JP5071854B2 - 微粒子−タンパク質複合体およびその作製方法、半導体装置、蛍光標識方法 - Google Patents

微粒子−タンパク質複合体およびその作製方法、半導体装置、蛍光標識方法 Download PDF

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Description

本発明は、微粒子−タンパク質複合体およびその製造方法に関するものである。
現在、ナノメーターサイズの構造体の構築を目指すナノテクノロジーが世界中で注目を浴びている。ナノテクノロジーの一つとして、球殻状あるいは棒状のタンパク質を鋳型として金属ナノ粒子を形成する試みがなされている。このいわゆるバイオナノプロセスに用いられるタンパク質として、アポフェリチンやリステリアフェリチン、DNA binding proteinなどがある。
図１は、フェリチン（アポフェリチン）およびリステリアフェリチン（リステリアアポフェリチン）の特性を示す図である。フェリチンは、ほ乳類では肝臓、脾臓、心臓に多く含まれる直径約１２ｎｍ（ウマの場合）の球殻状タンパク質で、１７５個のアミノ酸からなるモノマーサブユニット３が２４個集まって１つのタンパク質分子を形成している。１個のタンパク質分子の分子量は４８０ｋＤａである。フェリチンは、生体内においてはタンパク質からなる外殻２の内部に直径が最大で７ｎｍの酸化鉄からなるコア１を有している。フェリチンから酸化鉄のコア１が抜けたものはアポフェリチンと呼ばれる。
一方、リステリアフェリチンは、リステリア菌由来のＤｐｓ様タンパク質であり、１２個のモノマーサブユニット９で構成され、直径約９ｎｍの球殻状をしている。リステリアフェリチンもアポフェリチンと同様に、外殻７の内部に酸化鉄からなるコア６を格納できる空洞が形成されており、その空洞径は約４ｎｍである。なお、リステリアフェリチンから酸化鉄からなるコア６が抜けたものは、リステリアアポフェリチンと呼ばれる。
アポフェリチンには、酸化鉄からなるコアの代わりに種々の金属からなるコアを形成させることができる。このため、コバルト（Ｃｏ）、マンガン（Ｍｎ）、ニッケル（Ｎｉ）など、種々の金属からなる微粒子とアポフェリチンとの複合体が現在までに作製されている。リステリアアポフェリチンについても、種々の金属からなる微粒子の形成に利用することができる。
特開２００３−１１３１９８号公報
上記の従来技術では金属あるいは金属酸化物からなる微粒子を作製することができるが、２種類以上の化合物からなる化合物半導体の微粒子を作製することができなかった。そこで、アポフェリチン内の空洞に半導体からなる微粒子を保持させる研究が進められている。化合物半導体からなる微粒子の場合、励起させた場合に発光することが結晶性が良いことのひとつの目安となっている。半導体装置の材料としては結晶性の良好な半導体微粒子が求められているが、バイオナノプロセスを用いた場合、化合物半導体からなり、発光が可能な微粒子を作製することができなかった。
本発明は、化合物半導体からなり、発光が可能な微粒子を作製することを目的とする。
本発明の微粒子−タンパク質複合体は、複数のモノマーサブユニットから構成され、内部に空洞が形成された外殻と、前記外殻内に形成され、化合物半導体からなり、励起された場合に蛍光を発する微粒子とを備えている。
このため、微粒子−タンパク質複合体は、半導体からなる微粒子の量子効果を利用した半導体装置の作製に用いられる他、蛍光を生じることを利用して生体物質の標識方法などに用いられることができる。
空洞が形成されたタンパク質としてはアポフェリチンやリステリアアポフェリチンなどのフェリチンファミリータンパク質やその組み換え体が好ましく用いられる。
微粒子の材料としては、II−VI型の化合物半導体であるＣｄＳあるいはＺｎＳなどが挙げられる。微粒子の直径は、アポフェリチンを用いた場合は約７ｎｍ以下で、リステリアアポフェリチンを用いた場合は約４ｎｍ以下である。
本発明の微粒子−タンパク質複合体の作製方法は、水溶液中で金属のアンモニウム錯体を形成させる工程（ａ）と、内部に空洞が形成されたタンパク質の溶液とチオ酢酸とを前記水溶液中で混合して、前記タンパク質の前記空洞内に前記金属の硫化物からなる微粒子を形成させる工程（ｂ）とを備えている。
これにより、アンモニウム錯体を形成させることでタンパク質の外部で金属硫化物が形成されるのを防ぐとともに、チオ酢酸からＳ２−イオンが徐々に放出されることにより、タンパク質内に結晶性の良い金属硫化物を形成することができると考えられる。タンパク質としてはアポフェリチンやリステリアアポフェリチンなどのフェリチンファミリータンパク質が好ましく用いられ、金属としてはＣｄあるいはＺｎが好ましく用いられる。
なお、上述の方法で作製された微粒子−タンパク質複合体を用いれば、微粒子を用いた半導体記憶装置を実現したり、微粒子から発せられる蛍光を利用した生体物質等の標識を行ったりすることが可能となる。
以上のように、本発明の方法によって作製される微粒子−タンパク質複合体は、半導体装置の製造や生体物質等の標識など、種々の分野に用いることができる。
図１は、フェリチン（アポフェリチン）およびリステリアフェリチンの特性を示す図である。 図２（ａ）は、本発明の第１の実施形態に係る化合物半導体−アポフェリチン複合体の作製方法を示すフローチャートであり、（ｂ）は、各試薬の最終濃度を示す図である。 図３（ａ）は、イオウ源としてチオ尿素を用いた場合の反応液中のアポフェリチンを示す透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真であり、（ｂ）は、イオウ源としてチオ酢酸を用いた場合の反応液中のアポフェリチンを示すＴＥＭ写真である。 図４は、反応液中のアンモニア濃度を変化させた場合のＣｄＳ−アポフェリチン複合体を示すＴＥＭ写真である。 図５は、ＣｄＳ−アポフェリチン複合体の蛍光スペクトルを示す図である。 図６（ａ）〜（ｃ）は、各条件においてアポフェリチン中に形成されたＣｄＳ微粒子の粒子径を測定した結果を示す図である。 図７（ａ）は、チオ尿素を用いた場合の反応液中のＳ２−イオン濃度とｐＨとを示す図であり、（ｂ）は、チオ酢酸を用いた場合の反応液中のＳ２−イオン濃度とｐＨとを示す図である。 図８は、第１の実施形態に係るＣｄＳ−アポフェリチン複合体の作製方法における反応機構を説明するための図である。 図９（ａ）は、本発明の第２の実施形態に係る化合物半導体−アポフェリチン複合体の作製方法を示すフローチャートであり、（ｂ）は、各試薬の最終濃度を示す図である。 図１０（ａ）は、イオウ源としてチオ尿素を用いた場合の反応液中のアポフェリチンを示す透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真であり、（ｂ）は、イオウ源としてチオ酢酸を用いた場合の反応液中のアポフェリチンを示すＴＥＭ写真である。 図１１は、ＺｎＳ−アポフェリチン複合体の蛍光スペクトルを示す図である。 図１２（ａ）は、本発明の第３の実施形態に係る化合物半導体−リステリアアポフェリチン複合体の作製方法を示すフローチャートであり、（ｂ）は、各試薬の最終濃度を示す図であり、（ｃ）は、第３の実施形態の変形例に係る化合物半導体−リステリアアポフェリチン複合体の作製方法での各試薬の最終濃度を示す図である。 図１３は、ＣｄＳ−リステリアアポフェリチン複合体の形成方法の条件を変えた場合のコア形成率を示す図である。 図１４（ａ）は、本発明の第４の実施形態に係る化合物半導体−リステリアアポフェリチン複合体の作製方法を示すフローチャートであり、（ｂ）は、各試薬の最終濃度を示す図であり、（ｃ）は、第４の実施形態の変形例に係る化合物半導体−リステリアアポフェリチン複合体の作製方法での各試薬の最終濃度を示す図である。 図１５は、市販のアポフェリチン（欠失なし）およびFer8アポフェリチンを用いた場合で、反応液の上清中に残存するタンパク質量を示す図である。 