DE2633085A1

DE2633085A1 - Vorrichtung zum automatischen zuechten lebender gewebe oder zellen

Info

Publication number: DE2633085A1
Application number: DE19762633085
Authority: DE
Inventors: Nagahiro Gocho; Atsuo Goto; Shin-Ichiro Hattori; Masao Izawa; Shin-Ichi Kamachi; Yoshio Nakajima; Ichiro Sawamura; Toshio Shinohara; Shinroku Sogi; Makoto Yoshinaga
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1975-07-22
Filing date: 1976-07-22
Publication date: 1977-01-27
Also published as: DE2633085B2; DE2633085C3; US4090921A; JPS5212982A; JPS5724112B2

Description

PATENTANWÄLTE ZENZ & HELBER · D 43OO ESSEfJ ' AM RUHRSTEIN 1 · TE._.: (02 01) 412687 Seite 0 132

OLYMPUS OPTICAL CO., LTD. Hatagaya 2-43-2, Shibuya-ku, Tokyo-to, Japan

Vorrichtung zum automatischen Züchten lebender Gewebe oder Zellen

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum automatischen Züchten lebender Gewebe oder Zellen und insbesondere eine solche Vorrichtung, welche die erforderlichen Tätigkeiten zum Züchten einer Subkultur derartiger Gewebe oder Zellen unter vorgegebenen und gesteuerten Bedingungen automatisch und fortgesetzt durchzuführen vermag.

Die Züchtung von Geweben, insbesondere von Zellen eines lebenden Körpers oder lebenden Organismus hat gegenwärtig eine besondere Bedeutung auf vielen Gebieten, z.B. auf dem Gebiete der Medizin, der Biologie und angrenzenden Gebieten gefunden.

Aufgrund der technischen Schwierigkeit der Herstellung derartiger Gewebe oder Zellen des lebenden Körpers in Subkultur, insbesondere der Herstellung von menschlichen Geweben oder Zellen, konnten gezüchtete "Massen" derartiger Gewebe oder Zellen nicht gewonnen werden, bis die Technik der Kultivierung bzw. Züchtung solcher Gewebe oder Zellen in einem gasdichten Inkubator entwickelt worden ist. Die Gewebe- oder Zellzuchttechnik im gasdichten Inkubator ist eine Technik zum Züchten der lebenden Zellen oder Gewebe

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Z/bu.

in einer vorgegebenen Gasatraosphäre. Aufgrund dieser Züchttechnik wurde es möglich, selbst besondere Zellen des menschlichen Körpers, z.B. Leberzellen, Nervenzellen und Hypophyse-Zellen zu züchten.

Die Gewinnung einer Kultur (Subkultur) aus einer bestehenden Gewebe- oder Zellenkultur eines lebenden Körpers wurde in herkömmlicher Weise wie folgt durchgeführt. Die Zellen wurden zunächst mit einer Nährmittellösung soweit verdünnt, daß sie in der Nährmittellösung schwimmen. Eine vorgegebene Anzahl von Zellen wird sodann zusammen mit der Nährmittellösung in ein Gefäß, z.B» in eine Petrischale geschüttet. Das die vorgegebene Zellenanzahl und die Nährmittel lösung enthaltene Gefäß wird in einen Inkubator eingesetzt, in dessen Innenraum eine vorgegebene Gasatmosphäre eingestellt wird. Um den Vermehrungs- bzw. Vervielfachungszustand der Zellen im Gefäß prüfen zu können, wird das Gefäß in bestimmten Zeitabständen aus dern. Inkubator herausgenommen und der Vervielfachungszustand der Zellen mit Hilfe eines Mikroskops untersucht. Wenn bei einer derartigen Untersuchung festgestellt wird, daß die im Gefäß befindlichen Zellen sich ausreichend stark vermehrt haben, so daß das Gefäß mit vervielfachten Zellen gefüllt ist, scywird das Gefäß auf einen Reinigungstisch gestellt, um die vervielfachten Zellen in Stücke für die weitere Subkultur zu zerteilen. Aus den}, in der Reinigungsbank befindlichen Gefäß wird die NährmittelIosung mit Hilfe einer Pipette abgesaugt. Die vervielfachten Zellen, die im Gefäß zurückbleiben, werden sodann mit Hilfe einer Pufferlösung gespült und die Pufferlösung schließlich nach der Spülung aus dem Gefäß auspipetiert. Nach dem Reinigen der Zellen wird eine Enzymlösung, z.B. Trypsin in das Gefäß injiziert, um die vervielfachten Zellen, welche an der Innenoder Bodenfläche des Gefäßes haften, abzulösen und die Zellen in Stücke zu zerteilen. Danach werden die Zellen von der Enzymlösung mit Hilfe einer Zentrifuge getrennt und gesammelt. Mit anderen Worten, die Zellen und die Enzymlösung im Gefäß werden in ein Rohr der Zentrifuge eingeführt und voneinander getrennt, und sodann wird die im Rohr befindliche Enzymlösung, die über

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den Zellen schwimmt, aus dem Rohr abgesaugt. Bei einigen Zellenarten kann es überflüssig sein, eine Zentrifuge zum Trennen der Zellen von der Enzymlösung zu verwenden. In diesem Falle wird die Enzymlösung aus dem Gfaß abgesaugt, und zwar unmittelbar bevor die haftenden Zellen von der Enzymlösung befreit und die.Zellen dem nächsten Verarbeitungsschritt unterworfen werden.

