CN116874600A - 来自纳米抗体可靶向cd163受体的短肽的制备方法及其应用 - Google Patents

来自纳米抗体可靶向cd163受体的短肽的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学及生物医学技术领域，旨在提供一种来自纳米抗体可靶向CD163受体的短肽的制备方法及其应用。所述短肽是以截取自纳米抗体的CDR3肽段作为靶向肽，经与人工合成的纳米颗粒mi3的N端连接而获得，CDR3肽段能够多拷贝地展示在mi3的表面；所述短肽包括如SEQ ID NO.14～18中任意一项所示的氨基酸序列，对应地编码所述氨基酸序列的核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO.8～12所示。本发明提出从纳米抗体中获取能够靶向CD163受体的短肽的开发策略，该靶向肽能够实现与CD163受体进行特异性的结合、促进一些分子进入细胞，如纳米颗粒mi3和PCV2Cap、并具备抗病毒和抗炎症的功效；为针对CD163受体的靶向肽的开发提供了新的视角，也为同类靶向肽的开发提供了一个新的平台。

Description

来自纳米抗体可靶向CD163受体的短肽的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学及生物医学技术领域，具体涉及天然纳米抗体库的构建，CD163(SRCR5-9)蛋白纳米抗体的筛选和靶向肽的制备和功能评价的方法。
背景技术
CD163分子是在巨噬细胞上表达的I型跨膜糖蛋白，是清道夫受体富含半胱氨酸超家族(SRCR)B类的成员。它由九个细胞外SRCR结构域(SRCR1-9)、一个跨膜片段和一个细胞内结构域组成。CD163受体主要表达于巨噬细胞上，可作为巨噬细胞的特异性表征物，也可在绿猴肾细胞系(MA-104和MARC-145)的表面表达，多用于体外的研究。CD163为模式识别受体，能够与广泛的配体相结合。例如，作为肿瘤坏死因子(TNF)样弱诱导剂(TWEAK)、血红蛋白-haptoglobin复合物、细菌和病毒等病原体、以及红细胞粘附的受体。作为噬菌体的重要标志物，CD163分子在生物医学领域受到了广泛的关注。尤其是其有限的表达模式和内化潜力使CD163成为了细胞靶向免疫和治疗的有吸引力的途径。例如，抗体-药物结合物(ADC)靶向CD163，已经成为了治疗炎症和肿瘤的重要策略。与此同时，CD163在兽医学领域也同样被广泛研究。猪生殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)困扰猪业30多年，并造成了巨大的经济损失。CD163已经被确认为PRRSV感染的基本受体，PRRSV的糖蛋白(GP2、GP3、GP4和GP5)能够与宿主的CD163受体相互作用，介导病毒入侵细胞。研究表明，可以通过干扰CD163与病毒糖蛋白之间的相互作用来阻止病毒入侵细胞。
纳米抗体(Nb)是一种单域抗体，来源于骆驼科动物血清中天然存在的重链抗体(HCAbs)。HCAbs的抗原结合部分局限于单个结构域，称为HCAb(VHH)重链的可变结构域。即纳米抗体仅含重链而缺乏轻链和重链中的第一个恒定CH1结构域，这就导致其尺寸减小。Nb被认为是抗体中最小的抗原结合单位，其可变抗原结合结构域具有多种环状结构，并表现出具有高特异性和亲和力的抗原结合能力。Nb由四个保守框架区域(FR1-FR4)和三个可变抗原结合回路(CDR1、CDR2、CDR3)组成，其中CDR3是确定识别和相互作用的主要位置，而CDR1和CDR2有助于结合强度和框架区域经常涉及的抗原相互作用。与传统的经典抗体相比，纳米抗体具有更多的优势和更好的发展前景，因此近年来得到了广泛的开发和应用。许多出版物都已经描述了针对感兴趣的抗原生成VHH库，迄今为止描述的绝大多数分离的纳米抗体都是使用相同的程序，即选择显示从免疫骆驼科中提取的VHH的噬菌体库。在应用上，Nb主要用于肿瘤的诊断和治疗。与ADC类似，纳米体-药物共轭物(NDC)可以通过连接器将纳米体与药物结合，从而选择性地杀死肿瘤细胞。
