CN105132284B - 用于选择性转染细胞的光热衬底 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于对单细胞进行手术的新工具和用于将试剂递送给选定的细胞的衬底/装置。在某些实施方案中，所述衬底包含表面，所述表面具有一个或多个孔，其中纳米颗粒和/或薄膜被沉积在所述孔的表面上或所述孔附近，其中所述纳米颗粒和/或薄膜由当与电磁辐射接触时会升温的材料形成。在某些实施方案中，所述孔与微通道流体连通，所述微通道含有一种或多种要递送进细胞中的试剂。

Description

用于选择性转染细胞的光热衬底
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年5月13日提交的USSN 61/486,114的权益和优先权，其通过引用整体并入本文用于所有目的。
发明背景
在生物学的许多领域中，将宽范围的1种尺寸的待运物(包括蛋白、 DNA、RNA、染色体、细胞核和无生命的颗粒，诸如量子点、表面增强的拉曼散射(SERS)颗粒和微珠)转移进哺乳动物细胞中是非常合乎需要的。诸如胞吞等递送方法可以将待运物捕捉进核内体中，在此处的低pH 微环境和裂解酶经常导致待运物降解(Luo and Saltzman(2000)Nat.Biotechnol.18:33-37)。病毒和化学递送方法会将待运物包装在病毒内或形成增强摄取的化学复合物(Naldini et al(1996)Science,272:263-267； Felgner et al(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:7413-7417)。但是，毒性、细胞类型特异性的摄取和更重要的有限待运物包装能力会对待运物尺寸和可转移的细胞类型产生显著约束(Luo andSaltzman,出处同上)。
物理转移方法包括：电穿孔(Chu,et al(1987)Nucleic Acids Res.15: 1311-1326)和声致穿孔(Mitragotri(2005)Nat.Rev.Drug Discovery,4: 255-260)(它们产生随机分布的纳米级微孔)，以及光穿孔(Tirlapur and Konig(2002)Nature,418:290-291；Vogel,et al(2005)Appl.Phys.B:Laser Opt.,81:1015-1047；Clark et al(2006)J.Biomed.Opt.,11:014034)(其在激光焦点处在细胞膜上产生微孔)。穿过这些微孔，通过热扩散或通过电场将小待运物递送进细胞中。用这些方法递送大待运物的效率较低，因为待运物扩散的速度较慢和细胞存活力随着孔径增大而下降(Stevenson et al(2006)Opt.Express,14:7125-7133)。微毛细管注射(King(2004) Methods in MolecularBiology 245:Gene Delivery to Mammalian Cells 1； Humana Press Inc.:Totowa,NJ)使用尖锐的移液管尖部机械地穿透细胞膜进行递送。但是，为了维持细胞存活力，由膜穿透造成的机械创伤将典型的移液管尖部限制为0.5um直径(Han et al(2998)J.Nanomed.Nanotechnol.Biol.Med.,4:215-225)。
由于移液管堵塞和待运物剪切，不可注射大于移液管尖部的待运物。电注射(其组合了电穿孔和微毛细管注射)已经证实了向活细胞中的小分子(诸如RNA和质粒DNA)递送(Boudes et al(208)J.Neurosci.Meth., 170:204-211；Kitamura et al(2008)Nat.Meth.,5:61-67)和向人工脂囊泡中的细菌递送(Hurtig and Orwar(2008)SoftMatter,4:1515-1520)，其中通过使细胞膜与电场接触进行弱化，然后轻轻地机械穿透进细胞中。可替换地，简单的脂质辅助的显微注射(SLAM)技术(Laffafian and Hallett(1998)Biophys.J.,75:2558-2563)将合成的脂质分子整合在玻璃微毛细管的尖部。SLAM微量移液管与细胞膜的接触允许脂质分子与细胞膜融合以形成连续的且暂时的待运物递送通路。该方法避免了微量移液管尖部穿过细胞膜的曲折刺穿运动。但是，与待运物和细胞膜的亲脂相互作用可以产生在细胞中的以及与递送待运物的不希望的生物学效应，从而将该方法限于特定细胞类型和待运物含量。
发明概述
在某些实施方案中，本发明提供了一种细胞手术工具，其可以在显著减小对细胞的损伤或应激下实现细胞的非常局部的穿透。在某些实施方案中，提供了一种细胞显微手术工具，其中所述工具包含微毛细管(例如，微量移液管)，所述微毛细管在尖部处和/或尖部附近具有可通过施加电磁能而被加热的金属膜或多个纳米颗粒。
在某些实施方案中，提供了一种细胞显微手术工具。通常，所述工具包含微毛细管，所述微毛细管在尖部处和/或尖部附近具有可通过施加电磁能而被加热的金属膜或多个纳米颗粒。在某些实施方案中，所述微毛细管包含中空腔。在某些实施方案中，所述微毛细管的尖部的直径范围为约0.01μm、0.05μm、0.1μm或0.5μm至约1μm、3μm、5μm、8 μm或10μm。在某些实施方案中，所述微量移液管具有在约0.5至约2μm 或3μm范围内的OD。在不同的实施方案中，所述纳米颗粒的尺寸范围为约50nm至约500nm。在不同的实施方案中，所述纳米颗粒的尺寸范围为约10nm至约500nm。在不同的实施方案中，所述纳米颗粒选自：纳米珠、纳米线、纳米管、纳米点、纳米锥和量子点。在不同的实施方案中，所述金属膜或纳米颗粒包含贵金属、贵金属合金、贵金属氮化物和/或贵金属氧化物。在不同的实施方案中，所述金属膜或纳米颗粒包含过渡金属、过渡金属合金、过渡金属氮化物和/或过渡金属氧化物。在不同的实施方案中，所述金属膜或纳米颗粒包含磁性的、顺磁的或超顺磁性的材料。在不同的实施方案中，所述微毛细管包含选自玻璃、矿物、陶瓷和塑料的材料。在某些实施方案中，所述微毛细管包括在尖部附近具有纳米颗粒的玻璃微毛细管。在某些实施方案中，所述微毛细管包括在尖部附近具有金纳米颗粒的玻璃微毛细管。在某些实施方案中，所述微毛细管包括这样的玻璃微毛细管：其中所述纳米颗粒主要位于所述微毛细管的尖部的100μm内。
还提供了一种对细胞进行显微操作的方法。所述方法通常包括：使所述细胞接触如本文中所述的显微手术工具；和对所述工具施加电磁能，由此增加金属膜或金属纳米颗粒的温度，从而促进所述工具穿透进入或穿过细胞膜。在某些实施方案中，所述施加电磁能包括：施加光以加热金属膜或纳米颗粒。在某些实施方案中，所述施加电磁能包括：施加激光束以加热金属膜或纳米颗粒。尽管激光加热通常是优选的，还考虑其它电磁源。因此，在某些实施方案中，所述施加电磁能包括：施加磁场以加热金属膜或纳米颗粒。在某些实施方案中，所述施加电磁能包括：施加电场以加热金属膜或纳米颗粒。在不同的实施方案中，金属膜或金属纳米颗粒的温度比环境温度增加了至少100、150、200、250、300或 350摄氏度。在某些实施方案中，所述方法进一步包括：穿过微毛细管将物质注射进细胞中。在某些实施方案中，所述方法进一步包括：穿过微毛细管从细胞取出物质。在某些实施方案中，所述微毛细管包含中空腔。在某些实施方案中，所述微毛细管的尖部的直径范围为约0.1μm至约5μm。在某些实施方案中，所述纳米颗粒的尺寸范围为约5nm至约500nm 和/或约10nm至约400nm。在某些实施方案中，所述纳米颗粒选自：纳米线、纳米管、纳米点、纳米锥和量子点。在不同的实施方案中，所述金属膜或纳米颗粒包含贵金属、贵金属合金、贵金属氮化物和贵金属氧化物。在不同的实施方案中，所述金属膜或纳米颗粒包含过渡金属、过渡金属合金、过渡金属氮化物和过渡金属氧化物。在不同的实施方案中，所述金属膜或纳米颗粒包含磁性的、顺磁的或超顺磁性的材料。在某些实施方案中，所述微毛细管包含选自玻璃、矿物(例如，石英)、陶瓷和塑料(例如，聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、等)的材料。在某些实施方案中，所述微毛细管包括在尖部附近具有纳米颗粒的玻璃或石英微毛细管。在某些实施方案中，所述微毛细管包括在尖部附近具有金纳米颗粒的玻璃微毛细管。在某些实施方案中，所述微毛细管包括这样的玻璃微毛细管：其中所述纳米颗粒主要位于所述微毛细管的尖部的100μm内。
还提供了一种用于对细胞进行显微手术的系统，所述系统包含如本文中所述的显微手术工具和用于定位所述显微手术工具的显微操纵器(显微定位器)。在某些实施方案中，所述系统进一步包含显微镜，其用于显现通过显微手术工具操作的细胞。在某些实施方案中，所述系统进一步包含泵，其用于使用显微手术工具递送或取出试剂(例如，分子、细胞器或流体)。在某些实施方案中，所述系统进一步包含电磁能源(例如，激光)，其用于激发在显微手术工具上的颗粒/纳米颗粒和/或薄膜。在不同的实施方案中，所述电磁能源选自磁场发生器、激光、射频场发生器等。
在不同的实施方案中，本发明提供了制备用于对细胞进行显微手术的工具的方法。所述方法通常包括：在微毛细管的尖部处或附近，向微毛细管连接多个纳米颗粒，由此提供可通过向纳米颗粒施加电磁能而被局部加热的装置。在某些实施方案中，所述连接包括：将纳米颗粒吸附至微毛细管。在某些实施方案中，所述连接包括：在微毛细管上原位制造纳米颗粒。在某些实施方案中，所述连接包括：将纳米颗粒化学偶联至微毛细管。
在某些实施方案中，本发明的单细胞手术工具包括原子力测量(AFM) 尖部。例如，可以将纳米颗粒与用于细胞手术应用的AFM尖部集成到一起。该纳米颗粒集成的AFM尖部可以通过扫描尖部和用激光脉冲它而在细胞膜上切出任何希望的形状。
在某些其它实施方案中，本发明的工具明确地排除原子力测量(AFM) 尖部。
还提供了用于将试剂递送进细胞中的装置(转染装置)。在不同的实施方案中，所述装置包含承载颗粒和/或纳米颗粒和/或膜(例如，薄膜)的表面(例如，转染衬底)，其中所述颗粒/纳米颗粒和/或薄膜包含当暴露(例如，受照射)于能源(例如，电磁辐射诸如激光)时会升温的材料。可以将细胞布置在表面上或附近，且当所述颗粒/纳米颗粒和/或薄膜被加热时，在细胞中形成开口(例如，细胞膜被透化)，从而允许不同试剂向细胞中引入或从细胞中取出。在某些实施方案中，所述表面包括容器(例如，细胞培养容器、微量滴定板、微流体装置中的腔室等)的表面。在某些实施方案中，所述表面包含微量滴定板中的孔的壁和/或底、硅或玻璃晶片、显微镜载玻片、细胞培养容器或在微流体装置中的腔室或通道。在某些实施方案中，所述表面包括被构造成含有细胞且被设置成用于显微镜观察的腔室表面。在某些实施方案中，所述表面包括被构造成替代显微镜(例如，倒置显微镜)上的载物台的腔室表面。在某些实施方案中，所述腔室具有开放顶部，而在其它实施方案中，所述腔室的顶部是封闭的。在某些实施方案中，所述表面包含选自玻璃、矿物和塑料的材料。在某些实施方案中，所述表面包含选自II族材料、III族材料、IV族材料、V族材料和/ 或VI族材料的材料。在某些实施方案中，所述表面包含IV族材料(例如，硅、锗等)。
在不同的实施方案中，所述表面包含一个或多个孔。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜被沉积在孔表面上或孔附近。在某些实施方案中，所述表面包含至少2个孔、或至少3个孔、或至少4个孔、或至少5个孔、或至少8个孔、或至少10个孔、或至少15个孔、或至少 20个孔、或至少25个孔、或至少30个孔、或至少40个孔、或至少50 个孔、或至少75个孔、或至少100个孔、或至少200个孔、或至少300 个孔、或至少500个孔。在某些实施方案中，所述孔都位于所述表面的约2cm2或更小、或约1cm2或更小的区域内，或在约0.5cm2或更小的区域内，或在约0.1cm2或更小的区域内。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜被设置在所述孔的约100μm内、或约50μm内、或约25μm 内、或约20μm内、或约15μm内、或约10μm内、或约5μm内。在某些实施方案中，所述颗粒/纳米颗粒和/或薄膜被沉积在多个孔的表面上和/或多个孔附近。在某些实施方案中，所述颗粒/纳米颗粒和/或薄膜被沉积在大多数孔的表面上和/或大多数孔附近。在某些实施方案中，所述颗粒/纳米颗粒和/或薄膜被沉积在基本上所有孔的表面上和/或基本上所有孔附近。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜被沉积在孔的壁上和/或都在孔的边缘周围。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜优选是在孔的壁或边缘的一个区域上。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜被沉积在表面的正面上和/或孔的边缘上，所述正面和/或边缘在设置细胞的一侧的同侧。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜被沉积在表面的正面上和/或孔的边缘上，所述正面和/或边缘在设置细胞的一侧的对侧。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜包括薄膜。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜包括纳米颗粒，且所述纳米颗粒的尺寸范围为约5nm至约500nm。在某些实施方案中，所述纳米颗粒的尺寸范围为约2nm、或约5nm、或约10nm、或约15nm、或约20nm 至约400nm、或至约300nm、或至约250nm、或至约200nm、或至约 150nm、或至约100nm、或至约75nm、或至约50nm。在某些实施方案中，所述纳米颗粒选自：纳米珠或纳米球、纳米线、纳米管、纳米点、纳米锥和量子点。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜包含选自半导体、金属、金属合金、金属氮化物和金属氧化物的材料。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜包含选自过渡金属、过渡金属合金、过渡金属氮化物和过渡金属氧化物的材料。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜包含选自金、钛(Ti)、TiN、TiCn和TiAlN的材料。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜包含掺杂有III族材料或V族材料的IV族材料(例如，硅、锗等)。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜包含掺杂有选自硼、砷、磷或镓的材料的硅或锗。在某些实施方案中，一个或多个孔与腔室流体连通，所述腔室含有要递送进细胞中的试剂。在某些实施方案中，所述装置包含微通道，且一个或多个孔与所述微通道流体连通。在某些实施方案中，所述装置包含多个微通道。在某些实施方案中，不同的微通道与不同的孔流体连通。在某些实施方案中，所述装置包含歧管和/或阀以向不同的微通道递送流体。在某些实施方案中，所述微通道含有要递送进所述细胞中的试剂。在某些实施方案中，所述试剂选自：核酸、核酶、蛋白或肽、酶、抗体、细胞器、染色体、病原体和微粒或纳米颗粒。在某些实施方案中，所述微通道(或腔室)被增压，在泵控制下，通过重力进料而补料，或连接电动泵。在某些实施方案中，所述装置进一步包含控制器，所述控制器监测和/或控制所述微通道中的流动，并控制定时，且任选地控制所述表面的照射位置。在某些实施方案中，所述装置被构造成替代倒置显微镜上的载物台。在不同的实施方案中，将一个或多个细胞设置在表面上，且在某些实施方案中，将细胞设置在衬底中的孔的表面上或附近。在某些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞(例如，人细胞、非人哺乳动物细胞)。在某些实施方案中，所述细胞是干细胞(例如，胎儿干细胞、脐带血干细胞、成体干细胞、诱导的多能干细胞(IPSC)等)。
