DE102009018325B4

DE102009018325B4 - Vorrichtung zur automatisierten, parallelisierten Kultivierung von Zellen

Info

Publication number: DE102009018325B4
Application number: DE200910018325
Authority: DE
Inventors: Josef Seidl; Dr. Wiechmann Michael
Original assignee: PAN-SYSTECH GmbH; PAN SYSTECH GmbH
Current assignee: PAN-SERATECH GMBH, DE
Priority date: 2009-04-22
Filing date: 2009-04-22
Publication date: 2014-02-13
Anticipated expiration: 2029-04-23
Also published as: DE102009018325A1

Abstract

Vorrichtung zur automatisierten, parallelisierten Kultivierung von Zellen in Zellkulturgefäßen mit einem Gehäuse (23), in welchem eine Beobachtungseinheit (3), aufweisend mindestens ein Mikroskop (7) und mindestens eine Kamera (6), eine Aufnahmevorrichtung (4) zur Aufnahme der Zellkulturgefäße sowie eine Fluidverteilungseinheit (5) zum automatischen Befüllen und/oder Entleeren der Zellkulturgefäße mit Fluiden angeordnet sind, wobei die klimatischen Verhältnisse in der Vorrichtung, nämlich mindestens die Gaszusammensetzung und die Temperatur zumindest im Bereich der Zellkulturgefäße regelbar sind, wobei im Gehäuse eine Klimakammer vorgesehen ist, in der eine gewünschte Temperatur und eine bestimmte Gaszusammensetzung automatisch einstellbar ist und in der die Aufnahmevorrichtung mit den Zellkulturgefäßen mindestens teilweise integriert ist, wobei der Vorrichtung getrennte Gasbehälter zugeordnet sind, welche unterschiedliche Gase enthalten, wobei die Gasströme aus den Gasflaschen steuerbar sind und wobei bestimmte Gasmengen in eine Mischkammer geleitet werden können, von wo aus das gewünschte Gasgemisch in die Klimakammer geleitet wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur automatisierten, parallelisierten Kultivierung von Zellen in Zellkulturgefäßen, insbesondere Mikrotiterplatten (MT-Platten).
Die Kultivierung von isolierten Zellen in vitro ist ein anerkanntes wertvolles Werkzeug der biomedizinischen Forschung zur Ermittlung reproduzierbarer Daten. Die Zellkultivierung wird heute aber immer noch überwiegend manuell durchgeführt. Da bei händischen Prozessen signifikante Prozessvariationen unvermeidbar sind und Sterilitätsprinzipien häufig durchbrochen werden, leidet die Reproduzierbarkeit und Zellqualität, welche wiederum eine unmittelbare Voraussetzung für einen erfolgreichen Einsatz z. B. in der Wirkstoffentwicklung darstellt. Weiterhin besteht durch den Faktor Mensch grundsätzlich ein erhöhtes Risiko der falschen bzw. instabilen Handhabung, insbesondere auch bei der Arbeit mit einer großen Anzahl unterschiedlicher Zelllinien. Außer der Qualität ist auch der Durchsatz bei der händischen Zellkultivierung limitiert bzw. nur durch einen entsprechenden Mitarbeiterstab skalierbar.
Zellkulturen werden u. a. in der Pharma-, Kosmetik- und Biotechindustrie bei der Suche nach neuen Wirkprinzipien und Wirkstoffen auf dem Sektor der Pharmazeutika und Pflanzenschutzmittel häufig verwendet und sind mittlerweile unverzichtbar. Nur standardisierte, automatisierte Zellkulturverfahren mit zuverlässiger Überwachung sämtlicher Zellkulturparameter ermöglichen über Jahre hinweg einen Vergleich zwischen den Substanzen und ihren Wirkprinzipien und stellen somit unter anderem eine essentielle Basis für die Forschungs- und Entwicklungs-Aktivität in der biopharmazeutischen Industrie in den Bereichen Zellkultivierung, Medienentwicklung und Wirkstoffentwicklung dar. EP 1 548 099 A1 beschreibt eine Vorrichtung zur automatisierten Kultivierung von Zellen in Zellkulturgefäßen. Die hier beschriebene Vorrichtung weist ein Gehäuse auf, in dem eine Beobachtungseinheit aus Mikroskop und Kamera untergebracht ist. In dem Gehäuse ist ferner eine Klimakammer angeordnet, in welcher eine Aufnahmevorrichtung für die Zellkulturgefäße angeordnet ist. Die in der genannten Druckschrift beschriebene Vorrichtung weist ferner eine Fluidverteileinrichtung zum Befüllen bzw. Entleeren der Zellkulturgefäße auf. Die Gaszusammensetzung und die Temperatur ist im Bereich der Zellkulturgefäße regelbar. WO 00/53720 A1 beschreibt eine automatisierte Zellkulturvorrichtung für Mikrotiterplatten. Auch die in dieser Druckschrift beschriebene Vorrichtung weist ebenfalls eine Kamera zur Aufnahme von Bildern von Zellkulturen auf.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Zellkulturverfahren zeichnen sich bislang durch einen hohen manuellen Aufwand aufgrund umfangreicher serieller Testungen mit schwieriger Dokumentation und Reproduzierbarkeit aus. Jegliche gewollte Veränderung der Kulturbedingungen führt momentan aufgrund fehlender Flexibilität und Automatisierung der Zellkultur zu hohen Mehraufwänden und geht einher mit einer hohen Ressourcenbildung (Personal, Zeit) mit entsprechenden Kostenimplikationen für die Anwender. Zudem weisen die aus dem Stand der Technik bekannten Zellkulturvorrichtungen Nachteile hinsichtlich der Gasversorgung der zu kultivierenden Zellen auf.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung zur automatisierten, parallelisierten Kultivierung von Zellen in Zellkulturgefäßen, insbesondere Mikrotiterplatten zur Verfügung zu stellen, welche die Nachteile des Standes der Technik überwindet.
Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1.
Bei der erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtung können unterschiedliche Gase aus getrennten Gasbehältern in gezielten Mengen in eine Mischkammer geleitet werden, von wo aus das gewünschte Gasgemisch in eine Klimakammer geleitet wird. Hierdurch kann bereits vor Einleitung des Gasgemisches in die Klimakammer eine gewünschte, für bestimmte Zellkultivierungen eine optimale Gaszusammensetzung erzeugt und in der Mischkammer zunächst getestet werden. So benötigen beispielsweise gezüchtete Tumorzellen bestimmte Sauerstoffkonzentrationen, die sich von der Konzentration des Sauerstoffes in der Umgebungsluft unterscheidet. In der Mischkammer, welche Teil der Regelstrecke ist, kann nun das gewünschte Gasgemisch in konstanter Zusammensetzung hergestellt werden. Ferner kann in der Mischkammer auch eine bestimmte bevorzugte Temperatur des Gases eingestellt werden.
Durch die Beobachtungseinheit mit einem Mikroskop und einer Kamera ist eine ständige Beobachtung und optische Auswertung des Zellwachstums und der Zellmorphologie möglich.
Zellkulturgefäße können z. B. Zellkulturflaschen sein. Vorzugsweise sind die Zellkulturgefäße jedoch MT-Platten.
Die MT-Platten werden automatisch durch die Fluidverteilungseinheit befüllt bzw. nicht benötigtes bzw. verbrauchtes Fluid wird abgesaugt bzw. ausgetauscht.
Die Module des Systems (Beobachtungseinheit, Aufnahmevorrichtung, Fluidverteilungseinheit) sind in einem speziellen Gehäuse angeordnet, sodass die Vorrichtung als so genannte Sterilbank fungiert. Mit dieser Sterilbank ist eine offene Fluidik und Medienversorgung möglich, da die Gefahr einer bakterielle Verunreinigung durch das Gehäuse stark minimiert wird.
Die gesamte Vorrichtung funktioniert automatisch, d. h., dass die wesentlichen Arbeitsschritte bei der Kultivierung der Zellen, wie z. B. Befüllen und Absaugen der Wells (Mulden der MT-Platten), mikroskopische Beobachtung und Auswertung automatisch erfolgen. Dadurch können sämtliche Arbeitssschritte in dem geschlossenen System der Sterilbank durchgeführt werden und es müssen beispielsweise keine MT-Platten aus dem System entnommen werden. Durch die Regelbarkeit der klimatischen Verhältnisse in der Vorrichtung kann das Klima von außen an die jeweiligen Bedürfnisse der Zellkulturen angepasst werden.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist eine Klimakammer auf, in der ein gewünschtes Klima, nämlich eine gewünschte Temperatur und eine bestimmte Gaszusammensetzung automatisch einstellbar ist und in der die Aufnahmevorrichtung mit den Zellkulturgefäßen, insbesondere den MT-Platten mindestens teilweise integriert ist, wobei die Klimakammer im Gehäuse angeordnet ist. Durch die Klimakammer ist es möglich, ein bestimmtes Klima nur innerhalb eines begrenzten Bereiches innerhalb des Gehäuses zu erzeugen. In der Regel sind sämtliche verwendete Zellkulturgefäßen, insbesondere MT-Platten mit den darin befindlichen Zellkulturen innerhalb der Klimakammer angeordnet. In der Klimakammer wird dann ein bestimmtes, für die jeweiligen Zellkulturen optimales Klima eingestellt. Die Temperatur wird vorzugsweise auf Werte von 20 bis 45°C eingestellt. Die CO₂-Konzentration wird in der Regel auf 5 bis 20% eingestellt. Der Anteil an Sauerstoff innerhalb der Klimakammer liegt in der Regel bei 10 bis 40%. Die Kontrolle des Klimas innerhalb der Klimakammer erfolgt vorzugsweise durch entsprechende Sensoren innerhalb der Klimakammer. Ferner wird durch die Klimakammer erreicht, dass eine weitere Abschottung der Zellkulturen von der Aussenwelt erfolgt und so die Gefahr einer bakteriellen Verunreinigung der Zellkulturen in den Zellkulturgefäßen weiter minimiert wird.
Durch die Aufnahmevorrichtung können beispielsweise MT-Platten in verschiedener Anzahl und Wellzahl (z. B. 6, 12, 24, 96, 384) aufgenommen werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind die Zellkulturgefäße, insbesondere MT-Platten vorzugsweise im Bereich der Beobachtungseinheit und/oder im Bereich der Fluidverteilungseinheit, vorzugsweise automatisch durch einen Schlitten oder Roboterarm aus der Klimakammer bzw. in die Klimakammer transportierbar. Auf diese Art und Weise können bestimmte, ausgewählte Zellkulturgefäße, insbesondere MT-Platten zum Befüllen mit Fluid kurzfristig aus der Klimakammer herausgebracht werden. Auch können bestimmte Zellkulturgefäße zum Beobachten in den Bereich der Beobachtungseinheit transportiert werden. Diese gezielten, kurzfristigen Transporte aus der Klimakammer heraus haben keine negativen Auswirkungen auf das Klima innerhalb der Klimakammer. Das automatische Transportieren der Zellkulturgefäße aus der Klimakammer bzw. in die Klimakammer ersetzt ein manuelles Bewegen der MT-Platten innerhalb des Systems, was mit einer hohen Verunreinigungsgefahr verbunden wäre.
