗，作为抗新冠病毒感染的途径之一，为针对E蛋白设计免疫原用于制备疫苗奠定基础。除单独使用外，该疫苗还可以与现有针对其他靶点的疫苗联合使用，增强现有新冠疫苗预防新冠病毒感染的能力。
附图说明
图1为抗E蛋白脂膜外段多肽之抗体可结合完整灭活病毒颗粒表面图。
图2为IEDB程序预测E蛋白的免疫表位图(共41条，即下划线片段)。
图3为E蛋白脂膜外段多肽可诱导小鼠的外周血清产生以IgM和IgG2a类别为主的抗E蛋白脂膜外段的抗体。
图4为接种SARS-CoV-2灭活病毒疫苗的个体产生主要以IgM和IgG1类别为主的抗E蛋白脂膜外段的抗体。
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
本发明实施例用实验证实E蛋白在病毒包膜上采取N端在内C段在外的走向，并用多种免疫位点预测程序预测E蛋白的脂膜外段具有B细胞表位决定簇，在实验中初次证实接种新冠灭活病毒疫苗的个体外周血清中存在抗E蛋白脂膜外段的抗体，抗体以IgM和IgG1类别为主。并且用E蛋白脂膜外段免疫小鼠同样可以诱导其产生抗E蛋白脂膜外段的抗体，抗体以IgM和IgG2a类别为主。表明应用E多肽之脂膜外段可以诱导抗E脂膜外段的抗体。当抗体结合位于病毒表面，将可抑制病毒的生物学功能、达到预防病毒感染的目的。
以SARS-CoV-2病毒包膜E蛋白为靶点的新冠疫苗，由作为免疫原的SARS-CoV-2病毒的E蛋白序列C端脂膜外段对应的多肽，和辅助刺激机体产生免疫应答的佐剂所组成。本发明还提供所述新冠疫苗的制备方法，具体步骤为：依次加入溶剂、10～200uL佐剂、10～100μmoL E多肽，利用超声波粉碎器反复乳化至完全乳化。
该免疫佐剂包括但不限于含CpG基序的的寡核苷酸、非完全弗氏佐剂、铝佐剂、油乳佐剂或壳聚糖中的一种或者多种结合使用；所用溶剂包括但不限于PBS或0.9％生理盐水。
所述SARS-CoV-2病毒的E蛋白序列C端脂膜外段对应的多肽截取于SARS-CoV-2病毒的E蛋白序列C端脂膜外段38氨基酸，该脂膜外段具有B细胞表位决定簇；
所述脂膜外段对应的多肽序列为：RLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV；
所述含CpG基序的寡核苷酸佐剂成分可包括但不局限于公开报道的CpG-1826(序列为5-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3)、CpG-1018(序列为5-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3)或苏州吉玛基因股份有限公司的专利序列GP-CpG-2018A(序列为5-TCGTCGTTTGTCGTTTGACGTT-3)、GP-CpG-2018B(序列为5-TCGTCGTTTGACGTTTCGTTTG-3)等。
实验表明，该E蛋白脂膜外段具有较强的免疫原性，可诱导机体产生IgM和IgG抗体，并与抗体进行结合，抗体结合位于病毒表面，实现抑制病毒的生物学功能，预防病毒感染；因此，该E蛋白脂膜外段可作为SARS-CoV-2病毒疫苗靶点。
实施例1：免疫荧光证明包膜E蛋白C端在病毒胞膜外
首先应用SARS-CoV-2病毒E蛋白脂膜外段序列多肽及M蛋白脂膜外段序列多肽免疫小鼠以便获得抗E多肽和M多肽抗体。具体地：
合成E蛋白脂膜外段对应的多肽(RLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV)18.18/90.9μmol加入CpG-1826-DNA(20μg)和非完全佐剂(100μL体积)；
合成M多肽脂膜外段(MADSNGTITVEELKKLLEQ)18.18/90.9μmol加入CpG-1826-DNA(20μg)和非完全佐剂(100μL体积)；
乳化后小鼠足底及颈背部皮下注射，可以诱导抗E多肽和M多肽抗体的产生。
为证实多肽免疫后诱导的抗血清抗体可以结合于完整病毒，该血清可以用作后续检测的一抗，进行验证，方法如下。常规培养过表达ACE2的293T细胞，用0.25％胰酶消化后收获，离心去上清，加入4％多聚甲醛固定30min，用PBS缓冲液洗2遍；与灭活的SARS-CoV-2病毒(北京科兴中维Vero细胞来源新冠疫苗)以细胞︰病毒＝1︰1000的比例混合后于室温下孵育1h，用PBS洗去未结合的灭活病毒；分别用Triton X-100处理30min或不处理，然后用PBS洗3遍；用抗核衣壳蛋白抗体(浓度2μg/ml，100μL/管)及抗M蛋白的抗血清(1︰25稀释，100μL/管)作对照，对粘附于ACE2-293t细胞的灭活新冠疫苗病毒颗粒进行染色，室温孵育1h后PBS洗3遍；加入488标记的羊抗鼠IgG抗体作为二抗，室温避光孵育1h，加入PBS缓冲液洗涤3遍，DAPI封片剂封片；荧光显微镜下观察。结果显示，抗E多肽抗体可以结合于病毒表面(图1)，说明E蛋白脂膜外段不但具有免疫原性，且存在于完整病毒上的E蛋白脂膜外段可与其抗体进行结合，因此作为本发明的作用靶点。
