JP6680993B2 - ピペットホルダ、マイクロマニピュレータ、及びマイクロインジェクションシステム - Google Patents

Description

本発明は、ピペットホルダ、マイクロマニピュレータ、及びマイクロインジェクションシステムに係り、更に詳しくは、ホールド用及びインジェクション用の各ピペットを保持するピペットホルダ及びマイクロマニピュレータ、並びにマイクロマニピュレータを備えるマイクロインジェクションシステムに関する。

従来、マイクロインジェクション法を用いた顕微授精（ＩＣＳＩ：Intracytoplasmic sperm injection）を行う際には、卵母細胞を観察するための顕微鏡、卵母細胞を保持する微細なガラス管（以下、ピペットと称する）を操作するためのホールド用マニピュレータ、及び卵母細胞に精子を注入するピペットを操作するためのインジェクション用マニピュレータを備えたマイクロインジェクションシステムが用いられている。

この種のマイクインジェクションシステムにおいて、浮遊細胞である卵母細胞内への精子の注入を容易且つ確実に行うために、ホールド用及びインジェクション用の各ピペットを同軸的に配置したものが知られている（例えば特許文献１参照）。

上記特許文献１に開示されるシステムでは、ホールド用ピペットの内径側にインジェクション用ピペットが配置されるため、各ピペットの取り付けに高精度が要求される。

特開昭６０−５０１６８７号公報

本発明の第１の態様によれば、細胞に対する吸引動作により前記細胞を保持するホールド用ピペットを保持する第１ホルダと、前記細胞への前記吸引動作により前記細胞に作用する力に対向する方向から前記細胞内に挿入されるインジェクション用ピペットを保持する第２ホルダと、前記ホールド用ピペットにより保持された前記細胞内へ前記インジェクション用ピペットが挿入されるように、前記第１ホルダと前記第２ホルダとの一方のホルダを他方のホルダに対して相対移動させる駆動部と、を備え、前記駆動部は、前記ホールド用ピペットにより前記細胞が保持される保持領域に対して前記インジェクション用ピペットによる前記細胞への挿入領域が重ならないように、前記一方のホルダを移動させるマイクロマニピュレータ用のピペットホルダが、提供される。
本発明の第２の態様によれば、細胞に対する吸引動作により前記細胞を保持するホールド用ピペットを保持する第１ホルダと、前記細胞への前記吸引動作により前記細胞に作用する力に対向する方向から前記細胞内に挿入されるインジェクション用ピペットを保持する第２ホルダと、前記ホールド用ピペットにより保持された前記細胞内へ前記インジェクション用ピペットが挿入されるように、前記第１ホルダと前記第２ホルダとの一方のホルダを他方のホルダに対して相対移動させる駆動部と、を備え、前記第１ホルダに複数の前記ホールド用ピペットが装着され前記細胞上の複数領域に対して吸引動作が行われる場合、前記第１および第２ホルダは、前記複数領域に対して前記インジェクション用ピペットによる前記細胞への挿入領域が重ならないように前記複数のホールド用ピペット及び前記インジェクション用ピペットを保持するピペットホルダが、提供される。

本発明の第３の態様によれば、第１又は第２の態様に係るピペットホルダと、前記第１ホルダに保持されるホールド用ピペットと、前記第２ホルダに保持されるインジェクション用ピペットと、を備えるマイクロマニピュレータが、提供される。

本発明は、第４の態様によれば、第２の態様に係るマイクロマニピュレータと、前記マイクロマニピュレータを操作するための入力装置と、前記細胞が載置されるステージを含む顕微鏡装置と、を備えるマイクロインジェクションシステムが、提供される。

一実施形態のマイクロインジェクションシステムの構成を概略的に示す図である。 図１のマイクロインジェクションシステムが備えるピペットホルダの概念図である。 一実施形態に係るピペットホルダの内部構造図である。 図４（ａ）及び図４（ｂ）は、ピペットホルダにおけるピペットの取り付け構造を示す図（その１及びその２）である。 ホールド用及びインジェクション用の各ピペットの位置関係を説明するための図である。 卵母細胞を保持したペトリ皿の平面図である。 一実施形態に係るマイクロインジェクションシステムを用いた顕微授精の手順を示すフロー図である。 図８（ａ）〜図８（ｃ）は、卵母細胞内に精子を注入する際のホールド用及びインジェクション用の各ピペットの動作を説明するための図（その１〜その３）である。 図９（ａ）〜図９（ｃ）は、ホールド用及びインジェクション用の各ピペットの変形例（その１〜その３）を示す図である。

以下、一実施形態について、図１〜図８（ｃ）を用いて説明する。

図１には、一実施形態に係るマイクロインジェクションシステム１０の構成が概略的に示されている。本実施形態では、一例としてマイクロインジェクションシステム１０が、顕微授精（ＩＣＳＩ）に用いられる場合について説明する。

マイクロインジェクションシステム１０は、倒立顕微鏡装置２０、該倒立顕微鏡装置２０に取り付けられたマイクロマニピュレータ装置３０、該マイクロマニピュレータ装置３０を操作するための操作系４０などを備えている。図１において、倒立顕微鏡装置２０のステージ装置２６上には、顕微授精による操作対象細胞である卵母細胞Ｏを保持したペトリ皿９０（シャーレとも称される）が載置されている。ここで、本実施形態において、ステージ装置２６は、水平面に平行に配置されている。以下、ステージ装置２６の上面（水平面）に直交する方向をＺ軸方向として説明する。また、倒立顕微鏡装置２０は、水平面内の所定方向に離間して配置された一対の接眼レンズ２２ａを備えている。以下、水平面内で上記所定方向に平行な方向をＸ軸方向と称するとともに、水平面内でＸ軸に直交する方向をＹ軸方向として説明する。