在某些实施方案中，提供了用于在一个细胞或一组细胞中选择性地产生开口的系统。在某些实施方案中，所述系统是用于将试剂选择性地递送进细胞中的系统。所述系统通常包含：含有转染衬底的装置(例如，如上所述)，和能够加热纳米颗粒或薄膜的电磁能源。在某些实施方案中，所述电磁能源是激光或非相干光源。在某些实施方案中，所述电磁能源是激光。在某些实施方案中，所述系统包含透镜系统、镜系统、或罩板和/或定位系统，以将电磁能导向表面的特定区域。在某些实施方案中，所述系统包含控制器，其控制电磁辐射源的照射的定时和/或模式。
在某些实施方案中，提供了用于在一个细胞或一组细胞中选择性地产生开口的方法。在某些实施方案中，所述方法可以用于将一种试剂(或多种试剂)选择性地递送进细胞中。在不同的实施方案中，所述方法利用转染衬底和/或系统(例如，如上所述)。因此，在某些实施方案中，提供了一种将试剂递送进细胞中的方法。所述方法包括：将细胞提供在包含转染衬底的装置(例如，如上所述)上和/或在包含用于转染细胞的装置的系统(例如，如上所述)中，其中将所述细胞设置在表面(转染衬底)上；使所述细胞与试剂接触；和将所述表面的一个区域暴露于电磁辐射，由此诱导薄膜和/或颗粒的加热，其中所述加热会形成气泡，所述气泡在被加热的区域(或附近)的细胞的膜中产生开口，从而导致所述试剂向那些细胞中的递送。在某些实施方案中，通过将试剂提供在包围细胞的流体(例如，缓冲液、培养基)中，使所述细胞与所述试剂接触。在某些实施方案中，通过将试剂提供在存在于所述表面中的一个或多个孔中，使所述细胞与所述试剂接触。在某些实施方案中，通过将试剂提供在一个或多个与所述孔流体连通的微流体通道中，使所述细胞与所述试剂接触。在某些实施方案中，将不同的试剂递送至不同的孔。在某些实施方案中，所述暴露包括：将所述衬底的一个区域暴露于激光脉冲或非相干光源。在某些实施方案中，所述试剂选自：核酸、染色体、蛋白、标记、细胞器和小有机分子。
在某些实施方案中，提供了对细胞进行显微操作的方法，所述方法利用微毛细管的尖部作为光导引件和/或调节在所述尖部处的热分布。在某些实施方案中，所述方法包括，使细胞接触显微手术工具，所述工具包含在尖部处和/或尖部附近具有金属膜(涂层)或金属纳米颗粒的微毛细管，所述金属膜(涂层)或金属纳米颗粒可以通过施加电磁能而被加热；给所述工具施加电磁能，由此增加金属膜或金属纳米颗粒的温度，从而导致在细胞膜中形成开口，其中改变所述显微手术工具与所述细胞的接触角和/或电磁能的偏振，以改变在细胞中产生的开口的大小和/或形状。在某些实施方案中，所述施加电磁能包括：施加光(例如激光或非相干光) 以加热金属膜或纳米颗粒。在某些实施方案中，所述显微手术工具的尖部被构造成充当光导引件。在某些实施方案中，所述施加电磁能包括：施加激光束以加热金属膜或纳米颗粒。在某些实施方案中，所述施加电磁能包括：施加电场和/或磁场以加热金属膜或纳米颗粒。在某些实施方案中，所述金属膜或金属纳米颗粒的温度比环境温度增加了至少150℃。在某些实施方案中，所述方法进一步包括：穿过微毛细管，将试剂注射进细胞中。在某些实施方案中，所述微毛细管的尖部的直径范围为约0.1 μm至约5μm。在某些实施方案中，所述纳米颗粒的尺寸范围为约5nm 至约500nm。在某些实施方案中，所述金属膜或纳米颗粒包含半导体或选自以下的金属：贵金属、贵金属合金、贵金属氮化物和贵金属氧化物。在某些实施方案中，所述金属涂层或纳米颗粒包含过渡金属、过渡金属合金、过渡金属氮化物和过渡金属氧化物。在某些实施方案中，所述金属涂层或纳米颗粒包含选自金、钛(Ti)、TiN、TiCn和TiAlN的材料。在某些实施方案中，所述微毛细管包含选自玻璃、矿物、陶瓷和塑料的材料。在某些实施方案中，所述纳米颗粒或金属膜包含膜。在某些实施方案中，所述纳米颗粒或金属膜包含纳米颗粒。
定义
本文中使用的术语“纳米颗粒”表示这样的颗粒：其具有等于或小于约800nm或700nm或600nm或500nm、优选地等于或小于约200nm 或150nm或100nm、更优选地等于或小于约50或20nm的平均尺寸的至少一种尺寸，或具有约10nm或更小的微晶尺寸，所述微晶尺寸从电子显微镜图像和/或标准2-θx-射线衍射扫描的衍射峰半宽度测得。在某些实施方案中，优选地，尺寸分布的第一标准差是平均颗粒尺寸的60％或更小、优选地40％或更小、最优选地15-30％。
关于纳米颗粒尺寸的短语“尺寸范围”指示，纳米颗粒主要是在该尺寸范围内。因而，例如，在某些实施方案中，至少85％、优选至少90％、更优选至少95％和最优选至少98％、99％、或甚至所有的纳米颗粒是在所述的尺寸范围内。
术语“过渡金属”通常表示，在周期表的d-块中的任意元素，不包括锌、镉和汞。这对应于周期表上的3-12族。
术语“微毛细管”和“微量移液管”互换使用。“微毛细管”是这样的管：其尖部具有小于约50μm、优选地小于约25μm、更优选地小于约15μm 或10μm和最优选地小于约5μm的直径。在某些实施方案中，所述微毛细管具有约2μm或更小的尖部直径。在某些实施方案中，所述微毛细管可以是固体杆。在某些实施方案中，所述微毛细管可以用具有更大尖部直径(例如，大于约200nm，如本文中所述)的移液管(毛细管)替代。
术语“核酸”或“寡核苷酸”或语法等效词在本文中表示至少2个共价地连接在一起的核苷酸。本发明的核酸优选是单链的或双链的，且通常含有磷酸二酯键，尽管在某些情况下(如下所述)，包括可能具有替代性主链的核酸类似物，所述替代主链包含例如：磷酰胺(Beaucage et al (1993)Tetrahedron 49(10):1925和其中的参考文献；Letsinger(1970)J.Org. Chem.35:3800；Sprinzl et al(1977)Eur.J.Biochem.81:579；Letsinger et al(1986)Nucl.Acids Res.14:3487；Sawai et al(1984)Chem.Lett.805, Letsinger et al(1988)J.Am.Chem.Soc.110:4470；和Pauwels et al(1986) ChemicaScripta26:1419)、硫代磷酸酯(Mag et al(1991)Nucleic Acids Res. 19:1437；和美国专利号5,644,048)、二硫代磷酸酯(Briu et al(1989)J.Am. Chem.Soc.111:2321)、O-甲基亚磷酰胺键(参见Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,OxfordUniversity Press)和肽核酸主链和键(参见Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114:1895；Meier et al(1992) Chem.Int.Ed.Engl.31:1008；Nielsen(1993)Nature,365:566；Carlsson et al(1996)Nature 380:207)。其它类似物核酸包括具有阳性主链(Denpcy etal(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097)、非离子型主链(美国专利号 5,386,023,5,637,684,5,602,240,5,216,141和4,469,863；Angew.(1991) Chem.Intl.Ed.English 30:423；Letsinger et al(1988)J.Am.Chem.Soc. 110:4470；Letsinger et al(1994)Nucleoside&Nucleotide 13:1597；第2和3 章,ASC Symposium Series 580,“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”,Ed.Y.S.Sanghui and P.DanCook；Mesmaeker et al(1994), Bioorganic&Medicinal Chem.Lett.4:395；Jeffs et al(1994)J.Biomolecular NMR 34:17；Tetrahedron Lett.37:743(1996))和非核糖主链的那些，包括在以下文献中描述的那些：美国专利号5,235,033和5,034,506，以及ASCSymposium Series 580,Carbohydrate Modifications in Antisense Research,Ed.Y.S.Sanghui and P.Dan Cook，第6和7章。在核酸的定义中也包括含有一个或多个碳环糖的核酸(参见Jenkins et al(1995),Chem.Soc.Rev. 第169-176页)。几种核酸类似物描述在Rawls,C&E News(1997年6月 2日)第35页。可以对核糖-磷酸主链做出这些修饰，以便利额外部分(诸如标记)的添加，或增加这样的分子在生理环境中的稳定性和半衰期。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换地用于表示氨基酸残基的聚合物。该术语适用于：其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。该术语也包括在传统肽键上的变体，所述传统肽键连接组成多肽的多个氨基酸。优选的“肽”、“多肽”和“蛋白”是多个氨基酸的链，所述氨基酸的α碳通过肽键相连。因此，在链的一个末端(氨基端)处的末端氨基酸具有游离氨基，而在链的另一个末端(羧基端)处的末端氨基酸具有游离羧基。本文中使用的术语“氨基端”(缩写为N-端)表示，在肽的氨基端处的氨基酸上的游离α-氨基，或表示在肽内的任意其它位置处的氨基酸的α-氨基(当参与肽键时，为亚氨基)。类似地，术语“羧基端”表示，肽的羧基端上的游离羧基或在肽内的任意其它位置处的氨基酸的羧基。肽也包括基本上任意的聚氨基酸，包括、但不限于肽模拟物，诸如通过醚(而不是酰胺键)连接的氨基酸。
术语“试剂”当结合要递送进细胞中的物质来使用时，包括要递送进细胞中(或从细胞取出)的任意物质。这样的试剂包括、但不限于：核酸(包括、例如，载体和/或表达盒、抑制性的RNA(例如，siRHA、shRNA、 miRNA等)、核酶、蛋白/肽、酶、抗体、成像试剂、细胞器(例如，细胞核、线粒体、核仁、溶酶体、核糖体等)、染色体、细胞内的病原体、无生命的颗粒，诸如量子点、表面增强的拉曼散射(SERS)颗粒、微珠等。
附图简要说明
图1示意地示出了细胞手术工具的一个实施方案。
图2显示了用碳涂布的玻璃微量移液管的SEM图像(左图)和合成的金纳米颗粒的TEM图像(右图)。
图3显示了在激光脉冲处理之前和之后的细胞。(上图)玻璃微量移液管，(中图)碳涂布的微量移液管，(下图)金纳米颗粒涂布的微量移液管。
图4显示了长宽比3.2(A:24小时)和5.8(C:72小时)的TEM图像。
图5示出了使用基因枪注射器(左图)将金颗粒直接地轰击在塑料衬底上来制造转染衬底。中图为在衬底上的典型颗粒，而右图示出了在衬底上的颗粒密度。
图6，图A-D，显示了通过加热薄膜(例如，使用脉冲激光器)以形成退火颗粒而在表面上形成纳米颗粒的方法。在该实施例中，用脉冲激光器(532nm,6ns)以113.2mJ/cm2加热具有2nm钛附着层的30nm金膜，进行100次脉冲。颗粒尺寸范围为0.1-0.7μm(参见，例如，图C)。颗粒密度为约0.65个颗粒/μm2＝65个颗粒/细胞(假定细胞面积为约10μm x 10μm)。
图7示出了能够使用金颗粒涂布的衬底实现光图案化的分子递送的装置的一个实施方案的示意图。
图8示出了光图案化的分子递送的实验方案和用于捕获空化气泡动力学的时间分辨成像系统的示意图。
图9显示了通过脉冲激光器辐照在金颗粒上诱导的气泡。(a)在激光脉冲之前，(b)在激光脉冲之后78ns。条＝50μm。
图10显示了使用荫罩板在HEK293T细胞中的光图案化的荧光染料摄取。(a)明视野(b)荧光图像(罩板覆盖虚线的右侧)。
图11显示了在293T细胞上的初步光热移液管试验。激光脉冲处理之前(左列)和之后(右列)。给移液管涂布不同厚度的Au/Pd薄膜。膜厚度＝5nm(图a)相对于13nm(图b)。在2个实验中使用的激光能量密度为 88.3mJ/cm2。
图12，图a-c，显示了使用金薄膜涂布的移液管将编码GFP的质粒向贴壁293T细胞中的显微注射。图a：显微注射操作，图b：注射以后 24小时的细胞荧光图像，显示了存活的且表达GFP的细胞；图c：叠加在相位差上的图像和荧光图像。
图13显示了使用与光镊相组合的等离子体光热移液管的非贴壁细胞显微注射的示意图(上图)，和显示在与光热移液管尖部接触的同时被光镊捕获的Nalm-6细胞的图像(下图)。
图14示意地示出了用于将一种或多种试剂平行地、选择性地递送进细胞中的衬底。
图15示意地示出了“转染衬底”的一种构型，其包含微通道以将试剂选择性地递送进细胞中。
图16A-16C示意地示出了用于将一种或多种试剂平行地、选择性地递送进细胞中的一种示例性衬底的运行。如在图16A中示出的，将细胞设置在阵列中的一个孔上，并且所述孔与微通道流体连通。如所示出的，所述孔的一个边缘涂布有薄膜，在该情况下，为钛薄膜。用能源(例如，脉冲激光器)加热所述膜。这会导致薄膜的加热，如在图16B中所示。形成膨胀的蒸汽气泡，其导致贯穿细胞脂双层的开口的形成。如在图16C 中所示，可递送的物质通过被动扩散或主动泵送从微通道穿过孔进入细胞中。
图17示意地示出了制造衬底(诸如在图14中示出的衬底)的一种方法。
图18显示了示例性的转染衬底的照片。
图19示出了在试剂递送衬底上的平行气泡激发。通过用激光脉冲(脉冲宽度为6ns，波长为532nm)辐照该结构，在每个圆形开口中同步地产生气泡。由于新月形Ti薄膜涂层，仅沿着圆柱形侧壁的某些部分发生气泡爆炸。
图20，图A和B，示出了膜开口(图(a))和试剂递送衬底用于将试验试剂递送给HeLa细胞的用途(图(b))。以200μg/ml的浓度，将膜不可透过的绿色荧光FITC-葡聚糖(分子量＝3k Da.)加载进细胞培养基中。在156 mJ/cm2激光脉冲处理以后，在细胞中观察到荧光染料摄取，所述细胞生长在圆形孔的顶部并遭受了激光触发的气泡爆炸。这里，所述递送是通过被动扩散。
图21示出了使用光热纳米刀的超快膜切割机制，其用于将待运物递送进活哺乳动物细胞中。Ti薄膜涂布在玻璃微量移液管的外侧。在被纳秒激光脉冲激发以后，Ti通过热传导与周围的薄水层一起快速升温。在 <1μs内膨胀和破裂的爆炸性蒸汽纳米气泡与微毛细管内容物的压力驱动的递送同步地局部地切割接触的细胞膜。
图22A-22D显示了Ti涂布的微量移液管的结构和从激光激发计算的强度模式。图22A和22B：拉伸的Ti涂布的微量移液管的扫描电子显微镜图像。内径＝1.38±0.1μm(平均值±标准差)。外径＝1.88±0.1μm。Ti薄膜的厚度＝102±8nm(箭头指向在微量移液管内部延伸的玻璃丝的边缘)。图22C：在激光激发下，微量移液管的尖部处的标准化强度特性(nTi＝1.86 +2.56i(Lynch和Hunter(1998)Introduction to the data for several metals.见Handbook of Optical Constants of Solids,第III卷；Academic Press:San Diego,CA)，n玻璃＝1.46，n水＝1.34，λ＝532nm，θ＝30°)。图22D：在微量移液管尖部处的Ti环中的时间平均光吸收特性(∝|Eave|2)。
