JP3703479B2 - ナノ粒子の製造方法及び該製造方法によって製造されたナノ粒子 - Google Patents
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Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の空洞部を利用したナノ粒子の製造方法、該製造方法によって製造されたナノ粒子及び該製造方法の製造工程で生成されたナノ粒子−タンパク質複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでの機能材料開発の主流は、所望の機能を発現させる新規化合物の探索、合成によって行われている。しかしながら、近年は、物質をナノメートルサイズまでに微細化したナノ粒子を作製することで、バルク状態では得られない新機能を発現させることが望まれるようになっている。特に、近年注目されている量子効果デバイスを作製するために、半導体や金属化合物を中心とする無機材料のナノ粒子を作製することが強く望まれている。
【０００３】
従来、ナノ粒子を作製する方法は、物理的粉砕法および化学的合成法などによって行われている。例えば、物理的粉砕法は、セラミックスを焼成する際の出発材料を得るために広く用いられている。また、化学的合成法としては、長鎖の有機化合物の間で、塩化金酸を還元することによって金のナノ粒子を作製する方法などがある。ここで、長鎖の有機化合物は、金粒子が成長して巨大化することを阻害している。
【０００４】
また、有機化合物とナノ粒子との複合体を作り、化学反応させて均一な粒子を作る方法もある。この応用としては、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ膜）を形成するための材料に金原子を固定し、上記材料を金原子を中心にして集合させることによって、表面にＳＡＭ膜が形成された金のナノ粒子を得る方法もある。さらに、ナノ粒子を形成する材料を含むミセルをつくり、ミセル中での化学反応を用いてナノ粒子を作製することも行われている。
【０００５】
量子効果デバイスを作製するためには、直径が同一のナノ粒子を得ることが不可欠である。ナノ粒子において電子がとり得るエネルギーレベルは、数ナノメートルのオーダーでは、直径に依存して大きく変化する。このため、量子効果を持つナノ粒子を電子回路に応用するためには、直径が一定であることが重要になる。
【０００６】
しかし、上述の従来の方法では直径が均一なナノ粒子を得ることは難しい。例えば、物理的粉砕法では、そもそも直径をミクロンサイズよりも小さくすることが困難であり、ナノメートルオーダーに近づいたとしても直径を一定にするメカニズムがない。このため、得られるナノ粒子の直径には必然的に大きなバラツキが生じる。また、化学的合成法では、化学反応を利用しているため、これもまた得られるナノ粒子の直径には必然的に大きなバラツキが生じる。また、所要時間、コストの面でも非常に不利である。
【０００７】
一方、バイオテクノロジーを他分野に応用する試みの１つとして、金属化合物を保持する機能を有するタンパク質であるアポフェリチンに金属または金属化合物を取り込ませ、ナノオーダーの均一なサイズのナノ粒子を作製しようという研究がある。ナノ粒子の用途に応じて種々の金属あるいは金属化合物等をアポフェリチンに導入すべく研究が進められている。
【０００８】
ここで、アポフェリチンについて説明する。アポフェリチンは、生物界に広く存在するタンパク質であり、生体内では必須微量元素である鉄の量を調節する役割を担っている。鉄または鉄化合物とアポフェリチンとの複合体はフェリチンと呼ばれる。鉄は必要以上に体内に存在すると生体にとって有害であるため、余剰の鉄分はフェリチンの形で体内に貯蔵される。そして、フェリチンは必要に応じて鉄イオンを放出し、アポフェリチンに戻る。
【０００９】
図１は、アポフェリチンの構造を示す模式図である。図１に示すように、アポフェリチン１は、１本のポリペプチド鎖から形成されるモノマーサブユニットが非共有結合により２４個集合した分子量約４６万の球状タンパク質であり、その直径は約１２ｎｍで、通常のタンパク質に比べ高い熱安定性と高いｐＨ安定性を示す。アポフェリチン１の中心には直径約６ｎｍの空洞状の保持部４があり，外部と保持部４とはチャネル３を介してつながっている。例えば、アポフェリチン１に２価の鉄イオンが取り込まれる際、鉄イオンはチャネル３から入り、一部のサブユニット内にあるｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｓｅ ｃｅｎｔｅｒ（鉄酸化活性中心）と呼ばれる場所で酸化された後、保持部４に到達し、保持部４の内表面の負電荷領域で濃縮される。そして、鉄原子は３０００〜４０００個集合し、フェリハイドライト（５Ｆｅ２Ｏ３・９Ｈ２Ｏ）結晶の形で保持部４に保持される。保持部４に保持された金属原子を含むナノ粒子の直径は、保持部４の直径とほぼ等しく、約６ｎｍとなっている。
【００１０】
このアポフェリチンを用いて、人工的に鉄以外の金属や金属化合物を担持させたナノ粒子−アポフェリチン複合体が作製されている。
【００１１】
現在までに、マンガン（非特許文献１および非特許文献２を参照）、ウラン（非特許文献３を参照）、ベリリウム（非特許文献４を参照）、アルミニウム（非特許文献５を参照）、および亜鉛（非特許文献６を参照）といった金属あるいは金属化合物のアポフェリチンへの導入が報告されている。これらの金属あるいは金属化合物からなるナノ粒子の直径も、アポフェリチンの保持部４の直径とほぼ等しく、約６ｎｍとなる。
【００１２】
自然界において、鉄原子を含むナノ粒子がアポフェリチン内に形成される過程の概略は次の通りである。
【００１３】
アポフェリチン１の外部と内部とを結ぶチャネル３（図１参照）の表面には、ｐＨ７〜８の条件下でマイナス電荷を持つアミノ酸が露出しており、プラス電荷を持っている鉄（II）イオンは静電相互作用によりチャネル３に取り込まれる。 アポフェリチン１の保持部４の内表面には、チャネル３の内表面と同じく，ｐＨ７〜８でマイナス電荷を持つアミノ酸残基であるグルタミン酸残基が多く露出しており、チャネル３から取り込まれた鉄（II）イオンはｆｅｒｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｅｎｔｅｒで酸化され、内部の保持部４へと導かれる。そして、静電相互作用により鉄イオンは濃縮されて、フェリハイドライト（５Ｆｅ２Ｏ３・９Ｈ２Ｏ）結晶の核形成が起こる。
【００１４】
その後、順次取り込まれる鉄イオンがこの結晶の核に付着して酸化鉄からなる核が成長し、直径６ｎｍのナノ粒子が保持部４内に形成される。以上が、鉄イオンの取り込みと酸化鉄からなるナノ粒子形成の概略である。
【００１５】
なお、ここまで鉄イオンのアポフェリチンへの取り込みメカニズムについて述べたが、これまでに導入が報告されている他の金属イオンについては、鉄イオンとほぼ同じメカニズムで進むと考えられる。しかしながら、上述の方法によって空洞部内に取り込むことができる金属イオンは特定のものに限定されていた。
【非特許文献１】
P.Mackle、1993年、J. Amer. Chem. Soc. 115、8471-8472ページ
【非特許文献２】
F.C.Meldrumら、1995年、J. Inorg. Biochem. 58、59-68ページ
【非特許文献３】
J.F.Hainfeld、1992年、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89、11064-11068ページ
【非特許文献４】
D.J.Price、1983年、J. Biol. Chem. 258、10873-10880ページ
【非特許文献５】
J.Fleming、1987年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、84、7866-7870ページ
【非特許文献６】
D.PriceおよびJ.G.Joshi、1982年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、79、3116-3119ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、タンパク質の空洞部を利用したナノ粒子の製造方法であって、これまでタンパク質の空洞部内でのナノ粒子の形成が報告されていなかったニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、クロムイオン（Ｃｒ２＋）、銅イオン（Ｃｕ２＋）等の金属イオンからなる粒子径が均一なナノ粒子をも得ることができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、内部に空洞部を有するタンパク質、金属イオン、炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンを含む溶液中で、該タンパク質の空洞部内に該金属イオンの化合物からなるナノ粒子を形成させる工程を含む、ナノ粒子の製造方法である。
【００１８】
前記化合物としては、例えば水酸化物が挙げられる。
【００１９】
前記金属イオンは、好ましくはニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、クロムイオン（Ｃｒ２＋）または銅イオン（Ｃｕ２＋）のいずれかである。
【００２０】
前記溶液のｐＨは、好ましくは前記金属イオンの水酸化物の沈殿点とほぼ同じである。
【００２１】
前記金属イオンとして、ニッケルイオンを用いた場合、前記溶液のｐＨは、好ましくは８以上９以下である。
【００２２】
また、前記金属イオンとして、ニッケルイオンを用いた場合、前記溶液は、好ましくは、さらにアンモニウムイオンを含むものとし、この場合、前記溶液のｐＨは、好ましくは８．３を越えて８．６５以下とする。
【００２３】
例えば、前記タンパク質は、アポフェリチン、Ｄｐｓタンパク質、ＣＣＭＶタンパク質、ＴＭＶタンパク質またはヒートショックプロテインの少なくとも一つである。
【００２４】
例えば、前記溶液は、それに二酸化炭素を通気することによって生成した炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンを含むものである。
【００２５】
前記ナノ粒子を形成した後、タンパク質を熱処理によって除去する工程をさらに含むものであってもよい。
【００２６】
また、本発明は、金属イオンの化合物からなるナノ粒子であって、内部に空洞部を有するタンパク質、該金属イオン、炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンを含む溶液中で、該タンパク質の空洞部内に形成されたナノ粒子である。
【００２７】
また、本発明は、内部に空洞部を有するタンパク質と、該タンパク質の空洞部内に形成されたナノ粒子とからなる複合体であって、前記ナノ粒子は、金属イオンの化合物からなるナノ粒子であって、該タンパク質、該金属イオン、炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンを含む溶液中で、該タンパク質の空洞部内に形成されたナノ粒子である、複合体である。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によると、均一な粒子径を有するナノ粒子を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。
【００３０】
（実施形態１）
図１および図２を参照しながら本実施形態のナノ粒子の作製方法を説明する。
【００３１】
図２は、本実施形態のニッケル化合物のナノ粒子を内包したタンパク質からなる複合体（以下、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体ともいう）の作製方法を表すフローチャートである。
【００３２】
まず、図２に示すように、ステップＳｔ１では、ＨＥＰＥＳとＣＡＰＳＯとの混合溶液からなる緩衝液、アポフェリチン溶液、ニッケル塩溶液、ミリＱ水、二酸化炭素を用意する。このとき、緩衝液、アポフェリチン溶液、ニッケル塩溶液およびミリＱ水は、脱気したものを用意する。
【００３３】
次に、ステップＳｔ２では、脱気したミリＱ水に二酸化炭素を通気（バブリング）することによって、二酸化炭素バブリング水を調製する。
【００３４】
次に、ステップＳｔ３では、上記ステップＳｔ２で得られた二酸化炭素バブリング水に、緩衝液、アポフェリチン溶液およびニッケル塩溶液を添加し、反応溶液を調製する。この後、反応溶液を２４時間放置する。
【００３５】
なお、以上に説明したニッケル化合物−アポフェリチン複合体を作製するための操作は、すべて室温、もしくはアポフェリチンが変性しない温度範囲にて、スターラーで攪拌しながら行なう。
【００３６】
上記の操作によって、アポフェリチン１の保持部４にニッケルイオン（Ｎｉ２＋）の化合物が導入され、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体が形成される。
【００３７】
アポフェリチンを含めて、タンパク質はＤＮＡ情報から作製され、公知の方法で多数複製することは容易である。また、同じＤＮＡから多数複製されたタンパク質が、オングストロームの精度で同じ構造であることは周知である。このため、本実施形態で用いるアポフェリチンが有する空洞状の保持部４は、全て同じ大きさと形状を有する。
【００３８】
従って、本実施形態のように、タンパク質内にナノ粒子を作製すれば、ナノ粒子の直径がタンパク質により規定されるので、粒径が均一なナノ粒子が得られる。例えば、本実施形態では、ナノ粒子の直径は、アポフェリチンの保持部の直径とほぼ同じ６ｎｍになる。
【００３９】