实施例2：包膜E蛋白免疫表位分析
将SARS-CoV-2包膜E蛋白序列(YP_009724392.1：
MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV)输入Immune Epitope DataBase and Analysis Resource网站(https:// www.iedb.org)搜索板块，选用多种表位预测模式。图2给出IEDB程序预测E蛋白的免疫表位图(共41条，即下划线片段)。反馈的搜索结果共包含41个可能表位，除去N端及跨膜区(前37氨基酸)与C端38氨基酸之间重叠的可能表位外，前半部分含14个可能表位，而后半部分含21个表位，且其中15个表位包括Y57V58，提示围绕该位点的片段具有较强的免疫原性。
实施例3：E蛋白之合成多肽片段免疫小鼠可以诱导抗E抗体产生
合成SARS-CoV-2病毒E蛋白脂膜外段序列(RLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV-HHHHHH)对应的多肽，并合成用作佐剂含CpG-1826基序的寡核苷酸(CpG-1826，序列5-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3)。设计不同剂量E多肽混合后加CpG-1826-DNA、非完全弗氏佐剂(IFA)乳化后，小鼠足底及颈背部皮下注射，不同时间后分别采集血清、测定抗体水平。
免疫程序：分别设置3个组，包括空白对照组；E多肽(18.18μmol)+IFA(100μL)+CpG-1826(20μg)；5倍E多肽(90.9μmol)+IFA(100μL)+CpG-1826(20μg)。依次加入试剂PBS、CpG-1826、多肽、IFA，利用超声波粉碎器反复乳化共30min(乳化10～15s，然后静置冰中lmin左右)可完全乳化。然后进行小鼠免疫，采用多点注射方法，脚掌及颈背部皮下注射，每只脚掌20μL；背部皮下每侧注射60μL。初免3周后，尾静脉采血，行加强免疫(E多肽(9.09μmol)+IFA(100μL)，无CpG-1826)。二次免疫后3周进行第三次免疫(E多肽(9.09μmol)+IFA(100μL)，无CpG-1826)。第三次免疫后1月杀小鼠，制备外周血血清用于检测抗体。
抗体检测方法：用1μg/ml(约0.0067μM)的anti-HisTag antibody溶解于磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2-7.4)中，50μL/well加入到96孔板中，在室温下包被过夜。结束后用PBS-Tween20(0.1％)洗涤1次。5％脱脂牛奶在室温下封闭2h，200μL/well，随后洗涤1次。E(0.07μM)in PBS(50μL/well)加入到96孔板中，在室温下孵育1h。随后洗涤4次。稀释的小鼠血清(1︰50)以50μL/well in PBS加入在室温下孵育1h。随后洗涤4次。加入二抗(1︰5000稀释inPBS),50μL/well,在室温下孵育1h，随后洗涤4次。加TMB显色液(100μL/well)，在370nm处检测OD值。
主要结果：二次免疫之后，小鼠血清中的抗体滴度均不高，只有高剂量E多肽免疫组存在一定滴度的IgM，而IgG2a、IgGb与对照组没有显著差异(图3上)。第三次免疫后，部分小鼠中IgM和IgG抗体均有显著增加，但各组内不同小鼠间表现出显著异质性(图3下)。
实施例4：SARS-CoV-2灭活病毒疫苗免疫个体产生抗E蛋白脂膜外段抗体
根据抗疫政策要求，申请人所在医院多数医务人员接种“新型冠状病毒灭活疫苗(Vero细胞)”(北京生物制品研究所有限责任公司)。经伦理委员会批准和知情同意，从七位志愿者完成第一剂接种18天后和六位志愿者完成第二剂接种后2周左右分别收取血清，并以两位未接种者之血清作为对照，检测其中抗S蛋白、M多肽和E多肽抗体水平。
蛋白多肽包括：
STrimer蛋白，携带6xHis标签(近岸蛋白产品)；
M蛋白脂膜外段多肽：序列为MADSNGTITVEELKKLLEQ-HHHHHH；
E蛋白脂膜外段多肽：RLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV-HHHHHH。