CD163的靶向研究一直备受关注，目前更多的使用单克隆抗体作为配体靶向CD163。如ADC靶向CD163的研究中，该复合物由CD163的单克隆抗体通过化学连接器与药物结合。ADC与巨噬细胞表面的CD163结合，触发共轭体的内吞作用，使药物在细胞内发挥其功能。然而，类似于单克隆抗体这类常规抗体有物理尺寸大，不易合成，免疫原性和毒性较高，不易与纳米载体结合等缺陷，这些特征严重阻碍了其在靶向受体上的研究与应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种来自纳米抗体可靶向CD163受体的短肽的制备方法及其应用，能够起到靶向CD163受体、促进内化、起到抗病毒和抗炎症反应的功效。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种来自纳米抗体可靶向CD163受体的短肽，包括如SEQ ID NO.14～18中任意一项所示的氨基酸序列。
本发明进一步提供了对应地编码所述SEQ ID NO.14～18所述氨基酸序列的核苷酸序列，分别依次如SEQ ID NO.8～12所示。
作为本发明的优选方案，所述短肽是以截取自纳米抗体的CDR3肽段作为靶向肽，经与人工合成的纳米颗粒mi3的N端连接而获得；CDR3肽段能够多拷贝地展示在mi3的表面，组装后的产物命名为mi3-PTC；
其中，纳米抗体(Nb)的编码序列如SEQ ID NO.1～7中的任意一项所示；纳米颗粒mi3的编码序列如SEQ ID NO.13所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；而截取Nb1～4和Nb7的CDR3与mi3的N段连接而获得的mi3-PTC1～5的编码序列如SEQ ID NO.8～12所示。
本发明进一步提供了前述短肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建纳米抗体文库
从未免疫的羊驼血液中提取RNA并反转录成cDNA，将此段cDNA作为模板，经过两轮PCR得到VHH片段纳米体；利用同源重组的方式将VHH片段克隆到噬菌粒pCANTAB5e载体上，并转化到感受态细胞TG1内，涂板后收集板上所有的单克隆，建成纳米抗体文库；
(2)CD163重组蛋白的表达与纯化
利用杆状病毒表达系统表达和纯化CD163(SRCR5-9)蛋白；
(3)生物淘选和噬菌体ELISA筛选CD163特异性纳米抗体
用M13辅助噬菌体感染建好的VHH库，获得表面展示Nb的噬菌体；以CD163SRCR5-9蛋白作为包被原，噬菌体作为抗体进行3-5轮抗体淘筛，鉴定可能的阳性噬菌体；对ELISA鉴定阳性的噬菌体进行测序，获得纳米抗体序列；
(4)纳米抗体的表达与纯化
将纳米抗体序列克隆到PET30a表达质粒中，进行原核表达，并纯化纳米抗体；
(5)间接酶联免疫吸附法和免疫荧光检测纳米抗体的抗原特异性结合能力；
包被CD163 SRCR5-9蛋白，用纯化的纳米抗体进一步进行ELISA鉴定；并以纳米抗体为一抗，对表达CD163受体的Marc-145细胞系进行IFA检测，纳米抗体能够与CD163特异性结合；
(6)靶向肽蛋白的构建、表达与纯化
选择特异性和结合性最强的纳米抗体，截取具备结合功能的CDR3肽段制成靶向肽，并连到人工合成的纳米颗粒mi3的N端，克隆到原核表达载体PET30a上，并通过大肠杆菌表达系统表达和纯化mi3-PTC蛋白；
(7)免疫荧光检测mi3-PTC的抗原特异性结合能力
以mi3-PTC为一抗，对表达CD163受体的Marc-145细胞系进行IFA检测，mi3-PTC能够与CD163受体特异性结合。
本发明还提供了前述短肽在在制备促进纳米颗粒进入细胞内部的试剂中的应用(如人工合成的自组装蛋白纳米颗粒mi3和猪环状病毒Cap内化)；以及在制备用于防治猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)感染的药物或抗炎症的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的技术效果是：