倒立顕微鏡装置２０は、本体部２２、照明系２４、ステージ装置２６などを備えている。なお、本実施形態の倒立顕微鏡装置２０の構成は、例えば米国特許第８，２８４，４８１号明細書などに開示されるものと同等であることから、詳細な説明は省略し、以下簡単に説明する。

本体部２２は、倒立顕微鏡装置２０のベースとなる部分であり、上述した一対の接眼レンズ２２ａは、本体部２２に取り付けられている。照明系２４は、本体部２２の上方に配置され、該本体部２２に支柱２８を介して接続されている。照明系２４が有する光源（不図示）からの照明光は、ステージ装置２６上に載置された観察対象物（本実施形態では、ペトリ皿９０内の卵母細胞Ｏ）を照明する。ステージ装置２６は、本体部２２と照明系２４との間に配置され、ペトリ皿９０の位置決めを行うためのＸＹステージなどを備えている。その他、図示が省略されているが、倒立顕微鏡装置２０は、コンデンサ、対物レンズ、各種フィルタ、オートフォーカス装置、外部出力ポート、操作ボタンなどを備えている。

マイクロマニピュレータ装置３０は、後述するピペットホルダ５０の位置決めを行うための装置であり、倒立顕微鏡装置２０に取り付けられ（固定され）ている。マイクロマニピュレータ装置３０の倒立顕微鏡装置２０に対する取り付け構造は、特に限定されず、マイクロマニピュレータ装置３０は、例えば支柱２８に対して取り付けられても良いし、ステージ装置２６に対して取り付けられても良い。

マイクロマニピュレータ装置３０は、ピペットホルダ５０が接続される部分である接続部３２、協働して接続部３２を６自由度方向に駆動するための並進移動部３４、及び回転移動部３６を備えている。並進移動部３４は、接続部３２及び回転移動部３６をＸ軸、Ｙ軸、及びＺ軸方向に適宜、所定のストロークで駆動するための電動マニピュレータを備えている。また、回転移動部３６は、接続部３２をＺ軸に平行な軸線周り方向（図１の矢印Ａ参照）に回転駆動するための電動マニピュレータ、及び接続部３２をＸＹ平面に平行な軸線周り方向（図１の矢印Ｂ参照）に駆動するための電動マニピュレータを備えている。なお、マイクロマニピュレータ装置３０の構成は、適宜変更が可能であり、例えばピペットホルダ５０の駆動方向は、５自由度以下であっても良い。また、上記６自由度方向のうちの一部の方向への駆動（位置決め）は、電動マニピュレータによらず、手動により行っても良い。

ピペットホルダ５０は、上述したマイクロマニピュレータ装置３０に着脱可能に取り付けられている。以下、ピペットホルダ５０について、図２〜図５を用いて説明する。

図２には、本実施形態に係るピペットホルダの概念図が示されている。ピペットホルダ５０は、少なくとも１本（本実施形態では、例えば１本）のホールド用ピペット９２、及び１本のインジェクション用ピペット９４を保持する保持部材５４を備えている。ホールド用ピペット９２とインジェクション用ピペット９４は、ガラス管である。なお材質は、ガラスに限られず、例えば樹脂でもよい。ピペットホルダ５０では、保持部材５４の少なくとも一部がアクチュエータにより駆動されることにより、インジェクション用ピペット９４が、細胞（本実施形態では、例えば卵母細胞（図１参照））に対して相対移動し、該インジェクション用ピペット９４の先端部が細胞内に挿入される。

なお、例えば、ホールド用ピペット９２が細胞を保持している状態でインジェクション用ピペット９４が図２の黒矢印の方向に移動し、該インジェクション用ピペット９４の先端部が細胞内に挿入されるようにしてもよい。また、ホールド用ピペット９２が細胞を保持している状態で、ホールド用ピペット９２が図２の白矢印の方向に移動し、該インジェクション用ピペット９４の先端部が細胞内に挿入されるようにしてもよい。さらに、ホールド用ピペット９２が細胞を保持している状態で、ホールド用ピペット９２とインジェクション用ピペット９４の両方が移動して、該インジェクション用ピペット９４の先端部が細胞内に挿入されるようにしてもよい。

次に本実施形態に係るピペットホルダ５０の具体的な構成について図３〜５を用いて説明する。図３には、ピペットホルダ５０の断面図が示されている。また、図４（Ａ）及び図４（Ｂ）には、ピペットホルダ５０におけるピペットの取り付け構造が示されている。また、図５には、ホールド用ピペット９２とインジェクション用ピペット９４との位置関係が示されている。

なお、図１に示されるように、ピペットホルダ５０に保持されるホールド用、及びインジェクション用の各ピペット９２、９４は、実際には、それぞれの長軸方向がＸＹ平面に対して所定の角度を成した状態でマイクロマニピュレータ装置３０に取り付けられるが、図３〜図５では、便宜上、各ピペット９２、９４の長軸方向が、それぞれＸ軸に平行とされた状態が示されている。

図３に示されるように、ピペットホルダ５０は、マイクロマニピュレータ装置３０の接続部３２に対して接続される接続部５２、ホールド用ピペット９２の他端（卵母細胞Ｏ（図１参照）を保持する側とは反対側の端部）、及びインジェクション用ピペット９４の他端（卵母細胞Ｏに挿入される側とは反対側の端部）それぞれを着脱可能に保持する保持部材５４を備えている。本実施形態において、保持部材５４は、ホールド用ピペット９２を保持する部分である第１ホルダ５４Ａ、及びインジェクション用ピペット９４を保持する部分である第２ホルダ５４Ｂを含む。なお、保持部材５４と接続部５２は、別部材でもよいし、一体型の部材でもよい。