Nach dem Absaugen der Enzymlösung aus dem Rohr der Zentrifuge wird eine frische Nährmittellösung in das Rohr eingeführt, so daß die Zellen im Rohr auf die vorgegebene Dichte verdünnt werden. Diese Nährmittellösung, in der die zu Stücken zerteilten Zellen schwimmen, wird in vorgegebener Menge in Leergefäße verteilt. Das eine vorgegebene Anzahl von Zellen und Nährmittellösung enthaltende Gefäß wird sodann wieder in den Inkubator eingesetzt und unter vorgegebener Atmosphäre gehalten, so daß wiederum Zellen im Behälter kultiviert bzw. gezüchtet werden. Die zuvor beschriebene herkömmliche Züchtungsmethode hat jedoch die folgenden Nachteile. Ein Nachteil besteht darin, daß der Zuchtbehälter bzw. das Zuchtgefäß häufiger aus dem,Inkubator herausgenommen und der Luftatmosphäre ausgesetzt werden muß, um den Vermehrungszustand der Gewebe oder Zellen unter Verwendung eines Mikroskops prüfen zu können. Die Umgebung der Kultur, d. h. die gasförmige Atmosphäre, die Temperatur und die Feuchtigkeit werden dadurch jedesmal beim Herausnehmen des Gefäßes aus den). Innenraum des Inkubators stark geändert, und diese Umgebungsänderung bewirkt auch feine Änderungen oder Variationen in den im Gefäß befindlichen Zellen oder Geweben. Darüberhinaus besteht die Gefahr, daß die im Gefäß befindlichen Zellen oder Gewebe durch in der Luft enthaltene Bakterien oder Keime verunreinigt werden.

Da überdies die erforderlichen Arbeiten zum Subkultivieren, d.h. Trennen der Zellen von der Enzymlösung, Sammeln der Zellen, Verdünnen der Zellen durch die Nährmittellösung, Einfüllen der Zellen und der Nährmittellösung in Leergefäße usw. durch er-

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fahrene Fachleute manuell durchgeführt werden müssen, und zwar entsprechend den mikroskop isehen Untersuchungsergebnissen, werden auch die Eigenschaften und Charakteristiken der gezüchteten Zellen direkt von den Handarbeiten der Techniker bzw. Fachleute beeinflußt. D.h., die Qualität und Eigenschaften der gezüchteten Gewebe oder Zellen hängen von der Erfahrung und Geschicklichkeit der durch Handarbeit beteiligten Techniker und Mediziner ab.

Es ist daher mit den herkömmlichen Züchtungsmethoden unmöglich, das Züchten von lebenden Zellen oder Geweben zu vereinheitlichen oder zu standardisieren.

Aufgrund der Tatsache, daß die Standardisierung unter Vereinheitlichung der ZeilZüchtung aus den obengenannten Gründen außerordentlich schwierig ist, werden von verschiedenen, an dem gleichen Thema arbeitenden Wissenschaftlern häufig genau entgegengesetzte Schlußfolgerungen gezogen. Der Wissenschaftler sollte vielmehr seine Arbeiten und Kräfte nicht auf die Züchtung der Zellen selbst, sondern auf seine ursprünglichen medizinischen oder biologischen Studien richten. Dieser Umstand ist eine allgemeine Schwierigkeit für Wissenschaftler, die in verschiedenen biologischen und medizinischen Bereichen tätig sind; es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zur Verfugung zu stellen, mit deren Hilfe die Züchtung bzw. Kultivierung lebender Gewebe oder Zellen automatisiert, vereinheitlicht und standardisiert werden kann, ohne daß eine Verunreinigung der gezüchteten Zellen oder Gewebe durch Bakterien oder Keime zu befürchten ist.

Im folgenden wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert. In der Zeichnung zeigen:

Fig. 1 schematisch ein Ausführungsbeispiel eines automatischen Züchtapparats nach der Erfindung;

Fig. 2 einen Teilschnitt entlang den Linien II-II der Fig. 1;

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Fig. 3 schematisch eine Anordnung mit einer Vorrichtung zur Durchführung der erforderlichen Arbeiten zum Herstellen einer Kultur aus einer bereits bestehenden Kultur, nämlich der Zelltrennung, der ZeilSammlung und der Transfusion der Zellen zusammen mit einer Nährmittellösung in ein leeres Gefäß;

Fig. 4 schematisch eine Schnittansicht durch eine Gefäß-

zuführvorrichtung zur Verwendung in dem in Fig. 1 dargestellten Apparat;

Fig. 5A schematisch eine Frontansicht einer Deckelabzugsvorrichtung zur Entfernung eines Deckels von einem in dem in Fig. 1 dargestellten Apparat befindlichen Züchtgefäß;

Fig. 5B eine Teildraufsicht auf eine Deckelabzugsplatte,

die zur Deckelabzugsvorrichtung in Fig. 5A gehört; und

Fig. 5C eine Seitenansicht der Deckelabzugsplatte gemäß Fig. 5B.