1、本发明提出了从纳米抗体中获取能够靶向CD163受体的短肽的开发策略，该靶向肽能够实现与CD163受体进行特异性的结合、促进一些分子进入细胞，如纳米颗粒mi3和PCV2 Cap、并具备抗病毒和抗炎症的功效。
2、本发明为针对CD163受体的靶向肽的开发提供了新的视角，也为同类靶向肽的开发提供了一个新的平台。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为纳米抗体文库构建与抗原表达结果图。
图中：A代表纳米抗体第一轮PCR结果图；B代表纳米抗体第二轮PCR结果图；C代表纳米抗体文库菌落PCR结果图；D代表CD163(SRCR5-9)蛋白制备的SDS-PAGE电泳图。
图2为CD163(SRCR5-9)蛋白纳米抗体的筛选和测序结果图。
图中：A代表5轮噬菌体ELISA淘筛的噬菌体抗体投入量、输出量及回收率等指标的汇总表，B代表随机48个噬菌体克隆噬菌体ELISA结果，C代表七个CD163特异性纳米抗体的氨基酸序列。
图3为Nb1～7的表达与纯化结果图。
图中：A代表Nb1～7的表达和纯化SDS-PAGE结果，B代表Nb1～7的蛋白质印迹结果。
图4为7个Nbs与CD163蛋白的特异性结合能力鉴定结果图。
图中：A和B代表Nb1～7与CD163受体结合能力鉴别的间接ELISA结果，C代表Nb1～7与CD163受体特异性结合的免疫荧光鉴定结果。
图5为靶向肽蛋白的氨基酸序列和mi3-PTCs的构建。
图中：A代表PTC1～5的氨基酸序列，B代表mi3-PTCs和mi3的构建。
图6为靶向肽蛋白mi3-PTC～5和mi3的表达与纯化结果图。
图中：A代表mi3-PTC1～5和mi3的SDS-PAGE结果，B代表mi3-PTC1～5和mi3的蛋白质印迹结果。
图7为检测mi3-PTC1～5特异性结合CD163能力的免疫荧光结果图。
图8为检测mi3-PTC1～5内化细胞能力的效果分析。
图中：A代表检测mi3-PTC1～5促进内化的免疫荧光结果，B代表对应的共聚焦检测结果。
图9为免疫荧光检测mi3-PTC1～5抗PRRSV的功能结果图。
图10为检测Cap-PTC2调控炎症反应的结果图。
图中：A代表检测Cap和Cap-PTC2内化的免疫荧光结果，B代表qPCR检测Cap-PTC2对细胞内炎症相关细胞因子的调控结果。
具体实施方式
纳米抗体相对常规抗体的尺寸小，易于合成且具备高亲和性与特异性，是一种可代替的方法。现有技术尚未见到关于针对CD163受体的纳米抗体的报道。本发明通过构建天然的纳米抗体库，筛选到了针对CD163的纳米抗体，具有在抗PRRSV上的功效。为了进一步优化该技术，制成尺寸更小、特异性更强的CD163配体，本发明通过将筛选到的纳米抗体截短，只留取它能够与CD163结合的功能段，即CDR3肽段。CDR3肽段仅有13-21个氨基酸，是与CD163相互作用的部位，是具备靶向与携带功能的最佳配体。现有类似研究工作，通常鲜少对配体本身的功能进行研究，仅注重其靶向和内化能力。与此不同的是，本发明还探讨了该短肽本身的功能性。而这项研究中，除了上述重要作用外，更进一步的探讨了该短肽内化细胞后对炎症和病毒感染方面的作用。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1CD163(SRCR5-9)蛋白纳米抗体的筛选与鉴定
1)纳米抗体文库的构建和CD163重组蛋白的表达