本実施形態ではタンパク質としてアポフェリチンを用いたが、空洞部を有するタンパク質であれば、単一のサブユニットから構成されているタンパク質であっても、複数のサブユニットから構成されているタンパク質であってもアポフェリチンの代わりに用いることができる。また、タンパク質は、その空洞部の形状が球状のものに限定されることはなく、ロッド状、リング状等の空洞部を有するものであっても良い。例えば、Ｄｐｓタンパク質、ウイルスタンパク質、ヒートショックプロテインを用いることができる。Ｄｐｓタンパク質（直径９ｎｍであり、内部に直径４ｎｍの保持部を有する球殻状タンパク質）を用いれば、直径が４ｎｍのナノ粒子を作製することができる。ウイルスタンパク質としては、例えば、ＣＰＭＶ、ＣＣＭＶ、ＨＳＶ、Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ、Ｒｅｏｖｉｒｕｓ、ＬＡ−１、Ｐｏｌｙｏｍａ、ＣａＭＶ、ＨＰＶ、Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ、ＳｐＶ−４、φＸ１７４、ＦＨＶ、ＨＲＶ−１４、Ｐｏｌｉｏ等のウイルスのタンパク質が挙げられる。好ましくは、ＣＰＭＶ、ＣＣＭＶのウイルスタンパク質を用いることができる。本実施形態の方法によると、使用するタンパク質の空洞部の形状、大きさに応じたナノ粒子が形成されることになる。本明細書におけるナノ粒子とは、長径５０ｎｍ以下であって、粒子として安定に存在する大きさ以上の粒子をいう。一例を挙げるのであれば、長径１ｎｍ以上５０ｎｍ以下の粒子がナノ粒子に該当する。
【００４０】
また、本実施形態では、ニッケル化合物からなるナノ粒子を作製する場合について説明したが、クロム、銅の金属原子を含む化合物からなるナノ粒子を作製する場合にも本実施形態の方法を適用することができる。尚、本実施形態の方法により形成されたナノ粒子を構成する金属化合物は、添加する金属イオン等によって異なるが、例えば、水酸化物及び／又は酸化物である。
【００４１】
クロム化合物からなるナノ粒子を作製する場合、本実施形態で用いたニッケル塩溶液の代わりに、クロム塩溶液を反応溶液中に混合する。他の条件は、本実施形態に述べた通りである。銅化合物からなるナノ粒子を作製する場合、本実施形態で用いたニッケル塩溶液の代わりに、銅塩溶液を反応溶液中に混合する。他の条件は、本実施形態に述べた通りである。
【００４２】
本実施形態のナノ粒子の形成には、反応溶液中に炭素水素イオン（ＨＣＯ３−）及び／又は炭酸イオン（ＣＯ３ ２−）が存在することが重要である。従って、本実施形態のステップＳｔ２では、脱気したミリＱ水に二酸化炭素を通気（バブリング）しているが、これに限られず、炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）及び／又は炭酸イオン（ＣＯ３ ２−）が反応溶液中に添加される方法を用いればよい。例えば、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）等の炭酸塩を、ミリＱ水に溶解して用いてもよい。
【００４３】
本実施形態では、緩衝液としてＨＥＰＥＳとＣＡＰＳＯとの混合溶液を用いている。しかし、これに限定されず、ｐＨを調節するための手段は何であってもよい。例えば、１種類の緩衝剤を含む緩衝液を用いてもよく、複数種の緩衝剤の混合溶液を緩衝液として用いてもよい。特に、複数種の緩衝剤の混合溶液を緩衝液として用いる方が、１種類の緩衝剤を含む緩衝液を用いるよりも、反応溶液のｐＨの調節が容易になる。従って、複数の緩衝剤の混合溶液を緩衝液として用いることが好ましい。
【００４４】
ニッケル塩溶液は、本実施形態では硫酸ニッケルアンモニウム（ＮｉＮＨ３（ＳＯ４））を用いている。しかし、これに限定されない。例えば、硫酸ニッケル（Ｎｉ（ＳＯ４））、硝酸ニッケル（Ｎｉ（ＮＯ３）２）、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ２）を用いてもよい。本実施形態では、反応溶液中にアンモニウムイオン（ＮＨ４ ＋）が含まれている方が、反応収率の点からは望ましい。金属塩溶液として、金属塩アンモニウム溶液を用いた場合、他の成分を反応溶液に添加することなく、反応溶液はアンモニウムイオンを含有することになる。
【００４５】
本実施形態では、反応溶液調製後の放置時間を２４時間としたが、かかる時間に限定されず、各反応溶液の組成、ｐＨ等に応じた最適時間を選択することが望ましい。
【００４６】
本実施形態に示したナノ粒子の製造方法について、より具体的な反応溶液の条件等は、実施例の欄で後述する。
【００４７】
（実施形態２）
本実施形態では、上記実施形態１において作製されたニッケル化合物−アポフェリチン複合体を利用して作製されるナノ粒子からなるドット体をフローティングゲートとして含む不揮発性メモリセルについて説明する。
【００４８】
図３（ａ）〜（ｄ）は、本実施形態の不揮発性メモリセルの製造方法を示す工程断面図である。
【００４９】
まず、図３（ａ）に示す工程で、ｐ型Ｓｉ基板１０１上に、ＬＯＣＯＳ法により、活性領域を取り囲む素子分離酸化膜１０２を形成した後、基板上にトンネル絶縁膜として機能するゲート酸化膜１０３を熱酸化法によって形成する。その後、６ｎｍ程度の直径を有するニッケルのナノ粒子からなるドット体１０４を基板上に形成する。なお、ドット体１０４を基板上に形成する方法については、後述する。
【００５０】
次に、図３（ｂ）に示す工程で、基板上に、スパッタ法またはＣＶＤ法により、ドット体１０４を埋めるＳｉＯ２膜を堆積する。
【００５１】
次に、図３（ｃ）に示す工程で、基板上にＡｌ膜を堆積する。続いて、フォトレジストマスクＰｒ１を用いて、ＳｉＯ２膜およびＡｌ膜のパターニングを行なって電極間絶縁膜となるシリコン酸化膜１０５及び制御ゲート電極となるＡｌ電極１０６を形成する。このとき、ゲート酸化膜１０３のうちフォトレジストマスクＰｒ１で覆われていない部分は除去されるので、その上のドット体１０４も同時に除去される。その後、フォトレジストマスク及びＡｌ電極１０６をマスクとして不純物イオンの注入を行なって、第１、第２ｎ型拡散層１０７ａ、１０７ｂを形成する。
【００５２】
その後、図３（ｄ）に示す工程で、周知の方法により、層間絶縁膜１０８の形成と、層間絶縁膜１０８へのコンタクトホール１０９の開口と、コンタクトホール１０９内へのタングステンの埋め込みによるタングステンプラグ１１０の形成と、第１、第２アルミニウム配線１１１ａ、１１１ｂの形成とを行なう。
【００５３】
本実施形態では、基板としてｐ型Ｓｉ基板を用いたが、ｎ型Ｓｉ基板を用いてもよく、さらに、ＧａＡｓをはじめとする化合物半導体その他の半導体により構成される基板を用いてもよい。
【００５４】
次に、図３（ａ）に示す工程において、ドット体１０４を基板上に形成する方法を、図４および図５を参照しながら以下に説明する。なお、本発明は、以下に説明する方法には限定されず、他の公知の方法を適用することも可能である。まず、図４（ａ）に示す工程で、上記実施形態１で得られたニッケル化合物−アポフェリチン複合体（以下、本実施形態では複合体と略す）１５０を用意し、この複合体１５０を基板１３０の表面上に配置する。このことによって、複合体１５０が基板１３０の表面上に高密度、且つ高精度で配置された複合体膜が形成される。なお、基板１３０とは、図３（ａ）に示す工程で、ｐ型Ｓｉ基板１０１上に、ＬＯＣＯＳ法により、活性領域を取り囲む素子分離酸化膜１０２を形成した後、基板上にトンネル絶縁膜として機能するゲート酸化膜１０３が熱酸化法によって形成されたものを指す。以下の説明においても同様である。
【００５５】
次に、図４（ｂ）に示す工程で、複合体１５０のうちのタンパク質分子１４０を除去して、ニッケル化合物のナノ粒子１０４ａのみを残存させ、還元することによって、基板１３０上にニッケルのドット体１０４を形成する。
【００５６】
ここで、図４（ａ）に示す工程において、複合体１５０を基板１３０の表面上に高密度、且つ高精度で配置する、すなわち、基板１３０の表面上に２次元状に配列および固定する方法について説明する。本実施形態では、特開平１１−４５９９０号公報に記載の方法を採用する。以下、かかる方法を、図５を参照しながら説明する。
【００５７】
まず、図５（ａ）に示す工程において、複合体１５０を分散した液体１６０（本実施形態では、濃度４０ｍＭ、ｐＨ５．３のリン酸バッファ溶液と、濃度４０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液との等量混合溶液にニッケル化合物−アポフェリチン複合体を分散したもの）を用意する。
【００５８】
続いて、図５（ｂ）に示す工程において、ＰＢＬＨ（Ｐｏｌｙ−１−Ｂｅｎｚｉｌ−Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）を注射器などで静かに液体１６０の表面に展開する。このことによって、液体１６０の表面にＰＢＬＨからなるポリペプチド膜１７００が形成される。この後、液体１６０のｐＨを調節しておく。
【００５９】
次に、図５（ｃ）に示す工程において、時間の経過に伴って複合体１５０がポリペプチド膜１７０に付着し、複合体１５０の２次元結晶ができる。これは、ポリペプチド膜１７０が正電荷を帯びているのに対し、複合体１５０は負電荷を帯びているからである。
【００６０】
次に、図５（ｄ）に示す工程において、ポリペプチド膜１７０上に基板１３０を載置して（浮かべて）、ポリペプチド膜１７０を基板１３０に付着させる。
【００６１】
次に、図５（ｅ）に示す工程において、基板１３０を取り出せば、ポリペプチド膜１７０を介して、複合体１５０の２次元結晶が付着した基板１３０を得ることができる。
【００６２】
次に、図４（ｂ）に示す工程をさらに詳細に説明する。タンパク質分子は一般に熱に弱いため、複合体１５０のうちのタンパク質分子１４０の除去は、熱処理によって行なう。例えば、窒素等の不活性ガス中において、４００〜５００℃にて、約１時間静置すると、タンパク質分子１４０、およびポリペプチド膜１７０が焼失し、基板１３０上にはニッケルナノ粒子１０４ａが２次元状に、高密度で、且つ高精度で規則正しく配列したドット体１０４として残存する。
【００６３】
以上のようにして、図４（ｂ）に示すように、複合体１５０に保持させたニッケルナノ粒子１０４ａを、基板１３０上に２次元状に出現させ、高密度且つ高精度に配列したドット体１０４を形成することができる。尚、タンパク質分子１４０を除去する方法として、本実施形態においては熱処理を用いたが、かかる方法に限定されることはなく、例えばタンパク質分解酵素や化学物質等を用いてタンパク質を分解して消失させても良い。
【００６４】
図３（ｄ）に示すように、本実施形態のメモリセル１００は、制御ゲートとして機能するＡｌ電極１０６と、ソースまたはドレインとして機能する第１、第２ｎ型拡散層１０７ａ、１０７ｂとからなるＭＯＳトランジスタ（メモリセルトランジスタ）を備え、フローティングゲートとして機能するドット体１０４に蓄えられた電荷の量で上記メモリトランジスタの閾値電圧が変化することを利用した不揮発性メモリセルである。
【００６５】
この不揮発性メモリセルは、二値を記憶するメモリとしての機能が得られる。また、ニッケル、クロム及び銅は、表１に示すように、仕事関数が鉄やマンガン、コバルトなどと異なる。表１の仕事関数は、H. B. Michaelson“Work Functions of the elements”Journal of Applied Physics, pp536-540, volume 21, 1950.から引用した。
表１
このため、これらのナノ粒子を組み合わせて利用することによって、電子を蓄え易さの差を利用して電子の蓄積を制御することが可能となる。従って、量子効果デバイスの設計に融通性を持たせることができる。
【００６６】
図６は、互いに仕事関数が異なる化合物から形成された複数種類のドット体１０４がフローティングゲートとして形成されている以外、上記不揮発性メモリセル１００と全く同じ構成を有する不揮発性メモリセル１００’の上面図である。
【００６７】
図６に示すように、互いに仕事関数が異なる化合物から形成された複数種類のドット体１０４をフローティングゲートとして形成することによって、ドット体１０４に蓄えられる電荷の有無のみだけでなく電荷の蓄積量を制御することができる３値以上の多値メモリ（不揮発性メモリセル１００’は４値メモリ）を実現することもできる。
【００６８】
データの消去の際には、酸化膜を介したＦＮ（Ｆｏｗｌｅｒ−Ｎｏｒｄｈｅｉｍ）電流や直接トンネリング電流を利用する。
【００６９】
また、データの書き込みの際には、酸化膜を介したＦＮ電流や直接トンネリング電流あるいはチャネルホットエレクトロン（ＣＨＥ）注入を用いる。
【００７０】
本実施形態の不揮発性メモリセルでは、フローティングゲートが量子ドットとして機能できる程度に粒径の小さいニッケルナノ粒子により構成されているので、電荷の蓄積量がわずかである。したがって、書き込み、消去の際の電流量を小さくでき、低消費電力の不揮発性メモリセルを構成することができる。
【００７１】
また、本実施形態の不揮発性メモリセルでは、フローティングゲートを構成するニッケルのドット体１０４のサイズが均一であるため、電荷の注入、引き抜きの際の特性が各ニッケルのドット体１０４間で揃っており、これらの操作において制御が容易に行なえる。
【００７２】
実施例
（実施例１：ニッケル化合物−アポフェリチン複合体の作製）
本実施例では、まず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、市販のアポフェリチン（ウマ脾臓由来）を溶解したアポフェリチン溶液、および硫酸ニッケルアンモニウム溶液の各溶液を調製した。各溶液の濃度およびｐＨは、表２に示す通りである。各溶液を調製した後、直ちにＨＥＰＥＳ緩衝液およびＣＡＰＳＯ緩衝液の脱気を行った。
表２
次に、ミリＱ水を用意し、ミリＱ水中に二酸化炭素を３０分間通気（バブリング）することによって、二酸化炭素バブリング水を調製した。その後すぐに、二酸化炭素バブリング水に表２の各溶液を混合して、表３に示す組成の反応溶液を調製した。なお、ここでは３通りのＣＡＰＳＯ濃度を有する反応溶液を調製した。このことによって、３種類のｐＨの反応溶液を調製した。
表３
本実施例では、表３に示す組成の各反応溶液を、総体積３ｍｌとなるように調製したので、二酸化炭素バブリング水と表２の各溶液との添加量は、表４に示す通りであった。
表４
以上のようにして得られた３種類のｐＨの各反応溶液を、２３℃で２４時間放置した。その後、各反応溶液を８０００Ｇで３０分間遠心し、それぞれ上清を採取し、上清の状態を観察した。
【００７３】
