CN105792842B - 埃巴病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

提供了新的疫苗，其诱导对埃巴病毒(EBV)的中和抗体。一些疫苗包含在它们的表面上展示来自EBV的包膜蛋白的纳米颗粒。所述纳米颗粒包含融合蛋白，其包含自组装蛋白的单体亚基，例如铁蛋白，连接于EBV包膜蛋白的至少一部分。所述融合蛋白自组装以形成展示包膜蛋白的纳米颗粒。这些疫苗可以用于对个体疫苗接种以针对不同类型的埃巴病毒，以及与从其获得所述EBV包膜蛋白的病毒抗原性不同的埃巴病毒的感染。还提供融合蛋白和编码这类蛋白的核酸分子。

Description

埃巴病毒疫苗
对序列表的引用
本申请含有命名为“6137NIAID-34-PROV_Sequence_Listing_ST25.txt”，具有以字节计412KB的大小，创建于2013年10月11日，作为电子文本文件提交的序列表。该电子文件中含有的信息依据37CFR§1.52(e)(5)通过提述在此以其整体并入。
发明简述
本发明提供新的，基于纳米颗粒的埃巴病毒(Epstein–Barr virus)疫苗，其易于制造，有效，且其引起针对埃巴病毒的中和抗体。具体的，本发明提供新的埃巴病毒蛋白-铁蛋白纳米颗粒(np)疫苗。这类纳米颗粒包含融合蛋白，其每一个包含自组装蛋白的单体亚基，例如铁蛋白，与埃巴病毒包膜蛋白的免疫原性部分连接。因为这类纳米颗粒在它们的表面上展示埃巴病毒蛋白，它们可以用于疫苗接种个体针对埃巴病毒。
本发明的一个实施方案中是纳米颗粒，其包括第一融合蛋白，其与来自第一埃巴病毒包膜蛋白的至少一个免疫原性部分连接，所述第一埃巴病毒包膜蛋白选自gp350，gH，gL，gp42，gB和BMRF2。所述第一融合蛋白包括来自能够自组装为纳米颗粒的单体亚基蛋白的至少25个连续的氨基酸。此外，所述纳米颗粒在其表面上表达所述至少一个免疫原性部分。
所述自组装蛋白的单体亚基可以选自单体铁蛋白亚基蛋白，单体encapsulin蛋白，单体03-33蛋白，单体SOR蛋白，单体LS蛋白和单体PDC蛋白。在单体铁蛋白亚基蛋白的实施方案中，其可以选自细菌，植物，藻类、昆虫，真菌和哺乳动物铁蛋白。更具体的，所述单体亚基蛋白可以选自幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)铁蛋白的单体亚基，大肠杆菌蛋白的单体亚基和牛蛙(bullfrog)铁蛋白的单体亚基。另外，所述单体铁蛋白亚基蛋白可以是杂合蛋白，其包括牛蛙铁蛋白的至少部分连接到选自幽门螺杆菌铁蛋白和大肠杆菌铁蛋白的铁蛋白的至少部分。
所述单体亚基自组装蛋白可以包括选自下组的氨基酸序列的至少25个连续的氨基酸，与选自下组的氨基酸序列至少约80％相同，或包含选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO:2，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:17，SEQ IDNO:20，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:29。
所述第一埃巴病毒包膜蛋白可以来自埃巴病毒1型或埃巴病毒2型。另外，所述来自第一埃巴病毒包膜蛋白的至少一个免疫原性部分可以包括选自下组的氨基酸序列的至少100个氨基酸：SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:59，SEQ IDNO:62，SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:130，SEQ ID NO:132，SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:136。此外，所述至少一个免疫原性部分可以包括至少一个选自下组的域：EBVgp350域I,EBV gp350域II和EBV gp350域III。另外，所述至少一个免疫原性部分可以包括EBV gp350域I和域II的氨基酸序列。此外，所述至少一个免疫原性部分可以包括EBVgp350CR2结合位点。
在本实施方案中，所述第一EBV包膜蛋白可以包括与选自以下的氨基酸序列至少约80％相同的氨基酸序列，与选自以下的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或可以引起对选自以下的氨基酸序列的免疫应答的氨基酸序列：SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:53，SEQ IDNO:56，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:130，SEQID NO:132，SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:136。
所述第一融合蛋白可以包含接头序列。
所述纳米颗粒可以引起针对埃巴病毒的免疫响应，包括埃巴与从其获得埃巴病毒包膜蛋白的株，以及与从其获得埃巴病毒包膜蛋白的埃巴病毒抗原性相异的埃巴病毒是异源的埃巴病毒株。
所述第一融合蛋白可以包括与选自以下的序列至少约80％相同或相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:83，SEQ IDNO:86，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:95，SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:101，SEQID NO:104，SEQ ID NO:128，SEQ ID NO:134，SEQ ID NO:142，SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:146，其中所述纳米颗粒引起针对埃巴病毒的免疫应答。
所述纳米颗粒可以进一步包括第二融合蛋白，其包括来自第二埃巴病毒包膜蛋白的至少一个免疫原性部分，所述第二埃巴病毒包膜蛋白选自gp350，gH，gL，gp42，gB和BMRF2。在本实施方案中，所述第一和第二埃巴病毒包膜蛋白不相同且所述纳米颗粒在其表面上表达所述来自第二融合蛋白的至少一个免疫原性部分。
本发明的进一步的实施方案是疫苗组合物，其包括任意一种前述的纳米颗粒。所述疫苗组合物可以进一步包括至少一种另外的纳米颗粒，其包括第二融合蛋白，所述第二融合蛋白具有来自能够自组装为纳米颗粒的单体亚基蛋白的至少25个连续的氨基酸且其连接到来自可以是gp350，gH，gL，gp42，gB和BMRF2的第二埃巴病毒包膜蛋白的至少一个免疫原性部分。在本实施方案中，所述第二融合蛋白的至少一个免疫原性部分来自于埃巴病毒包膜蛋白，其与第一埃巴病毒包膜蛋白来自不同的埃巴病毒株，且所述纳米颗粒在其表面上表达所述第二融合蛋白的至少一个免疫原性部分。
本发明的进一步的实施方案是产生针对埃巴病毒的疫苗的方法。所述方法包括表达融合蛋白，其包含来自能够自组装为纳米颗粒的单体亚基蛋白的至少25个连续的氨基酸，且其连接到来自选自gp350，gH，gL，gp42，gB和BMRF2的第一埃巴病毒包膜蛋白的至少一个免疫原性部分。该表达步骤在这样的条件下进行，使得所述融合蛋白形成在其表面上展示埃巴病毒的至少一个免疫原性部分的纳米颗粒。所述方法进一步包括回收纳米颗粒。
本发明的进一步的实施方案是针对埃巴病毒疫苗接种个体的方法，其包括将纳米颗粒施用到个体使得所述纳米颗粒引起针对埃巴病毒的免疫响应。所述纳米颗粒包括融合蛋白，其包括来自能够自组装为纳米颗粒的单体亚基蛋白的至少25个连续的氨基酸且其连接到选自gp350，gH，gL，gp42，gB和BMRF2的第一埃巴病毒包膜蛋白的至少一个免疫原性部分。在本实施方案中，所述纳米颗粒在其表面上展示来自埃巴病毒包膜蛋白的至少一个免疫原性部分。在本疫苗接种方法中，所述纳米颗粒可以引起针对以下埃巴病毒株的免疫应答，所述埃巴病毒株与从其获得包膜蛋白的埃巴病毒株，或与从其获得包膜蛋白的埃巴病毒抗原性相异的埃巴病毒是异源的。
所述疫苗接种的方法可以包括向所述个体施用第一疫苗组合物然后在后来的时间施用第二疫苗组合物，其包括包含融合蛋白的纳米颗粒，所述融合蛋白包含来自能够自组装为纳米颗粒的单体亚基蛋白的至少25个连续的氨基酸且其连接到选自gp350，gH，gL，gp42，gB和BMRF2的第一埃巴病毒包膜蛋白的至少一个免疫原性部分。在本实施方案中，所述纳米颗粒在其表面上展示来自埃巴病毒包膜蛋白的至少一个免疫原性部分。在本实施方案中，所述融合蛋白可以包括与选自以下的氨基酸序列至少约80％相同或相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:71，SEQ ID NO:74，SEQ ID NO:77，SEQ ID NO:80，SEQ ID NO:83，SEQ IDNO:86，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:95，SEQ ID NO:98，SEQ ID NO:101，SEQID NO:104，SEQ ID NO:128，SEQ ID NO:134，SEQ ID NO:142，SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:146。
在本实施方案中，可以在所述第一疫苗组合物的施用后十天到四周之间施用所述第二疫苗组合物。在本实施方案中，可以在所述第一疫苗组合物的施用后十天到两个月之间施用所述第二疫苗组合物。在一个实施方案中，在第一疫苗组合物施用后六个月施用第三疫苗组合物。
本发明进一步的实施方案是融合蛋白，其包括来自能够自组装为纳米颗粒的单体亚基蛋白的至少25个连续的氨基酸且其连接到选自gp350，gH，gL，gp42，gB和BMRF2的埃巴病毒包膜蛋白的至少一个免疫原性部分。在本实施方案中，所述单体亚基可以选自单体铁蛋白亚基蛋白，单体encapsulin蛋白，单体03-33蛋白，单体SOR蛋白，单体LS蛋白和单体PDC蛋白。所述单体铁蛋白亚基蛋白可以选自细菌，植物，藻类，昆虫，真菌和哺乳动物铁蛋白。此外，所述单体铁蛋白亚基蛋白可以选自幽门螺杆菌铁蛋白的单体亚基，大肠杆菌铁蛋白的单体亚基和牛蛙铁蛋白的单体亚基。此外，所述单体铁蛋白亚基蛋白可以是杂合蛋白，其包括牛蛙铁蛋白的至少部分连接于幽门螺杆菌铁蛋白或大肠杆菌铁蛋白的至少部分。更进一步，所述单体铁蛋白亚基蛋白可以包含氨基酸序列，其与选自以下的氨基酸氨基酸至少约80％相同，相同，或包含选自以下的氨基酸序列的至少25个连续的氨基酸：SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:23，SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:29，其中所述融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。所述融合蛋白可以是埃巴病毒包膜蛋白1型或2型。
所述融合蛋白的至少一个免疫原性部分可以包括来自选自以下的氨基酸序列的至少100个氨基酸：SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:41，SEQ IDNO:44，SEQ ID NO:47，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:59，SEQ IDNO:62，SEQ ID NO:65，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:130，SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:136。所述至少一个免疫原性部分可以包括选自以下的至少一个域：EBV gp350域I,EBV gp350域II和EBV gp350域III。此外，所述至少一个免疫原性部分可以包括EBV gp350域I和域II的氨基酸序列。更进一步，所述至少一个免疫原性部分可以包括EBV gp350CR2结合位点。
所述EBV包膜蛋白可以包括与选自以下的氨基酸序列至少约80％相同或相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:44，SEQID NO:47，SEQ ID NO:50，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:62，SEQID NO:65，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:130，SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:136。所述融合蛋白的EBV包膜蛋白可以能够引起针对包括选自以下的氨基酸序列的蛋白的免疫应答：SEQ IDNO:32，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:41，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:47，SEQ IDNO:50，SEQ ID NO:53，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:62，SEQ ID NO:65，SEQ IDNO:68，SEQ ID NO:130，SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:136。
所述融合蛋白还可以包括接头序列。
本发明的进一步的实施方案包括核酸分子，其编码前述的融合蛋白。所述核酸分子可以功能性地连接到启动子。
本发明更进一步的实施方案是重组细胞，其包括前述的核酸分子。
本发明的进一步的实施方案是重组病毒，其包括前述的核酸分子。
背景
埃巴病毒(HBV)，也称为人类疱疹病毒4(HHV-4)，是感染性单核细胞增多症(IM)的主要病原体，且还与几种人类癌症相关，其中全世界每年超过300,000人被感染。世界卫生组织估测全世界95％的成人感染有EBV且是该病毒的携带者。对于大多数个体，EBV不引起任何症状且不能与常见的，温和的儿童疾病区分。目前，没有针对EBV的疫苗。然而，通过疫苗接种预防IM和EBV相关的恶性肿瘤将具有重大的公众健康和经济益处。
EBV具有线性的，双链DNA基因组，包含约192千碱基(KB)的DNA，由蛋白衣壳(capsid)包围。所述衣壳由蛋白被膜(protein tegument)包围，被膜又由包膜(envelope)包围。EBV包膜含有几种蛋白，包括糖蛋白gp350，gH，gB，gM，gp42，gL，gp78，gp150和gN。最丰富的包膜糖蛋白是350/220(gp350)，其结合补体受体2(CR2或CD21)使得EBV能够感染B细胞，而糖蛋白gH和gp42分别结合整联蛋白和人类白细胞抗原II类分子。已经证明了针对gp350上的推定CR2结合位点(CR2BS)的抗体有效地抑制B细胞的EBV感染，因此针对EBV疫苗的努力主要集中在gp350。
除了感染B细胞外，EBV也感染口咽中的上皮细胞，认为其在那里传到B细胞。目前的数据提示EBV对上皮细胞的感染由EBV BMRF2蛋白对上皮细胞的附着起始，接着EBV gH/gL结合整联蛋白，其中整联蛋白作为病毒在上皮细胞上的受体。对gH/gL的抗体在人类血浆中阻碍EBV对上皮细胞的感染(Bu和Cohen，未发表数据)，提示能够诱导对EBV gH/gL抗体的疫苗可以帮助预防由于EBV的感染或人类疾病。
虽然对EBV疫苗的工作仍在继续，迄今没有有效的EBV疫苗。例如，最近完成的有佐剂的重组gp350蛋白疫苗的2期临床试验表明该疫苗不能防止EBV感染，但却是将IM的发病率降低了78％(Sokal,E.M.,et al.J Infect Dis.196:1749-53,2007)。因此，对于提供针对EBV的强力保护的有效的埃巴病毒疫苗仍然存在需求。本发明通过提供新的基于ENV-SA蛋白的纳米颗粒疫苗满足了这种需求，所述疫苗易于制造，有效，并引发针对EBV的中和抗体。
附图简述
图1.对于EBV感染B细胞和上皮细胞必要的分子。EBV进入B细胞由EBV糖蛋白gp350对其细胞受体CR2/CD21的附着起始，接着病毒糖蛋白gp42(其也与EBV gH/gL相互作用形成三聚体)与HLA II类结合。这引起膜融合，其由糖蛋白gB完成。EBV进入上皮细胞认为是由EBV BMRF2对其细胞受体整联蛋白的结合起始，接着gH/gL异源二聚体与其细胞受体整联蛋白结合，随后由gB引起并完成膜融合(图来自Longnecker R,Kieff E,and Cohen JI.埃巴virus.In:Fields Virology 2013)。
图2.截短的gp350变体和基于gp350的纳米颗粒的分子设计。(A)含有CR2结合位点(CR2BS)的截短的gp350的分子设计。以表面呈现示出了EBV gp350受体结合域(RBD)(PDB:2h6o)的晶体结构(顶部)。以氨基酸编号指示了晶体结构中的N-和C-末端残基(B95-8编号)(左边)。全长gp350和其截短的变体的示意图(底部)。Gp350ecto通过去除跨膜(TM)和胞质尾区(CT)截短。Gp350RBD与用于晶体学研究的构建体相同(Szakonyi,G.,et al.,Nat StructMol Biol.13,996-1001,2006)且其含有完整的域I-III和延伸的尾部。Gp350DI/II/III和gp350DI/II进一步截短但分别保留了完整的域I-III和域I-II。(B)可溶性单体gp350和基于gp350的纳米颗粒的设计。可溶性gp350单体构建物通过分别在gp350的N-和C-末端遗传添加修饰的牛催乳素前导序列(bPRL)和多聚组氨酸标签(HIS)制得。基于gp350的铁蛋白通过将bPRL序列随后是gp350变体遗传融合到铁蛋白的N末端构建(幽门螺杆菌-牛蛙杂合体(Hp)或大肠杆菌-牛蛙杂合体(Ec))，在gp350变体和铁蛋白之间具有Ser-Gly接头。基于gp350的encapsulin通过将人类CD5前导(hCD5)序列和gp350变体分别遗传融合到encapsulin(海栖热袍菌(Thermotoga maritima))的N-和C末端来构建，在gp350变体和encapsulin之间具有(Ser-Gly3)2接头。接着将这些融合基因克隆到哺乳动物表达载体中(CMV8x/R)。可溶性gp350ecto和gp350DI/II/III分别命名为VRC 3796和3797。与Ec铁蛋白，Hp铁蛋白和encapsulin融合的Gp350变体分别命名为VRC3421-3424，3425-3428和3429-3432。