图23A-23C示出了通过光热纳米刀实现的超快膜切割和细胞存活力评价。图23A：具有最大半径的纳米气泡，当与细胞膜接触时，其从移液管尖部的边缘延伸至0.4μm。向接触膜的能量转移会减小纳米气泡形成的尺寸和局部地切割质膜。图23B：在270ns(在游离悬浮液中)和 170ns(与HeLa细胞膜接触)内的蒸汽纳米气泡的快速膨胀和破裂动力学。图23C：光热递送以后的细胞存活力。使用仅为玻璃的微量移液管与细胞接触(不刺穿膜)，并用相同能量密度(180mJ/cm2)的激光脉冲照射，进行对照实验。当对细胞进行激光脉冲处理和单独的膜开口(98±11％(平均值±标准差))时，以及在对细胞进行激光脉冲处理和液体注射的实验中 (94±4％)，细胞存活力>90％。
图24示出了光热纳米刀可递送的待运物尺寸的宽范围。将表达GFP 的RNA递送进lipofectamine抗性的IMR90原代人肺成纤维细胞中。在转移以后，在ROCK抑制剂分散的人胚胎干细胞中表达含有DsRed的慢病毒，其涂布在100nm绿色荧光珠子上。在没有堵塞的情况下，将直径为200nm的荧光珠子递送进HEK293T细胞。以高效率和高细胞存活力实现了泰国伯克霍尔德氏菌(B.thailandensis)细菌向HeLa细胞中的转移。
图25A-25C示出了通过光热纳米刀向HeLa细胞中的高效率细菌递送。图25A：在转移以后的细菌摄取途径(Wiersinga et al(2006)Nat.Rev. Microbiol.4:272-282)。图25B：将GFP-标记的泰国伯克霍尔德氏菌与红荧光葡聚糖四甲基罗丹明一起转移进HeLa细胞(平均效率＝46±33％(平均值±标准差))。共焦z-轴扫描显示了在红荧光细胞内的多个细菌。图 25C：转移的mCherry-标记的泰国伯克霍尔德氏菌在HeLa细胞中的繁殖和肌动蛋白聚合。
图26示出了在不同的激光偏振和微量移液管取向下由光热纳米刀产生的细胞膜切割模式。激光能量密度＝360mJ/cm2。移液管尖部直径＝2 μm。(a)线性偏振。(b)圆形偏振。(c)线性偏振的激光激发，以及微量移液管从垂直轴倾斜30°。在插图中的条＝1μm。
图27示出了照射角和偏振对纳米刀尖部处的热分布的影响。在上面一行中显示了瞬时强度，并在下面一行中显示了时间平均强度。左列显示了具有线性偏振的垂直取向的尖部。中间列显示了具有圆形偏振的垂直取向的尖部。右列显示了具有线性偏振的倾斜尖部(30°)。
图28A-28C示出了照射角和偏振对在细胞中产生的开口的影响。图 28A示出了使用线性偏振光加热的垂直移液管(纳米刀)所产生的开口。图 28B示出了使用圆偏振光加热的垂直移液管(纳米刀)所产生的开口。图 28C示出了用倾斜移液管(纳米刀)产生的开口。
详细描述
在某些实施方案中，本发明涉及可用于对单个细胞进行“手术”操作的新工具/装置，并涉及用于操作细胞和/或给那些细胞递送试剂或从那些细胞提取试剂的衬底。
用于在细胞上进行操作的手术工具
在不同的实施方案中，提供了“单细胞手术工具”，其用于在最小细胞损伤下执行显微注射、微提取和/或细胞内操作。它可以与被脂双层包裹的任意细胞(例如，真核细胞，更优选脊椎动物细胞，更优选哺乳动物细胞类型)一起使用。在某些实施方案中，所述装置可以与包含细胞壁的细胞(例如，植物细胞)一起使用。
在某些示例性实施方案中，所述装置包含微毛细管(例如，微量移液管)，所述微毛细管包含在微毛细管的尖部处或附近的“能吸收能量的”纳米颗粒和/或“能吸收能量的”薄膜。该装置通过激发/加热(例如，激光诱导的加热)涂布在微毛细管上的金属颗粒/纳米颗粒和/或金属膜(例如，纳米涂层)而实现细胞的精确的且可控的纳米级修饰。不受限于特定理论，据信，当到达细胞表面附近或与细胞表面接触时，该非常局部的加热会在细胞膜(和/或细胞壁)中产生精确设定大小的孔。以此方式，微量移液管可以容易地穿透细胞膜，而不诱发与当前的显微注射和提取技术有关的机械和生化损伤。该工具因而会促进在机械上脆弱的小细胞上的手术操作取得高成功率。
单细胞显微注射是一种强大的且通用的技术，其用于将外源物质引入细胞中，用于在细胞之间提取和转移细胞组分，和/或用于引入在细胞内通常不存在的组分，诸如探针、检测剂或遗传工程改造的细胞器、基因、蛋白等。常规玻璃微量移液管技术(诸如用于制备转基因小鼠的那些)会给细胞带来巨大的机械和生化应激，并造成低成功率，特别是对于机械上脆弱的细胞而言。
当前的激光诱导的细胞消融操作会消除该物理应激，但是需要非常集中的光，且损伤体积是衍射限制的。相比而言，本文中描述的细胞手术工具可以通过在移液管尖部处或附近局部加热颗粒/纳米颗粒和/或薄膜而实现在毛细管微量移液管的尖部处或附近在纳米尺寸量级的操作(例如，消融)。使用电磁辐射(例如，磁场、电场、射频场、宽或聚焦激光脉冲等)，加热所述颗粒/纳米颗粒和/或薄膜。
在不同的实施方案中，本文中描述的细胞手术方法利用金属颗粒/纳米颗粒和/或薄金属膜的光热效应。例如，通过控制颗粒的几何形状(例如，长宽比)和/或组成和/或膜的厚度或组成，可以“调节”所述材料，使得电磁辐射(例如，激光能)被颗粒和/或薄膜强烈吸收，但是不被附近的细胞或细胞内容物吸收，由此避免由传统的基于激光的细胞操作方法造成的细胞或遗传损伤。当前的激光细胞技术依赖于细胞内容物对激光能的强吸收来产生消融或空化效应。这样的方法可以损伤细胞，且可以造成不希望的细胞组分分解或可能影响受操作的细胞的生物学的化学效应。
相比而言，利用本文中描述的显微手术工具，可以使用激光或其它电磁能源来加热通过结合至微毛细移液管而局部化在细胞膜处的颗粒/纳米颗粒和/或薄膜。因而，能源(例如，激光)不会实质上损伤受操作的细胞。
取决于材料的选择，通过施加本质上任意的电磁辐射，可以激发(加热)纳米颗粒和/或薄膜。因而，在不同的实施方案中，通过施加磁场、和 /或电场、和/或射频场、和/或光(例如，激光)，加热纳米颗粒和/或薄膜。
例如，金属颗粒、纳米颗粒和薄膜强烈吸收具有与表面等离子体频率接近的频率的电磁波，所述频率通常在可见光和近红外范围内。颗粒、纳米颗粒和薄膜由于吸收的能量而快速地升温，以产生过热现象并蒸发周围介质。在所述细胞手术工具的某些实施方案中，将单个或多个纳米颗粒涂布在微量移液管的尖部上，例如，如图1所示。在激光脉冲激发后，在纳米颗粒周围产生纳米直径蒸汽气泡。当到达细胞表面附近或与细胞表面接触时，该过程在细胞膜(和/或细胞壁)中产生受控的、精确设定大小的孔。以此方式，微量移液管可以容易地穿透细胞膜，而不诱发与当前的显微注射和提取技术有关的机械和生化损伤。空化或“穿孔”过程在几纳秒内完成。所以，膜的其它部分没有时间做出反应，且保持在机械上的稳定性。一旦将移液管放入细胞中，可以用穿过移液管的中空腔的装置(诸如纤维光学装置)保持“膜孔”开放以进行操作。在某些实施方案中，使用沉积在微毛细管的尖部处和/或附近的薄金属膜，可以得到类似的效应。
在一个示例性的操作模式中，在显微镜(例如，倒置显微镜)下，通过显微操纵器和/或自动化的(例如，压力驱动的)载物台，将微量移液管放置在靶细胞附近。通过在微量移液管的尖部上脉冲激光(或其它能源)，移液管会容易地穿过膜，而不会造成显著的细胞变形。一旦移液管进入细胞中，可以像活细胞细胞内操作一样执行随后的分子和细胞组分的注射或提取。
所述细胞手术工具因而可以用于执行单细胞显微注射和/或提取和/ 或细胞内操作。已经证实了在贴壁细胞膜上的穿孔，且这容易扩展至悬浮细胞，扩展至使用光镊固定化的细胞，和/或在标准的基于抽吸的支持移液管辅助下扩展至常规地以簇、集落或团块的形式培养的细胞。示例性的实验结果显示在图3中。
在不同的实施方案中，通过改变移液管(纳米刀)的角度和/或通过改变激光偏振，可以实现不同的膜切割。例如，随着移液管从0(垂直)倾斜至30度，在钛环上的热点从在极性对面向彼此更近地移动(参见，例如，图27)。在膜中得到的切口是“蝙蝠眼”形(参见，例如，图28A-28C)。
控制切割模式(在Optics Express论文中提及)的另一个因素是移液管尖部尺寸。当移液管尖部尺寸减小至2微米时，热可以在2个热点之间扩散，并因此在膜上产生一个“猫门”形切口。
这显示在图26中。为了维持光热纳米刀的切割模式进行成像，将 HeLa细胞用戊二醛预处理20min，以诱导蛋白交联和显著减慢细胞膜重新密封。在激光脉冲处理(激光能量密度为360mJ/cm2)过程中，将2μm 大小的尖部直径Ti涂布的微量移液管放置成垂直于细胞膜表面与其轻轻接触。
在激光脉冲处理以后，在扫描电子显微镜下拍摄细胞膜的图像。通过施加线性偏振的激光脉冲，沿着Ti纳米结构涂布的尖部的任一侧在细胞膜中切出2个孔(每个<1μm)，而通过圆形偏振的激光激发产生圆形切口(约1.5μm直径)(图26(a)和26(b))，其匹配对应的气泡模式。通过倾斜微毛细管使得Ti环的仅一侧与细胞膜发生轻轻接触，在膜中产生约1.5μm“猫门”半月状开口(图26(c))。这些受控的切割模式是高度可再现的。
在另一个示例性的、但是非限制性的构型中，移液管在玻璃毛细管的尖部和外壁上均具有钛涂层。在该情况下，在尖部周围(圆环形)都产生气泡。膜切割被限制在与移液管尖部接触的区域。在该情况下，气泡形状不会随着移液管倾斜或激光偏振而显著变化，在某些实施方案中，这更好地适合用于显微注射。
所述细胞手术工具可以提供穿过特别设定尺寸的膜孔的精确细胞内接近，所述膜孔在操作员确定的时间段内保持开放，或者根据需要快速关闭，对于活细胞操作而言具有最小或没有细胞损伤。所述装置可以用于增加下述操作的效率和成功率：原核DNA显微注射、胚胎干细胞向胚泡中的转移、体细胞核转移、修复或替换其它细胞内细胞器、引入非细胞物质诸如探针等。
用于递送试剂和细胞转染的衬底
在另一个实施方案中，提供了用于将试剂(例如，核酸、蛋白、有机分子、细胞器、抗体或其它配体等)递送进活细胞中和/或从所述细胞提取所述试剂的方法、装置和系统。通常，所述装置包含承载颗粒(例如，纳米颗粒)和/或薄膜(例如，如上所述)的衬底。可以将细胞接种在该衬底上，并任选地培养至汇合培养物形成。在某些实施方案中，脉冲激光器(或其它电磁能源)可以辐照整个衬底，或选择性地辐照所述衬底的一个区域(例如，通过辐照荫罩板，由此将对应的照射图案成像在衬底上)。在暴露于能源(例如，脉冲激光器)的区域中，所述颗粒和/或薄膜由于吸收的能量而被加热至高温。通常，在几纳秒内，所述热会消散进颗粒和/或薄膜附近的液体介质层中，由此产生蒸汽气泡。蒸汽气泡的快速膨胀和随后破裂会产生瞬时流体流，该流体流在附近的细胞上诱导强剪应力，从而造成在细胞膜(和/或细胞壁)中的局部化微孔形成。所以，膜不可透过的分子可以通过流体流或热扩散而被携带进细胞中。由于空化气泡优先形成在颗粒和/或薄膜暴露于能源的地方，可以选择/设计在细胞培养物的特定区域中和/或在指定的时间诱导分子摄取的辐照模式。摄取区域在衬底上的定位可以取决于颗粒/纳米颗粒和/或薄膜的模式与照射模式的组合。类似地，通过照射的定时可以控制摄取的定时。以此方式，通过控制衬底上的颗粒尺寸、材料和/或密度、和/或衬底上的膜材料和/或厚度、能源定时、强度和频率以及辐照模式，可能实现高通量的、空间靶向的和/或时间靶向的分子递送。
在另一个示例性实施方案中，通过将吸收能量的膜和/或微粒或纳米颗粒整合在衬底上和/或微流体结构上，提供了试剂递送平台(例如，转染衬底)。在某些实施方案中，所述纳米颗粒和/或薄膜可以局部化在制造于衬底上的某些部件(例如，微孔、突出物、通道等)处、表面上或附近。在某些实施方案中，所述颗粒/纳米颗粒和/或薄膜被设置在衬底的“顶侧”(细胞设置在此处)上，而在其它实施方案中，额外地或可替换地，所述颗粒/ 纳米颗粒和/或薄膜被设置在衬底的底侧(例如，设置细胞的一侧的对侧) 上。在任一种情况下，所述吸收能量的膜或颗粒(例如，金属颗粒/纳米颗粒和/或薄膜)会强烈吸收具有与表面等离子体频率接近的频率的电磁波，并由于吸收的能量而快速升温，以产生过热现象并蒸发周围介质。例如，在激光脉冲激发以后，在纳米颗粒或薄膜周围产生纳米直径蒸汽气泡，且当与细胞表面接触或在细胞表面附近时，该过程会在细胞膜(和/或细胞壁)中产生受控的、精确设定大小的孔，以允许例如试剂进入或离开。所述空化或“穿孔”过程在几纳秒内完成。所以，膜的其它部分没有时间做出实质反应，且在机械上保持相对稳定。
在某些实施方案中，这样的装置可以包含一个或多个微流体孔(例如，在衬底表面上/在衬底内部/穿过衬底)，并且将吸收能量的膜(例如，Ti膜) 或纳米颗粒设置在所述孔的边缘上和/或在所述孔的侧壁上(或在所述孔的边缘附近)(参见，例如，图14和图18)。在某些实施方案中，所述装置包含微流体孔的阵列(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、50个或更多个、100 个或更多个孔)，并且将吸收能量的微粒或膜设置在所述孔的边缘或侧壁上或所述孔附近。所述孔可以连接至一个通道或连接至多个通道(例如，微流体通道)的网络。可以将细胞设置在孔上或附近。
不受限于特定理论，认为这样的装置中使细胞膜开口存在2种机制。一种机制是细胞膜与颗粒或膜的直接接触(或紧密靠近)，所以空化气泡在紧邻细胞膜处产生并破坏细胞膜。另一种机制是，当细胞膜没有与颗粒和/或薄膜接触时。例如，在细胞和颗粒和/或膜位于衬底的对侧上的情况下，空化气泡会挤压流体穿过空腔/孔，并且形成的液体射流刺穿细胞膜。
在图15中示意地示出了一种这样的衬底(例如，转染衬底)。如该图所示，所述衬底包含孔列，其中每列通过微通道连接。在该示例性的、但是非限制性的实施方案中，提供了2个歧管，它们各自递送试剂到2 个微通道中。在孔附近或包含孔的表面涂有在被照射时会被选择性地加热的薄膜(例如，包含Ti的薄膜)和/或纳米颗粒。可以根据需要照射衬底的选择性区域(例如，照射区域1和2)，以实现试剂向设置在照射区域内的细胞中的递送。尽管图15示出了2个歧管，在不同的实施方案中，预见到更多或更少的歧管。额外地或可替换地，阀系统可以控制试剂向孔的递送。在某些实施方案中，可以去除歧管。
在一个示例性的、但是非限制性的实施方案中，通过将吸收能量的膜和/或微粒或纳米颗粒整合在微流体结构上来提供试剂递送平台。这样的装置可以包含一个或多个微流体孔(例如，在衬底表面上/在衬底内部/ 穿过衬底)，并且将吸收能量的膜(例如，Ti膜)或纳米颗粒设置在所述孔的边缘上和/或在所述孔的侧壁上(或在所述孔的边缘附近)(参见，例如，图14)。在某些实施方案中，所述装置包含微流体孔的阵列(例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、 20个或更多个、50个或更多个、100个或更多个孔)，并且将吸收能量的微粒或膜设置在所述孔的边缘或侧壁上或所述孔附近。所述孔可以连接至一个通道或连接至多个通道(例如，微流体通道)的网络。可以将细胞设置在孔上或附近。
如在图16中示意地示出的，在加热/激发孔(例如，经由激光脉冲处理)以后，在细胞膜和/或细胞壁中形成开口，且微流体通道中的试剂可以通过扩散或者通过将流体泵送穿过微通道(使用例如外部压力源)递送进细胞中。
在不同的实施方案中，所述孔的直径范围为约1μm直到约100μm 或直到约50μm；或约2μm或约5μm直到约20μm或30μm；或约1μm、或2μm、或约5μm、直到约10μm、或约15μm、或约20μm、或约25 μm、或约30μm；或约5μm直到约10μm、15μm或20μm。在某些实施方案中，所述孔的直径为约10μm。
在不同的示例性实施方案中，微流体通道(微通道)具有约1000μm或更小的宽度和/或深度、或约800μm或更小的宽度和/或深度(或直径或特征尺寸)、或约500μm或更小的宽度和/或深度(或直径或特征尺寸)、或约 400μm或更小的宽度和/或深度(或直径或特征尺寸)、或约300μm或更小的宽度和/或深度(或直径或特征尺寸)、或约200μm或更小的宽度和/ 或深度(或直径或特征尺寸)、或约150μm或更小的宽度和/或深度(或直径或特征尺寸)、或约100μm或更小的宽度和/或深度(或直径或特征尺寸)、或约50μm或更小的宽度和/或深度(或直径或特征尺寸)、或约20μm或更小的宽度和/或深度(或直径或特征尺寸)。
通过选择性地辐照/加热某些孔，可以将试剂(例如，如本文中所述的) 选择性地递送给细胞，所述细胞在辐照的/加热的孔的上面或附近。类似地，通过将要递送的物质选择性地提供在适当的微通道中，可以将相同的物质或不同的物质递送给在相同衬底上的不同细胞。