次に、得られた各上清を水で３倍に薄め、２％金グルコースでアポフェリチンを染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるアポフェリチンと、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体とを区別することができる。
【００７４】
各上清を透過型電子顕微鏡で観察したところ、いずれもドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見えるニッケル化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチンが多数観察された。ニッケル化合物のナノ粒子は球状であり、その直径は６ｎｍ（標準偏差１ｎｍ）であった。すなわち、均一な粒径のナノ粒子が得られたといえる。
【００７５】
以上の観察結果を、ＣＡＰＳＯ緩衝液の濃度とナノ粒子形成収率（以下、ＹＣＦとも称す）との関係として表５に示す。尚、ナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）は、上清中のアポフェリチンのうち、ニッケル化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチン（すなわち、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体）の割合とする。
表５
一方、上記二酸化炭素バブリング水の代わりに、窒素バブリング水および酸素バブリング水を用い、他の条件は全く同様にした場合の結果をそれぞれ表６および表７に示す。表６は、窒素バブリング水を用いた場合の結果、表７は酸素バブリング水を用いた結果を示す。
表６
表７
これらの上清の状態を観察したところ、ＣＡＰＳＯの濃度が２５０ｍＭである反応溶液の上清は濁っており、ＣＡＰＳＯの濃度が２６５ｍＭである反応溶液の上清ではＮｉ（ＯＨ）２の沈殿が多数見られた。従って、ｐＨ８．３付近（酸素バブリング水を用いた場合はｐＨ８．２付近）が、本実施例の反応溶液の組成でのＮｉ（ＯＨ）２の沈殿点と考えられる。沈澱点より高いｐＨでは、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）がＮｉ（ＯＨ）２として高速に沈澱するので、かかる沈澱に伴い、多くのアポフェリチンは凝集し沈澱してしまうと考えられる。一方、ｐＨが低くなると、ナノ粒子を形成するために十分な水酸化物イオンが溶液中に存在しないことになるので、ナノ粒子が形成されにくくなると考えられる。したがって、沈澱点付近のｐＨもしくは沈澱点よりわずかに低いｐＨが効率良くナノ粒子を形成するための条件として好ましいといえる。
【００７６】
表５〜７の結果から、アポフェリチンを含む溶液において、沈殿点付近のｐＨになるとニッケルイオンが化合物を形成する条件となるため、アポフェリチン内の保持部にナノ粒子が形成されると考えられる。しかし実際には、アポフェリチンの凝集沈澱を生じさせることなくナノ粒子を形成することは極めて困難である。
【００７７】
本実施例では、二酸化炭素バブリング水、窒素バブリング水および酸素バブリング水のいずれを用いた場合においても、沈殿点より高いｐＨであるＣＡＰＳＯ濃度が２６５ｍＭの反応溶液の上清では、アポフェリチンが凝集沈殿していた。このため、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体を回収することが困難であり、工業的に利用するのは現実的ではないと考えられる。
【００７８】
ただし、表５〜７に示すように、ＣＡＰＳＯ濃度が２６５ｍＭである反応溶液の上清では、二酸化炭素バブリング水を用いた場合のみ、ほぼ１００％のアポフェリチンの保持部にナノ粒子が形成されていた。
【００７９】
さらに、二酸化炭素バブリング水を用いた場合、沈殿点よりもわずかに低いｐＨ（ＣＡＰＳＯ濃度が２３５ｍＭ、および２５０ｍＭである反応溶液の上清）でも、大半のアポフェリチンの保持部にニッケル化合物のナノ粒子が形成されており、アポフェリチンの凝集沈殿も抑制されていた。
【００８０】
それに対して、窒素バブリング水および酸素バブリング水を用いた場合では、沈殿点付近若しくは沈澱点よりもわずかに低いｐＨ（ＣＡＰＳＯ濃度が２３５ｍＭ、および２５０ｍＭである反応溶液の上清）で、大半のアポフェリチンの保持部にナノ粒子が形成されていなかった。
【００８１】
つまり、アポフェリチンの凝集を抑えながら、アポフェリチンの保持部にナノ粒子を形成することができるのは二酸化炭素バブリング水を用いた場合のみであった。
【００８２】
（実施例２：ニッケル化合物−アポフェリチン複合体の作製に際するニッケル塩の陰イオンの種類の影響を調べる試験）
本実施例では、まず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、市販のアポフェリチン（ウマ脾臓由来）を溶解したアポフェリチン溶液、およびニッケル塩溶液（硫酸ニッケル溶液、硝酸ニッケル溶液および塩化ニッケル溶液）の各溶液を調製した。各溶液の濃度およびｐＨは、表８に示す通りである。各溶液を調製した後、直ちにＨＥＰＥＳ緩衝液およびＣＡＰＳＯ緩衝液の脱気を行った。
表８
次に、ミリＱ水を用意し、ミリＱ水中に二酸化炭素を３０分間通気（バブリング）することによって、二酸化炭素バブリング水を調製した。その後すぐに、二酸化炭素バブリング水に表８の各溶液を混合して、表９に示す組成の反応溶液を調製した。なお、ここでは３通りのＣＡＰＳＯ濃度を有する反応溶液を調製した。このことによって、３種類のｐＨの反応溶液を調製した。
表９
本実施例では、表９に示す組成の各反応溶液を、総体積３ｍｌとなるように調製したので、二酸化炭素バブリング水と表８の各溶液との添加量は、表１０に示す通りであった。
表１０
以上のようにして得られた３種類のｐＨの各反応溶液を、２３℃で２４時間放置した。その後、各反応溶液を８０００Ｇで３０分間遠心し、それぞれ上清を採取し、上清の状態を観察した。ＣＡＰＳＯ濃度が１６０ｍＭである反応溶液の各上清（ｐＨ８．２４）は、わずかに濁っており、ｐＨ８．２付近が本実施例の反応溶液の組成でのＮｉ（ＯＨ）２の沈殿点であると考えられた。
【００８３】
次に、得られた各上清を水で３倍に薄め、２％金グルコースでアポフェリチンを染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるアポフェリチンと、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体とを区別することができる。
【００８４】
各上清を透過型電子顕微鏡で観察した結果を図７（ａ）〜（ｃ）に示す。図７（ａ）〜（ｃ）に示すように、いずれもドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見えるニッケル化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチンが観察された。いずれの上清においても、ニッケル化合物のナノ粒子は球状であり、その直径は６ｎｍ（標準偏差１ｎｍ）であった。すなわち、均一な粒径のナノ粒子が得られたといえる。
【００８５】
以上の観察結果を、ＣＡＰＳＯ濃度と使用するニッケル塩毎のナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）との関係として表１１に示す。
表１１
表１１からわかるように、本実施例の反応溶液の組成でのＮｉ（ＯＨ）２の沈殿点であるｐＨ８．２付近で、ほぼ１００％のアポフェリチンの保持部にニッケル化合物のナノ粒子が形成された。また、ＣＡＰＳＯ濃度が１４０ｍＭである反応溶液の各上清（ｐＨ８．１４）においても、ナノ粒子形成収率が低下しているものの、アポフェリチンの保持部にニッケル化合物のナノ粒子が形成されたことがわかる。
【００８６】
本実施例の結果と、上記実施例１の結果とから、アポフェリチンの保持部にニッケル化合物のナノ粒子を効率良く形成させるためには、Ｎｉ（ＯＨ）２の沈殿点付近若しくは沈澱点よりもわずかに低いｐＨが適していると考えられる。
【００８７】
さらに、本実施例の結果から、ナノ粒子形成収率は、ニッケル塩の陰イオンの種類によらずほぼ同じであり、ナノ粒子形成にニッケル塩の陰イオンが影響しないことがわかる。
【００８８】
（実施例３：ニッケル化合物−アポフェリチン複合体の作製に際するｐＨ、硫酸ニッケルアンモニウム溶液濃度、放置時間の最適条件を検索する試験）
本実施例では、まず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、市販のアポフェリチン（ウマ脾臓由来）を溶解したアポフェリチン溶液、および硫酸ニッケルアンモニウム溶液の各溶液を調製した。各溶液の濃度及びｐＨは、表１２に示す通りである。各溶液を調製した後、直ちにＨＥＰＥＳ緩衝液およびＣＡＰＳＯ緩衝液の脱気を行った。
表１２
次に、ミリＱ水を用意し、ミリＱ水中に二酸化炭素を３０分間通気（バブリング）することによって、二酸化炭素バブリング水を調製した。その後すぐに、二酸化炭素バブリング水に上記の各溶液を混合して、表１３に示す組成１〜１２の１２種類の反応溶液を総体積が３ｍｌとなるように調製した。
表１３
以上のようにして得られた１２種類の組成の各反応溶液を、２３℃で０，８，１６，２４，３２，４０，４８時間放置した。各試料のｐＨは、表１４に示す通りであり、これらのｐＨは４８時間放置後にも変化なかった。
表１４
所定時間放置後、各反応溶液を８０００Ｇで１０分間遠心し、それぞれ上清を採取し、上清の状態を観察した。
【００８９】
まず、得られた上清のアポフェリチン濃度をプロテインアッセーキット（バイオラド社製）を用いて定量した。
【００９０】
次に、得られた各上清を水で３倍に薄め、２％金グルコースでアポフェリチンを染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるアポフェリチンと、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体とを区別することができる。ニッケル化合物−アポフェリチン複合体は、タンパク質部分がドーナツ状に白く、ニッケル化合物のナノ粒子を内包した中心部が黒く見えた。
【００９１】
以上の観察結果を、放置時間とアポフェリチン濃度との関係（実線）及び放置時間とナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）との関係（点線）として図８（ａ）〜（ｄ）に示す。なお、図８（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）はそれぞれ、硫酸ニッケルアンモニウムの濃度が２，３，５，１０ｍＭの場合を示す。ＣＡＰＳＯ濃度が２６０ｍＭである溶液（組成物３，６，９，１２）はいずれも８時間放置後にほとんど全てのアポフェリチンが沈澱し、上清中のアポフェリチン濃度はほぼ０となったので、図８中では、この溶液の結果を省略することとする。従って、図８（ａ）は試料１，２、（ｂ）は試料４，５、（ｃ）は試料７，８、（ｄ）は試料１０，１１の結果を示す。
【００９２】
上記結果からわかるように、硫酸ニッケルアンモニウム濃度が２，３，５，１０ｍＭである場合のそれぞれのＮｉ（ＯＨ）２の沈澱点のｐＨは、８．８２，８．５８，８．４２，８．１５付近であった。
【００９３】
次に、上記観察結果を、硫酸ニッケルアンモニウム濃度とナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）との関係（実線）及び硫酸ニッケルアンモニウム濃度と沈澱点のｐＨとの関係（点線）として図９に示す。ナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）は、最初（溶液調製時）に添加したアポフェリチンのうち、上清におけるナノ粒子を内包したアポフェリチン（ニッケル化合物−アポフェリチン複合体）の割合とする。
【００９４】
図９に示す結果より、ナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）は、１６時間以上放置した場合は、硫酸ニッケルアンモニウムの濃度が３ｍＭ付近で最大値を示す。１６時間の放置が最も高いナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）を示すが、この条件でのナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）は、図８からわかるようにいずれの硫酸ニッケルアンモニウムの濃度においても１００％ではない。ナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）が１００％でない場合、上清中にナノ粒子を内包しているアポフェリチンと、ナノ粒子を内包していないアポフェリチンとが存在することになり、これらを分離するためのさらなる精製工程が必要となる。したがって、硫酸ニッケルアンモニウムの濃度が３ｍＭ、ｐＨが８．５８付近であって、溶液調製後の放置時間を２４時間とした条件が、形成効率及び精製効率の観点からニッケル化合物−アポフェリチン複合体を製造するための最適条件であると考える。
【００９５】
（実施例４：ニッケル化合物−アポフェリチン複合体の作製に際するアンモニウムイオンの影響を調べる試験）
本実施例では、まず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、市販のアポフェリチンを溶解したアポフェリチン溶液、アンモニア水、および硫酸ニッケルアンモニウム溶液の各溶液を調製した。各溶液の濃度およびｐＨは、表１５に示す通りである。各溶液を調製した後、直ちにＨＥＰＥＳ緩衝液およびＣＡＰＳＯ緩衝液の脱気を行った。
表１５
次に、ミリＱ水を用意し、ミリＱ水中に二酸化炭素を３０分間通気（バブリング）することによって、二酸化炭素バブリング水を調製した。その後すぐに、二酸化炭素バブリング水に表１５の各溶液を混合して、反応溶液を調製した。また、同時に二酸化炭素を通気せず、脱気しただけの水（脱気水）を、二酸化炭素バブリング水の代わりに加えた反応溶液も調製した。反応溶液の組成を表１６に示す。
表１６
本実施例においては、表１６に示す組成の反応溶液を、総体積３ｍｌとなるように溶液を調製したので、表１５の各溶液と二酸化炭素バブリング水または脱気水との添加量は、表１７に示す通りである。
表１７
