CN111991556A

CN111991556A - SARS-CoV-2 RBD共轭纳米颗粒疫苗

Info

Publication number: CN111991556A
Application number: CN202011178371.0A
Authority: CN
Inventors: 曾木圣; 康银峰; 孙聪; 冯国开
Original assignee: Sun Yat Sen University Cancer Center; National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University Cancer Center; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2020-10-29
Filing date: 2020-10-29
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2040-10-29
Also published as: CN111991556B; WO2022088953A1

Abstract

本发明涉及免疫医学领域，具体而言，涉及一种SARS‑CoV‑2 RBD共轭纳米颗粒疫苗。该疫苗包含免疫原性复合物，所述免疫原性复合物包含：a）与SpyCatcher融合表达的载体蛋白自组装得到的纳米颗粒载体；b）与SpyTag融合表达的SARS‑CoV‑2病毒的RBD抗原；所述载体蛋白选自Ferritin、mi3和I53‑50；所述载体蛋白与所述抗原之间通过SpyCatcher‑SpyTag共价连接。

Description

SARS-CoV-2 RBD共轭纳米颗粒疫苗

技术领域

本发明涉及免疫医学领域，具体而言，涉及一种SARS-CoV-2 RBD共轭纳米颗粒疫苗。

背景技术

严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndromecoronavirus 2，SARS-CoV-2）是引起高致死率的急性下呼吸道感染的病原体，能够引起新型冠状肺炎等疾病(COVID-19)。由于SARS-CoV-2的传染性强、传播速度快、致死率较高，目前尚无有效的特效药和疫苗防治，因此针对该病毒的预防性疫苗开发显得尤为迫切。

S蛋白是三聚体糖蛋白，为 I 类病毒融合蛋白，其中还包括HIV糖蛋白160（Env），流感血凝素（HA），副粘病毒F和埃博拉病毒糖蛋白。S蛋白可与宿主细胞的病毒受体结合，为决定病毒入侵易感细胞的关键蛋白。S蛋白在受体结合和膜融合中的作用，使其成为疫苗和抗病毒开发的理想靶标，可以诱导抗体阻断病毒结合和融合或中和病毒感染。在SARS-CoV-2的所有结构蛋白中，S蛋白是主要的抗原成分，负责诱导宿主免疫应答，中和抗体和抵抗冠状病毒感染的保护性免疫。S蛋白的免疫原性和蛋白产量限制了S蛋白大规模生产，因此亚单位疫苗主要集中在S蛋白的受体结合区（receptor-bindingdomain，RBD）。然而，尽管基于RBD的疫苗已经得到了广泛的研究，但由于各种原因，RBD亚基的免疫原性仍然很低，阻碍了RBD亚基的应用。为了增加免疫原性，科学家们努力对RBD进行改进。

迄今为止全球研发了多种SARS-CoV-2疫苗，主要包括灭活疫苗，亚单位疫苗，病毒载体疫苗和核酸疫苗，并且已有7个疫苗获批进入临床三期，然而还没有上市能够预防SARS-CoV-2的疫苗，因此研发针对SARS-CoV-2产生高滴度的中和抗体的预防性疫苗仍然存在需求。

发明内容

本发明涉及一种免疫原性复合物，包含：

a）与SpyCatcher融合表达的载体蛋白自组装得到的纳米颗粒载体；

b）与SpyTag融合表达的SARS-CoV-2病毒的RBD抗原；

所述载体蛋白选自mi3和I53-50；

所述载体蛋白与所述抗原之间通过SpyCatcher-SpyTag共价连接；

其中：

所述RBD抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；

所述mi3的氨基酸序列如3所示；所述I53-50蛋白由三聚体I53-50A1.1PT1和五聚体I53-50B.4PT1组装而成，所述I53-50A1.1PT1含有SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列；所述I53-50B.4PT1含有SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。

本发明还涉及一种纳米颗粒疫苗，其包含如上所述的免疫原性复合物。

根据本发明的再一方面，还涉及成套试剂盒，其包含如上所述的纳米颗粒疫苗，以及用于接种所述纳米颗粒疫苗的容器。

本发明还涉及如上所述的免疫原性复合物的制备方法，包括：

表达a）组分和b）组分中的融合蛋白，纯化后共孵育，自组装得到的所述免疫原性复合物。

本发明还涉及如上所述的免疫原性复合物，或如上所述的纳米颗粒疫苗在制备用于治疗新型冠状肺炎的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明通过特定序列的多肽欧联自组装得到的免疫原性复合物，与单体RBD相比，抗原特性显著增强，可以诱导更高滴度的中和抗体，且中和抗体阻碍阻碍ACE2和CB6抗体与RBD结合的能力更强，经检测，免疫后动物不产生明显的细胞免疫，疫苗使用更安全，且易于生产，产量高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中RBD偶联纳米颗粒的结构和结构特征；

(A) RBD纳米颗粒设计草图；左流程图简要介绍了利用SpyTag-SpyCatcher系统改造RBD和纳米颗粒骨架蛋白；图中颗粒展示了理想状态下偶联完毕的纳米颗粒外部充分偶联上了RBD；

(B)目的蛋白表达质粒在大肠杆菌和HEK293F细胞不同表达体系中的构建；

(C) RBD单体、RBD偶联纳米颗粒和未偶联的空载纳米颗粒在还原剂下SDS-PAGE跑SDS-PAGE胶的结果；如图所示共价偶联的效率极高，可见在RBD偶联纳米颗粒的泳道上未见到RBD单体和未连接的纳米颗粒骨架蛋白；

(D) RBD单体、未偶联的纳米颗粒和RBD偶联纳米颗粒在分子尺寸排阻色谱Superose 6increase 10/300GL的分布；在RBD-SpyTag与△N1-SpyCatcher-NPs共价偶联后可观察到峰前移；

(E) RBD单体、RBD偶联纳米颗粒和未偶联的纳米颗粒的动态光散射(DLS)分布图；可见偶联后的纳米颗粒直径增加；

图2为本发明一个实施例中组装颗粒的组装性质和物理特征验证；

负染电镜下观察的未偶联纳米颗粒和RBD偶联纳米颗粒，可见RBD偶联的纳米颗粒外侧有明显的毛刺装突起；

图3为本发明一个实施例中RBD单体和RBD偶联纳米颗粒的抗原性鉴定；

(A)ELISA检测RBD和RBD纳米颗粒结合ACE2和CB6抗体的能力，使用双因素方差分析分析单体与纳米颗粒的结合滴度差异，并使用Dunnett矫正；

(B)BLI动力学检测RBD和RBD纳米颗粒与ACE2的结合能力；

(C)BLI动力学检测RBD和RBD纳米颗粒与CB6的结合能力；

图4为本发明一个实施例中RBD单体和RBD偶联颗粒的免疫原性鉴定；

(A)动物免疫流程图；

(B)免疫小鼠的血清抗体滴度，图中按照不同的佐剂进行分别展示，使用双因素方差分析分析单体与纳米颗粒的抗体滴度差异，并使用Dunnett矫正，* p< 0.05; ** p< 0.01;*** p< 0.001; **** p< 0.0001；

(C)BLI血清竞争实验，对使用AddaVax作为佐剂的免疫组的血清进行与ACE2或者CB6抗体的竞争结合实验，其中Rc为在不同滴度血清结合下ACE2和CB6的RBD竞争结合信号，Ro为不与血清结合下ACE2与CB6的RBD结合信号；

(D)竞争实验热图，使用(Ro-Rc)/R0表示竞争度，更明亮的颜色则显示在不同的血清滴度下血清与ACE2和CB6竞争结合RBD的能力更强；

图5为本发明一个实施例中免疫血清中和实验；

(A)SARS-CoV-2假病毒中和实验，滴度用NT₉₀表示，可见RBD纳米颗粒的血清中和能力较RBD单体强；

(B)SARS-CoV-2活病毒中和实验，滴度用噬斑减少NT₉₀（FRNT₉₀）表示，同样可见RBD纳米颗粒的血清中和能力较RBD单体强，不同组的滴度比较用非配对的双尾Mann-Whitney U检验进行统计学检验，其中* p < 0.05; ** p< 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001；

图6为本发明一个实施例中各免疫后小鼠引流淋巴结的免疫细胞特征；

(A)生发中心B细胞用B220，IgD-low，GL7以及CD95 作为标志物通过流式细胞术进行鉴定，对各组小鼠的淋巴结的GCB细胞进行统计后发现各组之间未见明显差异；