图3.基于gH/gL铁蛋白，gH/gL/gp42铁蛋白和gH/gL/gp42encapsulin的纳米颗粒的分子结构和设计。(A)EBV gH/gL异源二聚体的晶体结构(PDB:3PHF)。(B)EBV gp42的带状结构图(Ribbon diagram)(PDB:3FD4)。(C)全长gH，gHD1234-铁蛋白融合蛋白，gHD1234可溶性，全长gL，全长gp42，encapsulin-gp42和gp42可溶性蛋白的示意图。gH-铁蛋白融合蛋白通过将gH胞外域(D1234)融合到铁蛋白的N-末端生成(幽门螺杆菌-牛蛙杂合体(Hp))。可溶性gH通过跨膜域和胞质尾部的删除构建。gH D1234与用于晶体学研究的构建体相同(Matsuura,H.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:22641–22646,2010)。EBV gL是全长野生型gL。Encapsulin-gp42是通过将人CD5前导(hCD5)序列融合到encapsulin(海栖热袍菌)的N末端构建，然后是(Ser-Gly3)2接头，然后是gp42(具有N末端氨基酸1-33缺失)。可溶性gp42通过将人CD5前导(hCD5)序列融合到N-末端截短的gp42以代替缺失的gp42氨基酸1-33构建。
图4.截短的gp350变体和基于gp350的纳米颗粒的纯化。(左边)，固定化的金属离子(Ni++)亲和色谱纯化的、从使用VRC 3796和3797转染的细胞上清获得的基于铁蛋白的gp350纳米颗粒(gp350ecto和gp350DI/II/III)的来源于尺寸排阻色谱(Superdex 200 10/300GL)的色谱。(右边)雪花莲凝集素(雪花莲，Galanthus nivalis)亲和色谱纯化的，从使用CRC 3426和3430转染的细胞上清获得的基于encapsulin的gp350和基于铁蛋白的gp350纳米颗粒的来源于尺寸排阻色谱(Sephacryl S-500 16/60)的色谱。
图5.基于gH/gL铁蛋白和基于gH/gL/gp42铁蛋白的纳米颗粒的纯化。(A)雪花莲凝集素(雪花莲，Galanthus nivalis)亲和色谱纯化的，从分别使用gH D1234-铁蛋白和gL质粒或gH D1234-铁蛋白，gL，和可溶性gp42质粒转染的细胞上清获得的基于gH/gL和gH/gL/gp42铁蛋白的纳米颗粒的来源于尺寸排阻色谱(Sephacryl S-500 16/60柱)的色谱。(B)通过SDS-PAGE表征纳米颗粒。指示了对应gH-铁蛋白，gp42和gL的条带。(C)通过mAb的基于gH/gL/gp42encapsulin的纳米颗粒的免疫沉淀。抗-gp42mAb(F2-1)和抗gH/gL mAb(E1D1)用于检测基于gH/gL/gp42encapsulin的纳米颗粒。HC和LC分别表示重链和轻链。
图6.基于gp350的纳米颗粒的电镜(EM)分析。示出了组装的铁蛋白和encapsulin纳米颗粒(左边)。融合的位点(铁蛋白上的N-末端和encapsulin上的C-末端)示作黑点(铁蛋白上24个位点和encapsulin上60个位点)。基于gp350的纳米颗粒的负染色透射EM照片(中间和右边)，使用Hp铁蛋白(顶部)和encapsulin(底部)平台。基于gp350的纳米颗粒衍生于VRC3426，3427，3430和3431。
图7.基于gH/gL铁蛋白和gH/gL/gp42铁蛋白的纳米颗粒的电镜(EM)分析。示出了基于gH/gL铁蛋白的纳米颗粒(左边)和基于gH/gL/gp42铁蛋白的纳米颗粒(右边)的负染色透射EM图片。
图8.基于截短的gp350变体和gp350的纳米颗粒的抗原性表征。纯化的基于gp350变体和gp350的纳米颗粒对抗gp350单克隆抗体(mAbs)的结合特性。通过ELISA测量了结合的mAbs的终点浓度(左边)。通过mAb的基于gp350的纳米颗粒的免疫沉淀(右边)。中和性抗CR2BS mAb(72A1)和非中和性抗gp350(未指定，不抗CD2BS)mAb(2L10)用于检测基于gp350变体和gp350的纳米颗粒。抗流感HA mAb(C179)用作同种型对照。HC和LC分别指抗体重链和轻链。基于可溶性gp350变体和gp350的纳米颗粒衍生于VRC 3796，3797，3426和3430。
图9.不同的gp350变体和纳米颗粒平台的免疫原性比较。基于gp350D123的纳米颗粒(A)和基于gp350RBD的纳米颗粒(B)的免疫原性。使用5μg所示的基于gp350的纳米颗粒与Ribi佐剂混合在第0周和第3周肌肉内免疫BALB/c小鼠(n＝5)。在第一次(1)和第二次(2)免疫后2周收集免疫血清。通过ELISA(左边)和中和滴度(右边)测量针对可溶性gp350ecto的抗体结合滴度来分析免疫血清。示出了抗gp350ecto的终点滴度(左边)。中和测定基于Raji B细胞系和GFP报告病毒(Sashihara J.,et al.,Virology.391,249-256,2009)且滴度示作抑制病毒进入50％需要的血清稀释(IC50)。每个点代表个体小鼠。条表示平均值和s.d.。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；****,p<0.0001。用于免疫的基于gp350的纳米颗粒衍生于VRC3422，3423，3426，3427，3430和3431。
图10.基于可溶性gp350变体和gp350的纳米颗粒的免疫原性比较。通过ELISA(左边)和LIPS(中间)测定和中和IC50滴度(右边)测量抗gp350抗体结合滴度来分析免疫血清。LIPS测定如先前所述进行(Sashihara J.,et al.,Virology.391,249-256,2009)。每个点代表个体小鼠。条表示均值和s.d.。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；****,p<0.0001。用于免疫的基于gp350变体和gp350的纳米颗粒衍生于VRC 3796，3797，3426和3430。
图11.在基于gp350的纳米颗粒免疫血清中检测针对CR2BS的抗体。(A)使用抗CR2BS(72A1)，抗gp350(2L10,不针对CR2BS)和同种型对照(C179,抗流感)mAbs，对免疫血清的基于表面等离子体共振的交叉竞争测定。每条曲线代表个体小鼠。通过不同的免疫组示出了通过72A1(顶部)和2L10(底部)对免疫血清的交叉竞争。(B)免疫血清中针对CR2BS的抗体和2L10样抗体的相对百分比。每个点代表个体小鼠，条代表均值和s.d.。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；****,p<0.0001。用于免疫的基于gp350的胞外域和gp350的纳米颗粒衍生于VRC 3796，3426和3430。
图12.使用基于可溶性gp350和gp350的纳米颗粒免疫后的血清中和滴度的动力学。使用5ug(上组)或0.5ug(下组)的可溶性gp350胞外域(左边)，D123-铁蛋白(中间)或D123-encapsulin(右边)与Ribi佐剂混合在第0，3和16周肌肉内免疫BALB/c小鼠组(n＝5)。免疫后定期收集免疫血清并测定血清中和IC50滴度。用于免疫的基于gp350胞外域和gp350的纳米颗粒衍生于VRC 3796，3426和3430。
图13.EBV阳性人类个体和基于gp350的纳米颗粒免疫的小鼠中血清中和滴度的比较。(左组)EBV-血清反应阳性个体和具有EBV阳性的单核细胞增多症的人的组合(n＝18)和基于gp350的纳米颗粒免疫的小鼠(第二次免疫后2周时滴度，联合组示于图9和图10中，n＝35)之间血清中和滴度(IC50)的比较。(右组)EBV-血清反应阳性的感染性单核细胞增多症人类个体(每个个体的峰值中和滴度，n＝15)和D123-铁蛋白免疫的小鼠(第二次免疫后2周时滴度，联合组示于图6中，n＝10)之间血清中和滴度(IC50)的比较。每个点代表个体血清样品，且条表示均值和s.d.。用于免疫的基于gp350的纳米颗粒衍生于VRC 3422，3423，3426，3427，3430和3431。
图14.牛蛙-大肠杆菌和牛蛙-幽门螺杆菌杂合铁蛋白的生成。示出了人(轻链)，牛蛙(红细胞低级亚基)和细菌(大肠杆菌非血红素铁蛋白，FtnA)的晶体结构(左边)。人和牛蛙铁蛋白中延伸的N末端部分(圈出的)暴露于组装的铁蛋白纳米颗粒的表面上，且对应的区域在大肠杆菌(和幽门螺杆菌)铁蛋白中缺失(使用虚线圈出)。为了制造杂合铁蛋白将牛蛙铁蛋白N末端延伸的部分移植到大肠杆菌或幽门螺杆菌铁蛋白。编码杂合大肠杆菌-牛蛙和幽门螺杆菌-牛蛙铁蛋白的质粒分别命名为VRC 3384和3419。
图15.免疫的小鼠血清中基于可溶性gH/gL,可溶性gH/gL/gp42,gH/gL铁蛋白的纳米颗粒和基于gH/gL/gp42铁蛋白的纳米颗粒的抗体滴度的比较。使用0.5μg所示蛋白和Ribi佐剂在第0周和第3周肌肉内免疫BALB/c小鼠(n＝5)。通过萤光素酶免疫沉淀系统(LIPS)测定在第5周测量免疫血清中对gH/gL(A)和gp42(B)的抗体滴度。LIPS测定如先前所述进行(Sashihara J.,et al.,Virology.391,249-256,2009)。条指示中位数和范围。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；ns,无显著差异。
图16.B细胞(A)和上皮细胞(B)中基于可溶性gH/gL,可溶性gH/gL/gp42，铁蛋白的纳米颗粒和基于铁蛋白的gH/gL/gp42纳米颗粒的中和的比较。使用0.5μg所示蛋白和Ribi佐剂在第0周和第3周免疫BALB/c小鼠组(n＝5)。(A)中和测定基于使用GFP报告病毒的B细胞感染(Sashihara J.,et al.,Virology.391,249-256,2009)且滴度表示为能够抑制病毒感染50％的血清稀释(IC50)。(B)通过将以2倍步骤系列稀释的小鼠血清与GFP报告病毒孵育2小时进行对上皮细胞的EBV感染的中和。将混合物添加到96孔板中的SVK-CR2细胞(表达CR2，一种EBV受体的上皮细胞系)并在37℃孵育3天。使用1x PBS洗涤细胞，胰蛋白酶化，并在溶于PBS的2％多聚甲醛中固定。定量GFP阳性细胞，且滴度表示为能够抑制病毒感染50％的血清稀释(IC50)。每个点代表个体小鼠。条表示中位数和范围。*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；ns,无显著差异。
图17.(A)免疫和采样时间表。来自使用基于可溶性gH/gL或gH/gL铁蛋白的纳米颗粒(B)和基于可溶性gH/gL/gp42或gH/gL/gp42铁蛋白的纳米颗粒(C)免疫的小鼠的血清中gH/gL抗体滴度动力学的比较。
图18.(A)免疫和采样时间表。(B)来自使用基于可溶性gH/gL/gp42或gH/gL/gp42铁蛋白的纳米颗粒免疫的小鼠的血清中gp42抗体滴度动力学的比较。
图19.(A)免疫和采样时间表。来自使用基于可溶性gH/gL或gH/gL铁蛋白的纳米颗粒(B)和基于可溶性gH/gL/gp42或gH/gL/gp42铁蛋白的纳米颗粒(C)免疫的小鼠的血清中B细胞中和抗体滴度的动力学的比较。
图20.(A)免疫和采样时间表。来自使用基于可溶性gH/gL或gH/gL铁蛋白的纳米颗粒(B)和基于可溶性gH/gL/gp42或gH/gL/gp42铁蛋白的纳米颗粒(C)免疫的小鼠的血清中上皮细胞中和抗体滴度的动力学的比较。
图21.与来自自然感染的人类血清相比，使用可溶性蛋白或基于铁蛋白的纳米颗粒免疫的小鼠的血清中第3次给药后(A)B细胞中和抗体和(B)上皮细胞中和抗体滴度。每个点代表一个个体。标绘了中位数滴度和范围。N.S.表示差异不是统计学上显著的。**,p<0.01,***,p<0.001,和****,p<0.0001。
图22.(A)表达gH/gL纳米颗粒或gH/gL/gp42纳米颗粒的单个多肽的设计。(B)通过尺寸排阻色谱(B)纯化的gH/gL纳米颗粒和gH/gL/gp42纳米颗粒的SDS-PAGE分析。跑道示出了从使用表达个体蛋白的质粒(共转染)或表达单个多肽的一个质粒共转染的细胞纯化的蛋白，所述单个多肽在细胞内自发剪切。
图23.食蟹猴中EBV gp350纳米颗粒的免疫原性。(A)免疫时间表。(B)使用SigmaAdjuvant System，来自使用50μg可溶性gp350胞外域蛋白(左边四条)，25μg的gp350D123-铁蛋白(中间四条)或25μg的gp350D123-encapsulin(右边四条)免疫的猴的血清中中和病毒的滴度。
图24.EBV gp350免疫的小鼠在使用表达EBV gp350的重组牛痘病毒激发后的生存曲线。小鼠未免疫(对照)或使用0.5ug(左边)或5.0μg(右边)的gp350胞外域，gp350D123-铁蛋白，或gp350D123-encapsulin免疫3次。每组免疫五只小鼠。
图25.EBV gp350-纳米颗粒没有佐剂，具有磷酸铝凝胶(alum)或SigmaAdjuvantSystem(SAS)佐剂的免疫原性。使用5μg的gp350D123-铁蛋白(左边)或gp350D123-encapsulin(右边)在第0，4和16周免疫小鼠。在最终免疫后2周收集血液样品并测量病毒中和滴度。
发明详述
本发明涉及用于埃巴病毒(EBV)的新的疫苗。更具体的，本发明涉及包含EBV包膜蛋白的新的融合蛋白，其中所述融合蛋白自组装为在其表面上展示EBV包膜蛋白的免疫原性部分的纳米颗粒。这类纳米颗粒可用于针对EBV对个体疫苗接种。相应地，本发明还涉及用于产生这类纳米颗粒的融合蛋白和编码这类蛋白的核酸分子。另外，本发明涉及，产生本发明的纳米颗粒的方法，和使用这类纳米颗粒疫苗针对EBV对个体疫苗接种的方法。
在进一步描述本发明之前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方案，因为这些当然可以变化。还应当理解本文使用的术语仅为了描述具体实施方案的目的，而不意图为限制性的，因为本发明的范围将仅由权利要求限制。
应当注意，如本文中及所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数提及物，除非上下文另有明确规定。例如，核酸分子指一种或多种核酸分子。因此，术语“一个”、“一种”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”可以互换使用。类似地，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。进一步注意到，权利要求书可以撰写为排除任何任选要素。因此，此陈述意图充当与权利要求要素的记载结合使用排除术语如“单独”、“仅”等，或者使用“负”限定的前置基础。
在上文外，除非另有明确定义，本文中公开的各个实施方案共同的下列术语和短语如下定义：
如本文中使用的，术语免疫原性指特定蛋白质或其特定区域引发对特定蛋白质，或包含与特定蛋白质具有高度同一性的氨基酸序列的蛋白质的免疫应答的能力。依照本发明，两种具有高度同一性的蛋白质具有至少80％相同，至少85％相同，至少87％相同，至少90％相同，至少92％相同，至少94％相同，至少96％相同，至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列。
如本文中使用的，对本发明的疫苗或纳米颗粒的免疫应答是受试者中形成对疫苗中存在的EBV包膜蛋白的体液和/或细胞免疫应答。出于本发明的目的，“体液免疫应答”指由抗体分子，包括分泌性(IgA)或IgG分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”指由T-淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面牵涉细胞裂解T细胞(“CTL”)的抗原特异性应答。CTL对由主要组织相容性复合物(MHC)编码并且在细胞表面上表达的蛋白质结合呈递的肽抗原具有特异性。CTL帮助诱导并促进对胞内微生物的破坏，或者此类微生物感染的细胞的裂解。细胞免疫的另一个方面牵涉辅助T细胞的抗原特异性应答。辅助T细胞作用为帮助刺激功能，并且聚焦非特异性效应细胞针对在其表面上展示与MHC分子结合的肽抗原的细胞的活性。细胞免疫应答还涉及生成由活化的T细胞和/或其它白细胞，包括那些自CD4+和CD8+T细胞衍生的细胞生成的细胞因子、趋化因子和其它此类分子。
因此，免疫学应答可以是刺激CTL，和/或辅助T细胞生成或活化的应答。也可以刺激趋化因子和/或细胞因子的生成。疫苗也可以引发抗体介导的免疫应答。因此，免疫学应答可以包括下列一种或多种效应：B细胞的抗体(例如IgA或IgG)生成；和/或抑制物、细胞毒性或辅助T细胞和/或特异性针对疫苗中存在的蛋白的T细胞的活化。这些应答可以用来中和感染性，和/或介导抗体-补体，或抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)以对经免疫个体提供保护。可以使用本领域中公知的标准免疫测定法和中和测定法测定此类应答。
根据本发明，用于描述EBV及其组分的所有命名是本领域技术人员通常使用的。因此，EBV(或HHV-4)指代所有的埃巴病毒，包括但不限于，EBV I型，EBV II型，EBV B95-8株，EBV Cao株和EBV RAJI株。EBV的类型指代EBV I型或EBV II型。分类埃巴病毒的方法是是本领域技术人员已知的。
如本文中使用的，中和性抗体指阻止EBV感染细胞、完成一轮复制或建立潜伏的抗体。如本文中定义的，一轮复制指病毒的生命周期，其以病毒附着宿主细胞开始并且以新形成的病毒从宿主细胞中出芽结束。此生命周期包括但不限于附着细胞，进入细胞，产生病毒蛋白，新病毒颗粒的形成和病毒颗粒从宿主细胞膜中出芽的步骤。
如本文中使用的，广泛中和性抗体指中和超过一种EBV类型和/或EBV株的抗体。例如，针对来自EBV I型的包膜蛋白引起的广泛中和抗体可以中和II型病毒。
如本文所使用的，EBV包膜蛋白指代全长EBV包膜蛋白或其任意部分，其能够引起免疫应答。全长EBV包膜蛋白的表位指代这类蛋白的部分，其能够引起针对同源的EBV株的中和抗体应答，所述同源的EBV株即，EBV包膜蛋白从其衍生的株。在一些实施方案中，这样的表位也能够引起针对异源的EBV株的中和抗体应答，所述异源的EBV株即具有与免疫原的包膜蛋白不同的包膜蛋白的株。
如本文中使用的，变体指在序列上与参照序列相似但不相同的蛋白质或核酸分子，其中变体蛋白质(或由变体核酸分子编码的蛋白质)的活性没有显著改变。这些序列变异可以是天然存在的变异或者它们可以经由使用本领域技术人员已知的遗传工程化技术来工程化改造。此类技术的例子可见Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T等,于Molecular Cloning--A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,1989,pp.9.31-9.57)，或于Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6，这两篇的完整内容通过提及并入本文。
就变体而言，氨基酸或核酸序列的任何类型变化是可允许的，只要所得的变体蛋白质保留引发针对埃巴病毒的中和性抗体的能力。此类变异的例子包括但不限于缺失、插入、取代及其组合。例如，就蛋白质而言，本领域技术人员公知的是，一个或多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9或10)氨基酸经常可以从蛋白质的氨基和/或羧基端末端除去，而不显著影响所述蛋白质的活性。类似地，一个或多个(例如2,3,4,5,6,7,8,9或10)氨基酸经常可以插入蛋白质中，而不显著影响蛋白质的活性。