以上のようにして得られた各反応溶液を、２３℃で２４時間放置した。その後、各反応溶液を８０００Ｇで３０分間遠心し、それぞれ上清を採取し、上清の状態を観察した。
【００９６】
次に、得られた各上清を水で３倍に薄め、２％金グルコースでアポフェリチンを染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるアポフェリチンと、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体とを区別することができる。
【００９７】
二酸化炭素バブリング水を用いた反応溶液の上清を透過型電子顕微鏡で観察した結果を図１０（ａ）に示す。図１０（ａ）に示すように、ドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見えるニッケル化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチンが観察された。
【００９８】
二酸化炭素バブリング水を用いた反応溶液の上清のｐＨをさらに調節し、沈殿点を探索した結果、Ｎｉ（ＯＨ）2の沈殿点はｐＨ８．６５であった。上記実施例１〜３に比べて沈殿点のｐＨが上昇した理由は、アンモニウムイオンがニッケルイオン（Ｎｉ2+）と錯体を形成し、ニッケルイオン（Ｎｉ2+）を保護するためだと考えられる。この沈殿点のｐＨ８．６５からやや低いｐＨ範囲がニッケル化合物のナノ粒子を形成する最適なｐＨ範囲である。二酸化炭素バブリング水を用いた反応溶液の上清が、上記最適なｐＨ範囲にあるとき、アポフェリチンの凝集は抑えられており、アポフェリチンの保持部にニッケル化合物のナノ粒子が形成されていることを確認できた。
【００９９】
二酸化炭素バブリング水を用いた反応溶液の上清のｐＨが沈殿点のｐＨ８．６５よりも上昇すると、アポフェリチンが凝集し、工業的に利用することが困難になる。また、二酸化炭素バブリング水を用いた反応溶液の上清のｐＨがナノ粒子を形成する最適なｐＨ範囲よりも低くなるにつれて、ナノ粒子の形成は減少し、ｐＨ８．３ではナノ粒子の形成を確認できなかった。
【０１００】
一方、脱気水を用いた反応溶液の上清を透過型電子顕微鏡で観察した結果を図１０（ｂ）に示す。図１０（ｂ）に示すように、ドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見えるニッケル化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチンが観察されなかった。また、脱気水を用いた反応溶液の上清のｐＨを様々に変化させても結果は同じであった。ナノ粒子が形成されない原因は、アンモニウムイオンの影響であると考えられるが、そのメカニズムは不明である。
【０１０１】
いずれにせよ、本実施例では、反応溶液中に存在するアンモニウムイオンがニッケルイオン（Ｎｉ2+）と錯体を形成することによって安定化するため、Ｎｉ（ＯＨ）2の沈殿点のｐＨが高くなっている。反応溶液中に炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンが存在することがナノ粒子の形成のために重要であることと、反応溶液のｐＨをＮｉ（ＯＨ）2の沈殿点のｐＨよりもわずかに低いｐＨに保つことがナノ粒子の形成に適していることは、上記実施例１〜３と共通している。
【０１０２】
（実施例５：ニッケル化合物−アポフェリチン複合体の作製に際するアンモニウムイオンの最適濃度を検索する試験）
本実施例では、まず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、市販のアポフェリチン（ウマ脾臓由来）を溶解したアポフェリチン溶液、アンモニア水、および硫酸ニッケルアンモニウム溶液の各溶液を調製した。各溶液の濃度およびｐＨは、表１８に示す通りである。各溶液を調製した後、直ちにＨＥＰＥＳ緩衝液およびＣＡＰＳＯ緩衝液の脱気を行った。
表１８
次に、ミリＱ水を用意し、ミリＱ水中に二酸化炭素を３０分間通気（バブリング）することによって、二酸化炭素バブリング水を調製した。その後すぐに、二酸化炭素バブリング水に表１８の各溶液を、表１９に示す組成の総体積３ｍｌの反応溶液となるように混合した。
表１９
以上のようにして得られた各反応溶液を、２３℃で４８時間放置した。その後、各反応溶液を８０００Ｇで３０分間遠心し、それぞれ上清を採取し、上清の状態を観察した。
【０１０３】
次に、得られた各上清を水で３倍に薄め、２％金グルコースでアポフェリチンを染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるアポフェリチンと、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体とを区別することができる。
【０１０４】
以上の観察結果を、反応溶液の上清のｐＨに対するナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）を図１１（ａ）に、ナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）を図１１（ｂ）に示す。それぞれの溶液の沈澱点はアンモニア水を添加していない溶液ではｐＨ８．４２、アンモニウムイオン（以下、本実施例におけるアンモニウムイオンとはアンモニア水により供給されたものをいう）１０ｍＭではｐＨ８．５８、アンモニウムイオン２０ｍＭではｐＨ８．６５、アンモニウムイオン３０ｍＭではｐＨ８．９２付近であった。
以上からわかるように、アンモニウムイオンの添加濃度に応じて沈澱点のｐＨは大きくなる。この理由は、実施例４でも解析したように、アンモニウムイオンがニッケルイオン（Ｎｉ２＋）と錯体を形成し、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）を保護するためだと考えられる。アンモニウムイオンの濃度の異なる各溶液においては、かかる沈殿点のｐＨ付近もしくは沈澱点よりわずかに低いｐＨがナノ粒子を形成する最適なｐＨ範囲である。二酸化炭素バブリング水を用いた反応溶液の上清が、上記最適なｐＨ範囲にあるとき、アポフェリチンの凝集は抑えられており、またアポフェリチンの保持部にニッケル化合物のナノ粒子が形成されていることを確認できた。
【０１０５】
図１１（ｂ）からわかるように、ナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）は、アンモニア水の濃度が２０ｍＭの溶液において最も高く、沈澱点付近のｐＨでは１００％であった。ナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）が１００％ということは、溶液中に添加した全てのアポフェリチンがその保持部内にナノ粒子を形成しているということである。アンモニア水を添加していない実施例３ではナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）はいずれの条件においても１００％に到達しなかったので（図９参照）、アンモニウムイオンの添加により、ナノ粒子をより収率良く形成することができるようになったことがわかる。特に、本実施例の組成においては、アンモニウムイオンが２０ｍＭとなるように添加された場合、ナノ粒子の収率が最も良い。尚、アンモニア水の添加にかかわらず、ナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）はそれぞれの沈澱点付近のｐＨで１００％が得られた。
【０１０６】
本実施例では、適切な濃度のアンモニウムイオンの添加により、高い値のナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）が得られる。尚、反応溶液中に炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンが存在することがナノ粒子の形成のために重要であることと、反応溶液のｐＨをＮｉ（ＯＨ）２の沈殿点のｐＨもしくはこれよりもわずかに低いｐＨに保つことがナノ粒子の形成に適していることは、上記実施例１〜４と共通している。
【０１０７】
（実施例６：クロム化合物−アポフェリチン複合体の作製）
本実施例では、まず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、遺伝子工学的に作製したＬ鎖のみのアポフェリチンを溶解したＬ鎖アポフェリチン溶液、および硫酸クロムアンモニウム溶液の各溶液を調製した。各溶液の濃度およびｐＨは、表２０に示す通りである。なお、各溶液を調製した後、直ちにＨＥＰＥＳ緩衝液およびＭＥＳ緩衝液の脱気を行った。
表２０
次に、ミリＱ水を用意し、ミリＱ水中に二酸化炭素を３０分間通気（バブリング）することによって、二酸化炭素バブリング水を調製した。その後すぐに、二酸化炭素バブリング水に表２０の各溶液を混合して、表２１に示す組成の反応溶液を調製した。
表２１
本実施例では表２１に示す組成の各反応溶液を、総体積３ｍｌとなるように調製したので、二酸化炭素バブリング水と表２０の各溶液との添加量は、表２２に示す通りである。
表２２
以上のようにして得られた反応溶液を、２３℃で２４時間放置した。その後、各反応溶液を８０００Ｇで３０分間遠心し、それぞれ上清を採取し、上清の状態を観察した。
【０１０８】
次に、得られた各上清を水で３倍に薄め、２％金グルコースでアポフェリチンを染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるアポフェリチンと、クロム化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチン（すなわち、クロム化合物−アポフェリチン複合体）とを区別することができる。
【０１０９】
各上清を透過型電子顕微鏡で観察したところ、いずれもドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見えるクロム化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチンが多数観察された。クロム化合物のナノ粒子は球状であり、その直径は６ｎｍ（標準偏差１ｎｍ）であった。すなわち、均一な粒径のナノ粒子が得られたといえる。
【０１１０】
反応溶液をＣｒ（ＯＨ）２の沈殿点付近のｐＨとしているため、反応溶液の上清はわずかに濁っていた。上清を透過型電子顕微鏡で観察したところ、ドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見えるクロム化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチンが観察された。
【０１１１】
本実施例の条件では、上清中約５０％のアポフェリチン内にクロム化合物のナノ粒子を確認した。すなわち、ナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）が約５０％であった。二酸化炭素バブリング水のかわりに、脱気水を用いたこと以外同じ条件の反応溶液でクロム化合物のナノ粒子の作製を試みたが、クロム化合物のナノ粒子の形成を確認することはできなかった。
【０１１２】
（実施例７：銅化合物−アポフェリチン複合体の作製）
本実施例では、まず、ＭＥＳ緩衝液、市販のアポフェリチン（ウマ脾臓由来）を溶解したアポフェリチン溶液、および硫酸銅アンモニウム溶液の各溶液を調製した。各溶液の濃度およびｐＨは、表２３に示す通りである。なお、各溶液を調製した後、直ちにＭＥＳ緩衝液の脱気を行った。
表２３
次に、ミリＱ水を用意し、ミリＱ水中に二酸化炭素を３０分間通気（バブリング）することによって、二酸化炭素バブリング水を調製した。その後すぐに、二酸化炭素バブリング水に表２３の各溶液を混合して、表２４に示す組成の反応溶液を調製した。
表２４
本実施例では、表２３に示す組成の各反応溶液を、総体積３ｍｌとなるように調製したので、二酸化炭素バブリング水と表２３の各溶液との添加量は、表２５に示す通りである。
表２５
以上のようにして得られた反応溶液を、２３℃で２４時間放置した。その後、各反応溶液を８０００Ｇで３０分間遠心し、それぞれ上清を採取し、上清の状態を観察した。
【０１１３】
次に、得られた各上清を水で３倍に薄め、２％金グルコースでアポフェリチンを染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるアポフェリチンと、銅化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチン（すなわち、銅化合物−アポフェリチン複合体）とを区別することができる。
【０１１４】
各上清を透過型電子顕微鏡で観察したところ、いずれもドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見える銅化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチンが多数観察された。銅化合物（Ｃｕ（ＯＨ）２）のナノ粒子は球状であり、その直径は６ｎｍ（標準偏差１ｎｍ）であった。すなわち、均一な粒径のナノ粒子が得られたといえる。
【０１１５】
反応溶液を銅化合物（Ｃｕ（ＯＨ）２）の沈殿点付近のｐＨとしているため、反応溶液の上清はわずかに濁っていた。上清を透過型電子顕微鏡で観察したところ、ドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見える銅化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチンが観察された。
【０１１６】
本実施例の条件では、上清中約３０〜４０％のアポフェリチン内に銅化合物のナノ粒子を確認した。すなわち、ナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）が約３０〜４０％であった。
【０１１７】
以上説明したように、本発明によると、均一な粒子径を有するナノ粒子を得ることができる。また、本発明によると、これまでタンパク質空洞部内での粒子形成が報告されていなかった金属イオンについても、タンパク質空洞部内でその化合物粒子を得ることができ、さらにそれらの金属イオンからなる均一な粒子径を有するナノ粒子を得ることができる。
