DE3390499C2 - Verfahren zur Durchf}hrung von Mikrooperationen anZelten und Einrichtung zu dessen Verwirklichung - Google Patents
Verfahren zur Durchf}hrung von Mikrooperationen anZelten und Einrichtung zu dessen VerwirklichungInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Einrichtung gemäß den Oberbegriffen der Ansprüche 1
und 3.
Es ist ein Verfahren zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen bekannt, das die Festhaltung der
Zelle mit Hilfe eines Mikroansaugers und die Einführung eines Mikroinstrumentes in die Zelle vorsieht. Das
Durchstechen der Zelle führt man auf der entgegengesetzten Seite in bezug auf die Stelle der Zellenfesthaltung durch (siehe beispielsweise P. Fonbrune, Mikromanipulationsmeihoden. Fremdliteratur, M., S. 147—149,
1951).
Das Durchstechen der Zellenmembran erfolgt infolge
ihrer Festigkeit und Elastizität nicht sofort nach der Einwirkung auf diese mit der Spitze des Mikroinstrumentes, sondern erst nach der bestimmten, in der Regel
ziemlich großer Deformation nicht nur des zu durchstechenden Abschnittes, sondern auch der ganzen Zelle,
die zu einer Traumatisierung der letztere» führt
Außerdem kommen bei großen Deformationen der
ίο Zelle im Durchstichmoment Zerreißungen der Membran vor, die mit einem Auswurf (Verlusten) von Zytoplasma infolge der Gesamterhöhung des intrazellularen
Drucks begleitet werden, und dabei entstehen Verschiebungen der intrazellularen Organellen in bezug aufein-
;5 ander.
Der Zytoplasmaauswurf führt zu einer Gleichgewichtsstörung zwischen dem intrazellularen Inhalt und
der Umgebung, was beträchtlich die Lebensfähigkeit der operierten Zellen herabsetzt
Bekannt ist auch ein Verfahren zur Durchführung von
Mikrooperationen an Zellen, nämlich ein Verfahren zur
Kerntransplantation, bestehend aus der Extraktion des Kernes aus der Spenderzelle und deren Transplantation
in die Rezipientenzelle, aus der deren eigener Kern ent
ferntist
Dabei wird das Mikroinstrument in die Zelle zweimal eingeführt und zwar das erste Mal, wenn der Kern aus
der Zelle ausgezogen wird, und das zweite Mal, wenn in
diese ein anderer Kern eingeführt wird, d. h. die Zelle
wird zweimal verletzt
Das alles führt in der Regel zu einer relativ niedrigen Anzahl von erfolgreichen Operationen (siehe beispielsweise Kopac M. J. Instrumentation for the transplantation of Nuclloli, J. of the Franklin Institute, 262,
407-411,1956).
Bekannt ist eine Einrichtung zur Durchführung von
Mikrooperationen an Zellen, die ein Mikroinstrument das in einem Halter montiert ,ist, der mit einem beweglichen Glied eines DreiwegeraikroKipnipuIators starr ver-
bunden ist, und einen Mikroansauger enthält der an
einem anderen Mikromanipulator zum Festhalten der
zu operierenden Zelle montiert ist (siehe beispielsweise
FR-PS 10 85 965).
Mikromanipulatoren, kennzeichnet sich durch hohe Kosten und relativ niedrige Arbeitsproduktivität bei Mikrooperationen aus, da sie die Koordinierung der Arbeit
von zwei Mikromanipulatoren erfordert, und dabei ist eine Verformung der Zelle im Durchstichmoment nicht
so ausgeschlossen. Infolge der Vibration des Mikroansaugers und Mikroinstrumentes kommt es zu einer zusätzlichen Traumatisierung der Zelle, und weil die Zelle, die
am Mikrosauger festgehalten wird, ziemlich elastisch ist, sind Brüche des Mikroinstrumentes während des
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen so zu vervollkommnen, daß die Verformung der Zelle bei derem Durchstechen mit dem Mikroinstrument
möglichst geringer und die Anzahl von erfolgreichen Operationen erhöht wird, und die Aufgabe, eine Einrichtung zur Verwirklichung dieses Verfahrens zu entwikkeln, die leicht bedienbar, nicht teuer ist, eine Dauerkürzung von Mikrooperationen ermöglicht und in ausrei-
chendem Maße betriebssicher ist.