Mit Vorteil sind die Beobachtungseinheit und/oder die Fluidverteilungseinheit außerhalb der Klimakammer angeordnet. Dies hat u. a. den Vorteil, dass diese Einheiten nicht dem, teilweise extremen Klima innerhalb der Klimakammer ausgesetzt werden. So werden diese Einheiten beispielsweise von einer hohen Luftfeuchtigkeit bewahrt, welche die genannten Einheiten schädigen könnte. Ferner werden Verunreinigungen der Zellkulturen durch die genannten Einheiten vermieden.
Mit Vorteil umfasst die Aufnahmevorrichtung mindestens zwei, vorzugsweise übereinander angeordnete Aufnahmeeinheiten und weist vorzugsweise Halteeinrichtungen zum Halten der Zellkulturgefäße, insbesondere MT-Platten auf. Durch die übereinander angeordneten Aufnahmeeinheiten wird eine gravierende Platzeinsparung erreicht, was auch zu einer Senkung der Systemkosten führt. Durch die Anordnung übereinander angeordneter Aufnahmeeinheiten können wesentlich mehr Zellkulturgefäße in der Klimakammer untergebracht werden. Die Halteeinrichtungen können beispielsweise Aussparungen innerhalb der Aufnahmeeinheiten sein, deren Form an die Form der Zellkulturgefäße, insbesondere MT-Platten angepasst ist.
Bei einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist ein im Bereich der Beobachtungseinheit befindliches Zellkulturgefäß, insbesondere MT-Platte bewegbar, wobei die Bewegungen vorzugsweise steuerbar sind.
Mit Vorteil ist die Optik (Mikroskop inkl. Kamera) der Beobachtungseinheit und/oder das zu beobachtende Zellkulturgefäß bewegbar, wobei die Bewegungen der Kamera bzw. der Zellkulturgefäße vorzugsweise steuerbar sind.
Das verwendete Mikroskop der Optik der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann ein normales Mikroskop (Durchlichtmikroskop) oder auch ein Phasenkontrastmikroskop sein. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann jedoch auch Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden, weshalb es oftmals auch von Vorteil ist, wenn das Mikroskop ein Fluoreszenzmikroskop ist.
Die Optik der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist vorzugsweise eine automatische Fokussierung auf. Ferner weist die Optik in der Regel einen automatischen Objektivwechsel auf.
Die Beobachtungseinheit ist vorzugsweise zur Online-Auswertung von Zellmorphologie, Zellphysiologie, Zellverhalten und Zellwachstum fähig.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfasst die Fluidverteilungseinheit mehrer Behältnisse zum Lagern unterschiedlicher Fluide, wie z. B. Zelllösungen, Nährstoffe und Farbstoffe, sowie eine Mikrodosiereinheit zur gezielten, kontrollierten Zugabe der Fluide in die Zellkulturgefäße, insbesondere in die Wells der MT-Platten und vorzugsweise auch zum Entfernen der Fluide aus den Zellkulturgefäßen, insbesondere aus den Wells der MT-Platten, wobei die Bewegungen und Aktionen der Mikrodosiereinheit vorzugsweise steuerbar sind. Durch die Ausführung der Fluidverteilungseinheit mit mehreren Behältnissen zum Lagern unterschiedlicher Fluide können beispielsweise in bestimmte Wells von MT-Platten mehrere, unterschiedliche Fluide zugegeben werden. Soll beispielsweise mit Fluoreszenzmikroskopie gearbeitet werden, können in manche Wells neben Zellösungen und Nährstoffen auch Farbstoffe für die Fluoreszenzmikroskopie eingebracht werden. Sollen manche Wells wiederum von Fluiden befreit werden, kann dies ebenfalls durch die Mikrodosiereinheit der Fluidverteilungseinheit erfolgen. Die Behältnisse können um die Mikrodosiereinheit herum positioniert werden. Bei einer derartigen Ausführungsform ist die Mikrodosiereinheit vorzugsweise rotierbar ausgestaltet, sodass die Mikrodosiereinheit durch Rotationsbewegungen die einzelnen Behältnisse anfahren kann.
Mit Vorteil sind die Zellkulturgefäße, insbesondere MT-Platten und vorzugsweise auch die Wells der MT-Platten indiziert. Dabei wird in der Regel jeder Platte und vorzugsweise jedem Well eine Zuordnungsnummer (Index) zugeordnet, welche vom System, insbesondere durch die unten beschriebene Software, wiedererkannt werden.
Besonders bevorzugt sind die Zellkulturgefäße transparent ausgebildet. Dadurch können alle Arten von Mikroskopie, insbesondere auch Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt werden. Verwendete MT-Platten sind vorzugsweise sehr dünn ausgebildet, wodurch die Objektive des Mikroskops möglichst nah an eine zu beobachtende Zellkultur herangebracht werden können. Die MT-Platten können beispielsweise dünne Folienböden aufweisen. Die MT-Platten können aus allen lichtdurchlässigen Materialien, wie z. B. Glas, Kunststoff etc. gefertigt sein.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist diese Sensoren zur Kontrolle sämtlicher relevanter Parameter, insbesondere Temperatur, CO₂-Konzentration, O₂-Konzentration, N₂-Konzentration, Luftfeuchtigkeit und/oder Zufuhr von Fluiden in die Zellkulturgefäße, insbesondere in die Wells von MT-Platten auf. Diese Sensoren sind die Grundlage für eine vollautomatische Kontrolle und Steuerung der klimatischen Verhältnisse sowie der Zufuhr von Fluiden in die Zellkulturgefäße.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist gekennzeichnet durch ein computergesteuertes Kontroll- und Steuersystem zur automatischen Kontrolle und Steuerung mindestens einer, vorzugsweise aller nachfolgend aufgeführter Parameter bzw. Arbeitsschritte:

a) Temperatur, insbesondere in der Klimakammer;
b) O₂-Anteil im Gas, insbesondere in der Klimakammer;
c) CO₂-Anteil im Gas, insbesondere in der Klimakammer;
d) N₂-Anteil im Gas, insbesondere in der Klimakammer;
e) Befüllung und/oder Entleerung ausgewählter Zellkulturgefäße, insbesondere ausgewählter Wells von ausgewählten MT-Platten mit ausgewählten Mengen von ausgewählten Fluiden;
f) mikroskopische Beobachtung und Auswertung von Zellkulturen in ausgewählten Zellkulturgefäßen, insbesondere ausgewählten Wells von ausgewählten MT-Platten zu ausgewählten Zeiten mit ausgewählter Technik, wie z. B. Fluoreszenz – oder Phasenkontrastmikroskopie.

Vorzugsweise werden sämtliche Parameter bzw. Arbeitsschritte in das System eingespeist. Ab diesem Zeitpunkt werden beispielsweise die klimatischen Bedingungen vom System automatisch geregelt. Sollte ein oder mehrere Parameter im Laufe der Zellkultivierungszyklen von den eingegebenen Werten abweichen (z. B. in Folge eines kurzfristigen Öffnens der Klimakammer zum Heraus- bzw. Hineintransportieren einer MT-Platte), wird dieser umgehend auf den vorgegebenen Wert nachgeregelt. Zur gezielten Befüllung ausgewählter Wells von ausgewählten MT-Platten mit ausgewählten Mengen von ausgewählten Fluiden sind die MT-Platten und vorzugsweise auch die Wells der MT-Platten indiziert. Dadurch können die Wells der MT-Platten auf besonders einfache Weise in das System eingegeben und von diesem wiedererkannt werden. Mit Hilfe der Optik werden vorzugsweise kontinuierlich Aufnahmen von den kultivierten Zellen gemacht, wobei die Aufnahmen vorzugsweise vom System gespeichert werden. Das System erkennt vorzugsweise auch bestimmte Veränderungen an den Zellkulturen und kann dadurch auf bestimmte Veränderungen der Zellkulturen durch Nachregeln der oben genannten Parameter bzw. Arbeitsschritte reagieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur automatisierten, parallelisierten Kultivierung von Zellen in Zellkulturgefäßen, insbesondere Mikrotiterplatten, die sich in einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13 befinden, mit folgenden Arbeitsschritten:

a) Befüllen des Systems mit Zellkulturgefäßen;
b) Befüllen des Systems mit Behältnissen, enthaltend zu verwendende Fluide, wie Zellkulturmedium, Zellsuspension, Prüfsubstanz, Farbstoff;
c) Bestücken des Systems mit Behältnissen, enthaltend zu verwendende Gase, wie O₂, CO₂, N₂;
d) Programmieren des Systems zur automatischen Einstellung mindestens einer der folgenden Parameter: – Temperatur – O₂-Anteil im Gas – CO₂-Anteil im Gas – N₂-Anteil im Gas;
e) Programmieren des Systems zur automatischen Befüllung und/oder Entleerung von Zellkulturgefäßen, insbesondere von ausgewählten Wells von ausgewählten MT-Platten mit ausgewählten Mengen von ausgewählten Fluiden;
f) Programmieren des Systems zur mikroskopischen Beobachtung und Auswertung von Zellkulturen in ausgewählten Zellkulturgefäßen, insbesondere in ausgewählten Wells von ausgewählten MT-Platten zu ausgewählten Zeiten mit ausgewählter Technik, wie z. B. Fluoreszenz – oder Phasenkontrastmikroskopie.

Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung bzw. beim erfindungsgemäßen Verfahren regelt das System die klimatischen Bedingungen automatisch nach im Sinne eines Regelkreises zur konstanten Aufrechterhaltung der klimatischen Bedingungen. Ferner führt das System die mikroskopische Auswertung gemäß den programmierten Werten für die Mikroskopie ans Ferner kann das System verbrauchtes Medium entnehmen und neues Medium zuführen.
Das Befüllen des Systems mit Zellkulturgefäßen und das Befüllen des Systems mit Behältnissen, enthaltend zu verwendende Fluide erfolgt in der Regel manuell. Dies gilt auch für das Bestücken des Systems mit Behältnissen, enthaltend zu verwendende Gase. Hierzu kann die erfindungsgemäße Vorrichtung ein weiteres Gehäuse aufweisen, welches die genannten Gasflaschen enthalten kann.
Zusammenfassend lassen sich unter anderem folgende Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie des erfindungsgemäßen Verfahrens nennen:

– Automatisierte, parallelisierte Kultivierung von Zellen in Zellkulturgefäßen, insbesondere in Mikrotiterplatten in einem Gesamtsystem mit automatischer Kontrolle sämtlicher Zellkulturparameter (z. B. Temperatur, CO₂-Konzentration, O₂-Konzentration, N₂-Konzentration, Luftfeuchtigkeit, Fluidsupport, aktive Substanzen);
– niedrige Kosten;
– offene Systemplattform-Lösung für die biopharmazeutische Industrie, um sowohl neue verbesserte Zelllinien entwickeln als auch neue Wirkstoffe effizient und hoch-reproduzierbar screenen und entwickeln zu können;
– geringer Platzbedarf und einheitliche, intuitive Bedienung mit geringer Einarbeitungszeit für das Bedienpersonal;
– wirtschaftliche Nutzung durch Mehrfachverwendung teurer Baugruppen;
– apparativ einfach, ergonomischer, modularer Aufbau, langlebige Komponenten mit hoher Biokompatibilität;
– ermöglicht eine parallele, simultane Kultivierung unterschiedlicher Zellen unter identischen Bedingungen;
– Möglichkeit einer ständigen mikroskopischen Beobachtung und Dokumentation und Speicherung aller relevanter Daten für den späteren Abruf und Auswertung;
– direkte Messung der Effekte bei Veränderung der Kulturbedingungen und Möglichkeit der Auswertung je nach Medienzusammensetzung;
– sofortige Erkennung morphologischer Veränderungen und Verbesserung der Entwicklungsqualität durch aussagekräftige Ergebnisse;
– Möglichkeit der Einstellung optimaler Konzentrationen einzelner Stoffe und stufenlose Änderung der Kulturbedingungen;
– Verkürzung der Entwicklungszeiten durch Parallelisierung um den Faktor 2 bis 4 (z. B. Reduktion der Zeit für eine Medienoptimierung von bisher 12 Monaten auf 3 bis 6 Monate);
– Reduktion der Entwicklungskosten durch Automatisierung um den Faktor 2 bis 3 (z. B. Reduktion der Kosten für eine Medienoptimierung von früher 75.000 EUR auf 25.000 EUR bis 40.000 EUR);
– automatisiertes Durchführen komplexer Zellkulturen z. B. für Toxizitätsstudien zur Reduktion der Notwendigkeit und der Anzahl von Tierversuchen.

Folgende Anwendungsfelder sind mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung bzw. dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich (beispielhaft):

– Entwicklung serumfreier Systeme;
– Nährmedien-Optimierung;
– Stammzellenforschung;
– Klonentwicklung;
– Wirkstoffforschung;
– Zellzyklus-Untersuchungen;
– Zell-Interaktionen;
– Organsimulation;
– Cytotoxizitäts-Tests;
– Cell-processing;
– Entwicklung therapeutischer Ansätze auf zellulärer Basis;
– Automatisiertes Durchführen komplexer Zellkulturen zur Reduktion von Tierversuchen.

Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung in Verbindung mit den Zeichnungen und den Unteransprüchen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich allein oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.
In den Zeichnungen zeigen:
1: eine Seitenansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung (ohne Gehäuse und Klimakammer);
2; eine perspektivische Darstellung der Vorrichtung von 1;
3: eine Draufsicht der Vorrichtung von 1;
4: eine perspektivische Darstellung der Vorrichtung von 1 mit Klimakammer;
5: die Vorrichtung von 4 mit Gehäuse;
6: Steuer- und Regelungsschema für eine erfindungsgemäße Vorrichtung.
1 zeigt eine Seitenansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung 1 zur automatisierten, parallelisierten Kultivierung von Zellen in Mikrotiterplatten 2 mit einer Beobachtungseinheit 3, einer Aufnahmevorrichtung 4 zur Aufnahme der Mikrotiterplatten 2 sowie einer Fluidverteilungseinheit 5. Die Beobachtungseinheit 3 umfasst eine CCD-Kamera 6, sowie ein Mikroskop 7. Die Kamera 6 sowie das Mikroskop 7 sind an einer Halterung 8 angeordnet. Die Beobachtungseinheit 3 umfasst ferner einen Aufnahmetisch 9 zur Aufnahme der MT-Platten 2.
Die Aufnahmevorrichtung 4 umfasst vier übereinander angeordnete Aufnahmeplatten 10. Die Aufnahmeplatten 10 weisen (hier nicht dargestellte) Aussparungen auf, in welche die MT-Platten einpassbar sind. Die Aufnahmevorrichtung 4 kann gehoben bzw. gesenkt werden. Innerhalb der Aufnahmeplatten 10 der Aufnahmevorrichtung 4 können die MT-Platten 2 bewegt werden. In der vorliegenden Darstellung ist gezeigt, wie eine MT-Platte 2a von der Aufnahmevorrichtung 4 in den Bereich der Beobachtungseinheit 3 mit Hilfe eines Schlittens 11 transportiert wird. Durch die Hub- und Senkbewegungen der Aufnahmevorrichtung 4 sowie durch die Transportierbarkeit der MT-Platten 2 innerhalb einer Ebene können gezielt MT-Platten beispielsweise der Beobachtungseinheit 3 oder der Fluidverteilungseinrichtung 5 zugeführt werden.
Die Fluidverteilungseinheit 5 umfasst eine Mikrodosiervorrichtung 12 mit einem bewegbaren, insbesondere Rotationsbewegungen ausführenden Verteilarm 13, welcher mit einer Pipette 14 versehen ist. Die Fluidverteilungseinheit umfasst ferner mehrere Behältnisse 15, in welchen unterschiedliche Fluide, wie beispielsweise Zellsuspensionen, Nährstoffe, Farbstoffe etc., enthalten sind. Die Behältnisse 15 sind in einer bestimmten Anordnung um die Mikrodosiervorrichtung 12 herum angeordnet, wobei die Pipette 14 durch Rotationsbewegungen des Verteilarms 13 und/oder durch Bewegung der Pipette entlang des oberen Abschnittes 16 des Verteilarms 13 zu den einzelnen Behältnissen gebracht werden kann. Zum Befüllen der Wells 17 der MT-Platten 2 können die MT-Platten 2 automatisch von der Aufnahmevorrichtung 4 in den Bereich der Fluidverteilungseinheit 5 mittels eines Schlittens transportiert werden. In der vorliegenden Darstellung ist eine MT-Platte 2b im Bereich der Fluidverteilungseinheit 5 angeordnet und wird dort mit Hilfe der Mikrodosiervorrichtung 12 mit bestimmten Fluiden befüllt.
2 zeigt eine perspektivische Darstellung der Vorrichtung von 1. Gut zu erkennen sind in dieser Darstellung die übereinander angeordneten Aufnahmeplatten 10 der Aufnahmevorrichtung 4. Die einzelnen Aufnahmeplatten 10 weisen Aussparungen 18 auf, die so dimensioniert sind, dass die MT-Platten 2 darin aufgenommen und gehalten werden können.
3 zeigt eine Draufsicht auf die Vorrichtung 1 von 1 bzw. 2. Neben dem eigentlichen Arbeitsraum, welcher sich unter dem hier nicht dargestellten Gehäuse befindet, ist eine Aufnahmekammer 19 zur Aufnahme von Gasflaschen 20 angeordnet.
4 zeigt die Vorrichtung 1, wobei die Aufnahmevorrichtung 4 in einer Klimakammer 21 angeordnet ist. Das Gehäuse 21a der Klimakammer kann transparent oder undurchsichtig sein. Das Gehäuse 21a schließt die Aufnahmevorrichtung 4 im Wesentlichen luftdicht ein und trägt so zu einer Vermeidung von Verunreinigung der MT-Platten bei. Innerhalb der Klimakammer 21 kann ein gewünschtes Klima eingestellt werden. So können beispielsweise die Temperatur, die O₂-Konzentration, die CO₂-Konzentration, N₂-Konzentration sowie die Luftfeuchtigkeit eingestellt werden. Auf diese Art und Weise können die klimatischen Verhältnisse auf die jeweiligen Bedürfnisse der zu kultivierenden Zellen eingestellt werden. Die Beobachtungseinheit 3 sowie die Fluidverteilungseinheit 5 sind außerhalb der Klimakammer 21 angeordnet und werden so nicht den klimatischen Gegebenheiten, welche für eine optimale Zellkultivierung nötig sind, ausgesetzt. Ferner wird verhindert, dass Verunreinigungen (z. B. Schmierfette) von der Beobachtungseinheit 3 bzw. der Fluidverteilungseinheit 5 in die MT-Platten 2 gelangen. Im Gehäuse 21a sind zwei Öffnungen 22 angeordnet, welche das Transportieren von MT-Platten aus der Klimakammer 21 heraus bzw. in die Klimakammer 21 hinein ermöglichen. Die Öffnungen 22 sind im Bereich der Beobachtungseinheit 3 sowie im Bereich der Fluidverteilungseinheit 5 angeordnet und ermöglichen dort ein Transportieren von MT-Platten 2. Die Öffnungen 22 können nach dem Transport der MT-Platten verschlossen werden.