【０１１８】
以下、本発明の好ましい実施の形態を、図面を参照しながら説明する。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明によると、均一な粒子径を有するナノ粒子を提供することができる。本発明により提供されるナノ粒子は、これらの量子効果を利用して、半導体素子、単電子デバイス、量子ドット、発光素子等へ利用することができる。
【０１２０】
また、本発明により提供されるナノ粒子は、光機能コーティング材、電磁波遮蔽材料、二次電池用材料、蛍光材料、電子部品材料、磁気記録材料、研磨材料、化粧品材料等の高機能、高性能、高密度、高度精密化材料として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
図１は、アポフェリチンの構造を示す模式図である。
【０１２２】
図２は、実施形態１のニッケル化合物−アポフェリチン複合体の作製方法を表すフローチャートである。
【０１２３】
図３は、不揮発性メモリセルの製造方法を示す工程断面図である。
【０１２４】
図４は、ドット体を基板の表面上に２次元状に配列及び固定する方法を示す工程断面図である。
【０１２５】
図５は、複合体を基板の表面上に２次元状に配列及び固定する方法について説明する図である。
【０１２６】
図６は、不揮発性メモリセルの上面図である。
【０１２７】
図７は、実施例２におけるナノ粒子の形成状態を表す電子顕微鏡写真である。
【０１２８】
図８は、実施例３の各硫酸ニッケルアンモニウム濃度における時間と、アポフェリチン濃度及び形成収率との関係を示す図である。
【０１２９】
図９は、実施例３における硫酸ニッケルアンモニウム濃度と形成効率との関係を示す図である。
【０１３０】
図１０は、実施例４におけるナノ粒子の形成状態を表す電子顕微鏡写真である。
【０１３１】
図１１は、実施例５におけるｐＨと、形成収率（ａ）及び形成効率（ｂ）との関係を示す図である。
【符号の説明】
【０１３２】
１ アポフェリチン
２ チャンネル
４ 保持部
１００，１００‘ メモリセル
１０１ ｐ型Ｓｉ基板
１０２ 素子分離酸化膜
１０３ ゲート酸化膜
１０４ ドット体
１０４ａ ナノ粒子
１０５ シリコン酸化膜
１０６ Ａｌ電極
１０７ａ 第１ｎ型拡散層
１０７ｂ 第２ｎ型拡散層
１０８ 層間絶縁膜
１０９ コンタクトホール
１１０ タングステンプラグ
１１１ａ 第１アルミニウム配線
１１１ｂ 第２アルミニウム配線
１３０ 基板
１４０ タンパク質分子
１５０ ニッケル化合物−アポフェリチン複合体
１６０ 液体
１７０ ポリペプチド膜
【０００１】
本発明は、タンパク質の空洞部を利用したナノ粒子の製造方法、該製造方法によって製造されたナノ粒子及び該製造方法の製造工程で生成されたナノ粒子−タンパク質複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでの機能材料開発の主流は、所望の機能を発現させる新規化合物の探索、合成によって行われている。しかしながら、近年は、物質をナノメートルサイズまでに微細化したナノ粒子を作製することで、バルク状態では得られない新機能を発現させることが望まれるようになっている。特に、近年注目されている量子効果デバイスを作製するために、半導体や金属化合物を中心とする無機材料のナノ粒子を作製することが強く望まれている。
【０００３】
従来、ナノ粒子を作製する方法は、物理的粉砕法および化学的合成法などによって行われている。例えば、物理的粉砕法は、セラミックスを焼成する際の出発材料を得るために広く用いられている。また、化学的合成法としては、長鎖の有機化合物の間で、塩化金酸を還元することによって金のナノ粒子を作製する方法などがある。ここで、長鎖の有機化合物は、金粒子が成長して巨大化することを阻害している。
【０００４】
また、有機化合物とナノ粒子との複合体を作り、化学反応させて均一な粒子を作る方法もある。この応用としては、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ膜）を形成するための材料に金原子を固定し、上記材料を金原子を中心にして集合させることによって、表面にＳＡＭ膜が形成された金のナノ粒子を得る方法もある。さらに、ナノ粒子を形成する材料を含むミセルをつくり、ミセル中での化学反応を用いてナノ粒子を作製することも行われている。
【０００５】
量子効果デバイスを作製するためには、直径が同一のナノ粒子を得ることが不可欠である。ナノ粒子において電子がとり得るエネルギーレベルは、数ナノメートルのオーダーでは、直径に依存して大きく変化する。このため、量子効果を持つナノ粒子を電子回路に応用するためには、直径が一定であることが重要になる。
【０００６】
しかし、上述の従来の方法では直径が均一なナノ粒子を得ることは難しい。例えば、物理的粉砕法では、そもそも直径をミクロンサイズよりも小さくすることが困難であり、ナノメートルオーダーに近づいたとしても直径を一定にするメカニズムがない。このため、得られるナノ粒子の直径には必然的に大きなバラツキが生じる。また、化学的合成法では、化学反応を利用しているため、これもまた得られるナノ粒子の直径には必然的に大きなバラツキが生じる。また、所要時間、コストの面でも非常に不利である。
【０００７】
一方、バイオテクノロジーを他分野に応用する試みの１つとして、金属化合物を保持する機能を有するタンパク質であるアポフェリチンに金属または金属化合物を取り込ませ、ナノオーダーの均一なサイズのナノ粒子を作製しようという研究がある。ナノ粒子の用途に応じて種々の金属あるいは金属化合物等をアポフェリチンに導入すべく研究が進められている。
【０００８】
ここで、アポフェリチンについて説明する。アポフェリチンは、生物界に広く存在するタンパク質であり、生体内では必須微量元素である鉄の量を調節する役割を担っている。鉄または鉄化合物とアポフェリチンとの複合体はフェリチンと呼ばれる。鉄は必要以上に体内に存在すると生体にとって有害であるため、余剰の鉄分はフェリチンの形で体内に貯蔵される。そして、フェリチンは必要に応じて鉄イオンを放出し、アポフェリチンに戻る。
【０００９】
図１は、アポフェリチンの構造を示す模式図である。図１に示すように、アポフェリチン１は、１本のポリペプチド鎖から形成されるモノマーサブユニットが非共有結合により２４個集合した分子量約４６万の球状タンパク質であり、その直径は約１２ｎｍで、通常のタンパク質に比べ高い熱安定性と高いｐＨ安定性を示す。アポフェリチン１の中心には直径約６ｎｍの空洞状の保持部４があり，外部と保持部４とはチャネル３を介してつながっている。例えば、アポフェリチン１に２価の鉄イオンが取り込まれる際、鉄イオンはチャネル３から入り、一部のサブユニット内にあるｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｓｅ ｃｅｎｔｅｒ（鉄酸化活性中心）と呼ばれる場所で酸化された後、保持部４に到達し、保持部４の内表面の負電荷領域で濃縮される。そして、鉄原子は３０００〜４０００個集合し、フェリハイドライト（５Ｆｅ２Ｏ３・９Ｈ２Ｏ）結晶の形で保持部４に保持される。保持部４に保持された金属原子を含むナノ粒子の直径は、保持部４の直径とほぼ等しく、約６ｎｍとなっている。
【００１０】
このアポフェリチンを用いて、人工的に鉄以外の金属や金属化合物を担持させたナノ粒子−アポフェリチン複合体が作製されている。
【００１１】
現在までに、マンガン（非特許文献１および非特許文献２を参照）、ウラン（非特許文献３を参照）、ベリリウム（非特許文献４を参照）、アルミニウム（非特許文献５を参照）、および亜鉛（非特許文献６を参照）といった金属あるいは金属化合物のアポフェリチンへの導入が報告されている。これらの金属あるいは金属化合物からなるナノ粒子の直径も、アポフェリチンの保持部４の直径とほぼ等しく、約６ｎｍとなる。
【００１２】
自然界において、鉄原子を含むナノ粒子がアポフェリチン内に形成される過程の概略は次の通りである。
【００１３】
アポフェリチン１の外部と内部とを結ぶチャネル３（図１参照）の表面には、ｐＨ７〜８の条件下でマイナス電荷を持つアミノ酸が露出しており、プラス電荷を持っている鉄（II）イオンは静電相互作用によりチャネル３に取り込まれる。 アポフェリチン１の保持部４の内表面には、チャネル３の内表面と同じく，ｐＨ７〜８でマイナス電荷を持つアミノ酸残基であるグルタミン酸残基が多く露出しており、チャネル３から取り込まれた鉄（II）イオンはｆｅｒｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｅｎｔｅｒで酸化され、内部の保持部４へと導かれる。そして、静電相互作用により鉄イオンは濃縮されて、フェリハイドライト（５Ｆｅ２Ｏ３・９Ｈ２Ｏ）結晶の核形成が起こる。
【００１４】
その後、順次取り込まれる鉄イオンがこの結晶の核に付着して酸化鉄からなる核が成長し、直径６ｎｍのナノ粒子が保持部４内に形成される。以上が、鉄イオンの取り込みと酸化鉄からなるナノ粒子形成の概略である。
【００１５】
なお、ここまで鉄イオンのアポフェリチンへの取り込みメカニズムについて述べたが、これまでに導入が報告されている他の金属イオンについては、鉄イオンとほぼ同じメカニズムで進むと考えられる。しかしながら、上述の方法によって空洞部内に取り込むことができる金属イオンは特定のものに限定されていた。
【非特許文献１】
P.Mackle、1993年、J. Amer. Chem. Soc. 115、8471-8472ページ
【非特許文献２】
F.C.Meldrumら、1995年、J. Inorg. Biochem. 58、59-68ページ
【非特許文献３】
J.F.Hainfeld、1992年、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89、11064-11068ページ
【非特許文献４】
D.J.Price、1983年、J. Biol. Chem. 258、10873-10880ページ
【非特許文献５】
J.Fleming、1987年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、84、7866-7870ページ
【非特許文献６】
D.PriceおよびJ.G.Joshi、1982年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、79、3116-3119ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、タンパク質の空洞部を利用したナノ粒子の製造方法であって、これまでタンパク質の空洞部内でのナノ粒子の形成が報告されていなかったニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、クロムイオン（Ｃｒ２＋）、銅イオン（Ｃｕ２＋）等の金属イオンからなる粒子径が均一なナノ粒子をも得ることができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、内部に空洞部を有するタンパク質、金属イオン、炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンを含む溶液中で、該タンパク質の空洞部内に該金属イオンの化合物からなるナノ粒子を形成させる工程を含む、ナノ粒子の製造方法である。
【００１８】
前記化合物としては、例えば水酸化物が挙げられる。
【００１９】
前記金属イオンは、好ましくはニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、クロムイオン（Ｃｒ２＋）または銅イオン（Ｃｕ２＋）のいずれかである。
【００２０】
前記溶液のｐＨは、好ましくは前記金属イオンの水酸化物の沈殿点とほぼ同じである。
【００２１】
前記金属イオンとして、ニッケルイオンを用いた場合、前記溶液のｐＨは、好ましくは８以上９以下である。
【００２２】
また、前記金属イオンとして、ニッケルイオンを用いた場合、前記溶液は、好ましくは、さらにアンモニウムイオンを含むものとし、この場合、前記溶液のｐＨは、好ましくは８．３を越えて８．６５以下とする。
【００２３】
例えば、前記タンパク質は、アポフェリチン、Ｄｐｓタンパク質、ＣＣＭＶタンパク質、ＴＭＶタンパク質またはヒートショックプロテインの少なくとも一つである。
【００２４】
例えば、前記溶液は、それに二酸化炭素を通気することによって生成した炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンを含むものである。
【００２５】
前記ナノ粒子を形成した後、タンパク質を熱処理によって除去する工程をさらに含むものであってもよい。
【００２６】
また、本発明は、金属イオンの化合物からなるナノ粒子であって、内部に空洞部を有するタンパク質、該金属イオン、炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンを含む溶液中で、該タンパク質の空洞部内に形成されたナノ粒子である。
【００２７】
また、本発明は、内部に空洞部を有するタンパク質と、該タンパク質の空洞部内に形成されたナノ粒子とからなる複合体であって、前記ナノ粒子は、金属イオンの化合物からなるナノ粒子であって、該タンパク質、該金属イオン、炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンを含む溶液中で、該タンパク質の空洞部内に形成されたナノ粒子である、複合体である。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によると、均一な粒子径を有するナノ粒子を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。
【００３０】
（実施形態１）
図１および図２を参照しながら本実施形態のナノ粒子の作製方法を説明する。
【００３１】
図２は、本実施形態のニッケル化合物のナノ粒子を内包したタンパク質からなる複合体（以下、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体ともいう）の作製方法を表すフローチャートである。
【００３２】
