DE102019211243A1

DE102019211243A1 - Bereitstellung von Zellkulturen

Info

Publication number: DE102019211243A1
Application number: DE102019211243.9A
Authority: DE
Inventors: Konrad Mueller-Auffermann
Original assignee: Krones AG
Current assignee: Krones AG
Priority date: 2019-07-29
Filing date: 2019-07-29
Publication date: 2021-02-04
Also published as: WO2021018480A1; EP4004182A1; CN114174488A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bereitstellen einer Zellkultur mit den Schritten: Füllen eines Substrats in einen Propagator, Inokulieren des Substrats in dem Propagator mit einer ersten Zellkultur, Propagieren der Zellkultur in dem Propagator, um in dem Propagator eine gewünschte Menge einer zweiten Zellkultur zu erhalten, wobei die zweite Zellkultur einen sedimentierten Anteil und einen schwebenden Anteil aufweist und wahlweises Abziehen eines Teils des sedimentierten Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur aus einem unteren Bereich des Propagators und/oder eines Teils des schwebenden Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur aus einem oberen Bereich des Propagators.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung von Zellkulturen einschließlich der Propagation der Zellkulturen in einem Propagator und dem Abziehen der propagierten Zellkulturen aus dem Propagator.
Stand der Technik
Zellkulturen, wie beispielsweise Hefe, werden im Allgemeinen in Propagatoren, also Bioreaktoren in Form von Tanks, vermehrt (propagiert). Üblicherweise sind die Propagatoren mit Umwälzvorrichtungen, wie Rührwerken, oder Umpumpleitungen ausgestattet, um das inokulierte Substrat zu durchmischen. Außerdem sind die Propagatoren typischerweise mit Temperiereinrichtungen ausgestattet, um das Substrat zu sterilisieren und/oder eine gewünschte Temperatur während der Propagation einzustellen. Die Temperiereinrichtungen können Heiz- und/oder Kühlflächen sowie externe Wärmetauscher umfassen.
Ein Propagationsverfahren des Stands der Technik ist in 1 veranschaulicht. Ein gereinigter Propagator 1 wird über einen Substrateinlass 2 mit einem Substrat, im in der 1A gezeigten Beispiel von unten, befüllt und mit einer zuvor im Labor angezüchteten reinen Zellkultur, etwa einer zum Bierbrauen Verwendung findenden Hefekultur, beispielsweise mithilfe eines sogenannten Carlsberg-Kolbens 3, inokuliert. Mithilfe einer Umwälzpumpe 4 wird die Reinkultur mit dem Substrat durchmischt, und es kann wahlweise über einen Gaseinlass 5 ein Gas, wie etwa Luft, zur Zellvermehrung eingeleitet werden. Üblicherweise beträgt die Verdünnung der Zellen mit Substrat in diesem Stadium 1:10 bis 1:100. Sobald die gewünschte Konzentration von Zellen im Propagator 1 erreicht worden ist (bei Hefen etwa 80 bis 120 Millionen Zellen pro ml), erfolgt eine erneute Substratzugabe (siehe 1B) zu einer erneuten Verdünnung von üblicherweise 1:10 bis 1:100, um eine Produktinhibition (durch Alkohol und CO₂) zu verhindern und weiteres Wachstum zu bewirken. Die Gaszufuhr und Umwälzung können dabei konstant aufrechterhalten oder intervallweise eingesetzt werden. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis die gewünschte Gesamtmenge an Zellen hergestellt worden ist.
Da die verwendeten Rührwerke beziehungsweise Umwälzvorrichtungen spezifisch auf die in den Propagatoren aufgenommene Massen ausgelegt werden müssen, wird typischerweise ein kleinerer Vorpropagator 1 und ein größerer Hauptpropagator 6 verwendet, wobei die aus dem Vorpropagator erhaltene Menge in den Hauptpropagator 6 geleitet wird, in dem der oben beschriebene Vorgang in gleicher Weise ausgeführt wird (1C). Schließlich kann die so erhaltene Zellkultur (das sogenannte Propagat) von unten abgezogen und beispielsweise einem Fermenter zum Ausführen einer Fermentation zugeführt werden.