図１６は、反応液中のアンモニア濃度を７．５ｍＭ、３７．５ｍＭ、７５ｍＭとした場合のＣｄＳ−Fer8アポフェリチン複合体の蛍光スペクトルを示す図である。 図１７は、市販のアポフェリチンを用いた場合とFer8アポフェリチンを用いた場合とでアポフェリチン内にコアが形成される割合を比較した図である。 図１８は、本発明の第６の実施形態に係る半導体装置を示す断面図である。 図１９（ａ）〜（ｆ）は、第６の実施形態に係る半導体装置の製造方法を説明するための断面図である。 図２０（ａ）〜（ｇ）は、本発明の第７の実施形態の第１の蛍光標識方法を説明するための図である。 図２１（ａ）、（ｂ）は、第７の実施形態の第２の蛍光標識方法を説明するための図である。 図２２（ａ）〜（ｃ）は、本発明の第８の実施形態に係る基板に対する蛍光標識方法の概略を示す図である。 図２３は、本発明の第９の実施形態に係る化合物半導体−アポフェリチン複合体の作成方法を示すフローチャートである。 図２４（ａ）は、第９の実施形態に係る方法を用いて作製されたＣｄＳ微粒子の直径を示す図であり、（ｂ）は、第１の実施形態の方法で形成させたＣｄＳ−アポフェリチン複合体のＴＥＭ写真であり、（ｃ）は、本実施形態の方法で形成させたＣｄＳ−アポフェリチン複合体のＴＥＭ写真である。
符号の説明
１、６、１１ コア
２、７、１２ 外殻
３、９、１３ モノマーサブユニット
１０１ 半導体基板
１０２ 素子分離用絶縁膜
１０３ トンネル絶縁膜
１０３ａ、１０５ａ ＳｉＯ２膜
１０４ 微粒子
１０５ 絶縁膜
１０６ コントロールゲート
１０７ａ ソース領域
１０７ｂ ドレイン領域
１０８ 層間絶縁膜
１０９ コンタクトホール
１１０ タングステンプラグ
１１１ａ、１１１ｂ Ａｌ配線
１２０ 半導体装置
１３０ チャネル
１３２ アポフェリチン
１３５ 硫化物イオン（金属イオン）
１３７ 微粒子−アポフェリチン複合体
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。
（第１の実施形態）
図２（ａ）は、本発明の第１の実施形態に係る化合物半導体−アポフェリチン複合体の作製方法を示すフローチャートであり、（ｂ）は、各試薬の最終濃度を示す図である。本実施形態では、硫化カドミウム（ＣｄＳ）からなる微粒子をアポフェリチン内に形成させる方法を説明する。
まず、図２（ａ）に示すステップＳ１では、酢酸アンモニウム溶液と酢酸カドミウム溶液とを混合する。具体的には、３００ｍＬの純水に、１Ｍの酢酸アンモニウム、１Ｍのアンモニア水、１００ｍＭの酢酸カドミウム溶液を混合する。酢酸アンモニウムの最終濃度が４０ｍＭ、アンモニアの最終濃度がそれぞれ７．５ｍＭ、３７．５ｍＭ、７５ｍＭ、酢酸カドミウムの最終濃度が１ｍＭとなるように各試薬を混合する。その後、反応液にアポフェリチン溶液を添加する。具体的には、適当な濃度のアポフェリチン溶液を最終濃度が例えば０．３ｍｇ／ｍＬになるように反応液に加える。なお、本実施形態の方法で用いられる試薬の濃度は、ここで例示したものに限られない。
次に、ステップＳ２では、ステップＳ１で調整された反応液を室温で１０分間放置する。これにより、カドミウムのアンモニウム錯体が形成される。
次いで、ステップＳ３では、反応液にチオ酢酸（Ｃ２Ｈ４ＯＳ）を添加する。具体的には、チオ酢酸を最終濃度が１ｍＭとなるように反応液に加える。なお、本実施形態で用いられるアポフェリチンはウマ脾臓由来のアポフェリチンである。また、このアポフェリチンは、ＬサブユニットとＨサブユニットの２種類のモノマーサブユニットで構成されている。
その後、ステップＳ４では、反応液を室温で１２時間以上放置してＣｄＳ−アポフェリチン複合体を形成させる。この際のｐＨは４．０以上９．０以下程度とする。
なお、各試薬の最終濃度は上述の値に限られない。各試薬の濃度範囲の例は、図２（ｂ）の通りである。ただし、反応液中のアポフェリチンの最終濃度が０．３ｍｇ／ｍＬ以上１ｍｇ／ｍＬ以下の範囲外であってもＣｄＳ−アポフェリチン複合体を形成することは可能である。また、酢酸アンモニウムの濃度も４０ｍＭに限られない。また、ステップＳ４での反応時間は２４時間程度であってもよい。
図３（ａ）は、イオウ源としてチオ尿素を用いた場合の反応液中のアポフェリチンを示す透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真であり、（ｂ）は、イオウ源としてチオ酢酸を用いた場合の反応液中のアポフェリチンを示すＴＥＭ写真である。また、図４は、反応液中のアンモニア濃度を変化させた場合のＣｄＳ−アポフェリチン複合体を示すＴＥＭ写真である。
図３（ｂ）に示すように、本実施形態の方法によれば、アポフェリチン中にＣｄＳからなるコアを形成できることが分かる（図中の黒い丸）。これに対し、チオ酢酸に代えてイオウ源としてチオ尿素を用いた場合には、アポフェリチン中にほとんどＣｄＳからなるコアが形成されなかった。この違いについての考察は後述する。
また、図４に示す結果から、反応液中のアンモニア濃度を７．５ｍＭ〜７５ｍＭに変化させると微粒子の粒径が異なるＣｄＳ−アポフェリチン複合体が形成できることが分かった。
図５は、ＣｄＳ−アポフェリチン複合体の蛍光スペクトルを示す図である。ここでは、ＣｄＳ−アポフェリチン複合体の濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとした反応液中で、波長３５０ｎｍの光で励起した際のＣｄＳ−アポフェリチン複合体の蛍光スペクトルを示す。同図において、波長４４０ｎｍ〜４５０ｎｍ付近のピークはアポフェリチンによる蛍光であると考えられる。また、特にアンモニア濃度が３７．５ｍＭと７５ｍＭの場合に波長５６０ｎｍ、６１０ｎｍ、６４０ｎｍ付近にＣｄＳ微粒子によるものと見られる蛍光が見られた。なお、励起光を浴びた反応液を目視した場合、アポフェリチンのみを含む反応液では青色になり、アンモニア濃度が増加するに従って反応液は赤に近い色に変わった。
ここで、発明者らは、アンモニア濃度が互いに異なる反応液中で形成されたＣｄＳ−アポフェリチン複合体の蛍光波長のピークが異なる理由について調べた。図６（ａ）〜（ｃ）は、各条件においてアポフェリチン中に形成されたＣｄＳ微粒子の粒子径を測定した結果を示す図である。これは、ＴＥＭ像を粒径分析ソフトを用いて分析した結果である。
この結果、図６（ａ）に示すように、アンモニア濃度が７．５ｍＭの場合にはＣｄＳ微粒子の平均径が４．７ｎｍで標準偏差σが０．７ｎｍであることが分かった。また、図６（ｂ）に示すように、アンモニア濃度が３７．５ｍＭの場合にはＣｄＳ微粒子の平均径が５．１ｎｍ、標準偏差σが０．８ｎｍであることが分かった。また、図６（ｃ）に示すように、アンモニア濃度が７５ｍＭの場合にはＣｄＳ微粒子の平均径が７．１ｎｍ、標準偏差σが０．８ｎｍであることが分かった。これらの結果から、反応液中のアンモニア濃度を調節することで、異なる粒径のＣｄＳ微粒子を形成できることが分かった。さらに、本実施形態の方法によれば、他の方法で微粒子を形成する場合に比べて、粒径の均一な微粒子を形成できることも分かった。
すなわち、本実施形態の方法により作製されたＣｄＳ−アポフェリチン複合体は、図３（ｂ）に示すように、多数（２４個）のモノマーサブユニット３により構成され、内部に空洞（保持部）が形成された外殻２と、外殻２の空洞内に形成されたＣｄＳからなり、励起された場合に蛍光を発するコア（微粒子）１とを備えている。
次に、本実施形態の方法によってＣｄＳ−アポフェリチン複合体を形成することができた理由についての仮説を説明する。
図７（ａ）は、チオ尿素を用いた場合の反応液中のＳ２−イオン濃度とｐＨとを示す図であり、（ｂ）は、チオ酢酸を用いた場合の反応液中のＳ２−イオン濃度とｐＨとを示す図である。図８は、本実施形態のＣｄＳ−アポフェリチン複合体の作製方法における反応機構を説明するための図である。なお、図７では、Ｃｄイオンを含まない反応液を用いて測定している。
