DE2626733B2

DE2626733B2 - Verfahren zum automatischen und fortgesetzten Züchten lebender Gewebe oder Zellen durch Gewebezucht

Info

Publication number: DE2626733B2
Application number: DE2626733A
Authority: DE
Inventors: Nagahiro Gocho; Atsuo Tachikawa Goto; Shinichiro Tokio Hattori; Masao Nakajima Yoshio Izawa; Shin-Ichi Hino Kamachi; Ichiro Sawamura; Toshio Chofu Tokio Shinohara; Shinroku Sogi; Makoto Hachiouji Yoshinaga
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1975-06-20
Filing date: 1976-06-15
Publication date: 1980-07-31
Also published as: DE2626733A1; GB1533301A; JPS51151384A; JPS5739746B2; US4154652A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum automatischen und fortgesetzten Züchten lebender Gewebe oder Zellen, die in einem Züchtgefäß zusammen mit einer Nährlösung in einem gasdicht abgeschlossenen Zuchtbehälter eingesetzt sind, durch Gewebezucht.

Die Züchtung von Geweben, insbesondere von Zellen eines lebenden Körpers oder lebenden Organismus hat gegenwärtig eine besondere Bedeutung auf vielen Gebieten, z. B. auf dem Gebiete der Medizin, der Biologie und angrenzenden Gebieten gefunden.

Neuere Entwicklungen und Fortschritte in der Viren- und Rickettsienforschung haben die Wissenschaft in die Lage versetzt, verschiedene neue Vakzine zu entwikkeln. Diese Vakzine müssen ständig erzeugt werden, um die notwendige Produktmenge mit stabilen Qualitäten entsprechend dem sozialen Bedarf zur Verfügung zu stellen. Bisher wurden die Vakzinen in der Regel unter Verwendung von Hühnereiern als Zucht- bzw. Kulturbasis hergestellt; aus immunologischen Gründen ist jedoch die Verwendung von Geweben oder Zellen eines menschlichen Körpers als Zucht- bzw. Kulturbasis erwünscht. Bekanntlich kann eine wiederholt mit auf Eierbasis erzeugten Vakzinen geimpfte Person unter Umständen eine Eierallergie entwickeln, und hierin liegt eines der sozialen Probleme, das die standardisierte Züchtung einer großen Menge von Geweben oder Zellen des menschlichen Körpers bzw. Organismus erforderlich macht.

Aufgrund der Schwierigkeit der Züchtung einer Subkultur von menschlichen Geweben oder Zellen aus einer bestehenden Kultur, war man bisher der Auffassung, daß die stabile gezüchtete »Masse« derartiger Gewebe oder Zellen mit Ausnahme von speziellen Zellen oder Geweben solange nicht gewonnen werden kann, bis die Technik der Züchtung von Geweben oder Zellen des lebenden Organismus in einem Inkubator oder in einem Zucht- bzw. Brutkasten, dessen Innenraum in einer besonderen Gasatmosphäre gehalten wird, entwickelt und popularisiert worden ist. Aufgrund dieser Züchttechnik wurde es möglich, selbst besondere lebende Zellen, wie Leberzellen, Nervenzellen und Hypophyse-Zellen zu züchten.

Aus den nachfolgend noch genauer angegebenen Gründen ist die herkömmliche Methode zur Züchtung lebender Gewebe oder Zellen jedoch schwer zu standardisieren. Bei der Zellen- oder Gewebezüchtungstechnik in einer Gasatmospkäre, die gegenwärtig ·: als die wirksamste Methode angesehen wird, ist es unvermeidlich notwendig, das die Gewebe oder Zellen enthaltende Züchtungsgefäß während des Züchtungsvorgangs aus einem gasdicht verschlossenen Zuchtbehälter herauszunehmen, um die Vermehrungs- bzw.

ίο Vervielfältigungsbedingungen der Gewebe oder Zellen beobachten zu können. Aufgrund dieser Beobachtungsbzw. Untersuchungsergebnisse führt der Züchtungsfachmann sodann die erforderlichen Handarbeiten zur Gewinnung der Subkultur der Zellen oder Gewebe durch. Daher werden die Zellen oder Gewebe im Züchtungsgefäß für relativ lange Zeiträume während der Untersuchung und Handarbeiten der Luft ausgesetzt, wodurch sich die Züchtungsumgebung für die Zellen oder Gewebe stark ändern kann. Dies bedeutet,

2t) daß die Züchtungsbedingungen der Zellen oder Gewebe aufgrund der Untersuchungen und Handarbeiten während der Züchtung beträchtlich beeinflußt werden. Neben diesen Änderungen der Züchtungsbedingungen können die Zellen oder Gewebe durch die Luft selbst

>■> oder durch in der Luft enthaltene Bakterien oder Keime verunreinigt werden. Überdies reicht die Zahl der zur Durchführung dieser Arbeiten befähigten Züchtungsfachleuchte nicht aus, da zur Ausbildung der Bedienungspersonen wenigstens eine zweijährige Ausbil-

lu dungszeit erforderlich ist.