从9只未接种疫苗的羊驼身上采集约450毫升的血液。采用PBMC分离试剂盒提取外周血单核细胞(PBMC)，并保存在-80℃。使用RNeasy Plus迷你试剂盒(Qiagen)提取总RNA，并使用具有Oligo-dT引物的逆转录酶M-MLV(TaKaRa)合成第一链cDNA。编码VHH和VH的cDNA从第一链反应中特异性扩增。所得聚合酶链反应(PCR)产物包括VHCH1-CH2外显子的900bp片段和VHH-CH2外显子的600bp片段。收集600bp片段作为模板，用引物VHH-up和VHH-down重新扩增VHH片段。从凝胶中提取所得的400bpVHH片段，并通过商业凝胶提取试剂盒(OMEGA)纯化。使用重组酶将VHH片段克隆到噬菌体pCANTAB5e上，并转化到感受态细胞(TG1)内，涂板后，次日收集板上所有的单克隆，加入甘油，在-80℃下储存，即得到了VHH文库。同时，对CD163重组蛋白进行了表达和纯化。将截短CD163 SRCR5-9片段插入转移载体pFBD的EcoRI和XhoI位点。根据制造商的说明，随后使用Bac-to-Bac系统生成重组杆状病毒。Sf9昆虫细胞在SF900 III SFM中培养，然后接种重组杆状病毒(MOI＝1)。在感染后96小时后，将培养物以12，000rpm离心30分钟，并使用Ni-NTA亲和柱纯化蛋白质。
成功构建纳米抗体文库。如图1A所示，第一轮PCR后，分离900bp和600bp片段。其中，900bp片段是VH-CH1-CH2外显子，600bp片段是VHH-CH2外显子。图中泳道1-2(900bp)的上条带代表经典Abs的Leader-VH-CH1-Hinge-CH2区域，泳道1-2中的下条带(600bp)代表HCAbs的Leader-VHH-Hinge-CH2区域。回收600bp片段并进行第二轮PCR以获得400bp片段(即VHH片段)(图1B)。将400bp的片段插入M13噬菌体基因组以构建VHH文库。收集文库细菌后，对涂有不同稀释液的平板上的单个菌落进行计数，计算出的文库丰度为1×107cfu/mL。随机选择24个重组VHH文库菌落进行菌落PCR鉴定，电泳结果显示重组率为100％(图1C)。CD163重组蛋白被成功纯化。如图1D所示，泳道1代表孵育后流通样品，泳道2代表25mM咪唑洗脱液，泳道3代表500mM咪唑洗脱液。M表示170kDa蛋白标志物。CD163蛋白的分子大小约为70kDa。
2)通过生物淘选和噬菌体ELISA筛选CD163特异性纳米抗体
用M13辅助噬菌体感染建好的纳米抗体文库，获得表面展示Nb的噬菌体。并以CD163 SRCR5-9蛋白作为包被原，噬菌体作为抗体进行3-5轮抗体淘筛。具体操作为：将构建好的VHH噬菌体展示文库接种到2xTYA(2xTY补充有100μg/mL氨苄青霉素)中，由1×108个独立克隆组成的M13辅助噬菌体感染，以获得VHH拯救噬菌体(说明：只有在M13辅助噬菌体存在的情况下，连有VHH片段的噬菌粒才能转化为具备功能性的噬菌体，称为拯救噬菌体。而加入辅助噬菌体之前连有VHH片段的噬菌粒被困在TG1菌内，只有加入辅助噬菌体它们才内从TG1内出来，转变为噬菌体)。免疫管(Maxisorp)涂有真核表达的CD163 SRCR5-9蛋白(5μg/mL)，在Na2CO3缓冲液(0.05N，PH＝9.6，2mL/管)中稀释过夜，在4℃下过夜，PBS作为对照。第二天，用PBS洗涤3次并用含有0.1％酪蛋白酸盐的PBS在37℃下封闭2小时后，然后用PBS洗涤3次，加入1×108PFU拯救噬菌体并在室温下孵育2h。用PBS'T洗涤6次，然后用PBS洗涤3次后，将指数生长期新鲜培养的大肠杆菌TG1加入免疫管中，并在室温下孵育10分钟以洗脱特定的噬菌体颗粒(说明：加入TG1后，拯救噬菌体又重新转变为噬菌粒)，完成第一轮淘筛(经历一轮淘筛，能够结合CD163的噬菌体被富集，不能结合的被洗去)。洗脱液进一步扩增并进入下一轮生物淘洗。10倍连续稀释后平板上的菌落数检测富集程度。经过5轮生物淘选，随机选择48个克隆进行接种培养，并感染M13辅助噬菌体，得到显示Nb的噬菌体。这48个克隆随后对噬菌体ELISA进行了鉴别。将真核表达的CD163 SECR5-9蛋白包被在4℃下包被在平板上过夜。第二天，用PBS'T洗涤五次后，加入溶解在PBS中的5％脱脂牛奶，在37℃下封闭1小时。然后，用PBST洗涤5次后，将与6×His标签融合的纳米抗体加入100ml/孔，在37℃下放2小时。用PBST洗涤孔5次，并在37℃下以1：2000稀释液用100ml辣根过氧化物酶(HRP)偶联抗His-tag小鼠单克隆抗体(CWBIO)孵育1小时。用PBST洗涤5次后，通过加入四甲基联苯胺(TMB)进行反应，并在孵育30分钟后加入2M H2SO4停止，并使用层析扫描仪在450nm处读取吸光度。然后选择结合能力和特异性强的噬菌体进行后续功能验证。