抗体检测方法：血清用PBS进行梯度稀释(1︰25、1︰50、1︰100)，包被ELISA板过夜后，封闭2h。多肽分子(0.07μM in PBS/5％FBS，STrimer约5μg/mL)加至各孔中(50μL/well)。60min后洗去未结合分子，用PBS-Tween20(0.1％)洗两遍。加入HRP标记的anti-His(2μg/mL×50μL/well)，室温60min，弃去缓冲液，用PBS-Tween20(0.1％)洗两遍，加入TMB反应液，10min后开始测OD值。
主要结果：七位志愿者在初次疫苗接种18天后，血清中均能检测到抗S蛋白、抗M多肽、抗E多肽的总抗体(图4上)。六位志愿者第二次免疫后，血清中均存在抗E多肽的IgM抗体，部分志愿者(3位)存在抗E多肽的IgG1抗体，仅有以为存在抗E多肽的IgG2抗体(图4下)。
本发明实验证明E蛋白可以在动物和人体诱导抗体产生，并证明E蛋白在病毒脂膜上的走向，为针对E蛋白设计免疫原用于制备疫苗奠定基础。
序列表
<110> 厦门大学附属翔安医院
<120> 以SARS-CoV-2病毒包膜E蛋白为靶点的新冠疫苗
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 38
<212> PRT
<213> 2019新型冠状病毒(Human coronavirus)
<400> 1
Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn Val Ser Leu Val Lys
1 5 10 15
Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn Leu Asn Ser Ser Arg
20 25 30
Val Pro Asp Leu Leu Val
35
<210> 2
<211> 19
<212> PRT
<213> 2019新型冠状病毒(Human coronavirus)
<400> 2
Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Leu Glu Gln

Claims (8)

1.一种SARS-CoV-2病毒的E蛋白脂膜外段的多肽，其特征在于该多肽截取于SARS-CoV-2病毒的E蛋白序列C端脂膜外段38氨基酸，该脂膜外段具有B细胞表位决定簇；
所述脂膜外段对应的多肽序列为：RLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV(序列表中的SEQ ID No.1)。
2.如权利要求1所述一种SARS-CoV-2病毒的E蛋白脂膜外段的多肽作为SARS-CoV-2病毒疫苗靶点的应用。
3.如权利要求1所述一种SARS-CoV-2病毒的E蛋白脂膜外段的多肽在制备预防COVID-19新型冠状病毒肺炎疫苗中的应用。
4.一种以SARS-CoV-2病毒包膜E蛋白为靶点的新冠疫苗，其特征在于其由作为免疫原的SARS-CoV-2病毒的E蛋白序列C端脂膜外段对应的多肽和辅助刺激机体产生免疫应答的佐剂所组成。
5.如权利要求4所述一种以SARS-CoV-2病毒包膜E蛋白为靶点的新冠疫苗，其特征在于所述佐剂包括但不限于含CpG基序的的寡核苷酸、非完全弗氏佐剂、铝佐剂、油乳佐剂或壳聚糖中的一种或多种结合使用。
6.如权利要求5所述一种以SARS-CoV-2病毒包膜E蛋白为靶点的新冠疫苗，其特征在于含CpG基序的寡核苷酸佐剂成分包括但不限于：
CpG-1826：5-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3
CpG-1018：5-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3
GP-CpG-2018A：5-TCGTCGTTTGTCGTTTGACGTT-3
GP-CpG-2018B：5-TCGTCGTTTGACGTTTCGTTTG-3。
7.如权利要求4所述一种以SARS-CoV-2病毒包膜E蛋白为靶点的新冠疫苗的制备方法，其特征在于其具体步骤为：依次加入溶剂、10～200uL佐剂、10～100μmoL E多肽，利用超声波粉碎器反复乳化至完全乳化。
8.如权利要求7所述一种以SARS-CoV-2病毒包膜E蛋白为靶点的新冠疫苗的制备方法，其特征在于所述溶剂包括但不限于PBS或0.9％生理盐水。
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