まず、図２に示すように、ステップＳｔ１では、ＨＥＰＥＳとＣＡＰＳＯとの混合溶液からなる緩衝液、アポフェリチン溶液、ニッケル塩溶液、ミリＱ水、二酸化炭素を用意する。このとき、緩衝液、アポフェリチン溶液、ニッケル塩溶液およびミリＱ水は、脱気したものを用意する。
【００３３】
次に、ステップＳｔ２では、脱気したミリＱ水に二酸化炭素を通気（バブリング）することによって、二酸化炭素バブリング水を調製する。
【００３４】
次に、ステップＳｔ３では、上記ステップＳｔ２で得られた二酸化炭素バブリング水に、緩衝液、アポフェリチン溶液およびニッケル塩溶液を添加し、反応溶液を調製する。この後、反応溶液を２４時間放置する。
【００３５】
なお、以上に説明したニッケル化合物−アポフェリチン複合体を作製するための操作は、すべて室温、もしくはアポフェリチンが変性しない温度範囲にて、スターラーで攪拌しながら行なう。
【００３６】
上記の操作によって、アポフェリチン１の保持部４にニッケルイオン（Ｎｉ２＋）の化合物が導入され、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体が形成される。
【００３７】
アポフェリチンを含めて、タンパク質はＤＮＡ情報から作製され、公知の方法で多数複製することは容易である。また、同じＤＮＡから多数複製されたタンパク質が、オングストロームの精度で同じ構造であることは周知である。このため、本実施形態で用いるアポフェリチンが有する空洞状の保持部４は、全て同じ大きさと形状を有する。
【００３８】
従って、本実施形態のように、タンパク質内にナノ粒子を作製すれば、ナノ粒子の直径がタンパク質により規定されるので、粒径が均一なナノ粒子が得られる。例えば、本実施形態では、ナノ粒子の直径は、アポフェリチンの保持部の直径とほぼ同じ６ｎｍになる。
【００３９】
本実施形態ではタンパク質としてアポフェリチンを用いたが、空洞部を有するタンパク質であれば、単一のサブユニットから構成されているタンパク質であっても、複数のサブユニットから構成されているタンパク質であってもアポフェリチンの代わりに用いることができる。また、タンパク質は、その空洞部の形状が球状のものに限定されることはなく、ロッド状、リング状等の空洞部を有するものであっても良い。例えば、Ｄｐｓタンパク質、ウイルスタンパク質、ヒートショックプロテインを用いることができる。Ｄｐｓタンパク質（直径９ｎｍであり、内部に直径４ｎｍの保持部を有する球殻状タンパク質）を用いれば、直径が４ｎｍのナノ粒子を作製することができる。ウイルスタンパク質としては、例えば、ＣＰＭＶ、ＣＣＭＶ、ＨＳＶ、Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ、Ｒｅｏｖｉｒｕｓ、ＬＡ−１、Ｐｏｌｙｏｍａ、ＣａＭＶ、ＨＰＶ、Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ、ＳｐＶ−４、φＸ１７４、ＦＨＶ、ＨＲＶ−１４、Ｐｏｌｉｏ等のウイルスのタンパク質が挙げられる。好ましくは、ＣＰＭＶ、ＣＣＭＶのウイルスタンパク質を用いることができる。本実施形態の方法によると、使用するタンパク質の空洞部の形状、大きさに応じたナノ粒子が形成されることになる。本明細書におけるナノ粒子とは、長径５０ｎｍ以下であって、粒子として安定に存在する大きさ以上の粒子をいう。一例を挙げるのであれば、長径１ｎｍ以上５０ｎｍ以下の粒子がナノ粒子に該当する。
【００４０】
また、本実施形態では、ニッケル化合物からなるナノ粒子を作製する場合について説明したが、クロム、銅の金属原子を含む化合物からなるナノ粒子を作製する場合にも本実施形態の方法を適用することができる。尚、本実施形態の方法により形成されたナノ粒子を構成する金属化合物は、添加する金属イオン等によって異なるが、例えば、水酸化物及び／又は酸化物である。
【００４１】
クロム化合物からなるナノ粒子を作製する場合、本実施形態で用いたニッケル塩溶液の代わりに、クロム塩溶液を反応溶液中に混合する。他の条件は、本実施形態に述べた通りである。銅化合物からなるナノ粒子を作製する場合、本実施形態で用いたニッケル塩溶液の代わりに、銅塩溶液を反応溶液中に混合する。他の条件は、本実施形態に述べた通りである。
【００４２】
本実施形態のナノ粒子の形成には、反応溶液中に炭素水素イオン（ＨＣＯ３−）及び／又は炭酸イオン（ＣＯ３ ２−）が存在することが重要である。従って、本実施形態のステップＳｔ２では、脱気したミリＱ水に二酸化炭素を通気（バブリング）しているが、これに限られず、炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）及び／又は炭酸イオン（ＣＯ３ ２−）が反応溶液中に添加される方法を用いればよい。例えば、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）等の炭酸塩を、ミリＱ水に溶解して用いてもよい。
【００４３】
本実施形態では、緩衝液としてＨＥＰＥＳとＣＡＰＳＯとの混合溶液を用いている。しかし、これに限定されず、ｐＨを調節するための手段は何であってもよい。例えば、１種類の緩衝剤を含む緩衝液を用いてもよく、複数種の緩衝剤の混合溶液を緩衝液として用いてもよい。特に、複数種の緩衝剤の混合溶液を緩衝液として用いる方が、１種類の緩衝剤を含む緩衝液を用いるよりも、反応溶液のｐＨの調節が容易になる。従って、複数の緩衝剤の混合溶液を緩衝液として用いることが好ましい。
【００４４】
ニッケル塩溶液は、本実施形態では硫酸ニッケルアンモニウム（ＮｉＮＨ３（ＳＯ４））を用いている。しかし、これに限定されない。例えば、硫酸ニッケル（Ｎｉ（ＳＯ４））、硝酸ニッケル（Ｎｉ（ＮＯ３）２）、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ２）を用いてもよい。本実施形態では、反応溶液中にアンモニウムイオン（ＮＨ４ ＋）が含まれている方が、反応収率の点からは望ましい。金属塩溶液として、金属塩アンモニウム溶液を用いた場合、他の成分を反応溶液に添加することなく、反応溶液はアンモニウムイオンを含有することになる。
【００４５】
本実施形態では、反応溶液調製後の放置時間を２４時間としたが、かかる時間に限定されず、各反応溶液の組成、ｐＨ等に応じた最適時間を選択することが望ましい。
【００４６】
本実施形態に示したナノ粒子の製造方法について、より具体的な反応溶液の条件等は、実施例の欄で後述する。
【００４７】
（実施形態２）
本実施形態では、上記実施形態１において作製されたニッケル化合物−アポフェリチン複合体を利用して作製されるナノ粒子からなるドット体をフローティングゲートとして含む不揮発性メモリセルについて説明する。
【００４８】
図３（ａ）〜（ｄ）は、本実施形態の不揮発性メモリセルの製造方法を示す工程断面図である。
【００４９】
まず、図３（ａ）に示す工程で、ｐ型Ｓｉ基板１０１上に、ＬＯＣＯＳ法により、活性領域を取り囲む素子分離酸化膜１０２を形成した後、基板上にトンネル絶縁膜として機能するゲート酸化膜１０３を熱酸化法によって形成する。その後、６ｎｍ程度の直径を有するニッケルのナノ粒子からなるドット体１０４を基板上に形成する。なお、ドット体１０４を基板上に形成する方法については、後述する。
【００５０】
次に、図３（ｂ）に示す工程で、基板上に、スパッタ法またはＣＶＤ法により、ドット体１０４を埋めるＳｉＯ２膜を堆積する。
【００５１】
次に、図３（ｃ）に示す工程で、基板上にＡｌ膜を堆積する。続いて、フォトレジストマスクＰｒ１を用いて、ＳｉＯ２膜およびＡｌ膜のパターニングを行なって電極間絶縁膜となるシリコン酸化膜１０５及び制御ゲート電極となるＡｌ電極１０６を形成する。このとき、ゲート酸化膜１０３のうちフォトレジストマスクＰｒ１で覆われていない部分は除去されるので、その上のドット体１０４も同時に除去される。その後、フォトレジストマスク及びＡｌ電極１０６をマスクとして不純物イオンの注入を行なって、第１、第２ｎ型拡散層１０７ａ、１０７ｂを形成する。
【００５２】
その後、図３（ｄ）に示す工程で、周知の方法により、層間絶縁膜１０８の形成と、層間絶縁膜１０８へのコンタクトホール１０９の開口と、コンタクトホール１０９内へのタングステンの埋め込みによるタングステンプラグ１１０の形成と、第１、第２アルミニウム配線１１１ａ、１１１ｂの形成とを行なう。
【００５３】
本実施形態では、基板としてｐ型Ｓｉ基板を用いたが、ｎ型Ｓｉ基板を用いてもよく、さらに、ＧａＡｓをはじめとする化合物半導体その他の半導体により構成される基板を用いてもよい。
【００５４】
次に、図３（ａ）に示す工程において、ドット体１０４を基板上に形成する方法を、図４および図５を参照しながら以下に説明する。なお、本発明は、以下に説明する方法には限定されず、他の公知の方法を適用することも可能である。まず、図４（ａ）に示す工程で、上記実施形態１で得られたニッケル化合物−アポフェリチン複合体（以下、本実施形態では複合体と略す）１５０を用意し、この複合体１５０を基板１３０の表面上に配置する。このことによって、複合体１５０が基板１３０の表面上に高密度、且つ高精度で配置された複合体膜が形成される。なお、基板１３０とは、図３（ａ）に示す工程で、ｐ型Ｓｉ基板１０１上に、ＬＯＣＯＳ法により、活性領域を取り囲む素子分離酸化膜１０２を形成した後、基板上にトンネル絶縁膜として機能するゲート酸化膜１０３が熱酸化法によって形成されたものを指す。以下の説明においても同様である。
【００５５】
次に、図４（ｂ）に示す工程で、複合体１５０のうちのタンパク質分子１４０を除去して、ニッケル化合物のナノ粒子１０４ａのみを残存させ、還元することによって、基板１３０上にニッケルのドット体１０４を形成する。
【００５６】
ここで、図４（ａ）に示す工程において、複合体１５０を基板１３０の表面上に高密度、且つ高精度で配置する、すなわち、基板１３０の表面上に２次元状に配列および固定する方法について説明する。本実施形態では、特開平１１−４５９９０号公報に記載の方法を採用する。以下、かかる方法を、図５を参照しながら説明する。
【００５７】
まず、図５（ａ）に示す工程において、複合体１５０を分散した液体１６０（本実施形態では、濃度４０ｍＭ、ｐＨ５．３のリン酸バッファ溶液と、濃度４０ｍＭの塩化ナトリウム水溶液との等量混合溶液にニッケル化合物−アポフェリチン複合体を分散したもの）を用意する。
【００５８】
続いて、図５（ｂ）に示す工程において、ＰＢＬＨ（Ｐｏｌｙ−１−Ｂｅｎｚｉｌ−Ｌ−Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）を注射器などで静かに液体１６０の表面に展開する。このことによって、液体１６０の表面にＰＢＬＨからなるポリペプチド膜１７００が形成される。この後、液体１６０のｐＨを調節しておく。
【００５９】
次に、図５（ｃ）に示す工程において、時間の経過に伴って複合体１５０がポリペプチド膜１７０に付着し、複合体１５０の２次元結晶ができる。これは、ポリペプチド膜１７０が正電荷を帯びているのに対し、複合体１５０は負電荷を帯びているからである。
【００６０】
次に、図５（ｄ）に示す工程において、ポリペプチド膜１７０上に基板１３０を載置して（浮かべて）、ポリペプチド膜１７０を基板１３０に付着させる。
【００６１】
次に、図５（ｅ）に示す工程において、基板１３０を取り出せば、ポリペプチド膜１７０を介して、複合体１５０の２次元結晶が付着した基板１３０を得ることができる。
【００６２】
次に、図４（ｂ）に示す工程をさらに詳細に説明する。タンパク質分子は一般に熱に弱いため、複合体１５０のうちのタンパク質分子１４０の除去は、熱処理によって行なう。例えば、窒素等の不活性ガス中において、４００〜５００℃にて、約１時間静置すると、タンパク質分子１４０、およびポリペプチド膜１７０が焼失し、基板１３０上にはニッケルナノ粒子１０４ａが２次元状に、高密度で、且つ高精度で規則正しく配列したドット体１０４として残存する。
【００６３】
以上のようにして、図４（ｂ）に示すように、複合体１５０に保持させたニッケルナノ粒子１０４ａを、基板１３０上に２次元状に出現させ、高密度且つ高精度に配列したドット体１０４を形成することができる。尚、タンパク質分子１４０を除去する方法として、本実施形態においては熱処理を用いたが、かかる方法に限定されることはなく、例えばタンパク質分解酵素や化学物質等を用いてタンパク質を分解して消失させても良い。
【００６４】
図３（ｄ）に示すように、本実施形態のメモリセル１００は、制御ゲートとして機能するＡｌ電極１０６と、ソースまたはドレインとして機能する第１、第２ｎ型拡散層１０７ａ、１０７ｂとからなるＭＯＳトランジスタ（メモリセルトランジスタ）を備え、フローティングゲートとして機能するドット体１０４に蓄えられた電荷の量で上記メモリトランジスタの閾値電圧が変化することを利用した不揮発性メモリセルである。
【００６５】
この不揮発性メモリセルは、二値を記憶するメモリとしての機能が得られる。また、ニッケル、クロム及び銅は、表１に示すように、仕事関数が鉄やマンガン、コバルトなどと異なる。表１の仕事関数は、H. B. Michaelson“Work Functions of the elements”Journal of Applied Physics, pp536-540, volume 21, 1950.から引用した。
表１
【００６６】
図６は、互いに仕事関数が異なる化合物から形成された複数種類のドット体１０４がフローティングゲートとして形成されている以外、上記不揮発性メモリセル１００と全く同じ構成を有する不揮発性メモリセル１００’の上面図である。
【００６７】
図６に示すように、互いに仕事関数が異なる化合物から形成された複数種類のドット体１０４をフローティングゲートとして形成することによって、ドット体１０４に蓄えられる電荷の有無のみだけでなく電荷の蓄積量を制御することができる３値以上の多値メモリ（不揮発性メモリセル１００’は４値メモリ）を実現することもできる。
【００６８】
データの消去の際には、酸化膜を介したＦＮ（Ｆｏｗｌｅｒ−Ｎｏｒｄｈｅｉｍ）電流や直接トンネリング電流を利用する。
【００６９】
また、データの書き込みの際には、酸化膜を介したＦＮ電流や直接トンネリング電流あるいはチャネルホットエレクトロン（ＣＨＥ）注入を用いる。
【００７０】