図７（ａ）に示すように、チオ尿素をイオウ源として用いた場合、いずれの濃度においても反応液中にＳ２−イオンは見られず、反応液のｐＨはチオ尿素の濃度に影響されない。これに対し、図７（ｂ）に示すように、チオ酢酸をイオウ源として用いた場合、チオ酢酸の添加後からＳ２−イオン濃度はゆっくり上昇し、５時間後に大きくなった後、２２時間後には低下する。反応液のｐＨはチオ酢酸の濃度に応じて変化する。また、Ｓ２−イオン濃度はチオ酢酸濃度が１０〜２０ｍＭのときに最も大きくなっている。チオ尿素を用いた場合にはＣｄＳ−アポフェリチン複合体はほとんど形成されないことから、Ｓ２−イオンの存在がＣｄＳ−アポフェリチン複合体の形成に必要であると考えられる。
また、アンモニウムイオンを反応液に加えない場合には、ＣｄＳ粒子がアポフェリチンの外部で形成されてしまうことから、カドミウムがアンモニウムイオンと錯体を形成して安定化されることがＣｄＳ−アポフェリチン複合体を形成させる上で好ましいと考えられる。すなわち、本実施形態の方法でＣｄＳ−アポフェリチン複合体を形成できるのは、図８に示すように、チオ尿素に比べて不安定なチオ酢酸が水溶液中でゆっくり分解してＳ２−イオンを供給することと、アンモニウムイオンの添加によりテトラアンミンカドミウムイオンが形成されてアポフェリチンの外部でＣｄＳの沈殿が防がれることとによるものと考えられる。
なお、図２（ａ）に示すステップＳ１では、酢酸アンモニウム溶液に代えてアンモニウムイオンを加えた酢酸など、アンモニウムイオンと酢酸イオンを含む溶液を用いてもＣｄＳ−アポフェリチン複合体を形成させることができる。
また、図２（ａ）に示すステップＳ２やステップＳ４では、反応液を室温で放置したが、室温以外の温度であっても錯体やＣｄＳ−アポフェリチン複合体を形成させることは可能である。
また、イオウ源としてはチオ酢酸が最も好ましいが、硫化アンモニウム（（ＮＨ４）２Ｓ）やチオ硫酸塩（Ｋ２Ｓ２Ｏ３、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）等をチオ酢酸の代わりに用いてもＣｄＳ−アポフェリチン複合体を形成させることはできる。反応時間を長くすればチオ尿素を用いてもＣｄＳ−アポフェリチン複合体は多少形成されるが、複合体形成数が少なく実用的ではない。
また、以上で説明した例ではウマ脾臓由来のアポフェリチンを用いたが、他の臓器（心臓や肝臓など）由来のアポフェリチンを用いてもよいし、他の生物のアポフェリチンを用いても、本実施形態と同様の方法でＣｄＳ−アポフェリチン複合体を形成させることができる。
なお、本実施形態のＣｄＳ−アポフェリチン複合体は、ＣｄＳからなる微粒子を用いた半導体記憶装置や蛍光を発する特性を用いたマーカーとしての利用など、種々の分野に用いることが可能である。
（第２の実施形態）
図９（ａ）は、本発明の第２の実施形態に係る化合物半導体−アポフェリチン複合体の作製方法を示すフローチャートであり、（ｂ）は、各試薬の最終濃度を示す図である。本実施形態では、硫化亜鉛（ＺｎＳ）からなる微粒子をアポフェリチン内に形成させる方法を説明する。
まず、図９（ａ）に示すステップＳ１１では、酢酸アンモニウム溶液と酢酸亜鉛溶液とを混合する。具体的には、３００ｍＬの純水に、１Ｍの酢酸アンモニウム、１Ｍのアンモニア水、１００ｍＭの酢酸亜鉛溶液を混合する。酢酸アンモニウムの最終濃度が４０ｍＭ、アンモニアの最終濃度がそれぞれ７．５ｍＭ〜７５ｍＭ、酢酸亜鉛の最終濃度が１ｍＭとなるように各試薬を混合する。その後、反応液にアポフェリチン溶液を加える。具体的には、適当な濃度のアポフェリチン溶液を最終濃度が例えば０．３ｍｇ／ｍＬになるよう加える。なお、本実施形態の方法で用いられる試薬の濃度は、ここで例示したものに限られない。
次に、ステップＳ１２では、ステップＳ１１で調整された反応液を室温で１０分間放置する。これにより、亜鉛のアンモニウム錯体が形成される。
次いで、ステップＳ１３では、反応液にチオ酢酸を添加する。具体的には、チオ酢酸を最終濃度が１０ｍＭとなるように反応液に加える。なお、本実施形態で用いられるアポフェリチンはウマ脾臓由来のアポフェリチンである。
その後、ステップＳ１４では、反応液を室温で１２時間以上放置してＺｎＳ−アポフェリチン複合体を形成させる。この際のｐＨは４．０以上９．０以下程度とする。ここで、アポフェリチン内に形成されるＺｎＳは、条件によっては一部がＺｎＳ２などＺｎＳ以外の亜鉛硫化物になっている場合がある。なお、ステップＳ１４の反応時間は２４時間程度であってもよい。
なお、各試薬の最終濃度は上述の値に限られない。各試薬の濃度範囲の例は、図９（ｂ）の通りである。ただし、反応液中のアポフェリチンの最終濃度が０．３ｍｇ／ｍＬ以上１ｍｇ／ｍＬ以下の範囲外であってもＺｎＳ−アポフェリチン複合体を形成することは可能である。また、酢酸アンモニウムの濃度も４０ｍＭに限られない。
図１０（ａ）は、イオウ源としてチオ尿素を用いた場合の反応液中のアポフェリチンを示す透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真であり、（ｂ）は、イオウ源としてチオ酢酸を用いた場合の反応液中のアポフェリチンを示すＴＥＭ写真である。
図１０（ｂ）に示すように、本実施形態の方法によれば、アポフェリチン中にＺｎＳを含む亜鉛硫化物からなるコアを形成できることが分かる。これに対し、チオ酢酸に代えてイオウ源としてチオ尿素を用いた場合には、アポフェリチン中にはほとんど亜鉛硫化物からなるコアが形成されなかった。また、反応液中のアンモニア濃度を１．０ｍＭ〜１００ｍＭに変化させてもＺｎＳ−アポフェリチン複合体が形成できた（図示せず）。
図１１は、ＺｎＳ−アポフェリチン複合体の蛍光スペクトルを示す図である。ここでは、ＺｎＳ−アポフェリチン複合体を含む反応液中で、波長３２５ｎｍの光でＺｎＳ微粒子を励起した際の蛍光スペクトルを示す。同図において、波長４００ｎｍ以下の領域にあるピークは、１５０ｍＭＮａＣｌ溶液であるブランク試料との比較から、ＺｎＳ粒子には依存しない蛍光であると考えられる。そして、反応液中のアンモニア濃度が７．５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で波長４００ｎｍ〜５００ｎｍの領域に、ＺｎＳ微粒子によるものと考えられる蛍光が見られた。特に、反応液中のアンモニア濃度が１５ｍＭ以上１００ｍＭの範囲であれば、より強い蛍光が見られた。なお、ＺｎＳ微粒子による蛍光は目視では青色に見え、長期保存（１年）後の消光もほとんど見られなかった。また、ＣｄＳ微粒子と同様に、反応液中のアンモニア濃度の上昇に伴ってＺｎＳ微粒子の粒径は変化する。
本実施形態の方法により作製されたＺｎＳ−アポフェリチン複合体は、図１０（ｂ）に示すように、多数（２４個）のモノマーサブユニット１３により構成され、内部に空洞が形成された外殻１２と、外殻１２の空洞内に形成されたＺｎＳからなり、励起された場合に蛍光を発するコア（微粒子）１１とを備えている。なお、本実施形態のＺｎＳ−アポフェリチン複合体は、ＺｎＳからなる微粒子を用いた半導体記憶装置や蛍光を発する特性を用いたマーカーとしての利用など、種々の分野に用いることが可能である。
なお、図９（ａ）に示すステップＳ１２やステップＳ１４では、反応液を室温で放置したが、室温以外の温度であってもアンモニウム錯体やＺｎＳ−アポフェリチン複合体を形成させることは可能である。
また、イオウ源としてはチオ酢酸が最も好ましいが、硫化アンモニウム（（ＮＨ４）２Ｓ）やチオ硫酸塩（Ｋ２Ｓ２Ｏ３、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３）等をチオ酢酸の代わりに用いてもＺｎＳ−アポフェリチン複合体を形成させることはできる。