Die beschriebene herkömmliche mehrstufige Propagation in mehreren Propagatoren/Assimilatoren verschiedener Größe ist jedoch relative aufwendig. Vor allem erfolgt der Abzug der propagierten Zellkultur zur Weiterverwendung beispielsweise in einem Fermentationsprozess undifferenziert ohne jegliche Berücksichtigung der spezifischen Eigenschaften der verschiedenartigen Zellen der Zellkultur.
Das Sedimentationsverhalten und das Flokkulationsverhalten der Zellen variiert jedoch stark gemäß der Alters- und Größenverteilung der Zellkultur, deren genetischer Variabilität, Vitalität und Viabilität. Diese Verhalten sind aber für nachfolgende Prozesse, die die erhalten Zellkultur verwenden, wie etwa Fermentationsprozesse, von Bedeutung. So werden beispielsweise bei der Vergärung von Bierwürze je nach gewünschter Biersorte oder Technologie unterschiedliche Sedimentationsverhalten und Flokkulationsverhalten der eingesetzten Hefekulturen gefordert. Dieses findet in dem beschriebenen herkömmlichen Prozess zur Herstellung einer Zellkultur keine hinreichende Berücksichtigung.
Es liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, die Bereitstellung einer Zellkultur zu vereinfachen und hinsichtlich der Differenziertheit der erhaltenen und weiter zu verwendenden Zellkultur zu verbessern.
Beschreibung der Erfindung
Die oben genannte Aufgabe wird durch ein Verfahren zum Bereitstellen einer (Ziel-)Zellkultur gelöst. Dieses Verfahren umfasst die Schritte:

Füllen eines Substrats in einen Propagator (Tank); Inokulieren des Substrats in dem Propagator mit einer ersten Zellkultur (beispielsweise mit einer im Labor hergestellte Reinkultur; beispielsweise einer Hefe zur Bierherstellung);
Propagieren der ersten Zellkultur in dem Propagator, um in dem Propagator eine gewünschte Menge einer zweiten Zellkultur mit einer gewünschten Konzentration (von Zellen zu Substrat) zu erhalten, wobei die zweite Zellkultur einen sedimentierten Anteil und einen schwebenden Anteil (an Zellen) aufweist; und
wahlweises Abziehen zumindest eines Teils des sedimentierten Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur aus einem unteren Bereich des Propagators und/oder zumindest eines Teils des schwebenden Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur aus einem oberen Bereich des Propagators, wodurch die (Ziel-)Zellkultur (als fertig propagierte erste Zellkultur) bereitgestellt wird.

Hier und im Weiteren wird unter dem Begriff „Propagator“ auch ein Assimilator, sprich ein Tank zur Anzucht und Vermehrung von Zellkulturen umfasst. Die zweite Zellkultur stellt die n-te Generation der ersten Zellkultur dar, wobei n größer als zwei ist. Die durch das Verfahren erhaltene (Ziel-)Zellkultur steht zur weiteren Verwendung, etwa in einem Fermentationsprozess, bereit. Im Gegensatz zum Stand der Technik kann diese zur weiteren Verwendung, etwa einem Fermentationsprozess, bereitgestellte (Ziel-)Zellkultur in ein und demselben Propagator hergestellt werden. Sie kann jedoch auch prinzipiell einem weiteren Propagator zur weiteren Propagation zugeführt werden.
Das wahlweise Abziehen umfasst die Auswahl davon, ob aus dem oberen Bereich oder dem unteren Bereich des Propagators abgezogen werden soll. Die Auswahl kann über eine entsprechende Verteilstation mit steuerbaren/regelbaren Ventilen, über die ein Zuleiten und Ausleiten von Medien in den Propagator hinein beziehungsweise aus diesen heraus gesteuert/geregelt wird, erfolgen (siehe auch detaillierte Beschreibung unten). Eine solche Auswahl wird im Stand der Technik nicht bereitgestellt. Vorteilhafterweise ermöglicht somit das erfindungsgemäße Verfahren ein nach Sedimentationsverhalten und Flokkationsverhalten der Zellen der erhaltenen (Ziel-)Zellkultur differenziertes Bereitstellen einer zur weiteren Verwendung zur Verfügung gestellten (Ziel-)Zellkultur.