Im folgenden wird auf die Figuren 1 und 2 Bezug genommen. Dort bezeichnet das Bezugszeichen 10 einen Hauptkörper bzw. ein Hauptgehäuse des erfindungsgemäßen Apparats und das Bezugszeichen 11 einen Deckel für das Gehäuse 10. Mit 12 ist ein Züchtgefäß, z.B. eine Petrischale bezeichnet, welche einen Hauptteil 12a und einen Gefäßdeckel 12b umfaßt. Der Innenraura des Hauptgehäuses 10 ist vollständig luftdicht abgeschlossen und wird unter der zur Subkultivierung von Geweben oder Zellen eines lebenden Körpers erforderlichen Atmoshäre gehalten. In dem Hauptgehäuse 10 sind eine Betätigungsvorrichtung 20 zur Durchführung der erforderlichen Arbeiten bei der Zellzüchtung, z.B. des Trennens der vermehrten Zellen, des Sammelns der Zellen, des Verdünnens der Zellen und der Injektion der Zellen zusammen mit einer Nährmittellösung in die leeren Züchtgefäße 12, ferner eine Untersuchungsvorrichtung 40, eine Gefäß zufuhr -

-vorrichtung 60 und eine Gasatmosphären-Steuereinrichtung 70 angeordnet. Eine Steuereinrichtung 80 steuert die Funktionen der Betätigungsvorrichtung 20, der Untersuchungsvorrichtung 40, der Gefäß- zufuhr «- vorrichtung 60 und der Atmosphären-Steuereinrichtung 70. Die Steuereinrichtung 80 wird durch einen Ven-

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tilsteuerteil 81, einen Inspektions- und Steuerteil 82, einen Antriebssteuerteil 83 und einen Atmosphären-Steuerteil 84 gebildet und jeder dieser Steuerteile 81 bis 84 ist elektrisch mit der zugehörigen Vorrichtung im Hauptgehäuse 10 verbunden.

Die Betätigungsvorrichtung 20 wird durch einen scheibenförmigen Gefäßträger 21 und einen Betätigungsteil 22 gebildet, der die erforderlichen Tätigkeiten zum Züchten der Gewebe oder Zellen aus bereits bestehenden Geweben oder Zellen durchführt, Wie aus Fig. 2 zu erkennen ist, sind in dem scheibenförmigen Träger 21 mehrere kreisförmige Löcher 21a an solchen Stellen ausgebildet, an denen die Züchtgefäße anzubringen sind. Der Umfang des scheibenförmigen Gefäßträgers 21 ist als Zahnrad 21b ausgebildet. Ein beispielsweise mit einem Motor verbundenes Triebrad 23 ist im Gehäuse 10 derart gelagert, daß es mit dem Zahnrad 21b kämmt. Auf diese Weise kann der scheibenförmige Gefäßträger 21 mittels des Triebrades 23 in Umlauf versetzt werden, wenn letzteres durch eine geeignete Antriebsvorrichtung gedreht wird.

Der Betätigungsteil 22 ist in Fig. 3 genauer dargestellt. In Fig. 3 bezeichnet das Bezugszeichen 24 einen Entrahnebehälter, der über ein Ventil 24a, ein Rohrstück 24d, eine Pumpe 24b und ein Dreiwegeventil 24c mit einer Entimaftiedüse 25 verbunden ist. Ein die Nährmittellösung enthaltender Behälter 26 ist in .ähnlicher Weise über ein Ventil 26a, ein Dreiwegeventil 26b, eine Pumpe 26c, ein weiteres Dreiwegeventil 26d und ein Rohr 26e mit einer ersten Nährlösungsabgabedüse 27 verbunden. Ein Pufferlösungstrog 28 isftzein Rohr 28c, ein Ventil 28a und eine Pumpe 28b mit einer Pufferlosungsabgabedüse 29 verbunden. Ein Enzyralösungsbehälter 30 ist über ein Rohr 30c, ein Ventil 30a und eine Pumpe 30b mit einer Enzymlösungsabgabedüse 31 verbunden. Eine Bewegungs- bzw. Verwirbelungsdüse 32 ist über ein Rohr 32c, eine Bewegungsvorrichtung 33, eine Pumpe 32a und ein Ventil 32b mit einer ZeIl-S chwimmlösungs-Bntnctnedüse 34 verbunden. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist das Rohr 32c ein elastischer Schlauch, und die Bewegungsvorrichtung 33 kann als

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hin- und hergehende Stange ausgebildet sein, an deren einem Ende eine gegenüber einem stationärem Bauteil bewegliche Druckplatte angebracht ist, mit deren Hilfe der elastische Schlauch oder das elastische Rohr 32c zwischen dem stationären Bauteil und der Druckplatte plattgedrückt und geöffnet werden kann. Aufgrund der Elastizität des Schlauchs 32c kehrt dieser nach der Deformation wieder in die ursprüngliche Form zurück, wenn die Stange zurückgezogen wird. Das Bezugszeichen 35 bezeichnet eine zweite Entnahmedüse, die über ein Rohr 35a mit einem Dreiwegeventil 24c verbunden ist. Eine Saugdüse 36 ist über ein Rohr 36a mit einem Dreiwegeventil 26b verbunden. Eine zweite Nährlösungs-Abgabedüse 37 ist über ein Rohr 37a mit dem Dreiwegeventil 26d verbunden, so daß die zweite Nährlösungs-Abgabedüse 37 mit dem Nährlösungstrog 26 kommunizieren kann. Diese vier Düsen, d.h. die Zell-Schwimmlösungs-Entnahmedüse 34, die zweite Entnahmedüse 35, die Saugdüse 36 und die zweite Nährlösungs-Abgabedüse 37 sind beweglich über einer Zentrifuge 38 angeordnet, welche zum Trennen und Sammeln der Gewebe oder Zellen dient. Um eine Schwingungsübertragung von der Zentrifuge 38 auf die verschiedenen Teile des Apparats zu vermeiden, ist ein geeigneter Puffermechanismus, z. B. eine in der Zeichnung nicht dargestellte Pufferfeder zur Absorption derartiger Schwingungen zwischen dem Hauptgehäuse 10 und der Zentrifuge 38 angeordnet.