また、マイクロマニピュレータ装置３０は、第１ホルダ５４Ａをホールド用ピペット９２の長軸方向（図３ではＸ軸方向）に駆動するための第１リニアアクチュエータ３８を備え、ピペットホルダ５０は、第２ホルダ５４Ｂの一部を第１ホルダ５４Ａに対して（インジェクション用ピペット９４をホールド用ピペット９２に対して）インジェクション用ピペット９４の長軸方向（図３ではＸ軸方向）に駆動するための第２リニアアクチュエータ６２などを備えている。なお、第１リニアアクチュエータ３８は、ピペットホルダ５０が備えていてもよい。また、第１リニアアクチュエータ３８によるホールド用ピペット９２を保持する第１ホルダ５４Ａの駆動方向と、第２リニアアクチュエータ６２によるインジェクション用ピペット９４を保持する第２ホルダ５４Ｂの駆動方向は、平行でもよいし平行でなくてもよい。なお、第１リニアアクチュエータ３８と第２リニアアクチュエータ６２の駆動方式は、並進駆動、並進駆動と回転駆動の組合せのどちらでもよい。また、第２リニアアクチュエータは、リニアモータを用いてもよい。

接続部５２のマイクロマニピュレータ装置３０（接続部３２）に対する接続構造は、特に限定されず、例えばボルトなどを介して機械的に締結しても良いし、磁石などを介して磁気的に固定しても良いし、接続部３２がクリップのような挟む機能を備えたものであり、接続部５２を挟むことで保持しても良い。

第１ホルダ５４Ａは、外径寸法がホールド用ピペット９２の外径寸法と同程度の（あるいは幾分大きい）棒状（筒状）に形成されたホルダ本体５６ａを有している。ホルダ本体５６ａは、一端（図３では−Ｘ側の端部）近傍がホールド用ピペット９２を保持し、他端近傍が接続部５２に対して接続されている。

第１ホルダ５４Ａがホールド用ピペット９２を保持するための保持構造は、特に限定されないが、本実施形態では、一例として図４（ａ）に示されるように、ホルダ本体５６ａの一端近傍が円筒状に形成され、その内径側に、ホールド用ピペット９２が挿入される。ホルダ本体５６ａの上記円筒状の部分の内周面には、例えばシリコンゴムなどにより形成されたシート５６ｃが貼り付けられており、ホールド用ピペット９２は、上記ゴムシート５６ｃとの間の摩擦力により、ホルダ本体５６ａに保持される。また、筒状の締め具５６ｄをホルダ本体５６ａの一端近傍に被せることにより、ゴムシート５６ｃとホールド用ピペット９２との密着性を高めるようにしてもよい。なお、ホルダ本体５６ａによるホールド用ピペット９２の保持構造は、これに限定されず、例えば、図４（ｂ）に示されるように、ホールド用ピペット９２とホルダ本体５６ａとが磁気的に吸着されるように、ホールド用ピペット９２、ホルダ本体５６ａそれぞれに磁石５６ｅ、５６ｆを固定しても良い。

図３に戻り、ホルダ本体５６ａの一端近傍には、開口部５６ｇが形成されている。開口部５６ｇには、例えば合成樹脂系の材料により形成されたチューブ６６の一端が挿入されている。チューブ６６の他端は、不図示のインジェクタ装置に接続されている。ホルダ本体５６ａの一端部近傍は、中空に形成されており、チューブ６６は、該中空の部分（エアダクト）を介してホールド用ピペット９２と連通している。

第１リニアアクチュエータ３８の種類は、特に限定されないが、小型、且つ軽量であり、第１ホルダ５４Ａを所定のストローク（例えば最大で３０ｍｍ程度）、所定の分解能（例えば１μｍ以下）で高速且つ高精度に駆動（位置決め）することができるものが望ましい。第１リニアアクチュエータ３８としては、一例として、ＡＣサーボモータ、及び光学式ロータリエンコーダなどを備える電動アクチュエータを用いることができる。

第２ホルダ５４Ｂは、第１ホルダ５４Ａの外側（外部）に配置されている。第２ホルダ５４Ｂは、筒状に形成された固定部６０ａと、該固定部６０ａの内径側に挿入された可動部６０ｂとを備えている。

第１ホルダ５４Ａが有するホルダ本体５６ａの外周面の一部には、凹部５６ｈが形成されており、第２ホルダ５４Ｂの固定部６０ａの一部が、上記凹部５６ｈに挿入されている。なお、第１ホルダ５４Ａと第２ホルダ５４Ｂの固定方法については、凹部５６ｈを用いずに例えばビスによる取り付けや接着材等でホルダ本体５６ａと固定部６０ａを固定してもよい。また、第１ホルダ５４Ａと第２ホルダ５４Ｂは一体の部品としてもよいため、ホルダ本体５６ａと固定部６０ａは一体成型としてもよい。固定部６０ａは、ホルダ本体５６ａに対して、例えばボルトなどにより固定されており、相対移動が制限されている。したがって、第１ホルダ５４Ａが第１リニアアクチュエータ３８により駆動されると、該第１ホルダ５４Ａと一体的に第２ホルダ５４Ｂの固定部６０ａも移動する。

固定部６０ａは、一端（図３では、−Ｘ側の端部）が開口しており、該開口部からは、可動部６０ｂの一端（図３では、−Ｘ側の端部）近傍が突き出している。可動部６０ｂは、外径寸法が固定部６０ａの内径寸法よりも小さい筒状の部材から成る。インジェクション用ピペット９４は、他端近傍が可動部６０ｂの一端近傍に保持される。可動部６０ｂによるインジェクション用ピペット９４の保持構造は、上述した第１ホルダ５４Ａによるホールド用ピペット９２の保持構造（図４（ａ）又は図４（ｂ）参照）と同一であるので、説明を省略する。なお、ホールド用ピペット９２とインジェクション用ピペット９４とで、保持構造が異なっていても良い。