5 zeigt die Vorrichtung 1 mit aufgesetztem Gehäuse 23. Das Gehäuse 23 kann komplett transparent oder auch komplett undurchsichtig sein. Das Gehäuse 23 kann auch – wie im vorliegendem Ausführungsbeispiel – einen transparenten Bereich 24 in Form einer Glasscheibe auf weisen. Die Glasscheibe 24 kann als öffenbares Fenster ausgebildet sein, so dass im Bedarfsfall durch das geöffnete Fenster 24 in das Innere des Gehäuses 23 gelangt werden kann. Die gesamte Vorrichtung 1 ist als so genannte „Sterilbank” ausgeführt. Das Gehäuse 23 schließt den Kultivierungsraum im Wesentlichen luftdicht ab und verhindert ein Eindringen von Schmutz, Bakterien etc. von außen in den Innenraum.
Sämtliche klimatische Bedingung im Inneren der Klimakammer 21 bzw. im Gehäuse 23 werden durch ein computergesteuertes Kontroll- und Steuersystem gesteuert. Sensoren im Inneren des Gehäuses 23 bzw. im Inneren der Klimakammer 21 liefern ständig Informationen über die gegenwärtigen Verhältnisse in den jeweiligen Räumen. Durch die Kontroll- und Steuersoftware werden die klimatischen Bedingungen stets auf einem vorgegebenen Level gehalten. Auch die Befüllung der Wells 17 bestimmter MT-Platten mit bestimmten Mengen von bestimmten Fluiden wird durch das computergesteuerte Kontroll- und Steuersystem gesteuert. Hierzu sind die MT-Platten (2) und die einzelnen Wells 17 der MT-Platten 2 indiziert und werden vom System wiedererkannt. Das computergesteuerte Kontroll- und Steuersystem kann dahingehend programmiert werden, dass bestimmte Wells (17) von ausgewählten MT-Platten (2) zu bestimmten Zeiten mit bestimmten Mengen von bestimmten Fluiden befüllt werden.
Ebenso wird das computergesteuerte Kontroll- und Steuersystem zur mikroskopischen Beobachtung und Auswertung von bestimmten Zellkulturen in bestimmten Wells (17) von bestimmten MT-Platten (2) zu bestimmten Zeiten mit bestimmter Technik, wie z. B. Flureszens- oder Phasenkontrastmikroskopie, programmiert. Ferner kann das System dahingehend programmiert werden, dass zu bestimmten Zeiten Aufnahmen von Zellkulturen gemacht werden, wobei die Aufnahmen in der Regel gespeichert und ständig ausgewertet werden.
6 zeigt eine schematische Darstellung der Steuerung und Regelung der klimatischen Verhältnisse im Inneren der Klimakammer 21 bzw. im Inneren des Gehäuses 23. In der Klimakammer 21 sind Gassensoren 25 angeordnet, nämlich ein CO₂-Sensor 26 sowie ein N₂-Sensor 27. Die von den Gassensoren 26 und 27 ermittelten Konzentrationswerte werden einem Klimakammerregler 28 zugeführt. Ein Luftfeuchtigkeitssensor 29 detektiert ständig die Luftfeuchtigkeit im Inneren der Klimakammer 21 bzw. im Inneren des Gehäuses 23. Ferner misst ein Temperatursensor 30 ständig die Temperatur. Auch der Feuchtigkeitssensor 29 sowie der Temperatursensor 30 übermitteln ihre Werte an den Klimakammerregler 28. Ein weiterer Temperatursensor 31 misst ständig die Temperatur im Inneren des Gehäuses 23. Eine so genannte Laminarflowheizung 32 stellt eine Temperatur im Gehäuse, die vorzugsweise der Temperatur in der Klimakammer entspricht, ein. Dadurch werden Kondensationsprozesse im Bereich der Klimakammer verhindert. Der Klimakammerregler 28 regelt über einen Befeuchter 33 die Luftfeuchtigkeit im Inneren der Klimakammer 21. Zwischen dem Befeuchter 33 und der Klimakammer 21 ist ein Filterelement 34 zwischengeschaltet. Ferner kann Frischluft 35 ins Innere des Gehäuses 23 bzw. der Klimakammer 21 eingebracht werden. Über den Klimakammerregler 28 werden über Gasregler die Gaszuströme aus den Gasflaschen 20 gesteuert. Dabei werden bestimmte Gasmengen in eine Mischkammer 36 geleitet. Über eine Gasumlaufpumpe 37, welche ebenfalls über den Klimakammerregler 28 geregelt wird, wird das gewünschte Gasgemisch in die Klimakammer 21 geleitet. Das gewünschte Gasgemisch wird durch eine Gasgemisch-Leitungsheizung 38 auf die gewünschte Temperatur gebracht.
Es versteht sich, dass eine erfindungsgemäße Vorrichtung auch anders ausgestaltet sein kann, als dies in den Figuren dargestellt ist. So kann die Aufnahmevorrichtung zur Aufnahme der MT-Platten auch aus übereinander angeordneten, unabhängig von einander drehbaren. Drehtellern aufgebaut sein. Auch können die einzelnen Aufnahmeelemente der Aufnahmevorrichtung in der Art von Fließbändern ausgebildet sein, durch die eine lineare Anordnung der MT-Platten und ein linearer Transport der selben erreicht wird.
Ferner ist es denkbar, dass die Klimakammer zumindest im Bereich der Beobachtungseinheit transparent ausgebildet ist und durch die Wand der Klimakammer hindurch mikroskopiert bzw. beobachtet werden kann, so dass die MT-Platten nicht aus der Klimakammer heraus bewegt werden müssen. Hierzu kann die Klimakammer auch eine Ausbuchtung aufweisen, in welche eine zu beobachtende MT-Platte zum Beobachten hineingebracht werden kann.
Unabhängig von der Ausführungsform sollen die Positionen der MT-Platten bei jeder Beobachtung definiert gleich sein, d. h. bei mehrmaligem Durchlauf sollte die Beobachtungsposition mit hoher Genauigkeit reproduzierbar angefahren werden. Die Genauigkeit des Systems wird von der Genauigkeit der Außenmaße der MT-Platten vorgegeben. Hierbei gibt es hinsichtlich der Ausrüstung der Platten verschiedene Varianten. Die MT-Platten können mit einer Folie am Boden bespannt und somit optisch definiert sein. Allerdings entstehen in Z-Richtung bestimmte Abweichungen. Eine andere Ausführungsform der MT-Platten besteht darin, dass die Platten mit einer Glasscheibe ausgerüstet und optisch definiert sind. Diese MT-Platten haben kaum Abweichungen in Z-Richtung.
Bei wiederholter Vorlage der MT-Platten an die Optik besteht die Notwendigkeit, die Zellpositionen in den MT-Platten mit den Maßabweichungen im System abzugleichen. Auch dies erfolgt durch das computergesteuerte Kontrollsystem.