Da die Standardisierung der Zellen- oder Gewebezüchtung aus den zuvor angeführten Gründen sehr schwierig ist, werden von verschiedenen, mit gleichen Untersuchungen befaßten Wissenschaftlern durchaus ■ gegensätzliche Schlüsse gezogen und Ergebnisse gewonnen.

Die Wissenschaftler müssen sich daher mit der Züchtung bzw. Kultivierung von Zellen oder Geweben befassen, anstatt sich den ursprünglichen medizinischen oder biologischen Studien zu widmen. Hierin liegt ein besonderes Arbeitsproblem für Wissenschaftler auf verschiedenen Gebieten, und es besteht ein besonderer Bedarf nach Vereinheitlichung, Standardisierung und Automatisierung der Zellen- oder Gewebeziichtung.

ι. Bei einer aus der CH-PS 4 89 609 bekannten Fermentiereinrichtung, deren Mischwerkzeug mit einem Leitrohr timgeben ist, welches mit Öffnungen zum Ansaugen aus verschiedenen Ebenen versehen ist, sind zum besseren und einheitlichen Durchmischen der

in Flüssigkeit Mittel vorgesehen, welche die im Behälter befindliche Flüssigkeit in vertikaler Richtung über mehrere Ebenen bewegen. Dadurch werden vor allem solche Fermentationsverfahren begünstigt, bei denen größere Gasmengen dauernd mit der Flüssigkeit in

■·'> innigem Kontakt gehalten werden müssen. Bei dieser bekannten Fermentiereinrichtung steht eine äußere Umlaufleitung mit der die Mischkammer umgebenden Behälterwand in Verbindung, in der zum Zwecke der Regelung der Umlaufmenge ein Ventil eingesetzt

t><) werden kann und Meßinstrumente zur Kontrolle und möglichen Regelung z. B. der Temperatur, der pH-, rH- und Druckwerte eingebaut werden können. Bei der Fermentation unter kräftiger Verwirbelung und Zerteilung der Flüssigkeit und Zugabe von beispielsweise

M gasförmigen Nährstoffen ist eine Feststellung einer Vermehrungsbedingiing und eine gezielte Teilung von in einer Flüssigkeit enthaltenen Geweben oder Zellen zur Züchtung von Subkulturen nicht möglich. Die

genaue Berücksichtigung der Vermehrungsbedingungen ist aber Voraussetzung für die Lösung des gattungsgemäßen Verfahrens zum automatischen und fortgesetzten Züchten lebender Gewebe oder Zellen. Insofern läßt die bekannte Fermentiereini ichtung keine Rückschlüsse darüber zu, wie der Fachmann verfahren soll, um die notwendigen Untersuchungsvorgänge insbesondere zur Feststellung des Vermehrungszustandes, der geeigneten Teilung der Zellen oder Gewebe und die Erzeugung von Subkulturen unter Vermeidung von Handarbeiten, zeitaufwendigen Manipulationen und eines Keimbefalls der Zellen oder Gewebe durch Umgebungseinflüsse zu vermeiden.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Züchten von Geweben oder Zellen lebender Körper bzw. Organismen zur Verfügung zu stellen, das die Zellen- oder Gewebezüchtung vereinheitlicht, standardisiert und automatisiert und mögliche Verunreinigungen durch Luft oder in Luft enthaltene Bakterien während der Züchtung ausschließt Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sollen lebende Gewebe oder Zellen automatisch fortgesetzt in großen Mengen gezüchtet werden können.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß in dem abgeschlossenen Züchtbehälter eine Vermehrungsbedingung der Gewebe oder Zellen und die aus der Temperatur, Feuchtigkeit uü-I Gasatmosphäre im Züchtbehälter sowie dem rH-Wert der Nährlösung bestehenden Züchtungsbedingungen bestimmt bzw. gemessen werden, daß nach diesen Meßwerten in dem Züchtbehälter die Züchtungsbedingungen auf den für die Kultur geeigneten Zustand gesteuert werden und daß die Gewebe oder Zellen nach der Vermehrung und Teilung in leere Züchtgefäße zur weiteren Züchtung und Vermehrung injiziert werden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können lebende Gewebe oder Zellen ohne Gefahr von Verunreinigungen oder Befall durch Bakterien sehr einfach und wirkungsvoll gezüchtet werden, da die Gewebe während des Züchtvorgangs nicht der Umgebungsluft ausgesetzt werden. Ferner gelingt es, die Züchtungsbedingungen zu vereinheitlichen oder zu standardisieren, da die Gasatmosphäre, die Temperatur, die Feuchtigkeit, der pH-Wert der Nährlösung und die erforderlichen Arbeiten bei der Züchtung einer Kultur aus einer bestehenden Kultur nach denjenigen Meßwerten bzw. Informationen automatisch gesteuert werden, die bei der forgesetzten Messung des Zrstands der Kultur und djr Züchtungsbedingungen gewonnen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren macht daher besonders ausgebildete Fachleuchte bei der Gewinnung der Subkultur überflüssig.

Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigt

Fi g. 1 eine schematische Darstellung des Zuchtapparats zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens; und

Fig. 2 ein Prozeßschaubild des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Züchtung von Geweben oder Zellen.

In F i g. 1 ist schematisch ein Zuchtapparat 10 zum Züchten oder Kultivieren von Zellen oder Geweben eines lebenden Organismus gezeigt. Der Zuchtapparat 10 weist einen gasdicht, abgeschlossenen Zuchtkasten bzw. -behälter 12 auf, in welchem mehrere Zuchtgefäße t4, z. B. Petrischalen angeordnet sind. Jedes dieser Gefäße 14 enthält in der Zeichnung nicht dargestellte lebende Zellen oder Gewebe zusammen mit einer Nährlösung. Im Zuchtkasten 12 sind eine erste

Detektoreinrichtung 16 zur Bestimmung der Gasatmosphäre, der Temperatur und der Feuchtigkeit im Kasten 12, eine zweite Detektoreinrichtung 18 zur Bestimmung des pH-Werts der Nährlösung in jedem Gefäß 14 und eine dritte Detektoreinrichtung 20 angeordnet, wobei letztere insbesondere aus einem optischen Mikroskop besteht, mit dem die Vervielfachungs- bzw. Vermehrungsbedingungen der Zeilen oder Gewebe in jedem Gefäß 14 bestimmt werden. Die dritte Detektoreinrichtung 20 ist an einer vorgegebenen Stelle im Zuchtbehälter 12 fest montiert, und jedes der Gefäße 14 wird nacheinander mit Hilfe einer in der Zeichnung nicht dargestellten Transportvorrichtung an die Stelle bewegt, wo die Vermehrungsbedingungen der Zellen oder Gewebe in jedem Gefäß 14 bestimmt werden können. Im beschriebenen Falle kann die Objektivlinse des Mikroskops der Detektoreinrichtung 20 bei der Messung bzw. Bestimmung in die Nährlösung oder die Gewebe oder Zellen im Gefäß 14 verlegt werden, wie dies in der japanischen Auslegeschrift Nr. 12 945/1976 beschrieben worden ist. Im Kasten 12 ist außerdem eine Verteilungsvorrichtung 22 angeordnet, die zur Verteilung einer Nährlösung, einer Pufferlösung und Enzymbzw. Fermentlösung in jedes Gefäß 14 und zur Abgabe dieser Lösungen aus den Gefäßen 14 in der nachfolgend noch genauer beschriebenen Weise dient. Die ersten, zweiten und dritten Detektoreinrichtungen 16 bis 20 sind jeweils mit Eingangsanschlüssen einer Steuereinrichtung 24 verbunden und so ausgebildet, daß sie die gemessene bzw. bestimmte Information, d. h. die Meßwerte in Form von elektrischen Signalen an die Steuereinrichtung 24 anlegen. Als Steuereinrichtung 24 kann beispielsweise ein Minicomputer dienen. Ein Temperaturregler 26 und ein Feuchtigkeitsregler 28 sind dem Zuchtkasten 12 zugeordnet und mit den Ausgangsanschlüssen der Steuereinrichtung 24 verbunden und steuern die Temperatur und die Feuchtigkeit im Zuchtkasten bzw. -behälter 12 entsprechend den von der Steuereinrichtung 24 bezogenen Steuersignalen. Diese wiederum sind aus den von der ersten Detektoreinrichtung 16 abgeleiteten Meßsignalen entwickelt.