本実施形態の不揮発性メモリセルでは、フローティングゲートが量子ドットとして機能できる程度に粒径の小さいニッケルナノ粒子により構成されているので、電荷の蓄積量がわずかである。したがって、書き込み、消去の際の電流量を小さくでき、低消費電力の不揮発性メモリセルを構成することができる。
【００７１】
また、本実施形態の不揮発性メモリセルでは、フローティングゲートを構成するニッケルのドット体１０４のサイズが均一であるため、電荷の注入、引き抜きの際の特性が各ニッケルのドット体１０４間で揃っており、これらの操作において制御が容易に行なえる。
【００７２】
実施例
（実施例１：ニッケル化合物−アポフェリチン複合体の作製）
本実施例では、まず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、市販のアポフェリチン（ウマ脾臓由来）を溶解したアポフェリチン溶液、および硫酸ニッケルアンモニウム溶液の各溶液を調製した。各溶液の濃度およびｐＨは、表２に示す通りである。各溶液を調製した後、直ちにＨＥＰＥＳ緩衝液およびＣＡＰＳＯ緩衝液の脱気を行った。
表２
表３
表４
【００７３】
次に、得られた各上清を水で３倍に薄め、２％金グルコースでアポフェリチンを染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるアポフェリチンと、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体とを区別することができる。
【００７４】
各上清を透過型電子顕微鏡で観察したところ、いずれもドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見えるニッケル化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチンが多数観察された。ニッケル化合物のナノ粒子は球状であり、その直径は６ｎｍ（標準偏差１ｎｍ）であった。すなわち、均一な粒径のナノ粒子が得られたといえる。
【００７５】
以上の観察結果を、ＣＡＰＳＯ緩衝液の濃度とナノ粒子形成収率（以下、ＹＣＦとも称す）との関係として表５に示す。尚、ナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）は、上清中のアポフェリチンのうち、ニッケル化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチン（すなわち、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体）の割合とする。
表５
表６
【００７６】
表５〜７の結果から、アポフェリチンを含む溶液において、沈殿点付近のｐＨになるとニッケルイオンが化合物を形成する条件となるため、アポフェリチン内の保持部にナノ粒子が形成されると考えられる。しかし実際には、アポフェリチンの凝集沈澱を生じさせることなくナノ粒子を形成することは極めて困難である。
【００７７】
本実施例では、二酸化炭素バブリング水、窒素バブリング水および酸素バブリング水のいずれを用いた場合においても、沈殿点より高いｐＨであるＣＡＰＳＯ濃度が２６５ｍＭの反応溶液の上清では、アポフェリチンが凝集沈殿していた。このため、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体を回収することが困難であり、工業的に利用するのは現実的ではないと考えられる。
【００７８】
ただし、表５〜７に示すように、ＣＡＰＳＯ濃度が２６５ｍＭである反応溶液の上清では、二酸化炭素バブリング水を用いた場合のみ、ほぼ１００％のアポフェリチンの保持部にナノ粒子が形成されていた。
【００７９】
さらに、二酸化炭素バブリング水を用いた場合、沈殿点よりもわずかに低いｐＨ（ＣＡＰＳＯ濃度が２３５ｍＭ、および２５０ｍＭである反応溶液の上清）でも、大半のアポフェリチンの保持部にニッケル化合物のナノ粒子が形成されており、アポフェリチンの凝集沈殿も抑制されていた。
【００８０】
それに対して、窒素バブリング水および酸素バブリング水を用いた場合では、沈殿点付近若しくは沈澱点よりもわずかに低いｐＨ（ＣＡＰＳＯ濃度が２３５ｍＭ、および２５０ｍＭである反応溶液の上清）で、大半のアポフェリチンの保持部にナノ粒子が形成されていなかった。
【００８１】
つまり、アポフェリチンの凝集を抑えながら、アポフェリチンの保持部にナノ粒子を形成することができるのは二酸化炭素バブリング水を用いた場合のみであった。
【００８２】
（実施例２：ニッケル化合物−アポフェリチン複合体の作製に際するニッケル塩の陰イオンの種類の影響を調べる試験）
本実施例では、まず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、市販のアポフェリチン（ウマ脾臓由来）を溶解したアポフェリチン溶液、およびニッケル塩溶液（硫酸ニッケル溶液、硝酸ニッケル溶液および塩化ニッケル溶液）の各溶液を調製した。各溶液の濃度およびｐＨは、表８に示す通りである。各溶液を調製した後、直ちにＨＥＰＥＳ緩衝液およびＣＡＰＳＯ緩衝液の脱気を行った。
表８
表９
表１０
【００８３】
次に、得られた各上清を水で３倍に薄め、２％金グルコースでアポフェリチンを染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるアポフェリチンと、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体とを区別することができる。
【００８４】
各上清を透過型電子顕微鏡で観察した結果を図７（ａ）〜（ｃ）に示す。図７（ａ）〜（ｃ）に示すように、いずれもドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見えるニッケル化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチンが観察された。いずれの上清においても、ニッケル化合物のナノ粒子は球状であり、その直径は６ｎｍ（標準偏差１ｎｍ）であった。すなわち、均一な粒径のナノ粒子が得られたといえる。
【００８５】
以上の観察結果を、ＣＡＰＳＯ濃度と使用するニッケル塩毎のナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）との関係として表１１に示す。
表１１
【００８６】
本実施例の結果と、上記実施例１の結果とから、アポフェリチンの保持部にニッケル化合物のナノ粒子を効率良く形成させるためには、Ｎｉ（ＯＨ）２の沈殿点付近若しくは沈澱点よりもわずかに低いｐＨが適していると考えられる。
【００８７】
さらに、本実施例の結果から、ナノ粒子形成収率は、ニッケル塩の陰イオンの種類によらずほぼ同じであり、ナノ粒子形成にニッケル塩の陰イオンが影響しないことがわかる。
【００８８】
（実施例３：ニッケル化合物−アポフェリチン複合体の作製に際するｐＨ、硫酸ニッケルアンモニウム溶液濃度、放置時間の最適条件を検索する試験）
本実施例では、まず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、市販のアポフェリチン（ウマ脾臓由来）を溶解したアポフェリチン溶液、および硫酸ニッケルアンモニウム溶液の各溶液を調製した。各溶液の濃度及びｐＨは、表１２に示す通りである。各溶液を調製した後、直ちにＨＥＰＥＳ緩衝液およびＣＡＰＳＯ緩衝液の脱気を行った。
表１２
表１３
表１４
【００８９】
まず、得られた上清のアポフェリチン濃度をプロテインアッセーキット（バイオラド社製）を用いて定量した。
【００９０】
次に、得られた各上清を水で３倍に薄め、２％金グルコースでアポフェリチンを染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるアポフェリチンと、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体とを区別することができる。ニッケル化合物−アポフェリチン複合体は、タンパク質部分がドーナツ状に白く、ニッケル化合物のナノ粒子を内包した中心部が黒く見えた。
【００９１】
以上の観察結果を、放置時間とアポフェリチン濃度との関係（実線）及び放置時間とナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）との関係（点線）として図８（ａ）〜（ｄ）に示す。なお、図８（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ）はそれぞれ、硫酸ニッケルアンモニウムの濃度が２，３，５，１０ｍＭの場合を示す。ＣＡＰＳＯ濃度が２６０ｍＭである溶液（組成物３，６，９，１２）はいずれも８時間放置後にほとんど全てのアポフェリチンが沈澱し、上清中のアポフェリチン濃度はほぼ０となったので、図８中では、この溶液の結果を省略することとする。従って、図８（ａ）は試料１，２、（ｂ）は試料４，５、（ｃ）は試料７，８、（ｄ）は試料１０，１１の結果を示す。
【００９２】
上記結果からわかるように、硫酸ニッケルアンモニウム濃度が２，３，５，１０ｍＭである場合のそれぞれのＮｉ（ＯＨ）２の沈澱点のｐＨは、８．８２，８．５８，８．４２，８．１５付近であった。
【００９３】
次に、上記観察結果を、硫酸ニッケルアンモニウム濃度とナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）との関係（実線）及び硫酸ニッケルアンモニウム濃度と沈澱点のｐＨとの関係（点線）として図９に示す。ナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）は、最初（溶液調製時）に添加したアポフェリチンのうち、上清におけるナノ粒子を内包したアポフェリチン（ニッケル化合物−アポフェリチン複合体）の割合とする。
【００９４】
図９に示す結果より、ナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）は、１６時間以上放置した場合は、硫酸ニッケルアンモニウムの濃度が３ｍＭ付近で最大値を示す。１６時間の放置が最も高いナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）を示すが、この条件でのナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）は、図８からわかるようにいずれの硫酸ニッケルアンモニウムの濃度においても１００％ではない。ナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）が１００％でない場合、上清中にナノ粒子を内包しているアポフェリチンと、ナノ粒子を内包していないアポフェリチンとが存在することになり、これらを分離するためのさらなる精製工程が必要となる。したがって、硫酸ニッケルアンモニウムの濃度が３ｍＭ、ｐＨが８．５８付近であって、溶液調製後の放置時間を２４時間とした条件が、形成効率及び精製効率の観点からニッケル化合物−アポフェリチン複合体を製造するための最適条件であると考える。
【００９５】
（実施例４：ニッケル化合物−アポフェリチン複合体の作製に際するアンモニウムイオンの影響を調べる試験）
本実施例では、まず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、市販のアポフェリチンを溶解したアポフェリチン溶液、アンモニア水、および硫酸ニッケルアンモニウム溶液の各溶液を調製した。各溶液の濃度およびｐＨは、表１５に示す通りである。各溶液を調製した後、直ちにＨＥＰＥＳ緩衝液およびＣＡＰＳＯ緩衝液の脱気を行った。
表１５
表１６
表１７
【００９６】
次に、得られた各上清を水で３倍に薄め、２％金グルコースでアポフェリチンを染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるアポフェリチンと、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体とを区別することができる。
【００９７】
二酸化炭素バブリング水を用いた反応溶液の上清を透過型電子顕微鏡で観察した結果を図１０（ａ）に示す。図１０（ａ）に示すように、ドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見えるニッケル化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチンが観察された。
【００９８】
二酸化炭素バブリング水を用いた反応溶液の上清のｐＨをさらに調節し、沈殿点を探索した結果、Ｎｉ（ＯＨ）2の沈殿点はｐＨ８．６５であった。上記実施例１〜３に比べて沈殿点のｐＨが上昇した理由は、アンモニウムイオンがニッケルイオン（Ｎｉ2+）と錯体を形成し、ニッケルイオン（Ｎｉ2+）を保護するためだと考えられる。この沈殿点のｐＨ８．６５からやや低いｐＨ範囲がニッケル化合物のナノ粒子を形成する最適なｐＨ範囲である。二酸化炭素バブリング水を用いた反応溶液の上清が、上記最適なｐＨ範囲にあるとき、アポフェリチンの凝集は抑えられており、アポフェリチンの保持部にニッケル化合物のナノ粒子が形成されていることを確認できた。
【００９９】
二酸化炭素バブリング水を用いた反応溶液の上清のｐＨが沈殿点のｐＨ８．６５よりも上昇すると、アポフェリチンが凝集し、工業的に利用することが困難になる。また、二酸化炭素バブリング水を用いた反応溶液の上清のｐＨがナノ粒子を形成する最適なｐＨ範囲よりも低くなるにつれて、ナノ粒子の形成は減少し、ｐＨ８．３ではナノ粒子の形成を確認できなかった。
【０１００】
一方、脱気水を用いた反応溶液の上清を透過型電子顕微鏡で観察した結果を図１０（ｂ）に示す。図１０（ｂ）に示すように、ドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見えるニッケル化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチンが観察されなかった。また、脱気水を用いた反応溶液の上清のｐＨを様々に変化させても結果は同じであった。ナノ粒子が形成されない原因は、アンモニウムイオンの影響であると考えられるが、そのメカニズムは不明である。
【０１０１】
