CH666850A5

CH666850A5 - Verfahren zur durchfuehrung von mikrooperationen an zellen und einrichtung zu dessen verwirklichung.

Info

Publication number: CH666850A5
Application number: CH1016/85A
Authority: CH
Inventors: Vladimir Afanasievich Nikitin; Anatoly Matveevich Khokhlov; Vyacheslav Tarasovich Larin; Boris Abramovich Fikhte
Original assignee: Inst Biokhim I Fiziol Mikroorg; Sp K Byuro Biolog Priborostr
Priority date: 1983-06-30
Filing date: 1983-06-30
Publication date: 1988-08-31
Also published as: GB2154608B; GB2154608A; US4619899A; DE3390499T1; WO1985000314A1; GB8503455D0; DE3390499C2; JPS60501687A

Description

BESCHREIBUNG

Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet Biologie, insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen und eine Einrichtung zu dessen Verwirklichung.

Es ist ein Verfahren zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen bekannt, das die Festhaltung der Zelle mit Hilfe eines Mikroansaugers und die Einführung eines Mikroinstrumentes in die Zelle vorsieht. Das Durchstechen der Zelle führt man auf der entgegengesetzten Seite in bezug auf die Stelle der Zellenfesthaltung (s. beispielsweise P. Fonbrune, «Mikromanipulationsmethoden», Fremdliteratur, M., S. 147-149, 1951).

Das Durchstechen der Zellenmembran erfolgt infolge ihrer Festigkeit und Elastizität nicht sofort nach der Einwirkung auf diese mit der Spitze des Mikroinstrumentes, sondern erst nach der bestimmten, in der Regel ziemlich grossen Deformation nicht nur des zu durchstechenden Abschnittes, sondern auch der ganzen Zelle, die zu einer Traumatisierung der letzteren führt.

Ausserdem kommen bei grossen Deformationen der Zelle im Durchstichmoment Zerreissungen der Membran vor, die mit einem Auswurf (Verlusten) von Zytoplasma infolge der Gesamterhöhung des intrazellularen Drucks begleitet werden, und dabei entstehen Verschiebungen der intrazellularen Organellen in bezug aufeinander.

Der Zytoplasmaauswurf führt zu einer Gleichgewichtsstörung zwischen dem intrazellularen Inhalt und der Umgebung, was beträchtlich die Lebensfähigkeit der operierten Zellen herabsetzt.

Bekannt ist auch ein Verfahren zur Durchführung von Mikro-5 Operationen an Zellen, nämlich ein Verfahren zur Kerntransplantation, bestehend aus der Extraktion des Kernes aus der Spenderzelle und deren Transplantation in die Rezipientenzelle, aus der deren eigener Kern entfernt ist.

Dabei wird das Mikroinstrument in die Zelle zweimal eingeführt, io und zwar das erste Mal, wenn der Kern aus der Zelle ausgezogen wird, und das zweite Mal, wenn in diese ein anderer Kern eingeführt wird, d. h. die Zelle wird zweimal verletzt.

Das alles führt in der Regel zu einer relativ niedrigen Anzahl von erfolgreichen Operationen (s. beispielsweise Kopac M. J., «Instru-15 mentation for the Transplantation of Nucleoli», J. of the Franklin Institute, 262,407-411, 1956).

Bekannt ist eine Einrichtung zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen, die ein Mikroinstrument, das in einem Halter montiert ist, der mit einem beweglichen Glied eines Dreiwegemikro-20 manipulators starr verbunden ist, und einen Mikroansauger enthält, der an einem anderen Mikromanipulator zum Festhalten der zu operierenden Zelle montiert ist (s. beispielsweise FR-PS 1085965, veröffentlicht im Jahre 1965).

25 Diese Einrichtung ist genug kompliziert in Steuerung von Mikro-manipulatoren, kennzeichnet sich durch hohe Kosten und relativ niedrige Arbeitsproduktivität bei Mikrooperationen, da sie die Koordinierung der Arbeit von zwei Mikromanipulatoren erfordert, und dabei ist eine Verformung der Zelle im Durchstichmoment nicht 3Q ausgeschlossen. Infolge der Vibration des Mikroansaugers und Mikroinstrumentes kommt es zu einer zusätzlichen Traumatisierung der Zelle, und weil die Zelle, die am Mikroansauger festgehalten wird, ziemlich elastisch ist, sind Brüche des Mikroinstrumentes während des Durchstechens der Zelle möglich.

