EP0918846A1 - Reaktionsbeutelvorrichtung zur durchführung von mehrstufigen kultivierungs-/separations-vorgängen und/oder reaktionen - Google Patents

Reaktionsbeutelvorrichtung zur durchführung von mehrstufigen kultivierungs-/separations-vorgängen und/oder reaktionen

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Publication number
EP0918846A1
EP0918846A1 EP97938900A EP97938900A EP0918846A1 EP 0918846 A1 EP0918846 A1 EP 0918846A1 EP 97938900 A EP97938900 A EP 97938900A EP 97938900 A EP97938900 A EP 97938900A EP 0918846 A1 EP0918846 A1 EP 0918846A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
reaction bag
reaction
chamber
chambers
reagents
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP97938900A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Manfred Kubbies
Stefan Koch
Bernhard Goller
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Diagnostics GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Priority to EP97938900A priority Critical patent/EP0918846A1/de
Publication of EP0918846A1 publication Critical patent/EP0918846A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/14—Bags
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/02—Blood transfusion apparatus
    • A61M1/0209—Multiple bag systems for separating or storing blood components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions

Definitions

  • Reaction bag device for carrying out multistage cultivation / separation processes and / or reactions
  • the present invention relates to a reaction bag device for carrying out multistage cultivation / separation processes and / or reactions, for example for growing antitumor cells or cells stimulating antitumor cells.
  • One approach to treating tumors is to cultivate anti-tumor cells or anti-tumor cell stimulating cells ex vivo, i.e. outside the human body. After breeding, i.e. according to intensive multiplication, the antitumor cells are injected back into the human body.
  • a blood sample is taken from a patient, in which there are also a small number of cells that specifically respond to a tumor to be treated, the so-called anti-tumor cells.
  • These antitumor cells contained in the blood sample can be stimulated to multiply in a culture vessel in a nutrient solution by bringing them into contact with whole tumor cells or so-called vesicles of the tumor cells.
  • Tumor cells can be obtained, for example, from the tumor tissue present in a patient.
  • the genetic information is removed by lysis of the tumor cells and subsequent filtering, so that only the cell membrane or fragments thereof are retained, which form the vesicles mentioned above.
  • These vesicles have the surface features that are characteristic of tumor cells, so that they are recognized by tumor cells as tumor cells and accordingly correspond to a appropriate stimulation of the multiplication of the antitumor cells. Since the vesicles only have the surface characteristics of the tumor cells, but no longer have the genetic information of the tumor cells, they cannot act on the multiplying antitumor cells, for example by releasing inhibitors.
  • the nutrient solution is exchanged and the cells are portioned into several growth containers.
  • the anti-tumor cells are separated from an undesired background in a selection step.
  • the anti-tumor cells are labeled, for example, with the aid of lyophilized or otherwise prepared retroviruses. These retroviruses lead to expression on the surface of the anti-tumor cells e.g. of the 1 NGFR receptor, which contributes to the enrichment of the antitumor cells in a subsequent separation step.
  • separation i.e. Enrichment of the antitumor cells, it is possible to either subject them again to separation in order to increase the enrichment rate, or to subject them to a further growth step, for example with the addition of a growth-promoting agent.
  • reaction bags which have an inlet opening for a starting material, an inlet opening for the reagents and an outlet opening from which the product produced by the reaction of the starting material with the reagents can be removed from the bag .
  • a single bag is therefore provided, into which different materials have to be entered or from which materials can be found.
  • a reaction bag device for carrying out multistage cultivation / separation processes and / or reactions, for example for growing antitumor cells or cells stimulating antitumor cells, comprising: a plurality of reaction bag chambers in one reaction bag, wherein in a starting material for the respective stage can be arranged in each reaction bag chamber and can be brought into contact with reagents for the respective stage for producing a reaction product of the respective stage, Dispensing opening means for dispensing a reaction product from each reaction bag chamber.
  • the reactions of the individual stages are therefore carried out in a reaction bag with a plurality of reaction bag chambers in which, on the one hand, a starting material for the stages can be arranged to carry out the reaction of the respective stage and, on the other hand, this starting material is brought into contact with a reagent for the stage can be. Since the reaction can therefore take place in a completely closed environment, there is no risk of contamination of the environment or introduction of contaminants into the reaction of the respective stages.
  • the device according to the invention is relatively simple and inexpensive to manufacture and, because of the possibility of adding or integrating additional reaction bag chambers in a process or removing a reaction bag chamber from a process, provides a high degree of flexibility in carrying out reactions.
  • starting material used in the present text is to be understood to mean any kind of material, i.e. Cells and other biological or chemical material, which is to be further processed, multiplied or modified in a respective reaction step to form a reaction product of this step.
  • reagents used in this text should be understood to mean any type of material, i.e. biological, chemical or other materials, as well as combinations of different materials or reagents, which in cooperation with the starting material of the respective stage for further processing, processing, multiplication or the like. of the source material.
  • At least one of the reaction bag chambers can have an input opening for inputting a starting material into it from the outside with respect to the reaction bag, and the reaction tion bag chambers can be formed in sequence for transferring the reaction product of a reaction bag chamber preceding the sequence as a starting material into at least one reaction bag chamber following the sequence.
  • the reaction product is transferred directly between the reaction bag chambers and thus does not come into contact with the surroundings, a particularly safe and contamination-free implementation of the reactions or the cultivation / separation processes is ensured.
  • At least one of the reaction bag chambers preferably the last reaction bag chamber in the sequence, have an outlet opening for discharging the reaction product therefrom with respect to the reaction bag.
  • reaction bag device in the case of two reaction bag chambers which follow one another in sequence, a preceding reaction bag chamber has an outlet opening and a subsequent reaction bag chamber has an inlet opening.
  • the reaction product obtained in the preceding reaction bag chamber is further processed in an external device and subsequently has to be reintroduced into the process to be carried out in the reaction bag device, namely into the subsequent reaction bag chamber.
  • the reaction bag device can comprise at least one reaction bag chamber, which is a reaction bag chamber for a plurality of successive stages, the reaction product of a preceding stage in each case forming the starting material for a subsequent stage. With such a configuration, the processed, increased or the like remains. Contain material in the at least one reaction bag chamber, so that work can be carried out without contamination.
  • reaction bag device which contains several reaction bag chambers
  • the liquid, fluid-like or gelatinous material contained in the reaction bag chambers can be transported forward, e.g. by wiping with the fingers. be transported into a next reaction bag chamber.
  • successive reaction bag chambers are separated from one another in the sequence by partition walls which point to a fluid transfer area between the successive reaction bag chambers in a fluid transfer direction in the essentially funnel-shaped s.
  • the reaction bag device according to the invention for the cultivation of antitumor cells, it is advantageous in the multiplication of antitumor cells if the starting material, which contains a relatively small number of antitumor cells, is accumulated in a relatively small volume range, since a Increasing the concentration of antitumor cells leads to accelerated growth.
  • the starting material which contains a relatively small number of antitumor cells
  • the reaction bag device according to the invention it is proposed that at least one through in at least one reaction bag chamber preferably V-shaped wall sections formed starting material / reaction product accumulation area is formed.
  • the at least one starting material / reaction product collection area is advantageously designed to widen in the fluid transfer direction.
  • the partition walls tapering in a funnel shape form the wall sections of the starting material / reaction product accumulation area at least in regions.
  • the growth or the multiplication of antitumor cells is carried out in a plurality of reaction bag chambers arranged in sequence, for example in each case with the addition of different growth stimulants, care must be taken that the multiplying antitumor cells do not exceed a certain concentration, since this increases inhibits growth or reproduction; i.e. as the growth process progresses, care must be taken to ensure that more volume is available for the multiplying antitumor cells. This can be achieved in a simple manner in that successive reaction bag chambers have an increasing chamber volume in the sequence.
  • reaction bag chambers In order to be able to bring the starting material into contact with the reagents of the respective stage in a reaction bag chamber, it is possible according to a particularly simple and practical embodiment that at least one of the reaction bag chambers is already pre-loaded with the reagents before the starting material is entered. With such a configuration, only the starting material has to be entered in the subsequent use.
  • At least one reaction bag chamber can be provided with at least one reagent chamber, preferably by means of apparent fluid flow interruption means destructible fluid flow interrupter, can be brought into reagent transfer connection with the reaction bag chamber, and that the reagents for the respective stage are contained in the reagent chamber.
  • the reagents provided for a particular stage can be brought into contact with the starting material at any time, for example after the starting material for the stage has been introduced.
  • At least one reaction bag chamber is provided with a plurality of reagent chambers for different stages, which can be brought into reagent transfer connection with the reaction bag chamber one after the other in order to carry out the several stages sequentially.
  • the reactions of several successive stages are thus carried out in a single reaction bag chamber and only the reagents contained in the different reagent chambers are sequentially transferred to the reaction bag chamber in accordance with the sequence of the stages, i.e. the reaction product generated in a reaction between reagents and starting material forms the starting material for the reaction of the next step, which is then to be brought into contact with the reagents for the next step.
  • a tightly closable reagent input opening can be provided for the input of reagents into the reaction bag chamber from an external container.
  • a separation column device for fluid transfer therethrough can also be provided between at least two reaction bag chambers which follow one another in sequence.
  • the separation column device is incorporated into a wall separating the at least two reaction bag chambers, that is to say, even for carrying out the separation, it is not necessary to carry the reaction product out one step, through a separation column or the like. to pass through and to put the resulting concentrated material back into a bag, for example for further cell proliferation.
  • a reaction bag device for carrying out desired multi-stage cultivation / separation processes and / or reactions, for example for growing antitumor cells or cells stimulating antitumor cells, comprising a reaction bag with a Reaction bag chamber in which a starting material for a stage can be arranged and brought into contact with reagents for the step for producing a reaction product of the stage, the reaction bag having an input opening for inputting starting material therein and an output opening for outputting one in the Reaction bag produced reaction product and wherein the reaction bag device contains the reagents and is prepared with these to form a reaction unit.
  • the reaction bag chamber is preloaded with the reagents.
  • the reaction bag comprises at least one reagent chamber which can be brought into reagent transfer connection with the reaction bag chamber by means of apparent fluid flow interruption means, preferably destructible fluid flow interruption means, and that the reagents for the respective stage are contained in the at least one reagent chamber.
  • the reaction bag chamber is a reaction bag chamber for a plurality of successive stages, the reaction product of a preceding stage in each case forming the starting material for a subsequent stage, i.e. Even with such a design, a reaction bag, i.e. in a single reaction bag chamber, a plurality of reaction stages can be carried out in succession without the reaction product in each case having to be dispensed from the bag.
  • the reaction bag comprises a plurality of reagent chambers for different stages, which reagent chambers can be brought into reagent transfer connection with the reaction bag chamber for sequential execution of the plurality of stages.
  • reaction bag chamber it is possible for the reaction bag chamber to also be provided with a sealable reagent entry opening for entering reagents into the reaction bag chamber from an external container. Even in this way, multi-stage reactions can be carried out in a reaction bag if, for example, a first reaction is carried out by introducing a starting material into a - for example pre-loaded - reaction bag, the reaction product of this stage is left in the reaction bag chamber and subsequently by entering reagents from an external one Container a second reaction stage is carried out.
  • the inlet and / or outlet openings be provided by valves, destructible or reclosable closure means o . Like. are closed.
  • the reaction bag device according to the invention is preferably made of flexible, preferably gas-permeable, but also liquid-impermeable, plastic. On the one hand, this contributes to a particularly simple and inexpensive producibility, and on the other hand the risk of damage to such reaction bag devices made of flexible plastic, for example due to breakage, is practically eliminated.
  • the respective reaction bag chamber is preferably formed integrally with the at least one reagent chamber.
  • the respective reaction bag chamber be designed to enter fresh nutrient solution or to remove used nutrient solution.
  • the respective reaction bag chamber can be replaced by a. "have a penetrable membrane area which automatically restores a fluid-tight seal after removal of the cannula.
  • the present invention further relates to a modular reaction bag system comprising one or a plurality of reaction bag devices according to the invention.
  • the modular reaction bag system can then be composed of suitably prepared reaction bag devices. are provided, the reaction bag device in each case, for example, being loaded with the reagents for the desired reaction stages or containing them in certain reaction chambers. From a certain number of different reaction bag devices, a suitable bag system can then be put together for a specific multistage process to be carried out, in which only those reaction bag chambers are contained which are actually required for the process.
  • the modular reaction bag system is to be used for cell multiplication, for example for the multiplication of anti-tumor cells, it is advantageous if this system further comprises at least one separation column unit.
  • At least one container for reagents is further provided for entering reagents from outside into at least one reaction bag chamber with respect to a reaction bag.
  • the present invention further relates to the use of a reaction bag device according to the invention and / or a modular reaction bag system according to the invention for the cultivation of anti-tumor cells or anti-tumor cell-stimulating cells.
  • the present invention further relates to a method for carrying out cultivation / separation processes with one or more stages and / or multi-stage reactions, for example for the cultivation of anti-tumor cells or anti-tumor cell stimulating cells.
  • reaction bag 1 is a schematic view of a reaction bag according to the invention, which contains four reaction bag chambers, each of which can be connected to one another in sequence;
  • FIG. 2 shows an alternative embodiment of a reaction bag according to the invention with two reaction bag chambers, each of the reaction bag chambers being connectable to a plurality of reagent chambers;
  • reaction bag chambers which follow one another in the sequence being formed by walls which converge in a V-shape
  • Fig. 4 is a schematic view of a reaction bag system, in which separate reaction bags are provided, each with a reaction bag chamber.