固定部６０ａの他端部近傍には。開口部６０ｃが形成され、該開口部６０ｃには、例えば合成樹脂系の材料により形成されたチューブ６８の一端部近傍が挿通されている。チューブ６８の他端は、不図示のインジェクタ装置に接続されている。可動部６０ｂは、両端が開口した筒状に形成されており、チューブ６８の一端は、可動部６０ｂの他端側の開口部内に挿入されている。従って、チューブ６８は、インジェクション用ピペット９４に直接的に連通している。

固定部６０ａは、可動部６０ｂの固定部６０ａに対する相対移動方向を、インジェクション用ピペット９４の長軸方向（図３ではＸ軸方向）に平行な方向へ制限するためのリニアガイド装置６４を内周面に有している。リニアガイド装置６４の種類は、特に限定されず、例えば磁性流体シールを形成する流体軸受を用いた流体ガイド装置、気体膜を形成する気体軸受を用いたエア式ガイド装置、機械式リニアガイド装置などを用いることができる。

第２リニアアクチュエータ６２の種類は、特に限定されないが、上記第１リニアアクチュエータ３８よりも、更に小型、且つ軽量であり、可動部６０ｂを固定部６０ａ（第１ホルダ５４Ａ）に対して、所定のストローク（例えば１０ｍｍ程度）、所定の分解能（例えば１μｍ以下）で高速且つ高精度に駆動（位置決め）することができるものが望ましい。また、第２リニアアクチュエータ６２としては、動力を供給しない状態（例えば電動アクチュエータである場合には、非通電時）に、可動部６０ｂが固定部６０ａに保持される構成であることが好ましい。第２リニアアクチュエータ６２としては、一例として、超音波モータを用いることができる。なお、第２リニアアクチュエータ６２は、固定部６０ａが有していても良いし、可動部６０ｂが有していても良い。また、固定部６０ａが有する要素（例えば固定子）と可動部６０ｂが有する要素（例えば可動子）との協働により駆動力を発生するアクチュエータを用いても良い。

ここで、本実施形態では、図５に示されるように、インジェクション用ピペット９４は、ホールド用ピペット９２に対して、＋Ｙ（使用者から見て手前）側に配置されるようにピペットホルダ５０に保持され（取り付けられ）ている。なお、ホールド用ピペット９２、及びインジェクション用ピペット９４の配置は、これに限定されず、例えばホールド用ピペット９２とインジェクション用ピペット９４とがＺ軸（上下）方向に並ぶようにピペットホルダ５０に保持されても良い。また、ホールド用ピペット９２、及びインジェクション用ピペット９４は、互いの長軸方向がほぼ平行となるように、ピペットホルダ５０（図５では不図示。図３参照）に取り付けられている。なお、ホールド用ピペット９２の長軸方向とインジェクション用ピペット９４の長軸方向は、平行でなくてもよい。

図１に戻り、操作系４０は、ジョイスティック４２ａ、各種ボタン４２ｂなどを有するコントローラ４２を備えている。マイクロマニピュレータ装置３０、ピペットホルダ５０、及び図示しないインジェクタ装置は、コントローラ４２に電気的に接続されており、該コントローラ４２を介して操作される。また、不図示のインジェクタ装置は、チューブ６６、６８（図１では不図示。図３参照）を介してピペットホルダ５０に接続されている。

ここで、本実施形態では、ホールド用及びインジェクション用の各ピペット９２、９４を保持するピペットホルダ５０が、単一のマイクロマニピュレータ装置３０に取り付けられていることから、コントローラ４２は、マイクロマニピュレータ装置３０に対応して、倒立顕微鏡装置２０の＋Ｘ側、すなわち、倒立顕微鏡装置２０の使用者（観察者）が接眼レンズ２２ａを用いて卵母細胞Ｏを観察する場合、使用者から見て倒立顕微鏡装置２０の右側にのみ配置されている。ただし、倒立顕微鏡装置２０の使用者（観察者）の操作性などの状況によっては、コントローラ４２は、マイクロマニピュレータ装置３０に対応して、使用者（観察者）から見て倒立顕微鏡装置２０の左側に配置されてもよい。

不図示のインジェクタ装置は、例えば各種ボタン４２ｂの操作に応じてホールド用及びインジェクション用の各ピペット９２、９４のエア制御を行う。例えば、ホールド用ピペット９２が卵母細胞Ｏを保持（ホールド）する時はエアを吸引し、卵母細胞Ｏを解除（リリース）する時はエアの吸引をやめる、またはエアを送出する、というエア制御を行う。また、インジェクション用ピペット９４の先端が卵母細胞Ｏに挿入され、精子を卵母細胞Ｏ内に注入する時はエアを送出する、というエア制御を行う。エア制御により、ホールド用ピペット９２に卵母細胞Ｏを保持（ホールド）させること、及び当該保持を解除（リリース）すること、並びに、先端が卵母細胞Ｏ内に挿入されたインジェクション用ピペット９４の先端からサンプル（試料）としての精子（不図示）を卵母細胞Ｏ内に注入（インジェクト）することが可能となる。