また、以上で説明した例ではウマ脾臓由来のアポフェリチンを用いたが、他の臓器（心臓や肝臓など）由来のアポフェリチンを用いてもよいし、他の生物のアポフェリチンを用いても、本実施形態と同様の条件でＺｎＳ−アポフェリチン複合体を形成させることができる。
また、酢酸アンモニウムの代わりにアンモニア水を加えた酢酸緩衝液などのアンモニウムイオンと酢酸イオンとを含む溶液を用いてもＺｎＳ−アポフェリチン複合体を形成することはできる。
（第３の実施形態）
図１２（ａ）は、本発明の第３の実施形態に係る化合物半導体−リステリアアポフェリチン複合体の作製方法を示すフローチャートであり、（ｂ）は、各試薬の最終濃度を示す図である。本実施形態では、ＣｄＳからなる微粒子をリステリアアポフェリチン内に形成させる方法を説明する。
まず、図１２（ａ）に示すステップＳ２１では、酢酸アンモニウム溶液と酢酸カドミウム溶液とを混合する。具体的には、３００ｍＬの純水に、１Ｍの酢酸アンモニウム、１Ｍのアンモニア水、１００ｍＭの酢酸カドミウム溶液を混合する。酢酸アンモニウムの最終濃度が４０ｍＭ、アンモニアの最終濃度がそれぞれ７．５ｍＭ〜７５ｍＭ、酢酸カドミウムの最終濃度が１ｍＭとなるように各試薬を混合する。その後、反応液にリステリアアポフェリチン溶液を添加する。具体的には、適当な濃度のリステリアアポフェリチン溶液を最終濃度が例えば０．３ｍｇ／ｍＬになるように反応液に加える。なお、本実施形態の方法で用いられる試薬の濃度は、ここで例示したものに限られない。
次に、ステップＳ２２では、ステップＳ２１で調整された反応液を室温で１０分間放置する。これにより、カドミウムのアンモニウム錯体が形成される。
次いで、ステップＳ２３では、反応液にチオ酢酸を添加する。具体的には、チオ酢酸を最終濃度が５〜１０ｍＭとなるように反応液に加える。なお、本実施形態で用いられるリステリアアポフェリチンはリステリア菌由来のＤｐｓ様タンパク質とその変異タンパク質である。
その後、ステップＳ２４では、反応液を室温で１２時間以上放置してＣｄＳ−アポフェリチン複合体を形成させる。この際のｐＨは４．０以上９．０以下程度とする。なお、反応液を０℃〜５５℃の範囲の温度下で放置するのが好ましい。
なお、各試薬の最終濃度は上述の値に限られない。各試薬の濃度範囲の例は、図１２（ｂ）の通りである。ただし、反応液中のリステリアアポフェリチンの最終濃度が０．３ｍｇ／ｍＬ以上１ｍｇ／ｍＬ以下の範囲外であってもＣｄＳ−リステリアアポフェリチン複合体を形成することは可能である。また、酢酸アンモニウムの濃度も４０ｍＭに限られない。
以上の方法により作製されるＣｄＳ−リステリアアポフェリチン複合体は、リステリアアポフェリチンの１２個のモノマーサブユニットからなり、内部に空洞が形成された外殻と、空洞内に形成されたＣｄＳからなる微粒子とを備えている。微粒子の直径は約５ｎｍあるいはそれ以下である。
−第３の実施形態の変形例−
図１２（ｃ）は、第３の実施形態の変形例に係る化合物半導体−リステリアアポフェリチン複合体の作製条件を示す図である。
本変形例の方法では、図１２（ａ）に示すステップＳ２１において、図１２（ｃ）に示す濃度になるように酢酸アンモニウム溶液と、酢酸カドミウム溶液と、アンモニア水、リステリアアポフェリチン溶液とを混合する。この際に、反応温度は０〜１５℃とする。特に、４℃程度であることが好ましい。また、酢酸カドミウム溶液の濃度は第３の実施形態に比べて高くすることが好ましい。
次に、ステップＳ２２において、１０分間放置した後、ステップＳ２３において図１２（ａ）に示す濃度になるようにチオ酢酸を反応液に添加する。ここで、酢酸カドミウムとチオ酢酸の濃度は第３の実施形態の方法に比べて高めにすることが好ましい。
次に、ステップＳ２４において、反応液を０℃以上１５℃以下で１２時間以上放置してＣｄＳ−リステリアアポフェリチン複合体を形成させる。
この方法により、リステリアアポフェリチン内でのＣｄＳ微粒子の形成率を１００％近くにまで高めることができる。
図１３は、ＣｄＳ−リステリアアポフェリチン複合体の形成方法の条件を変えた場合のコア形成率を示す図である。この結果から、２５℃で反応させる場合よりも４℃で反応させる方がコアの形成率が向上できること、および低温においては反応液中の酢酸カドミウム濃度（すなわちカドミウム濃度）が高い方がコア形成率が向上できることが分かる。特に、カドミウム濃度を３ｍＭにした場合には、コア形成率はほぼ１００％になっている。２５℃においてカドミウム濃度を上げた場合にはリステリアアポフェリチン外部でのＣｄＳの析出が増えるためにコア形成率の向上は見られないことから、低温にしつつカドミウム濃度を上げることで、ＣｄＳの析出が緩やかになり、リステリアアポフェリチン内での微粒子の形成率が上昇するものと推測される。
この方法によれば、より確実にＣｄＳ微粒子を作製することができる。そのため、微粒子作製時のコストダウンを図ることもできる。
（第４の実施形態）
図１４（ａ）は、本発明の第４の実施形態に係る化合物半導体−リステリアアポフェリチン複合体の作製方法を示すフローチャートであり、（ｂ）は、各試薬の最終濃度を示す図である。本実施形態では、硫化亜鉛（ＺｎＳ）からなる微粒子をリステリアアポフェリチン内に形成させる方法を説明する。
まず、図１４（ａ）に示すステップＳ３１では、酢酸アンモニウム溶液と酢酸亜鉛溶液とを混合する。具体的には、３００ｍＬの純水に、１Ｍの酢酸アンモニウム、１Ｍのアンモニア水、５０ｍＭの酢酸亜鉛溶液を混合する。酢酸アンモニウムの最終濃度が４０ｍＭ、アンモニアの最終濃度が１０ｍＭ、酢酸亜鉛の最終濃度が１ｍＭとなるように各試薬を混合する。その後、反応液にリステリアアポフェリチン溶液を添加する。具体的には、適当な濃度のリステリアアポフェリチン溶液を最終濃度が例えば０．３ｍｇ／ｍＬになるように反応液に加える。なお、本実施形態の方法で用いられる試薬の濃度は、ここで例示したものに限られない。
次に、ステップＳ３２では、ステップＳ３１で調整された反応液を室温で１０分間放置する。これにより、亜鉛のアンモニウム錯体が形成される。
次いで、ステップＳ３３では、反応液にチオ酢酸を添加する。具体的には、チオ酢酸を最終濃度が１０ｍＭとなるように反応液に加える。
その後、ステップＳ３４では、反応液を室温で１２時間以上放置してＺｎＳ−リステリアアポフェリチン複合体を形成させる。この際のｐＨは４．０以上９．０以下程度とする。
なお、各試薬の最終濃度は上述の値に限られない。各試薬の濃度範囲の例は、図１４（ｂ）の通りである。ただし、反応液中のリステリアアポフェリチンの最終濃度が０．３ｍｇ／ｍＬ以上１ｍｇ／ｍＬ以下の範囲外であってもＺｎＳ−リステリアアポフェリチン複合体を形成することは可能である。また、酢酸アンモニウムの濃度も４０ｍＭに限られない。
以上の方法により作製されるＺｎＳ−リステリアアポフェリチン複合体は、リステリアアポフェリチンの１２個のモノマーサブユニットからなり、内部に空洞が形成された外殻と、空洞内に形成されたＺｎＳからなる微粒子とを備えている。微粒子の直径は約５ｎｍあるいはそれ以下である。
−第４の実施形態の変形例−
図１４（ｃ）は、第３の実施形態の変形例に係る化合物半導体−リステリアアポフェリチン複合体の作製条件を示す図である。
本変形例の方法では、図１４（ａ）に示すステップＳ３１において、図１４（ｃ）に示す濃度になるように酢酸アンモニウム溶液と酢酸亜鉛溶液とリステリアアポフェリチン溶液とを混合する。この際に、反応温度は０℃以上１５℃以下とする。特に、４℃程度であることが好ましい。また、酢酸亜鉛溶液の濃度は第３の実施形態に比べて高くすることが好ましい。
次に、ステップＳ３２において、１０分間放置した後、ステップＳ３３において図１４（ｃ）に示す濃度になるようにチオ酢酸を反応液に添加する。ここで、チオ酢酸の濃度は第４の実施形態の方法に比べて高めにすることが好ましい。
次に、ステップＳ３４において、反応液を０〜１５℃で１２時間以上放置してＺｎＳ−リステリアアポフェリチン複合体を形成させる。