  • the reaction bag system 10a comprises a single reaction bag 70a, which is divided by wall sections 72a, 74a, 76a and 78a into four reaction bag chambers 1_, a, 26a, 38a and 52a.
  • the reaction bag system 10a as shown in FIG. 1, is suitable for the expansion of anti-tumor cells. However, it goes without saying that it can be designed for a wide variety of other purposes.
  • the first reaction bag chamber 18a in a reaction sequence has an input opening 16a for external input, into which - as indicated by an arrow 12a - cell populations containing a small number of antitumor cells are inserted.
  • a reagent chamber 80a is formed on an edge section of the first reaction bag chamber 18a.
  • the reagents for the first reaction stage are contained in the reagent chamber 80a.
  • the reagent chamber 80a is separated from the first reaction bag chamber 18a by destructible fluid flow interruption means, such as, for example, a destructible, ie breakable, membrane 81.
  • the frangible membrane is broken by the fingers of a user, so that the reagents are pressed into the first reaction bag chamber 18a by wiping them with their fingers and there with the Starting material of the first stage can react.
  • the first reaction stage is again a stimulation stage in which the anti-tumor cells are stimulated to grow by OKT 3 and / or by vesicles.
  • the user breaks a further breakable membrane 82a which is formed in the wall section 72a which separates the first reaction bag chamber 18a from the second reaction bag chamber 26a, ie after opening a dispensing opening Reaction bag chamber 18a provides.
  • the starting material for the second reaction stage ie the reaction product of the first reaction stage, can be transferred into the second reaction bag chamber 26a by wiping with the fingers.
  • the second reaction bag chamber 26a in turn has a reagent chamber 84a, the structure of which corresponds to the previously described reagent chamber 80a.
  • the reagent chamber 84a again contains, for example, retroviruses which, after being brought into contact with the starting material in the reaction bag chamber 26a, ie the antitumor cells contained therein, initiate a marking process, ie lead to the antitumor cells on the surface Cells a selection marker is stored.
  • a further breakable membrane 86a is formed, which is formed in the wall 74a, which separates the second reaction bag chamber 26a from the third reaction bag chamber 38a.
  • the third reaction bag chamber 38a in turn also has a reagent chamber 88a, which contains, for example, biotinylated antibodies for attachment to the 1-NGFR receptor of the antitumor cells.
  • the reagent chamber 88a is also separated from the third reaction bag chamber 38a by a frangible membrane or the like.
  • the reaction product of the third reaction stage can be fed into a separation column unit 44a via a line 92a via an outlet opening 90a.
  • the anti-tumor cells which have been released from the separation column unit 44a and which are freed from a disturbing background can, as indicated by a dashed arrow 94a, be input directly into a human body, or they can be input into an input opening 98a of a fourth reaction bag chamber 52a, to undergo further expansion there.
  • the reaction bag chamber 52a in turn has a reagent chamber 100a, which contains, for example, lyophilized or otherwise prepared IL 2, which in connection with the antitumor cells obtained from the separation column unit 44a leads to a further growth thereof. Apart from a positive selection, unwanted cells can also be removed from the cell population as part of a negative selection in the column.
  • the reaction product of the fourth reaction stage can be discharged through a discharge opening 54a and - as indicated by an arrow 56a - can be fed into a human body.
  • the different reaction bag chambers have a further input opening 102a through which reagents from an external container, for example a bottle or the like, can be input.
  • a separation column unit 44a ′ can be integrated directly into the wall section 76a separating the third reaction bag chamber 38a from the fourth reaction bag chamber 52a. In this case, there is no need to remove the reaction product of the third reaction stage from the reaction bag 70a and subsequently to enter it. The risk of contamination can thus be further reduced.
  • Each of the reaction bag chambers can have a membrane area ⁇ which can be penetrated through a cannula in order to be able to enter fresh nutrient solutions into the various reaction bag chambers or to be able to withdraw used nutrient solutions, the membrane area again having a fluid after pulling out a cannula from such a membrane area creates a tight seal.
  • reaction bag 70a it is also possible to use the entire reaction bag 70a to carry out at least the second reaction stage, i.e. introducing the marker 25 with retroviruses to undergo centrifugation.
  • reaction bag chambers with their wall sections delimiting them can in turn - as described above - by ultrasonic welding, gluing or the like.
  • reaction chambers are connected to one another in the manner of a square. However, they can also be connected to one another in a linear, circular or other manner in sequence.
  • the reaction bag system 10b comprises a reaction bag 70b which is divided into two reaction bag chambers 110b, 112b by wall sections 106b, 108b.
  • the first reaction bag chamber 110b in turn has an input opening 16b, into which - as indicated by the arrow 12b - cells are input as the starting material.
  • a plurality of reagent chambers 80b, 81b, 84b, 88b are provided on an edge section of the reaction bag chamber 110b, each of which is separated from the reaction bag chamber 110b again by destructible fluid flow interruption means, for example membranes that can be destroyed by finger pressure.
  • destructible fluid flow interruption means for example membranes that can be destroyed by finger pressure.
  • the antitumor cells After the antitumor cells have multiplied, they remain in the reaction bag chamber 110b as the starting material for the second reaction stage. Then the reagents contained in the second reagent chamber 81b, for example IL 2, that is to say a further growth stimulating agent, are introduced into the reaction bag chamber 110b, and a further growth step is carried out. The reaction product of this stage again remains in the reaction bag chamber 110b, and the reagents are subsequently introduced from the reagent chamber 84b. These are, for example, retroviruses that initiate a labeling step. The reagents of the reagent chamber 88b are subsequently introduced, ie, for example, biotinylated antibodies which attach to the antitumor cells and provide a further label.
  • Cells can also be marked which are to be selectively removed from the cell population.
  • This reaction product obtained is then passed, for example, again by wiping with a user's fingers, through a separation column unit 44b 'integrated in the wall sections 106b, 108b, which forms an outlet opening for the reaction bag chamber 110b, so that anti-tumor cells enriched in the second reaction bag chamber 112b enter.
  • Reagent chambers 100b, 101b are in turn assigned to second reaction bag chamber 112b, which can contain growth-promoting agents, for example IL 2, IL 10, IFN ⁇ or the like, in order to carry out one or more further growth or expansion stages after the separation.
  • the reaction product ie the greatly increased antitumor cells, is withdrawn again from the discharge opening 54b and, as indicated by the arrow 56b, introduced into a human body.
  • the reaction bag chambers 110b, 112b each form reaction bag chambers for a plurality of reaction stages to be carried out in succession, the reaction product of a previous stage forming the starting material for the subsequent stage.
  • the construction of the reaction bag is thus simplified since the walls separating the various reaction bag chambers and also destructible fluid flow interrupters or the like provided in these walls can be dispensed with.
  • the reaction bag chambers 110b, 112b of the embodiment in FIG. 2 again have the possibility of entering nutrient solution into this or withdrawing the used nutrient solution.
  • the first reaction bag chamber 110b has an outlet opening from which the reaction product of the last stage carried out in this reaction bag chamber is drawn off, is passed through a separation column unit which is arranged externally, and is subsequently introduced into the second reaction bag chamber 112b through an input opening.
  • Fig. 3 shows a further alternative embodiment of an inventive reaction bag system.
  • Reaction bag system 11Oe in turn comprises a reaction bag 70c with a plurality of reaction bag chambers 114c, 116c, 118c.
  • the reaction bag chamber 114c has an input opening 16c through which starting material can be input into it.
  • the reaction bag chamber 114c is assigned two reagent chambers 80c, 80c 'which can be broken by means of frangible fluid flow interruption means, e.g. breakable membranes 120c, 120c ', can be brought into connection with the reaction bag chamber 114c.
  • the first reaction bag chamber 114c is separated from the second reaction bag chamber 116c which follows this in the reaction sequence by wall sections 122c, 124c which converge essentially in the shape of a funnel.
  • a separation column unit 44c ' is arranged in a fluid transfer area 126c, through which the reaction product of the first reaction bag chamber 114c can be transferred into the second reaction bag chamber 116c.
  • Also assigned to the second reaction bag chamber 116c are two reagent chambers 84c, 84c 'which are arranged essentially opposite one another and which can be brought into connection with the reaction bag chamber 116c via destructible membranes 130c, 130c'.
  • two wall sections 132c extending from the walls 122c, 124c are formed in the second reaction bag chamber 116c.
  • the wall sections 132c form together with the wall sections 122c and 124c in a fluid transfer device R substantially V-shaped expanding areas.
  • the antitumor cells which form a starting material, can accumulate together with nutrient solution by the force of gravity during the multiplication, so that due to the V-shaped formation, an increased concentration of antitumor cells is present in a lower region of the respective accumulation areas , which leads to an increased multiplication.
  • Corresponding accumulation areas are formed between the walls 122c, 124c and the reaction bag chamber 116c, the walls 136c, 138c of the reaction bag 70c which are delimited towards the outside.
  • the second reaction bag chamber 116c is separated from the third reaction bag chamber 118c by wall sections 140c, 142c which run towards a fluid transfer region 144c in a substantially funnel shape.
  • a separation column unit 44c ' is arranged in this fluid transfer region.
  • the third reaction bag chamber 118c is assigned reagent chambers 88c, 88c ', which can again be brought into connection with the reaction bag chamber 118c via breakable membranes or the like. 146c, 146c'. Furthermore, in the third reaction bag chamber 118c, a plurality of wall sections 132c are again arranged, which together with the walls 142c, 140c form accumulation regions which expand in the fluid transfer device R and in which the starting material for cell multiplication or the like can be accumulated.
  • V-shaped converging walls On the one hand, this has the advantage that for fluid transfer between the individual reaction bag chambers in the fluid transfer direction R a funnel effect of the walls is generated, so that the reaction product generated in one reaction bag chamber can be transferred into the next reaction bag chamber with almost no loss. Furthermore, these walls simultaneously serve to form accumulation areas in the different reaction bag chambers, in which cells or the like are then accumulated in order to be able to carry out reactions in order to be able to provide an increased cell concentration.
  • the volume of successive reaction bag chambers 114c, 116c, 118c increases. This is due to the fact that, for example, a predetermined cell concentration must not be exceeded during cell multiplication, since this would hinder further multiplication, i.e. for the different steps in which cell multiplication is to occur, more volume must accordingly be made available for the multiplying cells.
  • Each of the reaction bag chambers can in turn have penetrable membrane means for the introduction or removal of nutrient solution.
  • penetrable membrane means for the introduction or removal of nutrient solution.
  • entry openings through which reagents can be entered from external containers.
  • FIG. 3 shows the reaction bag 70c shown there for use in a number of expansion steps to be carried out in succession.
  • the various reagent chambers can thus contain growth-stimulating or inhibiting reagents such as OKT 3, IL 2, IL 10, IL 12, IFN ⁇ TNFo ", GM-CSF or the like.
  • growth inhibitors such as OKT 3, IL 2, IL 10, IL 12, IFN ⁇ TNFo ", GM-CSF or the like.
  • FIG. 4 shows a modular reaction bag system of the type that can be used, for example, to obtain cell transplants for immunotherapy or gene therapy.
  • the structure of the reaction bag system 10 of FIG. 4 is described below with reference to the cultivation of antitumor cells.
  • a cell population for example a blood sample
  • a cell population is first taken from a human body and contains a small proportion of the antitumor cells to be grown.
  • this sample is introduced into a first reaction bag 14 through an input opening 16.
  • the first reaction bag 14 which forms a stimulation bag, i.e.
  • a bag in which the antitumor cells contained in the blood sample are to be replicated contains a growth stimulating agent for the antitumor cells, for example lyophilized or otherwise prepared OCT 3 and / or the ones described above, before the blood sample is entered Vesicle.
  • the blood sample with the antitumor cells contained therein form the starting material for the reaction step which is to be carried out in the reaction bag 14; the OCT 3 and / or the vesicles with which the first reaction bag 14 is preloaded form the reagents for the reaction of the first stage.
  • the first reaction bag 14, like the further reaction bags described below, has a membrane in its wall, which can be penetrated, for example, by a cannula, so that in the reaction bag 14, i. nutrient solution can be entered into a reaction bag chamber 18 formed therein, or used nutrient solution can be removed.
  • the antitumor cells After the first stage has been completed, ie the antitumor cells have increased sufficiently in the first reaction bag, they are passed through an output opening 20, for example via a flexible line 22 and an input opening 28, and into a second reaction bag 24. wear. In the second reaction bag, the multiplied antitumor cells are brought into contact with a retrovirus as the reagent in this second stage, in order to treat cells genetically and, if necessary, to initiate a cell marker expression.
  • this bag can be subjected to a centrifugation process in a centrifuge (not shown in the figures).
  • the content of the second reaction bag chamber 26 is subsequently examined.
  • Antibodies are contained as reagents in the reaction bag chamber 38 of the third reaction bag 36. Using immuno-adsorptive separation columns based on avidin or sreptavidin, these can be, for example, biotinylated antibodies.
  • a receptor for cell separation is expressed on a cell surface of the antitumor cells.
  • This can e.g. be a low affinity NGF receptor.
  • the biotinylated antibodies attach to this receptor in the reaction bag chamber 38 of the third reaction bag 36 and thus lead to an increased labeling effect of the antitumor cells.
  • the anti-tumor cells marked in this way are introduced via an outlet 40 of the third reaction bag 36 via a line 42 into a separation column unit 44.
  • the separation process carried out in the separation column unit 44 is designed in such a way that the labeled anti-tumor cells can pass through the separation column unit 44 unhindered, whereas unlabeled cells are retained.