35 Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen so zu vervollkommnen, dass die Verformung der Zelle bei deren Durchstechen mit dem Mikroinstrument möglichst geringer und die Anzahl von erfolgreichen Operationen erhöht wird, und die Aufgabe, eine Einrichtung 40 zur Verwirklichung dieses Verfahrens zu entwickeln, die leicht bedienbar und nicht teuer ist, eine Dauerkürzung von Mikrooperationen ermöglicht und in ausreichendem Masse betriebssicher ist.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, dass man im Verfahren zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen, das darin besteht, 45 dass man die Zelle mit Hilfe eines Mikroansaugers festhält und die Membran der Zelle mit einem Mikroinstrument durchsticht, erfin-dungsgemäss das Durchstechen der Zellenmembran am Abschnitt unter dem Mikroansauger ausführt, wobei das Mikroinstrument durch den Hohlraum des Mikroansaugers eingeführt wird.

50 Zweckmässigerweise wird der Hohlraum des Mikroansaugers mit einer isotonischen Lösung ausgefüllt.

Die Aufgabe wird auch dadurch gelöst, dass in der Einrichtung zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen, die ein Mi-55 kroinstrument, das in einem Halter montiert ist, der mit einem beweglichen Glied eines Dreiwegemanipulators starr verbunden ist, und einen Mikroansauger zum Festhalten der zu operierenden Zelle enthält, erfindungsgemäss der Mikroansauger am Halter des Mikroinstrumentes starr befestigt ist, das Mikroinstrument im Hohl-60 räum des Mikroansaugers koaxial zu diesem angeordnet und mit dem Halter durch ein Mittel verbunden ist, das eine Hin- und Herverschiebung des Mikroinstrumentes längs der Achse des Mikroansaugers gewährleistet.

Es ist zweckmässig, den Halter in Form eines Dreiwegestücks 65 auszuführen, von dem der eine Stutzen mit dem Hohlraum des Mikroansaugers kommuniziert, in dem gegenüberliegenden Stutzen ein Dichtungsring angebracht ist, der eine Öffnung auf dem Durchmesser des Mikroinstrumentes hat, und der dritte, seitliche Stutzen mit

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einem Saugrohransatz zur Erzeugung eines negativen Drucks im Hohlraum des Mikroansaugers und Einleitung einer isotonischen Lösung versehen ist.

Es sei erwünscht, als Verbindungsmittel zwischen dem Mikroinstrument und dem Halter ein Schrittschaltwerk mit Längsverschiebung oder einen Membrandruckregler anzuwenden, dessen Gehäuse mit dem Halter, die Membran mit dem Mikroinstrument starr verbunden ist und der Innenraum mit einer Quelle von Steuerdruckluftimpulsen kommuniziert.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen

— schliesst die Verformung der gesamten Zelle im Durchstichmoment mit dem Mikroinstrument aus;

— vermindert die Verletzung der Zelle;

— gewährleistet eine hohe Genauigkeit des Durchdringens des Mikroinstrumentes in die Zelle auf die vorgegebene Tiefe;

— gewährleistet das Durchdringen des Mikroinstrumentes in die Zelle unabhängig von deren Form und Abmessungen;

— verwirklicht die Verschiebung der Zelle, zusammen mit dem eingeführten Mikroinstmment, wenn es erforderlich ist;

— sichert die Transplantation der Zellenorganellen mit nur einem Durchstich;

— verwirklicht die Mikroinjektion von Stoffen in die bestimmten Zellenabschnitte oder die einzelnen Organellen;

— beschleunigt den Mikrochirurgieprozess der Zelle.

Die erfindungsgemässe Einrichtung zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen kennzeichnet sich neben den Verfahrensvorteilen durch eine hohe Zuverlässigkeit und leichte Bedienbarkeit, weil sie die Steuerung nur eines Mikromanipulators erfordert, durch im Vergleich zur bekannten Einrichtung niedrigere Kosten und vermindert die Zahl von möglichen Brüchen des Mikroinstrumentes während des Durchstechens der Zelle.

Nachstehend wird die Erfindung anhand einer Beschreibung von konkreten Ausführungsbeispielen und beigelegter Zeichnungen näher erläutert, wobei es zeigen:

Fig. 1 eine Einrichtung zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen, in Gesamtansicht;

Fig. 2 eine Mikroansaugereinheit mit einem Mikroinstrument und Membrandruckregler, auseinandergebracht;

Fig. 3 dieselbe Einheit wie in Fig. 1 mit einem Schrittmotor;

Fig. 4 eine Ausführungsvariante des Halters für einen Zwei-kanal-Mikroinstrument, auseinandergebracht;

Fig. 5 schematisch die Einrichtung zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen und die zu operierende Zelle im Sehfeld eines Mikroskops im Moment der Einführung des Mikroinstrumentes in die Zelle;

Fig. 6 die zu operierende Zelle im Sehfeld eines Mikroskops im Moment der Herausführung des Mikroinstrumentes aus der Zelle.