In einer Weiterbildung kann das Propagieren die folgenden in der angegebenen Reihenfolge hintereinander ausgeführten Schritte umfassen:

1) ein erstes Propagieren der ersten Zellkultur (des inokulierten Substrats) in dem Propagator, bis eine erste Konzentration von Zellen zu Substrat erreicht wird (und somit ein erstes Propagat erhalten wird);
2) Zugeben weiteren Substrats in den Propagator;
3) ein zweites Propagieren in dem Propagator, bis eine zweite Konzentration von Zellen zu Substrat (die gleich der ersten Konzentration sein kann) erreicht wird (und somit ein zweites Propagat erhalten wird); und
4) Wiederholen der Schritte 2) und 3) bis die gewünschte Menge der zweiten Zellkultur (als fertiges Propagat) mit der gewünschten Konzentration von Zellen zu Substrat erhalten wird.

Wenn bereits nach dem genannten zweiten Propagieren die gewünschte Menge der zweiten Zellkultur mit der gewünschten Konzentration erhalten worden ist, wird kein weiteres Mal wiederholt, d.h. Schritt 4) kann dann gegebenenfalls entfallen.
Das fertige Propagat, aus dem dann wahlweise die (Ziel)Zellkultur für weitere Prozesse abgezogen werden kann, wird hierbei also aus der Startzellkultur iterativ, bevorzugt in ein und demselben Propagator hergestellt.
Der Propagator kann eine erste (untere) Zu-/Ausleitung mit einer ersten Öffnung in einem, insbesondere unteren, Endbereich des Propagators und eine zweite (mittlere) Zu-/Ausleitung mit einer zweiten Öffnung in einem Bereich des Propagators, der näher als die erste Öffnung an dem Zentrum des Propagators angeordnet ist, aufweisen. Die zweite Öffnung ist also weiter vom Endbereich entfernt als die erste Öffnung und befindet sich insbesondere oberhalb des sich in dem Propagator ausbildenden Zellkultursediments. Das wahlweise Abziehen des Teils des sedimentierten Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur durch die erste Öffnung der ersten Zu-/Ausleitung und das wahlweise Abziehen des Teils des schwebenden Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur kann durch die zweite Öffnung der zweiten Zu-/Ausleitung erfolgen.
Insbesondere können die erste und zweite Zu-/Ausleitung parallel zur Längsachse des Propagators geführt sein, sodass sich die zweite Zu-/Ausleitung weiter in den Propagator erstreckt als die erste Zu-/Ausleitung. Die erste und zweite Zu-/Ausleitung können durch den Boden des Propagators geführt sein, in welchem Fall die zweite Öffnung höher als die erste Öffnung liegt.
Beispielsweise kann sich die erste Öffnung im Boden des Propagators befinden. Weiterhin kann die die zweite Zu-/Ausleitung in einer Rohr-in-Rohr-Konfiguration innerhalb der ersten Zu-/Ausleitung, beispielsweise konzentrisch, geführt sein. In der Rohr-in-Rohr-Konfiguration können auch eine oder mehrere weitere Zu-/Ausleitungen mit unterschiedlichen Höhenniveaus ihrer jeweiligen Öffnung geführt sein und dem Abziehen eines Teils der gewünschten Menge, insbesondere eines Teils des schwebenden Anteils, der zweiten Zellkultur dienen.
Der Propagator kann auch eine dritte Zu-/Ausleitung mit einer dritten Öffnung aufweisen, die innerhalb der ersten Zu-/Ausleitung geführt ist und sich weiter in den Propagator erstreckt als die zweite Zu-/Ausleitung, und in diesem Fall kann das wahlweise Abziehen des Teils des schwebenden Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur wahlweise durch die zweite Öffnung der zweiten Zu-/Ausleitung und/oder die dritte Öffnung der dritten Zu-/Ausleitung erfolgen.
Vor dem Propagieren und/oder während des Propagierens und/oder nach dem Propagieren kann ein zumindest zeitweilig durchgeführtes Umwälzen des Inhalts des Propagators in zumindest einem Teilbereich des Propagators erfolgen. So kann das Verfahren ein zumindest zeitweiligem Umwälzen des inokulierten Substrats (vor dem eigentlichen Propagieren) und/oder der propagierenden ersten Zellkultur während des Propagierens in dem Propagator und/oder der zweiten Zellkultur in zumindest einem Teilbereich des Propagators umfassen.