如记录的，相对于本文中公开的蛋白，本发明的变体蛋白质可以含有氨基酸取代。任何氨基酸取代是可允许的，只要蛋白质的活性不受显著影响。在这点上，本领域中理解，氨基酸可以基于其物理特性而分成组。此类组的例子包括但不限于带电荷的氨基酸、不带电荷的氨基酸、极性不带电荷的氨基酸、和疏水性氨基酸。含有取代的优选变体是那些其中的氨基酸用来自相同组的氨基酸取代的变体。此类取代称为保守取代。
天然存在的残基可以基于共同的侧链特性而分成类：
1)疏水性：Met,Ala,Val,Leu,Ile；
2)中性亲水性：Asn,Gln,Cys,Ser,Thr；
3)酸性：Asp,Glu；
4)碱性：His,Lys,Arg；
5)影响链取向的残基：Gly,Pro；和
6)芳香基：Trp,Tyr,Phe。
例如，非保守取代可以牵涉用这些类别之一的成员替换来自另一类别的成员。
在进行氨基酸变化中，可以考虑氨基酸的亲水指数。基于每种氨基酸的疏水性和电荷性质，已给每种氨基酸的亲水指数赋值。亲水指数是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。本领域一般了解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用性生物学功能中的重要性(Kyte等,1982,J.Mol.Biol.157:105-31)。已知可以用某些氨基酸替代其它具有相似亲水指数或分值的氨基酸，而仍然保留相似的生物学活性。在进行基于亲水指数的变化中，亲水指数在±2之内的氨基酸取代是优选的，在±1之内的那些氨基酸取代是特别优选的，且在±0.5之内的那些氨基酸取代是甚至更特别优选的。
本领域还了解可以基于亲水性有效地进行类似氨基酸的取代，特别是在意图将由此产生的生物功能等同性蛋白质或肽用于结合免疫学发明(本案就是如此)的情况中。蛋白质的最大局部平均亲水性(如由其相邻氨基酸的亲水性所决定的)与其免疫原性和抗原性，即与蛋白质的生物学特性相关联。已将下列亲水性数值(hydrophilicity value)赋予这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。在进行基于相似亲水性数值的变化时，亲水性数值在±2之内的氨基酸取代是优选的，在±1之内的那些氨基酸取代是特别优选的，且在±0.5之内的那些氨基酸取代是甚至更特别优选的。还可以基于亲水性鉴定来自一级氨基酸序列的表位。
在期望此类取代时，本领域技术人员可以确定期望的氨基酸取代(无论是保守的还是非保守的)。例如，可以使用氨基酸取代来鉴定EBV包膜蛋白或单体亚基蛋白的重要残基，或者提高或降低本文中描述的蛋白的免疫原性、溶解度或稳定性。下文在表I中显示了例示性的氨基酸取代。
表1
Figure BDA0001009051730000161
Figure BDA0001009051730000171
如本文中使用的，短语显著影响蛋白质活性指将蛋白质活性降低至少10％，至少20％，至少30％，至少40％或至少50％。就本发明而言，此类活性可以例如以蛋白质引发针对EBV病毒的中和性抗体或自组装成纳米颗粒的能力测量。此类活性可以通过测量针对EBV的此类抗体的效价或者通过测量由引发的抗体中和的病毒类型或毒株来测量。测定抗体效价的方法和实施病毒中和测定法的方法是本领域技术人员已知的。在上文描述的活性外，还可以分析变体EBV蛋白结合受体(例如补体受体2)或其他蛋白质的能力。例如，理解EBVgH结合EBV gL以形成二聚体。类似地，理解EBV gH结合EBV gL和gp42以形成三聚体。因此，可以分析变体EBV蛋白结合另一者的能力。测量此类活性的方法是本领域技术人员已知的。
如本文中使用的，融合蛋白指含有已经经由肽键连接在一起以生成单一蛋白质的来自至少两种不相关蛋白质的氨基酸序列的重组蛋白。不相关的氨基酸序列可以彼此直接连接或者它们可以使用接头序列连接。如本文中使用的，若发现蛋白质的氨基酸序列在其自然环境中(例如在细胞内部)通常没有经由肽键连接在一起，则它们是不相关的。例如，通常发现构成铁蛋白的单体亚基的氨基酸序列，和ENV包膜蛋白的氨基酸序列没有经由肽键连接在一起。
术语个体、受试者和患者是本领域中公知的，并且在本文中可互换使用，指对EBV感染易感的任何人或非人灵长类。例子包括但不限于人和其它灵长类，包括非人灵长类，诸如黑猩猩及其它猿和猴物种。术语个体、受试者和患者本身不表示特定年龄、性别、人种，等等。因此，任何年龄的个体(无论雄性或雌性)意图为本公开内容覆盖，并且包括但不限于老年人、成人、儿童、婴孩(babies)、婴儿(infant)、和幼童(toddler)。同样地，本发明的方法可以适用于任何人种，包括例如高加索人(Caucasian)(白种人)、非洲裔美国人(African-American)(黑人)、美洲原住民(Native American)、夏威夷原住民(Native Hawaiian)、西班牙裔(Hispanic)、拉美裔(Latino)、亚裔(Asian)、和欧洲裔。感染的受试者是已知在其体内具有EBV的受试者。
如本文中使用的，术语暴露和类似术语指受试者已经与已知感染EBV的动物个体接触。
本文中讨论的出版物仅提供其在本申请的申请日前的公开内容。本文中的任何内容不应解释为承认凭借在先发明，本发明没有资格早于此类出版物。此外，提供的公开日期可以与实际公开日期不同，这可能需要独立确认。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以用于实施或测试本发明，现在描述优选的方法和材料。本文中提及的所有出版物通过提及收入本文以公开并描述与结合出版物引用的方法和/或材料。
应当领会，本发明的某些特征(为了清楚，其在不同实施方案的背景中描述)也可以在单一实施方案中组合提供。相反，本发明的多个特征(为了简洁，其在单一实施方案的背景中描述)也可以分开或在任何合适的亚组合中提供。实施方案的所有组合是本发明明确涵盖的，并且在本文中公开，就像每种组合单独且明确公开一样。另外，所有亚组合也是本发明明确涵盖的，并且在本文中公开，就像每种此类亚组合在本文中单独且明确公开一样。
根据本发明，提供引起针对埃巴病毒包膜蛋白的中和免疫应答的疫苗。本文公开的一些疫苗可以引起针对整个包膜蛋白的免疫应答，而其它可以引起包膜蛋白特定区域或部分的免疫应答。此外，本发明人已经发现了含有包膜蛋白部分的特定融合蛋白对于引起针对埃巴病毒的免疫应答是有用的。这些实施方案的每一个将在下文中详细公开。
本发明人已经发现了EBV包膜(ENV)蛋白和自组装(SA)蛋白融合以产生ENV-SA融合蛋白，导致引起针对EBV病毒强力免疫应答的疫苗。这类ENV-SA融合蛋白自组装为纳米颗粒，其在它们的表面上展示EBV蛋白的免疫原性部分。这些纳米颗粒可用于针对EBV对个体疫苗接种。因此，本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本文公开的自组装亚基蛋白与本文公开的EBV包膜(ENV)蛋白连接，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。
根据本发明，本发明的自组装(SA)亚基蛋白是全长的，单体多肽，或其任意部分，其能够指导单体自组装亚基蛋白自组装为纳米颗粒。本发明的自组装蛋白的例子包括铁蛋白，encapsulin，硫加氧酶还原酶(SOR)，二氧四氢蝶啶(lumazine)合酶(LS)和丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(E2)。这类蛋白的代表性例子列于以下表2中。
表2
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因此本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，其包含选自下组的自组装亚基蛋白：铁蛋白，encapsulin，硫加氧酶还原酶，二氧四氢蝶啶合酶和二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(E2)，与本文公开的EBV包膜(ENV)蛋白连接，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。
在一个实施方案中，所述自组装蛋白是铁蛋白。铁蛋白形成存在于所有动物，细菌和植物中的球状蛋白，其主要作用于控制多核Fe(III)2O3形成的速率和位置，通过水合铁离子和质子运输到矿化核和从矿化核运输。铁蛋白的球状形式是由单体亚基蛋白(也称为单体铁蛋白亚基)构成的，其为具有分子量约17-20kD的多肽。一个这样的单体铁蛋白亚基的序列的例子由SEQ ID NO:2表示。每个单体铁蛋白亚基具有螺旋束的拓扑结构，其包括四个反平行的螺旋基序，其中第五个较短的螺旋(c-末端螺旋)位于大致垂直于4个螺旋束的长轴。根据惯例，从N-末端分别将螺旋标注为`A,B,C,和D&E`。N-末端序列位于与衣壳三重轴相邻并延伸到表面，而E螺旋线在四重轴处包装在一起，C-末端延伸到颗粒的核中。这一包装的结果在衣壳表面上创造了两个孔。预期这些孔的一个或两个代表了水合铁离子通过其扩散到衣壳中或衣壳外的点。产生后，这些单体铁蛋白亚基蛋白自组装为球状的铁蛋白蛋白质。因此，铁蛋白的球状形式包含24个单体铁蛋白亚基蛋白，并具有衣壳样结构，其具有432对称性。
根据本发明，本发明的单体铁蛋白亚基是铁蛋白蛋白质的全长的，单个多肽，或其任意部分，其能够指导单体铁蛋白亚基自组装为球状形式的蛋白质。来自任意已知铁蛋白蛋白质的单体铁蛋白亚基的氨基酸序列可以用于产生本发明的融合蛋白，只要所述单体铁蛋白亚基能够指导所述融合蛋白自组装为在其表面上展示EBV ENV蛋白的纳米颗粒。在一个实施方案中，所述单体亚基来自选自下组的铁蛋白蛋白质：细菌铁蛋白蛋白质，植物铁蛋白蛋白质，藻类铁蛋白蛋白质，昆虫铁蛋白蛋白质，真菌铁蛋白蛋白质和哺乳动物铁蛋白蛋白质。在一个实施方案中，所述铁蛋白蛋白质来自于幽门螺杆菌。在一个实施方案中，所述铁蛋白蛋白质来自大肠杆菌。在一个实施方案中，所述铁蛋白蛋白质是牛蛙铁蛋白。在一个实施方案中，所述铁蛋白蛋白质包含来自一个或多个选自下组的铁蛋白蛋白质的氨基酸序列：幽门螺杆菌铁蛋白，大肠杆菌铁蛋白和牛蛙铁蛋白。来自本发明的代表性的铁蛋白蛋白质的氨基酸序列公开于本文SEQ ID NO:2(幽门螺杆菌铁蛋白)，SEQ ID NO:5(大肠杆菌铁蛋白)，SEQ ID NO:8(牛蛙铁蛋白)，SEQ ID NO:11(幽门螺杆菌铁蛋白-牛蛙铁蛋白融合)和SEQ ID NO:14(大肠杆菌铁蛋白-牛蛙铁蛋白融合)。
在一个实施方案中，所述自组装蛋白是encapsulin。根据本发明，本发明的单体encapsulin亚基是encapsulin蛋白的全长单个多肽，或其任意部分，其能够指导单体encapsulin亚基自组装为纳米颗粒。来自任意已知encapsulin蛋白的单体encapsulin亚基的氨基酸序列可以用于产生本发明的融合蛋白，只要所述单体encapsulin亚基能够指导所述融合蛋白自组装为在其表面上展示EBV ENV蛋白的纳米颗粒。代表性的encapsulin蛋白的氨基酸序列公开于本文SEQ ID NO:17。
在一个实施方案中，所述自组装蛋白是人工设计的肠炎沙门菌03-33亚基蛋白。根据本发明，本发明的单体03-33亚基是03-33蛋白的全长的，单个多肽，或其任意部分，其能够指导单体03-33亚基自组装为纳米颗粒。来自任意已知03-33蛋白的单体03-33亚基的氨基酸序列可以用于产生本发明的融合蛋白，只要所述单体03-33亚基能够指导所述融合蛋白自组装为在其表面上展示EBV ENV蛋白的纳米颗粒。代表性的03-33蛋白的氨基酸序列公开于本文SEQ ID NO:20。
在一个实施方案中，所述自组装蛋白是硫加氧酶还原酶(SOR)。根据本发明，本发明的单体SOR亚基是SOR蛋白的全长的，单个多肽，或其任意部分，其能够指导单体SOR亚基自组装为纳米颗粒。来自任意已知SOR蛋白的单体SOR亚基的氨基酸序列可以用于产生本发明的融合蛋白，只要所述单体SOR亚基能够指导所述融合蛋白自组装为在其表面上展示EBVENV蛋白的纳米颗粒。代表性的SOR蛋白的氨基酸序列公开于本文SEQ ID NO:23。
在一个实施方案中，所述自组装蛋白是二氧四氢蝶啶合酶(LS)。根据本发明，本发明的单体LS亚基是全LS蛋白的全长的，单个多肽，或其任意部分，其能够指导单体LS亚基自组装为纳米颗粒。来自任意已知LS蛋白的单体LS亚基的氨基酸序列可以用于产生本发明的融合蛋白，只要所述单体LS亚基能够指导所述融合蛋白自组装为在其表面上展示EBV ENV蛋白的纳米颗粒。代表性的LS蛋白的氨基酸序列公开于本文SEQ ID NO:26。
在一个实施方案中，所述自组装蛋白是丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)二氢硫辛酰胺乙酰基转基酶(E2p)。根据本发明，本发明的单体E2p亚基是E2p蛋白的全长的，单个多肽，或其任意部分，其能够指导单体E2p亚基自组装为纳米颗粒。来自任意已知E2p蛋白的单体E2p亚基的氨基酸序列可以用于产生本发明的融合蛋白，只要所述单体E2p亚基能够指导所述融合蛋白自组装为在其表面上展示EBV ENV蛋白的纳米颗粒。代表性的E2p蛋白的氨基酸序列公开于本文SEQ ID NO:29。
本发明的ENV-SA融合蛋白不需要包含自组装(SA)蛋白的单体亚基多肽的全长序列。可以使用单体SA亚基蛋白的部分或区域，只要该部分包含指导ENV-SA融合蛋白自组装成纳米颗粒的氨基酸序列。这类部分的一个例子位于幽门螺杆菌铁蛋白的氨基酸5和167之间。铁蛋白的更具体的区域记载于Zhang,Y.Self-Assembly in the Ferritin Nano-CageProtein Super Family.2011,lnt.1.Mol.Sci.,12,5406-5421，其通过提述完整并入本文。
本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的埃巴病毒ENV蛋白连接到来自选自下组的蛋白的至少25个连续的氨基酸，至少50个连续的氨基酸，至少75个连续的氨基酸，至少100个连续的氨基酸，或至少150个连续的氨基酸：铁蛋白，encapsulin，硫加氧酶还原酶，二氧四氢蝶啶合酶和丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)二氢硫辛酰胺乙酰基转基酶(E2)，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。本发明的一个实施方案中是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的ENV蛋白连接到来自选自下组的氨基酸序列的至少25个连续的氨基酸，至少50个连续的氨基酸，至少75个连续的氨基酸，至少100个连续的氨基酸，或至少150个连续的氨基酸：SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:29，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。在本发明的一个实施方案中，所述ENV-SA融合蛋白包含本发明的ENV蛋白连接到来自SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8的氨基酸残基5-167的至少25个连续的氨基酸，至少50个连续的氨基酸，至少75个连续的氨基酸，至少100个连续的氨基酸，或至少150个连续的氨基酸，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。
如先前已经讨论的，本领域公知可以在蛋白的氨基酸序列中制造一些变异而不影响该蛋白的活性。这些变异包括氨基酸残基的插入，氨基酸残基的缺失，和氨基酸残基的取代。因此，在一个实施方案中，SA蛋白亚基的序列与天然发现的SA蛋白亚基的序列足够相异，使得当所述变体SA蛋白亚基引入动物中时，例如小鼠，其不导致与天然SA蛋白反应的抗体的产生。根据本发明，这样的单体亚基称为免疫学中性的。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的ENV蛋白连接到与单体SA蛋白亚基的氨基酸序列至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，和至少97％相同的氨基酸序列，所述单体SA蛋白亚基负责指导单体铁蛋白亚基自组装为纳米颗粒，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。在一个实施方案中，所述ENV-SA融合蛋白包含与选自下组的单体SA蛋白亚基序列相同的多肽序列：铁蛋白，encapsulin，硫加氧酶还原酶，二氧四氢蝶啶合酶(LS)和丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(E2)。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的ENV蛋白连接到与选自下组的单体SA蛋白亚基的氨基酸序列至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，和至少97％相同的氨基酸序列：铁蛋白，encapsulin，硫加氧酶还原酶，二氧四氢蝶啶合酶和丙酮酸脱氢酶复合物(PDC)二氢硫辛酰胺乙酰转移酶(E2)，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的ENV蛋白连接到与选自下组的序列至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，和至少97％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:11,SEQ IDNO:14,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:29，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的ENV蛋白连接到与来自SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8的氨基酸5-167至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，和至少97％相同的氨基酸序列，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。
在一些实施方案中，将突变工程化到本发明的蛋白的氨基酸序列中可能是有用的。例如，改变位点可能是有用的，例如单体铁蛋白亚基，三聚结构域，或接头序列中的位点例如酶识别位点或糖基化位点以给予融合蛋白的有益特性(例如，稳定性，溶解性，半衰期，蛋白从免疫监视的遮掩部分)。例如，已知铁蛋白的单体亚基不天然糖基化。然而，如果其在哺乳动物或酵母细胞中作为分泌蛋白表达，其可以被糖基化。因此，在一个实施方案中，来自单体铁蛋白亚基的氨基酸序列中潜在的N-连接的糖基化位点被突变使得突变的铁蛋白亚基序列在该突变的位点不再糖基化。