Gasbehälter bzw. -flaschen 30, 32 und 34, die jeweils CO2,02 und N₂ enthalten, sind über Leitungen 36,38 und 40 mit dem Zuchtkasten 12 verbunden. Um den Gasstrom in den Zuchtkasten 12 geeignet steuern zu können, sind Steuerventile 42, 44 und 46 in den zugehörigen Leitungen 36,38 und 40 angeordnet. Jedes Steuerventil 42, 44 und 46 ist mit einem der Ausgangsanschlüsse der Steuereinrichtung 24 verbunden und wird von dem von der Steuereinrichtung 24 abgegebenen Steuersignal entsprechend dem von den ersten und zweiten Detektoreinrichtungen 16 und 18 abgeleiteten Meßsignal gesteuert. Insbesondere der pH-Wert der Nährlösung im Gefäß 14 wird von dem Steuerventil 42 nach dem Steuersignal der Steuereinrichtung 24 gesteuert, wobei das Steuersignal auf dem von der Detektoreinrichtung 18 gewonnenen Meßsignal basiert.

Ein eine Nährlösung enthaltender Nährlösungstrog 48, ein eine Pufferlösung enthaltender Pufferlösungstrog 50 und ein eine Enzymlösung enthaltender Enzymlösungstrog 54 sind jeweils über Leitungen 56,58 bzw. 60 mit der Verteilungsvorrichtung 22 verbunden. Steuerventile 62,64 und 66 sind ähnlich den Ventilen 42, 44 und 46 in den Leitungen 56, 58 bzw. 60 angeordnet und steuern die Zufuhr der entsprechenden Lösung zur Verteilungsvorrichtung 22. Jedes der Steuerventile 62,

64 und 66 ist mit einem zugehörigen Ausgangsanschluß der Steuereinrichtung 24 verbunden und wird von der Steuereinrichtung 24 entsprechend dem von der dritten Detektoreinrichtung 20 abgeleiteten Meßsignal gesteuert.

Die lebenden Zellen oder Gewebe werden in jedem der im gasdicht abgeschlossenen Zuchtkasten 12 angeordneten Gefäße 14 derart gezüchtet, daß sich die Zellen oder Gewebe im Gefäß 14 graduell vervielfachen bzw. vermehren. Während der Züchtung werden die Gasatmosphäre, die Temperatur und die Feuchtigkeit im Zuchtkasten 12 und der pH-Wert der Nährlösung im Gefäß 14 kontinuierlich von den ersten und zweiten Detektoreinrichtungen 16 und 18 gemessen bzw. überwacht. In ähnlicher Weise werden die Vermehrungs- bzw. Vervielfachungsbedingungen der Zellen oder Gewebe in jedem Gefäß 14 fortgesetzt von der dritten Detektoreinrichtung 20 in der beschriebenen Weise gemessen bzw. überwacht.

Die Steuereinrichtung 24 vergleicht kontinuierlich die aus den Detektoreinrichtungen kommenden Meßsignale mit den Sollwerten in der Steuereinrichtung 24 und erzeugt entsprechend den Vergleichsergebnissen bzw. Regelabweichungen Steuersignale für den Temperaturregler 26, den Feuchtigkeitsregler 28 und die Steuerventile 42 bis 46, so daß die Gasatmosphäre, die Temperatur und die Feuchtigkeit innerhalb des Zuchtbehälters 12 und der pH-Wert der Nährlösung in den Gefäßen 14 auf den vorgesehenen günstigsten Sollbedingungen gehalten werden. Die Steuereinrichtung 24 bestimmt die Vermehrungsbedingungen der Gewebe oder Zellen im Gefäß 14 durch Verarbeitung der von der Detektoreinrichtung 20 eingegebenen Meßinformationen. Zu diesem Zweck kann die durch photoelektrische Sortierung der Dichte der Gewebe oder Zellen oder durch Sortierung der Bilder der Gewebe oder Zellen gewonnene Information zur Kennzeichnung der Dichtemuster der Gewebe oder Zellen verarbeitet werden. Wenn die Steuereinrichtung 24 feststellt, daß sich die Gewebe oder Zellen in einem Gefäß 14 genügend weit vermehrt haben, um in Stücke geteilt zu werden, wird das Gefäß 14 zu einer Stelle nahe der Verteilungsvorrichtung 22 bewegt und danach das von der Steuereinrichtung 24 entwickelte Steuersignal an die Verteilungsvorrichtung derart angelegt, daß letztere die Nährlösung aus dem Gefäß 14 absaugt oder abzieht. Nach dem Abziehen der Nährlösung erzeugt die Steuereinrichtung ein weiteres Steuersignal, das an das Steuerventil 64 angelegt wird, worauf die Pufferlösung im Trog 50 dem Gefäß 14 über die Verteilungsvorrichtung 22 zugeführt wird. Die Pufferlösung dient zur Reinigung des Gefäßes 14 in vorgegebenen Zeiträumen; sie wird von der Verteilungsvorrichtung 22 wieder abgezogen, sobald di< Gefäßreinigung beendet ist. Danach wird das Steuer ventil 66 nach Maßgabe eines von der Steuereinrichtuni 24 gelieferten Steuersignals geöffnet, worauf die Enzymlösung über die Verteilungsvorrichtung 22 den Gefäß 14 zugeführt wird, um die während der Züchtung an den Innenflächen des Gefäßes 14 zum Hafter gebrachten Gewebe oder Zellen vom Gefäß U abzulösen.