Diese Aufgabe wird zum einen dadurch gelöst, daß im Verfahren zur Durchführung von Mikrooperationen an
Zellen, bei dem man eine Zelle mit Hilfe eines Mikroan-
3 4
saugers festhält and die Membran der Zelle mit einem Schreibung von konkreten Ausführungsbeispielen und
Mikroinstrument durchsticht erfindungsgemäß:man das Zeichnungen näher erläutert, wobei es zeigt
Durchstechen der Membran der Zelle am Abschnitt un- Fig. 1 eine Einrichtung zur Durchführung von Miter
dem Mikroansauger ausführt wobei das Mikroin- krooperationen an Zellen, in Gesamtansicht:
slrument durch den Hohlraum des Mikroansaugers ein- 5 Fig.2 eine Mikroansaugereinheit mit einem Mi-
slrument durch den Hohlraum des Mikroansaugers ein- 5 Fig.2 eine Mikroansaugereinheit mit einem Mi-
geführt wird. kroinstrument und Membrandruckregler, auseinander-
Zweckmäßigerweise wird der Hohlraum des Mikro- gebracht;
ansaugers mit isotonischer Lösung ausgefüllt F ig. 3 dieselbe Einheit wie in Fig. 1 mit einem
Die Aufgabe wird andererseits auch dadurch'gelöst. Schrittmotor;
daß in der Einrichtung zur Durchführung von Mikro- 10 Fig.4 eine Ausführungsvariante des Halters für eioperationen
an Zellen, die ein Mikroinstrument das in nen Zweikanal-Mikroinstrument auseinandergebracht;
einem Halter montiert ist der mit einem beweglichen F i g. 5 schematisch die Einrichtung zur Durchführung
Glied eines Dreiwegemikromanipulators starr verbun- von MikroOperationen an Zellen und die zu operierende
den ist und einen Mikroansauger zum Festhalten der zu Zelle im Sehfeld eines Mikroskops im Moment der Einoperierenden
Zslle enthält erfindungsgemäß, der Mi- 15 führung des Mikroinstrumentesin die Zelle;
kroansauger am Halter des Mikroinstrumentes starr be- F i g. 6 die zu operierende Zelle im Sehfeld eines Mifestigt ist das Mikroinstrument im Hohlraum des Mi- kroskops im Moment der Herausführung des Mikroinkroans^ugers koaxial zu diesem angeordnet und mit struments aus der Zelle,
dem Halter durch ein Mittel verbunden ist das eine Hin-
und Herverschiebung des Mikroinstrumentes längs der 20 Bevorzugte Ausführungsvariante der Erfindung
Achse des Mikroansaugers gewährleistet
kroansauger am Halter des Mikroinstrumentes starr be- F i g. 6 die zu operierende Zelle im Sehfeld eines Mifestigt ist das Mikroinstrument im Hohlraum des Mi- kroskops im Moment der Herausführung des Mikroinkroans^ugers koaxial zu diesem angeordnet und mit struments aus der Zelle,
dem Halter durch ein Mittel verbunden ist das eine Hin-
und Herverschiebung des Mikroinstrumentes längs der 20 Bevorzugte Ausführungsvariante der Erfindung
Achse des Mikroansaugers gewährleistet
Es ist zweckmäßig, den Halter in Form eines Dreiwe- Das Wesen des erfindungsgemä&en Verfahrens zur
gestücks auszuführen, von dem der eine Stutzen mit Durchführung von MikroOperationen an Zellen besteht
dem Hohlraum des Mikroansaugers kommuniziert, in darin, daß man die Zelle, die einer mikrochirurgischen
dem gegenüberliegenden Stutzen ein Dichtungsring an- 25 Operation unterworfen wird, mit Hilfe eines Mikroangebracht
ist der eine öffnung auf dem Durchmesser des saugers festhält Das Festhalten der Zelle wird unter
Mikroinstrumentes hat, und der dritte, seitliche Stutzen negativem Druck zustandegebracht der im Hohlraum
mit einem Saugrohrajisatz zur Erzeugung eines negati- des Mikroansaugers mit einem Mikroinjekior,erzeugt
ven Drucks im Hohlraum des Mikroansaugers und Ein- wird, nachdem die Zelle mit der Stirnseite des Mikroanleitung
isotonischer Lösung versehen ist 30 saugers in Berührung gebracht ist Durch, den fixierten