この方法により、リステリアアポフェリチン内でのＺｎＳ微粒子の形成率を１００％近くにまで高めることができる。ＣｄＳ−リステリアアポフェリチン複合体の形成時と同様に、低温にしつつ亜鉛濃度を上げることで、ＺｎＳの析出が緩やかになってリステリアアポフェリチン外部での析出が抑えられると考えられる。そのため、リステリアアポフェリチン内での微粒子の形成率が上昇するものと推測される。
この方法によれば、第４の実施形態に係る方法よりも確実にＺｎＳ微粒子を作製することができる。そのため、微粒子作製時のコストダウンを図ることもできる。
（第５の実施形態）
本発明の第５の実施形態として、遺伝子組み換え技術を用いて作製されたリコンビナントアポフェリチンを用いて化合物半導体からなる微粒子−タンパク質複合体を形成させる方法を説明する。
上述したように、第１および第２の実施形態の方法で用いられた市販のアポフェリチンは、ＨサブユニットとＬサブユニットという２種類のモノマーサブユニットの混成体である。Ｌサブユニットのアミノ酸配列は配列番号１に示された通りである。天然に存在するアポフェリチンは体内でＮ末端から８残基分がプロセシングを受けて欠失すると言われている。この８残基のうちの一部はアポフェリチンの外表面に突きだしており、この部分を失うことでアポフェリチンの表面電荷の状態は変わると考えられる。本実施形態の方法では、Ｎ末端の８残基のうちアミノ酸配列の先頭に位置するメチオニンを除く７残基分を欠失させたＬサブユニットのみからなるリコンビナントアポフェリチンを用いて微粒子−タンパク質複合体の形成を行う。
まず、遺伝子組み換え技術を用いてウマＬ−アポフェリチンの（Ｎ末端から）２〜８番目のアミノ酸を欠失させたＬサブユニットを作製する。具体的には、２〜８番目のアミノ酸を欠失させたＬサブユニットをコードするＤＮＡを発現ベクターに導入し、これを用いて大腸菌を形質転換することでＮ末端アミノ酸を欠失させたＬサブユニットのみからなるリコンビナントアポフェリチンを得る。このリコンビナントアポフェリチンを以後「Fer8アポフェリチン」と呼ぶ。このFer8アポフェリチンのアミノ酸配列は、配列番号２に記載している。
次に、市販のアポフェリチンを用いる場合と同様の手順（第１の実施形態参照）によってＣｄＳ−Fer8アポフェリチン複合体を形成させる。これにより、ＣｄＳ−Fer8アポフェリチン複合体が高い収率で得られた。ただし、Fer8アポフェリチンを用いた場合、反応液のｐＨが４．０〜９．５の範囲でＣｄＳからなるコアを形成することができた。
図１５は、市販のアポフェリチン（C-Apoferritin)およびFer8アポフェリチンを用いた場合で、反応液の上清中に残存するタンパク質量を示す図である。本測定結果は、微粒子−アポフェリチン複合体を形成させた後に反応液を１２０００ｒｐｍで１０分間程度遠心分離し、得られた上清中のタンパク質を測定したものである。
その結果、図１５に示すように、Fer8アポフェリチンを用いた例では、市販のウマ脾臓由来アポフェリチンを用いた例に比べていずれのアンモニア濃度においても上清内に残存するタンパク質量が多くなっていた。これは、Fer8を用いた場合の方が市販のアポフェリチンを用いた場合に比べて反応液中でアポフェリチン同士が集合して沈殿する割合が低いことを意味する。従って、Fer8アポフェリチンを用いれば市販のアポフェリチンを用いる場合よりも高い収率でＣｄＳ−アポフェリチン複合体を得ることができると推察される。
次に、図１６は、反応液中のアンモニア濃度を７．５ｍＭ、３７．５ｍＭ、７５ｍＭとした場合のＣｄＳ−Fer8アポフェリチン複合体の蛍光スペクトルを示す図である。なお、図１６において「C-apoferritin」とあるのは市販のウマ脾臓由来のアポフェリチンのみの蛍光スペクトルを示し、「Fer8」とあるのはFer8アポフェリチンのみの蛍光スペクトルを示すものとする。図１６からは、ＣｄＳ−Fer8アポフェリチン複合体は、励起光を受けて５００〜６００ｎｍの付近に蛍光を発することが分かる。また、市販のアポフェリチンのみとFer8アポフェリチンのみを用いた場合の結果の比較から、Fer8アポフェリチンに由来する蛍光は市販のアポフェリチンに由来する蛍光に比べて強度が小さいことが分かる。従って、ＣｄＳ−Fer8アポフェリチン複合体においては、ＣｄＳに起因する蛍光がFer8アポフェリチンからの蛍光の影響をより受けにくくなっている。
さらに、図１７は、市販のアポフェリチンを用いた場合とFer8アポフェリチンを用いた場合とでアポフェリチン内にコアが形成される割合を比較した図である。なお、この試験においては、反応液中のＣｄ濃度を１ｍＭ、Ｓ２−濃度を１ｍＭとし、アンモニア濃度を７５ｍＭとした。
図１７から分かるように、Fer8アポフェリチンを用いた場合には、市販のアポフェリチンを用いた場合に比べてＣｄＳからなるコアがアポフェリチン内に形成する率が高くなっていた。従って、Fer8アポフェリチンを用いれば、ＣｄＳ−アポフェリチン複合体の収率を大幅に向上させることが可能になる。
また、Fer8アポフェリチンは、遺伝子組み換え技術によって大量供給が確保されているので、低コストでＣｄＳからなる微粒子を作製することが可能となる。
以上のように、Fer8アポフェリチンを用いれば、高い収率で安価にＣｄＳからなる微粒子を形成することができ、ＣｄＳによる蛍光がタンパク質部分の蛍光の影響を受けにくいＣｄＳ−アポフェリチン複合体を形成できる。従って、半導体装置などへの利用を図る上では本実施形態の方法を用いることがより好ましい。
なお、ここではＣｄＳからなる微粒子をFer8アポフェリチンに導入する方法について説明したが、第２の実施形態と同様の手順によってＺｎＳからなる微粒子をFer8アポフェリチンに導入することができる。
また、リステリアアポフェリチンについても、Ｎ末端の一部を除去することで、コア形成率を向上させることができる可能性がある。このようなリステリアアポフェリチンも大腸菌などを用いた遺伝子組み換え技術を用いて大量に作製することが可能である。
（第６の実施形態）
これ以降の実施形態では、化合物半導体−アポフェリチン（またはリステリアフェリチン）複合体の応用例について説明する。
−半導体装置の構成および機能−
図１８は、本発明の第６の実施形態に係る半導体装置を示す断面図である。同図に示す半導体装置は、化合物半導体からなる量子ドットを利用した不揮発性メモリセルである。
図１８に示すように、本実施形態の半導体装置１２０は、Ｓｉなどの第１導電型の半導体からなる半導体基板１０１と、半導体基板１０１上の活性領域を囲む素子分離用絶縁膜１０２と、半導体基板１０１の活性領域上に設けられたＳｉＯ２などからなるトンネル絶縁膜１０３と、トンネル絶縁膜１０３上に間隔を空けて配置された化合物半導体からなる微粒子１０４と、トンネル絶縁膜１０３上に設けられ、微粒子１０４を埋め込むＳｉＯ２などからなる絶縁膜１０５と、絶縁膜１０５上に設けられたＡｌなどの導電体からなるコントロールゲート（ゲート電極）１０６と、半導体基板１０１のうちコントロールゲート１０６の両側方に位置する領域に設けられ、第２導電型の不純物を含むソース領域１０７ａおよびドレイン領域１０７ｂ（不純物拡散層）と、基板の全面上に設けられた層間絶縁膜１０８と、層間絶縁膜１０８に形成されたコンタクトホール１０９と、コンタクトホール１０９を埋めるプラグを介してソース領域１０７ａおよびドレイン領域１０７ｂにそれぞれ接続されるＡｌ配線１１１ａ、１１１ｂとを備えている。トンネル絶縁膜１０３の厚みは例えば１．５ｎｍ以上４ｎｍ以下程度であり、絶縁膜１０５の厚みは例えば１７ｎｍ程度である。
また、微粒子１０４は直径が約７ｎｍの球状をしている。微粒子１０４の中心同士の間隔は約１２ｎｍで、トンネル絶縁膜１０３上に２次元状に配置されている。微粒子１０４の材料としては、ＣｄＳおよびＺｎＳが挙げられる。
なお、図１８に示す半導体装置の例では、ソース領域１０７ａおよびドレイン領域１０７ｂは高濃度のｎ型不純物を含み、半導体基板１０１はｐ型不純物を含んでいるものとする。