本文中描述的“可寻址的”递送装置/衬底可以用于多种背景中。例如，在高通量系统中，通过简单地将试剂施用给培养基，并辐照(例如，用激光辐射)含有要向其中运输所述试剂的细胞的区域，不同孔或单个孔的不同区域可以使所述试剂选择性地递送进靶细胞中。然后可以洗掉第一种试剂，施加第二种试剂，并辐照不同的区域，由此在培养物的不同位置处产生转染了不同试剂的细胞。这会促进细胞的大量平行处理，从而允许对一种或更多种试剂的时间和空间上可寻址的递送的特别控制。
在某些实施方案中，尽管要转染进细胞中的物质被提供在与衬底上的孔流体连通的微通道中，所述装置不需要在该形式下运行。例如，可以将要转染进细胞中的物质提供在培养基中。在细胞处或附近的区域的选择性加热会在细胞中形成微孔，由此将所述物质转染进细胞中。因而，纳米颗粒或薄膜区域可以是在所述表面的不需要与缝隙/孔关联的部分上。
在某些实施方案中，本文中描述的装置可以与例如其它微流体装置集成，所述其它微流体装置具有用于将特定试剂递送给细胞的泵和阀(例如，在芯片上的实验室)。
本文中描述的实施方案意图是示例性的和非限制性的。使用本文中提供的教导，可以常规地改变这样的“转染衬底”和微流体装置的构型，例如可以改变在衬底上的特征(例如，微孔(孔)尺寸、大小分布、空间分布)、膜和/或纳米颗粒的类型、微流体通道的分布和/或构型等。
能源和选择性照射
取决于材料的选择，通过施用多种方法中的基本上任一种，可以激发(加热)构成本文所述的手术装置和/或衬底的纳米颗粒和/或薄膜。这类方法包括、但不限于：施加微波、激光、非相干的光辐射(例如，红外辐射)、电加热、电子自旋共振(ESR)加热、磁性加热等。在某些示例性实施方案中，通过施加磁场、和/或电场、和/或射频场、和/或光(例如，激光)，完成纳米颗粒和/或薄膜的加热。
例如，金属颗粒/纳米颗粒、和/或薄膜强烈吸收具有与表面等离子体频率接近的频率的电磁波，所述频率通常在可见光和近红外范围内。颗粒、纳米颗粒和薄膜由于吸收的能量而快速地升温，以产生过热现象并蒸发周围介质。
在要选择性地加热手术装置和/或衬底(例如，衬底的一部分)的情况下，应当理解，可以使用局部地/选择性地照射所述装置或衬底的任何方式。因而，例如，在某些实施方案中，通过使用例如聚焦激光、聚焦非相干的光(例如，红外)源，可以完成衬底的特定区域的局部照射。
在某些实施方案中，通过使用罩板(荫罩板)，完成衬底的一个或更多个区域的选择性照射。在某些实施方案中，简单地通过使用透镜和/或镜系统将照射能源(例如，激光)聚焦于特定区域，可以实现局部照射。在某些实施方案中，可以将所述能源聚焦在固定区域并移动衬底(例如，使用可移动的台子或其它操纵器)以实现特定区域的局部照射。所述照射区域可以呈现任何期望的形状。例如，在某些实施方案中，所述照射区域是圆形、正方形、椭圆形、六角形、新月形或任意其它规则的或不规则的形状。在某些实施方案中，同时地或顺序地照射所述衬底的多个区域。
在某些实施方案中，所述能量脉冲(例如，激光脉冲)不仅可以通过静止荫罩板来成形(如在实施例中所证实的)，而且可以使用空间调光器诸如TI的DMD微显示器或LCD显示器通过动态罩板来成形。这会提供向靶细胞中的显微注射的实时和交互控制。
制造
在某些实施方案中，提供了单细胞手术装置，其包含微量移液管，所述微量移液管在尖部处或附近具有可以使用电磁能源(例如，激光)而被加热的颗粒或纳米颗粒和/或薄膜。在不同的实施方案中，提供了细胞转染装置，其包含衬底(例如细胞培养容器、微量滴定板等)，所述衬底包含可以使用电磁能源(例如，激光)而被加热的纳米颗粒和/或薄膜。
本文中描述的微量移液管和“转染衬底”可以使用本领域技术人员已知的方法来制造。例如，在不同的实施方案中，使用例如市售的移液管推拉器制造注射式微量移液管，而衬底可以使用半导体工业中已知的微型制造方法来制造。
微毛细管/微量移液管制造
微毛细管/微量移液管可以从具有下述特征的任意材料制成：其可以被拉伸、蚀刻或以其它方式制造成期望的尺寸，同时提供必需的刚度和耐热性以允许加热和细胞穿透。另外，所述材料优选地对目标细胞是无毒的。在某些实施方案中，所述微毛细管包含诸如玻璃、矿物(例如，石英)、陶瓷、塑料(例如，等)、金属、半导体等材料。
当制造微量移液管时，移液管的横截面形状通常是圆形的。但是，这并不意味着，仅圆形移液管可以用于所述细胞手术工具。可以制造具有其它横截面的微量移液管。例如，可以首先在玻璃或硅晶片上制造具有任意期望的模式(圆形、矩形或三角形)的移液管尖部，然后转移并与注射移液管一起装配。
另外，许多预拉伸的微量移液管是商购可得的(参见，例如，World PrecisionInstruments,Hertfordshire,英国)。
移液管直径是单细胞手术仪器的一个重要参数。本文中描述的单细胞手术仪器的一个优点是，它允许在细胞膜中切开约μm尺寸的孔，并对细胞具有较少的附带损伤。这允许在不杀死细胞的情况下将大尺寸DNA 或其它物质递送进细胞中。为了减少附带损伤，常规微量移液管技术通常要求玻璃移液管的尖部外径小于200nm，以便利跨小哺乳动物细胞的柔性细胞膜的穿透。该限制会极大地限制可以通过常规微量移液管技术递送的颗粒的尺寸。诸如染色体、细胞核、细胞器或其它细胞外物质等物质具有巨大的研究和商业价值，但是经常具有比移液管开口的物理尺寸更大的尺寸，且不可通过常规技术引入细胞中。
本文中描述的“激光”细胞手术移液管为该问题提供了一种独特解决方案，其具有彻底改变整个微量移液管工业的潜力。一般而言，本发明的方法和装置可以有效地将大DNA片段(例如，BAC大小的或更大的 DNA)、细胞核、细胞器和其它大型部分引入细胞中，与其它技术相比更有效且具有更少的细胞损伤。因此，在某些实施方案中，构成本文中描述的单细胞手术工具的微量移液管的尖部直径大于200nm，在某些实施方案中，大于约300nm、大于约400nm、大于约500nm、大于约600nm、大于约700nm、大于约800nm或大于约900nm或1μm。
转染衬底制造
类似地，构成“转染衬底”的衬底可以由任意方便的材料制成，所述材料优选对细胞无毒，且可以承载颗粒、纳米颗粒或薄膜涂层，且可以耐受通过向颗粒、纳米颗粒和/或薄膜施加电磁能而产生的局部加热。合适的材料包括、但不限于：玻璃/二氧化硅、锗、矿物(例如，石英)、陶瓷、塑料(例如，等)、金属、半导体等。
在某些实施方案中，所述衬底构成用于细胞筛选和/或用于细胞培养的容器的表面。这可以包括，例如，用于贴壁或悬浮细胞培养的容器。这还可以包括，微量滴定板(例如，96、384、864、1536个孔等)、微流体装置、高密度(微阵列)衬底、显微镜载玻片或腔室等。
在某些实施方案中，使用半导体工业中已知的技术，制造细胞转染衬底。一个方案示意地显示在图17中。在该示例性实施方案中，通过用 SU-8光致抗蚀剂在玻璃盖玻片衬底上形成图案，制造微流体孔和通道。首先，通过光刻法将底沟限定在100μm高的SU-8 2075光致抗蚀剂层中。将SU-8 2005光致抗蚀剂的另一个薄层(4μm厚)旋转涂布在底层上，并通过第二个光刻步骤限定圆形开口。在形成双层SU-8结构以后，通过在衬底处的电子束蒸发以60度倾斜角将100nm厚的Ti薄膜沉积在该结构上面，以涂布圆形孔的顶部和侧壁。最终的步骤包括：干燥蚀刻顶层Ti，并将微通道连接至外部流体泵。在一个示例性实施方案，底沟是200μm 宽且相距300μm。所述圆形孔具有在10-20μm范围内的直径。这些孔排列为正方形阵列，且间隔100μm。将新月形Ti薄膜涂布在圆形孔的侧壁上。
尽管示出的孔是圆形，它们不需要限于此。使用标准方法(例如，蚀刻方法)，可以产生基本上任意形状(例如，圆形、正方形、五角形、六角形、椭圆形、梯形、不规则形等)的孔。类似地，所述孔的图案形成可以是基本上任意期望的模式。
尽管在某些实施方案中将纳米颗粒和/或薄膜涂布在孔的一部分上 (例如，通过以一定角度沉积膜)，在某些其它实施方案中，用纳米颗粒和 /或薄膜均匀地涂布孔和/或剩余的表面。
颗粒/纳米颗粒/薄膜材料
在不同的实施方案中，构成本文中描述的不同装置的颗粒和/或纳米颗粒或薄膜都由相同材料形成。在其它实施方案中，在特定装置中的颗粒和/或纳米颗粒或薄膜包括不同的材料。因而，例如，给定的装置(例如，移液管或转染衬底)可以包括具有2、3、4、5种或更多种不同类型的颗粒 (例如，颗粒尺寸和/或形状和/或材料)的颗粒/纳米颗粒或薄膜。类似地，构成所述装置的薄膜可以包含多个膜(例如，作为多个层，或作为在微量移液管或衬底上的不同位置处的不同膜)。例如，通过将另一个金属或电介质材料(例如，氧化硅、氮化硅等)层涂布在金属薄膜的顶部以控制热消散途径和控制微气泡膨胀模式(其影响细胞上被衬底加热或移液管尖部损伤的区域的量)，可以改性所述装置。
在不同的实施方案中，在所述微量移液管和/或“转染衬底”上的颗粒/ 纳米颗粒和/或薄膜由金属、金属合金、半导体或通过施加适当的电磁能可以被加热的其它材料制成。在不同的实施方案中，还考虑半导体、金属、金属合金和它们的氧化物和/或氮化物。取决于尺寸、长宽比、膜厚度和/或材料，使用不同的能源(例如，激光、电场、射频场、磁场、超声源等)容易地加热这样的金属。
尽管本文中提供的大部分讨论涉及半导体或金属颗粒/纳米颗粒和/ 或膜，并且实施例描述了金颗粒和/或金或钛膜，但是被能源加热的材料不必限于此。基本上任意的能吸收适当的能量并引起加热的材料都可以用于本文描述的方法和装置中的加热材料。因此，在某些实施方案中，还考虑包含诸如金、银、钽、铂、钯、铑或钛或它们的氧化物、氮化物或合金等材料的纳米颗粒和/或膜。
可用于构成本文中描述的装置和方法的纳米颗粒和/或薄膜中的一种重要材料是钛(Ti)和/或其氧化物、氮化物、合金或掺杂的氧化物、掺杂的氮化物、或它们的合金。在某些实施方案中，构成本文中描述的装置和方法的纳米颗粒和/或薄膜包含钛和/或氮化钛(TiN)，其为非常硬的材料，具有比金高3倍的熔化温度。当涂布在移液管上时，已经使用一个单独的移液管连贯地注射40个细胞，没有观察到任何移液管损伤。这也意味着，TiN涂布的移液管可以潜在地注射数百个或数千个细胞，无需更换移液管。与金涂布的移液管(其可以在1次、2次或几次使用中被强爆炸气泡和高温激发损坏)相比，这是一项重大改进。
TiN的其它变型是本领域技术人员众所周知的。这些包括、但不限于钛碳氮化物(TiCN)和钛铝氮化物(TiAlN)，它们可以单独地使用，或者用在含TiN的交替层中，或者用在含有TiN颗粒的混合颗粒群体中。这些涂层剂会提供耐蚀性和硬度的类似或优越的增强和不同的(甚至可调的) 吸收性能。
如上面指出的，构成本文中描述的装置和/或衬底的颗粒或膜不必限于包含金属的材料。例如，我们已经证实，黑碳也可以在移液管附近诱导爆炸性气泡并杀死或穿透单个细胞。因此，在某些实施方案中，例如，碳纳米颗粒(包括、但不限于碳纳米管)可以用在本文描述的方法和装置中。
在不同的实施方案中，也考虑包含来自周期表的第II、III、IV、V 或VI族的一种或多种物质的颗粒/纳米颗粒和/或薄膜，以及它们的氧化物、氮化物、合金和掺杂形式，和/或考虑过渡金属、过渡金属氧化物、过渡金属氮化物、包含过渡金属的合金或复合材料等。在某些优选的实施方案中，所述纳米颗粒和/或膜包含：II族、III族、IV族、V族物质(例如，碳、硅、锗、锡、铅)，掺杂的II、III、IV、V和VI族元素，或纯的或掺杂的II、III、IV、V或VI族元素的氧化物，或过渡金属，过渡金属氧化物，或过渡金属氮化物。在某些优选的实施方案中，所述颗粒/纳米颗粒和/或薄膜包含III、IV或V族半导体。
从本文的教导应当理解，在某些实施方案中，所述颗粒/纳米颗粒和/ 或薄膜包括一种或多种物质，诸如Si、Ge、SiC、Au、Ag、Cu、Al、Ta、 Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、 Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、和它们的氧化物和氮化物。
如上面指出的，在不同的实施方案中，构成纳米颗粒和/或薄膜的II、 III、IV、V或VI族元素、过渡金属、过渡金属氧化物或氮化物可以是基本上纯的，或者它可以是掺杂的(例如，p型-或n型-掺杂的)和/或合金的。用于与II-VI族元素一起使用、尤其是用于与III、IV和V族元素一起使用、更特别是用于与IV族元素(例如，硅、锗等)一起使用的p型-和n型 -掺杂剂是本领域技术人员众所周知的。这样的掺杂剂包括、但不限于：磷化合物、硼化合物、砷化合物、铝化合物等。
在某些实施方案中，所述颗粒/纳米颗粒和/或膜包含IV族半导体，诸如硅、锗和硅碳化物。这样的半导体的最常见的掺杂剂包括得自III族元素的受体或得自V族元素的供体。这样的掺杂剂包括、但不一定限于硼、砷、磷和罕见的镓。
如上面指出的，在不同的实施方案中，所述颗粒/纳米颗粒包含半导体。许多掺杂的II、III、IV、V或VI族元素是半导体，且包括、但不限于：ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、 CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、GaN、GaP、GaAs、 GaSb、InP、InAs、InSb、AlS、AlP、AlSb、PbS、PbSe、Cd3Sb2、Zn3P2、 Zn3As2、Zn3Sb2、TiO2、TiO2、TiO2、Cu2O、CuO、UO2、UO3、Bi2O3、 SnO2、BaTiO3、SrTiO3、LiNbO3、La2CuO4、PbI2、MoS2、GaSe、SnS、Bi2S3、GaMnAs、InMnAs、CdMnTe、PbMnTe、La0.7Ca0.3MnO3、FeO、 NiO、EuO、EuS、CrBr3、Cu(In、Ga)Se2、Cu2ZnSnS4、CuInSe2、AgGaS2、 ZnSiP2、As2S3、PtSi、BiI3、HgI2、TlBr、Se、Ag2S、FeS2、Ge和Si和它们的三元和四元混合物等。
除了激光能以外，还可以容易地使用磁场、电场和射频场来加热颗粒、纳米颗粒和/或某些薄膜。因而，例如，美国专利公开号2007/0164250 (其通过引用并入本文)提供了磁性纳米颗粒，当将其放在磁场中时，其会在特定磁场频率被选择性地加热，所述磁场频率是它们的尺寸、组成或二者的函数。
在不同的实施方案中，这样的纳米颗粒或膜包含磁性材料(诸如Ferro V磁性颜料)，其当暴露于足够强度的磁场时会转换能量。因而，例如，交替磁场将在颗粒中诱导交流电，从而产生热。可以使用多种磁性材料。这样的材料包括、但不限于磁性材料，诸如Fe-O4、Fe2O3。并且，在某些实施方案中，银、铜、铂、钯等可以构成在本发明的装置中使用的颗粒、纳米颗粒和/或薄膜。在某些实施方案中，所述颗粒、纳米颗粒和/ 或薄膜可以包含TiO2、CeO2、Ag、CuO、钇铝石榴石(YAG)、InO2、CdS、 ZrO2或它们的组合。在另一个实施方案中，任意金属氧化物、金属合金、金属碳化物和/或过渡金属可以用在本发明中。在某些实施方案中，可以涂布所述颗粒，使得所述涂层不会改变它们各自对施加的场的应答性。
在某些实施方案中，在本发明的装置中使用的颗粒、纳米颗粒或薄膜可以由磁性材料制成，而在其它实施方案中，它们可以由顺磁的或超顺磁的材料制成，或者包含顺磁的或超顺磁的材料。
因此，在某些实施方案中，所述颗粒、纳米颗粒和/或薄膜可以包含顺磁的或超顺磁的材料，所述材料可以使用电子自旋共振吸收(SPM)和/ 或铁磁共振来加热。电子自旋共振(ESR)加热和铁磁共振(FMR)加热描述在美国专利公开2006/0269612和2005/0118102中，它们通过引用并入本文。钇铁石榴石Y3Fe5O12和γ-Fe2O3是2种众所周知的适合ESR和/或FMR加热的材料。可以加入不同的掺杂剂以减慢这些材料在不同应用中的自旋共振频率。磁性石榴石和尖晶石在通常环境条件下也是化学惰性的和不可破坏的。
还考虑包含得自周期表的II、III、IV和V族的物质的不同材料和/ 或半导体。
通式{c}3(a)2[d]3O12和尖晶石A[B]2O4铁氧体化合物的潜在稀释离子的示例性列表呈现在表1中。
表1.示例性的铁氧体稀释离子.
