DE2809032C3

DE2809032C3 - Vorrichtung zum Zuführen einer Nähr-, Puffer- oder Enzymlösung für einen automatischen Brutschrank

Info

Publication number: DE2809032C3
Application number: DE2809032A
Authority: DE
Inventors: Takayuki Aihara; Toshio Chofu Shinohara; Shinroku Sogi; Ikuo Tawara; Makoto Yoshinaga
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1977-03-02
Filing date: 1978-03-02
Publication date: 1980-02-21
Also published as: US4234023A; US4179339A; US4231403A; DE2809032A1; DE2809032B2

Description

a) einen Vorratsbehälter (1) für Flüssigkeit zum Speichern einer Nähr-, Puffer- oder Enzymlösung in gekühltem Zustand,
eine Saug- und Druckpumpe (7) für Flüssigkeit zum Ansaugen der Flüssigkeit aus dem Vorratsbehälter (1) und Abgeben derselben an eine Drucköffnung (Tb),
ein erstes Rohr (6), das die Saug- und Druckpumpe (7) mit dem Vorratsbehälter (1) verbindet,

ein zweites Rohr (8), von dem ein Ende an die Drucköffnung (7fc) der Saug- und Druckpumpe (7) angeschlossen ist und das andere Ende eine eine Schutzwand gegen Umwelteinflüsse darstellende Wand (11) eines Inkubators durchdringend gestaltet ist, wobei sein freies Ende zu einer vorgegebenen Stelle im Inneren des Inubators hin gerichtet ist, und

ein Rohrdurchführungsstück (12) mit einem Außenrohr (14), das durch die Wand (11) hindurch in den Inkubator eindringend und mit einem Füllmaterial (13) aus Silikon gegen die Wand (11) abdichtend und an ihr befestigt ist, und einem Innenrohr (15), das in das Außenrohr (14) eingesetzt, gegen dieses hermetisch abgedichtet und mit ihm lösbar verbunden ist, wobei das freie Ende des zweiten Rohres (8) das Innenrohr (15) durchdringend gestaltet und in diesem von Füllmaterial (21) aus Silikon umschlossen ist, um es gegen das Innenrohr (15) abzudichten und an ihm zu befestigen, wodurch das zweite Rohr (8) durch das Durchführungsstück (12) an den Inkubator anschließbar ist.

e)

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Zuführen einer Nähr-, Puffer- oder Enzymlösung in einem automatischen Brutschrank zum automatischen Züchten von biologischen Geweben und Zellen.

Die Technik des Züchtens von biologischen Geweben und Zellen stellt ein wesentliches fundamentales Versuchsverfahren auf verschiedenen Gebieten, einschließlich der Medizin, Biologie, Pharmazie und Landwirtschaftswissenschaft dar. Die Züchtung von biologischen Geweben und Zellen über aufeinanderfolgende Generationen hinweg beinhaltet jedoch technische Schwierigkeiten, die in der Praxis verhindert haben, daß ein stabilisierter Stamm oder Kolonie gezüchtet werden konnte. Es bestand daher Bedarf an einem Verfahren zum Züchten von biologischen Geweben und Zellen, das es ermöglichte, durch Züchtung einen stabilisierten Stamm zu erhalten. Durch eine in jüngerer Zeit entwickelte Züchtungstechnik unter Verwendung eines Gasmilieus in einem Brutschrank wurde es möglich, Zellen spezieller Arten,

ζ. B. Leber-, Neuron-, Hirnanhangdrüsenzellen, in aufeinanderfolgenden Generationen zu züchten, was bisher als schwierig angesehen worden war.