本実施形態の半導体装置においては、微粒子１０４に電荷が保持されているか否かによって二通りのドレイン電流−ゲート電圧特性を示すと考えられる。すなわち、本実施形態の半導体装置は、電子が微粒子１０４に注入された状態と、電子が微粒子１０４から引き抜かれた状態とでは、異なるドレイン電流−ゲート電圧特性を示すと考えられる。そのため、本実施形態の半導体装置を以下のように動作させることにより、不揮発性メモリセルとして機能させることができる。
まず、微粒子１０４に電子を注入する際には、コントロールゲート１０６に正電圧を印加する。これにより、トンネル絶縁膜１０３を介した直接トンネリングにより微粒子１０４に注入される。これに対し、微粒子１０４から電子を引き抜く際には、コントロールゲート１０６に負電圧を印加する。微粒子１０４に電子が注入された状態とされていない状態を「１」または「０」のいずれかの情報に対応させれば、上述のようにして情報の書き込みが行われる。情報を読み出す際には、所定のゲート電圧を印加した状態でのドレイン電流をセンスアンプ（図示せず）で読み出す。
なお、本実施形態の半導体装置において微粒子１０４の直径は約７ｎｍであるが、これ以下の直径を有する微粒子を用いてもよい。直径が７ｎｍより小さい微粒子は、第１の実施形態で説明したように、ＣｄＳ−アポフェリチン複合体の形成させる際に、反応液中のアンモニア濃度を変更することによって作製することができる。
−半導体装置の製造方法−
図１９（ａ）〜（ｆ）は、本実施形態の半導体装置の製造方法を説明するための断面図である。
まず、図１９（ａ）に示すように、第１〜第４の実施形態で説明した方法により、アポフェリチン１３２またはリステリアアポフェリチンなどのかご状タンパク質に金属イオンおよび硫化物イオン１３５を３回対称のチャネル１３０を介して導入し、ＣｄＳあるいはＺｎＳからなる微粒子を形成させる。
次に、図１９（ｂ）に示すように、１〜５×１０１６ｃｍ−３程度のｐ型不純物を含む半導体基板１０１上に熱酸化によって厚さ１．５ｎｍ以上４ｎｍ以下のＳｉＯ２膜１０３ａを形成後、ＬＯＣＯＳ法によって素子分離用絶縁膜１０２を形成する。素子分離用絶縁膜１０２はＳＴＩ（Shllow Trench Isolation）によって形成されてもよい。次に、基板を3-(2-aminoethyl amino)propyl-trimethoxy silane(APTMS)などのメトキシシラン化合物を用いて素子分離用絶縁膜１０２およびＳｉＯ２膜１０３ａの表面をアミノ基で修飾する。その後、素子分離用絶縁膜１０２およびＳｉＯ２膜１０３ａの上に先の工程で作製された、微粒子−アポフェリチン複合体１３７を２次元状に配置する。微粒子−アポフェリチン複合体１３７の基板への配置方法としては、例えば特開平１１−４５９９０号公報に記載された方法などが用いられる。
次に、図１９（ｃ）に示すように、オゾン存在下で基板に紫外線（ＵＶ）を１１０Ｗの強度で１０分間照射することによってアポフェリチン１３２（外殻部分）および3-(2-aminoethyl amino)propyl-trimethoxy silane（ＡＰＴＭＳ）分子を除去する。これにより、基板上に中心間隔が約１２ｎｍで２次元状に配置された直径約７ｎｍの微粒子１０４が残される。本工程ではオゾンを含む雰囲気中、波長がそれぞれ２５３．７ｎｍおよび１８４．９ｎｍのＵＶを１１０Ｗの強度で４０分間基板に照射する。本工程は、水分を除去するために１１５℃で行う。なお、アポフェリチン１３２等の有機物は、室温での酸素プラズマ処理や、窒素雰囲気下、４００℃での熱処理などによっても除去することができる。
続いて、図１９（ｄ）に示すように、素子分離用絶縁膜１０２およびＳｉＯ２膜１０３ａの上（基板全面上）にスパッタリングにより微粒子１０４を埋める厚さ１７ｎｍのＳｉＯ２膜１０５ａを形成する。本工程のスパッタリングは、例えばＳｉＯ２をターゲットとして用い、室温下、圧力が４．７〜５．３×１０−１Ｐａ、ＲＦ出力が２００Ｗ、アルゴン流量が１６ｓｃｃｍ（mL/min at 0℃、101.3kPa)、酸素流量が４ｓｃｃｍの条件で４分３０秒間行う。なお、ＳｉＯ２膜１０５ａの形成は、ＣＶＤ法により行ってもよい。
次に、図１９（ｅ）に示すように、基板上にＡｌ膜を堆積する。続いて、フォトレジストマスクＰｒ１を用いて、ＳｉＯ２膜１０３ａ、絶縁膜１０５およびＡｌ膜のパターニングを行なってトンネル絶縁膜１０３、電極間絶縁膜となる絶縁膜１０５およびＡｌからなるコントロールゲート１０６をそれぞれ形成する。その後、フォトレジストマスク及びコントロールゲート１０６をマスクとしてｎ型不純物イオンの注入を行なって、ソース領域１０７ａおよびドレイン領域１０７ｂを形成する。
その後、図１９（ｆ）に示す工程で、周知の方法により、層間絶縁膜１０８の形成と、層間絶縁膜１０８へのコンタクトホール１０９の開口と、コンタクトホール１０９内へのタングステンの埋め込みによるタングステンプラグ１１０の形成と、Ａｌ配線１１１ａ、１１１ｂの形成とを行なう。
以上の方法により、本実施形態の半導体装置を作製することができる。ここで示すように、第１〜第４の方法によって作製された化合物半導体−タンパク質複合体を用いて量子ドットの性質を利用した半導体記憶装置を実現することができる。
（第７の実施形態）
本発明の第７の実施形態として、本発明の化合物半導体−タンパク質複合体を蛍光標識として用いる方法について説明する。
−第１の方法−
図２０（ａ）〜（ｇ）は、本実施形態の第１の蛍光標識方法を説明するための図である。ここでは、化合物半導体−タンパク質複合体を用いて標的物質を蛍光標識する方法を説明する。
まず、図２０（ａ）に示すように、プラスミド中に先頭部分（５’側）にシステイン（図中では「Ｃｙｓ」と表記）をコードする配列を付加したアポフェリチンＤＮＡを組み込む。このプラスミドは発現ベクターである。
次に、図２０（ｂ）に示すように、作製されたプラスミドをホストである大腸菌に導入し、大腸菌の形質転換を行う。
次いで、図２０（ｃ）、（ｄ）に示すように、形質転換された大腸菌を培養し、菌体内で生産された変異アポフェリチン（Ｎ末端にＣｙｓが導入されたアポフェリチン）を抽出、精製する。その後、精製された変異アポフェリチン内に第１または第２の実施形態に係る方法を用いてＣｄＳあるいはＺｎＳからなる微粒子を形成させる。これにより、微粒子とＮ末端にＣｙｓが付加されたアポフェリチンとの複合体が形成できる。
一方で、図２０（ｅ）に示すように、標識したい物質（例えば図中のタンパク質Ａ）の表面に露出しているアミノ酸残基をＣｙｓに置換する。あるいは、標識したいタンパク質の表面露出部にＣｙｓあるいはＳＨ基を置換または付加する。なお、標的物質はタンパク質に限らずＳＨ基を導入できるものであれば何でもよい。例えば、ＤＮＡやポリマー等の高分子化合物などを標的物質とすることもできる。
次に、図２０（ｆ）に示すように、タンパク質Ａを含む溶液と微粒子−変異アポフェリチン複合体を含む溶液とを混合する。これにより、タンパク質ＡのＣｙｓと微粒子−変異アポフェリチン複合体のＣｙｓとがＳ−Ｓ結合（ジスルフィド結合）を形成し、タンパク質Ａと微粒子−変異アポフェリチン複合体とが結合される。微粒子−変異アポフェリチン複合体中の微粒子は例えば波長３５０ｎｍの励起光に対して蛍光を発するので、この蛍光を用いてタンパク質Ａを検出することができるようになる。以上のようにして、目的のタンパク質を蛍光標識することができる。標的物質がタンパク質以外の物質である場合には、標的物質に付加されたＳＨ基と微粒子−変異アポフェリチン複合体のＣｙｓとでＳ−Ｓ結合を形成させればよい。なお、図２０（ｇ）に示すように、このＳ−Ｓ結合は、還元剤の添加によって容易に切断することができる。
この方法によれば、任意のタンパク質を蛍光標識することができる上、微粒子の直径が異なる微粒子−変異アポフェリチン複合体を用いることで、標識されたタンパク質の蛍光波長を変えることもできる。このように、本発明の化合物半導体−タンパク質複合体は、生体物質等のマーカーとして利用することができる。