  • a Directional valve not shown, can be arranged, which leads in a first way via a line 46 to an input opening 48 of a fourth reaction bag 50.
  • a further growth stimulating agent for example lyophilized or otherwise prepared IL 2
  • the antitumor cells can then be obtained through an outlet opening 54 of the fourth reaction bag 50, as indicated by an arrow 56, and can be injected, for example, into a human body.
  • the reaction bag 58 can be designed such that it essentially corresponds to the third reaction bag 36, i.e. e.g. contains biotinylated antibodies in order to mark the anti-tumor cells obtained from the separation column unit again in its reaction bag chamber 62 and then to guide them again via an output opening 64 and a line 66 shown in broken lines to the entrance of the separation column unit 44.
  • the reaction bag system 10 shown in FIG. 4 comprises a plurality of different reaction bags 14, 24, 36, 50, 58, each of which has a reaction bag chamber 18, 26, 38, 52, 62, which contains the reagents for the different stages of the multi-stage reaction are loaded; i.e. the reagents are introduced into the respective reaction bag chambers of the reaction bags during the manufacture thereof, in order then to prepare them for reaction with the starting material which has been introduced into the respective reaction bags.
  • the system can also comprise only a single such bag for different reactions.
  • Each of the reaction bags preferably consists of a flexible plastic material or layers of flexible plastic materials which are connected to one another in an edge region forming the various reaction bag chambers by welding, gluing or the like. To observe the reactions, the material of the bags can be transparent at least in some areas.
  • the reaction bags are generally rectangular, but can take any other configuration.
  • the input and output openings of the various reaction bags can be such that they are already connected to the respective connection tubes between the individual reaction bags or have means for connection to such tubes. Furthermore, in the area of input or Dispensing openings or the connecting hoses can be provided by means of which the input or output openings can each be closed; These can be valves, clamps or the like, for example. In addition, it is possible to design the input or output openings to be weldable, so that, for example, once an initial material has been introduced into a reaction bag, the associated input opening is welded and the further input or escape of material through this input opening is no longer possible. The same applies to the dispensing openings.
  • the contacting of the respective starting material with the reagents contained in the bags can be carried out, for example, by swiping the fluid-like or liquid starting material forward through the flexible bags with the fingers of a user. Furthermore, it is possible to shake the bags or to centrifuge them, as described above with reference to the second reaction bag 24.
  • the reagents in the various reaction bags can be contained there in liquid or gelatinous form.
  • the reagents in dried form on the inner surface of the reaction bags, so that they are only dissolved when a liquid starting material is added.
  • both the input and the output openings are normally closed and can only be brought into an open state when they are connected to a line hose, a needle or the like.
  • membranes it is possible for membranes to be provided in the area of the input and output openings, which can be penetrated by needles and which produce a tight seal again after the needles have been removed.
  • reaction bags of FIG. 4 it is possible to construct the reaction bags of FIG. 4 in such a way that they contain several reaction bag chambers or that they have one or more 20 reagent chambers 17, which contain reagents for subsequent contacting with starting materials and from the reaction chambers through destructible membranes 19 o. the like are separated. Furthermore, additional input openings for the input of reagents from the outside can also be provided there.
  • reaction product of one of the reaction bag chambers it is also possible to transfer the reaction product of one of the reaction bag chambers to the outside via an outlet opening, to separate them in an externally arranged separation column unit and then to introduce them back into a reaction bag chamber.
  • reaction bag contains a plurality of reaction bag chambers, so that the entire reaction sequence can be practically carried out in one reaction bag, it is possible to work almost contamination-free.
  • reaction bags which are, for example, pre-loaded with different reagents and / or combined with different reagent chambers, it is possible to provide systems for a multitude of different multi-stage processes or reactions by combining different pre-loaded s or reaction bags combined with reagent chambers.
  • a reaction bag with at least one reaction chamber which has a multiplicity of different reagent chambers, but only those reagent chambers which are required for a specific reaction type are then opened for use.
  • the reagents can also be input through the input openings for the starting material, which are then preferably designed to be closable again.

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Abstract

Eine Reaktionsbeutelvorrichtung (10a) zur Durchführung von mehrstufigen Kultivierungs-/Separations-Vorgängen und/oder Reaktionen, beispielsweise zum Züchten von Antitumor-Zellen oder Antitumor-Zellen stimulierenden Zellen, umfaßt eine Mehrzahl von Reaktionsbeutelkammern (18a, 26a, 38a, 52a) in einem Reaktionsbeutel, wobei in jeder Reaktionsbeutelkammer (18a, 26a, 38a, 52a) ein Ausgangsmaterial für die jeweilige Stufe anordenbar ist und mit Reagenzien für die jeweilige Stufe zum Erzeugen eines Reaktionsprodukts der jeweiligen Stufe in Kontakt bringbar ist, und umfaßt ferner Ausgabeöffnungsmittel (82a, 86a, 44a', 54a) zum Ausgeben eines Reaktionsprodukts aus der Reaktionsbeutelkammer (18a, 26a, 38a, 52a).

Description

ReaktionsbeutelVorrichtung zur Durchführung von mehrstufigen Kultivierungs-/Separations-Vorgängen und/oder Reaktionen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reaktionsbeutelvorrichtung zur Durchführung von mehrstufigen Kultivierungs/Sepa- rations-Vorgängen und/oder Reaktionen, beispielsweise zum Züchen von Antitumor-Zellen oder Antitumor-Zellen stimulie- renden Zellen.
Eine Vorgehensweise zur Behandlung von Tumoren ist die -Züchtung von Antitumor-Zellen oder Antitumor-Zellen stimulierende Zellen ex vivo, d.h. außerhalb des menschlichen Körpers. Nach durchgeführter Züchtung, d.h. entsprechend intensiver Vermehrung, der Antitumor-Zellen werden diese wieder in den menschlichen Körper injiziert.
Um derartige Zellen außerhalb des menschlichen Körpers züchten zu können, wird einem Patienten eine Blutprobe entnommen, in der in geringer Anzahl auch Zellen vorhanden sind, die auf einen zu behandelnden Tumor spezifisch ansprechen, die sogenannten Antitumor-Zellen.
Diese in der Blutprobe enthaltenen Antitumor-Zellen können in einem Züchtgefäß in einer Nährlösung dadurch zur Vermehrung angeregt werden, daß sie mit ganzen Tumorzellen oder sogenannten Vesikeln der Tumorzellen in Kontakt gebracht werden.
Tumorzellen können beispielsweise aus dem in einem Patienten vorhandenen Tumorgewebe erhalten werden. Durch Lyse der Tumorzellen und anschließendes Filtrieren wird die Erbinformation entfernt, so daß man nur noch die Zellmembran oder Bruchstücke dieser zurückbehält, die die vorangehend erwähnten Vesikel bilden. Diese Vesikel weisen die für Tumorzellen charakteristischen Oberflächenmerkmale auf, so daß sie von Antitumor- Zellen als Tumorzellen erkannt werden und zu einer dementspre- chenden Anregung der Vermehrung der Antitumor-Zellen führen. Da die Vesikel lediglich über die Oberflächenmerkmale der Tumorzellen, jedoch nicht mehr über die Erbinformation der Tumorzellen verfügen, können sie nicht z.B. durch Abgabe von Inhibitoren auf die sich vermehrenden Antitumor-Zellen einwirken.
Während der Wachstums- bzw. Vermehrungsstimulation der Antitumor-Zellen durch Tumorzellen oder Vesikel wird die Nährlösung ausgetauscht, und die Zellen werden auf mehrere Züchtbehälter portioniert .
Ist die Vermehrung in ausreichendem Maße durchgeführt worden, so werden in einem Selektionsschritt die Antitumor-Zellen von einem unerwünschten Hintergrund getrennt. Hierzu werden die Antitumor-Zellen beispielsweise mit Hilfe von lyophilisierten oder auf sonstige Weise vorbereiteten Retroviren markiert. Diese Retroviren führen an der Oberfläche der Antitumor-Zellen zur Expression z.B. des 1 -NGFR-Rezeptors , der in einer nach- folgenden Separationsstufe zur Anreicherung der Antitumor- Zellen beiträgt. Nach durchgeführter Separation, d.h. Anreicherung der Antitumor-Zellen, ist es möglich, diese entweder erneut einer Separation zu unterziehen, um die Anreicherungs- rate zu erhöhen, oder einem weiteren Wachstumsschritt zu un- terziehen, beispielsweise unter Hinzufügung eines wachstumsfördernden Mittels.
Bei der Durchführung derartiger Kultivierungs/Separations- Vorgänge ebenso wie anderer mehrstufiger chemischer oder bio- logischer Reaktionen ist es wichtig, daß die einzelnen Reak- tionsstufen sowie die Übertragung von Materialien zwischen einzelnen Reaktionsstufen derart durchgeführt werden können, daß einerseits die Einbringung von Kontaminierungen in einzelne Reaktionsstufen vermieden wird, daß andererseits jedoch eine Kontaminierung der Umgebung mit in einzelnen Reaktionsstufen erzeugten Reaktionsprodukten vermieden werden kann. Darüber hinaus ist zur Anpassung derartiger mehrstufiger Vor- gänge an verschiedene Erfordernisse eine relativ große Flexibilität bei der Auswahl der verschiedenen Stufen erforderlich, um beispielsweise zusätzliche Reaktionsstufen hinzufügen zu können oder Reaktionsstufen weglassen zu können. Beispiels- weise ist es bekannt, Reaktionen in Reaktionsbeuteln durchzuführen, die eine Eingabeöffnung für ein Ausgangsmaterial, eine Eingabeöffnung für die Reagenzien sowie eine Ausgabeöffnung aufweisen, aus der das durch die Reaktion des Aus- gangsmaterials mit den Reagenzien erzeugte Produkt aus dem Beutel entnommen werden kann. Für jede Reaktion, d.h. jede Stufe, ist daher ein einziger Beutel vorgesehen, in den verschiedene Materialien einzugeben sind bzw. aus dem Materialien zu entnehmen sind. Insbesondere beim Eingeben bzw. Entnehmen von jeweiligen Materialien besteht die Gefahr, daß durch diese Materialien die Umgebung kontaminiert wird oder daß Kontaminierungen in das Material eingebracht werden.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenen Erfindung, eine Reaktionsbeutelvorrichtung zur Durchführung von mehrstufigen Kultivierungs/Separations-Vorgängen und/oder Reaktionen, beispielsweise zum Züchen von Antitumor-Zellen oder Antitumor- Zellen stimulierenden Zellen, vorzusehen, mit der bei hoher Flexibilität hinsichtlich der durchzuführenden Stufen ein im wesentlichen kontaminierungsfreies Arbeiten ermöglicht wird.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch eine Reaktionsbeutelvorrichtung zur Durchführung von mehrstufigen Kul- tivierungs/Separations-Vorgängen und/oder Reaktionen, beispielsweise zum Züchten von Antitumor-Zellen oder Antitumor- Zellen stimulierenden Zellen, umfassend: eine Mehrzahl von Reaktionsbeutelkammern in einem Reaktionsbeutel, wobei in jeder Reaktionsbeutelkammer ein Ausgangsmaterial für die jeweilige Stufe anordenbar ist und mit Reagenzien für die jeweilige Stufe zum Erzeugen eines Reaktionsprodukts der jeweiligen Stufe in Kontakt bringbar ist, Ausgabeöffnung mittel zum Ausgeben eines Reaktions- produkts aus jeder Reaktionsbeutelkammer.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung werden also die Reaktio- nen der einzelnen Stufen in einem Reaktionsbeutel mit mehreren Reaktionsbeutelkammern durchgeführt, in der einerseits zur Durchführung der Reaktion der jeweiligen Stufe ein Ausgangsmaterial für die Stufen anordenbar und andererseits dieses Ausgangsmaterial in Kontakt mit einem Reagenz für die Stufe gebracht werden kann. Da die Reaktion also in einer vollständig abgeschlossenen Umgebung stattfinden kann, besteht nicht die Gefahr einer Kontaminierung der Umgebung oder Einbringung von Verunreinigungen in die Reaktion der jeweiligen Stufen. Die erfindungsgmäße Vorrichtung ist relativ einfach und ko- stengünstig herstellbar und sieht aufgrund der Möglichkeit des beliebigen Hinzufügens bzw. Integrierens von zusätzlichen Reaktionsbeutelkammern in einen Vorgang bzw. das Herausnehmen einer Reaktionsbeutelkammer aus einem Vorgang eine hohe Flexibilität bei der Durchführung von Reaktionen vor.
Der in dem vorliegenden Text verwendete Ausdruck "Ausgangs- material" ist derart zu verstehen, daß er jegliche Art von Material, d.h. Zellen und sonstiges biologisches oder chemisches Material, umfaßt, das in einer jeweiligen Reaktionsstufe zu einem Reaktionsprodukt dieser Stufe weiterverarbeitet, vermehrt oder verändert werden soll. In entsprechender Weise ist der in diesem Text verwendete Ausdruck "Reagenzien" derart zu verstehen, daß er jegliche Art von Material, d.h. biologisches, chemisches oder sonstige Materialien, sowie Kombinatio- nen verschiedener Materialien oder Reagenzien umfaßt, die in Zusammenwirkung mit dem Ausgangsmaterial der jeweiligen Stufe zu einer Weiterverarbeitung, Bearbeitung, Vermehrung o. dgl . des Ausgangsmaterials beitragen.