为了筛选出与CD163 SRCR5-9蛋白具有特异性结合能力的Nb，对噬菌体VHH文库进行了连续淘选，并通过量化每次平移的P/N值来评估噬菌体颗粒的富集。经过5轮淘洗，结果表明，携带针对CD163 SRCR5-9蛋白的特异性纳米抗体的噬菌体颗粒得到有效富集(图2A)。(图2A中输入量指的是输入噬菌体的数量，阳性输出量指阳性噬菌体的输出量，阴性输出量指PBS的输出量。)随后，通过在平板上涂被CD163SRCR5-9蛋白，在筛选的噬菌体ELISA的VHH文库中随机选择48个噬菌体克隆继续进行噬菌体ELISA鉴定，鉴定出其中与CD163具有较强结合性的几个Nb1～7。所获得的纳米抗体Nb1～7的编码序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示。如图2B所示，黑色框代表CD163蛋白，灰色框代表对照蛋白。然后，选择其中几个OD值较高的Nb进行测序，最后将其归类为7中Nb，如图2C为7个Nb的氨基酸序列图。
3)纳米抗体的表达与纯化
将7个Nb分别克隆到PET30a载体上并转化到Rosetta(DE3)细胞中，并进行表达和纯化程序。在1mM IPTG条件下诱导，将细胞离心并经过超声破碎后得到混合蛋白。使用His-Select色谱柱(Sigmae Aldrich)通过固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化含有6×His标签的纳米抗体。用含有0.5M咪唑的PBS洗脱纳米抗体，并通过超滤柱(Millipore)过滤。最后，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹分析纯化的纳米抗体，并在-80℃条件下储存。
将7个测序的Nb序列插入pET-30a载体中，并转移到Rosetta(DE3)细胞中以进一步表达。SDS-PAGE和蛋白质印迹结果显示，成功表达和纯化了7个Nb，并达到了预期的大小(图3A，3B)。如图所示，泳道A～G分别带白Nb1～7的蛋白样品。Nb1～7大小约为15KDa。
4)间接酶联免疫吸附法检测纳米抗体的抗原特异性结合能力
进行间接ELISA以确定所选纳米抗体与CD163 SRCR5-9蛋白的结合能力。将纯化的CD163 SRCR5-9蛋白(500ng/孔)在4℃下包被到ELISA板上过夜。将包被的板用PBST洗涤三次，并与封闭缓冲液(有5％脱脂牛奶的PBS)在37℃孵育2小时。将选定的纳米抗体分别以两倍比例连续稀释，起始比例为40μg/mL。然后将加倍稀释后的纳米抗体分别加入到每个孔中，并在37℃下孵育1h。用PBST洗涤三次后，向每个孔中加入100微升HRP偶联山羊抗鼠IgG(1：10000稀释，Sungene，上海，中国)，并在37℃下孵育1小时。洗涤三次后，向每个孔中加入200μl3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB，景奇生物，中国北京)，并将板在室温下孵育10分钟。最后，使用2M H2SO4(50μL/孔)停止反应，并使用层析扫描仪(Biotek，佛蒙特州，美国)在450nm处读取吸光度。
如图4A所示，将CD163 SRCR5-9蛋白包被在微量滴定板上，从40μg/mL开始，分别以两倍比连续稀释Nb1～7。与其他纳米抗体相比，Nb1和Nb2对CD163 SRCR5-9蛋白表现出最高的结合能力(图4A)。与阴性对照相比，Nb1～7与CD163 SRCR5-9蛋白的特异性结合OD450mm值的P/N比均大于2.1(图4B)。这些结果表明，Nb1～7对CD163 SRCR5-9蛋白的结合具有良好的特异性。