(B)Tfh滤泡辅助T细胞使用CD4，CD44，PD-1以及CXCR5阳性作为标志物通过流式细胞术进行鉴定，统计后发现各组之间未见明显差异；

(C)细胞因子释放的CD4+细胞通过鉴定共表达IFN-γ，IL2或者TNF-α作为标记物，发现各组之间也未见明显的差异；

(D)细胞因子释放的CD8+ T细胞通过鉴定共表达IFN-γ，IL2或者TNF-α作为标记物，发现各组之间也未见明显的差异；

图7示出了各免疫后小鼠脾脏中的免疫细胞特征；

(A) 细胞因子释放的CD4+(A) 细胞通过鉴定共表达IFN-γ，IL2或者TNF-α作为标记物，发现各组之间也未见明显的差异；

(B) 细胞因子释放的CD8+ T (B) 细胞通过鉴定共表达IFN-γ，IL2或者TNF-α作为标记物，发现各组之间也未见明显的差异。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明涉及一种免疫原性复合物，包含：

b）与SpyTag融合表达的SARS-CoV-2病毒的RBD抗原；

所述载体蛋白选自Ferritin、mi3和I53-50；

所述载体蛋白与所述抗原之间通过SpyCatcher-SpyTag共价连接；

其中：

所述RBD抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；

所述Ferritin和所述mi3的氨基酸序列依次如SEQ ID NO: 2和3所示；所述I53-50蛋白由三聚体I53-50A1.1PT1和五聚体I53-50B.4PT1组装而成，所述I53-50A1.1PT1含有SEQ IDNO: 4所示的氨基酸序列；所述I53-50B.4PT1含有SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。

所述Ferritin蛋白来自牛蛙与幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori-bullfroghybrid）的杂合铁蛋白，其是由24个亚基组成的八面体。所述Ferritin蛋白在牛蛙铁蛋白部分残基8和幽门螺旋杆菌铁蛋白部分残基19进行了N8Q和N19Q点突变，以避免潜在的糖基化位点；和幽门螺杆菌的铁蛋白的残基7(I7E)进行了点突变，以保留盐桥。

载体蛋白mi3蛋白是由KDPG醛缩酶进行了点突变C76A和 C100A，以避免潜在的二硫键介导的异质性。其是由60个亚基组成的二十面体。

载体蛋白I53-50 是由20个三聚体I53-50A1.1PT1和12个五聚体I53-50B.4PT1组装而成的二十聚体。优选的，由20个三聚体I53-50A1.1PT1和12个五聚体I53-50B.4PT1在体外以摩尔质量比1 : 1-3组装而成的二十聚体。

在本发明的某些实施方案中，a）组分中所述SpyCatcher与所述载体蛋白通过连接肽融合。

在本发明的某些实施方案中，b）组分中所述SpyTag与所述RBD抗原通过连接肽融合。

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸数目为1~30个；可以是1，2，3，4，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个。

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸是不具有除连接以外的额外功能（例如蛋白定位、酶切位点等）的无意义多肽。

在一些实施方式中，所述连接肽为柔性连接肽。

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自Gly、Ser、Pro、Ala以及Glu中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自(GGGGS)n、(GGGS)n、(GGS)n、(GS)n或（G）n，其中n选自1，2，3，4，5或6。

其中(GGS)n的意思代表有n个GGS重复，例如(GGS)₄代表GGSGGSGGSGGS，其他同理。

在一些实施方式中，a）组分中所述连接肽的氨基酸序列为自 (GGS)₄。

在一些实施方式中，b）组分中所述连接肽的氨基酸序列为GSGGSGGSG。

在一些实施方式中，所述SpyCatcher位于所述载体蛋白的N端。

在一些实施方式中，所述SpyTag位于所述载体蛋白的C端。

在一些实施方式中，所述SpyTag含有SEQ ID NO: 6所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述SpyCatcher含有SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，b）组分为△N1-SpyCatcher-Ferritin，其含有SEQ ID NO: 9所示的氨基酸序列；或者

b）组分为△N1-SpyCatcher-mi3，其含有SEQ ID NO: 10所示的氨基酸序列；又或者

b）组分为△N1-SpyCatcher-I53-50，其包含I53-50蛋白由三聚体△N1-SpyCatcher-I53-50A1.1PT1和五聚体I53-50B.4PT1组装而成，其中△N1-SpyCatcher-I53-50A1.1PT1含有SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列，I53-50B.4PT1含有SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。

本发明还涉及一种纳米颗粒疫苗，包含如上所述的免疫原性复合物。

在一些实施方式中，还包括药学上可接受的载体和/或佐剂。

药学上可接受的载体成分的实例包括结合剂（糖浆、阿拉伯树胶、明胶、山梨醇、黄芪胶（tragacanth）、聚乙烯吡咯烷酮等）、填充剂（乳糖、蔗糖、淀粉、磷酸钙、山梨糖醇、甘氨酸等）、润滑剂（硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇等）、崩解剂（淀粉、微晶纤维素（microcrystalline cellulose）等）、湿润剂（十二烷基硫酸钠（sodium lauryl sulphate）等）、悬浮剂（山梨糖醇、糖浆、甲基纤维素、葡萄糖浆（glucose syrup）、明胶、氢化食用脂肪等）、乳化剂（卵磷脂、山梨醇单油酸酯、阿拉伯树胶等）、非水性载体（杏仁油、分馏椰子油或甘油、丙二醇、乙醇等疏水酯等）、防腐剂（对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸等）、芳香剂（合成香料、天然香料等）、甜味剂（蔗糖、甜叶菊、木糖醇等）、pH 调节剂（碳酸氢钠、碳酸钾等）、粉剂（色素、染料、树脂等）、增稠剂（阿拉伯树胶、甲基纤维素等）、抗氧化剂（维生素C、维生素E等）等等。

本发明所提供的疫苗优选地还包括佐剂。适用于本发明疫苗的佐剂包括可增强针对所述重组流感病毒中B细胞表位的抗体反应的佐剂，以及可增强细胞介导的针对所述重组流感病毒中T细胞表位的反应的佐剂。这些佐剂是本领域所熟知的。

在一些实施方式中，所述佐剂选自Sigma Adjuvant Systerm、AddaVax、角鲨烯、胞壁酰二肽、MF59、AS03、单磷脂酰脂质A，鞭毛蛋白、CpG-ODN、Poly（I：C），以及铝或钙盐的小分子中的一种或多种。这些佐剂均是本领域所熟知并可通过若干商业渠道获得的。其中，优选的佐剂为Sigma Adjuvant Systerm和/或AddaVax。

在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的油包水乳液。

在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的水包油乳液。

疫苗典型地被配制用于肠胃外施用。典型的免疫接种是通过鼻腔途径的疫苗接种，但本发明还考虑了口腔和皮下(SC)、肌内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)或真皮内(ID)注射实现。

上述疫苗是以与剂量配方相容的方式，以及诸如治疗有效量和免疫原性有效量的用量被施用的。施用量取决于接受治疗的对象、该对象的免疫系统合成抗体的能力，以及预期的保护程度。需施用的活性成分的准确数量取决于医师的判断，个体不同，用量也不同。最初施用和加强接种的合适方案也可变化，但典型地在首次施用后的一定间隔时间(数周或数月)后再进行1次注射或以其它方式施用。

本发明的另一个实施方式涉及成套试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的纳米颗粒疫苗，以及用于接种所述纳米颗粒疫苗的容器。

接种容器优选为医用注射器。

根据本发明的再一方面，还涉及如上所述的免疫原性复合物，或如上所述的纳米颗粒疫苗在制备用于治疗新型冠状肺炎的药物中的应用。

本发明进一步提供了受试者免于SARS-CoV-2病毒感染的方法，其包括给所述动物施用有效量的根据本发明的纳米颗粒疫苗。

上述用途的受试者可以指患者或怀疑携带有SARS-CoV-2的动物，特别是哺乳动物，例如蝙蝠、果子狸；优选为灵长类动物，更优选为人。

在一些实施方式中，受试者包括感染者、康复者、无症状感染者、疫苗接种者等。

有效量定义为在它被施用的个体中将诱导免疫应答的所述疫苗的量，导致在个体中针对所述疫苗的分泌、细胞和/或抗体介导的免疫应答的发展。针对疫苗的所述分泌、细胞和/或抗体介导的免疫应答针对用强毒流感病毒株的攻击也是有效的。

所述有效量优选经口或口鼻或肌内施用。

在一些实施方式中，施用一次或多次。

在本发明的某些实施方案中，

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

除非另有说明，本发明采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等是本领域的常规技能。参见萨姆布鲁克( Sambrook )、弗里奇( Fritsch )和马尼亚蒂斯( Maniatis )，《分子克隆：实验室手册》( MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL )，第2次编辑( 1989 )；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY )( F .M .奥苏贝尔( F .M .Ausubel )等人编辑，( 1987 ))；《酶学方法》( METHODS IN ENZYMOLOGY )系列(学术出版公司)：《PCR2:实用方法》( PCR 2:A PRACTICAL APPROACH )( M .J .麦克弗森( M .J .MacPherson )、B.D .黑姆斯( B .D .Hames )和G .R .泰勒( G .R .Taylor )编辑( 1995 ))、哈洛(Harlow )和拉内( Lane )编辑( 1988 )《抗体：实验室手册》( ANTIBODIES, A LABORATORYMANUAL )，以及《动物细胞培养》( ANIMAL CELL CULTURE )(R .I .弗雷谢尼(R .I.Freshney )编辑(1987 ))。

实施例1. 基于SARS-CoV-2 RBD纳米颗粒疫苗的设计

本实施例描述了基于SARS-CoV-2 RBD蛋白设计了Ferritin（24-mer），mi3（60-mer）和I53-50（120-mer）纳米颗粒。

考虑不同纳米颗粒能够展示不等的拷贝数抗原在其表面，本实施例设计了三种SARS-CoV-2 RBD共轭的纳米颗粒：RBD-Ferritin，RBD-mi3和RBD-I53-50。