ίο Nach diesen Operationen werden die von der Innenflächen des Gefäßes 14 gelösten Gewebe odei Zellen in einen im Zuchtbehälter 12 befindlicher Zentrifugalseparator eingebracht. Die im Separator von der Enzymlösung getrennten Gewebe oder Zellen werden sodann verdünnt, in Stücke vorgegebener Größe getrennt und in Leergefäße ähnlich den Gefäßen 14 in F i g. 1 zur weiteren Züchtung oder Vermehrung eingesetzt. Diese Operationen, d. h. das Einsetzen dei Gewebe oder Zellen in das Gefäß, das Teilen in Stück« vorgegebener Größe bzw. Menge und das Einsetzen ir den Leerbehälter werden mechanisch oder automatisch durch eine geeignete Vorrichtung (nicht gezeigt] durchgeführt, die im Zuchtkasten 12 eingebaut ist. Da diese Betätigungsvorrichtung an sich sowie die Transportvorrichtung zur Bewegung des Gefäßes 14 keiner wesentlichen Teil der vorliegenden Erfindung bildet unc da ferner beide Vorrichtungen entsprechend ihrer zugehörigen Funktionen ohne Schwierigkeit konstru iert werden können, sind diese Vorrichtungen in dei

jo Darstellung gemäß F i g. 1 fortgelassen, und es erübrig! sich ein näheres Eingehen auf deren bauliche Ausgestaltung.

F i g. 2 zeigt schematisch den beschriebenen Prozeß zur Züchtung von Geweben oder Zellen. In dem Prozeßschaubild gemäß F i g. 2 bezeichnen das Bezugszeichen 80 den Injektionsvorgang der geteilten Gewebe oder Zellen in einem Zuchtbehälter, das Bezugszeichen 82 den Züchtvorgang der Gewebe oder Zellen, das Bezugszeichen 84 den Vorgang der Bestimmung bzw.

«ο Messung der verschiedenen Zuchtbedingungen und der Vermehrungsbedingung der Gewebe oder Zellen, das Bezugszeichen 86 den Vorgang des Abziehens oder Absaugens der Nährlösung aus dem Zuchtgefäß, das Bezugszeichen 88 den Vorgang der Pufferlösungsinjek-

« tion in das Zuchtgefäß, das Bezugszeichen 90 den Vorgang des Abziehens der Pufferlösung aus dem Zuchtgefäß, das Bezugszeichen 92 den Vorgang der Injektion der Enzymlösung in das Zuchtgefäß, das Bezugszeichen 94 den Vorgang des Absaugens oder Austragens der Enzymlösung aus dem Zuchtgefäß und das Bezugszeichen 96 den Vorgang der Nährlösungsinjektion in ein leeres Zuchtgefäß.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

1
Patentanspruch:

Verfahren zum automatischen und fortgesetzten Züchten lebender Gewebe oder Zellen, die in einem Züchtgefäß zusammen mit einer Nährlösung in einem gasdicht abgeschlossenen Züchtbehälter eingesetzt sind durch Gewebezucht, dadurch gekennzeichnet, daß in dem abgeschlossenen Züchtbehälter eine Vermehrungsbedingung der Gewebe oder Zellen und die aus der Temperatur, Feuchtigkeit und Gasatmosphäre im Züchtbehälter sowie dem pH-Wert der Nährlösung bestehenden Züchtungsbedingungen bestimmt bzw. gemessen werden, daß nach diesen Meßwerten in dem abgeschlossenen Züchtbehälter die Züchtungsbedingungen auf den für die Kultur geeigneten Zustand gesteuert werden und daß die Gewebe oder Zellen nach der Vermehrung und Teilung ebenfall.; in dem Züchtbehälter in leere Züchtgefäße zur weiteren Züchtung und Vermehrung injiziert werden.