5)免疫荧光检测纳米抗体的抗原特异性结合能力
在24孔培养板中生长Marc-145细胞(1×105个细胞/孔)，并用4％多聚甲醛固定。将固定细胞与封闭溶液孵育，然后与选定的纯化纳米抗体在37℃下孵育1小时。用PBST洗涤后，将处理过的细胞与抗Flag标记小鼠单克隆抗体(CWBIO)在37℃下以1：2000的稀释度孵育1小时。最后加入红色荧光蛋白(RFP)标记的山羊抗小鼠抗体，并在倒置荧光显微镜下检查结果。
如图4C所示，与对照组相比，Nb1～7组均有荧光显示，这表明它们都能与Marc-145细胞上的CD163受体特异性结合。
实施例2靶向肽蛋白的表达及功能评价
1)靶向肽蛋白的构建、表达与纯化
对特异性、结合性最强的纳米抗体序列进行截短，参考现有文献，CDR3被认为是Nb具有结合能力的片段，因此，选取了特异性强的Nb1～4和Nb7的CDR3肽段制成靶向肽。将该基因序列连到自组装蛋白纳米颗粒mi3的N段，并将mi3-CDR3段克隆到PET30a载体上。mi3为人工合成的自组装蛋白纳米颗粒，由60个相同的亚基组成，该蛋白能够通过自组装形成纳米颗粒，与mi3相连后，CDR3能够多拷贝的展示在mi3的表面。转化到Rosetta(DE3)细胞中，并进行表达和纯化程序。在1mM IPTG条件下诱导，将细胞离心并经过超声破碎后得到靶向肽蛋白。使用His-Select色谱柱(Sigmae Aldrich)通过固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化含有6×His标签的蛋白。用含有0.5M咪唑的PBS洗脱，并通过超滤柱(Millipore)过滤。最后，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹进行分析，并在-80℃条件下储存。
如图5A所示，框出的区域即为Nb的CDR3段。如图5B所示，分别将5个CDR3段与mi3蛋白相连，并克隆到PET30a载体上，通过原核表达体系表达5个靶向肽蛋白和对照蛋白(mi3-PTCs和mi3)。如图6所示，SDS-PAGE和蛋白质印迹结果显示，成功表达和纯化了5个靶向肽，并达到了预期的大小(约为25KDa)(图6A，6B)。泳道1代表mi3蛋白，泳道2-6代表5个纳米抗体来源的靶向肽(PTC)：mi3-PTC1、mi3-PTC2、mi3-PTC3、mi3-PTC4、mi3-PTC5。其中，mi3-PTC1的CDR3肽来自Nb1，mi3-PTC2的CDR3肽来自Nb2，mi3-PTC3的CDR3肽来自Nb3，mi3-PTC4的CDR3肽来自Nb4，mi3-PTC5的CDR3肽来自Nb7。目的基因mi3-PTC1～5的编码序列如SEQ IDNO.8～12所示，其中以下划线标注的内容为PTC序列，纳米颗粒mi3的编码序列如SEQ IDNO.13所示。目的蛋白mi3-PTC的氨基酸序列如SEQ ID NO.14～18所示，其中以下划线标注的内容为PTC的氨基酸序列，mi3的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。
2)靶向肽能够特异性结合CD163受体
在24孔培养板中生长Marc-145细胞(1×105个细胞/孔)，并用4％多聚甲醛固定。将固定细胞与封闭溶液孵育，然后与纯化的CDR3在37℃下孵育1小时。用PBST洗涤后，将处理过的细胞与抗Flag标记小鼠单克隆抗体(CWBIO)在37℃下以1：2000的稀释度孵育1小时。最后加入FITC标记的山羊抗鼠的荧光二抗在37℃下以1:1000的稀释度孵育1小时，并在荧光显微镜下观察相应的荧光信号。
免疫荧光检测靶向肽特异性结合CD163受体的能力。如图7所示，与对照蛋白mi3相比，mi3-PTC2和mi3-PTC4表现出明显的荧光，这表示它们与CD163的强结合性。mi3-PTC5可见较弱的荧光，表明它与CD163有弱结合性。mi3无荧光显示，表明它不与CD163结合。
3)靶向肽可促进纳米颗粒的内化