根据本发明，本发明的ENV-SA融合蛋白的EBV包膜蛋白部分可以来自任意EBV病毒，只要所述ENV-SA融合蛋白引起针对埃巴病毒的免疫应答。因此，本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的自组装(SA)蛋白连接到来自EBV包膜蛋白的氨基酸序列，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的自组装(SA)蛋白连接到来自EBV I型的包膜蛋白的氨基酸序列，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的自组装(SA)蛋白连接到来自EBV II型的包膜蛋白的氨基酸序列，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的SA蛋白连接到来自列于表2中的EBV ENV蛋白的氨基酸序列。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的自组装(SA)蛋白连接到选自下组的氨基酸序列：EBV gp350蛋白，EBV gH蛋白，EBV gL蛋白和EBV gp42蛋白。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的SA蛋白连接到选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:132。
用于构建本发明的ENV-SA融合蛋白的优选的ENV包膜蛋白是引起针对埃巴病毒的免疫应答的那些。甚至更优选的EBV ENV蛋白是能够引起针对EBV抗体的那些。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，其引起针对I型或II型埃巴病毒的抗体。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，其引起针对列于表2中的EBV ENV蛋白的抗体。由本发明的ENV-SA融合蛋白引起的优选的抗体是中和埃巴病毒的那些。因此，本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，其引起针对I型或II型EBV的中和抗体。
由本发明的ENV-SA融合蛋白引起的中和抗体可以中和病毒感染，通过影响所述病毒生命周期的任意步骤。因此，在本发明的一个实施方案中，ENV-SA融合蛋白引起阻止EBV附着宿主细胞的中和抗体。在本发明的一个实施方案中，ENV-SA融合蛋白引起阻止病毒包膜与宿主细胞膜融合的中和抗体。
本领域的技术人员将理解本发明特别有用的ENV-SA蛋白是包含EBV包膜蛋白的免疫原性部分的那些。因此，本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的SA蛋白连接到EBV ENV蛋白的至少一个免疫原性部分。本发明的一个实施方案是ENV-SA蛋白，包含本发明的SA蛋白连接到选自下组的ENV蛋白的至少一个免疫原性部分：EBV gp350蛋白,EBVgH蛋白,EBV gL蛋白和EBV gp42蛋白。本发明的一个实施方案是ENV-SA蛋白，包含本发明的SA蛋白连接到来自表2中列出的ENV蛋白的ENV蛋白的至少一个免疫原性部分。在一个实施方案中，包含ENV蛋白的免疫原性部分的ENV-SA融合蛋白引起针对EBV的中和抗体的产生。
蛋白的免疫原性部分包含表位，其为由免疫系统识别从而引起免疫应答的氨基酸残基簇。这类表位可以由连续的氨基酸残基组成(即，在蛋白中彼此邻近的氨基酸残基)，或者它们由非连续的氨基酸残基组成(即，在蛋白中彼此不邻近的氨基酸残基)但其在最终折叠的蛋白中紧密空间靠近。本领域的技术人员理解这样的表位要求至少六个氨基酸残基为了被免疫系统识别。因此，本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含来自ENV蛋白的免疫原性部分，其中所述免疫原性部分包含至少一个表位。
本领域中可以容许已知蛋白序列中的一些变异而不显著改变该蛋白的活性。因此，本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的SA蛋白连接到氨基酸序列，其为来自I型或II型埃巴病毒的ENV蛋白的变体。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的铁蛋白蛋白质连接到与来自I型或I型埃巴病毒的ENV蛋白的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％或至少约99％相同的氨基酸序列，其中所述ENV-SA融合蛋白引起针对EBV的中和抗体的产生。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的SA蛋白连接到与来自表2中列出的那些的ENV蛋白的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％或至少约99％相同的氨基酸序列，其中所述ENV-SA融合蛋白引起针对EBV的中和抗体的产生。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的SA蛋白连接到与选自下组的ENV蛋白的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％或至少约99％相同的氨基酸序列：EBV gp350蛋白,EBV gH蛋白,EBV gL蛋白和EBV gp42蛋白，其中所述ENV-SA融合蛋白引起针对EBV的中和抗体的产生。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的SA蛋白连接到与选自下组的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％或至少约99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:136，其中所述ENV-SA融合蛋白引起针对EBV的中和抗体的产生。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的SA蛋白连接到选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68,SEQID NO:130,SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:136。
本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含与选自下组的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％或至少约99％相同的氨基酸序列：SEQID NO:71,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:86,SEQID NO:89,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:128,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:146。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:74,SEQ IDNO:77,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:92,SEQ IDNO:95,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:128,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:146。
本领域已知EBV ENV蛋白具有不同的区域，或结构域，每一个拥有特定的活性。例如EBV gp350具有胞外域，其从病毒膜向外延伸并包含受体结合域(RBD)。因此，本领域的技术人员将理解本发明的ENV-SA融合蛋白不需要包含EBV ENV的整个序列。作为替代，ENV-SA融合蛋白可以仅包含含有用于实施本发明的必要活性的那些部分，区域，结构域等等。例如，ENV-SA融合蛋白可以仅含有来自ENV蛋白的那些氨基酸序列，其含有抗原性远点，表位，免疫优势表位(immunodominant epitope)等等。
本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的SA蛋白连接到来自I型或II型EBV的蛋白的至少25个氨基酸，至少50个氨基酸，至少75个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸，至少200个氨基酸，至少300个氨基酸，至少400个氨基酸，或至少500个氨基酸，其中所述ENV-SA融合蛋白引起针对EBV的中和抗体的产生。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的SA蛋白连接到来自表2中列出的那些的ENV蛋白的至少25个氨基酸，至少50个氨基酸，至少75个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸，至少200个氨基酸，至少300个氨基酸，至少400个氨基酸，或至少500个氨基酸，其中所述ENV-SA融合蛋白引起针对EBV的中和抗体的产生。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的SA蛋白连接到来自选自下组的ENV蛋白的至少25个氨基酸，至少50个氨基酸，至少75个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸，至少200个氨基酸，至少300个氨基酸，至少400个氨基酸，或至少500个氨基酸：EBV gp350蛋白,EBV gH蛋白,EBV gL蛋白和EBV gp42蛋白，其中所述ENV-SA融合蛋白引起针对EBV的中和抗体的产生。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的SA蛋白连接到来自选自下组的蛋白的至少25个氨基酸，至少50个氨基酸，至少75个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸，至少200个氨基酸，至少300个氨基酸，至少400个氨基酸，或至少500个氨基酸：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68,SEQ IDNO:130,SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:136。
本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的SA蛋白连接到来自EBVgp350蛋白的至少一个域，其中所述域选自下组：胞外域，RDB域，域I，域II和域III。根据本发明，EBV gp350的胞外域指代位于其跨膜域外的gp350蛋白部分。本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的SA蛋白连接到选自下组的序列：SEQ ID NO:35,SEQ IDNO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ IDNO:55和EQ ID NO:58。
本发明的ENV-SA蛋白通过使本发明的SA蛋白与本发明的ENV蛋白连接来构建。在一些实施方案中，可以完成不同蛋白和/或域的连接使得该序列直接连接。在其他实施方案中，在不同蛋白和/或域之间采用接头(也称为间隔区序列)使得它们在正确的方向可能是必要的。更具体的，可以插入接头序列使得ENV蛋白以这样的方式定位，即保持引起针对EBV的免疫应答的能力。本发明的接头序列包含氨基酸。优选的使用的氨基酸是具有小的侧链和/或其不带电的那些。这类氨基酸不太可能干扰融合蛋白的正确折叠和活性。相应地，接头序列中优选使用的序列，单独或组合地，为丝氨酸，甘氨酸和丙氨酸。这类接头序列的例子包括但不限于，SGG，SGGG，GSG，GG，NGTGGSG及其重复。根据需要可以添加或减去氨基酸。本领域的技术人员能够确定用于本发明的蛋白的适合的接头序列。
根据本发明，ENV蛋白适合的部分可以通过与N-末端序列融合连接到SA蛋白，通过与C-末端融合作为衣壳内(endocapsid)产物，或其组合。在一个实施方案中，所述融合蛋白的ENV部分连接到融合蛋白的SA部分的N-末端序列。在一个实施方案中，所述融合蛋白的ENV部分连接到融合蛋白的SA部分的C-末端序列。
本发明人也已经发现可以通过使用表达融合蛋白的构建物促进本发明的纳米颗粒的产生，所述融合蛋白包含多个EBV蛋白。因此，本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的自组装(SA)蛋白连接到来自两个或多个EBV包膜(ENV)蛋白的氨基酸序列，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。在一个实施方案中，所述两个或多个EBV包膜蛋白来自I型和/或II型EBV。在一个实施方案中，所述氨基酸序列来自表2中列出的两个或多个ENV包膜蛋白。在一个实施方案中，所述ENV-SA融合蛋白包含自组装蛋白连接到来自两个或多个EBV包膜蛋白的免疫原性部分。在一个实施方案中，所述两个或多个EBV包膜蛋白选自下组：EBV gp350蛋白,EBV gH蛋白,EBV gL蛋白和EBV gp42蛋白。在一个实施方案中，所述两个或多个EBV包膜蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ IDNO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ IDNO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68和SEQID NO:132。
本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的自组装(SA)蛋白连接到来自两个或多个EBV包膜(ENV)蛋白的氨基酸序列，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒且其中所述两个或多个EBV包膜蛋白能够引发针对I型和/或II型EBV的抗体。在一个实施方案中，所述两个或多个EBV包膜蛋白能够引起针对表2中列出的至少一种EBV包膜蛋白的抗体。在优选的实施方案中，所述ENV-SA融合蛋白引发针对I型和/或II型EBV的中和抗体。
本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的自组装(SA)蛋白连接到来自两个或多个EBV包膜(ENV)蛋白的氨基酸序列，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒且其中所述来自两个或多个EBV包膜蛋白的氨基酸序列的每一个包含EBV包膜蛋白的免疫原性部分。在一个实施方案中，至少一个免疫原性部分能够引起针对I型和.或II型EBV的抗体。在优选的实施方案中，所述抗体是中和抗体。在一个实施方案中，所述免疫原性部分来自表2中列出的EBV包膜蛋白。在一个实施方案中，所述免疫原性部分来自包含选自下组的氨基酸序列的EBV蛋白：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ IDNO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:132。
本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的自组装(SA)蛋白连接到来自两个或多个EBV包膜(ENV)蛋白的氨基酸序列，其中所述两个或多个EBV包膜蛋白是来自I型和/或II型EBV的EBV包膜蛋白的变体，且其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。在一个实施方案中，所述两个或多个EBV包膜蛋白包含与来自I型和/或II型EBV的EBV包膜蛋白的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％或至少约99％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述两个或多个EBV包膜蛋白包含与选自下组的EBV包膜蛋白的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％或至少约99％相同的氨基酸序列：EBV gp350蛋白,EBV gH蛋白,EBV gL蛋白和EBV gp42蛋白。在一个实施方案中，所述两个或多个EBV包膜蛋白包含与表2中列出的EBV包膜蛋白的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％或至少约99％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述两个或多个EBV包膜蛋白包含与选自下组的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％或至少约99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ IDNO:65,SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:132。
本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的自组装(SA)蛋白连接到两个或多个EBV包膜(ENV)蛋白的氨基酸序列，其中来自两个或多个EBV包膜蛋白的每一个氨基酸序列长至少25个氨基酸，至少50个氨基酸，至少75个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸，至少200个氨基酸，至少300个氨基酸，至少400个氨基酸，或至少500个氨基酸，且其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。在一个实施方案中，所述氨基酸序列的至少一个能够引起针对I型和/或II型EBV的抗体。在优选的实施方案中，所述抗体是中和抗体。在一个实施方案中，来自两个或多个EBV包膜蛋白的每一个氨基酸序列包含来自选自下组的ENV包膜蛋白的至少25个氨基酸，至少50个氨基酸，至少75个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸，至少200个氨基酸，至少300个氨基酸，至少400个氨基酸，或至少500个氨基酸：EBV gH蛋白,EBV gL蛋白，EBV gp42蛋白和EBV gp350蛋白。在一个实施方案中，来自两个或多个EBV包膜蛋白的每一个氨基酸序列包含来自表2中列出的EBV包膜蛋白的至少25个氨基酸，至少50个氨基酸，至少75个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸，至少200个氨基酸，至少300个氨基酸，至少400个氨基酸，或至少500个氨基酸。在一个实施方案中，来自两个或多个EBV包膜蛋白的每一个氨基酸序列包含来自以下蛋白的至少25个氨基酸，至少50个氨基酸，至少75个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸，至少200个氨基酸，至少300个氨基酸，至少400个氨基酸，或至少500个氨基酸，所述蛋白具有与选自下组的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％或至少约99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:132。在一个实施方案中，来自两个或多个EBV包膜蛋白的每一个氨基酸序列包含来自以下蛋白的至少25个氨基酸，至少50个氨基酸，至少75个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸，至少200个氨基酸，至少300个氨基酸，至少400个氨基酸，或至少500个氨基酸，所述蛋白具有选自下组的氨基酸序列：SEQID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQID NO:68和SEQ ID NO:132。