いずれにせよ、本実施例では、反応溶液中に存在するアンモニウムイオンがニッケルイオン（Ｎｉ2+）と錯体を形成することによって安定化するため、Ｎｉ（ＯＨ）2の沈殿点のｐＨが高くなっている。反応溶液中に炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンが存在することがナノ粒子の形成のために重要であることと、反応溶液のｐＨをＮｉ（ＯＨ）2の沈殿点のｐＨよりもわずかに低いｐＨに保つことがナノ粒子の形成に適していることは、上記実施例１〜３と共通している。
【０１０２】
（実施例５：ニッケル化合物−アポフェリチン複合体の作製に際するアンモニウムイオンの最適濃度を検索する試験）
本実施例では、まず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＣＡＰＳＯ緩衝液、市販のアポフェリチン（ウマ脾臓由来）を溶解したアポフェリチン溶液、アンモニア水、および硫酸ニッケルアンモニウム溶液の各溶液を調製した。各溶液の濃度およびｐＨは、表１８に示す通りである。各溶液を調製した後、直ちにＨＥＰＥＳ緩衝液およびＣＡＰＳＯ緩衝液の脱気を行った。
表１８
表１９
【０１０３】
次に、得られた各上清を水で３倍に薄め、２％金グルコースでアポフェリチンを染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるアポフェリチンと、ニッケル化合物−アポフェリチン複合体とを区別することができる。
【０１０４】
以上の観察結果を、反応溶液の上清のｐＨに対するナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）を図１１（ａ）に、ナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）を図１１（ｂ）に示す。それぞれの溶液の沈澱点はアンモニア水を添加していない溶液ではｐＨ８．４２、アンモニウムイオン（以下、本実施例におけるアンモニウムイオンとはアンモニア水により供給されたものをいう）１０ｍＭではｐＨ８．５８、アンモニウムイオン２０ｍＭではｐＨ８．６５、アンモニウムイオン３０ｍＭではｐＨ８．９２付近であった。
以上からわかるように、アンモニウムイオンの添加濃度に応じて沈澱点のｐＨは大きくなる。この理由は、実施例４でも解析したように、アンモニウムイオンがニッケルイオン（Ｎｉ２＋）と錯体を形成し、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）を保護するためだと考えられる。アンモニウムイオンの濃度の異なる各溶液においては、かかる沈殿点のｐＨ付近もしくは沈澱点よりわずかに低いｐＨがナノ粒子を形成する最適なｐＨ範囲である。二酸化炭素バブリング水を用いた反応溶液の上清が、上記最適なｐＨ範囲にあるとき、アポフェリチンの凝集は抑えられており、またアポフェリチンの保持部にニッケル化合物のナノ粒子が形成されていることを確認できた。
【０１０５】
図１１（ｂ）からわかるように、ナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）は、アンモニア水の濃度が２０ｍＭの溶液において最も高く、沈澱点付近のｐＨでは１００％であった。ナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）が１００％ということは、溶液中に添加した全てのアポフェリチンがその保持部内にナノ粒子を形成しているということである。アンモニア水を添加していない実施例３ではナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）はいずれの条件においても１００％に到達しなかったので（図９参照）、アンモニウムイオンの添加により、ナノ粒子をより収率良く形成することができるようになったことがわかる。特に、本実施例の組成においては、アンモニウムイオンが２０ｍＭとなるように添加された場合、ナノ粒子の収率が最も良い。尚、アンモニア水の添加にかかわらず、ナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）はそれぞれの沈澱点付近のｐＨで１００％が得られた。
【０１０６】
本実施例では、適切な濃度のアンモニウムイオンの添加により、高い値のナノ粒子形成効率（ＥＣＦ）が得られる。尚、反応溶液中に炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンが存在することがナノ粒子の形成のために重要であることと、反応溶液のｐＨをＮｉ（ＯＨ）２の沈殿点のｐＨもしくはこれよりもわずかに低いｐＨに保つことがナノ粒子の形成に適していることは、上記実施例１〜４と共通している。
【０１０７】
（実施例６：クロム化合物−アポフェリチン複合体の作製）
本実施例では、まず、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、遺伝子工学的に作製したＬ鎖のみのアポフェリチンを溶解したＬ鎖アポフェリチン溶液、および硫酸クロムアンモニウム溶液の各溶液を調製した。各溶液の濃度およびｐＨは、表２０に示す通りである。なお、各溶液を調製した後、直ちにＨＥＰＥＳ緩衝液およびＭＥＳ緩衝液の脱気を行った。
表２０
表２１
表２２
【０１０８】
次に、得られた各上清を水で３倍に薄め、２％金グルコースでアポフェリチンを染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるアポフェリチンと、クロム化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチン（すなわち、クロム化合物−アポフェリチン複合体）とを区別することができる。
【０１０９】
各上清を透過型電子顕微鏡で観察したところ、いずれもドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見えるクロム化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチンが多数観察された。クロム化合物のナノ粒子は球状であり、その直径は６ｎｍ（標準偏差１ｎｍ）であった。すなわち、均一な粒径のナノ粒子が得られたといえる。
【０１１０】
反応溶液をＣｒ（ＯＨ）２の沈殿点付近のｐＨとしているため、反応溶液の上清はわずかに濁っていた。上清を透過型電子顕微鏡で観察したところ、ドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見えるクロム化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチンが観察された。
【０１１１】
本実施例の条件では、上清中約５０％のアポフェリチン内にクロム化合物のナノ粒子を確認した。すなわち、ナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）が約５０％であった。二酸化炭素バブリング水のかわりに、脱気水を用いたこと以外同じ条件の反応溶液でクロム化合物のナノ粒子の作製を試みたが、クロム化合物のナノ粒子の形成を確認することはできなかった。
【０１１２】
（実施例７：銅化合物−アポフェリチン複合体の作製）
本実施例では、まず、ＭＥＳ緩衝液、市販のアポフェリチン（ウマ脾臓由来）を溶解したアポフェリチン溶液、および硫酸銅アンモニウム溶液の各溶液を調製した。各溶液の濃度およびｐＨは、表２３に示す通りである。なお、各溶液を調製した後、直ちにＭＥＳ緩衝液の脱気を行った。
表２３
表２４
表２５
【０１１３】
次に、得られた各上清を水で３倍に薄め、２％金グルコースでアポフェリチンを染色し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて５万倍の倍率で観察した。なお、２％金グルコースで染色した場合、アポフェリチン内の保持部に侵入することがないので、保持部が空洞であるアポフェリチンと、銅化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチン（すなわち、銅化合物−アポフェリチン複合体）とを区別することができる。
【０１１４】
各上清を透過型電子顕微鏡で観察したところ、いずれもドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見える銅化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチンが多数観察された。銅化合物（Ｃｕ（ＯＨ）２）のナノ粒子は球状であり、その直径は６ｎｍ（標準偏差１ｎｍ）であった。すなわち、均一な粒径のナノ粒子が得られたといえる。
【０１１５】
反応溶液を銅化合物（Ｃｕ（ＯＨ）２）の沈殿点付近のｐＨとしているため、反応溶液の上清はわずかに濁っていた。上清を透過型電子顕微鏡で観察したところ、ドーナツ状にタンパク質部分が白く、中心部が黒く見える銅化合物のナノ粒子を内包したアポフェリチンが観察された。
【０１１６】
本実施例の条件では、上清中約３０〜４０％のアポフェリチン内に銅化合物のナノ粒子を確認した。すなわち、ナノ粒子形成収率（ＹＣＦ）が約３０〜４０％であった。
【０１１７】
以上説明したように、本発明によると、均一な粒子径を有するナノ粒子を得ることができる。また、本発明によると、これまでタンパク質空洞部内での粒子形成が報告されていなかった金属イオンについても、タンパク質空洞部内でその化合物粒子を得ることができ、さらにそれらの金属イオンからなる均一な粒子径を有するナノ粒子を得ることができる。
【０１１８】
以下、本発明の好ましい実施の形態を、図面を参照しながら説明する。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明によると、均一な粒子径を有するナノ粒子を提供することができる。本発明により提供されるナノ粒子は、これらの量子効果を利用して、半導体素子、単電子デバイス、量子ドット、発光素子等へ利用することができる。
【０１２０】
また、本発明により提供されるナノ粒子は、光機能コーティング材、電磁波遮蔽材料、二次電池用材料、蛍光材料、電子部品材料、磁気記録材料、研磨材料、化粧品材料等の高機能、高性能、高密度、高度精密化材料として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
図１は、アポフェリチンの構造を示す模式図である。
【０１２２】
図２は、実施形態１のニッケル化合物−アポフェリチン複合体の作製方法を表すフローチャートである。
【０１２３】
図３は、不揮発性メモリセルの製造方法を示す工程断面図である。
【０１２４】
図４は、ドット体を基板の表面上に２次元状に配列及び固定する方法を示す工程断面図である。
【０１２５】
図５は、複合体を基板の表面上に２次元状に配列及び固定する方法について説明する図である。
【０１２６】
図６は、不揮発性メモリセルの上面図である。
【０１２７】
図７は、実施例２におけるナノ粒子の形成状態を表す電子顕微鏡写真である。
【０１２８】
図８は、実施例３の各硫酸ニッケルアンモニウム濃度における時間と、アポフェリチン濃度及び形成収率との関係を示す図である。
【０１２９】
図９は、実施例３における硫酸ニッケルアンモニウム濃度と形成効率との関係を示す図である。
【０１３０】
図１０は、実施例４におけるナノ粒子の形成状態を表す電子顕微鏡写真である。
【０１３１】
図１１は、実施例５におけるｐＨと、形成収率（ａ）及び形成効率（ｂ）との関係を示す図である。
【符号の説明】
【０１３２】
１ アポフェリチン
２ チャンネル
４ 保持部
１００，１００‘ メモリセル
１０１ ｐ型Ｓｉ基板
１０２ 素子分離酸化膜
１０３ ゲート酸化膜
１０４ ドット体
１０４ａ ナノ粒子
１０５ シリコン酸化膜
１０６ Ａｌ電極
１０７ａ 第１ｎ型拡散層
１０７ｂ 第２ｎ型拡散層
１０８ 層間絶縁膜
１０９ コンタクトホール
１１０ タングステンプラグ
１１１ａ 第１アルミニウム配線
１１１ｂ 第２アルミニウム配線
１３０ 基板
１４０ タンパク質分子
１５０ ニッケル化合物−アポフェリチン複合体
１６０ 液体
１７０ ポリペプチド膜
Claims (12)
- 炭酸イオン及び／又は炭酸水素イオンを含む溶液を用意する工程と、
前記溶液に、内部に空洞部を有するタンパク質および金属イオンを添加し、該タンパク質の空洞部内に該金属イオンの化合物からなるナノ粒子を形成させる工程を有し、
前記金属イオンが、ニッケルイオン（Ｎｉ２＋）、クロムイオン（Ｃｒ２＋）または銅イオン（Ｃｕ２＋）のいずれかである、ナノ粒子の製造方法。 - 前記化合物が水酸化物である、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
- 前記金属イオンがニッケルイオンである、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
- 前記金属イオンがクロムイオンである、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
- 前記金属イオンが銅イオンである、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
- 前記溶液のｐＨが前記金属イオンの水酸化物の沈殿点とほぼ同じである、請求項２に記載のナノ粒子の製造方法。
- 前記溶液のｐＨが８以上９以下である、請求項３に記載のナノ粒子の製造方法。
- 前記溶液が、さらにアンモニウムイオンを含む、請求項３に記載のナノ粒子の製造方法。
- 前記溶液のｐＨが８．３を越えて８．６５以下である、請求項８に記載のナノ粒子の製造方法。
- 前記タンパク質が、アポフェリチン、Ｄｐｓタンパク質、ＣＣＭＶタンパク質、ＴＭＶタンパク質またはヒートショックプロテインの少なくとも一つである、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
- 前記溶液を用意する工程が、水に二酸化炭素を通気する工程である、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
- 前記ナノ粒子を形成した後、タンパク質を熱処理によって除去する工程をさらに含む、請求項１に記載のナノ粒子の製造方法。
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