Ferritin（SEQ ID NO: 2）是由24个亚基组成的八面体。Ferritin蛋白是牛蛙(Rana catesbeiana) 铁蛋白较低的亚基(UniProt: P07797)N端2-9位残基通过分子生物学手段融合到幽门螺杆菌非血红素铁蛋白3-167残基。为了消除N端潜在的糖基化位点影响，本发明在牛蛙铁蛋白部分残基8和19采用了N8Q和N19Q点突变。为了保留幽门螺杆菌-牛蛙Ferritin的残基6R和14E之间的盐桥，同样地我们在幽门螺杆菌的铁蛋白的残基7(I7E)创建了点突变。

mi3（SEQ ID NO: 3）是由60个亚基组成的二十面体，是来源于KDPG醛缩酶并在计算机设计和优化的I3-01纳米颗粒蛋白基础上突变C76A和 C100A以避免潜在的二硫键介导的异质性。

I53-50 是由20个三聚体I53-50A1.1PT1（SEQ ID NO: 4）和12个五聚体I53-50B.4PT1（SEQ ID NO: 5）在体外以摩尔质量比1:1组装而成的二十聚体。

SARS-Cov-2 S蛋白，特别是受体结合区（Receptor Bingding domain，RBD）是可与宿主细胞的病毒受体结合，为决定病毒入侵易感细胞的关键蛋白，由于其在受体结合和膜融合中的作用，使其成为疫苗和抗病毒开发的理想靶标。SARS-CoV-2病毒（Wuhan-Hu-1，GenBank：MN908947）RBD基因（残基：319-541）通过哺乳动物密码子偏好进行优化并合成。为了构建RBD-SpyTag融合蛋白，13个残基的SpyTag（SEQ ID NO: 6）通过Gly-Ser接头融合到RBD基因（SEQ ID NO: 1）的C端，得到SEQ ID NO: 8所示的序列。以方便纯化和去除标签蛋白，并且在SpyTag基因的C端融合HRV 3C位点和6个组氨酸的His标签；为了消除血清中的SpyTag标签对血清结合滴度的影响，我们构建在RBD基因没有SpyTag的质粒；为了方便利用真核表达系统纯化目的蛋白，我们在目的基因的N端融合了信号肽，使目的蛋白能够分泌至上清，最终得到SARS-CoV-2 S RBD- SpyTag（SEQ ID NO: 12）。为了构建和RBD共轭的Ferritin，mi3和I53-50, △N1-SpyCatcher（SEQ ID NO: 7）基因分别在 Ferritin，mi3和I53-50.1PT1基因的N端通过(G2S)₄接头融合，并在Ferritin和mi3的N端，I53-50.1PT1的C端融合6个组氨酸的His标签和 HRV 3C位点，构建了载体蛋白△N1-SpyCatcher-Ferritin（SEQ ID NO: 13），△N1-SpyCatcher-mi3（SEQ ID NO: 14）和△N1-SpyCatcher-I53-50.1PT1（SEQ ID NO: 15）。I53-50B.4PT1（SEQ ID NO: 16）是根据已经发表的文献设计【Bale, J.B., et al. Accurate design of megadalton-scale two-componenticosahedral protein complexes. Science 353, 389-394 (2016)】。原核表达的蛋白基因都是基于南京金斯瑞生物有限公司OptimumGeneTM大肠杆菌表达系统的密码子嗜好性进行优化并合成。

实施例2. 基于SARS-CoV-2 RBD纳米颗粒疫苗的表达和纯化

1、实验材料

（1）载体与构建重组载体所需菌株：哺乳动物表达载体VRC8400，大肠杆菌表达载体修改的PET-28a+，大肠杆菌感受态DH5a细胞、Rosseta细胞。

蛋白表达细胞株：HEK293-F细胞（来源于人的胚胎肾上皮细胞）。

（2）试剂与耗材：PCR酶和重组酶（购自诺唯赞有限公司），内切酶（购自NEB），细胞转染试剂PEI-MAX (Polysciences, Inc., Cat. No. 24765-1)、哺乳细胞培养基Union293培养基（购自上海永联生物），组氨酸标签蛋白纯化琼脂糖磁珠（购自GE公司），其他常规试剂和耗材均商品化。

(3)基因：△N1-SpyCatcher-Ferritin （SEQ ID NO: 18）, △N1-SpyCatcher-mi3（SEQ ID NO: 19），△N1-SpyCatcher-I53-50A1.1PT1（SEQ ID NO: 20），I53-50B.4PT1（SEQID NO: 21）。hACE2-8*his（残基：19-615）和hACE2-hFc基因都通过南京金斯瑞生物有限公司OptimumGeneTM嗜好密码子平台优化和合成。

2、步骤

(1)通过PCR扩增、酶切重组方法分别将SARS-CoV-2病毒的S蛋白受体结合区基因（SEQID NO: 17）和hACE2-8*his和hACE2-hFc基因连接在哺乳动物表达载体VRC8400。基因△N1-SpyCatcher-Ferritin（SEQ ID NO: 18），△N1-SpyCatcher-mi3（SEQ ID NO: 19），△N1-SpyCatcher-I53-50A1.1PT1（SEQ ID NO: 20），I53-50B.4PT1（SEQ ID NO: 21）通过PCR扩增、酶切重组方法连接至修改的原核表达载体pET-28a中。

(2)对于真核表达系统表达和纯化蛋白，方法如下：将测序正确的VRC8400-RBD-SpyTag-8*His，VRC8400-RBD-8*His，VRC8400-hACE2-8*his和VRC8400-hACE2-hFc的菌液以1:100体积比例接种到1L的TB培养基中，37℃，220 rpm过夜培养。菌液以4500 rpm离心10min之后，收集菌体，重悬、裂解和中和，经过离子交换等步骤提取大肠杆菌的重组质粒。以质粒：PEI-MAX=1: 5转染密度为1.0×10⁶的HEK293F细胞，1mg/L, 转染5天后，收集细胞上清。离心之后，上清经过0.22 μm滤膜过滤。对于蛋白携带His的标签，上清流穿Ni-NTA亲和层析色谱柱，咪唑洗脱目的蛋白，浓缩并经过凝胶层析柱进一步纯化，收集蛋白峰的蛋白跑SDS-PAGE验证，收集目的蛋白并浓缩，BCA方法测定纯化的蛋白浓度，分装，液氮速冻并冻存于-80℃。对于Fc标签的蛋白，上清流穿Protein A色谱柱，PBS清洗10个柱体积，0.2 M甘氨酸，PH 3.0，洗脱目的蛋白，进一步纯化方法同His标签蛋白。

(3)对于原核表达系统表达和纯化蛋白，方法如下：将重组载体pET-28a-N1-SpyCatcher-Ferritin, pET-28a-△N1-SpyCatcher-mi3，pET-28a-△N1-SpyCatcher-I53-50A1.1PT1，pET-28a-I53-50B.4PT1转化至大肠杆菌感受态Rosseta细胞中，抗性（卡那霉素和氯霉素）筛选阳性克隆和在37℃扩大培养目的细菌之后，在20 ℃加入终浓度为0.5 mM化学诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导目的蛋白表达，经过16-20 h诱导，收集菌体，高压破碎，离心取上清和0.22μm过滤，对于His标签的蛋白，进行如上蛋白亲和层析和分子筛纯化得到高纯度目的蛋白，即重组的纳米颗粒蛋白。纯化的△N1-SpyCatcher-I53-50A1.1PT1和I53-50B.4PT1在体外室温以亚基1:1比例组装，并经过分子筛Superose 6Increase 10/300 GL 凝胶过滤柱分离目的蛋白。

(4)将纯化的三个纳米颗粒蛋白（＞20 μM）和SARS-CoV-2的RBD-SpyTag蛋白在室温以亚基摩尔质量比8:1或者以上比例孵育12h，孵育的缓冲液为：50 mM HEPES，pH 7.3,300 mM NaCl, 当孵育过后，纳米颗粒与SARS-CoV-2的RBD-SpyTag蛋白的共轭混合液经过Superose 6 Increase 10/300 GL 凝胶过滤柱去除RBD单体蛋白，纯化得到目的蛋白。

3、结果

如图1C所示，表达和纯化了高纯度的RBD蛋白和三种纳米颗粒△N1-SpyCatcher-Ferritin,△N1-SpyCatcher-mi3 ，△N1-SpyCatcher-I53-50，以及三种纳米颗粒分别与RBD蛋白通过SpyTag和△N1-SpyCatcher的酰胺键共轭的RBD-Ferritin，RBD-mi3和RBD-I53-50纳米颗粒疫苗。

实施例3 RBD共轭的纳米颗粒蛋白的表征

1、实验材料

(1)试剂与耗材：300目铜网、一次性耐溶剂微型试管等均为商品化常用试剂与耗材。

(2)仪器设备：120KV透射电镜（FEI，USA），Nano differential scanningfluorimetry （NanoDSF ）Systems （NanoTemper Technologies）和Zetasizer Ultra（Malvern,UK）。