在某些实施方案中，所述融合蛋白中的序列直接连接。在另外的实施方案中，为了得到所需的结果采用接头，间隔区或其它类型的序列是有用的。这些序列可以插入特定的融合元件之间，例如为了保持最终的蛋白的化学计量(或分子比率)，保持最终蛋白中域的正确方向，促进最终蛋白在细胞中或细胞外的运输，或允许最终蛋白的剪切。因此，利用的有用的序列的例子包括，但不限于，接头序列，间隔区序列，结合序列，剪切序列，引导序列和分泌信号序列。利用这些序列的构建体的例子示于图22中。因此，本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含选自下组的一个或多个序列：接头序列，间隔区序列，结合序列，剪切序列，引导序列和分泌信号序列。在一个实施方案中，所述ENV-SA融合蛋白包含一个或多个蛋白酶剪切序列。在一个实施方案中，所述剪切序列是自剪切序列。在一个实施方案中，所述剪切序列是弗林蛋白酶(furin)剪切序列(Arg-Lys-Arg-Arg)。在一个实施方案中，所述ENV-SA融合蛋白包含指导蛋白的分泌的序列。在一个实施方案中，所述融合蛋白包含来自人类CD5的引导序列。在一个实施方案中，所述融合蛋白包含一个或多个选自下组的序列：SEQ ID NO:138，SEQ ID NO:140，RKRR和其功能性变体。
本发明的一个实施方案是ENV-SA融合蛋白，包含本发明的自组装(SA)蛋白连接到两个或多个EBV包膜(ENV)蛋白的氨基酸序列，其中所述融合蛋白包含至少一个剪切位点，其定位为使得在该剪切位点的剪切，包括自剪切，产生SA-gH融合蛋白。在一个实施方案中，所述SA-gH融合蛋白能够与EBV gL形成二聚体。在一个实施方案中，所述SA-gH融合蛋白能够与EBV gL和EBV gp42形成三聚体。在一个实施方案中，所述ENV-SA融合蛋白包含EBV gH蛋白和一个或多个的EBV gL和EBV gp42蛋白。在一个实施方案中，所述融合蛋白包含另外的剪切位点，使得所述融合蛋白的剪切，包括自剪切，产生SA-gH融合蛋白和一个或多个的EBV gL蛋白和EBV gp42蛋白。本发明的一个实施方案是融合蛋白，包含与选自下组的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％或至少约99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:142和SEQ ID NO:144。本发明的一个实施方案是包含SEQ ID NO:142或SEQ ID NO:144的融合蛋白。
本发明的蛋白质由本发明的核酸分子编码。另外，它们由本发明的核酸构建体表达。如本文中使用的，核酸构建体是重组表达载体，即如下的载体，该载体与编码蛋白质的核酸分子连接，使得在对例如受试者或器官、组织或细胞施用核酸构建体时核酸分子可以实现蛋白质表达。载体还使核酸分子能够转运到环境(诸如但不限于生物体、组织或细胞培养物)内的细胞。本公开内容的核酸构建体通过人干预生成。核酸构建体可以是DNA、RNA或其变体。载体可以是DNA质粒、病毒载体、或其它载体。在一个实施方案中，载体可以是巨细胞病毒(CMV)、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒(sindbis virus)、或任何其它DNA或RNA病毒载体。在一个实施方案中，载体可以是假型慢病毒或逆转录病毒载体。在一个实施方案中，载体可以是DNA质粒。在一个实施方案中，载体可以是DNA质粒，其包含病毒构件和质粒构件以实现核酸分子投递和表达。用于构建本公开的核酸构建体的方法是公知的。参见例如Molecular Cloning:a LaboratoryManual,第3版,Sambrook等2001Cold Spring Harbor Laboratory Press,和CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel等编,John Wiley&Sons,1994。在一个实施方案中，载体是DNA质粒，诸如CMV/R质粒，诸如CMV/R或CMV/R 8KB(在本文中称为CMV/R8kb)。本文中提供了CMV/R和CMV/R 8kb的例子。CMV/R也记载于2006年8月22日公告的US 7,094,598B2。
如本文中使用的，核酸分子包含编码本发明的SA单体亚基，ENV蛋白，和/或ENV-铁蛋白SA蛋白的核酸序列。核酸分子能以重组方式，合成方式，或者通过重组和合成程序的组合生成。公开内容的核酸分子可以具有野生型核酸序列或经密码子修饰的核酸序列，例如以掺入被人翻译系统更好识别的密码子。在一个实施方案中，核酸分子可以遗传工程化改造为引入，或消除编码不同氨基酸的密码子，诸如以引入编码N连接的糖基化位点的密码子。生成公开内容的核酸分子的方法是本领域中已知的，特别在知道核酸序列后。应当领会，核酸构建体可以包含一种核酸分子或超过一种核酸分子。还应当领会，核酸分子可以编码一种蛋白质或超过一种蛋白质。
优选的核酸分子是那些编码SA单体亚基，ENV蛋白，和/或包含SA蛋白的单体亚基连接到EBV ENV蛋白的ENV-铁蛋白SA蛋白的核酸分子。因此，本发明的一个实施方案是包含编码蛋白的核酸序列的核酸分子，所述蛋白包含SA蛋白的单体亚基连接到EBV ENV蛋白。在一个实施方案中，SA蛋白的单体亚基包含与选自下组的序列至少80％,至少85％,至少90％,至少92％,至少94％,至少96％,至少98％或至少99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:29。在一个实施方案中，所述单体亚基包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:11,SEQ IDNO:14,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:29。在一个实施方案中，所述EBV ENV蛋白包含与选自下组的序列至少80％,至少85％,至少90％,至少92％,至少94％,至少96％,至少98％或至少99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68,SEQID NO:130,SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:136。在一个实施方案中，所述EBV ENV蛋白包含选自下组的序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ IDNO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:136。在一个实施方案中，所述EBV ENV蛋白包含来自选自下组的序列的至少25个氨基酸、至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、或至少200个氨基酸：SEQID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQID NO:68,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:136。
本发明的一个实施方案是包含编码蛋白质的核酸序列的核酸分子，所述蛋白包含与选自下组的序列至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少94％，至少96％，至少98％或至少99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:77,SEQ IDNO:80,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:95,SEQ IDNO:98,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:128,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:146。本发明的一个实施方案是包含编码氨基酸序列的核酸序列的核酸分子，所述氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:80,SEQID NO:83,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:98,SEQID NO:101,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:128,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:146。
本发明中还包括核酸序列，其是编码本发明蛋白质的核酸序列的变体。此类变体包括核苷酸插入、缺失、和取代，只要它们不影响本发明的融合蛋白自组装成纳米颗粒的能力，或者显著影响融合蛋白的EBV包膜蛋白引起针对埃巴病毒的免疫应答的能力。因此，本发明的一个实施方案是编码本发明融合蛋白的核酸分子，其中SA蛋白的单体亚基由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与选自下组的核苷酸序列是至少85％,至少90％,至少95％或至少97％相同的：SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:28。本发明的一个实施方案是编码本发明的ENV-SA融合蛋白的核酸分子，其中所述ENV蛋白由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与编码选自下组的氨基酸序列的核酸序列是至少85％,至少90％,至少95％,至少97％相同或至少99％相同的：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:136。
本发明的一个实施方案是包含核酸序列的核酸分子，所述核酸序列与选自下组的核酸序列是至少约80％,至少约85％,至少约90％,至少约95％,至少约97％或至少约99％相同的：SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16。本发明的一个实施方案是包含选自下组的核酸序列的核酸分子：SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:16。
本发明的一个实施方案是包含核酸序列的核酸分子，所述核酸序列与选自下组的核酸序列是至少约80％,至少约85％,至少约90％,至少约95％,至少约97％或至少约99％相同的：SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:82,SEQID NO:85,SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:92。本发明的一个实施方案是包含选自下组的核酸序列的核酸分子：SEQ ID NO:70,SEQ ID NO:73,SEQ ID NO:76,SEQ ID NO:79,SEQ ID NO:82,SEQ ID NO:85,SEQ ID NO:88,SEQ ID NO:91,SEQ ID NO:94,SEQ ID NO:97,SEQ IDNO:100,SEQ ID NO:103,SEQ ID NO:127,SEQ ID NO:129,SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:145。
本发明的一个实施方案是编码ENV-SA融合蛋白的核酸分子，所述ENV-SA融合蛋白包含本发明的自组装(SA)蛋白连接到两个或多个EBV包膜(ENV)蛋白的氨基酸序列，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。在一个实施方案中，所述两个或多个EBV包膜蛋白来自I型和/或II型EBV。在一个实施方案中，所述氨基酸序列来自表2中列出的两个或多个ENV包膜蛋白。在一个实施方案中，所述ENV-SA融合蛋白包含自组装蛋白连接到来自两个或多个EBV包膜蛋白的免疫原性部分。在一个实施方案中，所述两个或多个EBV包膜蛋白选自下组：EBV gp350蛋白,EBVgH蛋白,EBV gL蛋白和EBV gp42蛋白。在一个实施方案中，所述两个或多个EBV包膜蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:132。
本发明的一个实施方案是编码ENV-SA融合蛋白的核酸分子，所述ENV-SA融合蛋白包含本发明的自组装(SA)蛋白连接到来自两个或多个EBV包膜(ENV)蛋白的氨基酸序列，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒且其中所述两个或多个EBV包膜蛋白能够引发针对I型和/或II型EBV的抗体。在一个实施方案中，所述两个或多个EBV包膜蛋白能够引起针对表2中列出的至少一种EBV包膜蛋白的抗体。在优选的实施方案中，所述ENV-SA融合蛋白引发针对I型和/或II型EBV的中和抗体。
本发明的一个实施方案是编码ENV-SA融合蛋白的核酸分子，所述ENV-SA融合蛋白包含本发明的自组装(SA)蛋白连接到来自两个或多个EBV包膜(ENV)蛋白的氨基酸序列，其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒且其中所述来自两个或多个EBV包膜蛋白的氨基酸序列的每一个包含EBV包膜蛋白的免疫原性部分。在一个实施方案中，至少一个免疫原性部分能够引起针对I型和/或II型EBV的抗体。在优选的实施方案中，所述抗体是中和抗体。在一个实施方案中，所述免疫原性部分来自表2中列出的EBV包膜蛋白。在一个实施方案中，所述免疫原性部分来自包含选自下组的氨基酸序列的EBV蛋白：SEQ ID NO:32,SEQ IDNO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ IDNO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68和SEQID NO:132。
本发明的一个实施方案是编码ENV-SA融合蛋白的核酸分子，所述ENV-SA融合蛋白包含本发明的自组装(SA)蛋白连接到来自两个或多个EBV包膜(ENV)蛋白的氨基酸序列，其中所述两个或多个EBV包膜蛋白是来自I型和/或II型EBV的EBV包膜蛋白的变体，且其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。在一个实施方案中，所述两个或多个EBV包膜蛋白包含与来自I型和/或II型EBV的EBV包膜蛋白的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％或至少约99％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述两个或多个EBV包膜蛋白包含与选自下组的EBV包膜蛋白的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％或至少约99％相同的氨基酸序列：EBV gp350蛋白,EBV gH蛋白,EBV gL蛋白和EBV gp42蛋白。在一个实施方案中，所述两个或多个EBV包膜蛋白包含与表2中列出的EBV包膜蛋白的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％或至少约99％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述两个或多个EBV包膜蛋白包含与选自下组的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％或至少约99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:132。
本发明的一个实施方案是编码ENV-SA融合蛋白的核酸分子，所述ENV-SA融合蛋白包含本发明的自组装(SA)蛋白连接到两个或多个EBV包膜(ENV)蛋白的氨基酸序列，其中来自两个或多个EBV包膜蛋白的每一个氨基酸序列长至少25个氨基酸，至少50个氨基酸，至少75个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸，至少200个氨基酸，至少300个氨基酸，至少400个氨基酸，或至少500个氨基酸，且其中所述ENV-SA融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。在一个实施方案中，所述氨基酸序列的至少一个能够引起针对I型和/或II型EBV的抗体。在优选的实施方案中，所述抗体是中和抗体。在一个实施方案中，来自两个或多个EBV包膜蛋白的每一个氨基酸序列包含来自选自下组的ENV包膜蛋白的至少25个氨基酸，至少50个氨基酸，至少75个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸，至少200个氨基酸，至少300个氨基酸，至少400个氨基酸，或至少500个氨基酸：EBV gH蛋白,EBV gL蛋白，EBV gp42蛋白和EBV gp350蛋白。在一个实施方案中，来自两个或多个EBV包膜蛋白的每一个氨基酸序列包含来自表2中列出的EBV包膜蛋白的至少25个氨基酸，至少50个氨基酸，至少75个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸，至少200个氨基酸，至少300个氨基酸，至少400个氨基酸，或至少500个氨基酸。在一个实施方案中，来自两个或多个EBV包膜蛋白的每一个氨基酸序列包含来自以下蛋白的至少25个氨基酸，至少50个氨基酸，至少75个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸，至少200个氨基酸，至少300个氨基酸，至少400个氨基酸，或至少500个氨基酸，所述蛋白具有与选自下组的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％或至少约99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:132。在一个实施方案中，来自两个或多个EBV包膜蛋白的每一个氨基酸序列包含来自以下蛋白的至少25个氨基酸，至少50个氨基酸，至少75个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸，至少200个氨基酸，至少300个氨基酸，至少400个氨基酸，或至少500个氨基酸，所述蛋白具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:132。