Das zumindest zeitweilige Umwälzen kann hierbei über eine mit dem Propagator verbundene Umwälzleitung (die sich außerhalb des Propagators befindet) und mithilfe einer in der Umwälzleitung angebundenen Umwälzpumpe erfolgen. Insbesondere kann das zumindest zeitweilige Umwälzen über zumindest eine der oben genannten ersten Zu-/Ausleitung, zweiten Zu-/Ausleitung und dritten Zu-/Ausleitung erfolgen. Hierbei kann das zumindest zeitweilige Umwälzen zumindest zeitweilig, insbesondere nach einer Sedimentation oder für eine Sedimentation der propagierenden ersten Zellkultur in einem unteren Bereich des Propagators, lediglich in einem Bereich zwischen der zweiten Öffnung der zweiten Zu-/Ausleitung (22) und der dritten Öffnung der dritten Zu-/Ausleitung (23) erfolgen, sodass insbesondere das durch die Sedimentation entstehende oder entstandene Sediment im Wesentlichen nicht umgewälzt wird.
Außerdem kann das Verfahren den Schritt des Zuführens von Zink und/oder Kupfer zu dem Substrat/Propagat während und/oder nach dem Propagieren, insbesondere über eine Zinkanode und/oder Kupferanode (beziehungsweise Elektroden), die in der genannten Umwälzleitung angeordnet ist, umfassen. Zudem können Nährstoffe und/oder wachstumsfördernden Stoffen vor und/oder während des Propagierens gezielt, beispielsweise über eine der oben genannten ersten bis dritten Zu-/Ausleitungen zugegeben werden. Auch kann vor dem Propagieren und/oder während des Propagierens Luft, Sauerstoff, und/oder ein anderes Gas bzw. Gasgemisch in den Propagator geleitet werden. Dieses kann über die oben genannte mit dem Propagator verbundene Umwälzleitung und eine an diese angebundene Luftzufuhreinrichtung geschehen.
Weiterhin wird ein Verfahren zum Vergären einer Bierwürze mit dem Schritt des Füllens eines Fermentationstanks mit der Bierwürze und dem Schritt des Lieferns der gemäß einem der oben beschriebenen Verfahren bereitgestellten (Ziel-)Zellkultur in den Fermentationstank bereitgestellt.
Sodann wird ein Nachrüstverfahren zum Nachrüsten eines herkömmlichen Propagators und/oder zuvor anderweitig genutzten Tanks bereitgestellt. Das Verfahren ist ein Verfahren zum Nachrüsten eines Propagators und/oder zuvor anderweitig genutzten Tanks, der an einem Endbereich eine Zu-/Ausleitung aufweist, mit Führen einer ersten weiteren und insbesondere zusätzlich einer zweiten weiteren Zu-/Ausleitung durch die Zu-/Ausleitung in den Propagator und/oder zuvor anderweitig genutzten Tank und Anschließen der Zu-/Ausleitung, der ersten weiteren Zu-/Ausleitung und insbesondere der zweiten weiteren Zu-/Ausleitung über eine Verteilstation an eine Umwälzleitung, in die eine Umwälzpumpe angebunden ist, mithilfe derer ein Inhalt des Propagators und/oder zuvor anderweitig genutzten Tanks über die Zu-/Ausleitung, und/oder die erste weitere Zu-/Ausleitung und/oder insbesondere die zweite weitere Zu-/Ausleitung umgewälzt werden kann. Die Verteilstation weist hierbei Ventile zum Öffnen und Schließen der verschiedenen Zu-/Ausleitungen auf.
Es wird auch eine Vorrichtung zum Bereitstellen einer Zellkultur, die einen Propagator und eine Steuerungs-/Regelungseinheit umfasst, bereitgestellt, wobei die Steuerungs-/Regelungseinheit dazu ausgebildet ist, das Verfahren gemäß einem der oben beschriebenen Beispiele auszuführen.
Weitere Merkmale und beispielhafte Ausführungsformen sowie Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es versteht sich, dass die Ausführungsformen nicht den Bereich der vorliegenden Erfindung erschöpfen. Es versteht sich weiterhin, dass einige oder sämtliche der im weiteren beschriebenen Merkmale auch auf andere Weise miteinander kombiniert werden können.

1 zeigt die Herstellung einer Zellkultur gemäß dem Stand der Technik.
2 zeigt einen Propagator, wie er in einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens Verwendung finden kann.