2、实验步骤

2.1负染透射电镜

（1）稀释RBD共轭的纳米颗粒蛋白和△N1-SpyCatcher-NPs（未共轭空颗粒）蛋白浓度为0.05-0.2 mg/mL，移液器吸取蛋白10 μL滴在干净的塑料膜上，将放电之后的碳涂层铜网放于蛋白溶液中2 min，用滤纸轻轻地吸干，然后用双蒸水轻轻地清洗两次，滤纸吸干，然后与2 %乙酸铀孵育染色2 min，并且自然地风干。

（2）染色后的蛋白样品进行透射电镜观察颗粒的大小和形态。

2.2通过Zetasizer Ultra检测颗粒的粒径

（1）将RBD共轭的纳米颗粒蛋白和△N1-SpyCatche-NPs蛋白离心10min，12000 rpm，用PBS稀释蛋白浓度为0.5 mg/mL，加入40 μL样品至一次性耐溶剂微型试管样品池中，静置3min。

（2）使用马尔文公司Zetasizer Ultra仪器检测纳米颗粒的粒径，设置测量角度为173°，通过测量散射光的强度来确定纯化蛋白的尺寸分布。

2.3 使用NanoDSF Systems检测颗粒疫苗的Tm值和Tagg值

（1）将RBD共轭的纳米颗粒蛋白和△N1-SpyCatche-NPs蛋白离心10 min，12000 rpm，用PBS稀释蛋白浓度为0.5 mg/mL，加入10 μL样品至石英毛细管中，并放入卡槽中。每个样品设置三个重复。

（2）PR.ThermControl软件中设置参数，升温速率为1℃/min，升温范围为20 ℃-95℃。

（3）Dsicovery Scan之后，确定样品无误，设置30 % Excitation Power, 开始Melting Scan。

3、实验结果

如图2所示，为RBD共轭的纳米颗粒蛋白和△N1-SpyCatche-NPs蛋白的透射电镜图，结果表明所有重组纳米颗粒蛋白均形成了均一的颗粒，并且RBD共轭的3种纳米颗粒蛋白的颗粒直径要轻微大于△N1-SpyCatche-NPs蛋白。表1为RBD共轭的纳米颗粒蛋白和△N1-SpyCatche-NPs蛋白的水合粒径的大小和分布。

动态光散射结果表明，如表1，重组纳米颗粒蛋白由于外面包着一层水，使重组纳米颗粒蛋白的水合半径相对于透射电镜结果于轻微增大，RBD单体蛋白为8.98±0.03nm，△N1-SpyCatche-Ferritin为28.75±0.18nm，RBD-Ferritin为32.99±0.04nm，△N1-SpyCatche-mi3为41.87±0.39nm，RBD-mi3为55.19±0.49nm，△N1-SpyCatche-I53-50为46.54±0.40nm，RBD-I53-50为50.67±0.11nm。相对于单体纳米颗粒，RBD共轭的纳米颗粒蛋白更大，表明△N1-SpyCatche-NPs蛋白外面展示着RBD蛋白。高通量蛋白稳定分析仪分析显示RBD和RBD共轭的纳米颗粒蛋白的Tm值在45℃左右，然而RBD-I53-50在70℃左右会聚集（表1）。

表1纳米颗粒的DLS和DSF结果表格

R_d: 流体动力学直径；

PDI: 分散度指标，小于0.2时则表示颗粒分布单一；

T_m1:第一解链温度；

T_m2: 第二解链温度；

T_aggr: 聚集温度；

如上参数均来自于软件生成的参数值。

实施例4. RBD共轭的纳米颗粒蛋白的抗原特性

1、实验材料

（1）试剂与耗材：蛋白A、蛋白G、蛋白A 芯片、SA芯片、ELISA板和EL-TMB显色试剂盒等均为商品化常用试剂与耗材。

（2）抗体：羊抗人、羊抗鼠和羊抗兔HRP共轭的IgG H&L均为商品化抗体(Promega)，羊抗兔hACE2 多克隆抗体（义翘神州）。

2、实验步骤

2.1纯化CB6抗体

（1）CB6抗体的重链和轻链IgG基因克隆至VH和VK表达载体中，提取质粒，并以DNA浓度1:1.2比例转染至HEK293F细胞中，经过Protein A基质和凝胶柱分离纯化，获得CB6抗体。

2.2 ELISA

2.2.1 RBD共轭的纳米颗粒和SARS-CoV-2病毒的受体hACE2的亲和能力

（1）纯化hACE2-8*his蛋白。如实施例2所示，在HEK293F细胞表达并纯化hACE2蛋白。

（2）将SARS-CoV-2病毒S蛋白的受体结合区（RBD-SpyTag）和RBD共轭的纳米颗粒蛋白（RBD-Ferritin，RBD-mi3和RBD-I53-50）以及对照组BSA以PBS作为稀释液，稀释成1 μg/mL, 分别包被ELISA板，100 ng/孔，总体积为100 μL，4°C包被过夜，PBST洗三次，加入封闭液 (PBS中含有2 % gelatin, 5 % casino 和 0.1 % proclin 30)过夜封闭。每个样品设置三个重复。

（3）稀释hACE2蛋白。蛋白浓度起始为50 μg/mL，连续5倍稀释，共12个梯度，蛋白和蛋白复合物在37℃孵育2 h。

（4）PBST洗3次，加入1:5000稀释的抗ACE2蛋白的多克隆兔抗，37 ℃孵育1 h。

（5）PBST洗5次，加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶共轭的羊抗兔IgG二抗（Promega Cat# W4011, RRID:AB_430833），37℃孵育45 min。

（6）PBST洗5次，去除未结合的抗体，加入TMB显色液，孵育15 min后加入终止液，读取OD₄₅₀和OD₆₃₀的吸光值，在GraphPad Prism 8软件绘制抗原和受体亲和曲线。

2.2.2 RBD共轭的纳米颗粒和RBD特定的抗体CB6的亲和能力

（1）将SARS-CoV-2病毒S蛋白的受体结合区（RBD-SpyTag）和RBD共轭的纳米颗粒蛋白（RBD-Ferritin，RBD-mi3和RBD-I53-50）以及对照组BSA以PBS作为稀释液，稀释成1 μg/mL,分别包被ELISA板，100 ng/孔，总体积为100 μL，4 °C包被过夜，PBST洗三次，加入封闭液(PBS溶液含有2 % gelatin, 5 % casino 和 0.1 % proclin 30)过夜封闭。每个样品设置三个重复。

（2）稀释CB6抗体。抗体浓度起始为250 μg/mL，连续5倍稀释，共12个梯度，蛋白和抗体复合物在37 ℃孵育2 h。

（3）PBST洗5次，加入1:5000稀释的HRP共轭的羊抗人IgG二抗（Promega， Cat#W4031, RRID:AB_430835），37 ℃孵育45 min。

（4）PBST洗5次，加入TMB显色液，孵育15min后加入终止液，读取OD₄₅₀和OD₆₃₀的吸光值，在GraphPad Prism 8软件绘制抗原和抗体亲和曲线。

2.3 生物膜干涉技术（BLI）分析

在Octet Red 96 (Fortebio)仪器上进行BLI分析，温度为30℃，每分钟振动1000转。信号以默认的标准频率(5.0 Hz)采集。

动力学检测:首先，将链霉亲和素(SA)生物传感器(Fortebio)在含有0.05 %Tween 20 (Sigma-Aldrich)的PBS (ThermoFisher)中预孵育15min，在整个过程中使用该缓冲液。为了将RBD蛋白连接到生物传感器上，使用EZ-link-Sulfo-NHS-biotin生物素化试剂盒(ThermoFisher)对RBD/ACE2/CB6抗体进行生物素化处理，操作步骤如下。

步骤1:计算生物素化试剂用量

1. 计算添加到反应中的生物素试剂的毫摩尔量为20倍摩尔过量的量；

2. 计算10 mM生物素试剂溶液的体积加入到反应中；

步骤2:将计算量的10 mM生物素试剂加入RBD/ACE2/CB6蛋白中，PBS (5 mg/mL, 200 μL)室温孵育30分钟。

步骤3:脱盐

用10 mL PBS平衡脱盐柱PD-10 (GE Pharmacia)，平衡后，将反应溶液加入柱中，分别用400 μL PBS洗涤和洗脱。

为进行动力学检测，基线结合60 s后，用缓冲液稀释的ACE/ CB6-生物素化蛋白在SA传感器上以2 μg/mL捕获120 s。然后将RBD单体或同RBD单体的等摩尔质量浓度的RBD-共轭的纳米颗粒进行连续2倍梯度稀释，在生物传感器上结合180 s，然后进行300 s的解离，在10 mM pH 1.5的甘氨酸上进行3轮再生。曲线数据采用ForteBio数据分析软件进行分析。进行1:1结合模型拟合之前，将原始曲线与基线信号进行调整。然后对所有结合解离曲线进行全局拟合，绘制总体动力学参数(kD、kon、kdis等)。

3、结果

为了验证三种RBD共轭的纳米颗粒的抗原性，我们使用SARS-CoV-2 ACE2和抗体CB6去验证纯化的RBD共轭的纳米颗粒的抗原性。ACE2能够识别SARS-CoV-2 S蛋白的受体结合区。CB6抗体为从COVID-19康复病人利用B细胞分选分离获得的抗体，能够识别SARS-CoV-2 S蛋白的受体结合区，并且具有中和SARS-CoV-2病毒的能力。本研究的结果如图3A所示，ACE2蛋白都能识别RBD共轭的纳米颗粒和RBD单体蛋白，并且没有显著性差异。CB6抗体虽然都能识别RBD共轭的纳米颗粒和RBD单体蛋白，但是相对于识别RBD单体，三种RBD共轭的纳米颗粒能够更强的结合CB6抗体，暗示着RBD共轭的纳米颗粒可能具有更高的抗原性。