Es ist ferner von Vorteil, als Verbindungsmittel zwi- Abschnitt der Zellenmembran, der durch die Stirnseite
sehen dem Mikroinstrument und dem Halter ein Schritt des Mikroansaugers begrenzt ist erfolgen das. Durchschaltwerk
mit Längsverschiebung oder einen stechen der Membran mit dem Instrument und das Ein-Membrandruckregler
anzuwenden, dessen Gehäuse mit führen des letzteren in die Zelle aiis dem Hohlraum des
dem Halter, die Membran mit dem Mikroinstrument 35 Mikroansaugers. Der fixierte und ausgedehnte Ab-H
starr verbunden ist und der Innenraum mit einer Quelle schnitt der Zelle unter dem Mikroansauger wird mit
Ti von Steuerdruckiuftimpuisen kommuniziert. isotonischer Lösung umspült, mit der der Hohlraum des
; Das erfindungsgemäße Verfahren zur Durchführung Mikroansaugers vor der Operation ausgefüllt wird. Iso-L-von
Mikrooperationen an Zellen tonische Lösung wird in den Hohlraum des Mikr-oansau-ϊ'
40 gers eingeleitet, damit der gleiche osmotische Druck des ,',' — schließt die Verformung der gesamten Zelle im intrazellularen Inhalts und der extrazellularen Lösung in
fs Durchstichmoment mit dem Mikroinstrument aus; der Durchstichzone im Moment des Durchstechens der
"i — vermindert die Verletzung der Zelle; Zellenmembran beibehalten wird. Für die Zellen der
A, — gewährleistet eine hohe Genauigkeit des Durch- Kaltblüter, Einzeller und Mikroorganismen wird öfters
;- dringens des Mikroinstruments in die Zelle auf die 45 als isotonische Lösung die. Ringer-Lösung verwendet,
vorgegebene Tiefe; Für Zellen der Warmblüter werden die Ringer-Lock- •i — gewährleistet das Durchdringen des Mikroinstru- Lösung, Ringer-Tyrode-Lösung und andere bekannte
ments in die Zelle unabhängig von deren Form und Lösungen verwendet In allen diesen Lösungen ist das
Abmessungen; . Vorliegen von stabilisierenden Faktoren für die Mem-'5
— verwirklicht die Verschiebung der Zelle, zusammen 50 bran, und zwar von Kalziumionen erforderlich, die im
ή mit dem eingeführten Mikroinstrument, wenn es Falle der Verletzung der Membran zu einer schnellen
erforderlich ist; Wiederherstellung des verletzten Abschnitts der Mim-
— sichert die Transplantation der Zellenorganellen bran dienen. In einigen Fällen, z. B. bei Transplantation
mit nur einem Durchstich; dnzvilner intrazellularen Orgahellen, wenn es erforder-
— verwirklicht die Mikroinjektion von Stoffen in die 55 Hch ist, Mikroinslrumente mit großem Durchmesser zu
bestimmten Zellenabschnitte oder die einzelnen benutzen, d.h. wenn die Zellenmembran'bedeutende
' Organellen; Verletzungen hat, enthält isotonische Lösung in der Re-
— beschleunigt den Mikrochirurgieprozeß der Zelle. gel verschiedene hochmolekulare Verbindungen (Kolli-,
din, Dextran und andere) zur Erzeugung von kolloidos-
Die erfindungsgemäße Einrichtung zur Durchführung Bo motischem (onkotischem) Druck, der durch das Vorhan-
1' von Mikfooperationen an Zellen kennzeichnet sich ne- densein im Zytoplasma der Zelle von hochmolekularen
ben den Verfahrensvorteilen durch eine hohe Zuverläs- Stoffen, hauptsächlich von Eiweißstoffen bestimmt wird,
sigkeit, leichte Bedienbarkeit, weil sie die Steuerung nur Das alles trägt zu einer schnellen Wiederherstellung der
eines Mikromanipulator erfordert, durch im Vergleich perforierten Zellenmembran und zu einem geringfügi-
zur bekannten Einrichtung niedrigere Kosten aus und 65 gen Durchdringen Intrazellularer Komponenten in den
vermindert die Zahl von möglichen Brüchen des Mi- Hohlraum des Mikroansaugers während des Durchste-
kroinstrumentes wähl e-jd des Durchstechens der Zelle. chens bei.