なお、以上で説明した方法以外にも、本発明の化合物半導体−タンパク質複合体は、アビジン−ビオチン結合や抗原抗体反応を用いた蛍光標識方法に利用することができる。
また、本実施形態の方法では、アポフェリチンに代えてリステリアアポフェリチンを用いることもできる。
また、上述のように、タンパク質だけでなくＤＮＡ、抗原、ウイルス、ポリマーなどの高分子化合物など、ＳＨ基を保持しているもの、あるいはＳＨ基で修飾可能なものであれば蛍光標識することができる。
−第２の方法−
図２１（ａ）、（ｂ）は、本実施形態の第２の蛍光標識方法を説明するための図である。
まず、図２１（ａ）に示すように、第１および第２の実施形態に係る方法によって微粒子−アポフェリチン複合体を作製する。そして、微粒子−アポフェリチン複合体を含む溶液と標識したい対象物（抗体、抗原を含むタンパク質、細胞などの標的生体物質）を含む溶液とを混合する。次いで、ＤＥＣ（1-(3-(Dimethyl amino)propyl)-3-ethylcarbodiimide)などのカップリング剤を反応液に添加すると、アポフェリチン外表面に存在するカルボキシル基と標識対象物のアミノ基末端とが縮合反応を起こし、図２１（ｂ）に示すように、アミド結合が形成される。これにより、微粒子−アポフェリチン複合体が結合された標識対象物を作製することができる。微粒子−アポフェリチン複合体中の微粒子は、例えば波長３５０ｎｍの励起光に対して蛍光を発するので、標識対象物を容易に観察することができるようになる。
なお、アポフェリチン溶液に標識したい対象物とカップリング剤を加えてアポフェリチンと標識対象物とを結合させた後で、アポフェリチン内に微粒子を形成させてもよい。
なお、本方法において、標的物質としてはタンパク質や細胞などの他、ＤＮＡ、ポリマー、カーボンナノホーンなど、アミノ基を保持しているもの、または化学的にアミノ基を修飾可能な物質を用いることができる。
（第８の実施形態）
本発明の第８の実施形態として、基板に対して蛍光標識を行う方法について説明する。
チタン（Ｔｉ）などを認識して結合するＴｉ認識ペプチドが、文献等により発表されている（Kenichi Sanoら,Small,No.8-9,p826-832(2005)）。このＴｉ認識ペプチドはArg-Lys-Leu-Pro-Asp-Alaの６残基のアミノ酸からなり、Ｔｉ、Ｓｉなどに結合する性質がある。本実施形態の蛍光標識方法では、Ｔｉ認識ペプチドを用いて微粒子−アポフェリチン複合体を基板の所望の位置に配置させる。以下にその手順を説明する。
図２２（ａ）〜（ｃ）は、本発明の第８の実施形態に係る基板に対する蛍光標識方法の概略を示す図である。
まず、図２２（ａ）に示すように、アポフェリチンの外表面上にＴｉ認識ペプチド１５０を付加する。Ｔｉ認識ペプチド１５０はカップリング剤などを用いてアポフェリチンの外表面上に結合されてもよいが、遺伝子組み換え技術を用いてアポフェリチンのＮ末端にＴｉ認識ペプチド１５０を導入する方が、生産性の面から見て好ましい。具体的には、アポフェリチンをコードするＤＮＡの上流（５’側）にＴｉ認識ペプチド１５０をコードするＤＮＡを加えたものを発現ベクターに入れ、これを大腸菌などに導入する。この大腸菌内ではＴｉ認識ペプチド１５０がＮ末端側に付加されたリコンビナントアポフェリチンが大量に生産される。次に、リコンビナントアポフェリチンを菌体内から抽出し、精製する。リコンビナントアポフェリチンはモノマーサブユニットが集合した形で精製することが可能である。モノマーサブユニットのＮ末端はアポフェリチンの外表面上に突出しているため、Ｎ末端側に付加されたＴｉ認識ペプチドもリコンビナントアポフェリチンの外表面上に突出している。なお、配列番号３には、リコンビナントアポフェリチンのモノマーサブユニットのアミノ酸配列を示している。
次に、図２２（ｂ）に示すように、ＣｄＳまたはＺｎＳからなる微粒子をリコンビナントアポフェリチン内に形成させる。本工程は、第１および第２の実施形態と同一の方法によって行われる。
次いで、図２２（ｃ）に示すように、微粒子−リコンビナントアポフェリチン複合体を基板上に配置する。ここで、基板のうち微粒子−リコンビナントアポフェリチン複合体を配置させたい領域上には事前にＴｉ膜を形成しておく。この基板を微粒子−リコンビナントアポフェリチン複合体を含む水溶液中に置けば、微粒子−リコンビナントアポフェリチン複合体が、基板のＴｉ膜が形成された部分にのみ結合する。ＣｄＳまたはＺｎＳは紫外光などによって励起すると蛍光を発するので、図２２（ｃ）に示すように、基板のうち微粒子−リコンビナントアポフェリチン複合体が配置された部分のみに蛍光が見られる。
このように、本実施形態の方法によれば、基板上にＴｉ膜のパターン通りに微粒子−リコンビナントアポフェリチン複合体を配置することができるので、種々の蛍光模様を基板上に描くことができる。
また、基板の異なる領域に異なる粒径の微粒子を有する微粒子−リコンビナントアポフェリチン複合体を配置することで、領域ごとに異なる蛍光を生じさせることも可能となる。また、青色を発するＺｎＳ−リコンビナントアポフェリチン複合体と赤色を発するＣｄＳ−リコンビナントアポフェリチン複合体とをそれぞれ基板の異なる領域上に配置し、ナノ蛍光パターンやナノ蛍光文字を作成することもできる。あるいは、基板の任意の位置に化合物半導体からなる微粒子を配置させることができるので、従来よりもより複雑な半導体デバイスや光デバイスを作製することが可能となる。
なお、ここではウマ肝臓由来のアポフェリチンのＮ末端にＴｉ認識ペプチドを付加したものを用いる例を示したが、他の臓器由来のアポフェリチンや他の生物由来のアポフェリチンのＮ末端にＴｉ認識ペプチドを付加したものを用いても基板上の任意の領域に配置することができる。
また、リステリアフェリチンのＮ末端側にＴｉ認識ペプチドを付加してもアポフェリチンの場合と同様の効果を得ることができる。
（第９の実施形態）
図２３は、本発明の第９の実施形態に係る化合物半導体−アポフェリチン複合体の作成方法を示すフローチャートである。本実施形態では、ＣｄＳからなる微粒子をアポフェリチン内に形成させる方法を説明する。
まず、図２３に示すステップＳ５１では、第１の実施形態に係る方法でＣｄＳ−アポフェリチン複合体を形成させた後、カラムなどを用いてＣｄＳ−アポフェリチン複合体を精製する。
次に、ステップＳ５２では、再度図２（ｂ）に示す組成の反応液中に精製されたＣｄＳ−アポフェリチン複合体を加える。ここで、ＣｄＳ−アポフェリチン複合体はアポフェリチンの代わりに用い、その濃度はアポフェリチン濃度と同じ０．３ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬであることが好ましい。その後、ステップＳ５３では、反応液を室温で１２時間以上放置する。
次に、ステップＳ５４では、最終濃度が１ｍＭとなるように反応液に酢酸カドミウムを添加し、ステップＳ５５ではこの反応液を室温で１０分間放置する。
次いで、ステップＳ５６では、チオ酢酸を最終濃度が１ｍＭとなるように反応液に加える。その後、ステップＳ５７では、反応液を室温で１２時間以上放置する。
次に、ステップＳ５８では、ステップＳ５４からステップＳ５７までのステップを繰り返す。
以上の方法により、アポフェリチン内の微粒子をさらに成長させることができる。
図２４（ａ）は、本実施形態の方法において７．５ｍＭアンモニア水を用いて作製されたＣｄＳ微粒子の直径を示す図であり、（ｂ）は、第１の実施形態の方法で形成させたＣｄＳ−アポフェリチン複合体のＴＥＭ写真であり、（ｃ）は、本実施形態の方法で形成させたＣｄＳ−アポフェリチン複合体のＴＥＭ写真である。