我们应用生物膜层干涉法进一步检测RBD共轭的纳米颗粒的结合动力学。如图3B和表2所示，测量了RBD单体和两个RBD共轭的纳米颗粒， RBD-Ferritin 和RBD-I53-50, 结合hACE2受体的亲和常数值(kD)分别为4.34E-09, 1.74E-08 和1.00E-09 M。然而, RBD-mi3 纳米颗粒解离非常缓慢，和hACE2之间的结合解离常数kD值达到1.0 e-12 M，表明RBD-mi3 NP与RBD-Ferritin NP和RBD-I53-50 NP相比，表现出更高的抗原性。同时测定了RBD共轭纳米颗粒与CB6抗体的结合动力学。三种RBD偶联纳米颗粒与CB6抗体的结合能力明显强于RBD单体(图3C和表2)，说明三种RBD偶联纳米颗粒可能对靶向SARS-CoV-2 RBD的特异性BCR具有更高的亲和力。

表2BLI的动力参数表

k_D: 结合常数；

k_on: 结合速率；

k_dis: 解离速率。

实施例5 RBD共轭的纳米颗粒对BALB/c小鼠的免疫原性

1、实验材料

（1）小鼠：雌性6~8周的BALB/c小鼠。

（2）佐剂：商品化Sigma Adjuvant Systerm（SAS，Sigma）和AddaVax佐剂（InvivoGen）。

（3）其他试剂耗材均为商品化常规试剂耗材。

2、实验步骤

45只6-8周龄BALB/c雌性小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，随机分为9组。免疫前用PBS稀释纯化后的免疫原，用等体积的AddaVax 佐剂(InvivoGen)或SigmaAdjuvant System (SAS，Sigma)轻轻混匀，在4℃孵育过夜，40 RPM，使佐剂和抗原在4℃下充分粘附吸收。每组小鼠在第0、2、4周经皮下注射免疫3次。免疫剂量为RBD单体5 μg/只，与RBD单体等摩尔质量的三种RBD-conjugated NPs： RBD-mi3 (9.51 μg/只)，RBD-Ferritin(9.34 μg/只) 和 RBD-I53-50 (11.91 μg/只)。PBS作为阴性对照。每次免疫接种后10天采集小鼠眼眶血，在37℃放置30分钟以达到充分凝固。取血样，4℃离心12000 RPM，离心10min，轻轻提取上层血清，56 ℃热灭活30 min，使补体因子和病原体失活，-20℃保存备用。

间接酶联免疫吸附试验：分离样品的血清通过间接酶联免疫吸附试验检测小鼠血清抗SARS-CoV-2 RBD结合的总IgG滴度、IgG1和 IgG2a抗体滴度。 PBS稀释RBD的C端不携带SpyTag单体蛋白,浓度为1 μg/mL，包被96孔高结合ELISA板，100μL/孔，放置4℃过夜；配置如上的封闭液，加入封闭液至ELISA板中，100μL/孔，4℃过夜；稀释血清：血清起始浓度为1:50，然后以5倍为梯度，PBS为稀释液，连续稀释到10^-8，加入到ELISA板中，37℃孵育1 h；PBST洗5次，分别加入以1:5000稀释的辣根过氧化物酶共轭的羊抗鼠总IgG，IgG1或者IgG2a抗体，37℃孵育45 min；PBST洗5次，加入显色液TMB，37℃孵育15 min之后加入2 M H₂SO₄终止反应；在450 nm和630 nm处，SpectraMax Plus读板机(Molecular Devices，USA)立即测定吸光度。结果用GraphPad Prism 8绘制并拟合，拟合曲线采用4参数非线性回归拟合计算EC50值。

血清竞争试验（生物膜层干涉法）：收集第二次加强免疫免疫原和AddaVax佐剂等体积混合加强免疫接种后的小鼠血清，将同一免疫原组的每只小鼠的等体积(5 μL)血清混合在一起，以体现该组的整体特征。为了进行竞争测定试验，在生物传感器上捕获浓度为5μg/mL 以上的RBD-生物素蛋白。然后，为了饱和RBD，每组和对照组的2倍连续稀释的小鼠血清混合PBST被加载到生物传感器上300 s。加载结束后，将400 mM ACE2或CB6抗体与生物传感器结合300 s，检测各稀释水平小鼠血清饱和情况下的竞争性结合信号。用pH为1.5的10mM甘氨酸再生传感器。采集实时信号数据，通过不同曲线的ACE2/CB6结合信号显示竞争行为。结合信号数据从曲线中检索，Ro代表饱和非竞争结合曲线高度，Rc代表各稀释水平的饱和竞争结合曲线。各血清稀释水平的相对竞争水平可计算为(Ro-Rc)/Rc。

3. 实验结果

本研究的结果，如图4B所示，免疫等体积混合AddaVax或SAS佐剂和RBD单体一个剂量，并没有诱导RBD特异性总的IgG抗体。相对于RBD单体蛋白，免疫三种RBD共轭的纳米颗粒，RBD-Ferritin，RBD-mi3或者RBD-I53-50，和等体积的AddaVax佐剂混合皮下免疫能够诱导71.8 至168.4倍的RBD特异性总的IgG抗体(ED₅₀: 分别为10^3.8±0.4, 10^3.9±0.2, 10^4.2±0.2)。与Addvax佐剂类似，添加SAS佐剂与RBD-Ferritin，RBD-mi3或者 RBD-I53-50颗粒蛋白诱导小鼠几乎产生相同的抗原特异性结合抗体(ED₅₀: 分别为10^4.1±0.3, 10^4.0±0.2, 10^4.3±0.2)。随着加强免疫第一次和第二次，RBD共轭纳米颗粒添加AddaVax或者SAS佐剂诱导的总IgG结合抗体逐渐升高，相对于免疫RBD单体具有显著的升高趋势（图4B）。为了探究免疫过程中免疫应答的细节，我们进一步评估了所引出抗体的IgG亚型，结果显示，无论IgG亚型如何，不同免疫组组间的抗体效价均呈现相似趋势。此外，IgG1:IgG2a在整个免疫过程中各组间结合抗体滴度比均大于1，说明抗体诱导主要为Th2免疫反应。

除抗体产生强度外，产生抗体的中和能力是影响免疫质量的另一个关键因素。因此，为了进一步评估RBD偶联纳米颗粒的免疫原性，我们通过BLI方法进行了血清竞争测定。取第2次加强免疫后的小鼠血清，在各组中混合进行综合评价。连续2倍稀释后，依次稀释后的血清应用于生物传感器捕获的RBD上进行阻断。我们观察到，与RBD单体相比，在不同稀释水平下，RBD偶联纳米颗粒组的血清会优先阻碍ACE2和CB6抗体与RBD结合(图4C)。记录结合信号后，各稀释水平的非竞争性结合曲线高度Ro和竞争性结合曲线Rc可用于定量分析。小鼠血清相对竞争水平的热图进一步显示，RBD偶联纳米颗粒组的竞争水平比单体RBD组强4-16倍 (图4D)。随着RBD表面拷贝数的增加，RBD-Ferritin与RBD- I53 -50/mi3 纳米颗粒之间的竞争更加激烈。相对竞争展现的更强水平可能表明病毒上的spike蛋白的RBD能够更持久地侵入并阻碍其与ACE2结合以防止细胞感染，这将通过中和试验进一步证实。

实施例6 利用SARS-CoV-2假病毒和活病毒测定并比较免疫RBD共轭纳米颗粒和RBD单体诱导的血清中和滴度

为了验证RBD共轭纳米颗粒在小鼠诱导产生中和抗体能力，6周龄BALB/c鼠皮下免疫RBD单体5 μg/只，与RBD单体等摩尔质量的三种RBD-conjugated NPs： RBD-mi3 (9.51 μg/只)，RBD-Ferritin (9.34 μg/只) 和 RBD-I53-50 (11.91 μg/只)，PBS作为对照组，每组5只。间隔两周之后再加强免疫，一共两次。每次免疫10天之后，采集血清。为了评估免疫RBD共轭纳米颗粒诱导产生的血清中和抗体滴度，我们利用SARS-CoV-2假病毒、活病毒引起细胞病变方法（cytopathic effect，CPE）和焦点减少中和测试（Focus ReductionNeutralization Test，FRNT）。