Die Züchtung in aufeinanderfolgenden Generationen sei nachstehend zusammengefaßt dargestellt. Eine bestimmte Anzahl von Zellen wird in einer Nährlösung zu einer Suspension aufgeschlämmt_v die in ein Kulturgefäß, z. B. eine Petrischale, eingespritzt wird. Das Kulturgefäß wird in einen Brutschrank eingesetzt und dort zum Züchten der Zellen unter bzw. in einer gegebenen Gasatmosphäre still stehengelassen. Nach Ablauf einer bestimmten Zeitspanne wird das Kulturgefäß aus dem Brutschrank herausgenommen und unter dem Mikroskop durch Zählen der gewachsenen Zellen auf das Züchtungsergebnis hin untersucht. Wird festgestellt, daß die gewachsene Kolonie der gewünschten Zellen das Kulturgefäß ganz bedeckt, wird das K'ilturgefäß auf einen von Zellstämmen freien, sauberen Arbeitstisch übernommen, wo die Nährlösung im Kulturgefäß mit einer Pipette entnommen und weggeschafft wird. Danach wird eine Pufferlösung in das Kulturgefäß eingespritzt, um die zurückgebliebenen Zellen zu reinigen, und wird dann mit einer Pipette entfernt. Zum bequemen Ablösen der am Boden des Kulturgefäßes haftenden gewachsenen Zellen wird eine Enzymlösung, z. B. Trypsin, eingespritzt und das Kulturgefäß während einer bestimmten Zeitdauer ruhig stehengelassen. Nach Ablauf dieser Zeitspanne wird die Enzymlösung mit einer Pipette aus dem Kulturgefäß entfernt und weggeschafft, und es wird erneut eine Nährlösung in das Kulturgefäß eingespritzt. Die Nährlösung wird wiederholte Male mit der Pipette aufgesaugt und wieder abgegeben, um Schwingungen oder Bewegung hervorzurufen, welche ein völliges Ablösen der gewachsenen Zellen vom Boden des Kulturgefäßes und ihre Aufschlämmung in der Nährlösung ermöglicht. Die Zellensuspension wird dann mit der Pipette in ein Zentrifugierglas gegeben, das zum Abscheiden der Zellen aus der Nährlösung in eine Zentrifuge eingesetzt wird. Nach dem Zentrifugieren haften die Zellen am Boden des Zentrifugierglases an, während die Nährlösung als dekantierte Lösung abgegossen werden kann. In das Zentrifugierglas wird erneut eine Nährlösung eingespritzt und durch Aufsaugen und Wiederabgeben mit der Pipette bewegt, um durch Trennen der Zellen voneinander im Zentrifugierglas eine gleichmäßige Zellensuspension in der Nährlösung zu erhalten. Zur Beendigung eines Züchtungs-Vorganges wird abschließend die Lösung in gleichen Mengen auf ein Paar Kulturgefäße verteilt.

Bei dem beschriebenen Züchtungsverfahren ist es notwendig, zur mikroskopischen Untersuchung des Wachstums der Gewebe oder Zellen das Kulturgefäß aus dem Brutschrank herauszunehmen und der Außenatmosphäre auszusetzen. Dies ruft eine plötzliche Veränderung der Züchtungsbedingungen hervor, da die Zellen oder Gewebe aus einem gegebenen Milieu herausgenommen werden, das im Innern des Brutschrankeis aufrechterhalten worden war und zu dem die Beschaffenheit der Gasatmosphäre, Temperatur und Feuchtigkeit zählen. Dadurch entsteht eine empfindliche Beeinflussung der Gewebe oder Zellen der gezüchteten Kolonie und führt auch zu einer unvermeidlichen Verunreinigung derselben mit verschiedenartigen, in der Atmosphäre vorhandenen Stämmen.

Die zum Züchten in aufeinanderfolgenden Gene-

rationen erforderlichen verschiedenen Arbeitsgänge, die auf der Grundlage der mikroskopischen Untersuchungsergebnisse vorgenommen werden sollten, stützen sich auf eine vom Laboranten ausgeführte manuelle Verrichtung am sauberen Arbeitstisch. Dies bedeutet, daß jede kleine, von den Laboranten abhängige Abweichung bei der Durchführung der verschiedenen Arbeitsgänge das Ergebnis der Gewebeoder Zellenzüchtung direkt beeinflussen kann. Da die Laboranten unterschiedliche Erfahrung haben und in der Züchtungstechnik unterschiedlich geübt sind, ist es schwierig, ein allgemein gültiges Vorgehen in der Züchtungstechnik zu schaffen. Dies macht es unmöglich, durch Züchtung Gewebe oder Zellen einheitlicher Qualität zu erhalten. Folglich können verschiedene Forschergruppen, die eine gemeinsame Untersuchung über denselben Gegenstand durchführen, zu Ergebnissen kommen, die von der Qualität der gezüchteten Gewebe abhängig sind. In Extremfällen können sich die Aussagen widersprechen. Dies bedeutet, daß, wenn die Gewebe oder Zellen nach dem herkömmlichen Verfahren gezüchtet worden sind, die Gefahr unzuverlässiger Ergebnisse gegeben ist.