3A bis 3G dienen der Veranschaulichung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Bereitstellen einer Zellkultur.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bereitstellen einer (Ziel-)Zellkultur, in dem ein Propagator/Assimilator (Tank) zum Propagieren (Vermehren, Züchten) einer Zellkultur Verwendung findet. Ein Beispiel für eine Vorrichtung mit einem solchen Propagator 10 ist in 2 gezeigt. Der Propagator/Assimilator 10 weist einen sich konisch verjüngenden unteren Bereich 11 auf, in dem wahlweise ein Anteil einer propagierten Zellkultur sedimentieren kann. Eine Zu-/Ausleitung 12 ist durch die Spitze des Konus geführt und mit einer Umwälzleitung 13 verbunden, in welche eine Umwälzpumpe 14 zum Umwälzen des Inhalts des Propagators 10 eingebunden ist. Die Umwälzpumpe 14 kann in der Geschwindigkeit regelbar und beispielsweise frequenzgesteuert ausgebildet sein. Weiterhin ist eine Luftzufuhreinrichtung 15 an die Umwälzleitung 13 angebunden, um Luft (oder ein anderes Gas) in das Innere des Propagators 10 leiten zu können. Die Luftzufuhreinrichtung 15 ermöglicht oder beschleunigt das Wachstum der Zellen in dem Propagator 10. In der Umwälzleitung 13 kann eine Zinkanode zur Erhöhung des Zinkgehalts zum Verbessern des Zellenwachstums und/oder eine Kupferanode zur Entschwefelung angeordnet sein.
Außerdem weist der Propagator 10 eine zur Umwälzleitung 13 alternativ vorgesehene Zu-/Ausleitung 16 auf, die eine gegenüber der Öffnung der durch die Spitze des Konus geführten Zu-/Ausleitung 12, die in der Spitze selbst angeordnet sein kann, höher und insbesondere oberhalb des sich in dem Propagator ausbildenden Zellkultursediments liegt. In dem in 2 gezeigten Beispiel endet die weitere Zu-/Ausleitung 16 seitlich in dem Tank. Alternativ kann die weitere Zu-/Ausleitung 16 innerhalb der durch die Spitze des Konus geführten Zu-/Ausleitung 12 verlaufen und weiter oberhalb als diese in den Propagator 10 münden (siehe auch die Beschreibung der 3A bis 3G unten). Der Propagator 10 kann außerdem eine Temperiereinrichtung, insbesondere zum Kühlen, aufweisen.
Erfindungsgemäß wird eine (Ziel-)Zellkultur durch wahlweises Abziehen der in dem Propagator 10 hergestellten Zellkultur durch die Zu-/Ausleitung 12 oder die Zu-/Ausleitung 16 bereitgestellt. So können einerseits ein Anteil der Zellkultur, der sich durch sich ablagernde Zellen auszeichnet, und anderseits ein Anteil der Zellkultur, der sich durch schwebende Zellen auszeichnet, zur weiteren Verwendung, beispielsweise in einem Fermentationsprozess, gewonnen werden.
Selbstverständlich kann auch eine Mischung dieser Zellen unterschiedlichen Sedimentations- und Schwebe beziehungsweise Flokkolationsverhaltens mit einem gewünschten Mischungsverhältnis gewonnen werden. Da vor der Abfüllung des Endproduktes häufig eine Abscheidung (Filtration) der Zellenerfolgt, bzw. die Gärung bei einem zu raschen Absetzen stark verlangsamt wird, ist das Flokkulations- und Sedimentationsverhalten ein wichtiger Qualitätsparameter einer für die Fermentation eingesetzten Zellkultur.
Insbesondere kann der Propagator 10 zur Bierherstellung Verwendung finden. Für bestimmte Biertypen und die darauf abgestimmte Technologie wird beispielsweise ein „staubiger Charakter“ (d.h. ein möglichst hoher Anteil an Zellen in Schwebe) der Population bevorzugt, um eine homogene Suspension beispielsweise mithilfe einer Zentrifugation zu klären und Bierverluste durch die klassische Hefeernte von unten zu reduzieren. Bei anderen Biertypen hingegen wird eine möglichst rasche und vollständige Sedimentation der Kultur nach der Gärung angestrebt, um beispielsweise die Hefe von unten möglichst vollständig aus dem Tank ernten zu können und dadurch auch die nach der Lagerung anschließende Kieselgur- oder Membranfiltration zu vereinfachen.