Das Wesen des erfindungsgemässen Verfahrens zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen besteht darin, dass man die Zelle, die einer mikrochirurgischen Operation unterworfen wird, mit Hilfe eines Mikroansaugers festhält. Das Festhalten der Zelle wird unter negativem Druck zustande gebracht, der im Hohlraum des Mikroansaugers mit einem Mikroinjektor erzeugt wird, nachdem die Zelle mit der Stirnseite des Mikroansaugers in Berührung gebracht ist. Durch den fixierten Abschnitt der Zellenmembran, der durch die Stirnseite des Mikroansaugers begrenzt ist, erfolgen das Durchstechen der Membran mit dem Instrument und das Einführen des letzteren in die Zelle aus dem Hohlraum des Mikroansaugers. Der fixierte und ausgedehnte Abschnitt der Zelle unter dem Mikroansauger wird mit einer isotonischen Lösung umspült, mit der der Hohlraum des Mikroansaugers vor der Operation ausgefüllt wird. Eine isotonische Lösung wird in den Hohlraum des Mikroansaugers eingeleitet, damit der gleiche osmotische Druck des intrazellularen Inhalts und der extrazellularen Lösung in der Durchstichzone im Moment des Durchstechens der Zellenmembran beibehalten wird. Für die Zellen der Kaltblüter, Einzeller und Mikroorganismen wird öfters als isotonische Lösung die Ringer-Lösung verwendet. Für

Zellen der Warmblüter werden die Ringer-Lock-Lösung, Ringer-Tyrode-Lösung und andere Lösungen verwendet. In allen diesen Lösungen ist das Vorliegen von stabilisierenden Faktoren für die Membran, und zwar von Kalziumionen erforderlich, die im Falle der Verletzung der Membran zu einer schnellen Wiederherstellung des verletzten Abschnitts der Membran dienen. In einigen Fällen, z. B. bei Transplantation einzelner intrazellularer Organellen, wenn es erforderlich ist, Mikroinstrumente mit grossem Durchmesser zu benutzen, d. h. wenn die Zellenmembran bedeutende Verletzungen hat, enthält eine isotonische Lösung in der Regel verschiedene hochmolekulare Verbindungen (Kollidin, Dextran und andere) zur Erzeugung von kolloidosmotischem (onkotischem) Druck, der durch das Vorhandensein im Zytoplasma der Zelle von hochmolekularen Stoffen, hauptsächlich von Eiweissstoffen bestimmt wird. Das alles trägt zu einer schnellen Wiederherstellung der perforierten Zellenmembran und zu einem geringfügigen Durchdringen intrazellularer Komponenten in den Hohlraum des Mikroansaugers während des Durchstechens bei.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen schliesst die Verformung der gesamten Zelle im Durchstichmoment dadurch aus, dass die Zelle mit dem Mikroinstrument nur auf dem fixierten und ausgedehnten Membranabschnitt, der durch die Stirnseite des Mikroansaugers begrenzt ist, festgehalten und durchstochen wird. Solch ein Abschnitt der Membran wird mit dem Mikroinstrument leicht durchstochen, wobei sich die gesamte Zelle in freiem Zustand befindet und der Verformung nicht ausgesetzt ist.

Die Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens bewirkt die Beschleunigung des Prozesses der Zellenmikrochirurgie, weil sie eine kraft- und zeitraubende Suche des zu durchstechenden Abschnitts ausschliesst. Dieser Abschnitt wird schon während des Festhaltens der Zelle mit dem Mikroansauger vorgegeben. Darüber hinaus manipuliert man gleichzeitig mit dem Mikroansauger und dem Mikroinstrument. Das Mikroinstrument kann während des Durchstechens der Membran von dieser nicht abgleiten, wodurch eine hohe Genauigkeit des Durchdringens des Mikroinstrumentes in die Zelle unabhängig von deren Form und Abmessungen gesichert wird.

Das Verfahren zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen wurde erfindungsgemäss mit Hilfe einer Einrichtung realisiert, die in Fig. 1,2, 3,4 dargestellt ist.

Fig. 1 zeigt eine Einrichtung zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen, enthaltend ein Mikroinstrument 1, das in einem Halter 2 montiert ist, der mit einem beweglichen Glied 3 eines Dreiwegemanipulators 4 starr verbunden ist, und einen Mikroansauger 5, der an dem Halter 2 starr befestigt ist. Dabei ist das Mikroinstrument 1 im Hohlraum des Mikroansaugers 5 koaxial zu diesem angeordnet und mit dem Halter 2 mit Hilfe eines Verbindungsgehäuses 6 und eines Mittels 7a (Fig. 1, a) verbunden, das eine Hin- und Herverschiebung des Mikroinstrumentes 1 längs der Achse des Mikroansaugers 5 ermöglicht.