所述颗粒或纳米颗粒可以呈现许多可能形态学中的任一种，且仍然适合用于本发明中。因而，例如，本发明考虑使用下述种类的纳米管：单壁的，双壁的，多壁的，具有往复手性，或手性的混合物，扭曲的，直的，弯曲的，扭结的，卷曲的，扁平的，和圆形的；纳米管绳，扭曲的纳米管，编织的纳米管；纳米管的小束(例如，在某些实施方案中，具有许多管，小于约10个)，纳米管的中束(例如，在某些实施方案中，具有许多管，以百计算)，纳米管的大束(例如在某些实施方案中，具有许多管，以千计算)；纳米架(nanotorii)，纳米圈，纳米棒，纳米线，纳米角；空纳米笼，填充的纳米笼，多面的纳米笼，空纳米茧，填充的纳米茧，多面的纳米茧；薄纳米片，厚纳米片，插入的纳米片，纳米锥等。不同的纳米颗粒(纳米结构)可以呈现异质形式。这样的异质形式包括、但不限于这样的结构：其中所述结构的一部分具有某种化学组成，而所述结构的另一部分具有不同的化学组成。一个例子是多壁纳米管，其中不同壁的化学组成可以彼此不同。异质形式也包括不同形式的纳米结构材料，其中超过一种上面列出的形式被连接成更大的不规则的结构。另外，在某些实施方案中，任一种上述材料可以具有裂缝、位错、分支或其它杂质和/或缺陷。
在某些实施方案中，可以调节或优化用于本发明中的所述颗粒或纳米颗粒的尺寸和/或所述薄膜的面积和/或厚度，并反映纳米颗粒或膜材料的选择、激发能量的性质、和激发能量的频率和/或强度。在某些实施方案中，所述纳米颗粒的尺寸范围(例如，长度和/或宽度和/或直径)为约10 至约500nm、优选约20nm至约200nm、更优选约20nm、30nm、40nm 或50nm至100nm或150nm或200nm。在某些实施方案中，用于本发明中的纳米颗粒的尺寸范围为约4nm至约25nm，在另一个实施方案中， 8nm至5nm，在另一个实施方案中，5nm至100nm，在另一个实施方案中，10nm至800nm，在另一个实施方案中，10nm至50nm，在另一个实施方案中，50nm至200nm，且在另一个实施方案中，150nm至500 nm。
在不同的实施方案中，当存在时，金属膜的厚度范围为约1、2、5、 10、50、100、150、200、300、400或500nm至约800nm、1μm、5μm、 10μm、50μm或100μm。在某些实施方案中，金属膜的厚度范围为约2 nm或5nm、10nm、20nm或30nm至约100nm、300nm、500nm、800 nm或1μm。在某些实施方案中，金属膜的厚度范围为1nm至150nm、优选约5nm至100nm、更优选约5nm、10nm或20nm至约50nm、75 nm或100nm。在某些实施方案中，所述金属膜的厚度为约30nm。
在不同的实施方案中，构成本文描述的装置的涂层可以是连续薄膜、分成小域(例如，5nm、10nm、20nm、50nm、100nm、200nm、500nm 域)的薄膜，或者可以包含如本文中所述的离散颗粒或纳米颗粒。颗粒的形状和薄膜的厚度以及颗粒或膜组成将会影响物质的吸收谱和产生期望的局部加热所需的能源和强度。
一般而言，膜厚度和/或颗粒尺寸会影响通过局部加热产生的气泡的尺寸和在气泡附近的微流体流的性质。这决定了产生的剪应力和在细胞中产生的开口的尺寸。一般而言，颗粒越大，产生的气泡越大，对细胞产生的影响越大。薄膜厚度具有与颗粒尺寸类似的效应。膜越厚，产生的气泡越大，在细胞中产生的孔越大。
颗粒/纳米颗粒的制造和将颗粒和/或膜施用于微毛细管和/或转染衬底
制造颗粒或纳米颗粒并将它们沉积在表面上的方法，或者在表面上原位合成这样的颗粒的方法，以及将薄膜沉积在表面上的方法，是本领域技术人员众所周知的。
例如，可以通过任意合适的方法沉积薄膜，所述方法包括、但不限于溅射沉积、化学气相沉积(CVD)、分子束外延(MBE)、等离子体辅助的气相沉积、阴极弧沉积或Arc-PVD、和电子束蒸发沉积。在不同的实施方案中，在单细胞手术装置中，所述膜部分地或完全地覆盖微毛细管的尖部至离尖部最远100μm、50μm、25μm、10μm、或5μm的距离，至离尖部最远1μm的距离，更优选地至离尖部最远800nm的距离，优选地离尖部最远500nm，更优选地离尖部最远300、200、150、100、50 或25nm。还可以将薄膜化学沉积在微毛细管或细胞转染衬底上。
制造颗粒和纳米颗粒的方法也是本领域技术人员众所周知的。这类方法包括、但不限于：燃烧合成(例如，在氧化还原反应中使用氧化剂(例如，金属盐)和燃料(例如，有机化合物))、蒸发/凝结(EC)发生器、喷雾热解(例如，等离子体加工和粉末喷雾)、使用溶液化学的液相方法诸如超临界流体、化学还原或化学氧化、机械合金化、模板方法(例如，在小空隙或区域内形成纳米颗粒.沸石,柱状粘土,纳米孔膜和反胶束)等(参见，例如，美国专利号7,212,284、7,204,999、7,147,712、7,128,891、6,972,046、 6,688,494、5,665,277，它们都通过引用并入本文，和PCT专利申请号 WO/2007/024323，其通过引用并入本文)。纳米角的生产描述在，例如， Berber et al(2000)Physical Review B,62(4):R2291-2294中，而纳米纤维的生产描述在，例如美国专利6,706,248、6,485,858中，它们通过引用并入本文。也参见,Fedlheim and Colby(2001)Metal Nanoparticles:Synthesis Characterization&Applications,Marcel Dekker,Inc.,N.Y.；Baraton(2002) Synthesis,Functionalization and Surface Treatment of Nanoparticles, American ScientificPublishers；Fendler(1998)Nanoparticles and Nanostructured Films:Preparation,Characterization and Applications, Wiley-VCH,N.Y.；等。
在某些实施方案中，在表面活性剂系统中合成纳米颗粒。这样的基于表面活性剂的方法是本领域技术人员众所周知的。在实施例1中示出了一个这样的方案。
更一般而言，在某些实施方案中，通过用有机溶剂(例如，乙醇)还原金属性盐以形成金属胶体，可以形成纳米颗粒(参见，例如，Hirai et al (1979)J.Macromol.Sci.Chem.,A13:727；Hirai et al(1976)Chem.Lett., 905；Toshima and Yonezawa(1992)Makromol.Chem.,Macromol.Symp.,59: 281；Wang and Toshima(1997)J.Phys.Chem.,97:11542,等)。一个示例性方案描述在Pastoriza-Santos和Liz-Marzan(2000)PureAppl.Chem., 72(1-2):83-90。在他们的方案中，在有或没有稳定剂存在下，用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)还原Ag+离子。所述反应导致形成通过静电附着于表面上的银纳米颗粒薄膜或银纳米颗粒的稳定分散体。
在另一个示例性的方案中，可以如下制备磁石纳米颗粒材料：将铁盐与醇、羧酸和胺在有机溶剂中混合，并将混合物加热至200-360℃。通过改变铁盐与酸/胺的比例，或通过用更多的氧化铁涂布小纳米颗粒，可以控制颗粒的尺寸。可以容易地得到尺寸范围为2nm至20nm且具有狭窄尺寸分布的磁石纳米颗粒。所述方法可以容易地扩展至其它基于氧化铁的纳米颗粒材料，包括MFe2O4(其中M是例如Co、Ni、Cu、Zn、 Cr、Ti、Ba、Mg等)纳米材料和氧化铁涂布的纳米颗粒材料。通过用硫醇替代反应混合物中的醇，所述方法也会导致基于硫化铁的纳米颗粒材料的合成。可以将磁石纳米颗粒氧化为γ-Fe2O3或α-Fe2O3，或者可以将其还原为bcc-Fe纳米颗粒，而基于氧化铁的材料可以用于制备基于二价铁的金属性纳米颗粒，诸如CoFe、NiFe和FeCoSmx纳米颗粒(参见，例如，美国专利7,128,891，其通过引用并入本文)。
一种生产金纳米颗粒的方法包括：将金盐溶液与吸附剂混合。将复合物形式的金吸附到吸附剂的表面上。通过筛选、过滤、沉降或其它方法从溶液中分离负载金的吸附剂以后，将所述吸附剂制灰以形成灰。所述灰含有金纳米颗粒和杂质，诸如钠、钾和钙的氧化物。通过使用稀酸溶解，可以除去所述杂质。在除去杂质以后，得到相对纯的金纳米颗粒。可以使用活性炭或金吸附树脂作为吸附剂。通过该方法，还可以容易地生产银或铂族金属纳米颗粒(参见，例如，美国专利号7,060,121，其通过引用并入本文)。
在另一个方案中，使用激光热解可以形成纳米颗粒。常规激光热解方法(经常被称作光热方法)是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，美国专利5,958,348、3,941,567、6,254,928，它们通过引用并入本文,等)。在该方法中，辐射吸收剂或其它前体气态物质会吸收能量(例如，激光)，这导致反应地带中的物质的加热，从而造成反应地带中的化学组分之间的热驱动的化学反应。通常，激光热解方法采用精确限定的热地带(通常 1000～1500℃)，所述热地带例如由激光束穿过化学蒸汽地带而产生，在所述化学蒸汽地带中，气体热反应以形成期望的纳米级微粒材料。与热地带接触的壁的缺失会消除任何污染。
在热解反应中形成的物质通常在重力或气流驱动下离开热地带。所述物质被快速冷却/淬灭，由此形成具有非常均匀的尺寸和形状分布的纳米颗粒。在典型的实施方案中，使用二氧化碳(CO2)激光通过光吸收来直接加热气体分子。使用激光的另一个优点是它的狭窄波谱宽度，这允许光和具有精确吸收波长的分子前体之间的有效偶联(超过消耗的激光功率的15％)。已经使用技术来从金属、金属碳化物、金属氮化物和金属氧化物生产不同的纳米尺寸材料(参见，例如，Haggerty et al(1981)第165-241 页，见:Laser InducedChemical Processes,J.J.Steinfeld；Bi et al(1993)J. Mater.Res.,8(7):1666-1674；Bi et al(1995)J.Mater.Res.10(11): 2875-2884；Curcio et al(1990)Applied SurfaceScience,46:225-229；Danen et al(1984)SPIE,458:124-130；Gupta et al(1984)SPIE,458:131-139；美国专利5,958,348、6,225,007、6,200,674、6,080,337等)。
类似地，最常见的TiN薄膜产生方法是物理气相沉积(PVD，通常是溅射沉积、阴极弧沉积或电子束加热)和化学气相沉积(CVD)。在两种方法中，将纯钛升华，并在高能真空环境中与氮反应。
可以如下制造散装陶瓷物体：将粉末化的金属钛包装成期望的形状，将它压制至适当的密度，然后在纯氮环境中将它点燃。由金属和气体之间的化学反应释放出的热足以将氮化物反应产物烧结为硬的完成品。
通过本领域技术人员已知的许多方法中的任一种，可以将颗粒或纳米颗粒附着于微毛细管或细胞转染衬底。所述颗粒可以简单地原位溅射，在金属胶体形成过程中形成在表面上，在成核颗粒上原位生长，离子附着于表面，或共价偶联至表面，例如，直接地或通过接头/官能化剂(例如， -SH、硅烷(例如，3-氨基丙基三甲氧基硅烷等)，诸如此类。
如在实施例中所示出的，在一个实施方案中，如下制造细胞转染衬底：使用基因枪细胞注射器(BioRad)，将金颗粒直接地轰击到塑料衬底上 (参见，例如，实施例4和图5)。
在另一个方案中发现，加热衬底或微量移液管上的薄膜(例如使用脉冲激光器)可以使薄膜退火成离散的纳米颗粒。因而，如图6所示，制造可以包括：将附着金属(例如钛、铬)层和随后的金(或其它金属)膜层沉积在玻璃或塑料或石英等衬底上。然后加热样品(例如，用激光脉冲辐照)。在足够高的激光能下，所述金属膜熔化，熔化的金属冷凝以在衬底或微量移液管上形成珠子样颗粒(如在图6中的SEM图像中所见)。
被夹在衬底和金层之间的任选附着金属(例如，钛)层在与衬底退火以后会提供金膜以及金珠子的更强附着。在没有附着层存在下，金仍然可以通过激光脉冲或其它加热方法在表面上退火成纳米颗粒珠子。
在另一个方案中，提供了承载薄膜的衬底或微量移液管。然后蚀刻掉薄膜以剩下纳米级尺寸域，其可以通过施加激光或其它能源而被加热。
颗粒阵列制造方法可以扩展至其它微米或纳米制造技术，诸如纳米印刷、电子束平版印刷术和其它。可以用其它聚合物材料(诸如PDMS 或玻璃衬底或硅衬底或其它)替代当前的塑料衬底。
上面描述的制备颗粒和纳米颗粒并将其附着于表面或者在表面上形成薄膜的方法是示例性的，且无意是限制性的。使用本文提供的教导，至多使用例行实验，可以生产其它颗粒、纳米颗粒和薄膜涂布的表面。
与光镊的整合
在非贴壁细胞中的常规显微注射是一个艰苦的过程，因为它需要使用另一个支持移液管来施加抽吸和稳定细胞。以此方式，细胞具有锚定来抵消当移液管穿透细胞膜时由注射移液管施加的力。抽吸压力，注射移液管和支持移液管的相对定位可以引起对脆弱细胞的严重细胞损伤和死亡。一种当前的增加非贴壁细胞的显微注射效率的方法是，在注射之前将它们结合在具有经处理的表面的衬底上，然后从衬底释放它们。该方法不仅引入了对细胞的额外化学处理，而且也是费时的。已经证实光镊会捕获和操作微米大小的和甚至亚微米大小的物体和生物内容物。光镊的捕获力通常是在皮牛顿级别。所以，在常规玻璃微毛细管注射过程中通常不可能使用光镊来锚定非贴壁细胞。
另一方面，等离子体光热移液管(本发明的单细胞手术工具)可以容易地与光镊组合。在该情况下，受操作的细胞会通过光力与注射位置自对齐。在注射过程中，细胞经历微小的剪切力和机械变形，这是保持注射的细胞存活的2个关键参数。光镊整合的激光细胞手术技术具有实现非贴壁细胞的高速和高效显微注射的潜力。
细胞类型
通常，本文描述的方法和装置可以与基本上任意的具有细胞膜的细胞一起使用。另外，所述方法和装置还可以用在具有细胞壁的细胞上。