図２４（ａ）に示す「条件１」は、第１の実施形態に係る方法により形成された微粒子を表しており、「条件２」は、１ｍＭのカドミウムと１ｍＭのチオ酢酸をＣｄＳ−アポフェリチン複合体の精製後に１回添加することにより形成された微粒子を表しており、「条件３」は、１ｍＭのカドミウムと１ｍＭのチオ酢酸をＣｄＳ−アポフェリチン複合体の精製後に２回添加することにより形成された微粒子を表しており、「条件４」は、１ｍＭのカドミウムと１ｍＭのチオ酢酸をＣｄＳ−アポフェリチン複合体の精製後に３回添加することにより形成された微粒子を表している。
これらの結果から、一度ＣｄＳ−アポフェリチン複合体を形成させた後にカドミウムとチオ酢酸とを交互に添加することで、アポフェリチン内に形成されるＣｄＳ微粒子のサイズを大きくすることができることが分かる。カドミウムとチオ酢酸をＣｄＳ−アポフェリチン複合体の精製後に３回添加した場合にはＣｄＳ微粒子の直径がほぼ７ｎｍとなっており、ＣｄＳ微粒子の直径がほぼアポフェリチン内の空洞のサイズと等しくなっていることが分かる。また、本実施形態の方法によれば、カドミウムとチオ酢酸の添加を繰り返すことで、ＣｄＳ微粒子の直径のバラツキを小さくすることも可能である。
なお、本実施形態の方法において、ステップＳ５５で反応液の放置時間は１０分に限られない。また、ステップＳ５４で添加される酢酸カドミウムの濃度は１ｍＭに限られず、ステップＳ５６で添加されるチオ酢酸の濃度も１ｍＭに限られない。
また、上述の反応を０〜１５℃で行ってもよい。
また、本実施形態と同様の方法を用いてＺｎＳ−アポフェリチン複合体やＣｄＳ−リステリアアポフェリチン複合体、ＺｎＳ−リステリアアポフェリチン複合体を形成することもできる。
例えば、ＺｎＳ−アポフェリチン複合体を形成する際には、第２の実施形態の方法でＺｎＳ−アポフェリチン複合体を形成させた後にこれを精製し、ＺｎＳ−アポフェリチン複合体を反応液に加える。その後、１ｍＭの酢酸亜鉛、１ｍＭのチオ酢酸を順次反応液に加える。以後、酢酸亜鉛とチオ酢酸を交互に添加していくことで、ＺｎＳ微粒子を成長させることができる。また、ＣｄＳ−リステリアアポフェリチン複合体やＺｎＳ−リステリアアポフェリチン複合体を作製する際には、上述の方法において、アポフェリチンとリステリアアポフェリチンを置き換えればよい。
以上の方法により、高いレベルで均一なサイズの化合物半導体からなる微粒子を形成することができる。
なお、第１の実施形態以外の方法で作製したＣｄＳ−アポフェリチン複合体を用いてステップＳ５１〜ステップＳ５８を行ってもよい。
以上説明したように、本発明の方法により作製された化合物半導体−タンパク質複合体は、量子ドットを利用した半導体装置や生体物質の蛍光標識などの種々の用途に用いることができる。

Claims (12)

  1. 水溶液中で金属のアンモニウム錯体を形成させる工程（ａ）と、
    内部に空洞が形成されたタンパク質の溶液とチオ酢酸とを前記水溶液中で混合して、前記タンパク質の前記空洞内に前記金属の硫化物からなる微粒子を形成させる工程（ｂ）とを備え、
    前記タンパク質はアポフェリチン、リステリアアポフェリチンまたはこれらの組み換え体であり、
    前記金属は、ＣｄまたはＺｎであることを特徴とする微粒子−タンパク質複合体の作製方法。
  2. 前記工程（ａ）では、酢酸イオンとアンモニウムイオンとを含む溶液と、前記金属の酢酸塩溶液と、アンモニア水とを混合することを特徴とする請求項１に記載の微粒子−タンパク質複合体の作製方法。
  3. 前記工程（ｂ）では、前記水溶液中のアンモニア濃度によって直径の異なる微粒子が形成されることを特徴とする請求項１または２に記載の微粒子−タンパク質複合体の作製方法。
  4. 前記工程（ａ）および前記工程（ｂ）は、共に０℃以上１５℃以下で行うことを特徴とする請求項１〜３のうちいずれか１つに記載の微粒子−タンパク質複合体の作製方法。
  5. 前記工程（ｂ）で形成された前記微粒子と前記タンパク質との複合体を精製する工程（ｃ）と、
    前記工程（ｃ）で精製された前記微粒子と前記タンパク質との複合体を含む溶液と前記金属を含む溶液とを混合する工程（ｄ）と、
    前記工程（ｄ）で作製された混合液にチオ酢酸を加え、前記タンパク質内に形成された前記微粒子を成長させる工程（ｅ）と、
    前記工程（ｅ）の後、前記混合液に前記金属を含む溶液と前記チオ酢酸とを交互に加える工程を繰り返して前記微粒子を成長させる工程（ｆ）とをさらに備えていることを特徴とする請求項１〜４のうちいずれか１つに記載の微粒子−タンパク質複合体の作製方法。
  6. 内部に空洞が形成されたタンパク質と、前記空洞内に形成された金属の硫化物からなる微粒子との複合体を含む溶液を作製する工程（ａ）と、
    前記微粒子と前記タンパク質との複合体を含む溶液に前記金属を含む溶液を加える工程（ｂ）と、
    前記工程（ｂ）の後に、前記微粒子と前記タンパク質との複合体を含む溶液にチオ酢酸を加えて前記微粒子を成長させる工程（ｃ）と、
    前記工程（ｂ）と前記工程（ｃ）とを繰り返して前記微粒子を成長させる工程（ｄ）とを備え、
    内部に空洞を有する前記タンパク質はアポフェリチン、リステリアアポフェリチンまたはこれらの組み換え体であり、
    前記金属はＣｄまたはＺｎであることを特徴とする微粒子−タンパク質複合体の作製方法。
  7. 水溶液中でＣｄまたはＺｎのアンモニウム錯体を形成させる工程（ａ）と、
    内部に空洞が形成されたタンパク質の溶液とチオ酢酸とを前記水溶液中で混合して、前記空洞内にＣｄＳまたはＺｎＳを含み、励起された場合に蛍光を発する微粒子を形成させ、微粒子−タンパク質複合体を作製する工程（ｂ）と、
    前記微粒子−タンパク質複合体を標的物質に結合させて前記標的物質を標識する工程（ｃ）とを備え、
    内部に空洞を有する前記タンパク質はアポフェリチン、リステリアアポフェリチンまたはこれらの組み換え体であることを特徴とする蛍光標識方法。
  8. 前記工程（ｃ）の前に、Ｎ末端にシステインを付加した第１の変異アポフェリチンまたは第１の変異リステリアアポフェリチンを作製する工程（ｄ）と、
    前記工程（ｃ）の前に、前記標的物質をＳＨ基を有する化合物で修飾する工程（ｅ）とをさらに備え、
    前記工程（ｃ）では、前記第１の変異アポフェリチンまたは前記第１の変異リステリアアポフェリチンと前記標的物質とをジスルフィド結合によって結合させることを特徴とする請求項７に記載の蛍光標識方法。
  9. 前記標的物質は外表面にアミノ基を有しており、
    前記工程（ｃ）では、カップリング剤を用いて前記標的物質の外表面に位置するアミノ基と前記アポフェリチンまたは前記リステリアアポフェリチンの外表面に位置するカルボキシル基とを縮合反応させてアミド結合を形成させることを特徴とする請求項７に記載の蛍光標識方法。
  10. 前記タンパク質は、Ｎ末端にＴｉ認識ペプチドが付加された第２の変異アポフェリチンであり、
    前記標的物質は表面の一部にＴｉ膜を有する基板であることを特徴とする請求項７に記載の蛍光標識方法。
  11. 前記工程（ａ）の前に、遺伝子組み換え技術を用いて前記第２の変異アポフェリチンを作製する工程をさらに備えていることを特徴とする請求項１０に記載の蛍光標識方法。
  12. 水溶液中でＣｄまたはＺｎのアンモニウム錯体を形成させる工程（ａ）と、
    内部に空洞を有するタンパク質を標的物質に結合させる工程（ｂ）と、
    内部に空洞が形成されたタンパク質の溶液とチオ酢酸とを前記水溶液中で混合して、前記タンパク質内にＣｄＳまたはＺｎＳを含み、励起された場合に蛍光を発する微粒子を形成させ、微粒子−タンパク質複合体を作製する工程（ｃ）とを備え、
    内部に空洞を有する前記タンパク質はアポフェリチン、リステリアアポフェリチンまたはこれらの組み換え体であることを特徴とする蛍光標識方法。
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