选取生长状态良好的Marc-145细胞于24孔培养板中(1×105个细胞/孔)。以40ug/ml的浓度加入靶向肽蛋白(mi3-PTC1、mi3-PTC2、mi3-PTC3、mi3-PTC4、mi3-PTC5)和对照蛋白mi3，孵育3小时后用Hanks液清洗两次，换含2％血清的DMEM继续培养12小时，用4％多聚甲醛固定15分钟，用Triton-100以1:1000的稀释度通透15分钟，并用山羊血清封闭15分钟。鼠源Flag抗体作为一抗以1:500的稀释度4℃下孵育过夜，然后加入FITC标记的山羊抗鼠的荧光二抗在37℃下以1:500的稀释度孵育1小时，最后DAPI以1:1000的稀释度核染3min，并分别用倒置荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)IX81-FV1000(奥林巴斯)检测免疫荧光信号。
免疫荧光检测靶向肽蛋白的内化效果。如图8A所示，与对照组mi3相比，mi3-PTC2、mi3-PTC4和mi3-PTC5组可见明显的荧光显示。共聚焦显微镜结果如图8B所示，mi3-PTC2、mi3-PTC4和mi3-PTC5组在细胞核周围能够观察到荧光。这些结果表明，mi3-PTC2、mi3-PTC4和mi3-PTC5能够促进内化，并将mi3这种不易进入细胞的纳米颗粒带入细胞内。
4)靶向肽的抗PRRSV功效
为了检测靶向肽对PRRSV的阻断作用，选取生长状态良好的Marc-145细胞于48孔培养板中，待细胞生长密度至70％～80％。将透析后的靶向肽蛋白(mi3-PTC1、mi3-PTC2、mi3-PTC3、mi3-PTC4、mi3-PTC5)和对照蛋白mi3以50ug/ml的浓度添加到Marc-145细胞中，并在37℃下孵育1小时。Hanks洗涤2次后，用PRRSV HuN4毒株(100TCID50)攻击细胞，孵育2小时后换含2％血清的DMEM继续培养12小时。用4％多聚甲醛固定15分钟，并与封闭溶液孵育30分钟，以PRRSV N蛋白抗体(VH13)为一抗以1:1000的稀释度孵育1小时，然后加入FITC标记的山羊抗鼠的荧光二抗在37℃下以1:500的稀释度孵育1小时，并在倒置荧光显微镜下检测PRRSV N蛋白的荧光强度。
免疫荧光检测靶向肽对PRRSV的阻断作用。如图9所示，与对照蛋白mi3和PBS组相比，mi3-PTC2和mi3-PTC4的荧光明显减弱，表明它们具有较强的PRRSV阻断作用。mi3-PTC5组也表现为抗病毒效果，但弱于上述两组。
5)靶向肽的抗炎症反应功效
为了检测靶向肽对细胞内各种细胞因子的调节作用，选取生长状态良好的Marc-145细胞于48孔培养板中，待细胞生长密度至70％～80％。由于mi3与mi3-PTC的内化效果相差比较大，因此本发明选择了另一种NP，即PCV2的Cap蛋白。通过Cap和Cap-PTC的对比来评估PTC对细胞内各种细胞因子的调节作用。首先评估了Cap和Cap-PTC2的内化效果，步骤如3)所示，仅免疫荧光实验的相关步骤。然后使用qRT-PCR分析了靶向肽对各类炎症相关的细胞因子的调节。选取生长状态良好的Marc-145细胞于48孔培养板中，待细胞生长密度至70％～80％。将透析后的靶向肽蛋白Cap-PTC2和对照蛋白Cap以50ug/ml的浓度添加到Marc-145细胞中，并在37℃下孵育2小时。Hanks洗涤2次后，换含2％血清的DMEM继续培养12小时。使用qRT-PCR分析CD163、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-β和IL-8的相对mRNA水平。
免疫荧光检测Cap和Cap-PTC2的内化效率。如图10A所示，Cap和Cap-PTC2均有荧光显示，这表明它们均内化进入了细胞，并内化效率基本一致。qRT-PCR分析CD163、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-β和IL-8的相对mRNA水平。如图10B所示，与Cap组相比，Cap-PTC2抑制了CD163的转录水平，根据申请人的研究，应该是靶向肽与蛋白酶产生了竞争效应，靶向肽与CD163的不断结合抑制了蛋白酶对CD163的降解与切割，导致新的CD163无法表达。NF-κB信号通路的激活能够导致一些促进炎症反应的细胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β等释放。如图10B所示，与Cap组相比，Cap-PTC2抑制了炎症反应相关细胞因子的转录水平，即靶向肽达到了抗炎症反应的功效。