Das Absetzverhalten der Zellen wird genetisch von den eingesetzten Stämmen, der Substratzusammensetzung, der Zellgröße, der Altersverteilung, sowie der Vitalität und Viabilität der Kultur beeinflusst, weshalb die Anzahl der Wiederverwendungen und Mischungsverhältnisse (Propagationshefen zu Erntehefen) aufeinander abgestimmt werden sollten. Weiterhin sollten natürlich möglichst viele von den denjenigen Hefezellen zum Anstellen der Bierwürze verwendet werden, die die gewünschten Absetzeigenschaften aufweisen. Diese oben genannten Bedingungen können in dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung beispielsweise der in der 2 gezeigten Vorrichtung berücksichtigt werden, wie es im Stand der Technik bisher nicht möglich war.
Eine Ausführungsform des erfindungsmäßen Verfahrens zum Bereitstellen einer (Ziel)Zellkultur, beispielsweise für einen Fermentationsprozess wie die Vergärung von Bierwürze, wird im Weiteren mit Bezug auf die 3A bis 3G beschrieben.
In dem in den 3A bis 3G veranschaulichten Verfahren findet eine Vorrichtung mit einem Propagator 20 Verwendung, der sich dadurch auszeichnet, dass er mehrere, in diesem Fall drei, Zu-/Ausleitungen (Zu-/Abläufe) 21, 22 und 23 aufweist. Die drei Zu-/Ausleitungen 21, 22 und 23 werden in einer Rohr-in-Rohr-Konfiguration bereitgestellt, in der sich die mittlere Zu-/Ausleitung 22 und die obere Zu-/Ausleitung 23 (beispielsweise konzentrisch) durch die untere Zu-/Ausleitung 21 erstrecken. Die untere Zu-/Ausleitung 21 weist eine Öffnung unten im Propagator 20, beispielsweise in der Konusspitze, auf, die mittlere Zu-/Ausleitung 22 weist optional einen Verdrängungskörper geeigneter Geometrie (an der mittleren Zu-/Ausleitung 22 beispielsweise in Doppelkonusform angebracht) und eine Öffnung oberhalb derjenigen der unteren Zu-/Ausleitung 21 auf, und die obere Zu-/Ausleitung 23 weist eine Öffnung oberhalb derjenigen der mittleren Zu-/Ausleitung 22 auf. Die mittlere Zu-/Ausleitung 22 erstreckt sich also weiter in den Propagator 20 hinein als die untere Zu-/Ausleitung 21, und die obere Zu-/Ausleitung 23 erstreckt sich also weiter in den Propagator 20 hinein als die mittlere Zu-/Ausleitung 22. In anderen Ausführungsformen können Zu-/Ausleitungen von oben oder seitlich in den Propagator reichen.
Der Zu-/Ablauf von Medien in den Propagator 20 hinein beziehungsweise aus dem Propagator 20 heraus wird über eine Verteilstation 24 geregelt beziehungsweise gesteuert. Hierbei wird der Zu-/Ablauf über die untere Zu-/Ausleitung 21 über ein Ventilsystem 24a der Verteilstation 24, der Zu-/Ablauf über die mittlere Zu-/Ausleitung 22 über ein Ventilsystem 24b der Verteilstation 24 und der Zu-/Ablauf über die obere Zu-/Ausleitung 23 über ein Ventilsystem 24c der Verteilstation 24 geregelt beziehungsweise gesteuert. Der Propagator 20 kann außerdem eine Temperiereinrichtung, insbesondere zum Kühlen, aufweisen, wobei ein externer Wärmetauscher zum Erwärmen und/oder Kühlen in der Umwälzleitung 25 ebenfalls zusätzlich oder alternativ vorgesehen werden kann.
Die Verteilstation 24 verbindet die Zu-/Ausleitungen 21, 22 und 23 mit einer Umwälzleitung 25, in die eine Umwälzpumpe 26 eingebunden ist. In der Umwälzleitung 25 kann außerdem eine Zinkanode (Elektrode) zur bedarfsorientierten Erhöhung des Zinkgehalts und/oder eine Kupferanode (Elektrode) zur bedarfsorientierten Entschwefelung angeordnet sein. Die Umwälzpumpe 26 kann in der Geschwindigkeit regelbar und beispielsweise frequenzgesteuert ausgebildet sein. Weiterhin sind Probeentnahmestationen 27, eine Messtechnikstation 28 und eine Regelung-/Steuerungsstation 29 in der Umwälzleitung 25 vorgesehen beziehungsweise an diese angebunden. Die Messtechnikstation 28 kann beispielsweise zur Bestimmung eines Extraktgehalts (einer Konzentration), einer Zellzahl (beispielsweise mithilfe einer Trübungsmessung oder kapazitativen Messung), eines pH-Werts, eines Füllstands, einer Temperatur, eines Leitwerts, einer Sauerstoff/CO₂ - Messung, etc. dienen.