Nachstehend wird die Erfindung anhand einer Be- Das erfindungsgemäße Verfahren zur Durchführung
von MikroOperationen an Zellen schließt die Verformung der gesamten Zelle im Durchstichmoment dadurch aus, daß die Zelle mit dem Mikroinstrument nur
auf dem fixierten und ausgedehnten Membranabschnitt, der durch die Stirnseite des Mikroansaugers begrenzt
ist, festgehalten und durchstochen wird. Solch ein Abschnitt der Membran wird mit dem Mikroinstrument
leicht durchstochen, wobei sich die gesamte Zelle in freiem Zustand befindet und der Verformung nicht ausgesetzt ist.
Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bewirkt die Beschleunigung des Prozesses der Zellenmikrochirurgie, weil sie eine kraft- und zeitraubende Suche des zu durchstechenden Abschnitts ausschließt. Dieser Abschnitt wird schon während des Festhaltens der is
Zelle mit dem Mikroansauger vorgegeben. Darüber hinaus manipuliert man gleichzeitig mit dem Mikroansauger und dem Mikroinstrument. Das Mikroinstrument kann während des Durchstechens der Membran
von dieser nicht abgleiten, wodurch eine hohe Genauigkeit des Durchdringen des Mikroinstruments in die
Zelle unabhängig von deren Form und Abmessungen gesichert wird.
Das Verfahren zur Durchführung von Mikrooperattonen an Zellen wurde erfindungsgemäß mit Hilfe einer
Einrichtung realisiert, die in F i g. 1,2,3,4 dargestellt ist.
F i g. 1 zeigt eine Einrichtung zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen, enthaltend ein Mikroinstrument 1, das in einem Halter 2 montiert ist, der mit
einem beweglichen Glied 3 eines Dreiwegemikromanipulators 4 starr verbunden ist, und einen Mikroansauger
5. der an dem Halter 2 starr befestigt ist. Dabei ist das Mikroinstrument 1 im Hohlraum des Mikroansaugers S
koaxial zu diesem angeordnet und mit dem Halter 2 mit Hilfe eines Verbindungsgehäuses 6 und eines Mittels 7a
(Fig. 1, a) verbunden, das eine Hin- und Herverschiebung des Mikroinstrumentes 1 längs der Achse des Mikroansaugers 5 ermöglicht.
Der Halter 2, der in F i g. 2 auseinandergebracht gezeigt ist, ist in Form eines Dreiwegestücks 8 ausgeführt,
von dem der eine Stutzen 9 mit dem Hohlraum des Mikroansaugers 5 starr verbunden ist und kommuniziert, in dem gegenüberliegenden Stutzen 10 ein Dichtungsring 11 mit einer Mittelöffnung auf dem Durchmesser des Mikroinstrumentes 1 angebracht ist und der
dritte, seitliche Stutzen mit einem Rohransatz 12 zur Erzeugung eines negativen Druckes im Hohlraum des
Mikroansaugers 5 und zur Einleitung in diesen isotonischer Lösung versehen ist
Das Mittel 7a stellt einen Membrandruckregler dar. so der sich aus eine;.) Gehäuse 13 einer Decke 14 und einer
zwischen diesen befestigten Membran 15 mit einem Stößel 16 zusammensetzt Das Gehäuse 13 ist mit einem
Rohransatz 17 versehen, durch den der Innenraum des Membrandmckreglers mit einer Quelle von Steuerdruckluftimpulsen kommuniziert (in Fig. nicht gezeigt).