Die Betätigungsvorrichtung 20 führt mit dem Betätigungsteil 22 die erforderlichen Arbeiten für die Subkultur bzw. Weiterzüchtung, z.B. Trennen der Zellen, Sammeln der Zellen, Verdünnen der Zellen und Übertragen ..der Zellen zusammen mit der Nährlösung in leere Züchtgefäße in der zuvor beschriebenen Weise aus.

Die zu züchtenden Gewebe oder Zellen werden zusammen mit der Nährlösung in ein Züchtgefäß 12 gegeben. Das Züchtgefäß 12 wird sodann auf den Gefäßträger an einer mit einem kreisförmigen Loch 21a versehenen Stelle aufgesetzt. Das Hauptgehäuse

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wird durch Schließen des Deckels 11 hermetisch abgeschlossen und sodann auf die vorgegebene Gasatmosphäre gebracht, bei der sich die Gewebe oder Zellen im Gefäß 12 graduell mit der Zeit vervielfachen. Nach gewissen Zeitabschnitten und nach Feststellung durch ein Mikroskop, daß die Zellenvermehrung den vorgegebenen Wert erreicht hat, wird die erste Abgabedüse 25 nach unten in das die vermehrten Gewebe oder Zellen mit der Nährlösung enthaltende Gefäß 12 bewegt und die Nährlösung aus dem Gefäß 12 durch Öffnen des Ventils 24a und Betätigung der Pumpe 24b in den Entnahmebehalter 24 überführt. Nachdem die Nährlösung vollständig aus dem Gefäß 12 entfernt worden ist, wird die erste Ertnahmedüse 25 aus dem Gefäß 12 nach oben herausgehoben, das Ventil 24a geschlossen und die Pumpe 24b abgestellt. Danach wird die Pufferlösungs-Abgabedüse 29 nach unten in das Gefäß 12 bewegt und die im Pufferlösungstrog 28 enthaltene Pufferlösung durch die Düse 29 in das Gefäß mit der vorgegebenen Menge durch Öffnen des Ventils 28a und Betätigung der Pumpe 28b übertragen, so daß die Oberfläche der vermehrten Zellen gespült und gereinigt werden. Nach diesem Spülvorgang wird die Pufferlösungs-Abgabedüse 29 nach oben aus dem Behälter 12 bewegt, das Ventil 28a geschlossen und die Pumpe 28b abgeschaltet. Die zum Spülen oder Reinigen der gezüchteten Zellen verwendete Pufferlösung wird sodann aus dem Gefäß 12 in den Entnahmebehalter 24 durch Betätigung des Ventils 24a, der Pumpe 24b und des ersten Entnahmestutzens 25 in der zuvor bereits beschriebenen Weise entnommen. Nach der Entnahme der Pufferlösung wird die Enzymlösungs-Abgabedüse 31 nach unten in das Gefäß 12 bewegt und die Enzymlösung aus dem EnzymlösungsVorratstrog 30 durch die Düse 31 unter Öffnen des Ventils 30a und Beütigung der Pumpe 30b übertragen. Die Enzymlösungs-Abgabedüse 31 wird sodann aus dem Gefäß 12 gehoben, nachdem eine vorgegebene Enzymlosungsraenge in das Gefäß 12 abgegeben worden ist. Nach dem Herausziehen der Enzymlösungs-Abgabedüse 31 wird die Bewegungs- bzw. Verwirbelungsdüse 32 in das Gefäß abgesenkt und die Pumpe 32a bei geschlossenem Ventil 32b betätigt, so daß die aus dem Gefäß 12 abgesaugte Enzymlösung das elastische Rohr 32c zwischen der Düse 32 und

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dem Ventil 32b füllt. Wenn das elastische Rohr bzw. der elastische Schlauch 32c zwischen der Düse 32 und dem Ventil 32b mit Enzymlösung gefüllt ist, wird die Pumpe 32a stillgesetzt und gleichzeitig die Bewegungsvorrichtung 33 betätigt. Durch die Vorwärtsbewegung der kolbenartigen Stange der Bewegungsvorrichtung wird die im elastischen Schlauch 32c befindliche Enzymlösung stoßartig in das Gefäß 12 zurückgedrückt und sodann bei ^Rückkehr der zur Bewegungsvorrichtung gehörigen Kolbenstange wieder in den elastischen Schlauch 32c eingesaugt. Diese Operation wird bei Betrieb der Bewegungsvorrichtung 33 fortgesetzt, wobei die Enzymlösung im Gefäß 12 bewegt bzw. gerührt und verwirbelt wird. Die Bewegungsvorrichtung wird angehalten, wenn die Zellen in Stücke geteilt worden sind, und die die unterteilten Zellen enthaltende Enzymlösung als Zellschwimralösung durch die Bewegungsdüse 32 in den elastischen Schlauch 32c eingesaugt und durch die Zellenschwimmlösungs-Entladungsdüse 34 in die Zentrifuge durch Öffnen des Ventils 32b und Betätigung der Pumpe 32a überführt wird. Durch Betätigung der Zentrifuge 38 werdentiie Zellen von der Enzymlösung getrennt und im unteren Teil des Zentrifugen^jrohrs gesammelt. Die Enzymlösung aus der die Zellen extrahiert werden und die über den Zellen im Zentrifugenrohr schwimmt, wird aus dem.Zentrifugenrohr durch Öffnen des Ventils 24a und Betätigung der Pumpe 24b sowie durch Umschalten des Dreiwegeventils 24c unter Verbindung des Rohrs 35a und der zweiten Entnahmedüse 35 mit dem ^Rohr 24b in den Entnahmebehälter 24 überführt. Nach der Entnahme der Enzymlösung aus dem Zentrifugenrohr wird das Ventil 24a geschlossen und die Pumpe 24b stillgesetzt. Danach wird frische Nährlösung aus dem Nährlösungsbehälter 26 durch die zweite Nährlösungsabgabedüse 37 unter Betätigung der Pumpe 26c nach Öffnen des Ventils 26a überführt, wobei das Dreiwegeventil 26d derart umgeschaltet ist, daß der Nährlösungsbehälter 26 mit der zweiten Nährlösungs-Abgabedüse 37 kommuniziert. Daher werden die Zellen mit der Nährlösung bereits im Zentrifugenrohr gemischt. Die Zellen und die Nährlösung werden sodann zur weteren Zellenzüchtung in bestimmten Mengen aus dem Zentrifugenrohr in mehrere leere Züchtbehälter eingesetzt, die