また、マイクロインジェクション法では、ホールド用ピペット９２に卵母細胞Ｏを保持させた後、インジェクション用ピペット９４の先端を該卵母細胞Ｏに刺す動作を行うが、本実施形態のインジェクション用ピペット９４は、ホールド用ピペット９２に対して（第１ホルダ５４Ａを基準として）移動するので、ホールド用ピペット９２に卵母細胞Ｏを保持させた後のインジェクション用ピペット９４の移動ストロークを予め設定することができる。このため、インジェクション用ピペット９４の先端を該卵母細胞Ｏに刺す動作（スティング）、及び精子注入後にピペット９４を戻す動作（プル）もボタン操作で行うことが可能である。なお、マイクロマニピュレータ装置３０の操作装置（入力装置）としては、これに限られず、適宜変更が可能である。また、インジェクタ装置としては、電動式に限られず、公知の手動インジェクタを用いても良い。

次に、マイクロインジェクションシステム１０を用いた顕微授精の手順、及び顕微授精を行う際のマイクロインジェクションシステム１０の動作の一例を図６〜図８（ｃ）を用いて説明する。図１に示されるように、倒立顕微鏡装置２０のステージ装置２６上には、ペトリ皿９０が載置され、該ペトリ皿９０内には、卵母細胞Ｏが収容されている。図６には、卵母細胞Ｏを保持したペトリ皿の平面図が示されている。また、図７には、マイクロインジェクションシステム１０を用いた顕微授精の手順を説明するためのフロー図が示されている。また、図８（ａ）〜図８（ｃ）には、顕微授精時における各ピペット９２、９４の動作を説明するための図（その１〜その３）が示されている。

図７のステップ１００で、マイクロマニピュレータ装置３０は、使用者によりコントローラ４２のジョイスティック４２ａ（それぞれ図１参照）が適宜操作され、ホールド用ピペット９２、及びインジェクション用ピペット９４の位置決めが行われたことを検出する。図８（ａ）には、マイクロマニピュレータ装置３０（図１参照）によりホールド用及びインジェクション用の各ピペット９２、９４が卵母細胞Ｏに対して位置決めがされた状態が示されている。このとき、ホールド用及びインジェクション用の各ピペット９２、９４それぞれの長軸方向は、Ｙ軸に直交し且つＸＹ平面に対して所定（ただし９０°未満）の角度を成している。以下、このときの各ピペット９２、９４の長軸方向と平行な方向をＸ’方向と称して説明する。また、インジェクション用ピペット９４は、先端に精子（不図示）を保持しているものとする。

各ピペット９２、９４の位置決めが完了すると、図７のステップ１０２で、マイクロマニピュレータ装置３０は、ホールド用ピペット９２を−Ｘ方向に駆動する。マイクロマニピュレータ装置３０は、ホールド用ピペット９２を卵母細胞Ｏに接触させるために、第１リニアアクチュエータ３８（それぞれ図３参照）を制御することにより、図８（ｂ）に示されるように、ホールド用ピペット９２を−Ｘ’方向に駆動する。ホールド用ピペット９２は、先端が卵母細胞Ｏの＋Ｘ’側から該卵母細胞Ｏに向けて接近する（図８（ｂ）の黒矢印参照）。次いで、図７のステップ１０４で、マイクロマニピュレータ装置３０は、インジェクタ装置（不図示）を制御して、ホールド用ピペット９２に卵母細胞Ｏの＋Ｘ’側を向いた面の一部を吸引保持させる。

この後、図７のステップ１０６で、マイクロマニピュレータ装置３０は、インジェクション用ピペット９４の先端が卵母細胞Ｏ内に挿入されるように、ピペットホルダ５０が有する第２リニアアクチュエータ６２（それぞれ図３参照）を制御することにより、インジェクション用ピペット９４を−Ｘ’方向に駆動する。これにより、図８（ｃ）に示されるように、インジェクション用ピペット９４の先端部が卵母細胞Ｏ内に挿入される。この際、インジェクション用ピペット９４の先端もホールド用ピペット９２と同様に、卵母細胞Ｏの＋Ｘ’側から該卵母細胞Ｏに向けて接近する（図８（ｃ）の黒矢印参照）。

ここで、ホールド用ピペット９２による卵母細胞Ｏの保持領域ＨＡに対して、卵母細胞Ｏに対するインジェクション用ピペット９４の挿入領域ＩＡが重ならないように、各ピペット９２、９４がピペットホルダ５０（図３参照）に保持されている。本実施形態において、ホールド用ピペット９２による卵母細胞Ｏの保持領域ＨＡとは、ホールド用ピペット９２と卵母細胞Ｏとの接触領域と、ホールド用ピペット９２からの吸引保持力が卵母細胞Ｏに作用する領域とを併せた領域を意味するものとする。また、卵母細胞Ｏには、ホールド用ピペット９２による吸引力が＋Ｘ’方向に作用しているが（図８（ｃ）の白矢印参照）、インジェクション用ピペット９４は、この吸引力に対向するように（すなわち＋Ｘ’側から−Ｘ’側へ向けて）先端部を卵母細胞Ｏ内に挿入する。

以下、図７のステップ１０８で、マイクロマニピュレータ装置３０は、インジェクタ装置（不図示）を制御して、インジェクション用ピペット９４の先端に保持されている精子（不図示）を卵母細胞Ｏ内に注入する。また、図７のステップ１１０で、マイクロマニピュレータ装置３０は、インジェクション用ピペット９４の先端を卵母細胞Ｏから引き抜くための制御を行う（インジェクション用ピペット９４を＋Ｘ’方向に駆動する）。また、図７のステップ１１２で、マイクロマニピュレータ装置３０は、インジェクタ装置（不図示）を制御して、ホールド用ピペット９２による卵母細胞Ｏの保持を解除する。この後、図７のステップ１１４で、マイクロマニピュレータ装置３０は、ホールド用ピペットを卵母細胞Ｏから離間させるために、ピペットホルダ５０（それぞれ図１参照）を＋Ｘ’方向に駆動するための制御を行う。