Wenigstens eine der Reaktionsbeutelkammern kann eine Eingabeöffnung zum Eingeben eines Ausgangsmaterials in diese von außen bezüglich des Reaktionsbeutels aufweisen und die Reak- tionsbeutelkam ern können in Sequenz zur Übertragung des Reak- tionsprodukts einer in der Sequenz vorangehenden Reaktionsbeutelkammer als Ausgangsmaterial in wenigstens eine in der Sequenz folgende Reaktionsbeutelkammer ausgebildet sein. Da bei dieser Ausgestaltung das Reaktionsprodukt direkt zwischen den Reaktionsbeutelkammern übertragen wird und somit keinen Kontakt zur Umgebung bekommt, ist auf diese Art und Weise eine besonders sichere und kontaminationsfreie Durchführung der Reaktionen oder der Kultivierungs/Separations-Vorgänge gewähr- leistet.
Um einen gesteuerten Transfer von Reaktionsprodukten . bzw. Ausgangsmaterialien zwischen den verschiedenen Reaktonsbeutel- kammern vorsehen zu können, wird vorgeschlagen, daß zwischen wenigstens zwei in der Sequenz aufeinanderfolgenden Reaktionsbeutelkammern offenbare Fluidflußunterbrechungsmittel vorgesehen sind, vorzugsweise zerstörbare Fluidflußunterbrechungsmittel, welche eine Ausgabeöffnung der in der Sequenz vorangehenden Reaktionsbeutelkammer bilden.
Um nach Durchführung einer Reaktion Zugriff auf das dabei erzeugte Reaktionsprodukt zu erhalten, wird vorgeschlagen, daß wenigstens eine der Reaktionsbeutelkammern, vorzugsweise die in der Sequenz letzte Reaktionsbeutelkammer, eine Ausgabeöff- nung zum Ausgeben des Reaktionsprodukts aus dieser nach außen bezüglich des Reaktionsbeutels aufweist.
Ferner kann vorgesehen sein, daß bei zwei in der Sequenz aufeinander folgenden Reaktionsbeutelkammern eine vorangehende Reaktionsbeutelkammer eine Ausgabeöffnung aufweist und eine nachfolgende Reaktionsbeutelkammer eine Eingabeöffnung aufweist. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn das in der vorangehenden Reaktionsbeutelkammer gewonnene Reaktionsprodukt in einer externen Vorrichtung weiter verarbeitet wird und nachfolgend wieder in den in der Reaktionsbeutelvorrichtung durchzuführenden Vorga g einzubringen ist, nämlich in die nachfolgende Reaktionsbeutelkammer. Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung der Reaktionsbeutelvorrichtung kann diese wenigstens eine Reaktionsbeutelkammer umfassen, die eine Reaktionsbeutelkammer für eine Mehrzahl von aufeinander folgenden Stufen ist, wobei jeweils das Reak- 5 tionsprodukt einer vorangehenden Stufe das Ausgangsmaterial für eine nachfolgende Stufe bildet. Bei derartiger Ausgestaltung bleibt also das zu verarbeitende, zu vermehrende o. dgl . Material in der wenigstens einen Reaktionsbeutelkammer enthalten, so daß auch dabei kontaminationsfrei gearbeitet werden o kann .
Bei Verwendung einer Reaktionsbeutelvorrichtung, die me-hrere Reaktionsbeutelkammern enthält, kann das in den Reaktionsbeutelkammern enthaltene flüssige, fluidartige oder gallertartige s Material, beispielsweise durch Abstreifen mit den Fingern, vorwärtstransportiert, d.h. in eine nächste Reaktionsbeutelkammer transportiert werden. Um dabei einen sehr effizienten Übertragungsvorgang zu gewährleisten, ohne dabei irgendwelches in einer Reaktionsbeutelkammer enthaltenes Reaktionsprodukt zu 0 verlieren, wird vorgeschlagen, daß in der Sequenz aufeinander folgende Reaktionsbeutelkammern durch Trennwandungen voneinander getrennt sind, die auf einen Fluidtransferbereich zwischen den aufeinander folgenden Reaktionsbeutelkammern in einer Fluidtransferrichtung im wesentlichen trichterförmig s zulaufen.
Insbesondere bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Reaktionsbeutelvorrichtung zur Züchtung von Antitumor-Zellen ist es bei der Vermehrung von Antitumor-Zellen vorteilhaft, wenn 0 das Ausgangsmaterial , das eine relativ geringe Anzahl an Antitumor-Zellen enthält, in einem relativ kleinen Volumenbereich angesammelt wird, da eine Zunahme der Konzentration an Antitumor-Zellen zu einem beschleunigten Wachstum führt. Um bei der erfindungsgemäßen Reaktonsbeutelvorrichtung in wenigstens 5 einer Reaktionsbeutelkammer eine derartige Ansammlung bzw. Konzentration vorsehen zu können, wird vorgeschlagen, daß in wenigstens einer Reaktionsbeutelkammer wenigstens ein durch vorzugsweise V-förmig aufeinander zulaufende Wandungsab- schnitte gebildeter Ausgangsmaterial/Reaktionsprodukt-Ansammelbereich gebildet ist. Dabei ist vorteilhafterweise der wenigstens eine Ausgangsmaterial/Reaktionsproduk -Ansammelbe- reich sich in der Fluidtransferichtung erweiternd ausgebildet.
Zur Vereinfachung der Herstellung der Reaktionsbeutelvorrichtung wird vorgeschlagen, daß die trichterförmig aufeinander zulaufenden Trennwandungen wenigstens bereichsweise die Wan- dungsabschnitte des Ausgangsmaterial/Reaktionsprodukt-Ansam- melbereichs bilden.
Wird das Wachstum bzw. die Vermehrung von Antitumor-Zellen in mehreren in Sequenz angeordneten Reaktionsbeutelkammern durch- geführt, beispielsweise jeweils unter Hinzufügung verschiedener Wachstumsstimulanzen, so muß darauf geachtet werden, daß die sich vermehrenden Antitumor-Zellen eine bestimmte Konzentration nicht überschreiten, da dies zu einer Hemmung des Wachstums bzw. der Vermehrung führt; d.h. mit zunehmendem Fortschreiten des Wachstumsvorgangs ist dafür zu sorgen, daß für die sich vermehrenden Antitumor-Zellen mehr Volumen zur Verfügung steht. Dies kann in einfacher Weise dadurch erreicht werden, daß in der Sequenz aufeinander folgende Reaktionsbeutelkammern ein zunehmendes Kammervolumen aufweisen.
Um in einer Reaktionsbeutelkammer das Ausgangsmaterial mit den Reagenzien der jeweiligen Stufe in Kontakt bringen zu können, ist es gemäß einer besonders einfachen und praktischen Aus- führungsform möglich, daß wenigstens eine der Reaktionsbeutel- kammern bereits vor Eingabe des Ausgangsmaterials mit den Reagenzien vorbeschickt ist. Bei einer derartigen Ausgestaltung muß also bei der nachfolgenden Verwendung lediglich das Ausgangsmaterial eingegeben werden.
Ferner ist es möglich, daß bei wenigstens einer Reaktionsbeutelkammer wenigstens eine Reagenzienkammer vorgesehen ist, die durch offenbare Fluidflußunterbrechungsmittel , vorzugsweise zerstörbare Fluidflußunterbrechungsmittel , in Reagenzienübertragungsverbindung mit der Reaktionsbeutelkammer bringbar ist, und daß in der Reagenzienkammer die Reagenzien für die jeweilige Stufe enthalten sind. Bei einer derartigen Ausgestaltung s können die für eine jeweilige Stufe vorgesehenen Reagenzien, beispielsweise nach Einbringen des Ausgangsmaterials für die Stufe, zu einem beliebigen Zeitpunkt in Kontakt mit dem Ausgangsmaterial gebracht werden.
0 Dabei ist es beispielsweise möglich, daß wenigstens eine Reaktionsbeutelkammer mit einer Mehrzahl von Reagenzienkammern für verschiedene Stufen versehen ist, die zur sequentiellen Durchführung der mehreren Stufen nacheinander in Reagenzienübertragungsverbindung mit der Reaktionsbeutelkammer bringbar sind. Es werden dabei also die Reaktionen mehrerer aufeinander folgender Stufen in einer einzigen Reaktionsbeutelkammer durchgeführt und jeweils lediglich die in den verschiedenen Reagenzienkammern enthaltenen Reagenzien sequentiell entsprechend der Reihenfolge der Stufen in die Reaktionsbeutelkammer übertragen, d.h. das bei einer Reaktion zwischen Reagenzien und Ausgangsmaterial erzeugte Reaktionsprodukt bildet dabei das Ausgangsmaterial für die Reaktion der nächsten Stufe, das dann mit den Reagenzien für die nächste Stufe in Kontakt zu bringen ist .
Ferner kann bei wenigstens einer Reaktionsbeutelkammer eine dicht verschließbare Reagenzieneingabeöf fnung zum Eingeben von Reagenzien in die Reaktionsbeutelkammer aus einem externen Behälter vorgesehen sein .
Zur Durchführung der vorangehend angesprochenen Separation bei der Antitumor-Zellen-Züchtung kann ferner zwischen wenigstens zwei in der Sequenz aufeinander folgenden Reaktionsbeutelkammern eine Separationssäulenvorrichtung zum Fluidtransfer durch diese hindurch vorgesehen sein. Bei einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Reaktionsbeutelvorrichtung ist die Separationssäulenvorrichtung in eine die wenigstens zwei Reaktionsbeutelkammern trennende Wandung eingegliedert, d.h. selbst zur Durchführung der Separation ist es nicht erforderlich, das Reaktionsprodukt einer Stufe nach außen zu führen, durch eine Separationssäule o. dgl . hindurchzuleiten und das daraus ge- wonnnene, konzentrierte Material wieder in einen Beutel einzugeben, beispielsweise zur weiteren Zellvermehrung.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Reaktionsbeutelvorrichtung zur Durchführung von gewü-nsch- tenfalls mehrstufigen Kultivierungs/Separations-Vorgängen und/oder Reaktionen, beispielsweise zum Züchten von Antitumor- Zellen oder Antitumor-Zellen stimulierenden Zellen, vorgesehen, umfassend einen Reaktionsbeutel mit einer Reaktionsbeutelkammer, in der ein Ausgangsmaterial für eine Stufe anordenbar und mit Reagenzien für die Stufe zum Erzeugen eines Reak- tionsprodukts der Stufe in Kontakt bringbar ist, wobei der Reaktionsbeutel eine Eingabeöffnung zum Eingeben von Ausgangs- material in diesen sowie eine Ausgabeöffnung zum Ausgeben eines in dem Reaktionsbeutel erzeugten Reaktionsprodukts aufweist und wobei die Reaktionsbeutelvorrichtung die Reagenzien enthält und mit diesen zu einer Reaktionseinheit vorbereitet ist .
Bei dieser erfindungsgemäßen Ausgestaltung eines Reaktions- beutels muß also lediglich das Ausgangsmaterial in die Reaktionsbeutelkammer eingebracht werden und kann dort zur Reak- tion mit den bereits in jedem Reaktionsbeutel bereitgehaltenen Reagenzien gebracht werden, d.h. auch bei einer derartigen Reaktionsbeutelvorrichtung ist die Gefahr des Einbringens von Kontaminierungen über die Reagenzien verringer .
Zur Vorbereitung der Reaktionseinheit kann beispielsweise vorgesehen sein, daß die Reaktionsbeutelkammer mit den Reagenzien vorbeschickt ist. Alternativ oder zusätzlich ist es möglich, daß der Reaktionsbeutel wenigstens eine Reagenzienkammer umfaßt, die durch offenbare Fluidflußunterbrechungsmittel , vorzugsweise zerstörbare Fluidflußunterbrechungsmittel , in Reagenzienübertragungs- Verbindung mit der Reaktionsbeutelkammer bringbar ist, und daß in der wenigstens einen Reagenzienkammer die Reagenzien für die jeweilige Stufe enthalten sind.
Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung kann vor- gesehen sein, daß die Reaktionsbeutelkammer eine Reaktionsbeutelkammer für eine Mehrzahl von aufeinander folgenden Stufen ist, wobei jeweils das Reaktionsprodukt einer vorangehenden Stufe das Ausgangsmaterial für eine nachfolgende Stufe bildet, d.h. auch bei derartiger Ausgestaltung kann in einem Reaktionsbeutel, d.h. in einer einzigen Reaktionsbeutelkammer, eine Mehrzahl an Reaktionsstufen aufeinanderfolgend durchgeführt werden, ohne daß jeweils das Reaktionserzeugnis aus dem Beutel ausgegeben werden muß.
Dabei ist es vorteilhaft, wenn der Reaktionsbeutel eine Mehrzahl von Reagenzienkammern für verschiedene Stufen umfaßt, welche Reagenzienkammern zur sequentiellen Durchführung der mehreren Stufen nacheinander in Reagenzienübertragungsverbin- dung mit der Reaktionsbeutelkammer bringbar sind.
Zusätzlich ist es möglich, daß bei der Reaktionsbeutelkammer ferner eine dicht verschließbare Reagenzieneingabeöffnung zum Eingeben von Reagenzien in die Reaktionsbeutelkammer aus einem externen Behälter vorgesehen ist. Auch somit lassen sich mehr- stufige Reaktionen in einem Reaktionsbeutel durchführen, wenn beispielsweise eine erste Reaktion durch Einbringen eines Ausgangsmaterials in einen - beispielsweise vorbeschickten - Reaktionsbeutel durchgeführt wird, das Reaktionserzeugnis dieser Stufe in der Reaktionsbeutelkammer belassen wird und nachfolgend durch Eingeben von Reagenzien aus einem externen Behälter eine zweite Reaktionsstufe durchgeführt wird. Um das Ausgangsmaterial in möglichst einfacher Art und Weise in die jeweilige Reaktionsbeutelkammer einbringen zu können und/oder Ausgangsmaterial aus einer Reaktionsbeutelkammer entnehmen zu können, wird vorgeschlagen, daß die Eingabe- und/ s oder die Ausgabeöffnungen durch Ventile, zerstörbare oder wie- derverschließbare Verschlußmittel o. dgl . verschlossen sind.