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nacheinander unter das erste Nährlösungs-Abgabeventil 27 geschoben werden. Dabei wird das Dreiwegeventil 26b umgeschaltet, so daß die Saugdüse bzw. der Saugstutzen 36 mit der ersten Nährlösungs-Abgabedüse 27 kommuniziert, und die Pumpe 26c betätigt. Die verschiedenen Funktionen der Betätigungsvorrichtung 20 und des Betätigungsteils 22 werden unter der vollständigen Steuerung durch die Steuervorrichtung 80 durchgeführt. D.h., das Öffnen und Schließen der Ventile und das Umschalten der Dreiwegeventile werden vom Ventilsteuerteil 81 und die Betätigung jedes Teils der Betätigungsvorrichtung 20 und des Betätigungsteils 22, z.B. die Drehung des scheibenförmigen Gefäßträgers, durch den Antriebssteuerteil 83 der Steuervorrichtung 80 gesteuert.

Wie aus der vorstehenden Beschreibung ersichtlich ist, muß die Düse in das Zuchtgefäß 12 eingesetzt werden, wenn bdspielsweise die Pufferlösung aus dem Pufferlösungsbehalter 28 in das Gefäß überführt werden soll oder wenn die gebrauchte Nährlösung und die Pufferlösung aus dem Gefäß 12 in den zugehörigen Entnahmebehälter 24 abgezogen werden soll. Andererseits werden die zugehörigen Düsen bzw. Stutzen vorzugsweise in ihren Ruhezeiten über dem Gefäß 12 gehalten, damit das Gefäß aus der Stellung unter den Düsen bzw. Stutzen herausbewegt werden kann und auch der Behälterdeckel während der Züchtung selbst aufgesetzt werden kann. Zu diesem Zweck ist jede Düse bzw. jeder Stutzen mit einem geeigneten Antrieb, z.B. aus einem Zahnstangengetriebe oder einem Nockengetriebe ausgestattet, mit dessen Hilfe nur die jeweils betätigte Düse unabhängig aufwärts- und abwärtsbewegt werden kann. Es ist jedoch in der Regel nicht ratsam, die Düsen mit einem gemeinsamen Axialantrieb auszustatten, durch den alle Düsen gleichzeitig gesenkt oder gehoben werden können. In diesem Falle könnten nämlich Rückstände an den Außenenden der Düsen mit den Zellen in Berührung kommen. Im Prinzip die gleichen Überlegungen gelten für die oberhalb der Zentrifuge 38 angeordneten Düsen.

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Vorzugsweise werden die Düsen nach jedem Betätigungszyklus
gereinigt, um eine Verschmutzung und die Mischung der Lösungen zu vermeiden.

Selbstverständlich können auch gegenüber der Ausführungsform nach Fig. 3 abgewandelte Bewegungs- bzw. Verwirbelungsvorrichtungen eingesetzt werden.

Im folgenden wird auf die Untersuchungseinrichtung 40 Bezug
genommen. In Fig. 1 bezeichnen 41 eine als Lichtquelle dienende Lampe, 42 eine Sammellinse, 43 eine Helligkeitssteuereinrichtung, 44 einen reflektierenden Spiegel, 45 einen Kondensor,
46 ein Objektiv, 47 einen anderen reflektierenden Spiegel, 48
eine Relaislinse, 49 einen Halbspiegel (teildurchlässigen
Spiegel), 50 eine Augenlinse und 51 eine Untersuchungseinrichtung. In der Wand des Hauptgehäuses 10 sind Glasplatten 52 und 53 angeordnet. Der Kondensor 45 und die Objektivlinse 46 der
Untersuchungseinrichtung 40 sind jeweils über und unter dem
scheibenförmigen Gefäßträger 21 derart angeordnet, daß ihre
gemeinsame optische Achse durch jedes kreisförmige Loch 21a
durchtreten kann, wenn der Gefäßträger bzw. -halter 21 gedreht wird. Wenn die Zellen daher im Züchtgefäß 12 beobachtet werden sollen, so wird der Gefäßträger 21 in eine solche Stellung gedreht, in der die optische Achse der Untersuchungseinrichtung
40 den entsprechenden Züchtbehälter 12 durchdringt, worauf sowohl eine Beobachtung durch die Augenlinse mit dem normalen
Auge als auch die Untersuchung durch die Inspektionsvorrichtung 51 erfolgen kann. Obwohl die Beieuchtungslampe 41 und die Sammellinse 42 außerhalb des Hauptgehäuses 10 im Ausführungsbeispiel gemäß den Figuren 1 und 2 angeordnet sind, können sie in abgewandelter Ausführungsform auch im Hauptgehäuse 10 angeordnet werden. Die Gefäß-Zuführvorrichtung 60 ist entsprechend Fig. 4 ausgebildet. Sie weist eine Gefäß-Speicherkanuaer 61 mit einem Kammerdeckel 62 und einem Gefäß-Zuführteil 63 auf, welch letzteres mit einer Zahnstange 64 versehen ist. Der Zuführteil 63 ist in der Kammer61 so gelagert, daß er horizontale Bewegungen