なお、卵母細胞Ｏにインジェクション用ピペット９４の先端を挿入するためには、上述した図７のステップ１００からステップ１１４のすべてのステップを必ずしも実施する必要はない。例えば、ホールド用ピペット９２が吸引により卵母細胞Ｏを保持すること（ステップ１０４）と、インジェクション用ピペット９４の先端が卵母細胞Ｏ内に挿入されること（ステップ１０６）が実施されればよい。上述の説明ではホールド用ピペット９２の動作について、卵母細胞Оに対して位置決め（ステップ１００）、卵母細胞Ｏに接触（ステップ１０２）、卵母細胞Оを吸引（ステップ１０４）とステップを分けたが、必ずしも上記のステップが分かれている必要はない。例えば、ステップ１００、ステップ１０２、ステップ１０４の３つのステップを同時に実行するような動作、つまりホールド用ピペット９２が吸引動作を行いながら、卵母細胞Ｏに対して位置決めを行い、接触、吸引するという操作を一連の操作として実行してもよい。また例えば、ステップ１００とステップ１０２を同時に実行し、ステップ１０４を実行する動作でもよい。

以上説明した本実施形態に係るマイクロインジェクションシステム１０によれば、卵母細胞Ｏに対する精子の注入時に、ホールド用、及びインジェクション用の各ピペット９２、９４が、ともに卵母細胞Ｏに対して同じ側（本実施形態では卵母細胞Ｏの＋Ｘ’側）から卵母細胞Ｏに接近する。ここで、仮にホールド用ピペット９２で卵母細胞Ｏを一側（例えば−Ｘ側）から保持するとともに、該卵母細胞Ｏの他側（例えば＋Ｘ側）からインジェクション用ピペット９４を用いて精子を注入する場合には、ホールド用及びインジェクション用の各ピペット９２、９４の先端を、卵母細胞Ｏを挟んで正確に位置合わせする必要があり、マイクロマニピュレータ装置３０の操作に熟練を要する。これに対し、本実施形態に係るマイクロインジェクションシステム１０によれば、ホールド用及びインジェクション用の各ピペット９２、９４の互いの先端の相対的な位置合わせを行う必要がないため、容易に精子を卵母細胞Ｏ内に注入することができる。

また、ピペットホルダ５０は、ホールド用ピペット９２による卵母細胞Ｏの保持領域ＨＡ（図８（ｃ）参照）と、卵母細胞Ｏに対するインジェクション用ピペット９４の挿入領域ＩＡ（図８（ｃ）参照）とが重ならないように、ホールド用ピペット９２の外側でインジェクション用ピペット９４を保持している。したがって、各ピペット９２、９４の単独での交換が容易である。また、ホールド用及びインジェクション用の各ピペット９２、９４の位置合わせを厳密に行う必要がなく、セッティングが容易である。

また、インジェクション用ピペット９４は、ホールド用ピペット９２が卵母細胞Ｏを吸引保持する際の吸引力の向きとは反対の方向に力を作用させて、先端を卵母細胞Ｏ内に挿入する（刺す）ので、上述した卵母細胞Ｏを一側から保持し、他側から挿入する場合に比べ、卵母細胞Ｏの変形を抑制することができ、卵母細胞Ｏへのダメージが少ない。

また、マイクロマニピュレータ装置３０を操作するための操作系４０を構成するコントローラ４２が、倒立顕微鏡装置２０に対して＋Ｘ側、すなわち使用者の右側にのみ配置されているので、使用者は右手のみでマイクロマニピュレータ装置３０、ピペットホルダ５０、及び不図示の電動インジェクタを操作することができ、操作性に優れる。

また、ピペットホルダ５０は、インジェクション用ピペット９４を駆動するための第２アクチュエータ６２を有しているので、マイクロマニピュレータ装置の種類を問わず取り付けることができ、汎用性に優れる。

なお、本実施形態のピペットホルダ５０は、ホールド用ピペット９２と、インジェクション用ピペット９４と、保持部材５４とで構成することができる。図３ではピペットホルダ５０の内部構造を示したが、一例として一実施形態を示したものに過ぎず、ピペットホルダ５０において必ずしも図３の全ての構成要素が必要というわけではない。例えば、ピペットホルダ５０は、必ずしも第２リニアアクチュエータ６２を有していなくても良い。図１に示される、倒立顕微鏡装置２０、マイクロマニピュレータ装置３０、操作系４０なども、同様にピペットホルダ５０を構成する要素ではない。また、図１ではマイクロインジェクションシステム１０の構成を示したが、一例として一実施形態を示したものに過ぎず、マイクロマニピュレータ装置３０、マイクロインジェクションシステム１０において必ずしも図１の全ての構成要素が必要というわけではない。

なお、上記実施形態の構成は、適宜変更が可能であり、例えばホールド用ピペット９２の形状、配置などは、適宜変更が可能である。図９（ａ）〜図９（ｃ）には、変形例（その１〜その３）に係るホールド用ピペットが示されている。

図９（ａ）に示される第１の変形例では、ホールド用ピペット９２ａは、長軸方向（Ｘ軸方向）に直交する断面の形状がほぼ逆Ｕ字状（又はＣ字状）とされている。従って、ホールド用ピペット９２ａによる卵母細胞Ｏ（図１参照）の保持領域は、円弧状にカーブした形状となる。インジェクション用ピペット９４の形状は、上記実施形態と同じであるが、ホールド用ピペット９２ａの内径側に配置されている点が異なる。本第１の変形例によれば、インジェクション用ピペット９４による卵母細胞への挿入領域が、ホールド用ピペット９２ａによる卵母細胞の保持領域の内径側に形成されるので、バランス良く卵母細胞を保持でき、且つピペットホルダ（不図示）を上記実施形態に比べて全体的にコンパクトにすることができる。