Die erfindungsgemäße Reaktionsbeutelvorrichtung ist vorzugsweise aus flexiblem, vorzugsweise gasdurchlässigem jedoch o flüssigkeitsundurchlässigem, Kunststoff hergestellt. Dies trägt einerseits zu einer besonders einfachen und kostengünstigen Herstellbarkeit bei, andererseits ist die Gefahr einer Beschädigung derartiger Reaktionsbeutelvorrichtungen aus flexiblem Kunststoff, beispielsweise durch Zerbrechen, praktisch s ausgeschlossen.
Ferner ist die jeweilige Reaktionsbeutelkammer vorzugsweise mit der wenigstens einen Reagenzienkammer integral ausgebildet . 0
Um bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Reaktionsbeutel - Vorrichtung zur Zellvermehrung die Vermehrung immer in einer geeigneten Umgebung durchführen zu könen, wird vorgeschlagen, daß die jeweilige Reaktionsbeutelkammer zur Eingabe frischer s Nährlösung bzw. zur Entnahme verbrauchter Nährlösung ausgebildet ist.
Beispielsweise kann die jeweilige Reaktionsbeutelkammer einen durch eine ."müle o. dgl. durchdringbaren Membranbereich auf- 0 weisen, der nach Entfernen der Kanüle einen fluiddichten Abschluß selbsttätig wieder herstellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein modulares Reak- tionsbeutelsystem, umfassend eine oder eine Mehrzahl von er- 5 findungsgemäßen Reaktionsbeutelvorrichtungen . Je nach Verwendungszweck kann dann das modulare Reaktionsbeutelsystem aus geeignet vorbereiteten Reaktionsbeutelvorrichtungen zusammen- gestellt werden, wobei die Reaktionsbeutelvorrichtung jeweils beispielsweise mit den Reagenzien für gewünschte Reaktions- stufen beschickt sind oder diese in bestimmten Reaktionskammern enthalten. Aus einer bestimmten Anzahl verschiedener Reaktionsbeutelvorrichtungen kann dann für einen bestimmten durchzuführenden mehrstufigen Vorgang ein geeignetes Beutelsystem zusammengestellt werden, in dem lediglich diejenigen Reaktionsbeutelkammern enthalten sind, die für den Vorgang tatsächlich benötigt werden.
Soll das modulare Reaktionsbeutelsystem zur Zellvermehrung, beispielsweise zur Vermehrung von Antitumor-Zellen, verwendet werden, so ist es vorteilhaft, wenn dieses System ferner wenigstens eine Separationssäuleneinheit umfaßt.
Um in die Reaktionskammern gewünschtenfalls von außen Reagenzien eingeben zu können, wird vorgeschlagen, daß ferner wenigstens eine Behälter für Reagenzien vorgesehen ist, um Reagenzien in wenigstens eine Reaktionsbeutelkammer von außen bezüglich eines Reaktionsbeutels einzugeben.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer erfindungsgemäßen Reaktionsbeutelvorrichtung und/oder eines erfindungsgemäßen modularen Reaktionbeutelsystems zur Züchtung von Antitumor-Zellen oder Antitumor-Zellen stimulierenden Zellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Durchführung von Kultivierungs/Separations-Vorgängen mit einer oder mehreren Stufen und/oder mehrstufigen Reaktionen, beispielsweise zum Züchten von Antitumor-Zellen oder Antitumor- Zellen stimulierenden Zellen.
Die Erfindung wird nachfolgend mit Bezug auf die beiliegenden Zeichungen anhand bevorzugter Ausführungsfor en detailliert beschrieben . Es zeigt - '
Fig. 1 eine sche atische Ansicht eines erfindungsgemäßen Reaktionsbeutels, der vier Reaktionsbeutelkammern enthält, die jeweils in Sequenz miteinander in Verbindung gebracht werden können;
Fig. 2 eine alternative Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Reaktionsbeutels mit zwei Reaktionsbeutel - kammern, wobei jede der Reaktionsbeutelkammern mit einer Mehrzahl von Reagenzienkammern in Verbindung bringbar ist;
Fig. 3 eine weitere alternative Ausgestaltungsform eines erfindungsgemäßen Reaktionsbeutels, wobei der Übergang zwischen in der Sequenz aufeinanderfolgenden Reaktionsbeutelkammern durch V-förmig aufeinander zulaufende Wandungen gebildet ist; und
Fig. 4 eine schematische Ansicht eines Reaktionsbeutelsystems, bei dem separate Reaktionsbeutel mit jeweils einer Reaktionsbeutelkammer vorgesehen sind.
In Fig. 1 ist eine erste Ausführungsform eines erfindungsgemä- ßen Reaktionsbeutelsystems 10a dargestellt. Das Reaktionsbeu- telsystem 10a umfaßt einen einzigen Reaktionbeutel 70a, der durch Wandungsabschnitte 72a, 74a, 76a und 78a in vier Reaktionsbeutelkammern l_,a, 26a, 38a und 52a unterteilt ist. Das Reaktionsbeutelsystem 10a, wie es in Fig. 1 dargestellt ist, ist zur Expansion von Antitumor-Zellen geeignet. Es ist jedoch selbstverständlich, daß es für verschiedenste andere Zwecke ausgelegt werden kann.
Die in einer Reaktionssequenz erste Reaktionsbeutelkammer 18a weist eine Eingabeöffnung 16a zum Eingeben von außen auf, in die - wie durch einen Pfeil 12a angedeutet - Zellpopulationen, die eine geringe Anzahl an Antitumor-Zellen enthalten, einge- geben werden. An einen Randabschnitt der ersten Reaktionsbeutelkammer 18a ist eine Reagenzienkammer 80a angeformt. In der Reagenzienkammer 80a sind die Reagenzien für die erste Reaktionsstufe enthalten. Die Reagenzienkammer 80a ist von der ersten Reaktionsbeutelkammer 18a durch zerstörbare Fluidfluß- unterbrechungsmittel , wie z.B. eine zerstörbare, d.h. zerbrechbare, Membran 81 getrennt. Entweder bevor oder nachdem das Ausgangsmaterial, d.h. z.B. Zellen, in die erste Reaktionsbeutelkammer 18a eingegeben worden ist, wird durch die Finger eines Verwenders die zerbrechbare Membran zerbrochen, so daß die Reagenzien durch Abstreifen mit den Fingern in die erste Reaktionsbeutelkammer 18a gedrückt werden und dort mit dem Ausgangsmaterial der ersten Stufe reagieren können. Die erste Reaktionsstufe ist wiederum eine Stimulationsstufe, in der die Antitumor-Zellen durch OKT 3 und/oder durch Vesikel zum Wachstum angeregt werden.
Nachdem die Stimulationsreaktion in ausreichendem Maße durchgeführt worden ist, wird durch den Verwender eine weitere zerbrechbare Membran 82a zerbrochen, die in dem Wandungsab- schnitt 72a ausgebildet ist, der die erste Reaktionsbeutelkammer 18a vcn der zweiten Reaktionsbeutelkammer 26a trennt, d.h. nach dem Öffnen eine Ausgabeöffnung der Reaktionsbeutelkammer 18a vorsieht. Durch Abstreifen mit den Fingern kann das Aus- gangsmaterial für die zweite Reaktionsstufe, d.h. das Reaktionsprodukt der ersten Reaktionsstufe , in die zweite Reaktionsbeutelkammer 26a transferiert werden. Die zweite Reaktionsbeutelkammer 26a weist wiederum eine Reagenzienkammer 84a auf, die in ihrem Aufbau der vorangehend beschriebenen Reagen- zienkammer 80a entspricht. In der Reagenzienkammer 84a sind beispielsweise wieder Retroviren enthalten, die nach ihrem Inkontaktbringen mit dem Ausgangsmaterial in der Reaktionsbeutelkammer 26a, d.h. den Antitumor-Zellen, die darin enthalten sind, einen Markierungsvorgang einleiten, d.h. dazu füh- ren, daß an der Oberfläche der Antitumor-Zellen ein Selek- tionsmarker eingelagert wird. Nachdem diese Reaktion durchgeführt worden ist, wird eine weitere zerbrechbare Membran 86a zerbrochen, die in der Wandung 74a ausgebildet ist, die die zweite Reaktionsbeutelkammer 26a von der dritten Reaktionsbeutelkammer 38a trennt. Auch die dritte Reaktionsbeutelkammer 38a weist wiederum eine Reagenzienkammer 88a auf, in der beispielsweise biotinylierte Antikörper zur Anlagerung an den 1-NGFR-Rezeptor der Antitumor- Zellen enthalten sind. Auch die Reagenzienkammer 88a ist durch eine zerbrechbare Membran o. dgl. von der dritten Reaktions- beutelkammer 38a getrennt.
Ist die Reaktion in der dritten Reaktionsbeutelkammer 38a durchgeführt, so kann über eine Ausgabeöffnung 90a das Reak- tionsprodukt der dritten Reaktionsstufe über eine Leitung 92a in eine Separationssäuleneinheit 44a eingegeben werden. Die aus der Separationssäuleneinheit 44a ausgegebenen Antitumor- Zellen, die von einem störenden Hintergrund befreit sind, können - wie durch einen strichlierten Pfeil 94a angedeutet - direkt in einen menschlichen Körper eingegeben werden, oder sie können in eine Eingabeöffnung 98a einer vierten Reaktionsbeutelkammer 52a eingegeben werden, um dort einer weiteren Expansion unterzogen zu werden. Zu diesem Zweck weist die Reaktionsbeutelkammer 52a wiederum eine Reagenzienkammer 100a auf, in der beispielsweise lyophilisiertes oder auf andere Weise vorbereitetes IL 2 enthalten ist, das in Verbindung mit den aus der Separationssäuleneinheit 44a erhaltenen Antitumor- Zellen zu einem weiteren Wachstum derselben führt. Abgesehen von einer Positiv-Selektion können auch im Rahmen einer Negativ-Selektion in der Säule unerwünschte Zellen aus der Zell- population entfernt werden. Nach Durchführung dieses weiteren Expansionsschrittes kann das Reaktionsprodukt der vierten Reaktionsstufe durch eine Ausgabeöffnung 54a ausgegeben werden und - wie durch einen Pfeil 56a angedeutet - in einen menschlichen Körper eingegeben werden.
Wie bei der ersten Reaktionsbeutelkammer 18a in Fig. 1 angedeutet, ist es möglich, daß die verschiedenen Reaktionsbeutel- kammern eine weitere Eingabeöffnung 102a aufweisen, durch die Reagenzien aus einem externen Behälter, beispielsweise einer Flasche o. dgl., eingegeben werden können.
5 Ferner kann - wie in Fig. 1 strichliert dargestellt - eine Separationsäuleneinheit 44a' direkt in den die dritte Reaktionsbeutelkammer 38a von der vierten Reaktionsbeutelkammer 52a trennenden Wandungsabschnitt 76a integriert sein. In diesem Fall entfällt das Entnehmen des Reaktionsprodukts der o dritten Reaktionsstufe aus dem Reaktionsbeutel 70a und das nachfolgende Eingeben in diesen. Es kann somit die Gefahr einer Kontamination weiter vermindert werden.
Jede der Reaktionsbeutelkammern kann einen Membranbereich ιε aufweisen, der durch eine Kanüle durchdringbar ist, um in die verschiedenen Reaktionsbeutelkammern frische Nährlösungen eingeben zu können bzw. verbrauchte Nährlösungen abziehen zu können, wobei nach Herausziehen einer Kanüle aus einem derartigen Membranbereich der Membranbereich wieder einen fluid- 20 dichten Abschluß herstellt.
Obgleich vorangehend nicht beschrieben, ist es ebenso möglich, den gesamten Reaktionsbeutel 70a zur Durchführung wenigstens der zweiten Reaktionsstufe, d.h. des Einleitens der Markierung 25 mit Retroviren, einer Zentrifugation zu unterziehen.
Die verschiedenen Reaktionsbeutelkammern mit ihren diese begrenzenden Wandungsabschnitten können wiederum - wie vorangehend beschrieben - durch Ultraschallverschweißen , Verkleben o.
30 dgl. zweier - möglicherweise transparenter - Lagen von Kunststoffmaterial gebildet werden. Bei diesem Vorgang können gleichzeitig die verschiedenen zerstörbaren Membranen, die verschiedene Kammern voneinander trennen, sowie die Reagenzienkammern selbst angeformt bzw. mit dem Reaktionsbeutel 70a
35 integral ausgebildet v/erden. In der Darstellung sind die Reaktionskammern nach Art eines Quadrats miteinander verbunden. Sie können jedoch auch in linearer, kreisförmiger oder sonstiger Weise in Sequenz miteinander verbunden sein.
In Fig. 2 ist ein alternatives Reaktionsbeutelsystem 10b dargestellt. Das Reaktionsbeutelsystem 10b umfaßt einen Reaktionsbeutel 70b, der durch Wandungsabschnitte 106b, 108b in zwei Reaktionsbeutelkammern 110b, 112b unterteilt ist. Die erste Reaktionsbeutelkammer 110b weist wiederum ein Eingabeöffnung 16b auf, in die - wie durch den Pfeil 12b angedeutet - Zellen als Ausgangsmaterial eingegeben werden.