Die Membran 15 ist mit dem Mikroinstrument 1 durch den Stößel 16 und ein Klemmstück 18 starr verbunden.
F i g 3 zeigt eine Ausführungsvariante der Einrichtung zur Durchführung von Mikrooperatioaen an ZeI-
len, in der zum Unterschied von der Variante der F i g. 1. 2 ein Mittel 7b, das die Hin- und Herverschiebung des
Mikroinstruments 1 im Hohlraum des Mikroansaugers 5 sichert in Form eines Schrittmotors mit Längsverschiebung ausgeführt ist wobei dessen Gehäuse 19 mit dem
Halter 2 und das bewegliche Glied 20 des Schrittmotors der Längsverschiebung mit dem Mikroinstrument 1
starr verbunden ist
Fig.4 zeigt auseinandergebracht eine Ausführungsvariante des Klemmstückes 18 für ein Zweikanal-Mikroinstrument, die auseinandernehmbare Stutzen 21
und 22 mit Rohransätzen 23 bzw. 24 enthält, die zum Kommunizieren mit den jeweiligen Kanälen des Mikroinstruments vorausbestimmt sind. Die Stutzen 21
und 22 sind miteinander verbunden und durch einen Dichtungsring 25 hermetisiert, außerdem besitzt der
Stutzen 21 an seinem freien Ende einen Dichtungsring 26 mit einer Kiemmutter 27.
Das Funktionieren der Einrichtung, die in F i g. 1 bis 4 gezeigt ist, wird mit F i g. 5,6 illustriert, am Beispiel der
Kerntransplantation beschrieben und besteht im folgenden.
Mit Hilfe des Dreiwegemikromanipulators 4 (F i g. 1), der die Verschiebung des Mikroinstruments 1 und Mikroansaugers 5 sichert, werden diese ins Sehfeld 28
(F i g. 5) eines Mikroskops neben der Zelle 29 gebracht. Man saugt die Zelle an die Stirnseite des Mikroansaugers 5 an, indem man einen Unterdruck durch einen
speziellen Mikroinjektor erzeugt, der mit dem Rohransatz 12 (F i g. 1) verbunden ist und indem man das Ende
des Mikroansaugers 5 der Zelle 29 (F i g. 5) zuführt so daß der durch die Stirnseite des Mikroansaugers begrenzte Abschnitt der Membran als Einführungsstclle
des Mikroinstruments 1 in die Zelle 29 dient. Dann führt man den Druck durch den Rohransatz 17 (F i g. 1) dem
Innenrlum des Membrandruckreglers oder der Arbeitskammer des Schrittmotors — dem Mittel 7b (F i g. 3) —
zu. Dabei wird die Membran 15 (F i g. 2) deformiert und sie verschiebt den Stößel 16 und das Klemmstück 18 mit
dem Mikroinstrument 1. In der Variante mit einem Schrittmotor verschiebt sich das bewegliche Glied 20
(Fig.3) des Motors. Das Mikroinstrument 1 verschiebt
sich dabei hin und durchsticht den fixierten und durch den Durchmesser der Stirnseite des Mikroansaugers 5
(Fig.5) begrenzten Abschnitt der Membran. Der zu transplantierende Kern 30, der aus einer anderen Zelle
genommen ist, wird im voraus in einen der Kanäle des Mikroinstrumentes 1 untergebracht. In diesem Falle
dient als Mikroinstrument 1 eine Zweikanalmikropipctte, deren jeder Kanal an den jeweiligen Mikroinjektor
angeschlossen ist mit deren Hilfe das Einsaugen und Herausstoßen von Kernen erfolgt Die Mikroinjektion
und das Mikroeinsaugen mit dem Mikroinstrument 1 führt man bei der Zufuhr eines Druckes oder Unterdruckes ins Gehäuse des Halters 2 (F i g. 4) über zwei
Kanäle durch die Rohransätze 23 und 24 (F i g. 4) aus. Die Zuführung isotonischer Lösung, die den Störungseffekt der Ganzheit der äußeren Membran der Zelle vermindert führt man mit Hilfe eines Mikroinjekivirs (in