因而，例如，使用本文描述的装置和方法，已经将表达GFP的质粒注射进贴壁细胞，包括NIH3T3小鼠成纤维细胞、HEK293T胚胎肾成纤维细胞和HeLa宫颈癌细胞。一般而言，据信使用本文描述的装置和方法可以容易地注射任何贴壁的哺乳动物细胞类型，因为：1)对于所有试验的细胞类型而言，在有效穿孔和维持细胞存活力方面被确定为最佳的激光能量密度位于相对狭窄的范围内；和2)通过观察可容易地鉴别用于确定适当注射位置(例如，核周或可能细胞核)的贴壁细胞特征。
淋巴细胞、不同类型的干细胞、生殖细胞和其它细胞是非贴壁的，但是经常合乎需要的是，对这样的细胞注射或执行其它“手术”操作。光镊与如本文中所述的细胞手术工具的整合使得这成为可能。
另外，使用本文描述的方法和装置，给细胞簇内的单个细胞进行注射(诸如培养人胚胎干细胞和维持多能性需要该注射)是可实现的，特别是使用本文描述的方法和装置在干细胞簇的表面上。还认为可能的是，立体定位地注射簇内的特定细胞，这由于多种原因而成为合乎需要的(例如，发育跟踪、建立梯度等)。
可递送的物质
据信，使用本文描述的方法和装置，可能将基本上任何期望的物质递送进细胞中。这样的物质包括、但不限于：核酸、蛋白、细胞器、药物递送纳米颗粒、探针、标记等。已经在至少3种贴壁细胞类型中证实了使用本文所述的方法向细胞中递送质粒DNA。因此，通过本文描述的方法和装置，可以容易地转移任何质粒大小的遗传物质。
BAC(细菌人工染色体)-一种期望的目标，难以转导细胞和用于递送具有尺寸限制的媒介物(质粒、逆转录病毒、慢病毒)，其用于引入大遗传异常或用于跟踪发育过程中受调节的特定基因表达。
因此，认为本文描述的装置和方法可以用于递送完整的或部分的天然或合成染色体。类似于BAC，通过以前的方法不能转导进大部分细胞类型中的大染色体或染色体片段可以通过我们的方法转移进细胞中，例如，以建立人三体性障碍的模型(例如，唐氏综合征和克莱里菲尔特综合征)。
类似地，所述方法可以用于转移细胞核(例如，在体核转移中)，或者可以将其它细胞器(例如，线粒体或纳米工程改造的结构)容易地引入细胞中。
在不同的实施方案中，所述可递送的物质包含试剂，包括、但不限于选自以下的试剂：核酸(包括、例如，载体和/或表达盒、抑制性的RNA (例如，siRHA、shRNA、miRNA等)、核酶、蛋白/肽、酶、抗体、成像试剂、细胞器(例如，细胞核、线粒体、核仁、溶酶体、核糖体等)、染色体、细胞内的病原体、无生命的颗粒，诸如量子点、表面增强的拉曼散射(SERS)颗粒、微珠等。
模块系统
在某些实施方案中，所述衬底(转染衬底)被提供为可以容易地与现有设备整合的“模块”。例如，在某些实施方案中，以可以添加至现有显微镜的载物台或者可以替换所述载物台的形式提供转染衬底。在某些实施方案中，设计所述衬底以替换倒置显微镜(例如，Zeis倒置显微镜)上的 x/y/z载物台。
在某些实施方案中，将所述转染衬底提供为微流体系统(例如，在芯片系统上的实验室)和/或可以与微流体系统整合的模块。
细胞手术系统和图案化的转染系统
在不同的实施方案中，本发明考虑用于细胞手术或图案化的细胞转染的系统。在某些实施方案中，所述细胞手术系统包含如本文中所述的显微手术工具和显微操纵器和/或定位器，以相对于例如细胞精确地定位工具。所述系统可以任选地进一步包含：用于支持细胞的装置(例如，移液管或其它操纵器)，用于通过手术工具向细胞中递送流体和/或气体或工具的装置，用于通过工具从细胞中取出流体、细胞器等的装置等。在某些实施方案中，所述系统可以进一步包含：观察系统(例如，显微镜)、数据/图像获取系统和用于控制观察系统、显微操纵器、数据/图像获取系统的计算机控制系统等。
类似地，在不同的实施方案中，图案化的转染系统包含细胞转染衬底(例如，包含一个或多个表面的培养容器，所述表面承载如本文中所述的颗粒、纳米颗粒和/或薄膜)。所述衬底通常承载细胞和/或细胞培养物。所述系统可以任选地包含用于递送试剂的装置、要转染进细胞中的试剂、用于掩蔽衬底的某些部分免于电磁能源的装置等。
在某些实施方案中，所述系统任选地进一步包括电磁能源，以加热在手术工具或转染衬底上的颗粒、纳米颗粒和/或薄膜。合适的能源包括、但不限于：激光、磁场发生器、射频场发生器等。
在不同的实施方案中，所述系统可以包括控制器(例如，激光控制器)。所述控制器可以被构造成控制显微手术工具和/或转染衬底的照射源的强度和/或持续时间和/或波长和/或照射模式。在某些实施方案中，所述控制器检测和/或控制穿过微通道的试剂流，所述微通道构成转染衬底和/或在其中设置转染衬底的微流体系统。在将转染衬底提供在显微镜(例如，倒置显微镜)上的情况下，所述控制器可以任选地控制显微镜载物台、显微镜焦点和/或从显微镜的图像获取。在某些实施方案中，所述控制器任选地控制微毛细管(其构成显微手术工具)的填充、和/或显微手术工具相对于细胞表面和/或相对于照射的角度、和/或显微手术工具的运动、和/或微毛细管的操作，以将试剂注射进细胞中。在某些实施方案中，所述控制器协调显微手术工具的动作，以及能源对尖部的照射。
试剂盒
在另一个实施方案中，本发明提供了用于执行单细胞手术或试剂向细胞中的图案化递送(图案化转染)的试剂盒。在某些实施方案中，所述试剂盒包含容器，所述容器含有如本文中所述的单细胞手术工具和/或转染衬底。在不同的实施方案中，所述试剂盒可以任选地另外包含本文描述的试剂或装置(例如，试剂、缓冲液、管道、指示器、操纵器等)中的任一种，以执行细胞的单独手术和/或图案化的转染。
另外，所述试剂盒任选地包含标记和/或说明材料，其提供关于本发明的手术工具和/或图案化的转染衬底的使用(例如，所述方法的实施)的指导(即，方案)。在某些实施方案中，所述说明材料描述了本文描述的细胞手术工具用于注射或取出物质、和/或操作细胞组分的用途，和/或转染衬底将一种或更多种试剂递送进细胞中的用途。
尽管所述说明材料通常包含书面的或印刷的材料，但是它们不限于此。本发明考虑能够存储这样的指令和将它们传送给最终使用者的任何介质。这样的介质包括、但不限于：电子存储介质(例如，磁盘、带、盒、芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。这样的介质可以包括提供这样的说明材料的因特网站点的地址。
实施例
提供下述实施例来说明、而不是限制要求保护的发明。
实施例1
细胞手术工具的制造和应用
本实施例涉及新的细胞手术装置，其整合了纳米颗粒光热效应与微毛细管技术。这里提供了概念验证实验结果。常规微毛细管技术是一种用于执行单细胞记录和操作的通用工具。但是，当微毛细管刺穿细胞膜时，它会给细胞带来巨大应激。所以，该操作经常导致细胞死亡，特别是对于小的或机械上脆弱的细胞。
当前的使用激光消融的细胞手术方法(Vogel et al(2005)Appl.Phys. B-LasersO.,81(8):1015-1047)会消除物理应激，但是它们需要非常集中的光和注射式微量移液管在激光焦点处的精确定位。我们在本实施例中描述的细胞手术装置利用在微毛细移液管的尖部上的纳米颗粒的光热效应。随着移液管遇到细胞，激光诱导的纳米颗粒的加热会在细胞膜中产生瞬时的孔。由于加热仅发生在与纳米颗粒接触的膜区域，该装置可以与非聚焦的或轻微聚焦的激光一起运行。以此方式，使不希望的应激最小化。会避免由强激光强度引起的可能化学效应，以确保在研究中的被操作细胞的生物学未受影响。
图1显示了所述细胞手术工具的示意图。将金纳米颗粒涂布在微量移液管的尖部上。贵金属纳米颗粒强烈吸收具有与它的表面等离子体频率接近的频率的电磁波，所述频率通常在可见光和近红外范围内(Hartland (2006)Annu.Rev.Phys.Chem.,57:403-430)。例如，30nm直径金纳米球在它们的消光谱中表现出在532nm附近的波长处的峰。在激光脉冲激发后，所述纳米颗粒由于吸收的能量而快速地升温，从而造成过热现象和周围介质的蒸发。该直接加热或来自爆炸的蒸汽气泡的空化力会导致细胞膜通透性的增加或膜中的“穿孔”。通过激光脉冲能量密度和纳米颗粒尺寸可以控制损伤体积。已经证实，加热的体积会从30nm金纳米球的表面扩展数十纳米，并且所述纳米颗粒在激光脉冲处理以后几纳秒内冷却至平衡温度(Pitsillides et al(2003)Biophys.J.,84:4023-4032,2003； Kotaidis etal(2006)J.Chem.Phys.,124(18),Art.No.184702)。所以，膜或细胞的其它部分没有足够的时间做出反应，且保持在机械上的稳定性。以此方式，微量移液管可以容易地穿透细胞膜，并使细胞损伤最小化。
实验和结果
金纳米棒的合成
在不同的实施方案中，通过使用刚性模板或表面活性剂，可以实现纳米棒的合成。就我们的应用而言，我们采用了表面活性剂途径用于相对容易的合成方法。简而言之，通过Jana et al(2001)J.Phys.Chem.B, 105(19):4065-4067开发的种子介导的生长，产生合成的纳米棒，其中将 3-4nm种子加入生长溶液中，并在存在表面活性剂的情况下老化，以产生具有独特长宽比的纳米棒。除了表面活性剂浓度以外，已经证实通过加入特定量的银离子来控制长宽比(Nikoobakht and El-Sayed(2003)Chem. Mater.15(10):1957-1962)。通过在碳涂布的铜格上的TEM，表征得到的纳米棒溶液。图4显示了具有3.2和5.8的2种长宽比的合成纳米棒。
合成方法
苄基二甲基氯化铵水合物(BDAC)、十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)、L-抗坏血酸、硝酸银(AgNO3)、硼氢化钠(NaBH4)、四氯金酸氢 (HAuCl4-3H2O)获自Sigma Aldrich。在整个实验中使用去离子水(18M)。
种子溶液：
在搅拌下在25℃，将5.0ml 0.20M CTAB与5.0ml 0.0005M HAuCl4混合。将0.60ml冰冷的0.01M NaBH4加入混合物中。由于金的还原，得到的溶液变成黄褐色。将得到的溶液剧烈搅拌2分钟，以确保所有Au已经被还原为Au0。
生长溶液：
混合20.0ml 0.15M BDAC和0.40g CTAB，并在40℃下声处理20 min，以完全溶解CTAB。向4个单独的瓶中，分配200μl 0.004M AgNO3，继之以5ml BDAC/CTAB表面活性剂溶液。这会产生4种不同的生长溶液，进行不同的老化。生长溶液表现出橙色的色彩。向每个瓶中，加入 5.0ml 0.0010M HAuCl4，并轻轻混合，然后加入70μl 0.0778M L-抗坏血酸。在Au3+还原为Au0的过程中，橙色色彩消失。将12μl种子溶液加入每个瓶中。这产生淡红色，这指示至少60％的Au的还原。将得到的溶液老化1小时、24小时、48小时和72小时。
将种子Au直接散布在玻璃上，并随后将移液管浸入生长溶液中以使得Au颗粒变大。
细胞手术工具的应用
在这里描述的实验中，使用具有532nm的波长和5纳秒的脉冲持续时间的脉冲激光器。激光将883J/m2的能量密度递送到5×3mm2的非聚焦点上。使用Xu et al(2004)Chem.Mater.,16(11):2259-2266报道的方法，在玻璃微毛细管上直接合成金纳米颗粒(图2)。使用在RPMI中培养的 Nalm-6细胞(人B细胞前体白血病)。通过在玻璃微量移液管上的纳米颗粒的光热效应，产生细胞膜的高度局部化的瞬时开口，典型开口的尺寸接近于微量移液管尖部尺寸，约2μm(图3 （下图） )。细胞在操作以后保持存活。还进行了对照实验，其中使用相同尺寸的不含金纳米颗粒的玻璃微量移液管。在激光脉冲处理以后，细胞膜立即恢复其形状，且没有表现出孔打开的迹象。我们还研究了导电和导热的无定形碳涂层的激光诱导的光热效应。将无定形碳的薄膜溅射在玻璃微量移液管上。实验结果表明，在相同激光能量密度下的爆炸效应扩展至立即裂解和杀死细胞的大体积 (图3 （中图） )。
结论
本实施例显示了新的利用金属纳米颗粒的光热效应的细胞手术工具，并提供了概念验证实验。与无定形碳涂布的微量移液管造成的立即细胞裂解和杀死相比，使用金-纳米颗粒涂布的微量移液管实现在细胞膜上的局部化的和瞬时的孔打开。
实施例2
质粒DNA转染和表达
我们使用我们的等离子体光热移液管证实了在细胞膜上的孔打开。在这里描述的实验中，使用Q-转换的、双频率的Nd:YAG脉冲激光器，其具有532nm的波长和6ns的脉冲持续时间(Continuum Minilite I)。所述激光在11.8mm2的非聚焦点上递送88.3mJ/cm2的能量密度。通过溅射，将金/钯薄膜沉积在玻璃微量移液管上。使用在DMEM中培养的人胚胎肾HEK293T细胞。通过在玻璃微量移液管上的Au/Pd薄膜的光热效应，造成细胞膜的破裂。对于5nm的膜厚度，膜开口的尺寸接近于微量移液管尖部尺寸，约2μm(参见，例如，图11,图a)。对于具有13nm厚度的膜，在相同激光能量密度下的爆炸效应扩展至立即裂解和杀死细胞的大体积(图11,图b)。还进行了对照实验，其中使用相同尺寸但是没有涂层的玻璃微量移液管。在激光脉冲处理以后，细胞膜没有表现出孔打开或损伤的迹象。
我们还已经证实了编码绿色荧光蛋白(GFP)的质粒向HEK293T细胞中的显微注射。所述质粒是环状DNA链，其在注射进细胞中以后会允许该细胞产生GFP和发绿色荧光。图12、图a显示了显微注射操作。随着光热移液管与细胞膜发生轻柔接触，含有质粒的缓冲液的连续流被射出移液管尖部。在施加激光脉冲以后，所述缓冲液插入细胞中，并立即将移液管移开细胞。受注射的细胞在注射后24小时是存活的，且表达GFP。进行了一个单独的对照实验，其中在不施加激光脉冲的情况下，当移液管与细胞膜接触时，移液管射出含有质粒的缓冲液流。24小时后，没有发现表达GFP的细胞。这直接证实了等离子体光热移液管在细胞膜上成功地打开了孔，所述孔允许质粒流入。所述细胞也活过了该过程并在24 小时以后保持存活。
实施例3
与光镊的整合
在图13中显示了Nalm-6细胞，其当与光热移液管尖部接触时被50 mW、1064nm激光束捕获在N.A.1.3 100×油浸透镜的焦点处。该光镊被构建在用于拍摄光热细胞手术过程的时间分辨图像的相同Zeiss倒置显微镜上。这给我们提供了能够同时执行光捕获、细胞手术和时间分辨成像的集成光系统。由于光热移液管依赖于纳米气泡爆炸来在质膜上打开孔，移液管尖部仅需要轻柔接触细胞。在该情况下，光镊会提供足够的捕获力以在操作过程中保持细胞在原位。除了使从支持移液管和注射移液管向细胞施加的接触力最小化以外，并入光镊的另一个优点是，在操作过程中容易选择、捕获和释放细胞。