An einem Randabschnitt der Reaktionsbeutelkammer 110b ist eine Mehrzahl von Reagenzienkammern 80b, 81b, 84b, 88b vorgesehen, die jeweils wieder durch zerstörbare Fluidflußunterbrechungsmittel, beispielsweise durch Fingerdruck zerstörbare Membranen, von der Reaktionsbeutelkammer 110b getrennt sind. Nach Einleiten der Zellpopulationen, welche die Antitumor-Zellen enthalten, in die Reaktionsbeutelkammer 110b als Ausgangsmaterial für die erste Stufe werden die Reagenzien, die in der Reagenzienkammer 80b enthalten sind, beispielsweise OKT 3 und/oder Vesikel, in die Reaktionsbeutelkammer 110b eingeleitet und zur Reaktion mit dem Ausgangsmaterial gebracht, d.h. es wird eine erste Wachstumsstimulation durchgeführt.
Nach erfolgter Vermehrung der Antitumor-Zellen verbleiben diese als Ausgangsmaterial für die zweite Reaktionsstufe in der Reaktionsbeutelkammer 110b. Es werden dann die in der zweiten Reagenzienkammer 81b enthaltenen Reagenzien, beispielsweise IL 2, d.h. ein weiteres Wachstumsstimulationsmit- tel, in die Reaktionsbeutelkammer 110b eingeleitet, und ein weiterer Wachstumsschritt wird durchgeführt. Das Reaktionsprodukt dieser Stufe verbleibt wiederum in der Reaktionsbeu- telkammer 110b, und es werden nachfolgend die Reagenzien aus der Reagenzienkammer 84b eingeleitet. Dies sind beispielsweise wieder Retroviren, die einen Markierungsschritt einleiten. Nachfolgend werden die Reagenzien der Reagenzienkammer 88b eingeleitet, d.h. z.B. biotinylierte Antikörper, die sich an die Antitumor-Zellen anlagern und eine weitere Markierung vorsehen. Ebenso können Zellen markiert werden, die selektiv aus der Zellpopulation entfernt werden sollen. Dieses erhaltene Reaktionsprodukt wird dann, beispielsweise wiederum durch Abstreifen mit den Fingern eines Verwenders, durch eine in die Wandungsabschnitte 106b, 108b integrierte Separationssäuleneinheit 44b' hindurchgeleitet, die eine Ausgabeöffnung für die Reaktionsbeutelkammer 110b bildet, so daß in die zweite Reaktionsbeutelkammer 112b angereichterte Antitumor-Zellen eintreten. Der zweiten Reaktionsbeutelkammer 112b sind wiederum Reagenzienkammern 100b, 101b zugeordnet, die Wachstumsförderungsmittel, beispielsweise IL 2, IL 10, IFNγ o. dgl., enthal- ten können, um nach der Separation eine oder mehrere weitere Wachstums- bzw. Expansionsstufen durchzuführen. Nach Durchführung dieser Stufen wird das Reaktionsprodukt, d.h. die stark vermehrten Antitumor-Zellen, wieder aus der Ausgabeöffnung 54b abgezogen und - wie durch den Pfeil 56b angedeutet - in einen menscnlichen Körper eingeleitet.
Bei der Ausführungsform der Fig. 2 bilden also die Reaktionsbeutelkammern 110b, 112b jeweils Reaktionsbeutelkammern für mehrere nacheinander durchzuführende Reaktionsstufen, wobei das Reaktionsprodukt einer vorangegangenen Stufe das Ausgangs- material für die nachfolgende Stufe bilde . Es wird somit der Aufbau des Reaktionsbeutels vereinfacht, da auf die verschiedenen Reaktionsbeutelkammern trennende Wandungen und ebenso in diesen Wandungen vorgesehene zerstörbare Fluidflußunterbre- chungsmittel o. dgl. verzichtet werden kann. Auch die Reaktionsbeutelkammern 110b, 112b der Ausführungsform der Fig. 2 weisen wieder die Möglichkeit auf, in diese jeweils Nährlösung einzugeben bzw. verbrauchte Nährlösung abzuziehen. Ferner kann - ähnlich wie bei der Ausführungsform gemäß Fig. 1 - vorgese- hen sein, daß zusätzlich oder alternativ zum Eingeben von Reagenzien aus den Reagenzienkammern zusätzliche Eingabeöffnungen vorhanden sind, in die aus externen Behältern, wie z.B. Reagenzienflaschen o. dgl., Reagenzien eingeleitet werden können. Darüber hinaus ist es wiederum möglich, daß analog zur Ausführungsform gemäß Fig. 1 anstelle des Integrierens der Separationssäuleneinheit 44b' in die Wandungsabschnitte 106b, 108b die erste Reaktionsbeutelkammer 110b eine Ausgabeöffnung aufweist, aus der das Reaktionsprodukt der letzten in dieser Reaktionsbeutelkammer durchgeführten Stufe abgezogen wird, durch eine Separationssäuleneinheit geleitet wird, die extern angeordnet ist, und nachfolgend durch eine Eingabeöffnung der zweiten Reaktionsbeutelkammer 112b in diese eingeleitet wird.
Fig. 3 zeigt eine weitere alternative Ausgestaltungsform eines erfindungsge äßen Reaktionsbeutelsystems . Das Reaktionsbeutelsystem llOe umfaßt wiederum einen Reaktionsbeutel 70c mit einer Mehrzahl von Reaktionsbeutelkammern 114c, 116c, 118c. Die Reaktionsbeutelkammer 114c weist eine Eingabeöffnung 16c auf, durch die Ausgangsmaterial in diese eingegeben werden kann. Ferner sind der Reaktionsbeutelkammer 114c zwei Reagenzienkammer 80c, 80c' zugeordnet, die über zerbrechbare Fluid- flußunterbrechungsmittel , z.B. zerbrechbare Membranen 120c, 120c' , in Verbindung mit der Reaktionsbeutelkammer 114c bringbar sind. Die erste Reaktionsbeutelkammer 114c ist von der in der Reaktionssequenz auf diese folgenden zweiten Reaktionsbeutelkammer 116c durch im wesentlichen trichterförmig aufein- ander zulaufende Wandungsabschnitte 122c, 124c getrennt. In einem Fluidtransferbereich 126c ist eine Separationssäuleneinheit 44c' angeordnet, durch die das Reaktionsprodukt der ersten Reaktionsbeutelkammer 114c in die zweite Reaktionsbeutelkammer 116c transferiert werden kann. Auch der zweiten Reaktionsbeutelkammer 116c sind wiederum zwei im wesentlichen gegenüberliegend angeordnete Reagenzienkammern 84c, 84c' zugeordnet, die über zerstörbare Membranen 130c, 130c' in Verbindung mit der Reaktionsbeutelkammer 116c bringbar sind.
Wie in Fig. 3 erkennbar, sind in der zweiten Reaktionsbeutelkammer 116c zwei sich von den Wandungen 122c, 124c weg erstreckende Wandungsabschnitte 132c ausgebildet. Die Wandungs- abschnitte 132c bilden zusammen mit den Wandungsabschnitten 122c bzw. 124c sich in einer Fluidtransf errichtung R im wesentlichen V-förmig erweiterende Ans mmelbe reiche . In diesen Bereichen können sich beispielsweise bei der Vermehrung die Antitumor-Zellen, die ein Ausgangsmaterial bilden, zusammen mit Nährlösung durch die Schwerkraftwirkung ansammeln, so daß aufgrund der V-förmigen Ausbildung in einem unteren Bereich der jeweiligen Ansammelbereiche eine erhöhte Antitumor-Zellen - Konzentration vorliegt, was zu einer verstärkten Vermehrung führt . Entsprechende Ansammelbereiche sind zwischen den Wandungen 122c, 124c und die Reaktionsbeutelkammer 116c nach außen hin abgrenzenden Wandungen 136c, 138c des Reaktionsbeutels 70c gebildet.
Die zweite Reaktionsbeutelkammer 116c ist von der dritten Reaktionsbeutelkammer 118c durch Wandungsabschnitte 140c, 142c getrennt, die auf einen Fluidtransf erbereich 144c im wesentlichen trichterförmig zulaufen.
In diesem Fluidtransf erbereich ist eine Separationssäuleneinheit 44c' angeordnet. Der dritten Reaktionsbeutelkammer 118c sind Reagenzienkammern 88c, 88c' zugeordnet, die wieder über zerbrechbare Membranen o. dgl. 146c, 146c' in Verbindung mit der Reaktionsbeutelkammer 118c bringbar sind. Ferner sind in der dritten Reaktionsbeutelkammer 118c wieder mehrere Wandungsabschnitte 132c angeordnet, die zusammen mit den Wandungen 142c, 140c sich in der Fluidtransf errichtung R erweiternde Ansammelbereiche bilden, in denen das Ausgangsmaterial zur Zellvermehrung o. dgl. angesammelt werden kann.
Den Ausgang aus der dritten Reaktionsbeutelkammer 118c bildet wieder eine Separationssäuleneinheit 44c'.
Bei der Ausgestaltungsform der Fig. 3 sind - wie in der Figur zu erkennen - die verschiedenen Reaktionsbeutelkammern durch
V-förmig aufeinander zulaufende Wandungen getrennt. Dies hat einerseits den Vorteil, daß zum Fluidtransfer zwischen den einzelnen Reaktionsbeutelkammern in der Fluidtransferrichtung R eine Trichterwirkung der Wandungen erzeugt wird, so daß das in einer Reaktionsbeutelkammer erzeugte Reaktionsprodukt nahezu verlustfrei in die nächste Reaktionsbeutelkammer trans- feriert werden kann. Ferner dienen diese Wandungen gleichzeitig dazu, in den verschiedenen Reaktionsbeutelkammern Ansam- melbereiche zu bilden, in denen dann zur Durchführung von Reaktionen Zellen o. dgl. angesammelt werden, um eine erhöhte Zellkonzentration vorsehen zu können.
Wie in Fig. 3 erkennbar, nimmt das Volumen von aufeinander folgenden Reaktionsbeutelkammern 114c, 116c, 118c zu.. Dies wird dadurch bedingt, daß beispielsweise bei der Zellvermehrung eine vorbestimmte Zellkonzentration nicht überschritten werden darf, da dies eine weitere Vermehrung behindern würde, d.h. für die verschiedenen Schritte, in denen jeweils eine Zellvermehrung auftreten soll, muß dementsprechend mehr Volumen für die sich vermehrenden Zellen bereitgestellt werden.
Jede der Reaktionsbeutelkammern kann wiederum durchdringbare Membranmittel aufweisen zum Eingeben bzw. zum Entnehmen von Nährlösung. Darüber hinaus ist es möglich, daß neben dem Vorsehen jeweiliger Reagenzienkammern für die verschiedenen Reaktionsbeutelkammern Eingabeöffnungen vorgesehen sind, durch die aus externen Behältern Reagenzien eingegeben werden können.
In der Darstellung der Fig. 3 ist der dort gezeigte Reaktionsbeutel 70c zur Verv/endung bei mehreren aufeinanderfolgend durchzuführenden Expansionsschritten dargestellt. So können die verschiedenen Reagenzienkammern wachstumsfordernde oder -inhibierende Reagenzien wie OKT 3, IL 2, IL 10, IL 12, IFNγ TNFo", GM-CSF o. dgl. enthalten. Grundsätzlich ist es in allen erfindungsgemäßen Ausführungsformen möglich daß solche Reagenzien Wachstumsinhibitoren enthalten, die das Wachstum be- stimmter Zelltypen hemmen. In Fig. 4 ist ein modular aufgebautes Reaktionsbeutelsystem gezeigt, wie es beispielsweise zur Gewinnung von Zelltransplantaten für die Immuntherapie bzw. Gentherapie verwendbar ist. Insbesondere wird der Aufbau des Reaktionsbeutelsystems 10 der Fig. 4 nachfolgend anhand der Züchtung von Antitumor- Zellen beschrieben.
Beispielsweise wird aus einem menschlichen Körper zunächst eine Zellpopulation, z.B Blutprobe, entnommen, die einen ge- ringen Anteil der zu züchtenden Antitumor-Zellen enthält. Diese Probe wird, wie durch einen Pfeil 12 in Fig. 4 angedeutet, in einen ersten Reaktionsbeutel 14 durch eine Eingabeöffnung 16 eingegeben. Im ersten Reaktionsbeutel 14, der einen Stimulationsbeutel bildet, d.h. einen Beutel, in dem die in der Blutprobe enthaltenen Antitumor-Zellen vermehrt werden sollen, ist bereits vor der Eingabe der Blutprobe ein Wachs- tumsstimulierungsmittel für die Antitumor-Zellen enthalten, beispielsweise lyophilisiertes oder auf ander Weise vorbereitetes OKT 3 und/oder die vorangehend beschriebenen Vesikel. Die Blutprobe mit den darin enthaltenen Antitumor-Zellen bilden das Ausgangsmaterial für die Reaktionsstufe, die im Reaktionbeutel 14 durchzuführen ist; das OKT 3 und/oder die Vesikel, mit denen der erste Reaktionsbeutel 14 vorbeschickt ist, bilden die Reagenzien für die Reaktion der ersten Stufe. Zu- sätzlich weist der erste Reaktionsbeutel 14, ebenso wie die nachfolgend beschriebenen weiteren Reaktionsbeutel, in seiner Wandung eine Membran auf, die beispielsweise durch eine Kanüle durchdringbar ist, so daß in den Reaktionsbeutel 14, d.h. in eine in diesem ausgebildete Reaktionsbeutelkammer 18, Nähr- lösung eingegeben bzw. verbrauchte Nährlösung entnommen werden kann .