本发明的一个实施方案是核酸分子，包含与选自下组的序列至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约97％或至少约99％相同的核苷酸序列：SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:143。本发明的一个实施方案是核酸分子，包含SEQ ID NO:141或和SEQ IDNO:143。
本发明还涵盖用于生成本发明的融合蛋白的表达系统。在一个实施方案中，本发明的核酸分子与启动子可操作连接。如本文中使用的，可操作连接意味着当活化连接的启动子时，可以表达由连接的核酸分子编码的蛋白质。可用于实施本发明的启动子是本领域技术人员已知的。本发明的一个实施方案是包含本发明的核酸分子的重组细胞。本发明的一个实施方案是包含本发明的核酸分子的重组病毒。
如上文指示的，可以使用本领域中目前已知的任何合适的常规重组技术进行本发明的ENV-SA融合蛋白的重组生成。例如，表达融合蛋白，例如本发明的SA蛋白与适合的蛋白例如重组EBV ENV蛋白的构建体的分子克隆可以通过在大肠杆菌中表达来实施。然后，可以将构建体转化到蛋白质表达细胞中，培养至合适的大小，并且诱导以生成融合蛋白。
如已经描述的，因为本发明的ENV-SA融合蛋白包含单体自组装蛋白(SA)，它们可以自组装。依照本发明，源自此类自组装的超分子称为表达ENV的基于SA蛋白的纳米颗粒。为了容易讨论，表达ENV的基于SA蛋白的纳米颗粒将简单称为纳米颗粒(np)。本发明的纳米颗粒包含融合蛋白，其包含SA单体亚基连接到EBV ENV蛋白。这类纳米颗粒在它们的表面上展示至少部分的ENV蛋白。在这样的结构中，ENV易接近免疫系统，因此可以引发免疫应答。因此，本发明的一个实施方案是包含ENV-SA融合蛋白的纳米颗粒，其中所述融合蛋白包含单体SA亚基连接到EBV ENV蛋白。在一个实施方案中，所述纳米颗粒是八面体。在一个实施方案中，所述ENV蛋白能够引起针对EBV的中和抗体。在一个实施方案中，所述单体SA亚基包含来自选自下组的氨基酸序列的至少50个氨基酸,至少100个氨基酸或至少150个氨基酸：SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:29。在一个实施方案中，所述单体SA亚基包含与选自下组的氨基酸序列至少85％,至少90％,至少95％,至少97％至少99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:29。在一个实施方案中，所述单体SA亚基包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5,SEQID NO:8,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23,SEQID NO:26和SEQ ID NO:29。
在一个实施方案中，所述ENV蛋白包含至少一个来自表2中所列的EBVENV蛋白的表位。在一个实施方案中，所述ENV蛋白包含来自表2中所列的ENV蛋白的至少25个氨基酸、至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少300个氨基酸、至少400个氨基酸、或至少500个氨基酸。在一个实施方案中，所述ENV蛋白包含来自由选自下组的蛋白的至少25个氨基酸，至少50个氨基酸，至少75个氨基酸，至少100个氨基酸，至少150个氨基酸，至少200个氨基酸，至少300个氨基酸，至少400个氨基酸，或至少500个氨基酸：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ IDNO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ IDNO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:132和d SEQ ID NO:136。在一个实施方案中，所述ENV蛋白包含选自下组的序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68。
在一个实施方案中，所述ENV蛋白包含与来自表2中所列的ENV蛋白序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述ENV蛋白包含与选自下组的蛋白质序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:136。
在一个实施方案中，所述ENV-SA融合蛋白包含与选自下组的蛋白序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:71,SEQID NO:74,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:89,SEQID NO:92,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:128,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:146。在一个实施方案中，所述ENV-SA融合蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:95,SEQ IDNO:98,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:128,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:146。
本发明的纳米颗粒可以包含多于一种类型的融合蛋白。也就是说，本发明的纳米颗粒可以包含至少两种类型的融合蛋白，其每一个包含来自不同的EBV ENV蛋白的氨基酸序列(例如，gp350和gH)。此外，不同类型的融合蛋白可能包含来自相同或不同SA蛋白(即，铁蛋白和/或encapsulin)的氨基酸序列。此外，除了至少一种ENV-SA融合蛋白外，本发明的纳米颗粒可以包含不融合到SA蛋白的蛋白。例如，除了包含ENV-SA融合蛋白(例如，EBV gH-铁蛋白蛋白质)外，本发明的纳米可以还可以包含一种或多种蛋白，所述蛋白包含来自其他EBV ENV蛋白的氨基酸序列，或其部分或变体。这些蛋白的例子包括，但不限于gp350，gH，gL和gp42。这些另外的一种或多种蛋白可以，但不必，彼此或与所述ENV-SA融合蛋白形成复合物。
由于本发明的ENV-SA融合蛋白和纳米颗粒可以引发针对埃巴病毒的免疫应答，它们可以用作疫苗以保护个体免于EBV的感染。依照本发明，疫苗可以是本发明的ENV-SA融合蛋白或纳米颗粒。因此，本发明的一个实施方案是包含本发明的ENV-SA融合蛋白或纳米颗粒的疫苗。本发明的疫苗还可以含有其它组分，诸如佐剂、缓冲剂等。虽然可以使用任何佐剂，优选的实施方案可以含有：化学佐剂，诸如磷酸铝、苯扎氯铵(benzyalkoniumchloride)、乌苯美司(ubenimex)、和QS21；遗传佐剂，诸如IL-2基因或其片段、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因或其片段、IL-18基因或其片段、趋化因子(C-C基序)配体21(CCL21)基因或其片段、IL-6基因或其片段、CpG、LPS、TLR激动剂、和其它免疫刺激基因；蛋白质佐剂，诸如IL-2或其片段、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或其片段、IL-18或其片段、趋化因子(C-C基序)配体21(CCL21)或其片段、IL-6或其片段、CpG、LPS、TLR激动剂和其它免疫刺激细胞因子或其片段；脂质佐剂，诸如阳离子脂质体、N3(阳离子脂质)、单磷酰脂质A(MPL1)；其它佐剂，包括霍乱毒素、肠毒素、Fms样酪氨酸激酶-3配体(Flt-3L)、布比卡因(bupivacaine)、丁哌卡因(marcaine)、和左旋咪唑(levamisole)。
本发明的一个实施方案是基于SA蛋白的纳米颗粒疫苗，其包括多于一种的EBVENV蛋白。这样的疫苗可以包括不同EBV包膜蛋白的组合，在单个纳米颗粒中，或作为纳米颗粒的混合物，其至少两种具有独特的EBVENV蛋白。为了导致所需的免疫应答的产生，多价疫苗可以包含必要多的EBV包膜蛋白。在一个实施方案中，所述疫苗包含来自至少两种不同类型的EBV的ENV蛋白(二价)。在一个实施方案中，所述疫苗包含来自至少三种不同的埃巴病毒的ENV蛋白(三价)。
本发明的一个实施方案是针对EBV对个体接种疫苗的方法，该方法包括对个体施用纳米颗粒，使得在个体中产生针对EBV的免疫应答，其中所述纳米颗粒包含来自本发明的SA的单体亚基连接到本发明的EBV包膜蛋白，且其中所述纳米颗粒在其表面上展示EBV包膜。在一个实施方案中，纳米颗粒是单价纳米颗粒。在一个实施方案中，纳米颗粒是多价纳米颗粒。本发明的另一个实施方案是针对EBV感染对个体接种疫苗的方法，该方法包括：
a)获得包含单体亚基的纳米颗粒，其中所述单体亚基包含与EBV ENV蛋白连接的SA蛋白，且其中纳米颗粒在其表面上展示所述EBV ENV蛋白；和
b)对个体施用纳米颗粒，使得产生针对EBV的免疫应答。
本发明的一个实施方案是针对EBV对个体接种疫苗的方法，该方法包括对个体施用实施方案的疫苗，使得在个体中产生针对EBV的免疫应答，其中所述疫苗包含至少一种纳米颗粒，该纳米颗粒包含与EBV包膜蛋白连接的来自SA蛋白的单体亚基，且其中所述纳米颗粒在其表面上展示EBVENV蛋白。在一个实施方案中，所述疫苗是纳米颗粒。在一个实施方案中，所述疫苗是单价疫苗。在一个实施方案中，所述疫苗是多价疫苗。本发明的另一个实施方案是针对EBV感染对个体接种疫苗的方法，该方法包括：
a)获得包含至少一种纳米颗粒的疫苗，所述纳米颗粒包含ENV-SA融合蛋白，其中所述融合蛋白包含与EBV ENV蛋白连接的SA蛋白，且其中所述纳米颗粒在其表面上展示EBVENV；和
b)对个体施用疫苗，使得产生针对EBV的免疫应答。
在一个实施方案中，纳米颗粒是单价纳米颗粒。在一个实施方案中，纳米颗粒是多价纳米颗粒。在一个实施方案中，纳米颗粒是八面体。在一个实施方案中，所述EBV ENV蛋白能够引发针对EBV的中和性抗体。在一个实施方案中，融合蛋白的SA部分包含来自选自下组的氨基酸序列的至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、或至少150个氨基酸：SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:29。在一个实施方案中，融合蛋白的SA部分包含与选自下组的氨基酸序列至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:14,SEQ IDNO:17,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:29。在一个实施方案中，融合蛋白的ENV部分包含至少一个来自表2中所列的ENV蛋白的表位。在一个实施方案中，融合蛋白的ENV部分包含来自表2中所列的ENV的至少25个氨基酸、至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少300个氨基酸、至少400个氨基酸或至少500个氨基酸。在一个实施方案中，融合蛋白的ENV部分包含来自由选自下组的序列组成的蛋白质的至少25个氨基酸、至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少300个氨基酸、至少400个氨基酸或至少500个氨基酸：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ IDNO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:136。在一个实施方案中，融合蛋白的ENV部分包含与来自表2中所列ENV蛋白的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，融合蛋白的ENV部分包含与选自下组的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ IDNO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ IDNO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:132和SEQID NO:136。在一个实施方案中，所述ENV-SA融合蛋白包含与选自下组的蛋白质序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:86,SEQ IDNO:89,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:104,SEQID NO:128,SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:134。在一个实施方案中，所述ENV-SA融合蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:71,SEQ ID NO:74,SEQ ID NO:77,SEQ ID NO:80,SEQ ID NO:83,SEQ ID NO:86,SEQ ID NO:89,SEQ ID NO:92,SEQ ID NO:95,SEQ ID NO:98,SEQ ID NO:101,SEQ ID NO:104,SEQ ID NO:128,SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:134。
使用引发/加强方案，本发明的疫苗可以用于对个体接种疫苗。此类方案记载于美国专利公开文本No.20110177122，其全部内容通过提及并入本文。在此类方案中，可以对个体施用第一疫苗组合物(引发)，然后在一段时间后，可以对个体施用第二疫苗组合物(加强)。加强性组合物的施用一般是施用引发性组合物后几天、几周或几个月，优选约10天，约两周，约三周，约4周，约8周，约16周，约20周，约24周，约28周，或约32周。在一个实施方案中，加强性组合物配制为在施用引发性组合物后约1周，约2周，约3周，约4周，约5周，约6周，约7周，约8周，约9周，约16周，约20周，约24周，约28周，或约32周施用。在一个实施方案中，第二加强性组合物(即，第三疫苗组合物)在施用第一加强性组合物后一段时间施用。例如，第二加强性组合物可以在引发性组合物的施用后约8周，约9周，约10周，约12周，约16周，约20周，约24周，或约32周施用。在一个实施方案中，第二加强性组合物在引发性组合物的施用后六个月施用。如本文所使用的，对于疫苗组合物的使用时间，术语约指代不超过10％的变化。因此例如，约10天指定9-11天的时间段。相似的，例如，约6个月指定162-196天的时间段。
第一和第二疫苗组合物可以是但不需要是同一组合物。因此，在本发明的一个实施方案中，施用疫苗的步骤包括施用第一疫苗组合物，然后在后来的时间时，施用第二疫苗组合物。在一个实施方案中，第一疫苗组合物包含纳米颗粒，该纳米颗粒包含本发明的ENV-SA融合蛋白。在一个实施方案中，第一疫苗组合物包含纳米颗粒，该纳米颗粒包含EBV ENV蛋白。在一个实施方案中，第一疫苗组合物的ENV包含与选自下组的氨基酸序列至少80％相同，至少85％相同，至少90％相同，至少95％相同，至少97％相同或至少99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ IDNO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ IDNO:65,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:132,SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:146。在一个实施方案中，所述第一疫苗组合物包含ENV-SA融合蛋白，其包含与选自下组的氨基酸序列至少80％相同，至少85％相同，至少90％相同，至少95％相同，至少97％相同或至少99％相同的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQID NO:62,SEQ ID NO:65,SEQ ID NO:68,SEQ ID NO:130,SEQ ID NO:132,SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:146，其中所述纳米颗粒引起针对EBV的免疫应答。在一个实施方案中，所述第一疫苗组合物包含ENV-SA融合蛋白，其包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ IDNO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:50,SEQ IDNO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65,和SEQ ID NO:68。在一个实施方案中，第二疫苗组合物包含纳米颗粒，其包含本发明的ENV-SA融合蛋白。在一个实施方案中，所述个体已经暴露于EBV。如本文中使用的，术语暴露等指示受试者已经与已知感染EBV的人或动物接触。可以使用本领域技术人员公知的技术施用本发明的疫苗。用于配制和施用的技术可以参见例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”,第18版,1990,Mack Publishing Co.,Easton,PA。可以通过手段施用疫苗，所述手段包括但不限于传统注射器、无针注射装置、或微粒轰击基因枪。合适的施用路径包括但不限于胃肠外投递，诸如肌肉内、皮内、皮下、髓内注射，及鞘内、直接室内、静脉内、腹膜内、鼻内、或眼内注射，等等。对于注射，本发明的一个实施方案的化合物可以配制为水溶液，优选在生理学相容缓冲液中，诸如汉克斯(Hanks)氏溶液、林格(Ringer)氏溶液、或生理盐水缓冲液。