Ein Substrat wird über eine ein Ventil 30 aufweisende Prozessanbindung und die untere Zu-/Ausleitung 21 in den Propagator 20 eingeleitet.
Das Substrat kann eine Bierwürze ohne Fremdorganismen sein, idealerweise ausreichend mit Nähr- und Wuchsstoffen sowie mit verwertbaren Zuckern ausgestattet sein, eine Temperatur von 10-28°C bei der Inokulation und zwischen 6-20°P Stammwürze haben. Bei Mangel an Nähr- und Wuchsstoffen können diese wahlweise dem Substrat zugeführt werden, wobei erfindungsgemäß eine Zinkanreicherung und/oder Kupferanreicherung bedarfsorientiert auch mittels Spannungsanlegung auf entsprechende Elektroden erfolgen kann.
Dabei können sämtliche Ventile 24a, 24b und 24c der Verteilstation 24 geöffnet sein, um die Strömungsgeschwindigkeit des eingeleiteten Substrats gering zu halten (siehe 3A). Hier und im Weiteren wird ein geöffneter Ventilstand durch ein ausgefülltes Ventilsymbol und ein geschlossener Ventilstand durch ein leeres Ventilsymbol angezeigt. Strömungsrichtungen der Medien sind hier und im Weiteren durch Pfeile angezeigt. In dem in 3A gezeigten Beispiel wird Substrat bis zu einem Pegel eingeleitet, der oberhalb des Höhenniveaus der Öffnung der mittleren Zu-/Ausleitung 22 liegt. In anderen Beispielen kann der Pegel darunter liegen.
Weiterhin finden sich in der Umwälzleitung 25 beziehungsweise daran angebunden eine Luftzufuhreinrichtung 31, eine Inokulationsstelle 32 zur Zuführung einer Start-Zellkultur und ein Ventil 33, das eine Leitung, die mit einem Gully verbunden sein kann, zum Verwerfen eines Mediums öffnen kann.
Um eine erste Propagation der Zellkultur zu starten, wird, wie es in 3B gezeigt ist, das Substrat mit dem Kulturorganismus (Startzellkultur), wie beispielsweise einer Start-Hefezellenkultur, über die Inokulationsstelle 32 und den unteren Zu-/Ablauf 21 beimpft und das so erhaltene Medium, zumindest in zeitlichen Intervallen, mithilfe der Umwälzpumpe 26 umgewälzt und über die Luftzufuhreinrichtung 31 zum Ermöglichen des aeroben Zellwachstums zumindest zeitweise belüftet.
Der optionale Verdrängungskörper dient beim Umwälzvorgang im Propagator 20 als Strömungsbrecher und Strömungslenker der Kontrolle der Strömung des Mediums. Das Impfen kann mit einem sogenannten Carlsbergkolben 34 und/oder mit einer alternativ behandelten Kultur (z.B. sprühgetrockneten, abgenutschten, fest- oder flüssigangereicherten und/oder zuvor gefrorenen Kultur) erfolgen. Falls gewünscht können unterschiedliche Ventile 24a, 24b, 24c der Druckseite der Umwälzpumpe und somit Zu-/Abläufe 21, 22, 23 angewählt werden, um eine ideale Durchmischung auch bei nicht bedecktem mittleren Zu-/Ablauf 22 und/oder oberen Zu-/Ablauf 23 zu gewährleisten.
Wenn im Verlauf der ersten Propagation in dem Propagator 20 eine gewünschte Konzentration von Zellen der Zellkultur, etwa 80 bis 120 Millionen Hefezellen pro ml Substrat, erreicht worden ist, wird weiteres Substrat über die untere Zu-/Ausleitung 21 in den Propagator 20 geleitet (siehe 3C), um beispielsweise eine Verdünnung von 1:10 bis 1:100 der Zellkultur mit Substrat zu erreichen, sodass eine Wachstumsinhibierung (durch beispielsweise einen erhöhten Alkohol- und CO₂ Gehalt und einen Mangel an Wuchsstoffen) vermieden werden kann. Wiederum erfolgt ein Umwälzen und Belüften. Die Strömungsrichtung kann durch eine geeignete Steuerung/Regelung der Ventile 24a, 24b und 24c der Verteilstation 24 gewählt werden.