Es steht allgemein fest, daß die Ausbildung zu einem geübten Laboranten wenigstens zwei Jahre dauert, und aus dieser Tatsache ergibt sich ein ständiger Bedarf an geübten Laboranten. Folglich mußten die Forscher die mit der Züchtung zusammenhängenden Arbeiten selbst verrichten, statt sich ausschließlich auf ihre Untersuchungsarbeiten zu konzentrieren.

Der Erfindung lie<5t die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung der eingangs genannten Art vorzuschlagen, mit der sich bestimmte, mit der Züchtung zusammenhängende Zufuhrvorgänge automatisieren und dadurch Verunreinigungen und andere auf die sonst manuelle Verrichtung zurückzuführende Beeinträchtigungen vermeiden lessen.

Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe ist im Patentanspruch angegeben.

Eine Besonderheit der Erfindung ist die Durchführung des Zuführrohres durch die Wand des Brutschrankes im Bereich eines Rohrdu^rchführungsstükkes, welches die Gestalt eines aus einem inneren Rohr und einem äußeren Rohr gebildeten Rohrpaares hat. Das Zuführerrohr ist gegen das Innenrohr abgedichtet und an ihm befestigt.

Auf diese Weise wird das Auswechseln einer Flüssigkeitszuführvorrichtung erleichtert; man kann durch Herausschrauben des Innenrohres aus dem Außenrohr eine Zuführvorrichtung mit erschöpftem Flüssigkeitsvorrat durch eine neue gefüllte Vorrichtung ersetzten. Ferner besteht die Möglichkeit, die Zuführvorrichtung für Lösung oder Flüssigkeit im zusammengebauten Zustand zu sterilisieren, wodurch alle Verunreinigungsmöglichkeiten ausgeschaltet werden, die sonst mit der Demontage verbunden wären.

Nachstehend wird ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 eine Seitenansicht einer Vorrichtung zum Zuführen einer Lösung für einen automatischen Brutschrank, und

Fig. 2 einen vergrößerten Längsschnitt durch ein Rohrdurchführungsstück der Vorrichtung von Fig. 1.

Der in Fig. 1 dargestellte Vorratsbehälter 1 für eine Nähr-, Puffer- oder Enzymlösung hat eine obere Öffnung 2, die gewöhnlich mit einem Stopfen 3 aus Silikon-Kunstharz verschlossen ist, und ist im Betrieb

in einem Kühlschrank 4 angeordnet. Der Stopfen 3 ist mit einem Vorfilter 5 versehen, der Verbindung mit der Atmosphäre zuläßt, Zellstämme jedoch vom Innern des Vorratsbehälters 1 fernhält. Der Stopfen 3 ist von einem in ihm befestigten Ende eines ersten Rohres 6 durchdrungen, das den Vorratsbehälter 1 mit einer Saug- und Druckpumpe 7 verbindet, wobei das offene freie Ende des Rohres 6 in die Flüssigkeit eingetaucht ist. Das andere Ende des Rohres 6 ist an eine Ansaugöffnung Ta der Saug- und Druckpumpe 7 angeschlossen, die weiterhin eine Drucköffnung Ib aufweist, welche mit einem Ende eines von einem flexiblen Rohr gebildeten zweiten Rohres 8 zum Zuführen von Flüssigkeit verbunden ist. Das andere Ende des Rohres 8 hat eine Rohrspirale 9 und ist zu einem bestimmten Ort hin, z. B. zu einem Kulturgefäß oder Zentrifugierglas, gerichtet, das in einem Brutschrank angeordnet ist, in dem ein spezielles Milieu 10 aufrechterhalteu wird. Wie nachstehend näher beschrieben wird, erstreckt sich das zweite Rohr C durch ein Innenrohr eines Rohrdurchführungsstückes 12 und reicht mit seinem freien Ende in den Brutschrank. Das Rohrdurchführungsstück 12 hat ein Rohrpaar aus einem Innen- und einem Außenrohr und ist in einer Wand 11 angeordnet, welche die Isolier- oder Schutzwand des Brutschrankes gegen die Umgebung darstellt.