在一个实施方案中，本发明的疫苗，或纳米颗粒，可以用于保护个体免于异源EBV的感染。也就是说，使用来自一种类型的EBV的EBV蛋白制备的疫苗能够保护个体免于不同类型的EBV的感染。例如，使用来自I型EBV的一种或多种ENV蛋白制备的疫苗，可以用于保护个体免受II型EBV的感染。
虽然已经参考其特定实施方案描述本发明，本领域的技术人员应当理解可以进行各种改变且可以替换等同物而不脱离本发明的真正的精神和范围。另外，可作出许多修改以使特定的情况，材料，组合物，方法，方法步骤适于本发明的目的，精神和范围。所有这些修改都旨在权利要求的范围内。
现在一般性描述的本发明将通过参考以下实施例更容易理解，包括以下实施例仅为了说明本发明实施方案的某些方面的目的。实施例不意图限制本发明，因为本领域的技术人员将从以上教导和以下实施例认识到其它技术和方法可以满足权利要求，并可以被采用而不背离要求保护的发明的范围。
实施例
实施例1.基于EBV表面蛋白的纳米颗粒的设计
本实施例描述了包含EBV表面蛋白和铁蛋白或encapsulin的纳米颗粒的构建。
考虑了两种平台用于能够在它们的表面上展示抗原的自组装纳米颗粒的构建：铁蛋白(Cho,et al.J Mol Biol,2009；Stillman,et al.J Mol Biol,2001)和encapsulin(Sutter,et al.Nat Struct Mol Biol,2008)。铁蛋白形成由24个亚基组成的4-3-2点八面体而encapsulin形成由60个相同亚基组成的5-3-2点二十面体(T＝1)。铁蛋白结构的比较揭示了包括人轻链(Z.Wang,C.Li,M.Ellenburg,E.Soistman,J.Ruble,B.Wright,J.X.Ho,D.C.Carter,Structure of human ferritin L chain.Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 62,800-806(2006))和牛蛙低级亚基(J.Trikha,E.C.Theil,N.M.Allewell,High resolution crystal structures of amphibian red-cell L ferritin:potentialroles for structural plasticity and solvation in function.J Mol Biol 248,949-967(1995))(PDB:1rcc)的几种铁蛋白含有N-末端延伸，其不存在于来自幽门螺杆菌(K.J.Cho,H.J.Shin,J.H.Lee,K.J.Kim,S.S.Park,Y.Lee,C.Lee,S.S.Park,K.H.Kim,Thecrystal structure of ferritin from Helicobacter pylori reveals unusualconformational changes for iron uptake.J Mol Biol 390,83-98(2009))(PDB:3egm)或大肠杆菌(T.J.Stillman,P.D.Hempstead,P.J.Artymiuk,S.C.Andrews,A.J.Hudson,A.Treffry,J.R.Guest,P.M.Harrison,The high-resolution X-ray crystallographicstructure of the ferritin(EcFtnA)of Escherichia coli；comparison with human Hferritin(HuHF)and the structures of the Fe(3+)and Zn(2+)derivatives.J MolBiol 307,587-603(2001))(PDB:1eum)的非血红素型铁蛋白中。该N-末端延伸导致最N-末端的残基从组装的纳米颗粒中心径向突出，且所述末端均匀地分布在铁蛋白颗粒的表面上。因此，为了验证可以将牛蛙铁蛋白的N-末端延伸添加到细菌的对应物上以使得其N-末端暴露并均匀地分布在纳米颗粒的表面上的想法，构建了杂合铁蛋白蛋白质，其将来自幽门螺杆菌铁蛋白或大肠杆菌铁蛋白的序列与来自牛蛙铁蛋白的N-末端延伸组合。该构建的详细说明列于下文。
尚未研究Encapsulin作为支架以在其表面上呈递异源蛋白。与铁蛋白不同，encapsulin在表面上暴露其C-末端，因此提供了融合外源序列的潜在位点。Encapsulin的C-末端径向突出并也分散地定位于5重对称轴的周围。
埃巴病毒(EBV)的糖蛋白350(gp350)是最丰富的病毒表面蛋白，且在天然感染的个体中其是中和抗体的主要靶标(Thorley-Lawson DA,Poodry CA.Identification andisolation of the main component(gp350-gp220)of Epstein-Barr virus responsiblefor generating neutralizing antibodies in vivo.J Virol.1982；43:730–736.)。gp350是I类跨膜蛋白，包含970个氨基酸，含有860个氨基酸的胞外域，跨膜域和胞质尾区。为了测试gp350诱导免疫应答的能力，将gp350的截短变体融合到铁蛋白或encapsulin而不感染自组装蛋白的自组装能力(见图2)。通过创建编码融合基因的表达载体来构建这些融合蛋白，所述融合基因编码gp350变体和幽门螺杆菌-牛蛙(HpBf)，大肠杆菌-牛蛙(EcBf)，或encapsulin。该构建体的详细描述在下文中给出。
A.基因合成和载体构建
本研究中使用的所有基因经优化用于哺乳动物密码子使用。通过将牛蛙(Ranacatesbeiana)铁蛋白低级亚基(UniProtKB:P07797)的N-末端延伸区域(残基2-9)遗传融合到幽门螺杆菌非血红素铁蛋白(UniProtKB:Q9ZLI1)的残基3-167来构建编码幽门螺杆菌-牛蛙杂合铁蛋白的基因。为了废除潜在的N-连接的糖基化位点，在牛蛙部分的残基8创建了点突变(N8Q)。相似的，为了创建与牛蛙N-末端部分的6R的盐桥和废除潜在的N-连接的糖基化位点，分别在幽门螺杆菌铁蛋白的残基7(I7E)和19(N19Q)创建了点突变。
相似地构建了编码大肠杆菌-牛蛙杂合铁蛋白的基因，但在牛蛙N-末端延伸区域中没有N8Q突变，且使用大肠杆菌铁蛋白-1(UniProtKB:P0A998，残基3-162，在残基7(I7E)具有点突变以创建与牛蛙N-末端部分的6R的盐桥)。这些构建体在幽门螺杆菌或大肠杆菌的末端还含有额外的SG残基用于克隆的目的。
通过将人CD5信号序列遗传融合到海栖热袍细菌素(也称为maritimacin或encapsulin，UniProtKB:Q9WZP2，残基1-264)构建了编码encapsulin的基因。
合成了编码埃巴病毒B95-8株全长gp350(UniProtKB:P03200，残基1-907)的基因且通过聚合酶链式反应使用适当的引物扩增对应胞外域(残基2-860)，受体结合域(RBD，残基2-470)，域I，II和III(DI/II/III或D123，残基2-425)和域I和II(残基2-317)的基因片段。将扩增的基因片段遗传融合到经修饰的牛催乳素(bPRL)分泌信号序列和具有SG接头的杂合铁蛋白以产生gp350-铁蛋白融合基因。
为了构建gp350-encapsulin融合基因，使用(SG3)2接头将扩增的基因片段融合到encapsulin的末端。为了产生可溶性gp350胞外域和D123，将扩增的基因片段与bPRL信号序列融合，并在gp350基因的末端使用六聚组氨酸标记用于纯化的目的。
通过将gH的胞外域(域I，II，III和IV)融合到铁蛋白的氨基末端，构建了gH-铁蛋白(图3)。
通过表达gH的胞外域(域I，II，III和IV)构建了可溶性gH(图3)。
通过将人CD5引导(hCD5)序列融合到截短的gp42的N-末端代替gp42氨基酸1-33构建了可溶性gp42。
本研究中使用的EBV gL蛋白是全长的，野生型gL蛋白。
上述所有基因构建体克隆到CMV/R 8κb(VRC 8405)哺乳动物表达载体中用于有效的表达。
B.重组纳米颗粒的产生和纯化
使用(A)中描述的表达载体，单独或组合地，分别使用293fectin或ExpiFectamine293转染试剂(Life Technologies)，瞬时转染FreeStyle 293-F或Expi293F细胞(LifeTechnologies)。例如，通过将单独的gp350-铁蛋白或gp350-encapsulin构建体转染到受体细胞中制得gp350纳米颗粒。通过将表达gH-铁蛋白和全长gL的质粒转染到细胞中制得gH/gL纳米颗粒，而通过将表达gH-铁蛋白，全长gL和可溶性gp42的质粒共转染到细胞中制备了gH/gL/gp42纳米颗粒。转染后细胞培养4天，收集培养上清且如下文所述纯化蛋白或纳米颗粒。
使用亲和和尺寸排阻色谱纯化纳米颗粒。简言之，使用30kDa分子量截留超滤单元(Pall)浓缩澄清的细胞培养上清，接着使用PBS替换缓冲液。接着，将纳米颗粒应用于雪花莲凝集素(Galanthus nivalis agglutinin)(GNA，雪花莲凝集素)亲和柱(EYLaboratories)并使用溶于PBS的1.0M甲基α-D-吡喃甘露糖苷溶液洗脱。通过尺寸排阻柱色谱使用HiPrep 16/60Sephacryl S-500HR柱(GE Healthcare Life Sciences)在PBS中进一步纯化纳米颗粒，并收集峰级分用于进一步研究。基于gp350的纳米颗粒的SEC色谱示于图4(右边)而gH/gL-铁蛋白和gH/gL/gp42-铁蛋白的纳米颗粒的SEC色谱示于图5A。
使用离子亲和和SEC色谱纯化可溶性蛋白。简短地说，将澄清的细胞培养上清调整为50mM Tris，pH 8和500mM NaCl，并应用于含有Ni琼脂糖excel树脂的金属离子亲和色谱柱(GE Healthcare Life Sciences)。使用缓冲液(50mM Tris,500mM NaCl,30mM咪唑,pH8.0)洗涤所述柱后，使用洗脱缓冲液(50mM Tris,500mM NaCl,300mM咪唑,pH 8.0)洗脱蛋白。然后通过尺寸排阻色谱使用Superdex 20010/300GL或Superose 610/300GL柱(GEHealthcare Life Sciences)在PBS中进一步纯化蛋白，并收集峰级分用于进一步研究。用于可溶性gp350单体的SEC色谱示于图4(左边)。
C.基于EBV gp350，基于gH/gL，和基于gH/gL/gp42的纳米颗粒的表征
通过电镜(EM)分析进一步检查纯化的纳米颗粒。简短的说，对于负染色EM分析，约50μg ml-1的样品吸收到新鲜的辉光放电(glow-discharged)的碳包被的网格，使用PBS漂洗，并使用2％钼酸铵或0.75％甲酸双氧铀染色。使用Eagle CCD照相机将图像记录在FEIT20显微镜上。gp350-铁蛋和gp350-encapsulin纳米颗粒的EM图像示于图6而基于gH/gL铁蛋白的纳米颗粒和基于gH/gL/gp42铁蛋白的纳米颗粒的图像示于表7，分别在左边和右边。该分析确认了表达的蛋白形成纳米颗粒，具有从球形纳米颗粒核的球状突起。
实施例2.基于gp350的纳米颗粒的抗原性
为了验证基于gp350的纳米颗粒的抗原性，使用抗gp350单克隆抗体(mAbs)MAb72A1和MAb 2L10测试了纳米颗粒的反应性。MAb 72A1识别gp350的受体结合位点，其介导对宿主细胞受体，补体受体2(CR2或CD21)的病毒附着。Mab 72A1也有效地中和EBV(G.J.Hoffman,S.G.Lazarowitz,S.D.Hayward,Monoclonal antibody against a 250,000-dalton glycoprotein of Epstein-Barr virus identifies a membrane antigenand a neutralizing antigen.Proc Natl Acad Sci U S A 77,2979-2983(1980),Sairenji T,Bertoni G,Medveczky MM,Medveczky PG,Nguyen QV,Humphreys RE.,Inhibition of Epstein-Barr virus(EBV)release from P3HR-1and B95-8cell linesby monoclonal antibodies to EBV membrane antigen gp350/220.J Virol.1988Aug；62(8):2614-21.)。CR2结合位点(CR2BS)是病毒上易受攻击的位点之一，并因此是疫苗开发有吸引力的靶标。MAb 2L10是一种非中和性抗体且不与72A1竞争(J.Luka,R.C.Chase,G.R.Pearson,A sensitive enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)against themajor EBV-associated antigens.I.Correlation between ELISA andimmunofluorescence titers using purified antigens.J Immunol Methods 67,145-156(1984))。为了测试表达的蛋白和纳米颗粒与这些抗体的反应性，将100ul纯化的纳米颗粒或可溶性gp350蛋白(以25nM)包被到MaxiSorp平板上(Nunc)。接着向每个孔添加抗gp350抗体(MAb 72A1或MAb 2L10)或抗流感血凝素(MAb C179)。适当的孵育和去除抗体后，使用过氧化物酶缀合的二抗(抗小鼠IgG)检测结合的抗体(Southern Biotech)。
本研究的结果，其示于图8中(左边)，表明72A1和2L10mAbs二者都识别基于gp350的纳米颗粒以及可溶性gp350胞外域。另外，两种抗体以较少的程度结合可溶性D123单体。两种纯化的蛋白均不结合同种型独照MAbC179。
通过免沉淀进一步确认了基于gp350的纳米颗粒的抗原性。简短的说，将五微克针对gp350CR2结合位点(72A1)，gp350非CR2结合位点(2L10)或流感血凝素(C179)的抗体与纯化的纳米颗粒(5μg)在室温孵育30分钟。孵育后，将预洗涤的蛋白G Dynabeads(LifeTechnologies)添加到反应并再孵育30分钟。含有0.01％Tween 20的PBS用作洗涤缓冲液。接着磁性分离免疫复合物，在含有还原剂的Lamini缓冲液中洗涤并洗脱。接着通过SDS-PAGE分析一半体积的反应物。该分析的结果示于图8中(右边)。
实施例3.由基于gp350的纳米颗粒诱导的免疫应答
为了评价基于gp350的纳米颗粒的免疫原性，使用5.0μg的HpBf和EcBf铁蛋白两者和在表面上表达gp350RBD或D123的encapsulin纳米颗粒，在Sigma Adjuvant System(SAS，也称为Ribi)的存在下，在第0周和第3周免疫10周龄的小鼠。每次免疫后2周收集免疫血清来分析针对gp350的免疫应答。简短的说，将可溶性gp350胞外域蛋白(2μg ml-1,100μl孔-1)包被到MaxiSorp平板的孔上(Nunc)，之后每个孔添加系列稀释的免疫血清的等分试样。孵育并去除免疫血清后，向每个孔添加过氧化物酶缀合的二抗(抗小鼠IgG)。孵育和去除未结合的二抗后，孔使用SureBlue chromogen(KPL)显色，且通过添加0.5M硫酸终止反应。然后通过SpectraMax M2e(Molecular Devices)测量450nm的吸光度。通过从结合曲线计算吸光度阈值(四倍背景)处的浓度来确定终点滴度。
本研究的结果，其示于图9中，表明在所有的用基于gp350的纳米颗粒免疫的小鼠中，在单次给药后都检测到了滴度为～103.9-104.9的针对gp350的抗体应答，且通过二次给药，滴度增强约10倍。在所有小鼠中单次给药后也检测到了中和抗体滴度，虽然该滴度不高(IC50<50)。通过二次给药这些滴度以～100倍显著增强。
实施例4.基于gp350的纳米颗粒和可溶性gp350蛋白的比较
为了将基于gp350的纳米颗粒引起的免疫应答与可溶性gp350蛋白的比较，使用5.0和0.5μg的可溶性gp350胞外域或D123或D123纳米颗粒，在作为佐剂的SAS的存在下在第0周和第3周免疫10周龄的小鼠。在首次(1)和二次(2)免疫后收集免疫血清并如实施例2和3中所述进行分析。
本研究的结果，其示于图10中，表明在首次免疫后2周，D123纳米颗粒比可溶性gp350胞外域或可溶性D123蛋白引起更高的抗体应答(对于D123-铁蛋白和D123-encapsulin滴度分别为47,654±16,482和32,042±24907对比gp350胞外域和D123分别为261±219和<50)。然而，在二次免疫后，可溶性gp350胞外域将ELISA滴度显著地升高到仅比D123-铁蛋白或D123-encapsulin免疫组低～2-3倍的滴度(261,116±116,301相比于分别的567,764±188,536或499,128±211,748)。令人惊讶的，可溶性gp350D123甚至在二次免疫后未能引起抗体应答(滴度为96±92)，虽然在铁蛋白和encapsulin上展示的相同的D123为高免疫原性的。因为先前的研究(Sashihara,et al.Virology,2009)揭示了中和性测定和基于免疫沉淀的测定(萤光素酶免疫沉淀系统，LIPS)中测量的滴度之间的强相关性，除ELISA外还在LIPS测定中检测了小鼠免疫血清。对于LIPS测定，在96孔过滤底板(Millipore)中将gp350和Remilla萤光素酶组成的融合蛋白与血清孵育并使用蛋白A/G珠(Thermo Scientific)免疫沉淀。接着，通过添加腔肠素底物(Promega)并通过Centro LB 960光度计(BertholdTechnologies)检测测量抗体结合的融合蛋白的萤光素酶活性。
这些研究表明，在二次免疫后2周，gp350胞外域免疫的小鼠的血清中LIPS抗体滴度比D123-铁蛋白或D123-encapsulin纳米颗粒免疫的小鼠低大于两个log(分别为103.6±0.3相比106.2±0.2或106.1±0.)。为了验证LIPS滴度是否反映了中和抗体滴度，通过GFP报告测定(Sashihara,et al.Virology,2009)确定了血清中和抗体。先前已经描述了B细胞的EBV中和(Sashihara,J.,Burbelo,P.D.,Savoldo,B.,Pierson,T.C.,Cohen,J.I.,Humanantibody titers to Epstein-Barr virus(EBV)gp350correlate with neutralizationof infectivity better than antibody titers to EBV gp42using a rapid flowcytometry-based EBV neutralization assay.Virology 391,249-256(2009))。简短的说，以2倍的梯度系列稀释免疫血清，并将25ul稀释的样品与B95-8/F病毒孵育2小时。将该混合物添加到96孔板中的Raji细胞并在37℃孵育3天。(Raji细胞在具有完全补充物的RPMI1640中传代：10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺)孵育后，在溶于PBS的2％多聚甲醛中固定细胞，并通过Accuri C6流式细胞仪和BD Csampler软件(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)分析来基于GFP表达定量感染的细胞的百分比。中和抗体滴度表示为需要抑制病毒进入50％(IC50)的血清抗体的浓度，基于不存在病毒(0％感染)或血清(100％感染)的对照计算。