Claims

Vorrichtung zur automatisierten, parallelisierten Kultivierung von Zellen in Zellkulturgefäßen mit einem Gehäuse (23), in welchem eine Beobachtungseinheit (3), aufweisend mindestens ein Mikroskop (7) und mindestens eine Kamera (6), eine Aufnahmevorrichtung (4) zur Aufnahme der Zellkulturgefäße sowie eine Fluidverteilungseinheit (5) zum automatischen Befüllen und/oder Entleeren der Zellkulturgefäße mit Fluiden angeordnet sind, wobei die klimatischen Verhältnisse in der Vorrichtung, nämlich mindestens die Gaszusammensetzung und die Temperatur zumindest im Bereich der Zellkulturgefäße regelbar sind, wobei im Gehäuse eine Klimakammer vorgesehen ist, in der eine gewünschte Temperatur und eine bestimmte Gaszusammensetzung automatisch einstellbar ist und in der die Aufnahmevorrichtung mit den Zellkulturgefäßen mindestens teilweise integriert ist, wobei der Vorrichtung getrennte Gasbehälter zugeordnet sind, welche unterschiedliche Gase enthalten, wobei die Gasströme aus den Gasflaschen steuerbar sind und wobei bestimmte Gasmengen in eine Mischkammer geleitet werden können, von wo aus das gewünschte Gasgemisch in die Klimakammer geleitet wird.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die unterschiedlichen Gase ausgewählt sind aus der Gruppe von CO₂, O₂ und N₂.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Zellkulturgefäße (2) vorzugsweise im Bereich der Beobachtungseinheit (3) und/oder im Bereich der Fluidverteilungseinheit (5), vorzugsweise automatisch durch einen Schlitten (11) oder Roboterarm aus der Klimakammer (21) oder in die Klimakammer transportierbar sind.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Beobachtungseinheit (3) und/oder die Fluidverteilungseinheit (5) außerhalb der Klimakammer (21) angeordnet sind.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufnahmevorrichtung (4) mindestens zwei, vorzugsweise übereinander angeordnete Aufnahmeeinheiten (10) und vorzugsweise Halteeinrichtungen (18) zum Halten der Zellkulturgefäße (2) aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop (7) inkl. Kamera (6) der Beobachtungseinheit (3) bewegbar ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein im Bereich der Beobachtungseinheit (3) befindliches Zellkulturgefäß (2a) bewegbar ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop (7) ein Durchlicht- und/oder Phasenkontrast- und/oder Fluoreszenzmikroskop ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluidverteilungseinheit (5) mehrere Behältnisse zum Lager unterschiedlicher Fluide, sowie eine Mikrodosiereinheit (12) zur gezielten, kontrollierten Zugabe der Fluide in die Zellkulturgefäße, insbesondere in die Wells (17) von MT-Platten (2) und vorzugsweise auch zum Entfernen der Fluide aus den Zellkulturgefäßen, insbesondere aus den Wells der MT-Platten aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturgefäße, insbesondere die MT-Platten (2) und vorzugsweise auch die Wells (17) der MT-Platten indiziert sind.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturgefäße (2) transparent ausgebildet sind.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch Sensoren (25, 26, 27, 29, 30, 31) zur Kontrolle sämtlicher relevanter Parameter, insbesondere Temperatur, CO₂-Konzentration, O₂-Konzentration, N₂-Konzentration, Luftfeuchtigkeit und/oder Zufuhr von Fluiden in die Zellkultivierungsgefäße, insbesondere in die Wells (17) der MT-Platten (2).
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein computergesteuertes Kontroll- und Steuersystem zur automatischen Kontrolle und Steuerung mindestens einer, vorzugsweise aller nachfolgend aufgeführter Parameter oder Arbeitsschritte: a) Temperatur, insbesondere in der Klimakammer (21); b) O₂-Anteil im Gas, insbesondere in der Klimakammer; c) CO₂-Anteil im Gas, insbesondere in der Klimakammer; d) N₂-Anteil im Gas, insbesondere in der Klimakammer; e) Befüllung und/oder Entleerung von ausgewählten Zellkulturgefäßen, insbesondere ausgewählter Wells (17) von ausgewählten MT-Platten (2) mit ausgewählten Mengen von ausgewählten Fluiden; f) mikroskopische Beobachtung und Auswertung von Zellkulturen in ausgewählten Zellkulturgefäßen, insbesondere in ausgewählten Wells von ausgewählten MT-Platten zu ausgewählten Zeiten mit ausgewählter Technik.
Verfahren zur automatisierten, parallelisierten Kultivierung von Zellen in Zellkulturgefäßen, die sich in einer Vorrichtung (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 13 befinden, mit folgenden Arbeitsschritten: a) Befüllen des Systems mit Zellkulturgefäßen (2); b) Befüllen des Systems mit Behältnissen (15), enthaltend zu verwendende Fluide; c) Bestücken des Systems mit Behältnissen (20), enthaltend zu verwendende Gase; d) Programmieren des Systems zur automatischen Einstellung mindestens einer der folgenden Parameter: – Temperatur – O₂-Anteil im Gas – CO₂-Anteil im Gas – N₂-Anteil im Gas; e) Programmieren des Systems zur automatischen Befüllung und/oder Entleerung von Zellkulturgefäßen; f) Programmieren des Systems zur mikroskopischen Beobachtung und Auswertung von Zellkulturen in ausgewählten Zellkulturgefäßen.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die zu verwendenden Gase O₂ _, CO₂ und N₂ sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass Arbeitsschritt e) das Programmieren des Systems zur automatischen Befüllung und/oder Entleerung von ausgewählten Wells (17) von ausgewählten MT-Platten (2) mit ausgewählten Mengen von ausgewählten Fluiden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt f) das Programmieren des Systems zur mikroskopischen Beobachtung und Auswertung von Zellkulturen in ausgewählten Wells (17) von ausgewählten MT-Platten (2) zu ausgewählten Zeiten mit ausgewählter Technik ist.