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ausführen kann. Mit der Zahnstange 64 steht ein Zahnrad 65 in Eingriff, das ebenfalls zum Gefäß-Zuführteil 63 gehört. Das Zahnrad 65 ist mit einem in der Zeichnung nicht dargestellten geeigneten motorischen Antrieb versehen. Die Gefäß-Speicherkammer 61 ist ebenfalls luftdicht abgeschlossen und steht mit dem Innenraum des Hauptgehäuses durch ein in der Wand des Hauptgehäuses 10 ausgebildetes Fenster 10a in Verbindung. Die in der Gefäß-Speicherkammer 61 gestapelten Züchtbehälter werden einzeln aus der Kammer 61 dem Gefäßträger mit Hilfe des Zuführteils 63 zugeführt. Der Behälter-Zufuhr teil 63 wird dabei von dem Zahnrad 65 nach rechts geschoben, wodurch der unterste Behälter aus der Kammer 61 durch das Fenster 10a in den Innenraum des Hauptgehäuses 10 überführt wird. Bei diesem Ausführungsbeispiel (Figuren 1 bis 3) sind langgestreckte, von der Peripherie des scheibenförmigen Gefäßträgers 21 ausgehende radiale Schlitze 21c vorgesehen, welche die zugehörigen kreisförmigen Löcher 21a durchlaufen. Es sind ferner geneigte Flächen 2ld zwischen den entsprechenden kreisförmigen Löchern 21a und der Peripherie des scheibenförmigen Gefäßträgers 21 vorgesehen. Die einzeln durch das Fenster 10a in das Hauptgehäuse 10 eingeschobenen Züchtbehälter 12 werden daher von dem Gefäß-Zuführteil 63 über die geneigten Flächen 21d des scheibenförmigen Trägers 21 eingeführt, wenn der Gefäßträger 21 jeweils mit einem der Schlitze 21c mit dem Gefäß-Zuführteil 63 in Ausrichtung kommt. In diesem Falle greift das Gefäß-Zuführteil 63 in den radialen Schlitz 21c ein. Wenn daher der Zuführschieber 63 durch umgekehrte Drehung des Zahnrads 65 in seine in Fig. 4 dargestellte Ursprungslage zurückgestellt wird, bleibt das Gefäß 12 an einer vorgegebenen Stelle auf dem Gefäßträger 21 oberhalb des kreisförmigen Lochs 21a abgesetzt. Wenn der Gefäß-Zuführschieber 63 in seine Ausgangslage zurückgekehrt ist, wird auf ihn das jetzt unterste Gefäß 12 abgesetzt. Auf diese Weise werden die gestapelten Züchtgefäße 12 nacheinander durch Wiederholung der zuvor beschriebenen Operation auf den Gefäßträger 21 transportiert bzw. überführt.

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Um die Zellen und Nährlösung in den mit Hilfe des Zuführschiebers 63 auf den Gefäßtrager 21 aufgesetzten Züchtbehälter 12 zu injizieren, muß zunächst der Behälterdeckel 12b des Züchtbehälters 12 abgenommen werden. Zu diesem Zweck ist eine Deckelabzugsvorrichtung in dem Hauptgehäuse vorgesehen. Die Deckelabzugsvorrichtung ist in Fig. 5A gezeigt und weist einen Deckelabzugsschieber 66 auf. Wie aus den Figuren 5B
und 5C zu erkennen ist, ist das eine Ende des Deckelabzugsschiebers 66 gabelförmig ausgebildet und mit einem gestuften Abschnitt 66b an der Innenseite jeder Gabelzinke versehen.
Der Abstand t^ zwischen den beiden gestuften Abschnitten der Zinken ist etwa gleich dem Außendurchmesser des Gefäßdeckels 12b des Züchtgefäßes 12, und der Abstand t_ zwischen den beiden Innenflächen der Zinken ist angenähert gleich dem Außendurchmesser des Schraubteils 12a des Gefäßes 12. Wenn der Deckelabzugsschieber 66 horizontal auf das Züchtgefäß 12 zubewegt
wird und die Schultern der gestuften Abschnitte 66b die Unterseite untergreifen, kann der Züchtbehälter 12 zwischen die
beiden Zinken bzw. Schenkel des dort gabelförmigen Deckelabzugsschiebers 66 gebracht werden. Wenn in diesem Zustand das Deckelabzugsbauteil 66 angehoben wird, wird der Gefäßdeckel
12b vom Gefäßhauptteil 12a abgehoben. Wie in Fig. 5A gezeigt ist, ist das Deckelabzugsbauteil 66 an einer Halterung 67 so gelagert, daß es sich bezüglich der Halterung 67 nur horizontal verschieben läßt. Ein Zahnrad 69a, das mit einem geeigneten, in der Zeichnung nicht dargestellten Antrieb verbunden ist,
ist in der Halterung 67 so gelagert, daß es mit einer an der Unterseite des Deckelabzugsbauteils 66 ausgebildeten Zahnstange 66a kämmt. Die Halterung 67 weist außerdem eine vertikale Zahnstange 67a auf und ist selbst am Hauptgehäuse durch geeignete Träger derart abgestützt, daß es nur in Vertikalrichtung bewegt werden kann. Ein anderes Trägerbauteil 68 ist unter der ersten Halterung 67 angeordnet. Ein weiteres Zahnrad 69b, das mit einem geeignetem Antrieb (nicht dargestellt) verbunden ist, ist im Stützbauteil 68 derart gelagert, daß es mit der vertikalen Zahnstange 67a an der ersten Halterung 67 in formschlüssigen Eingriff tritt. Auf diese Weise läßt sich das