Claims (7)

1.一种来自纳米抗体可靶向CD163受体的短肽，其特征在于，包括如SEQ ID NO.14～18中任意一项所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的短肽，其特征在于，具有对应地编码SEQ ID NO.14～18所述氨基酸序列的核苷酸序列，分别依次如SEQ ID NO.8～12所示。
3.根据权利要求1所述的短肽，其特征在于，该短肽是以截取自纳米抗体的CDR3肽段作为靶向肽，经与人工合成的纳米颗粒mi3的N端连接而获得；CDR3肽段能够多拷贝地展示在mi3的表面，组装后的产物命名为mi3-PTC；
其中，所用纳米抗体Nb的编码序列如SEQ ID NO.1～7中的任意一项所示；纳米颗粒mi3的编码序列如SEQ ID NO.13所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；通过截取Nb1～4和Nb7的CDR3与mi3的N段连接而获得的mi3-PTC1～5的编码序列如SEQ ID NO.8～12所示。
4.权利要求1所述来自纳米抗体可靶向CD163受体的短肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建纳米抗体文库
从未免疫的羊驼血液中提取RNA并反转录成cDNA，将此段cDNA作为模板，经过两轮PCR得到VHH片段纳米体；利用同源重组的方式将VHH片段克隆到噬菌粒pCANTAB5e载体上，并转化到感受态细胞TG1内，涂板后收集板上所有的单克隆，建成纳米抗体文库；
(2)CD163重组蛋白的表达与纯化
利用杆状病毒表达系统表达和纯化CD163蛋白；
(3)生物淘选和噬菌体ELISA筛选CD163特异性纳米抗体
用M13辅助噬菌体感染建好的VHH库，获得表面展示Nb的噬菌体；以CD163SRCR5-9蛋白作为包被原，噬菌体作为抗体进行3-5轮抗体淘筛，鉴定可能的阳性噬菌体；对ELISA鉴定阳性的噬菌体进行测序，获得纳米抗体序列；
(4)纳米抗体的表达与纯化
将纳米抗体序列克隆到PET30a表达质粒中，进行原核表达，并纯化纳米抗体；
(5)间接酶联免疫吸附法和免疫荧光检测纳米抗体的抗原特异性结合能力；
包被CD163 SRCR5-9蛋白，用纯化的纳米抗体进一步进行ELISA鉴定；并以纳米抗体为一抗，对表达CD163受体的Marc-145细胞系进行IFA检测，纳米抗体能够与CD163特异性结合；
(6)靶向肽蛋白的构建、表达与纯化
选择特异性和结合性最强的纳米抗体，截取具备结合功能的CDR3肽段制成靶向肽，并连到人工合成的纳米颗粒mi3的N端，克隆到原核表达载体PET30a上，并通过大肠杆菌表达系统表达和纯化mi3-PTC蛋白；
(7)免疫荧光检测mi3-PTC的抗原特异性结合能力
以mi3-PTC为一抗，对表达CD163受体的Marc-145细胞系进行IFA检测，mi3-PTC能够与CD163受体特异性结合。
5.权利要求1所述来自纳米抗体可靶向CD163受体的短肽在制备促进纳米颗粒进入细胞内部的试剂中的应用。
6.权利要求1所述来自纳米抗体可靶向CD163受体的短肽在制备用于防治猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)感染的药物中的应用。
7.权利要求1所述来自纳米抗体可靶向CD163受体的短肽在制备抗炎症的药物中的应用。
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