Der Halter 2, der in Fig. 2 auseinandergebracht gezeigt ist, ist in Form eines Dreiwegestücks 8 ausgeführt, von dem der eine Stutzen 9 mit dem Hohlraum des Mikroansaugers 5 starr verbunden ist und kommuniziert, in dem gegenüberliegenden Stutzen 10 ein Dichtungsring 11 mit einer Mittelöffnung auf dem Durchmesser des Mikroinstrumentes 1 angebracht ist, und der dritte, seitliche Stutzen mit einem Rohransatz 12 zur Erzeugung eines negativen Druckes im Hohlraum des Mikroansaugers 5 und zur Einleitung in diesen einer isotonischen Lösung versehen ist.

Der Mechanismus 7a stellt einen Membrandruckregler dar, der sich aus einem Gehäuse 13, einer Decke 14 und einer zwischen diesen befestigten Membran 15 mit einem Stössel 16 zusammensetzt. Das Gehäuse 13 ist mit einem Rohransatz 17 versehen, durch den der Innenraum des Membrandruckreglers mit einer Quelle von Steuerdruckluftimpulsen kommuniziert (in Fig. nicht gezeigt). Die Membran 15 ist mit dem Mikroinstrument 1 durch den Stössel 16 und ein Klemmstück 18 starr verbunden.

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Fig. 3 zeigt eine Ausführungsvariante der Einrichtung zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen, in der zum Unterschied von der Variante der Fig. 1, 2 ein Mittel 7b, das die Hin- und Herverschiebung des Mikroinstrumentes 1 im Hohlraum des Mikroansaugers 5 sichert, in Form eines Schrittmotors mit Längsverschiebung ausgeführt ist, wobei dessen Gehäuse 19 mit dem Halter 2 und das bewegliche Glied 20 des Schrittmotors der Längsverschiebung mit dem Mikroinstrument 1 starr verbunden ist.

Fig. 4 zeigt auseinandergebracht eine Ausführungsvariante des Klemmstückes 18 für ein Zweikanal-Mikroinstrument, die auseinandernehmbare Stutzen 21 und 22 mit Rohransätzen 23 bzw. 24 enthält, die zum Kommunizieren mit den jeweiligen Kanälen des Mikroinstrumentes vorausbestimmt sind. Die Stutzen 21 und 22 sind miteinander verbunden und durch einen Dichtungsring 25 her-metisiert; ausserdem besitzt der Stutzen 21 an seinem freien Ende einen Dichtungsring 26 mit einer Kiemmutter 27.

Das Funkzionieren der Einrichtung, die in Fig. 1 bis 4 gezeigt ist, wird mit Fig. 5, 6 illustriert, am Beispiel der Kerntransplantation beschrieben und besteht im folgenden:

Mit Hilfe des Mikromanipulators 4 (Fig. 1), der die Verschiebung des Mikroinstrumentes 1 und Mikroansaugers 5 sichert, werden diese ins Sehfeld 28 (Fig. 5) eines Mikroskops neben der Zelle 29 gebracht. Man saugt die Zelle an die Stirnseite des Mikroansaugers 5 an, indem man einen Unterdruck durch einen speziellen Mikroinjektor erzeugt, der mit dem Rohransatz 12 (Fig. 1) verbunden ist, und indem man das Ende des Mikroansaugers 5 der Zelle 29 (Fig. 5) zuführt, so dass der durch die Stirnseite des Mikroansaugers begrenzte Abschnitt der Membran als Einführungsstelle des Mikroinstrumentes 1 in die Zelle 29 dient. Dann führt man den Druck durch den Rohransatz 17 (Fig. 1) dem Innenraum des Membrandruckreglers oder der Arbeitskammer des Schrittmotors — dem Mittel 7b (Fig. 3) — zu. Dabei wird die Membran 15 (Fig. 2) deformiert, und sie verschiebt den Stössel 16 und das Klemmstück 18 mit dem Mikroinstrument 1. In der Variante mit einem Schrittmotor verschiebt sich das bewegliche Glied 20 (Fig. 3) des Motors. Das Mikroinstrument 1 verschiebt sich dabei hin und durchsticht den fixier-5 ten und durch den Durchmesser der Stirnseite des Mikroansaugers 5 (Fig. 5) begrenzten Abschnitt der Membran. Der zu transplantieren-de Kern 30, der aus einer anderen Zelle genommen ist, wird im voraus in einem der Kanäle des Mikroinstrumentes 1 untergebracht. In diesem Falle dient als Mikroinstrument 1 eine Zweikanal-Mikro-10 pipette, deren jeder Kanal an den jeweiligen Mikroinjektor angeschlossen ist, mit deren Hilfe das Einsaugen und Herausstossen von Kernen erfolgt. Die Mikroinjektion und das Mikroeinsaugen mit dem Mikroinstrument 1 führt man bei der Zufuhr eines Druckes oder Unterdruckes ins Gehäuse des Halters 2 (Fig. 4) über zwei 15 Kanäle durch die Rohransätze 23 und 24 (Fig. 4) aus. Die Zuführung einer isotonischen Lösung, die den Störungsefiekt der Ganzheit der äusseren Membran der Zelle vermindert, führt man mit Hilfe eines Mikroinjektors (in Fig. nicht angedeutet) durch den Rohransatz 12 (Fig. 5) durch. Nach der Einführung des Mikroinstrumentes 20 1 in die Zelle 29 wird deren Kern 31 (Fig. 6) in den freien Kanal des Mikroinstrumentes 1 eingesaugt, und der zu transplantierende Kern 30, der sich im zweiten Kanal des Mikroinstrumentes befindet, wird aus diesem in die Zelle 29 hineingestossen. Das heisst, die Mikroope-ration zur Kerntransplantation wird mit einem Durchstich bewerk-25 stelligt.

Die Erfindung ist zur Verwendung im Gebiet Biologie, Landwirtschaft und Medizin vorausbestimmt. Sie kann erfolgreich zur Extraktion und Transplantation von Kernen und anderen Organellen, Eizellenblastomeren, zu Mikroinjektionen von Stoffen in die Zellen, 30 zur Kerninaktivation, zur Implantation und Inkorporation von Zellenteilen oder einzelnen Zellen in andere Zellen oder Gewebe und Organismen, zu Mikrooperationen an kleinsten Gefässen, Muskelfasern u.a.m. verwendet werden.

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3 Blätter Zeichnungen

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen, das darin besteht, dass eine Zelle (29) mit Hilfe eines Mikro-ansaugers (5) festgehalten und die Membran der Zelle (29) mit einem Mikroinstrument (1) durchstochen wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Durchstechen der Membran der Zelle (29) am Abschnitt unter dem Mikroansauger (5) erfolgt, wobei das Mikroinstrument (1) durch den Hohlraum des Mikroansaugers (5) eingeführt wird.
2. Verfahren zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Hohlraum des Mikroansaugers (5) mit einer isotonischen Lösung ausgefüllt wird.
3. Einrichtung zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen, enthaltend ein Mikroinstrument (1), das in einem Halter (2) montiert ist, der mit einem beweglichen Glied (3) eines Dreiwegemi-kromanipulators (4) starr verbunden ist, und einen Mikroansauger (5) zum Festhalten der zu operierenden Zelle, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroansauger (5) am Halter (2) starr befestigt ist, das Mikroinstrument (1) im Hohlraum des Mikroansaugers (5) koaxial zu diesem angeordnet und mit dem Halter (2) durch ein Mittel (7a, 7b) verbunden ist, das eine Hin- und Herverschiebung des Mikro-instrumentes (1) längs der Achse des Mikroansaugers (5) gewährleistet.
4. Einrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Halter in Form eines hohlen Dreiwegestücks (8) ausgeführt ist, von dem der eine Stutzen (9) mit dem Hohlraum des Mikroansaugers (5) kommuniziert, im gegenüberliegenden Stutzen (10) ein Dichtungsring (11) mit einer Öffnung auf dem Durchmesser des Mi-kroinstrumentes (1) eingebaut ist und der dritte, seitliche Stutzen mit einem Rohransatz (12) zur Erzeugung negativen Druckes im Hohlraum des Mikroansaugers (5) und Einleitung einer isotonischen Lösung versehen ist.
5. Einrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Mittel (7b) zur Verbindung des Mikroinstrumentes (1) mit dem Halter (2) ein Schrittschaltwerk mit Längsverschiebung angewandt ist.
6. Einrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Mittel (7a) zur Verbindung des Mikroinstrumentes (1) mit dem Halter (2) ein Membrandruckregler angewandt ist, dessen Gehäuse (13) mit dem Halter (2), die Membran (15) mit dem Mikroinstrument (1) und der Innenraum mit einer Quelle von Steuer-druckluftimpulsen starr verbunden ist.