实施例4
使用金颗粒涂布的衬底的、光图像图案化的向活细胞中的分子递送
光穿孔(一种用于向细胞中递送分子和基因的方法)利用高度聚焦的脉冲激光束来在细胞膜中产生孔(Vogel et al(2005)Appl.Phys.B-Lasers O.,81(8):1015-1047)。它允许无接触递送和使用飞秒激光，已经证实了靶向单个细胞的100％转染效率(Tirlapurand Konig(2002)Nature418: 290-291)。该方案的一个缺点是，为了得到位点特异性的或图案化的细胞转染，激光束必须扫描穿过每个细胞，这在需要大规模图案化细胞转染 (诸如在复杂组织中)的情况下是耗时的。
另一种增加细胞膜通透性的无接触方法是使用吸光的微粒或纳米颗粒(Pitsillides et al(2003)Biophys.J.84:4023-4032)。在受到短脉冲激光辐照以后，所述颗粒会产生瞬时的且局部化的爆炸气泡，其破坏细胞膜的邻近这些颗粒的部分，并保持其它细胞结构的完整性。通过控制颗粒尺寸、密度和激光能量密度，可以高效率地实现细胞穿透和转染(Yaoet al (2005)J.Biomed.Optics,10(6):064012)。
在这里，我们描述了一种简单装置，其可以通过光图像图案化来在空间上选择和靶向用于分子递送的细胞。我们的方案具有下述潜力：实现大规模的基于图像的、分子和基因向复杂单层混合物内的特定细胞中的确定模式的递送。
原理和装置结构
在某些实施方案中，所述装置由塑料衬底组成，所述塑料衬底具有固定化在表面上的颗粒(例如，金颗粒)(参见，例如，图7)。将细胞接种在该衬底上，例如，直到汇合培养物形成。用脉冲激光器辐照荫罩板，并将对应的照射图案投射在衬底上。在暴露于脉冲激光器的区域中，金颗粒由于吸收的光能而被加热至高温。在几纳秒内，所述热消散至包围金颗粒的薄液体介质层，这会产生爆炸性蒸汽气泡(Kotaidis et al(2006)J. Chem.Phys.,124:184702)。蒸汽气泡的快速膨胀和随后破裂会产生瞬时流体流，该流体流在贴壁细胞上诱导强剪应力，从而造成在细胞膜中的局部化孔形成。所以，膜不可透过的分子可以通过流体流动或热扩散而被携带进细胞中。由于空化气泡仅形成在金颗粒暴露于激光的地方，可以设计光模式以在细胞培养物的特定区域中实现分子摄取。以此方式，通过控制金颗粒尺寸、在衬底上的密度和激发激光能量密度，使得高通量的、空间靶向的分子递送成为可能。
实验和结果
在一个实验中，使用基因枪注射器，在2200psi轰击压力(Bio-Rad, PDS-1000)下，将0.6μm金纳米球(Bio-Rad)轰击在塑料培养皿上。然后将在DMEM中培养的永生化的人胚胎肾细胞(HEK293T)铺板在培养皿中，并温育过夜直到达到约70-80％的细胞汇合度。使用在532nm波长的Q-转换的、双频率的Nd:YAG激光(Continuum,Minilite I)辐照该装置。所述激光具有6纳秒的脉冲宽度和9.4mm2的斑点尺寸。将荫罩板放在光束路径中以投射期望的光图案，所述图案以0.83倍减小成像在装置上。使用图8中描绘的时间分辨成像系统，捕获来自金颗粒的诱导的空化气泡。高速强化CCD照相机(Princeton Instrument,PI-MAXII)会提供短至500 ps的曝光时间。通过光纤延迟线的长度，控制捕获的气泡图像和激发激光脉冲之间的纳秒时间延迟。在激光脉冲处理过程中，将细胞浸入含有1 mg/ml的膜不可透过的荧光染料钙黄绿素(Invitrogen,molwt 622.5)的培养基中。在空化诱导以后，将细胞培养物用磷酸盐缓冲盐水洗涤，并重新浸入新鲜培养基中，然后检查荧光染色。
图9显示了在没有荫罩板的情况下激光脉冲以后78纳秒由加热的金颗粒诱导的空化气泡。颗粒的密度为约0.004颗粒/μm2。这对应于约0.9 气泡/细胞(假定HEK293T细胞的面积是约15x15μm)。在图10中，使用了荫罩板，且仅装置的左半用激光脉冲辐照(虚线对应于荫罩板边界)。激光能量密度是128.2mJ/cm2，并施加7次脉冲。荧光图像清楚地表明，染料摄取图案与光照的区域一致。
结论
这里描述了能够光图案化的分子递送的装置。在贴壁细胞培养物中证实了荧光分子的成功递送。靶向的递送区域由荫罩板控制。该装置具有在活细胞中实现大规模、光图案化的分子和基因递送的潜力。
实施例5
试剂向靶细胞的平行递送
我们通过将吸收光的金属纳米结构整合在微流体结构上，开发了另一种平行递送平台(参见，例如，图14)。示出的装置由微流体孔的阵列组成，所述孔具有在侧壁上的钛涂层。所述孔连接至在下面的微流体通道网络。在激光脉冲处理和细胞膜打开以后，通过用外部压力源泵送流体，可以将在微流体通道中的悬浮的待运物主动递送进在孔顶部的细胞中。
在所述装置上试验了平行气泡激发。通过用激光脉冲(脉冲宽度为6 ns，波长为532nm)辐照该结构，在每个圆形开口中同步地产生气泡。由于新月形Ti薄膜涂层，气泡爆炸仅沿着圆柱形侧壁的某些部分发生(参见，例如，图19)。
为了试验细胞膜打开和待运物递送，将HeLa细胞接种在所述装置上。细胞像常见的那样在SU-8衬底顶部和孔上生长和分裂。以200μg/ml 的浓度，将膜不可透过的绿色荧光FITC-葡聚糖(分子量＝3k Da.)加载进细胞培养基中。在156mJ/cm2激光脉冲处理以后，在生长于圆形孔顶部并进行激光触发的气泡爆炸的细胞中观察到荧光染料摄取(参见，例如，图20)。这里的递送是通过被动扩散。
实施例6
用于向哺乳动物细胞中递送大待运物的光热纳米刀
难以实现弹性的、机械上脆弱的和快速重新密封的哺乳动物细胞膜的受控切割。在该实施例中，我们描述了光热纳米刀，其利用金属纳米结构来收集短激光脉冲能量并将它转化成高度局部化的爆炸性蒸汽气泡，后者通过高速流体流动和诱导的瞬时剪应力快速地刺穿轻微接触的细胞膜。空化气泡模式受金属结构构型和激光脉冲持续时间和能量控制。金属纳米结构与微量移液管整合的纳米刀产生微米大小的膜进入口，用于以高效率(46％)和细胞存活力(>90％)将高度浓缩的待运物(5x 108活细菌/mL)递送进哺乳动物细胞中。还已经将其它生物的和无生命的待运物 (在尺寸上超过3个数量级，包括DNA、RNA、200nm聚苯乙烯珠子，至2μm细菌)递送进多种哺乳动物细胞类型中。总之，所述光热纳米刀是将困难的待运物递送进哺乳动物细胞中的有效方案。
本实施例涉及这样的光热纳米刀，其为与微毛细移液管整合的金属纳米结构(图21)。所述光热纳米刀收集光脉冲能量以触发空间上模式化的、时间上同步化的空化气泡，后者产生高速的局部化的流体流。如果将软物质或脆弱的结构(诸如细胞膜)与光热纳米刀接触，超快的且局部化的流动能够在接触区域附近刺穿膜，并且对结构的其它部分几乎没有机械干扰。通过来自激光诱导的空化气泡的强烈瞬时机械剪应力，产生膜切割(Marmottant and Hilgenfeldt(2003)Nature,423:153-156； Lokhandwalla andSturtevan(2001)Phys.Med.Biol.46:413-437；Hellmanet al(2008)Biophoton.,1:24-35)。由此在细胞膜中产生递送入口，无需使连接的微量移液管前进到细胞中。在切割过程中，刀与膜轻柔接触，从而消除了对在膜下面的强机械支持的需要。该新装置允许以高效率和细胞存活力细胞内递送不同尺寸的物体(从生物分子至细菌)到软哺乳动物体细胞中。
为了演示光热纳米刀，将100nm厚的钛(Ti)薄膜沉积在玻璃微毛细移液管的尖部上，尖部直径为2μm(图22A和22B)。将Ti涂布的微量移液管固定于倒置显微镜载物台上的动力化的显微操纵器臂上。将微量移液管尖部定位成与细胞膜轻轻接触，在532nm波长下的6ns Nd:YAG激光脉冲穿过物镜照射260μm-宽场。脉冲激光器暴露快速地加热Ti和附近的薄水层，以沿着环形Ti薄膜诱导局部化的蒸汽气泡爆炸，其切割接触的细胞膜。该过程(激光脉冲处理、Ti加热、空化气泡膨胀和破裂) 仅需要几百纳秒。压力控制的微量移液管中的流体和待运物的递送与激光脉冲处理和膜切割同步化。
材料和方法
装置制造和实验方案
如下制造钛(Ti)涂布的微量移液管：加热和拉伸(P-97,Sutter Instrument)1mm直径硼硅酸盐玻璃毛细管，随后使用磁控管溅射沉积系统将Ti薄膜沉积在逐渐变细的末端上。使用扫描电子显微镜，定量Ti 涂层厚度和微量移液管尖部直径。激光脉冲系统是在532nm波长和6ns 脉冲宽度运行的Q-转换的、双频率的Nd:YAG激光(Minilite I,Continuum)。
通过使分光板(beam splitter)(其一个臂发送至倒置显微镜 (AxioObserver,Zeiss)的荧光口中，然后穿过物镜(40X,0.6NA))偏振来分隔激光束，以在样品平面上产生260μm宽的激光斑点。用于待运物递送的优化的激光能量密度为180mJ/cm2。建立电开关来使激发激光脉冲与液体注射系统(FemtoJet,Eppendorf)同步化。使用具有短至500ps的曝光时间的强化CCD照相机(PI-MAX2,Princeton Instruments)构建时间分辨成像系统以表征空化气泡动力学。通过照相机控制单元设置接收激光触发信号和照相机快门开口之间的可编程的延迟。在使分光板偏振以后，将激光束的另一臂发送穿过荧光染料细胞。将激发的荧光脉冲(波长中心为约698nm)偶联进多模式纤维中，然后发送穿过显微镜聚光镜以与照相机快门同步地照射样品。通过光纤延迟线的长度控制捕获的气泡图像和样品激发激光脉冲之间的纳秒时间延迟。
在Ti涂布的微量移液管上的强度模式的数字计算
使用3D时域有限差分(FDTD)方法来模拟电磁强度模式(FullWAVE, RSoft DesignGroup)。用水介质区域(n水＝1.34)和玻璃微量移液管(n玻璃＝ 1.46)构建模拟域，所述玻璃微量移液管具有100nm Ti(nTi＝1.86+2.56i) 薄膜涂布的尖部和外侧壁。整个域被完美匹配的边界层包围，以模仿无限延伸的空间。使用平面波激发(λ＝532nm)，其具有沿着y偏振的电场和波载体k，造成相对于移液管尖部的30°角。通过取标准化的电能量密度在一个电磁波振荡内的平均值，得到Ti中的时间平均的强度特性|Eave|2。
确定用于膜切割的光热纳米刀的最佳激光能量密度
研究了最佳激光能量密度、膜打开和维持高细胞存活力的标准。在激光脉冲处理之前，将碘化丙啶(PI)染料加入细胞培养基(10μg/mL)中。使微量移液管与细胞膜接触，并在指定的能量密度水平用激光脉冲照射。在激光脉冲处理以后立即检查经过处理的细胞，以验证PI的摄取。在激光脉冲处理以后90min加入PI，以类似的方式单独确定细胞存活力，随后随时间进行视觉生长检测。
细胞存活力评价
在光热纳米刀切割以后90min，通过膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)细胞染色，确定细胞存活力。为了准确地跟踪注射的细胞，将细胞接种在化学图案化的玻璃盖玻片衬底上(Peterbauer et al(2006)Lab Chip,6: 857-863)。在衬底上限定圆形区域(直径约200μm)以将细胞粘附和生长限制在这些区域内。对于每个实验，使在相同圆形图案内的每个细胞(在一个图案中约60个细胞)经受相同的激光脉冲处理和待运物递送条件。为了排除在图案化的衬底上的培养细胞的存活力效应，通过相同玻璃衬底上的邻近的未处理的图案中的活细胞的百分比，进一步标准化经处理的图案中的活细胞的百分比。通过3个独立实验的平均值，确定递送后存活力。
具有免疫荧光成像的生物分子、羧酸酯珠子和细菌递送
将表达GFP的RNA在1X PBS(pH 7.4)中稀释，并注射进IMR90 原代人肺成纤维细胞中。将编码DsRed的慢病毒DNA与阳离子的100nm 绿色聚苯乙烯珠子一起温育，以允许DNA吸附在球形表面上。然后将珠子悬浮于1X PBS(pH7.4)中，并注射进人胚胎干(hES)细胞中。将hES 细胞解离，并使用ROCK(Watanabe et al(2007)Nat.Biotechnol.25: 681-686)抑制剂在基质胶(BDBiosciences)薄层顶部进行培养。在注射后 24h，验证DsRed表达。将绿色羧酸酯修饰的聚苯乙烯珠子(200nm)悬浮于1x PBS(pH7.4)(0.1％固体体积比)中，并注射进HEK293T细胞中。将荧光泰国伯克霍尔德氏菌细菌悬浮于1X PBS(pH7.4)(浓度108-109 /mL)中，并注射进HeLa细胞。使用不含青霉素和链霉素的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，在带腔室的显微镜载玻片(LabTek,Nunc)中培养细胞。注射后立即将细胞用PBS洗涤3次，并在含有1000mg/mL卡那霉素的新鲜培养基中温育2h，以杀死细胞外细菌。然后用含有5mg/mL头孢他啶的DMEM替代生长培养基以抑制细胞外的细菌生长，并在37℃在5％CO2中温育另外的16-24h。在注射后16-24h，将细胞用4％低聚甲醛固定，并用Alexa-Fluor标记的鬼笔环肽染色以使肌动蛋白细胞骨架显影(Invitrogen)。然后使用Leica SP2AOBS激光扫描共焦显微镜装置，使细胞显影。
细菌菌株和生长条件
在L-培养基中培养泰国伯克霍尔德氏菌和突变体衍生物。
根据需要加入氯霉素(25μg/mL)或四环素(20μg/mL)。
细菌侵入效率测定
在L-液体培养基中将泰国伯克霍尔德氏菌E264培养至1.0的光密度 (OD600)(4x108CFU/mL)。在37℃，以10:1的感染复数(MOI)，用细菌感染在12-孔平板中培养的共计1x105个HeLa细胞2h。然后将感染的细胞用PBS洗涤，并与含有400μg/mL卡那霉素的新鲜培养基一起温育 15min以杀死细胞外的细菌，随后用含1％Triton X-100的PBS裂解。将感染的HeLa细胞裂解物的系列稀释液涂布在L-琼脂上，并通过测定CFU 来确定细胞内细菌的数目。
结果和讨论
在光热纳米刀上的光强度图案的模拟