SARS-CoV-2假病毒：根据先前报道，SARS-CoV-2假病毒在HEK293T细胞产生。简短地说，HEK293T细胞通过PEI-MAX以质量比1:2:1转染PsPAX2, pCMV14-SARS-CoV-2 S ΔCT-3×Flag 和pLenti-GFP，转染5 h后换上新鲜完全培养基，64 h之后收获包含SARS-CoV-2假病毒的上清，经过PEG₈₀₀₀溶液的沉淀，浓缩冻存于-80℃。为了检测血清中和抗体滴度，1.75×10⁴ HEK293T-hACE2 细胞在病毒感染之前12 h铺于96孔细胞培养板。小鼠血清起始浓度1:20，以完全培养基连续4倍梯度稀释血清，加入等体积的SARS-CoV-2假病毒，共100 μL，放于37℃孵育2 h。血清和病毒混合物加入至HEK293T-hACE2细胞感染2 h，弃去细胞上清，感染48 h之后，加入裂解液和通过Dual-Glo荧光素酶检测系统(Promega)测定荧光素酶活性。细胞不含小鼠血清和仅仅加入病毒分别作为阴性和阳性对照。研究结果示图5A所示，在第2次增强免疫之后采集的血清中，以AddaVax佐剂配制的RBD偶联纳米颗粒收集的血清中和效价比RBD单体对照组血清的中和效价高约10 ~ 120倍。同样地，当免疫原和SAS佐剂配置的疫苗也能得到类似的结果。

我们进一步采用CPE和焦点减少中和测试的方法，检测了活SARS-CoV-2病毒对血清的中和活性。

PRNT₉₀：焦点减少中和测试的方法如先前报道一致。简短地说，血清从1:10开始稀释，连续稀释5倍，与100 斑点形成单位（Focus Forming Unit，FFU）SARS-CoV-2 CHN/IQTC01/2020毒株等体积混合，加入到在96孔培养板中，37 ℃培养1 h。然后将混合物加入预先接种了Vero-E6细胞的96孔板中。在37 ℃、5% CO₂的条件下孵育1小时后，混合物被去除，代之以含1.2%羧甲基纤维素的100 μL MEM，预加热至37℃，再培养24小时。此后，细胞用4 %多聚甲醛固定和含0.2 % Triton X-100的PBS内化，然后孵育抗兔的SARS-CoV-2核衣壳蛋白抗体(义翘神州)，室温孵育1小时，之后添加辣根过氧化物酶共轭的1:4000稀释的山羊抗兔IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. West Grove, PA)。使用TrueBlue™过氧化物酶底物(KPL)着色。焦点依靠ELISPOT读板机测定并计算(CellularTechnology Ltd. Cleveland, OH)。将90%中和抗体滴度(NT₉₀)定义为抑制病毒感染90%FFU的血清稀释的倒数，用GraphPad Prism 8对拟合曲线进行4参数非线性回归拟合并计算。结果如图5B所示，使用AddaVax佐剂配置的RBD-Ferritin、RBD-mi3或者RBD-I53-50纳米疫苗在第二次增强免疫免疫小鼠之后10天采集的血清的中和抗体滴度要比RBD单体高约10-40倍。与AddaVax类似，三种含SAS佐剂的RBD偶联纳米颗粒的FRNT₉₀滴度也显示出明显高于RBD单体(图4B)。

CPE建立的中和试验：血清开始在以1:4稀释，用DMEM补充2 % FBS和1 %青霉素和链霉素连续稀释4倍，并加入等体积的100组织培养感染剂量(half tissue cultureinfective doses，TCID₅₀) SARS-CoV-2-XN4276活病毒，在37℃孵育2 h。孵育过后，混合物加入到预先在96孔培养板已铺好的Vero-E6细胞，在37℃和 5 %二氧化碳孵育96 h，观察CPE。每个培养皿设置纯病毒处理孔、纯稀释血清处理孔或仅细胞作为对照。同时在每个平板上进行病毒返滴定。所有稀释后的血清样本做2个重复。所有血清的中和抗体滴度被定义为感染后4天能够中和50 %病毒感染的血清稀释的倒数。

表3根据诱导细胞病变效应(CPE)测定的SARS-CoV-2活病毒中和效价表

结果如表3所示，在免疫一个剂量之后，各组间的中和作用互相比较之后发现RBD-mi3、RBD-Ferritin和RBD-I53-50纳米颗粒能够诱导中和抗体，然而免疫RBD单体没有诱导任何的中和抗体。随着免疫程序的加强，无论使用何种佐剂，RBD偶联纳米颗粒组血清样本的中和效果都明显优于单体RBD组。特别的是，RBD纳米颗粒偶联组在第1次免疫加强后可以观察到血清中和活性的比较，而单体RBD组在第2次免疫加强后才有同等强度的中和，这期间纳米颗粒组的中和活性几乎提高了10倍。有趣的是，当我们在组间进行平行对比时，RBD-Ferritin 纳米颗粒表现出相对于其他两种纳米颗粒较差的效果，这与竞争分析是一致的（表3）。

实施例7 免疫RBD共轭的纳米颗粒诱导的细胞免疫

为了验证RBD共轭纳米颗粒在小鼠诱导T细胞免疫反应能力，小鼠在免疫三次之后12天进行安乐死，采集小鼠引流淋巴结。为了同时识别生发中心（germinal center，GC）B 细胞和T卵泡辅助细胞（T follicular helper cells，Tfh），引流淋巴结制备成细胞悬液，细胞染色固定活性染色剂780，通过CD16/32抗体封闭，然后用如下抗体进行染色标记：anti-B220-BV421 (BD Biosciences)，anti-IgD-PE (BD Biosciences), anti-GL7-AlexaFluor 647 (BD Biosciences)，anti-CD95-FITC (BD Biosciences), anti-CD4-BV510(BD Biosciences)，anti-CD44-BV786 (BD Biosciences)，anti-ICOS-PE-Cyanine7 (BDBiosciences)，anti-CXCR5-PE-CF594 (BD Biosciences)和anti-PD-1-APC-R700 (BDBiosciences)。使用CytoFLEX S流式细胞仪(BECKMAN COULTER)采集标记样品的荧光信号。结果如图6A和6B所示，相对于单体RBD，RBD共轭的纳米颗粒皮下免疫三次之后采集的引流淋巴结的Tfh和GC细胞数并没有观察到明显的差异。

为了深入观察RBD共轭纳米颗粒在小鼠诱导T细胞免疫反应能力，小鼠在免疫之后40天进行安乐死，采集小鼠引流淋巴结和脾脏进行细胞内因子染色。引流淋巴结和脾脏经过RPMI 160清洗，制备成细胞悬液，经过40 μm尼龙网过滤，清洗，加入红细胞裂解液(双蒸水中含1.5 M NH₄Cl，100 mM NaHCO₃，10 mM EDTA，pH7.4)。红细胞裂解之后，细胞离心、清洗以及计数。大约1.0 ×10⁶淋巴细胞加入至6孔板中，加入anti-CD16/32抗体阻止Fc受体，随后加入15μg/mL 的RBD单体蛋白刺激3 h之后，加入GolgiStop和GolgiPlug (BDBiosciences)孵育额外的15h，阻止细胞内因子分泌至上清。细胞清洗之后，加入anti-CD3e-PerCP-Cy5.5 (BD Biosciences)，anti-CD4-BV510 (BD Biosciences) 和 anti-CD8a FITC (BD Biosciences)标记。细胞加入4 %多聚甲醛固定和含2 % BSA，0.1 %saponin，0.05 % Na₃N的PBS内化。最后，细胞清洗两次，加入如下抗体：anti-IFN-γ- PE-CY7 (BD Biosciences)，anti-IL-2-APC (BD Biosciences)，anti-TNF-α-PE (BDBiosciences) 和 control anti-IgG1进行标记。使用CytoFLEX S流式细胞仪(BECKMANCOULTER)采集标记样品的荧光信号。

结果如图6C，6D和图7所示，相对于单体RBD，RBD共轭的纳米颗粒皮下免疫三次之后采集的引流淋巴结和脾脏CD4，CD8aT细胞共表达IL-2，IFN-γ或者TNF-α并没有显著性差异，这个结果和已经报道的RBD-SC-dimer免疫小鼠采集的脾脏结果一致【Dai, L., et al.A Universal Design of Betacoronavirus Vaccines against COVID-19, MERS, andSARS. Cell 182, 722-733 e711 (2020)】。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中山大学，中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所）

<120> SARS-CoV-2 RBD共轭纳米颗粒疫苗

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 223

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

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Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

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<213> Artificial Sequence

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Met Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu

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Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met

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Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu

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Phe Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu

50 55 60

Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile

65 70 75 80

Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys

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Ala Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val

100 105 110

Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln

115 120 125

Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile

130 135 140

Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His Gly Leu Tyr Leu

145 150 155 160

Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys Ser

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<211> 205

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<400> 3

Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu

1 5 10 15

Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Lys Lys Lys Ala Leu Ala Val Phe

20 25 30

Leu Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala

35 40 45

Asp Thr Val Ile Lys Glu Leu Ser Phe Leu Lys Glu Met Gly Ala Ile

50 55 60

Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Ala Arg Lys Ala Val

65 70 75 80

Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile

85 90 95

Ser Gln Phe Ala Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met

100 105 110

Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Thr Ile Leu

115 120 125

Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met

130 135 140

Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn

145 150 155 160

Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly

165 170 175

Val Gly Ser Ala Leu Val Lys Gly Thr Pro Val Glu Val Ala Glu Lys

180 185 190

Ala Lys Ala Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu

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<213> Artificial Sequence

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Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu

1 5 10 15

Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe

20 25 30

Ala Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala

35 40 45

Asp Thr Val Ile Lys Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile

50 55 60

Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val

65 70 75 80

Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile

85 90 95

Ser Gln Phe Cys Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met

100 105 110

Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu

115 120 125

Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met

130 135 140

Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn

145 150 155 160

Leu Asp Asn Val Cys Lys Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly

165 170 175

Val Gly Lys Ala Leu Val Lys Gly Lys Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys

180 185 190

Ala Lys Lys Phe Val Lys Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu Gly Ser Leu

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Glu

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Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

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Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala

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Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

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Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

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100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Asn Tyr Asp Lys Ser Lys Ala His Thr Leu

115 120 125

Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala

130 135 140

Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala Gly Ser Leu

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Glu

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Gly Ser Ser Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu

1 5 10 15

Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser

20 25 30

Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe

35 40 45

Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala Ala Pro Asp

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Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn Glu Gln Gly

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Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile

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Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

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Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

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Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

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Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

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Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Gly

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Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ala His Ile Val Met Val Asp Ala

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Tyr Lys Pro Thr Lys

245

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Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys

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Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr

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Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile Gly Gly Ser Gly

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Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe

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Ser Lys Asp Ile Glu Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met

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Gln Ser Ser Asn Leu Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr His

130 135 140

Ser Leu Asp Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu

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Tyr Glu His Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val

165 170 175

Pro Val Gln Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly

180 185 190

Leu Thr Gln Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser

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Glu Ser Ile Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His

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Ala Thr Phe Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu

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Glu Val Leu Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn

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275

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<213> Artificial Sequence

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Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys

1 5 10 15

Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Thr

20 25 30

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65 70 75 80

Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile Gly Gly Ser Gly

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Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys

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Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala

115 120 125

Lys Lys Lys Ala Leu Ala Val Phe Leu Gly Gly Val His Leu Ile Glu

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Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr Val Ile Lys Glu Leu Ser

145 150 155 160

Phe Leu Lys Glu Met Gly Ala Ile Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser

165 170 175

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180 185 190

Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile Ser Gln Phe Ala Lys Glu Lys Gly

195 200 205

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210 215 220

Met Lys Leu Gly His Thr Ile Leu Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

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Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser

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65 70 75 80

Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile

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Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe Ala Gly Gly Val His

130 135 140

Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr Val Ile Lys

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Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Ile Gly Ala Gly Thr

165 170 175

Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val Glu Ser Gly Ala Glu

180 185 190

Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile Ser Gln Phe Cys Lys

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Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met Thr Pro Thr Glu Leu

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Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu Lys Leu Phe Pro Gly

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Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met Lys Gly Pro Phe Pro

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Lys Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu Gly Ser Leu Glu

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<211> 305

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65 70 75 80

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115 120 125

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130 135 140

Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu

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Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg

165 170 175

Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr

180 185 190

Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr

195 200 205

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210 215 220

Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro

225 230 235 240

Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys

245 250 255

Cys Val Asn Phe Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ala His Ile

260 265 270

Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys Gly Ser Arg Ser Leu Glu

275 280 285

Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Ser Gly His His His His His His His

290 295 300

His

305

<210> 13

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<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 13

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Ser Gly Gly Ser Glu Ser Gln Val Arg Gln Gln Phe Ser Lys Asp Ile

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Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln Leu

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Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln Ile

195 200 205

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210 215 220

Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe Asn

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Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu Phe

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Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg Lys

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<211> 321

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 14

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His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly

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Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr

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65 70 75 80

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Ser Gly Gly Ser Met Lys Met Glu Glu Leu Phe Lys Lys His Lys Ile

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Val Ala Val Leu Arg Ala Asn Ser Val Glu Glu Ala Lys Lys Lys Ala

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Leu Ala Val Phe Leu Gly Gly Val His Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr

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Val Pro Asp Ala Asp Thr Val Ile Lys Glu Leu Ser Phe Leu Lys Glu

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Met Gly Ala Ile Ile Gly Ala Gly Thr Val Thr Ser Val Glu Gln Ala

180 185 190

Arg Lys Ala Val Glu Ser Gly Ala Glu Phe Ile Val Ser Pro His Leu

195 200 205

Asp Glu Glu Ile Ser Gln Phe Ala Lys Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met

210 215 220

Pro Gly Val Met Thr Pro Thr Glu Leu Val Lys Ala Met Lys Leu Gly

225 230 235 240

His Thr Ile Leu Lys Leu Phe Pro Gly Glu Val Val Gly Pro Gln Phe

245 250 255

Val Lys Ala Met Lys Gly Pro Phe Pro Asn Val Lys Phe Val Pro Thr

260 265 270

Gly Gly Val Asn Leu Asp Asn Val Cys Glu Trp Phe Lys Ala Gly Val

275 280 285

Leu Ala Val Gly Val Gly Ser Ala Leu Val Lys Gly Thr Pro Val Glu

290 295 300

Val Ala Glu Lys Ala Lys Ala Phe Val Glu Lys Ile Arg Gly Cys Thr

305 310 315 320

Glu

<210> 15

<211> 320

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 15

Met Gly Ser Ser Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys Arg Asp

1 5 10 15

Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg Asp Ser

20 25 30

Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val Lys Asp

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65 70 75 80

Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala His Ile

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Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Met Glu Glu

100 105 110

Leu Phe Lys Lys His Lys Ile Val Ala Val Leu Arg Ala Asn Ser Val

115 120 125

Glu Glu Ala Ile Glu Lys Ala Val Ala Val Phe Ala Gly Gly Val His

130 135 140

Leu Ile Glu Ile Thr Phe Thr Val Pro Asp Ala Asp Thr Val Ile Lys

145 150 155 160

Ala Leu Ser Val Leu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Ile Gly Ala Gly Thr