図９（ｂ）に示される第２の変形例では、上記実施形態のホールド用ピペット９２（図５参照）に比べて小径の（細い）、例えば３本のホールド用ピペット９２ｂが用いられている。例えば３本のホールド用ピペット９２ｂは、卵母細胞Ｏ（図１参照）上の保持領域が、同一直線上にない３点に（正三角形の頂点に対応する３箇所に対応して）形成されるように、互いに離間して配置されている。インジェクション用ピペット９４の形状は、上記実施形態と同じであるが、上記例えば３本のホールド用ピペット９２ｂに囲まれる領域（空間）内に配置されている。本第２の変形例によれば、複数の（本第２の変形例では、例えば３本）のホールド用ピペット９２ｂを用いるので、バランス良く卵母細胞を保持できる。

図９（ｃ）に示される第３の変形例では、上記第１の変形例に係るホールド用ピペット９２ａと同様に断面Ｕ字状に形成されたホールド用ピペット９２ａが一対用いられる。本第３の変形例では、一対のホールド用ピペット９２ａによりリング状の（実際には２箇所で破断した）保持領域が形成されるように、一対のホールド用ピペット９２ａが上下対称に配置される。インジェクション用ピペット９４は、一対のホールド用ピペット９２ａの間に配置される。本第３の変形例も、上記第２の実施形態と同様に、バランス良く卵母細胞を保持できる。

なお、図９（ａ）〜図９（ｃ）に示される図では、ピペットホルダの図示が省略されているが、変形例に係る各ピペットの配置、及び形状に応じて、図３に示されるピペットホルダ５０の構成、具体的には、ホルダ本体５６ａの先端部の形状、及び数を適宜変更すれば良い。また、例えば上記第２の変形例では、３本のホールド用ピペット９２ｂが用いられたが、ホールド用ピペット９２ａの数は、変更が可能であり、例えば２本のホールド用ピペットの間にインジェクション用ピペットが配置されるようにしても良いし、ホールド用ピペットを４本以上用いても良い。また、上記第３の変形例では、一対の断面Ｕ字状のホールド用ピペット９２ａが用いられたが、卵母細胞Ｏの保持領域がリング状に形成されるのであれば、ホールド用ピペットの数は、３本以上であっても良い。また、ホールド用ピペットを二重管構造に構成することにより、破断箇所のないリング状の保持領域を形成しても良い。

また、保持部材５４は、ホールド用ピペット９２を保持する部分である第１ホルダ５４Ａと、インジェクション用ピペット９４を保持する部分である第２ホルダ５４Ｂとの２つの部分を有していたが、これに限られず、ピペットホルダ５０の保持部材は、ホールド用ピペット９２及びインジェクション用ピペット９４の一方のみを保持可能な１つの部材であっても良い。

また、ピペットホルダ５０は、ホールド用及びインジェクション用の各ピペット９２、９４の少なくとも一方を、卵母細胞Ｏに対して相対的に駆動できれば良い。したがって、例えば、上記実施形態では、インジェクション用ピペット９４の挿入時に、インジェクション用ピペット９４を卵母細胞Ｏに接近するように駆動したが、これに限られず、例えば卵母細胞Ｏがインジェクション用ピペット９４に接近するように、図８（ｂ）に示される状態から、卵母細胞Ｏを保持したホールド用ピペット９２を＋Ｘ’方向に駆動しても良い。この場合、インジェクション用ピペット９４を保持する保持部材、及びインジェクション用ピペット９４を駆動するアクチュエータをピペットホルダ５０が有していなくても良い。

また、マイクロマニピュレータ装置３０に着脱可能に接続されるピペットホルダ５０自体は、各ピペット９２、９４を駆動するためのアクチュエータを有していなくても良い。この場合、マイクロマニピュレータ装置３０に各ピペット９２、９４それぞれを独立にその長軸方向に駆動するアクチュエータを設けると良い。

また、ピペットホルダ５０は、電動式のマイクロマニピュレータ装置３０に対して着脱可能に取り付けられる構成であったが、これに限られず、マイクロマニピュレータ装置３０と一体の構成でもよい。すなわち、マイクロマニピュレータ装置３０の接続部３２と、ピペットホルダ５０の接続部５２がなく、保持部材５４をマイクロマニピュレータ装置３０が備える構成でもよい。また、マイクロマニピュレータ装置３０を構成する部材のうち、６自由度方向の高精度位置決めが可能である部材が、各ピペット９２、９４を保持し、且つ、マイクロマニピュレータ装置３０自体が、少なくともインジェクション用ピペット９４をホールド用ピペット９２に対して相対的に駆動するアクチュエータを有していても良い。

また、ホールド用ピペット９２、及びインジェクション用ピペット９４の形状は、適宜変更が可能であり、例えばホールド用ピペット、及びインジェクション用のピペットの少なくとも一方は、先端部近傍が、ペトリ皿９０の底面と平行となるように曲がっていても良い。

また、上記実施形態では、ホールド用ピペット９２の長軸方向と、インジェクション用ピペット９４の長軸方向とが平行とされたが、各ピペット９２、９４同士が接触しなければ、厳密に平行である必要はなく、所定の角度を成していても良い。

また、卵母細胞Ｏは、斜め上方を向いた面（＋Ｘ’側の面）にホールド用ピペット９２による保持領域、及びインジェクション用ピペット９４による挿入領域が形成されたが、これに限られず、その他の方向を向いた面、例えば＋Ｚ側の面（上方を向いた面）に保持領域、挿入領域が形成されてもよい。