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Deckelabzugsbauteil 66 durch Drehung des Zahnrads 69a horizontal und durch Drehung des Zahnrads 69b vertikal bewegen.

Die in Fig. 5A dargestellte Deckelabzugsvorrichtung ist, wie in den Figuren 1 und 2 zu erkennen ist, im Hauptgehäuse 10 gegenüber der Gefäß-Zuführvorrichtung 60 angeordnet. Beispielsweise beim Einfüllen der Zellen und der Nährlösung in das leere Zuchtgefäß 12 wird letzteres zunächst in eine vorgegebene Stellung auf dem Gefäßträger 21 durch Betätigung des Zuführschiebers 63 gebracht. In diesem Falle muß sich das Deckelabzugsbauteil 66 zunächst in seiner untersten Stellung befinden, in der die Schultern der gestuften Abschnitte 66b tiefer als die Ebene der Unterseite des Deckels 12b liegt. Sodann wird das Deckelabzugsbauteil 66 durch Drehung des Zahnrads 69a soweit in Fig. 1 horizontal nach links geschoben, bis das Zuchtgefäß zwischen den Zinken des gabelförmigen Deckelabzugsbauteils 66 liegt. Sodann wird das Zahnrad 69b gedreht, wodurch die Halterung 67 zusammen mit dem Deckelabzugsbauteil 66 aufwärts verschoben wird. Aufgrund dieser Aufwärtsbewegung des Deckelabzugsbauteils 66 wird der Gefäßdeckel 12b unter Auflage auf den Schultern des Deckelabzugsbauteils 66 angehoben und von dem Hauptgefäß 12a abgehoben. Danach wird das Deckelabzugsbauteil wieder durch Drehungsumkehr des Zahnrads 69a in die erste Lage gebracht, damit die erste Nährlösungs-Abgabedüse 27 in · den Hauptteil 12a des Gefäßes 12 eingeführt werden kann. Der abgezogene Gefäßdeckel 12b kann auf das zugehörige Gefäß 12a durch umgekehrte Bewegung des Deckelabzugsbauteils wieder aufgesetzt werden. Diese Operationen der Gefäß-Zuführvorrichtung 60 und der Deckelabzugsvorrichtung gemäß Fig. 5A sowie die Drehbewegung des Gefäßträgers 21 stehen unter der Steuerung des Antriebssteuerteils 83.

Die in Fig. 1 gezeigte Gasatmosphären-Steuereinrichtung 70 weist einen CO.-Detektor 71a, eine CO^-Bestimmungs- und Steuerungseinrichtung 71b, einen CO,,-Gasbehälter 71c, einen Temperaturdetektor 72a und ein Temperaturstellglied 72b auf. Mit diesen Teilen der Gasatmosphären-Steuereinrichtung 70 kann die

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Atmosphäre im Hauptgehäuse 10 unter Steuerung des Atmosphären-Steuerteil, s 84 der Gesamtsteuereinrichtung 80 auf den für die Züchtung besten Bedingungen gehalten werden. Obwohl nur die Temperatur- und die COp-Steuereinrichtungen in Fig. 1 dargestellt sind, ist natürlich klar, daß auch Feuchtigkeits-, Np- und Op-Steuereinrichtungen in einem vollständigen Züchtapparat vorhanden sind, die dann mit detn Atmosphären-Steuerteil 84 verbunden sind, da der Innenraum des Hauptgehäuses 10 ständig unter konstanter Temperatur, Feuchtigkeit und Gasatmosphäre gehalten werden muß, wobei COp, Np und Op in geeignetem Verhältnis gemischt sind.

Es ist auch möglich, die Steuereinrichtung 80 als reine Folgesteuereinrichtung auszubilden und anzuordnen. Wenn die Gesamtsteuereinrichtung 80 jedoch über eine geeignete Schnittstellenelektronik mit einem Computer verbunden wird, können alle Operationen des Züchtapparats entsprechend einem vorgegebenen Programm gesteuert werden.