165 170 175

Val Thr Ser Val Glu Gln Cys Arg Lys Ala Val Glu Ser Gly Ala Glu

180 185 190

Phe Ile Val Ser Pro His Leu Asp Glu Glu Ile Ser Gln Phe Cys Lys

195 200 205

Glu Lys Gly Val Phe Tyr Met Pro Gly Val Met Thr Pro Thr Glu Leu

210 215 220

Val Lys Ala Met Lys Leu Gly His Asp Ile Leu Lys Leu Phe Pro Gly

225 230 235 240

Glu Val Val Gly Pro Gln Phe Val Lys Ala Met Lys Gly Pro Phe Pro

245 250 255

Asn Val Lys Phe Val Pro Thr Gly Gly Val Asn Leu Asp Asn Val Cys

260 265 270

Lys Trp Phe Lys Ala Gly Val Leu Ala Val Gly Val Gly Lys Ala Leu

275 280 285

Val Lys Gly Lys Pro Asp Glu Val Arg Glu Lys Ala Lys Lys Phe Val

290 295 300

Lys Lys Ile Arg Gly Cys Thr Glu Gly Ser Leu Glu His His His His

305 310 315 320

<210> 16

<211> 167

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 16

Met Asn Gln His Ser His Lys Asp His Glu Thr Val Arg Ile Ala Val

1 5 10 15

Val Arg Ala Arg Trp His Ala Glu Ile Val Asp Ala Cys Val Ser Ala

20 25 30

Phe Glu Ala Ala Met Arg Asp Ile Gly Gly Asp Arg Phe Ala Val Asp

35 40 45

Val Phe Asp Val Pro Gly Ala Tyr Glu Ile Pro Leu His Ala Arg Thr

50 55 60

Leu Ala Glu Thr Gly Arg Tyr Gly Ala Val Leu Gly Thr Ala Phe Val

65 70 75 80

Val Asn Gly Gly Ile Tyr Arg His Glu Phe Val Ala Ser Ala Val Ile

85 90 95

Asn Gly Met Met Asn Val Gln Leu Asn Thr Gly Val Pro Val Leu Ser

100 105 110

Ala Val Leu Thr Pro His Asn Tyr Asp Lys Ser Lys Ala His Thr Leu

115 120 125

Leu Phe Leu Ala Leu Phe Ala Val Lys Gly Met Glu Ala Ala Arg Ala

130 135 140

Cys Val Glu Ile Leu Ala Ala Arg Glu Lys Ile Ala Ala Gly Ser Leu

145 150 155 160

Glu His His His His His His

165

<210> 17

<211> 915

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

atggacgcca tgaagagggg cctgtgctgc gtgctgctgc tgtgtggcgc cgtgtttgtg 60

tcccccagcc aggaaatcca cgcccggttc agaagaggcg ccagaggatc cagggtgcag 120

ccaaccgagt ctatcgtgcg ctttcctaat atcacaaacc tgtgcccatt tggcgaggtg 180

ttcaacgcaa cccgcttcgc cagcgtgtac gcctggaata ggaagcggat cagcaactgc 240

gtggccgact atagcgtgct gtacaactcc gcctctttca gcacctttaa gtgctatggc 300

gtgtccccca caaagctgaa tgacctgtgc tttaccaacg tctacgccga ttctttcgtg 360

atcaggggcg acgaggtgcg ccagatcgcc cccggccaga caggcaagat cgcagactac 420

aattataagc tgccagacga tttcaccggc tgcgtgatcg cctggaacag caacaatctg 480

gattccaaag tgggcggcaa ctacaattat ctgtaccggc tgtttagaaa gagcaatctg 540

aagcccttcg agagggacat ctctacagaa atctaccagg ccggcagcac cccttgcaat 600

ggcgtggagg gctttaactg ttatttccca ctccagtcct acggcttcca gcccacaaac 660

ggcgtgggct atcagcctta ccgcgtggtg gtgctgagct ttgagctgct gcacgcccca 720

gcaacagtgt gcggccccaa gaagtccacc aatctggtga agaacaagtg cgtgaacttc 780

ggctccggag ggtcaggcgg atctggggct catattgtta tggttgatgc ttacaagcca 840

actaagggat ccagatctct ggaggtgctg tttcagggac caggctccgg acatcatcat 900

catcatcatc accac 915

<210> 18

<211> 870

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

atgcaccatc atcaccacca ccaccacggt agcagcgaca gcgcgaccca catcaaattc 60

agcaagcgtg acgaggatgg taaagaactg gcgggcgcga ccatggagct gcgtgatagc 120

agcggcaaga ccatcagcac ctggattagc gacggccagg tgaaagattt ctacctgtat 180

ccgggcaagt acacctttgt tgaaaccgcg gcgccggatg gttatgaagt ggcgaccgcg 240

atcaccttca ccgttaacga acagggtcaa gtgaccgtta acggtaaagc gaccaagggc 300

gatgcgcaca ttggtggcag cggtggcagc ggtggcagcg gtggcagcga gtcccaggtg 360

cggcagcagt tctctaagga catcgagaag ctgctgaacg agcaagtgaa taaggagatg 420

cagagctcca acctgtacat gagcatgtct agctggtgct atacccactc cctggacgga 480

gcaggactgt tcctgtttga tcacgccgcc gaggagtacg agcacgccaa gaagctgatc 540

atctttctga atgagaacaa tgtgcccgtg cagctgacct ccatctctgc ccctgagcac 600

aagttcgagg gcctgacaca gatctttcag aaggcctacg agcacgagca gcacatcagc 660

gagtccatca acaatatcgt ggaccacgcc atcaagtcta aggatcacgc cacattcaac 720

tttctgcagt ggtacgtggc cgagcagcac gaggaggagg tgctgttcaa ggacatcctg 780

gataagatcg agctgatcgg caacgagaat cacggcctgt acctggccga tcagtatgtg 840

aagggcatcg ccaagtctag aaagagctaa 870

<210> 19

<211> 966

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

atgcaccatc atcaccacca ccaccacggt agcagcgaca gcgcgaccca catcaaattc 60

agcaagcgtg acgaggatgg taaagaactg gcgggcgcga ccatggagct gcgtgatagc 120

agcggcaaga ccatcagcac ctggattagc gacggccagg tgaaagattt ctacctgtat 180

ccgggcaagt acacctttgt tgaaaccgcg gcgccggatg gttatgaagt ggcgaccgcg 240

atcaccttca ccgttaacga acagggtcaa gtgaccgtta acggtaaagc gaccaagggc 300

gatgcgcaca ttggtggcag cggtggcagc ggtggcagcg gtggcagcat gaaaatggag 360

gaactgttta agaaacacaa gatcgtggcg gttctgcgtg cgaacagcgt ggaggaagcg 420

aagaaaaagg cgctggcggt gttcctgggt ggcgttcacc tgatcgagat tacctttacc 480

gtgccggacg cggataccgt tattaaagag ctgagcttcc tgaaggaaat gggcgcgatc 540

attggtgcgg gcaccgtgac cagcgttgaa caggcgcgta aagcggtgga gagcggtgcg 600

gaatttatcg ttagcccgca cctggacgag gaaattagcc aattcgcgaa agagaagggt 660

gtgttttaca tgccgggcgt tatgaccccg accgaactgg tgaaagcgat gaagctgggc 720

cacaccatcc tgaaactgtt cccgggtgag gtggttggcc cgcaatttgt taaagcgatg 780

aagggtccgt tcccgaacgt gaagtttgtt ccgaccggtg gcgtgaacct ggataacgtt 840

tgcgaatggt tcaaagcggg cgtgctggcg gtgggtgttg gcagcgcgct ggttaagggt 900

accccggttg aggtggcgga aaaagcgaag gcgtttgttg agaagattcg tggttgcacc 960

gaataa 966

<210> 20

<211> 966

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

atgggtagca gcgacagcgc gacccacatc aaattcagca agcgtgacga ggatggtaaa 60

gaactggcgg gcgcgaccat ggagctgcgt gatagcagcg gcaagaccat cagcacctgg 120

attagcgacg gccaggtgaa agatttctac ctgtatccgg gcaagtacac ctttgttgaa 180

accgcggcgc cggatggtta tgaagtggcg accgcgatca ccttcaccgt taacgaacag 240

ggtcaagtga ccgttaacgg taaagcgacc aagggcgatg cgcacattgg tggcagcggt 300

ggcagcggtg gcagcggtgg cagcaagatg gaggaactgt tcaagaaaca caaaatcgtg 360

gcggttctgc gtgcgaacag cgttgaggaa gcgattgaga aagcggtggc ggtttttgcg 420

ggtggcgtgc acctgatcga aattaccttt accgtgccgg acgcggatac cgttatcaag 480

gcgctgagcg tgctgaagga gaaaggtgcg atcattggtg cgggcaccgt gaccagcgtt 540

gaacagtgcc gtaaagcggt tgagagcggc gcggaattta tcgtgagccc gcacctggac 600

gaggaaatta gccaattctg caaggagaag ggtgtgttct acatgccggg cgtgatgacc 660

ccgaccgaac tggttaaggc gatgaaactg ggtcacgata tcctgaagct gttcccgggt 720

gaggtggttg gcccgcagtt tgtgaaggcg atgaaaggcc cgttcccgaa cgtgaaattt 780

gttccgaccg gtggcgtgaa cctggacaac gtttgcaagt ggttcaaagc gggtgttctg 840

gcggtgggtg ttggcaaggc gctggttaag ggcaaaccgg atgaagtgcg tgaaaaggcg 900

aagaaattcg tgaagaaaat tcgtggttgc accgagggca gcctggaaca ccaccaccac 960

caccac 966

<210> 21

<211> 504

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

atgaaccagc acagccacaa ggaccacgag accgtgcgta ttgcggtggt tcgtgcgcgt 60

tggcatgcgg agattgtgga tgcgtgcgtt agcgcgttcg aagcggcgat gcgtgacatc 120

ggtggcgatc gtttcgcggt ggacgttttt gatgtgccgg gtgcgtacga gattccgctg 180

catgcgcgta ccctggcgga aaccggtcgt tatggcgcgg ttctgggcac cgcgttcgtg 240

gttaacggtg gcatctaccg tcacgaattt gtggcgagcg cggttattaa cggtatgatg 300

aacgtgcaac tgaacaccgg cgtgccggtt ctgagcgcgg ttctgacccc gcacaactat 360

gacaagagca aagcgcacac cctgctgttc ctggcgctgt ttgcggtgaa gggtatggaa 420

gcggcgcgtg cgtgcgttga gatcctggcg gcgcgtgaaa aaattgcggc gggcagcctg 480

gaacaccacc accaccacca ctaa 504

Claims

1.免疫原性复合物，其特征在于，包含：

b）与SpyTag融合表达的SARS-CoV-2病毒的RBD抗原；

所述载体蛋白选自mi3和I53-50；

所述载体蛋白与所述抗原之间通过SpyCatcher-SpyTag共价连接；

其中：

所述RBD抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；

所述mi3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示；所述I53-50蛋白由三聚体I53-50A1.1PT1和五聚体I53-50B.4PT1组装而成，所述I53-50A1.1PT1含有SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列；所述I53-50B.4PT1含有SEQ ID NO: 5所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的免疫原性复合物，其特征在于，a）组分中所述SpyCatcher与所述载体蛋白通过连接肽融合；

和/或；

b）组分中所述SpyTag与所述RBD抗原通过连接肽融合。

3.根据权利要求2所述的免疫原性复合物，其特征在于，所述连接肽为柔性连接肽。

4.根据权利要求3所述的免疫原性复合物，其特征在于，a）组分中所述连接肽的氨基酸序列为GGSGGSGGSGGS。

5.根据权利要求1~4任一项所述的免疫原性复合物，其特征在于，所述SpyCatcher位于所述载体蛋白的N端。

6.根据权利要求1~4任一项所述的免疫原性复合物，其特征在于，所述SpyTag位于所述载体蛋白的C端。

7.根据权利要求1~4任一项所述的免疫原性复合物，其特征在于，所述SpyTag含有SEQID NO: 6所示的氨基酸序列；所述SpyCatcher含有SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。

8.纳米颗粒疫苗，其特征在于，包含权利要求1~7任一项所述的免疫原性复合物。

9.根据权利要求8的纳米颗粒疫苗，其特征在于，还包括药学上可接受的载体和/或佐剂。

10.根据权利要求9所述的纳米颗粒疫苗，其特征在于，所述佐剂为Sigma AdjuvantSysterm和/或AddaVax。

11.成套试剂盒，其特征在于，包含权利要求8~10任一项所述的纳米颗粒疫苗，以及用于接种所述纳米颗粒疫苗的容器。

12.权利要求1~7任一项所述的免疫原性复合物的制备方法，其特征在于，包括：

13.权利要求1~7任一项所述的免疫原性复合物，或权利要求8~10任一项所述的纳米颗粒疫苗在制备用于治疗新型冠状肺炎的药物中的应用。