また、マイクロインジェクションシステム１０を構成する顕微鏡装置は、倒立顕微鏡装置２０に限らず、例えば正立顕微鏡装置などであっても良い。

また、上記実施形態のマイクロインジェクションシステム１０は、卵母細胞Ｏ内に精子を注入する顕微授精に用いられたが、これに限られず、その他の細胞の中から核、細胞質などを採取する作業、採取した核、細胞質などを別の細胞に移植する作業、その他、細胞内にさまざまな物質を注入する作業を行うために用いることができる。

以上説明したように、本実施形態のピペットホルダ、及びマイクロマニピュレータは、ホールド用及びインジェクション用の各ピペットを保持するのに適している。また、本実施形態のマイクロインジェクションシステムは、ホールド用ピペットに保持された細胞にインジェクション用ピペットを挿入するのに適している。

１０…マイクロインジェクションシステム、２０…倒立顕微鏡装置、３０…マイクロマニピュレータ装置、４０…操作系、５０…ピペットホルダ、９０…ペトリ皿、９２…ホールド用ピペット、９４…インジェクション用ピペット、Ｏ…卵母細胞。

Claims (14)

1. 細胞に対する吸引動作により前記細胞を保持するホールド用ピペットを保持する第１ホルダと、
   前記細胞への前記吸引動作により前記細胞に作用する力に対向する方向から前記細胞内に挿入されるインジェクション用ピペットを保持する第２ホルダと、
   前記ホールド用ピペットにより保持された前記細胞内へ前記インジェクション用ピペットが挿入されるように、前記第１ホルダと前記第２ホルダとの一方のホルダを他方のホルダに対して相対移動させる駆動部と、
   を備え、
   前記駆動部は、前記ホールド用ピペットにより前記細胞が保持される保持領域に対して前記インジェクション用ピペットによる前記細胞への挿入領域が重ならないように、前記一方のホルダを移動させるマイクロマニピュレータ用のピペットホルダ。
2. 前記駆動部は、前記相対移動させる移動方向に関して、前記細胞に挿入される前記インジェクション用ピペットの先端の位置と前記細胞を保持する前記ホールド用ピペットの先端の位置とを異ならせるよう、前記一方のホルダを移動させる請求項１に記載のピペットホルダ。
3. 前記第１及び前記第２ホルダは、前記移動方向に交差する方向に関して、前記インジェクション用ピペットの先端と、前記ホールド用ピペットの先端との相対位置が変化しないように、前記インジェクション用ピペットと前記ホールド用ピペットとをそれぞれ保持する請求項２に記載のピペットホルダ。
4. 前記駆動部は、前記ホールド用ピペットにより前記細胞を保持するように、前記一方のホルダを前記他方のホルダに対して相対移動させる請求項１〜３のいずれか一項に記載のピペットホルダ。
5. 前記駆動部は、前記ホールド用ピペットにより前記細胞を保持するように、前記他方のホルダを前記一方のホルダに対して相対移動させる請求項１〜３のいずれか一項に記載のピペットホルダ。
6. 前記駆動部は、
   前記ホールド用ピペットを前記細胞に接近させるホールド用アクチュエータと、
   前記インジェクション用ピペットを前記細胞内に挿入させるインジェクション用アクチュエータと、を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載のピペットホルダ。
7. 前記ホールド用アクチュエータは、可動部が前記第１ホルダに接続され、
   前記インジェクション用アクチュエータは、固定部が前記ホールド用アクチュエータの前記可動部に接続されるとともに可動部が前記第２ホルダに接続される請求項６に記載のピペットホルダ。
8. 前記インジェクション用アクチュエータによる前記第２ホルダの駆動方向と、前記ホールド用アクチュエータによる前記第１ホルダの駆動方向とが平行である請求項７に記載のピペットホルダ。
9. 細胞に対する吸引動作により前記細胞を保持するホールド用ピペットを保持する第１ホルダと、
   前記細胞への前記吸引動作により前記細胞に作用する力に対向する方向から前記細胞内に挿入されるインジェクション用ピペットを保持する第２ホルダと、
   前記ホールド用ピペットにより保持された前記細胞内へ前記インジェクション用ピペットが挿入されるように、前記第１ホルダと前記第２ホルダとの一方のホルダを他方のホルダに対して相対移動させる駆動部と、を備え、
   前記第１ホルダに複数の前記ホールド用ピペットが装着され前記細胞上の複数領域に対して吸引動作が行われる場合、
   前記第１および第２ホルダは、前記複数領域に対して前記インジェクション用ピペットによる前記細胞への挿入領域が重ならないように前記複数のホールド用ピペット及び前記インジェクション用ピペットを保持するピペットホルダ。
10. 前記インジェクション用ピペットによる前記細胞への挿入領域は、前記複数領域に囲まれた領域、又は前記複数領域の間の領域に形成される請求項９に記載のピペットホルダ。
11. 前記ホールド用ピペットによる前記細胞の保持領域は、前記インジェクション用ピペットの挿入領域の少なくとも半分以上を取り囲むように形成される請求項９に記載のピットホルダ。
12. 前記ホールド用ピペットによる前記細胞の保持領域は、前記インジェクション用ピペットの挿入領域を円弧状に取り囲むように形成される請求項１１に記載のピペットホルダ。
13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のピペットホルダと、
    前記第１ホルダに保持されるホールド用ピペットと、
    前記第２ホルダに保持されるインジェクション用ピペットと、を備えるマイクロマニピュレータ。
14. 請求項１３に記載のマイクロマニピュレータと、
    前記マイクロマニピュレータを操作するための入力装置と、
    前記細胞が載置されるステージを含む顕微鏡装置と、を備えるマイクロインジェクションシステム。

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