令人惊讶的是，在二次给药后，来自可溶性gp350胞外域免疫的小鼠和来自D123-铁蛋白或D123-encapsulin免疫的小鼠血清之间的中和抗体滴度差异为～1000倍(分别为5±1相对8,594±5944或3,939±874)而可溶性gp350胞外域免疫的组中的滴度几乎没有在测定的阈值以上(IC50<10)。总的来说，结果揭示，使用可溶性gp350胞外域免疫主要诱导非中和性抗体，其仅在ELISA中可检测。使用5.0和0.5μg D123-铁蛋白或D123-encapsulin免疫的小鼠中ELISA，LIPS和中和抗体滴度几乎相同(<2倍差异)，而在使用两种可溶性gp350胞外域免疫的小鼠中ELISA和中和抗体滴度存在轻微的下降(ELISA滴度4.4倍下降且使用较低剂量免疫的组中没有中和抗体滴度)。
实施例5.基于gp350的纳米颗粒免疫的小鼠中中和抗体应答的持久性
为了评估实施例4中免疫的小鼠中病毒中和抗体应答的动力学，持续＞6个月纵向测定了中和抗体的滴度。在二次免疫后2个月，以5.0和0.5μg剂量的D123-铁蛋白或D123-encapsulin免疫的动物中中和滴度降低了约一个log到102.4-103.1，然而，该滴度保持在没有进一步的免疫的情况下载相同的水平又持续了一个月。接着，所有小鼠在第16周接受了第三次给药并监控它们的血清中和抗体滴度。
该研究的结果示于图12中。预期地，在D123-铁蛋白和D123-encapsulin中滴度分别提高了33和26倍(分别为104.3±0.2和103.7±0.2)，而该效果在使用可溶性gp350胞外域免疫的组中不明显，如在增强后2周测量的(101.0±0.7)。D123-铁蛋白中的峰值中和抗体滴度比二次免疫后高(103.8±0.3)且该滴度没有像二次免疫后那样快的衰减。在D123-铁蛋白和D123-encapsulin免疫的组中，第三次免疫后2个月和3个月的滴度稳定在103.3-103.8，且其比峰值低1.5-5.9倍并比二次免疫后的相同时间点高一个log。当使用小10倍剂量(0.5μg)的任一种基于gp350的纳米颗粒免疫动物时，观察到了中和抗体滴度相似的动力学和量级。然而，在这一剂量可溶性gp350胞外域不能引起任何中和抗体应答。
实施例6.通过基于gp350的纳米颗粒引起的抗体表征
为了确定由可溶性gp350胞外域或基于gp350的纳米颗粒引起的抗体的精确特异性，进行了基于表面等离子共振(SPR)的抗体竞争测定。该测定检测免疫血清中的特定抗体群体，其特异性与竞争mAb相似。简短的说，通过胺偶联反应将可溶性gp350胞外域固定化到传感器芯片上。在测量免疫血清的结合前，将72A1，2L10或C179注射到流动池以使芯片上mAb识别的位点饱和。接着，将免疫血清(在使用Ribi作为佐剂的5μg免疫原二次免疫后2周采取)注射到抗体饱和的流动池，并测量血清抗体的结合动力学。和72A1针对相同表位的血清抗体不能结合72A1饱和的gp350，并因此导致与C179饱和的gp350相比较低的总体结合。所有数据使用同种型对照(C179饱和的)标准化并表示为分数应答。72A1或2L10对血清抗体结合gp350的抑制(X)通过以下方程式计算：X＝100-{(72A1-或2L10-饱和的流动池的最大反应单位/同种型抗体饱和的流动池的最大反应单位)×100}。令人惊讶的，当竞争抗体抗体是指向CR2BS的mAb 72A1时，由D123-铁蛋白和D123-encapsulin引起的免疫血清中分别52±11和60±12％的总抗gp350抗体为竞争的，而由可溶性的gp350胞外域引起的免疫血清中仅5±4％的抗gp350抗体被阻断。
该分析的结果，其示于图11中，证明了基于gp350的纳米颗粒上的CR2BS确实是抗体应答的主要目标，而可溶性gp350胞外域上的相同位点不是的。重要的，这些血清中存在可忽略的抗gp350抗体部分，其由非中和性的、非CR2BS指向的mAb 2L10竞争(可溶性gp350胞外域，D123-铁蛋白和D123-encapsulin中分别为6±5，5±4和12±16％)，提示由2L10识别的位点在可溶性gp350胞外域和基于gp350的纳米颗粒两者中都不是免疫显性的。
实施例7.EBV阳性人类个体和基于gp350的纳米颗粒免疫的小鼠中血清中和滴度 的比较
获得了来自实施例3和4中免疫小鼠的血清并测定了中和滴度。接着将这些滴度与天然感染EBV的人类中观察到的中和滴度比较。图13(左边)示出了EBV血清反应阳性个体和具有EBV阳性单核细胞增多症的人的组合与基于gp350的纳米颗粒免疫的小鼠之间血清中和滴度(IC50)的比较；(右边)具有EBV阳性感染性单核细胞增多症的人和D123-铁蛋白免疫的小鼠之间血清中和滴度(IC50)的比较。
实施例8.基于gH/gL和gH/gL/gp42的纳米颗粒的抗原性
在小鼠中检测了纯化的纳米颗粒诱导抗体产生的能力。简短的说，使用0.5ug的可溶性gH/gL，可溶性gH/gL/gp42，铁蛋白-gH/gL或铁蛋白-gH/gL/gp42肌肉内注射十周龄的BALB/c小鼠(n＝5)。三周后进行第二轮的注射。在首次注射后5周，抽血并使用Sashihara,et al.,Virology 391,249-256,2009描述的LIPS(萤光素酶免疫沉淀测定)测定对gH，gL和gp42的抗体滴度。
该分析的结果，其示出图15中，表明基于铁蛋白的gH/gL纳米颗粒或基于铁蛋白的gH/gL/gp42纳米颗粒诱导的针对gH/gL复合物的抗体水平比由可溶性gH或gL蛋白诱导的水平显著高。另外的，基于铁蛋白的gH/gL/gp42纳米颗粒诱导的针对gp42的抗体水平比可溶性gH/gL/gp42诱导的水平显著高。
实施例9.中和抗体诱导的比较
使用B细胞和上皮细胞中和测定测量了纯化的纳米颗粒在小鼠中诱导中和抗体的能力。简短的说，如实施例8中所述免疫十周龄的BALB/c小鼠(n＝5)。在二次注射后2周，抽血并测试了血清抑制B细胞和上皮细胞被表达GFP的重组报告病毒(Sashihara J.,et al.,Virology,391,249-256,2009)感染的能力。
该分析的结果，其示于图16中，表明基于铁蛋白的gH/gL纳米颗粒或基于铁蛋白的gH/gL/gp42诱导针对EBV的中和抗体水平，其比由可溶性gH/gL蛋白或可溶性gH/gL/gp42蛋白诱导的水平显著高。
实施例10.使用0.5μg可溶性gH/gL，gH/gL纳米颗粒,可溶性gH/gL/gp42，或gH/gL/ gp42纳米颗粒免疫的小鼠血清中gH/gL抗体滴度的动力学的比较
如实施例1中所述制备基于铁蛋白的纳米颗粒和可溶性蛋白。接着使用0.5ug可溶性gH/gL，可溶性gH/gL/gp42，铁蛋白-gH/gL或铁蛋白-gH/gL/gp42在第0周，第3周和第14周肌肉内注射BALB/c小鼠(n＝5)。在第2,5,13,16,20,24和28周抽血并使用LIPS测定确定对gH/gL的抗体滴度，如Sashihara,et al.,Virology 391,249-256,2009所述。本研究的结果，其示于图17中，证明使用gH/gL纳米颗粒的gH/gL抗体应答比可溶性gH/gL蛋白高，且该抗体滴度在第三次给药后维持>12周。该结果也证明，在2次给药后，使用gH/gL/gp42纳米颗粒免疫的小鼠中gH/gL抗体滴度比可溶性gH/gL/gp42高，但与疫苗的3次给药后的可溶性gH/gL/gp42可比。最后，结果表明，该抗体滴度在第三次给药后维持>12周。
实施例11.使用可溶性gH/gL/42或gH/gL/42纳米颗粒免疫的小鼠血清中gp42抗体 滴度的动力学的比较
如实施例10中所述的进行纳米颗粒和可溶性蛋白的产生，以及免疫和抽血。接着通过LIPS测定确定对gp42的抗体滴度，如Sashihara,et al.,Virology 391,249-256,2009所述。本研究的结果，其示于图18中，证明在2次给药后，使用gH/gL/gp42纳米颗粒免疫的小鼠中gp42抗体滴度比可溶性gH/gL/gp42高，但与疫苗的3次给药后的可溶性gH/gL/gp42可比。结果还表明，gp42抗体滴度在第三次给药后维持>12周。
实施例12.使用可溶性gH/gL，gH/gL纳米颗粒，可溶性gH/gL/gp42，或gH/gL/gp42 纳米颗粒免疫的小鼠中B细胞中和抗体滴度的动力学的比较
如实施例10中所述的进行纳米颗粒和可溶性蛋白的产生，以及免疫和抽血。接着测试了小鼠血清中和B细胞的EBV感染的能力，如实施例9中所述。本研究的结果，其示于图19中，证明使用gH/gL纳米颗粒或gH/gL/gp42纳米颗粒的B细胞中和抗体应答分别比可溶性gH/gL或gH/gL/gp42蛋白高。该结果还证明B细胞中和抗体滴度在第三次给药后维持>12周。
实施例13.使用可溶性gH/gL，gH/gL纳米颗粒，可溶性gH/gL/gp42，或gH/gL/gp42 纳米颗粒免疫的小鼠中上皮细胞中和抗体滴度的动力学的比较
如实施例10中所述的进行纳米颗粒和可溶性蛋白的产生，以及免疫和抽血。如实施例9中所述进行上皮细胞中和测定。本研究的结果，其示于图20中，证明使用gH/gL纳米颗粒或gH/gL/gp42纳米颗粒的上皮细胞中和抗体应答分别比可溶性gH/gL或gH/gL/gp42蛋白高。该结果还证明上皮细胞中和抗体滴度在第三次给药后维持>12周。
实施例14.与来自天然感染的人类血清相比，使用可溶性蛋白或纳米颗粒免疫的 小鼠血清中第三次给药后的B细胞和上皮细胞中和抗体滴度
将实施例12中得到的B细胞中和抗体滴度和实施例13中得到的上皮细胞中和抗体滴度与来自天然感染EBV的个体的人类血清中观察到的中和滴度比较。图21显示了与来自使用可溶性蛋白或纳米颗粒免疫的小鼠的血清相比，人类血清中B细胞中和抗体滴度(左边)或上皮细胞中和滴度(右边)。该比较表明使用纳米颗粒免疫的小鼠中B细胞中和抗体滴度比天然感染的人类高>20倍，而使用纳米颗粒免疫的小鼠中上皮细胞中和抗体滴度比天然感染的人类高>100倍。
实施例15.从单个多肽产生gH/gL-纳米颗粒或gH/gL/gp42-纳米颗粒
为了方便二聚gH/gL-纳米颗粒和三聚gH/gL/gp42-纳米颗粒的制造用于临床研究，制造了表达多聚蛋白的构建体，所述多聚蛋白能够形成含有多个EBV蛋白的纳米颗粒。特别地，制造了表达铁蛋白-gH/gL多肽或铁蛋白-gH/gL/gp42多肽的构建体。每个多肽经设计以包括弗林蛋白酶(fulin)和小核糖核酸病毒2A剪切位点，并使得它们通过自剪切产生基于铁蛋白的纳米颗粒。这些多肽还包含来自人类CD5蛋白的引导肽序列以促进所述多聚蛋白从细胞的分泌。图22阐明了两种不同多聚蛋白的结构。
如实施例1中所述产生纳米颗粒。简短的说，从使用表达个体蛋白的多个质粒共转染的细胞或使用表达gH/gL或gH/gL/gp42多肽的质粒转染的细胞上清纯化蛋白。接着如实施例1A中所述进行通过尺寸排阻色谱对纳米颗粒的纯化。对纯化的gH/gL纳米颗粒和gH/gL/gp42纳米颗粒的SDS-PAGE分析(图22B)表明可以通过表达单个多聚蛋白的单一质粒的瞬时转染产生gH/gL纳米颗粒和gH/gL/gp42纳米颗粒，所述多聚蛋白通过自剪切加工。
实施例16.gp350纳米颗粒在非人类灵长类中的免疫原性
为了评价纯化的纳米颗粒在与比小鼠更接近人类的物种中诱导中和抗体的能力，使用gp350纳米颗粒免疫食蟹猴(Macaca fascicularis)。简短的说，将十二只猴分为三组并在第0，4和12周给予50μg gp350胞外域，或25μg gp350D123-铁蛋白或gp350D123-encapsulin和佐剂(Sigma Adjuvant System)。在免疫前和第6，8和14周抽血，并确定中和抗体滴度。结果示于图23中。
免疫前，在所有的猴中发现了交叉反应的EBV中和抗体(IC50滴度从101.1至102.0)，这是不足为奇的，因为食蟹猴天然地被淋巴隐伏病毒(lymphocryptovirus)感染，所述病毒与EBV共享同源性。在所有组中，两次免疫后(第6周)EBV中和抗体滴度增加，且所述滴度通过第三次给药(第14周)进一步增强。使用gp350D123-铁蛋白(中间四条)和D123-encapsulin(右边四条)免疫的猴中，中和抗体滴度分别为103.3±0.3和102.8±0.3，比可溶性gp350免疫的猴高(102.4±0.6)(左边四条)。这些结果证明了基于gp350的纳米颗粒在第二种动物物种中的免疫原性。
实施例17.针对小鼠被表达EBV gp350的重组牛痘病毒的实验感染的保护免疫力
通过如实施例4和5中所述免疫小鼠评估了gp350纳米颗粒疫苗保护小鼠免受表达EBV gp350的重组牛痘病毒攻击(challenge)的能力。最终免疫后十个月，使用106pfu的表达EBV gp350的重组牛痘病毒通过鼻内途径攻击小鼠。每天监控体重和临床症状。
本研究的结果，其示于图24中，证明使用gp350D123-铁蛋白和gp350D123-encapsulin免疫的小鼠部分地被保护(高达80％的存活)免受表达gp350的牛痘疫苗的致死攻击。相反，所有的未免疫对照小鼠和使用可溶性gp350免疫的动物，除了一只以外，由于病毒感染的攻击死亡。这些结果证明使用基于gp350的纳米颗粒免疫提供了针对表达gp350的重组牛痘病毒攻击的部分保护免疫力。
实施例18.磷酸铝凝胶佐剂中的gp350纳米颗粒的免疫原性
在小鼠中测试了纯化的纳米颗粒在磷酸铝凝胶(alum)佐剂(其被批准用于人类)中诱导中和抗体的能力。将小鼠分为6组：3组接受5μg的gp350D123-铁蛋白而3组接受D123-encapsulin。疫苗在第0，4和16周以无佐剂，磷酸铝凝胶(alum)佐剂，或Sigma AdjuvantSystem(SAS)给予。
本研究的结果，其示于图25中，证明在使用具有佐剂的gp350纳米颗粒免疫的小鼠中EBV中和抗体滴度比使用gp350纳米颗粒但没有佐剂来免疫的动物中高。接受SAS佐剂中的gp350D123-铁蛋白(左边)或gp350D123-encapsulin(右边)的动物具有比接受alum佐剂中相同疫苗的动物高10倍左右的EBV中和抗体滴度。这些结果证明alum佐剂中的gp350纳米颗粒疫苗能够诱导滴度为102.6±0.3至102.8±0.3的EBV中和抗体滴度，其比天然感染的人类中EBV中和滴度高5-8倍。
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Claims (10)

1.一种纳米颗粒，其包含第一融合蛋白，其中所述第一融合蛋白包含选自下组的单体亚基蛋白：单体铁蛋白亚基，单体encapsulin蛋白，单体03-33蛋白，单体硫加氧酶还原酶蛋白，单体二氧四氢蝶啶合酶蛋白，和单体丙酮酸脱氢酶复合物二氢硫辛酰胺乙酰转移酶蛋白，所述单体亚基蛋白与来自选自下组的第一埃巴病毒(EBV)包膜蛋白的至少一个免疫原性部分连接：gp350，gH，gL和gp42，其中所述第一融合蛋白自组装为纳米颗粒，且其中所述纳米颗粒在其表面上表达所述至少一个免疫原性部分。
2.权利要求1的纳米颗粒，其中所述单体亚基蛋白由选自下组的氨基酸序列组成：SEQID NO:2,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:17,SEQ IDNO:20,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:29。
3.权利要求1的纳米颗粒，其中所述至少一个免疫原性部分选自：
a)由来自选自下组的氨基酸序列的至少100个氨基酸组成的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ IDNO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65和SEQID NO:68；
b)由选自下组的至少一个域组成的氨基酸序列：EBV gp350域I,EBV gp350域II和EBVgp350域III；或
c)由EBV gp350 CR2结合位点组成的氨基酸序列。
4.一种产生针对EBV的疫苗的方法，所述方法包括a)在下述条件下表达融合蛋白，所述融合蛋白包含选自下组的单体亚基蛋白：单体铁蛋白亚基，单体encapsulin蛋白，单体03-33蛋白，单体硫加氧酶还原酶蛋白，单体二氧四氢蝶啶合酶蛋白，和单体丙酮酸脱氢酶复合物二氢硫辛酰胺乙酰转移酶蛋白，所述单体亚基蛋白与来自选自下组的第一埃巴病毒(EBV)包膜蛋白的至少一个免疫原性部分连接：gp350，gH，gL和gp42，其中所述融合蛋白自组装为纳米颗粒，所述条件使得所述融合蛋白形成在其表面上展示EBV包膜蛋白的所述至少一个免疫原性部分的纳米颗粒，和b)回收所述纳米颗粒。
5.权利要求1，2或3的纳米颗粒在制备用于疫苗接种个体的针对EBV的疫苗中的用途。
6.一种融合蛋白，其包含来选自下组的单体亚基蛋白：单体铁蛋白亚基，单体encapsulin蛋白，单体03-33蛋白，单体硫加氧酶还原酶蛋白，单体二氧四氢蝶啶合酶蛋白，和单体丙酮酸脱氢酶复合物二氢硫辛酰胺乙酰转移酶蛋白，所述单体亚基蛋白与来自选自下组的埃巴病毒(EBV)包膜蛋白的至少一个免疫原性部分：gp350，gH，gL和gp42，其中所述融合蛋白自组装为纳米颗粒。
7.权利要求6的融合蛋白，其中所述单体铁蛋白亚基蛋白由选自下组的氨基酸序列组成：SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:5,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:29，其中所述融合蛋白能够自组装为纳米颗粒。
8.权利要求6的融合蛋白，其中所述至少一个免疫原性部分选自：
a)由来自选自下组的氨基酸序列的至少100个氨基酸组成的氨基酸序列：SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:47,SEQ IDNO:50,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:59,SEQ ID NO:62,SEQ ID NO:65和SEQID NO:68；
b)由选自下组的至少一个域的免疫原性部分组成的氨基酸序列：EBV gp350域I,EBVgp350域II和EBV gp350域III；或
c)由EBV gp350 CR2结合位点组成的氨基酸序列。
9.一种融合蛋白，其包含选自下组的单体亚基蛋白：单体铁蛋白亚基，单体encapsulin蛋白，单体03-33蛋白，单体硫加氧酶还原酶蛋白，单体二氧四氢蝶啶合酶蛋白，和单体丙酮酸脱氢酶复合物二氢硫辛酰胺乙酰转移酶蛋白，其中所述融合蛋白自组装为纳米颗粒，与来自选自下组的至少两种埃巴病毒(EBV)包膜蛋白的免疫原性部分连接：gp350，gH，gL和gp42。
10.一种核酸分子，编码权利要求6-9任一项的融合蛋白。
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