Der beschriebene Züchtapparat arbeitet in der folgenden Weise:

Zunächst werden die Gewebe oder Zellen zur Weiterzucht bzw. Vermehrung zusammen mit einer Nährlösung in ein leeres Züchtgefäß 12 eingeführt. Das die Gewebe oder Zellen sowie die Nährlösung enthaltende Züchtgefäß 12 wird sodann in die vorgegebene Lage auf dem Gefäßträger 21 im Hauptgehäuse 10 gebracht, wobei der Innenraum des Hauptgehäuses für gewisse Zeitabschnitte bis zur ausreichenden Vermehrung der Gewebe oder Zellen unter der gewünschten Atmosphäre gehalten wird. Wenn der Vervielfachungsbzw. Vermehrungszustand während der Züchtung untersucht oder beobachtet werden soll, so wird der scheibenförmige Gefäßträger soweit gedreht, bis das Gefäß 12 zwischen dem Kondensor 45 und der Objektivlinse 46 der Untersuchungseinrichtung 40 ausgerichtet ist. Die Untersuchung oder Beobachtung der Gewebe oder Zellen kann mit bloßem Auge oder mit Hilfe der Untersuchungseinrichtung 51 erfolgen. Wenn durch eine derartige Untersuchung oder Beobachtung festgestellt wird, daß das Gefäß 12 mit vermehrten

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Zellen angefüllt ist, so wird der scheibenförmige Gefäßträger 21 solange gedreht, bis das Gefäß in die Stellung zwischen der Gefäß-Speicherkammer 61 und der Deckelabzugsvorrichtung mit dem Deckelabzugsbauteil 66 kommt. Der Deckel 12b des Gefäßes 12 wird sodann durch Betätigung der Deckelabzugsvorrichtung entfernt. Danach werden die erforderlichen Arbeiten zur Herstellung der Subkultur, z.B. Entnahme der Nährlösung, Spülen der Zellen mit der Pufferlösung, Trennen und Befreien der Zellen vom Gefäß 12 und Trennen der Zellen von der Enzymlösung in der Zentrifuge durchgeführt, und zwar in der anhand Fig. 3 beschriebenen Weise. Nach der Beendigung dieser Tätigkeiten wird die Gefäß-Trägerscheibe 21 soweit gedreht, daß das nachfolgende runde Loch 21a in die Lage im Bereich zwischen der Gefäß-Speicherkammer 61 und der Deckelabzugsvorrichtung gelangt, in der der zugehörige Schlitz 21c mit dem Gefäß-Zuführschieber 63 ausgerichtet ist. Sodann wird ein leeres Züchtgefäß 12 auf die entsprechende Ausnehmung in der Gefäß-Trägerscheibe 21 unter Betätigung des Gefäß-ZufuhrSchiebers 63 aufgesetzt. Der Gefäßdeckel 12b des leeren Gefäßes 12 wird sodann mit Hilfe der Deckelabzugsvorrichtung bzw. des Deckelabzugsbauteils 66 entfernt, und die getrennten Zellen sowie frische Nährlösung werden in das leere Gefäß 12 zur Herstellung einer weiteren Subkultur von Zellen eingeführt. Auf diese Weise werden mehrere Züchtgefäße nacheinander aus der Gefäß-Speicherkammer 61 entfernt, auf die Gefäß-Trägerscheibe 21 aufgesetzt, und schließlich werden die Zellen und die zugehörige Nährlösung in jedes der nacheinander zugeführten Gefäße eingefüllt. Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Apparats gezüchteten und vermehrten Zellen werden geteilt und in neue Leergefäße zusammen mit frischer Nährlösung zur Herstellung einer Subkultur dieser Zellen eingeführt.

Als Untersuchungsmethode zur Feststellung des Vermehrungszustandes der Zellen im Gefäß 12 mit Hilfe der Untersuchungseinrichtung 51 sind verschiedene Methoden geeignet, so z.B.

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ein Spektralmuster, Untersuchung mit einem Ionendetektor sowie Untersuchungen durch Änderung des elektrischen Widerstandes.

Die Gefäß-Zuführvorrichtung kann dann entfallen, wenn eine Vielzahl leerer Züchtgefäße 12 bei Beginn auf den Gefäßträger 21 aufgesetzt wird.

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Claims

PATENTANWÄLTE ZENZ & HELBER · D 4300 ESSEN 1 ■ AM RUHRSTEiN '. ■ TEL.: (O2Oi) 4126 Seite _ 18 - 0 132

Ansprüche

(l) Vorrichtung zum automatischen Züchten lebender Gewebe oder Zellen, die zusammen mit einer Nährlösung in einem Züchtgefäß eingesetzt sind, gekennzeichnet durch , ein gasdicht abschließbares Gehäuse (10), das das Züchtgefäß (12) mit den Geweben oder Zellen und der Nährlösung sowie leere Gefäße (12) aufnimmt,

eine Untersuchungsvorrichtung (40) zur Untersuchung bzw. Beobachtung des Vermehrungszustandes der Gewebe oder Zellen im Züchtgefäß (12),

eine zur Herstellung der Subkultur aus bestehenden Geweben oder Zellen die Zellen trennende und die getrennten Zelloder Gewebestücke jeweils zusammen mit einer frischen Nährlösung in leere Züchtgefäße (12) einfüllende Betätigungsvorrichtung (20), die im Innenraum des Gehäuses (10) angeordnet ist;

eine Vorrichtung (70) zur Konstanterhaltung einer Atmosphäre im Hauptgehäuse (10); und

eine Steuervorrichtung zur Steuerung der Untersuchungsvorrichtung, der Betätigungsvorrichtung und der Konstanthaltungsvorrichtung.

2·Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Innenraura des Hauptgehäuses (10) eine Gefäß-Trägerscheibe (21) drehbar angeordnet ist, die zur Aufnahme bzw. Halterung mehrerer Züchtgefäße (12) geeignet ausgebildet ist.

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Z/bu.

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