空化气泡图案由薄膜组成和构型以及激光激发参数(包括波长、脉冲持续时间和能量)控制。图22C显示了使用3D时域有限差分(FDTD) 模拟计算的在激光激发的、Ti涂布的微量移液管上的强度图案。以相对于尖部30°角度照射Ti涂布的微量移液管。对于线性偏振光而言，等离子体增强的光吸收(∝|Eave|2)在2μm宽Ti环内是不均匀的(图22D)。高强度区域沿着波偏振方向集中在环的边缘处。在Ti环中的温度分布不仅由在这些高强度区域中产生的热控制，而且由激光脉冲处理过程中向冷却金属区域和周围介质的热扩散控制。在微量移液管上的Ti膜中，估测的热扩散长度(约(Dτ)1/2)在6ns内是230nm。这导致沿着整个环形移液管尖部的更平滑的温度曲线。结果，从Ti膜传导走的热能会将邻近的薄水层加热到临界温度以上(Kotaidis et al(2006)J.Chem.Phys.124:184702)，从而在环形的微量移液管尖部上产生蒸汽纳米气泡(图23A)。
空化气泡诱导的膜切割和对应的细胞存活力
对于微米大小的待运物向活哺乳动物细胞中的递送，希望瞬时膜入口以容纳待运物尺寸。此外，优选地含有损伤地带以允许细胞修复和维持存活力。图23A显示了激光脉冲辐照以后70ns在倾斜的Ti涂布的微量移液管的尖部处的空化气泡。当使尖部与细胞膜接触时，观察到气泡尺寸的急剧下降，因为该相互作用会阻碍气泡膨胀。在该情况下，气泡在70ns中生长至距离尖部边缘400nm的最大半径，并在激发激光脉冲以后200ns内完全破裂(图23A和23B)。刀尖部从未进入细胞，所以保留了细胞内的结构完整性，这有助于培养快速的修复性孔重新密封，如持久的细胞存活力所证实的(图23C)。在激光脉冲处理以后90min，通过膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)排除染色，确定细胞存活力。在这些条件下，用单独的激光脉冲处理和气泡爆炸(在180mJ/cm2的最佳能量密度)，或者当与缓冲液向HeLa或HEK293T细胞中的注射偶联时，得到了>90％的细胞存活力。在24h内对光热纳米刀处理过的细胞的监测表明，细胞保持存活，且像通常一样继续生长和分裂。
由光热纳米刀实现的生物分子和细菌递送
我们使用光热纳米刀在不同细胞类型上试验了递送的待运物尺寸范围。将表达GFP的RNA有效地递送进lipofectamine抗性的IMR90原代人肺成纤维细胞中，并在注射以后在ROCK38抑制剂分散的人胚胎干细胞中成功地表达了涂布在100nm绿色荧光聚苯乙烯珠子上的含有DsRed 的慢病毒。像微米大小的细菌一样，没有堵塞地递送了200nm直径的荧光珠子(图24)。我们进一步评价了细胞内的细菌，作为通过该方案递送的最大的且最脆弱的待运物(图25)。泰国伯克霍尔德氏菌是一种测量为约0.7μm x 2μm的杆状细菌。为了确定注射效率，以约5x 108/mL的浓度(比常规显微注射高2个数量级)，将GFP-标记的细菌悬浮于缓冲液中(Goetz et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,98:12221-12226)。在实现高递送效率时，高待运物浓度是关键性的，因为递送进细胞中的液体体积限于约1pL。如果没有高浓度，注射1个细菌/注射的频率较低。在我们的实验中，在激光脉冲处理和细胞膜打开以后，将1-5pL细菌溶液射出移液管，这对应于约1个细菌/注射的平均值。并非所有射出的溶液都被递送进细胞中，因为移液管尖部与细胞膜轻轻接触，且移液管的孔在切割以后没有膜完美密封。在该条件下，我们从多个独立实验得到了 46％的平均递送效率。
我们进一步评价了天然细菌在HeLa细胞中的侵入效率，其中将所述细胞与泰国伯克霍尔德氏菌一起温育2h。光热注射的递送效率比0.8％的泰国伯克霍尔德氏菌的天然HeLa细胞感染性高2个数量级。重要的是，细菌保持存活，且被保护免于玻璃移液管内的气泡循环过程中的破坏和免于通过大口径尖部开口注射过程中的剪切，正如转移后24h在被注射的细胞中的细菌繁殖和肌动蛋白聚合所证实的(Stevens et al(2005)J.Bacteriol.,187:7857-7862)(图25C)。
光热纳米刀的可靠性评价
为了稳健的操作，希望金属薄膜耐受高温和来自冲击波的强压力以及由空化气泡产生的高速流。由于Ti与其它惰性金属(诸如金)相比更高的熔化温度和向玻璃衬底的强附着力，选择Ti作为涂布材料(Benjamin and Weaver(1961)Proc.R.Soc.London,Ser.A,261:516-531)。在我们的实验中已经证实，金涂布的微量移液管由于薄膜损伤在几个激光脉冲后失效。我们证实，Ti涂布的微量移液管在至少50个激光脉冲处理和气泡爆炸循环中保持功能性。
结论
在本实施例中描述的光热纳米刀具有将目前不可转移的大待运物 (诸如染色体、细胞器和细胞内的病原体，它们超过了当前的递送方案的尺寸约束)递送进哺乳动物细胞中的前景。光热纳米刀的另一个优点是，它易于使用。由于膜切割受激光脉冲能量和Ti涂层构型控制，使用者简单地将微量移液管尖部定位成与细胞膜轻微接触以实现递送。相反，对于常规的玻璃微毛细管显微注射而言，玻璃针进入细胞中的方式(例如，速度、力、角度)会强烈影响递送效率和细胞存活力。所以，常规方法需要使用者具有大量训练和经验以变得熟练。使用光热纳米刀，还存在很少的破坏脆弱的微量移液管尖部的机会，因为它不需要微量移液管的穿透和离开细胞的快速“往复(zig-zag)”运动。在当前的论证中，光热纳米刀不在任何特定表面等离子体共振模式下运行。进一步优化金属纳米结构以匹配激发激光波长，可以降低用于激发空化气泡的阈值激光能。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于例证目的，并且提示本领域技术人员可以以此为依据进行各种变型或改变，且它们包括在本申请的精神和范围和所附权利要求范围内。本文引述的所有出版物、专利和专利申请通过参考引用为所有目的整体并入本文。

Claims (59)

1.用于将试剂递送至细胞的装置，所述装置包括：
容器表面，所述表面承载当暴露于激光或非相干光源时会升温的材料的纳米颗粒和/或薄膜；
其中所述表面包含多个孔，并且所述纳米颗粒或薄膜被沉积在所述孔中的至少一个的表面上和/或在所述孔中的至少一个附近，并且其中所述装置被构造成通过所述孔递送所述试剂，以便当所述纳米颗粒或薄膜被所述激光或非相干光源加热时将所述试剂选择性递送至所述孔处的细胞或所述孔附近的细胞。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述表面包括培养容器的表面。
3.根据权利要求1所述的装置，其中所述容器包括微定量滴定板。
4.根据权利要求1所述的装置，其中所述表面包括微量滴定板中的孔的壁和/或底、硅或玻璃晶片、显微镜载玻片、细胞培养容器或在微流体装置中的腔室或通道。
5.根据权利要求1所述的装置，其中所述表面包括腔室的表面，所述腔室被构造成含有细胞且被设置成用于显微镜观察。
6.根据权利要求5所述的装置，其中所述腔室具有开放顶部。
7.根据权利要求5所述的装置，其中所述腔室具有封闭所述腔室的顶部。
8.根据权利要求1所述的装置，其中所述表面包含选自玻璃、矿物和塑料的材料。
9.根据权利要求1所述的装置，其中所述表面包含至少5个孔，其中所述纳米颗粒和/或薄膜被沉积在所述孔的表面和/或所述孔附近。
10.根据权利要求1所述的装置，其中所述表面包含至少10个孔，每个孔包含承载薄膜的表面，和/或具有设置在所述孔附近的所述薄膜。
11.根据权利要求1所述的装置，其中所述表面包含至少20个孔，每个孔包含承载薄膜的表面，和/或具有设置在所述孔附近的所述薄膜。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的装置，其中所述孔全部都位于所述表面的2cm2或更小的区域内。
13.根据权利要求9-11中任一项所述的装置，其中所述孔全部都位于所述表面的1.5cm2或更小的区域内。
14.根据权利要求9-11中任一项所述的装置，其中所述孔全部都位于所述表面的1cm2或更小的区域内。
15.根据权利要求9-11中任一项所述的装置，其中所述孔全部都位于所述表面的0.5cm2或更小的区域内。
16.根据权利要求9-11中任一项所述的装置，其中所述纳米颗粒和/或薄膜被设置在所述孔的每一个的100μm内。
17.根据权利要求9-11中任一项所述的装置，其中所述纳米颗粒和/或薄膜被设置在所述孔的每一个的50μm内。
18.根据权利要求9-11中任一项所述的装置，其中所述纳米颗粒和/或薄膜被设置在所述孔的每一个的20μm内。
19.根据权利要求9-11中任一项所述的装置，其中所述纳米颗粒和/或薄膜被设置在所述孔的每一个的10μm内。
20.根据权利要求1所述的装置，其中所述纳米颗粒和/或薄膜被沉积在所述孔的壁上和/或全部都在所述孔的边缘周围。
21.根据权利要求1所述的装置，其中所述纳米颗粒和/或薄膜在所述孔的壁或边缘的一个区域上。
22.根据权利要求1所述的装置，其中所述纳米颗粒和/或薄膜被沉积在所述表面的正面上和/或孔的边缘上，所述表面的正面和/或孔的边缘在设置细胞的一侧的同侧。
23.根据权利要求9-11中任一项所述的装置，其中所述纳米颗粒和/或薄膜被沉积在所述表面的正面上和/或孔的边缘上，所述表面的正面和/或孔的边缘在设置细胞的一侧的同侧。
24.根据权利要求1所述的装置，其中所述纳米颗粒和/或薄膜被沉积在所述表面的正面上和/或孔的边缘上，所述表面的正面和/或孔的边缘在设置细胞的一侧的对侧。
25.根据权利要求9-11中任一项所述的装置，其中所述纳米颗粒和/或薄膜被沉积在所述表面的正面上和/或孔的边缘上，所述表面的正面和/或孔的边缘在设置细胞的一侧的对侧。
26.根据权利要求1所述的装置，其中所述纳米颗粒和/或薄膜包括薄膜。
27.根据权利要求9-11中任一项所述的装置，其中所述纳米颗粒和/或薄膜包括薄膜。
28.根据权利要求1所述的装置，其中所述纳米颗粒和/或薄膜包括纳米颗粒，且所述纳米颗粒的尺寸范围为5nm至500nm。
29.根据权利要求9-11中任一项所述的装置，其中所述纳米颗粒和/或薄膜包括纳米颗粒，且所述纳米颗粒的尺寸范围为5nm至500nm。
30.根据权利要求1所述的装置，其中所述纳米颗粒和/或薄膜包含选自以下的材料：过渡金属、过渡金属合金、过渡金属氮化物和过渡金属氧化物。
31.根据权利要求9-11中任一项所述的装置，其中所述纳米颗粒和/或薄膜包含选自以下的材料：过渡金属、过渡金属合金、过渡金属氮化物和过渡金属氧化物。
32.根据权利要求1所述的装置，其中所述纳米颗粒和/或薄膜包含选自以下的材料：金、钛(Ti)、TiN、TiCN和TiAlN。
33.根据权利要求1所述的装置，其中所述孔中的一个或多个与腔室流体连通，所述腔室含有要递送进细胞中的试剂。
34.根据权利要求33所述的装置，其中所述装置包含微通道，且所述孔中的一个或多个与所述微通道流体连通。
35.根据权利要求34所述的装置，其中所述装置包含多个微通道。
36.根据权利要求35所述的装置，其中不同的微通道与不同的孔流体连通。
37.根据权利要求36所述的装置，其中所述装置包含歧管和/或阀，以将流体递送至不同的微通道。
38.根据权利要求34所述的装置，其中所述微通道含有要递送进所述细胞中的试剂。
39.根据权利要求38所述的装置，其中所述试剂选自：核酸、蛋白、细胞器、病原体、和微粒。
40.根据权利要求38所述的装置，其中所述试剂选自核酶、染色体、肽和纳米颗粒。
41.根据权利要求38所述的装置，其中所述试剂选自酶和抗体。
42.根据权利要求34所述的装置，其中所述微通道在泵控制下被增压或通过重力进料而补料。
43.根据权利要求34所述的装置，其中所述装置进一步包含控制器，所述控制器监测和/或控制所述微通道中的流动，并控制定时，且任选地控制所述表面的照射位置。
44.根据权利要求1所述的装置，其中所述装置被构造成替代倒置显微镜上的载物台。
45.根据权利要求1所述的装置，其中将细胞设置在所述表面上。
46.根据权利要求45所述的装置，其中将所述细胞设置在所述衬底中的孔的表面上或附近。
47.用于将试剂选择性地开放递送进细胞中的系统，所述系统包含：
根据权利要求1-42中任一项所述的装置；
能够加热所述纳米颗粒或薄膜的激光或非相干光源；以及
控制器，其被构造成控制所述激光或非相干光源对所述容器表面的照射定时和/或位置。
48.根据权利要求47所述的系统，其中所述激光或非相干光源包括激光。
49.根据权利要求47所述的系统，其中所述系统包含镜系统或罩板和/或定位系统，以将电磁能导向所述表面的特定区域。
50.根据权利要求47所述的系统，其中所述系统包含透镜系统。
51.根据权利要求47所述的系统，其中所述控制器控制所述激光或非相干光源的照射定时和/或模式。
52.根据权利要求47所述的系统，其中所述控制器被构造成：
控制一个或多个微通道中的流动；和/或
控制所述激光或非相干光源的强度和/或持续时间和/或波长；和/或
控制所述表面的照射位置和/或模式；和/或
检测和/或控制穿过所述微通道的试剂流；和/或
在将所容器设置在显微镜上的情况下，所述控制器能够控制显微镜载物台、显微镜焦点和/或从显微镜的图像获取。
53.将试剂递送进细胞中的方法，所述方法包括：
将细胞提供在根据权利要求1-42中任一项所述的装置上和/或根据权利要求47-52中任一项所述的系统中，其中所述细胞设置在所述表面上；
使所述细胞与所述试剂接触；和
将所述表面的一个区域暴露于电磁辐射，由此诱导所述薄膜和/或颗粒的加热，其中所述加热会形成气泡，所述气泡在被加热的区域或附近的细胞的膜中产生开口，从而导致所述试剂向那些细胞中的递送。
54.根据权利要求53所述的方法，其中通过将所述试剂提供在包围所述细胞的培养基中，使所述细胞与所述试剂接触。
55.根据权利要求53所述的方法，其中通过将所述试剂提供在存在于所述表面的一个或多个孔中，使所述细胞与所述试剂接触。
56.根据权利要求55所述的方法，其中通过将所述试剂提供在一个或多个与所述孔流体连通的微流体通道中，使所述细胞与所述试剂接触。
57.根据权利要求56所述的方法，其中将不同的试剂引入不同的孔中。
58.根据权利要求53所述的方法，其中所述暴露包括：将所述表面的一个区域暴露于激光脉冲或非相干光源。
59.根据权利要求53所述的方法，其中所述试剂选自：核酸、染色体、蛋白、标记、细胞器和小有机分子。
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