Einzelheiten des Aufbaues des Rohrdurchführungsstückes 12 sind in Fig. 2 zu erkennen. Beim gezeigten Beispiel hat das Rohrdurchführungsstück 12 ein Außenrohr 14, das sich durch die Wand 11 erstreckt und an dieser mittels eines Füllmaterials 13 aus Silikon unter Abdichtung befestigt ist, sowie ein Innenrohr 15, das unter hermetischer Abdichtung lösbar im Außenrohr 14 angeordnet ist. Das untere Ende des Außenrohres 14 mündet in das Milieu 10 des Brutschrankes und weist an seinem Umfang ein mit ihm fest bzw. einstückig verbundenes Anschlußstück 16 auf, das an einer oberen Platte 18 des Brutschrankes mit Schrauben 17 sicher befestigt ist. Zwischen dem Außenrohr 14 und dem Innenrohr 15 ist ein O-Ring 19 angeordnet, um an Undichtigkeitssteilen zwischen ihnen ein Austreten des Milieus 10 aus dem Brutschrank nach außen zu verhindern. Am Außenumfang seines oberen Teils hat das Innenrohr 15 ein Gewinde 20 zum klemmenden Verschrauben mit dem Außenrohr 14. Das freie Ende des zweiten Rohres 8 ist durch das Innenrohr 15 hindurchgeführt, und ein Abschnitt 8o davon, der im Innenrohr 15 angeordnet ist, ist am Innenrohr 15 unter hermetischer Abdichtung mittels eines Füllmaterials 21 aus Silikon befestigt, welches den Zwischenraum darin ausfüllt. In den Fällen, wo das Rohrdurchführungsstück 12 auch mit einer anderen Vorrichtung zum Zuführen von Flüssigkeit verwendet wird, die ähnlich aufgebaut ist, jedoch eine verschiedene Flüssigkeit abgibt, läßt sich im Innenrohr 15 ein zweites Rohr 22 dieser anderen Zuführvorrichtung zusamme η mit dem Rohr 8 mittels des Füllmaterials 21 aus Silikon befestigen.

Im Betrieb wird der Vorratsbehälter 1 im Kühlschrank 4 angeordnet, und das Rohrdurchführungsstück 12 dient dazu, das zweite Rohr 8 durch die Wand 11 des Brutschrankes hindurchzuführen, wobei das freie Ende des Rohres 8 zu einer vorgegebenen Stelle darin gerichtet ist, nämlich zu einem Kulturgefäß oder zu einem Zentrifugierglas hin. Nach dem Einschalten der Saug- und Druckpumpe 7 wird die Flüssigkeit aus dem Vorratsbehälter 1 durch die Rohre 6 und 8 von

außen in das Innere des Brutschrankes gefördert und wird beim Durchlauf durch die Rohrspirale 9 des Rohres 8 auf die im Milieu 10 aufrechterhaltene Temperatur erwärmt, bevor sie aus dem inneren Ende des Rohres 8 an das Kulturgefäß oder an das Zentrifugierglas abgegeben wird.

Wenn die Flüssigkeit im Vorratsbehälter 1 aufgebraucht ist, läßt sich das Innenrohr 15 durch Anfassen und Drehen an einem gerändelten oberen Endstück 23 aus dem Außenrohr 14 herausschrauben. Auf diese Weise läßt sich die gesamte Vorrichtung zum Zuführen von Flüssigkeit vom Brutschrank wegnehmen und durch eine neue Zuführvorrichtung mit voller Flüssig-Reiisfüüung ersetzen. Die neue Zuführvorrichtung für Flüssigkeit ist in völlig zusammengebautem Zustand sterilisiert worden. Das mit dem zweiten Rohr 8 verbundene Innenrohr IS läßt sich dann in das Außenrohr 14 einsetzen und mittels des Gewindes 20 mit ihm verschrauben. Sodann wird das freie Ende des ^r> Rohres 8 zu einem im Brutschrank angeordneten Kulturgefäß oder Zentrifugierglas hin gerichtet. Sobald der Vorratsbehälter 1 im Kühlschrank 4 angeordnet worden ist, ist die Vorrichtung zum Zuführen von Flüssigkeit betriebsbereit.

ίο Beim Montieren der Vorrichtung zum Zuführen von Flüssigkeit wird ein Austreten des Milieus 10 durch das Füllmaterial 13 und 21 aus Silikon und durch den O-Ring 19 sicher verhindert, die eine Flüssigkeitsversorgung gewährleisten, ohne eine Verunreinigung des Brutschrankes hervorzurufen.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

b)

c)

d)

Patentanspruch:

Vorrichtung zum Zuführen einer Nähr-, Pufferoder Enzymlösung in einem automatischen Brutschrank zum automatischen Züchten von biologischen Geweben und Zellen, gekennzeichnet durch