Nachdem die erste Stufe abgeschlossen ist, d.h. die Antitumor- Zellen sich in dem ersten Reaktionsbeutel ausreichend vermehrt haben, werden diese durch eine Ausgabeöffnung 20, beispielsweise über eine flexible Leitung 22 und eine Eingabeöffnung 28, nach außen und in einen zweiten Reaktionsbeutel 24 über- tragen. Im zweiten Reaktionsbeutel werden die vemehrten Antitumor-Zellen mit einem Retrovirus als das Reagenz in dieser zweiten Stufe in Kontakt gebracht, um somit Zellen gentech- nisch zu behandeln und, wenn notwendig, eine Zellmarker-Ex- pression in Gang zu setzen.
Um in der Reaktionsbeutelkammer 26 des zweiten Reaktionsbeutels 24 eine verstärkte bzw. beschleunigte Reaktion der Retroviren mit den Antitumor-Zellen zu erreichen, kann dieser Beu- tel in einer in den Figuren nicht dargestellten Zentrifuge einem Zentrifugiervorgang unterzogen werden. Nachfolgend wird der Inhalt der zweiten Reaktionsbeutelkammer 26 durch . eine Ausgabeöffnung 30 des zweiten Reaktionsbeutels 24, beispielsweise wieder vermittels einer flexiblen Leitung 32, über eine Ξingabeöffnung 34 in einen dritten Reaktionsbeutel 36 eingegeben. In der Reaktionsbeutelkammer 38 des dritten Reaktionsbeutels 36 sind als Reagenzien Antikörper enthalten. Unter Verwendung von immun-adsorptiven Separationssäulen auf Basis von Avidin oder Sreptavidin können dies beispielsweise biotinylierte Antikörper sein. Der Kontakt der Antitumor-Zellen in der Reaktionsbeutelkammer 26 des zweiten Reaktionsbeutels 24 z.B. mit Retroviren führt dazu, daß an einer Zelloberfläche der Antitumor-Zellen ein Rezeptor für die Zellsepa- ration exprimiert wird. Dies kann z.B. ein niederaffiner NGF- Rezeptor sein. An diesem Rezeptor lagern sich in der Reaktionsbeutelkammer 38 des dritten Reaktionsbeutels 36 die bio- tinylierten Antikörper an und führen somit zu einer verstärkten Markierungswirkung der Antitumor-Zellen.
Die derart markierten Antitumorzellen werden über eine Ausgabeöffnung 40 des dritten Reaktionsbeutels 36 über eine Leitung 42 in eine Separationssäuleneinheit 44 eingegeben. Der in der Separationssäuleneinheit 44 durchgeführte Separationspro- zeß ist derart ausgelegt, daß die markierten Antitumor-Zellen ungehindert durch die Separationssäuleneinheit 44 hindurchtreten l.önnen, wogegen nicht markierte Zellen zurückgehalten werden. Am Austritt der Separationssäuleneinheit 44 kann ein nicht dargestelltes Wegeventil angeordnet sein, das in einem ersten Weg über eine Leitung 46 zu einer Eingabeöffnung 48 eines vierten Reaktionsbeutels 50 führt. In der Reaktionsbeutelkammer 52 des vierten Reaktionsbeutels 50 ist als Reagenz ein weiteres Wachstumsstimulierungsmittel , beispielsweise lyophilisiertes oder auf ander Weise vorbereitetes IL 2, enthalten, das zu einer weiteren Zellexpansion führt. Nach durchgeführter Zellexpansion können die Antitumor-Zellen dann durch eine Ausgabeöffnung 54 des vierten Reaktionsbeutels 50, wie durch einen Pfeil 56 angedeutet, erhalten werden und beispielsweise in einen menschlichen Körper injiziert werden.
Ein zweiter Weg des Wegeventils, das sich an die Separationssäuleneinheit 44 anschließt, führt über eine Eingabeöffnung 60 in einen fünften Reaktionsbeutel 58. Der Reaktionsbeutel 58 kann derart ausgebildet sein, daß er im wesentlichen dem dritten Reaktionsbeutel 36 entspricht, d.h. z.B. biotinylierte Antikörper enthält, um die aus der Separationssäuleneinheit erhaltenen Antitumor-Zellen in seiner Reaktionsbeutelkammer 62 erneut zu markieren und diese dann über eine Ausgabeöffnung 64 und eine strichliert dargestellte Leitung 66 wieder zum Eingang der Separationssäuleneinheit 44 zu leiten.
Das in der Fig. 4 dargestellte Reaktionsbeutelsystem 10 umfaßt eine Mehrzahl verschiedener Reaktionsbeutel 14, 24, 36, 50, 58, die jeweils eine Reaktionsbeutelkammer 18, 26, 38, 52, 62 aufweisen, die mit den Reagenzien für die verschiedenen Stufen der mehrstufigen Reaktion vorbeschickt sind; d.h. bereits bei der Herstellung der Reaktionsbeutel werden in die jeweiligen Reaktionsbeutelkammern derselben die Reagenzien eingebracht, um sie dann zur Reaktion mit dem in die jeweiligen Reaktionsbeutel eingegebenen Ausgangsmaterial vorzubereiten. Selbstverständlich kann für verschiedene Reaktionen das System auch nur einen einzigen derartigen Beutel umfassen.
Jeder der Reaktionsbeutel besteht vorzugsweise aus einem flexiblen Kunststoffmaterial bzw. aus Lagen flexiblen Kunststoff- materials, die in einem die verschiedenen Reaktionsbeutelkammern bildenden Randbereich durch Verschweißen, Verkleben o. dgl. miteinander verbunden sind. Zur Beobachtung der Reaktionen kann das Material der Beutel wenigstens bereichsweise transparent sein. Die Reaktionsbeutel sind im wesentlichen rechteckig ausgebildet, können jedoch beliebige andere Konfigurationen annehmen.
Die Eingabe- und Ausgabeöffnungen der verschiedenen Reaktions- beutel können derart sein, daß sie mit den jeweiligen Verbindungsschläuchen zwischen den einzelnen Reaktionsbeuteln bereits verbunden sind oder Mittel zur Verbindung mit derartigen Schläuchen aufweisen. Ferner können im Bereich der Eingabebzw. Ausgabeöffnungen bzw. der Verbindungsschläuche Mittel vorgesehen sein, durch die die Eingabe- bzw. Ausgabeöffnungen jeweils verschlossen werden können; dies können beispielsweise Ventile, Klemmen o. dgl. sein. Darüber hinaus ist es möglich, die Eingabe- bzw. Ausgabeöffnungen verschweißbar auszubilden, so daß beispielsweise nach einmal durchgeführtem Eingeben eines Ausgangsmaterials in einen Reaktionsbeutel die zugehörige Eingabeöffnung verschweißt wird und somit das weitere Eingeben bzw. Entweichen von Material durch diese Eingabeöffnung nicht mehr möglich ist . Entspechendes trifft für die Ausgabeöffnungen zu.
Das Inkontaktbringen des jeweiligen Ausgangsmaterial mit den in den Beuteln enthaltenen Reagenzien kann beispielsweise durch Vorwärtsstreichen des fluidartigen oder flüssigen Ausgangsmaterials durch die flexiblen Beutel hindurch mit den Fingern eines Verwenders durchgeführt werden. Darüber hinaus ist es möglich, die Beutel zu schütteln oder sie, wie vorangehend mit Bezug auf den zweiten Reaktionsbeutel 24 beschrieben, einer Zentrifugation zu unterziehen.
Die Reagenzien in den verschiedenen Reaktionsbeuteln können dort in flüssiger oder gallertartiger Form enthalten sein. Darüber hinaus ist es bei verschiedenen Reaktionen möglich, die Reagenzien in getrockneter Form an der Innencberflache der Reaktionsbeutel anzuordnen, so daß sie erst bei Eingabe eines flüssigen Ausgangsmaterials gelöst werden. Insbesondere bei Verwendung flüssiger Reagenzien in den verschiedenen Reak- 5 tionsbeuteln ist es wichtig, daß sowohl die Eingabe- als auch die Ausgabeöffnungen normalerweise verschlossen sind und erst bei Verbindung mit einem Leitungsschlauch, einer Nadel o. dgl. in einen geöffneten Zustand gebracht werden können. Beispielsweise ist es möglich, daß im Bereich der Eingabe- und Ausgabe- 10 Öffnungen wiederum Membranen vorgesehen sind, die durch Nadeln durchdringbar sind und nach Entfernen der Nadeln wieder einen dichten Abschluß herstellen.
Es ist selbstverständlich, daß verschiedene Ausgestaltungs- i5 merk ale der verschiedenen vorangehend beschriebenen Ausfüh- rungsformen bei anderen Ausführungsformen angewandt werden können. So ist es beispielsweise möglich, die Reaktionsbeutel der Fig. 4 jeweils derart aufzubauen, daß sie mehrere Reaktionsbeutelkammern enthalten oder daß sie eine oder mehrere 20 Reagenzienkammern 17 aufweisen, die Reagenzien zum nachfolgenden Inkontaktbringen mit Ausgangsmaterialien enthalten und von den Reaktionskammern durch zerstörbare Membranen 19 o . dgl . getrennt sind. Ferner können auch dort zusätzliche Eingabeöffnungen zur Eingabe von Reagenzien von außen vorgesehen sein.
2S
Auch bei der Ausgestaltung der Fig. 1 ist es möglich, das Reaktionsprodukt einer der Reaktionsbeutelkammern über eine Ausgabeöffnung nach außen zu transferieren, in einer extern angeordneten Separationssäuleneinheit zu separieren und dann 0 wieder in eine Reaktionsbeutelkammer einzuleiten.
Bei allen erfindungsgemäßen Ausgestaltungsformen, insbesondere jedoch bei denjenigen, in denen ein Reaktionsbeutel mehrere Reaktionsbeutelkammern enthält, so daß die gesamte Reakticns- 35 abfolge praktisch in einem Reaktionsbeutel durchgeführt werden kann, ist ein nahezu kontaminationsfreies Arbeiten möglich. Durch das Vorsehen verschiedener Reaktionsbeuteltypen, die beispielsweise mit verschiedenen Reagenzien vorbeschickt sind und/oder mit verschiedenen Reagenzienkammern kombiniert sind, ist es möglich, durch Kombinieren verschiedener vorbeschickter s oder mit Reagenzienkammern kombinierter Reaktionsbeutel Systeme für eine Vielzahl verschiedener mehrstufiger Vorgänge oder Reaktionen vorzusehen. Beispielsweise ist es auch möglich, einen Reaktionsbeutel mit wenigstens einer Reaktionskammer vorzusehen, die eine Vielzahl verschiedener Reagenzien- o kammern aufweist, wobei jedoch dann zur Verwendung lediglich diejenigen Reagenzienkammern geöffnet werden, die für einen bestimmten Reaktionstyp benötigt werden.
Ferner ist es ebenso möglich, daß bei den Ausgestaltungsformen 5 gemäß den Fig. 1 bis 3 wenigstens eine der verschiedenen Reaktionsbeutelkammern bereits mit den Reagenzien vorbeschickt ist, wie es bei der Ausgestaltungsform gemäß Fig. 4 der Fall ist .
Neben der bei den Ausführungsformen dargestellten immun-ad- sorptiven Separation ist ebenso die Anwendung einer immun- magnetischen Separation möglich.
Zusätzlich oder anstelle der vorangehend beschriebenen Reak- tionsmittel ist auch der Einsatz anderer zeilaktivierender und/oder zellwachstumsstimulierender Stoffe möglich.
Bei allen vorangehend beschriebenen Ausführungsformen können die Reagenzien auch durch die Eingabeöffnungen für das Aus- gangsmaterial eingegeben werden, die dann vorzugsweise wieder verschließbar ausgebildet sind.

Claims

Patentansprüche
s 1. Reaktionsbeutelvorrichtung zur Durchführung von mehrstufigen Kultivierungs/Separations-Vorgängen und/oder Reaktionen, beispielsweise zum Züchten von Antitumor-Zellen oder Antitumor-Zellen stimulierenden Zellen, umfassend: eine Mehrzahl von Reaktionsbeutelkammern (18a, 26a, o 38a, 52a; 110b, 112b; 114c, 116c, 118c) in einem Reaktionsbeutel, wobei in jeder Reaktionsbeutelkammer (18a, 26a, 38a, 52a; 110b, 112b; 114c, 116c, 118c) ein Ausgangsmaterial für eine jeweilige Stufe anordenbar ist und mit Reagenzien für die jeweilige Stu- 5 fe zum Erzeugen eines Reaktionsprodukts der jeweiligen Stufe in Kontakt bringbar ist,
Ausgabeöffnungsmittel (82a, 86a, 54a; 54b; 44c) zum Ausgeben eines Reaktionsprodukts aus jeder Reaktionsbeutelkammer (18a, 26a, 38a, 52a; 110b, 112b; 114c, 116c, 118c) .
2. Reaktionsbeutelvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine (18a) der Reaktionsbeutelkammern (18a, 26a, 38a, 52a) eine Eingabeö fnung (16a) zum Eingeben eines Ausgangsmaterials in diese von außen bezüglich des Reaktionsbeutels aufweist und daß die Reaktionsbeutelkammern (18a, 26a, 38a, 52a) in Sequenz zur Übertragung des Reaktionsprodukts einer in der Sequenz vorangehenden Reaktionsbeutelkammer als Ausgangs- material in wenigstens eine in der Sequenz folgende Reaktionsbeutelkammer ausgebildet sind.
3. Reaktionsbeutelvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen wenigstens zwei in der Sequenz aufeinanderfolgenden Reaktionsbeutelkammern (18a, 26a, 38a) offenbare Fluidflußunterbrechungsmittel (82a, 86a) vorgesehen sind, vorzugsweise zerstörbare Fluidflußunter- brechungsmittel , welche eine Ausgabeöffnung der in der Sequenz vorangehenden Reaktionsbeutelkammer bilden.
4. Reaktionsbeutelvorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, da- durch gekennzeichnet, daß wenigstens eine (52a) der Reaktionsbeutelkammern (18a, 26a, 38a, 52a), vorzugsweise die in der Sequenz letzte Reaktionsbeutelkammer. (52a), eine Ausgabeöffnung (54a) zum Ausgeben des Reaktionsprodukts aus dieser nach außen bezüglich des Reaktionsbeutels aufweist .
5. Reaktionsbeutelvorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß bei zwei in der Sequenz aufeinander folgenden Reaktionsbeutelkammern (38a, 52a) eine vorange- hende Reaktionsbeutelkammer (38a) eine Ausgabeöffnung (90a) zum Ausgeben nach außen aufweist und eine nachfolgende Reaktionsbeutelkammer (52a) eine Eingabeöffnung (98a) zum Eingeben von außen aufweist.
6. Reaktionsbeutelvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Reaktionsbeutelkammer (110b, 112b) eine Reaktionsbeutelkammer für eine Mehrzahl von aufeinander folgenden Stufen ist, wobei jeweils das Reaktionsprodukt einer vorangehen- den Stufe das Ausgangsmaterial für eine nachfolgende Stufe bildet.
7. Reaktionsbeutelvorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß in der Sequenz aufeinander folgende Reaktionsbeutelkammern ( 110b, 112b; 114c, 116c, 118c) durch Trennwandungen (106b, 108b; 122c, 124c, 140c, 142c) voneinander getrennt sind, die auf einen Fluidtransferbereich (126c, 144c) zwischen den aufeinander folgenden Reaktionsbeutelkammern in einer Fluidtransfer- richtung (R) im wesentlichen trichterförmig zulaufen.
8. Reaktionsbeutelvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in wenigstens einer Reaktionsbeutelkammer (116c, 118c) wenigstens ein durch vorzugsweise V-förmig aufeinander zulaufende Wan- 5 dungsabschnitte (132c) gebildeter Ausgangεmaterial/Reak- tionsprodukt-Ansammelbereich gebildet ist.
9. Reaktionsbeutelvorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der wenigstens eine Ausgangsmaterial/ ιo Reaktionsprodukt-Ansammelbereich sich in Fluidtransferrichtung (R) erweiternd ausgebildet ist.
10. Reaktionsbeutelvorrichtung nach Anspruch 7 und einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die
15 trichterförmig aufeinander zulaufenden Trennwandungen (122c, 124c, 140c, 142c) wenigstens bereichsweise die Wandungsabschnitte des Ausgangsmaterial/Reaktionsprodukt - Ansammelbereichs bilden.
20 11. Reaktionsbeutelvorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß in der Sequenz aufeinander folgende Reaktionsbeutelkammern (114c, 116c, 118c) ein zunehmendes Kammervolumen aufweisen.
25 12. Reaktionsbeutelvorrichtung nach einem der verhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine der Reaktionsbeutelkammern (18, 26, 38, 52, 62) mit den Reagenzien vorbeschickt ist.
30 13. Reaktionsbeutelvorrichtung nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei wenigstens einer Reaktionsbeutelkammer (18a, 26a, 38a, 52a; 110b,
112b; 114c, 116c, 118c) wenigstens eine Reagenzienkammer
(80a, 84a, 88a, 100a; 80b, 81b, 84b, 88b, 100b, 101b;
3 80c, 80c', 84c, 84c', 88c, 88c') vorgesehen ist, die durch offenbare Fluidflußunterbrechungsmittel (120c, 120c', 130c, 130c', 146c, 146c'), vorzugsweise zerstör- care Fluidfluß nterbrecr -ingsmittεl , m Reagenzienuber- tragungsverbindung mit der Reaktionsbeutelkammer (18a, 26a, 38a, 52a, 110b, 112b; 114c, 116c, 118c) bringbar ist, unα daß in der Reagenzienkammer (80a, 84a, 88a, 5 100a; 8C-D, 81b, 84b, 88b, 100b, 101b; 8Cc, 80c', 84c, 84c', 88c, 88c') die Reagenzien für die jeweilige Stufe enthalten sind.
14 Reaktionsbeutelvorrichtung nach Anspruch 6 und 13, da- ιo durch gekennzeichnet, daß wenigstens eine Reaktionsbeutelkammer (110b, 112b) mit einer Mehrzahl von Reagenzienkammern (80b, 81b, 84b, 88b, 100b, 101b) für verschiedene Stufen versehen ist, die zur sequentiellen Durchfuhrung der mehreren Stufen nacheinander in Reagenzienubertra-
15 gungsverümdung mit der Reaktionsbeutelkammer (110b, 112b) bringbar sind.
15 Reaktionsbeutelvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei wenigstens
20 einer Reaktionsbeutelkammer (18a) eine dient verschließbare Reagenzienemgabeöffnung (102a) zum Eingeben von Reagenzien m die Reaktionsbeutelkammer (18a) aus einem externen Behälter vorgesehen ist.
25 16 Reaktionsbeutelvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen wenigstens zwei in der Sequenz aufeinander folgenden Reaktionsbeutelkammern (38a, 52a; 110b, 112b; 114c, 116c, 118c) eine Separationssaulenvorrichtung (44a, 44a' , 44b' ;
30 44c') zum Fluidtransfer durch diese hindurch vorgesehen
17 Peaktionsoeutelvorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß αie Separationssaulenvorrichtung 3s (44a'; 44b'; 44c') m eine die wenigstens zwei Reaktionsbeutelkammern (110b; 112b; 114c, 116c, 118c) trennende Wandung (76a; 106b, 108b; 122c, 124c, 140c, 142c) eingegliedert ist.
18. Reaktionsbeutelvorrichtung zur Durchführung von gewünsch- 5 tenfalls mehrstufigen Kultivierungs/Separations-Vorgängen und/oder Reaktionen, beispielsweise zum Züchten von Antitumor-Zellen oder Antitumor-Zellen stimulierenden Zellen, umfassend einen Reaktionsbeutel mit einer Reaktionsbeutelkammer (18, 26, 38, 52, 62), in welcher ein Aus- ιo gangsmaterial für eine Stufe anordenbar und mit Reagenzien für die Stufe zum Erzeugen eines Reaktionsprodukts der Stufe in Kontakt bringbar ist, wobei der Reaktionsbeutel (14, 24, 36, 50, 58) eine Eingabeöffnung (16, 28, 34, 48, 60) zum Eingeben von Ausgangsmaterial in diesen
15 sowie eine Ausgabeöffnung (20, 30, 40, 54, 64) zum Ausgeben eines in dem Reaktionsbeutel (14, 24, 36, 50, 58) erzeugten Reaktionsprodukts aufweist, und wobei die Reaktionsbeutelvorrichtung die Reagenzien enthält und mit diesen zu einer Reaktionseinheit vorbereitet ist.
20
19. Reaktionsbeutelvorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsbeutelkammer (18, 26, 38, 52, 62) mit den Reagenzien vorbeschickt ist.
25 20. Reaktionsbeutelvorrichtung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktionsbeutel wenigstens eine Reagenzienkammer (17) umfaßt, die durch offenbare Fluidflußunterbrechungsmittel (19), vorzugsweise zerstörbare Fluidflußunterbrechungsmittel , in Reagenzien-
30 Übertragungsverbindung mit der Reaktionsbeutelkammer bringbar ist, und daß in der wenigstens einen Reagenzienkammer die Reagenzien für die jeweilige Stufe enthalten sind .
35 21. Reaktionsbeutelvorrichtung nach einem Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsbeutelkammer eine Reaktionsbeutelkammer für eine Mehrzahl von aufein- ander folgenden Stufen ist, wobei jeweils das Reaktionsprodukt einer vorangehenden Stufe das Ausgangsmaterial für eine nachfolgende Stufe bildet.
5 22. Reaktionsbeutelvorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktionsbeutel eine Mehrzahl von Reagenzienkammern für verschiedene Stufen umfaßt, welche Reagenzienkammern zur sequentiellen Durchführung der mehreren Stufen nacheinander in Reagenzienübertragungs- ιo Verbindung mit der Reaktionsbeutelkammer bringbar sind.
23. Reaktionsbeutelvorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Reaktionsbeutelkammer ferner eine dicht verschließbare Reagenzien- ls eingabeöffnung zum Eingeben von Reagenzien in die Reaktionsbeutelkammer aus einem externen Behälter vorgesehen ist .
24. Reaktionsbeutelvorrichtung nach einem der vorhergehenden 20 Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Eingabe- und/oder die Ausgabeöffnungen durch Ventile, zerstörbare oder wiederverschließbare Verschlußmittel oder dergleichen verschlossen sind.
25 25. Reaktionsbeutelvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprache, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus flexiblem, vorzugsweise gasdurchlässigem jedoch flüssigkeitsundurch- lässigem, Kunststoff hergestellt ist.
0 26. Reaktionsbeutelvorrichtung nach Anspruch 13, 20 oder 22 und gewünschtenfalls einem weiteren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die jeweilige Reaktionsbeutelkammer (18a, 26a, 38a, 52a; 110b, 112b; 114c, 116c, 118c) mit der wenigstens einen Reagenzienkam- 5 mer (80a, 84a, 88a, 100a; 80b, 81b, 84b, 88b, 100b, 101b; 80c, 80c', 84c, 84c', 88c, 88c') integral ausgebildet ist .
27. Reaktionsbeutelvorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die jeweilige Reaktionsbeutelkammer (18, 26, 38, 52, 62; 18a, 26a, 38a, 52a; 110b, 112b; 114c, 116c, 118c) zur Eingabe frischer
5 Nährlösung bzw. zur Entnahme verbrauchter Nährlösung ausgebildet ist.
28. Reaktionsbeutelvorrichtung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die jeweilige Reaktionsbeutelkammer ιo (18, 26, 38, 52, 62; 18a, 26a, 38a, 52a; 110b, 112b; 114c, 116c, 118c) einen durch eine Kanüle oder dergleichen durchdringbaren Membranbereich aufweist, der. nach Entfernen der Kanüle einen fluiddichten Abschluß selbsttätig wieder herstellt.
15
29. Modulares Reaktionsbeutelsystem, umfassend eine oder eine Mehrzahl von Reaktionsbeutelvorrichtungen nach einem vorhergehenden Ansprüche .
:o 30. Modulares Reaktionsbeutelsystem nach Anspruch 29, ferner umfassend wenigstens eine Separationssäuleneinheit (44b) .
31. Modulares Reaktionsbeutelsystem nach Anspruch 29 oder 30, ferner umfassend wenigstens einen Behälter für Reagenz-
25 ien, um Reagenzien in wenigstens eine Reaktionsbeutelkammer von außen bezüglich eines Reaktionsbeutels einzugeben .
32. Verwendung einer Reaktionsbeutelvorrichtung nach einem 30 der Ansprüche 1 bis 28 und/oder eines modularen Reaktionsbeutelsystems nach einem der Ansprüche 29 bis 31 zur Züchtung von Antitumor-Zellen oder Antitumor-Zellen stimulierenden Zellen.
3 33. Verfahren zum Durchführen von Kultivierungs/Separations- Vorgängen mit einer oder mehreren Stufen und/oder mehrstufigen Reaktionen, insbesondere vermittels einer Reak- tionsbeutelvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 28 und/oder einem modularen Reaktionsbeutelsystem nach einem der Ansprüche 29 bis 31, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen wenigstens einer Reaktionsbeutelkammer (18, 26, 38, 52, 62; 18a, 26a, 38a, 52a; 110b, 112b;
114C, 116c, 118c) ; b) Einleiten eines Ausgangsmaterials in die wenigstens eine Reaktionsbeutelkammer (18, 26, 38, 52, 62; 18a, 26a, 38a, 52a; 110b, 112b; 114c, 116c, 118c); c) Inkontaktbringen des Ausgangsmaterial in der wenigstens einen Reaktionsbeutelkammer (18, 26, 38, 52, 62; 18a, 26a, 38a, 52a; 110b, 112b; 114c, 116c, 118c) ,* mit Reagenzien für wenigstens eine Stufe durch : - vorheriges Beschicken der wenigstens einen Reaktionsbeutelkammer (18, 26, 38, 52, 62) mit den Reagenzien und/oder
In-Fluidkontakt-Bringen einer der wenigstens einen Reaktionsbeutelkammer (18a, 26a, 38a, 52a, 110b, 112b; 114c, 116c, 118c) zugeordneten Reagenzienkammer (80a, 84a, 88a, 100a; 80b, 81b, 84b, 88b, 100b, 101b; 80c, 80c', 84c, 84c', 88c, 88c') mit der Reaktionsbeutelkammer (18a, 26b, 38a, 52a, 62a; 110b, 112b; 114c, 116c, 118c) und/oder - Einleiten von Reagenzien in die wenigstens eine Reaktionsbeutelkammer aus einem externen Behälter durch eine Reagenzieneingabeöffnung (102a) , d) Abziehen des Reaktionsprodukts einer Stufe aus der Reaktionsbeutelkammer durch eine Ausgabeöffnung, gegebenenfalls unter vorherigem oder nachherigem
Durchführen eines Separationsschritts .
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