Fig. nicht angedeutet) durch den Rohransatz 12 (F i g. 5) durch. Nach der Einführung des Mikroinstruments 1 in
die Zelle 29 wird deren Kern 31 (Fig.6) in den freien
Kanal des Mikroinstruments 1 eingesaugt und der zu transplantierende Kern 30, der sich im zweiten Kanal
des Mikroinstruments befindet wird aus diesem in die Zelle 29 hineingestoßen. Das heißt die Mikrooperation
zur Kerntransplantation wird mit einem Durchstich bewerkstelligt
Die Erfindung ist zur Verwendung im Gebiet Biologie, Landwirtschaft und Medizin bestimmt Sie kann erfolgreich zur Extraktion und Transplantation von Kernen und anderen Organellen, Eizellenblastomeren. zu
Mikroinjektionen von Stoffen in die Zellen, zur Kerninaktivation, zur Implantation und Inkorporation von Zellenteilen oder einzelnen Zellen in andere Zellen oder
Gewebe und Organismen, zu Mikrooperationen an
7 8
kleinsten Gefäßen, Muskelfasern u.a.m. verwendet werden.
15
25
30
35
40
45
50
55
Claims (6)
1. Verfahren zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen, bei dem eine Zelle mit Hilfe eines
Mikroansaugers festgehalten und die Membran der Zelle mit einem Mikroinstrument durchstochen
wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Durchstechen der Membran der Zelle (29) am Abschnitt unter dem Mikroansauger (5) erfolgt, wobei
das Mikroinstrument (1) durch den Hohlraum des Mikroansaugers (5) eingeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Hohlraum des Mikroansaugers (5)
mit isotonischer Lösung ausgefüllt wird.
3. Einrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, enthaltend ein Mikroinstrument,
das in einem Halter montiert ist, der mit einem beweglichen Glied eines Dreiwegemikromanipulators
starr verbunden ist und einen Mikroansauger zum Festhalteif der zu operierenden Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroansauger (S) am Halter
(2) starr befestigt ist, das Mikroinstrument (1) im Hohlraum des Mikroansaugers (5) koaxial zu diesem
angeordnet und mit dem Halter (2) durch ein Mittel (7a, Tb) verbunden ist, das eine Hin- und Herverschiebung des Mikroinstruments (1) längs der Achse
des Mikroansaugers (5) gewährleistet
4. Einrichtung nach Anspruch 3 zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet riaß-der Halter in Form eines hohlen Dreiwegestücks (8) ausgeführt ist von dem der eine Stutzen (19) mit dem Hohlraum des Mikroansaugers (5)
kommunizierend ist ini gegenüberliegenden Stutzen (10) ein Dichtungsring (11) i.iit einer Öffnung auf
dem Durchmesser des Mikroinstrumentes (1) eingebaut ist und der dritte, seitliche Stutzen mit einem
Rohransatz (12) zur Erzeugung negativen Druckes im Hohlraum des Mikroansaugers (5) und Einleitung
isotonischer Lösung versehen ist
5. Einrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Mittei (Jb) zur Verbindimg
des Mikroinstrumentes (1) mit dem Halter (2) ein Schrittschaltwerk mit Längsverschiebung vorgesehen ist
6. Einrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Mittel (7a) zur Verbindung
des Mikroinstrumentes (1) mit dem Halter (2) ein Membrandruckregler vorgesehen ist, dessen Gehäuse (13) mit dem Halter (2), die Membran (15) mit dem
Mikroinstrument (1) und der Innenraum mit einer Quelle von Steuerdruckluftimpulsen starr verbunden ist.
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