Die in den 3B und 3C gezeigte Prozessfolge kann solange wiederholt werden, bis die gewünschte Menge an Zellkultur mit der gewünschten Konzentration an Zellen in dem Substrat in dem Propagator 20 hergestellt worden ist. In dem in 3D gezeigten Verfahrensstand wird beispielhaft eine Umwälzung gezeigt, bei der die obere Zu-/Ausleitung 23 zum Einströmen des umgewälzten Mediums verwendet und somit der gesamte Behälterinhalt homogenisiert wird.
Ab einem gewissen Zeitpunkt sollte zumindest der untere Bereich des Propagators 20 nicht mehr aktiv durchströmt werden, also keine Umwälzung des Mediums in diesem unteren Bereich erfolgen, sodass sich die Zellen absetzen und anreichern und damit eine Sediment S bilden können, wie es in 3E gezeigt ist. Wenn es gewünscht ist, kann jedoch noch eine Umwälzung zwischen den Höhenniveaus der Öffnungen der mittleren Zu-/Ausleitung 22 und oberen Zu-/Ausleitung 23 erfolgen, um dort weiter zu homogenisieren, wie es ebenfalls in 3E gezeigt ist. In dem in 3E gezeigten Verfahrensstand wird beispielhaft eine Umwälzung gezeigt, bei der die obere Zu-/Ausleitung 23 zum Einströmen des umgewälzten Mediums verwendet wird.
Wenn die gewünschte Menge an Zellkultur mit der gewünschten Konzentration an Zellen in dem Substrat in dem Propagator 20 hergestellt worden ist, kann ein wahlweiser Abzug eines Anteils dieser Menge durch eine oder mehrere der Zu-/Ausleitungen 21, 22 und 23 erfolgen. So können schwebende Zellen aus einem oberen Bereich des Propagators 20 über die obere Zu-/Ausleitung 23 und/oder die mittlere Zu-/Ausleitung 23 abgezogen werden, wie es in 3F gezeigt ist. Der Abzug erfolgt über das Ventil 30 der Prozessanbindung. Wünschenswerterweise verbleibt ein kleiner Teil (etwa 1 bis 10%) der angereicherten Kultur aus dem Konus im Tank, der dann wieder der Inokulation der nachfolgenden Charge dient.
Die so gewonnene (Ziel-)Zellkultur kann in einem weiteren Prozess, beispielsweise einer Fermentation, Verwendung finden. Beispielsweise kann eine so gewonnene (Ziel-)Hefezellkultur zum Vergären einer Bierwürze im Rahmen der Herstellung einer Biersorte dienen, für die ein hoher Anteil von Hefezellen mit starker Neigung zum Schweben gewünscht ist.
Für einen der Propagation nachfolgenden Prozess, in dem wünschenswerterweise Zellen mit starker Neigung zur Sedimentation Verwendung finden sollen, wird, wie es in 3G gezeigt ist, ein Abzug der propagierten Zellkultur von unten über die untere Zu-/Ausleitung 21 erfolgen.
Hierbei sollte ein vergleichsweise größeres Restvolumen von etwa 10 bis 20% für die nachfolgende Charge zurückgehalten werden. Die durch Abziehen von unten erhaltene (Ziel-)Zellkultur weist nicht nur eine verstärkte Neigung zur Sedimentation auf, sondern auch eine höhere Konzentration als diejenige, die durch Abziehen über die obere Zu-/Ausleitung 23 und/oder die mittlere Zu-/Ausleitung 23 erhalten wird. So können also auch wahlweise (Ziel-)Zellkultur unterschiedlicher Konzentration weiteren Prozessen bereitgestellt werden.
Beim Transfer der erhaltenen (Ziel-)Zellkultur zu einem weiteren Prozess, beispielsweise zum Anstellen von Bierwürze mit Hefezellen, kann die reale Hefegabemenge über die Transferzeit ermittelt werden, indem auch Schwankungen in der Zellzahl (gemessen beispielsweise über die Trübung) in Bezug zum Massentransfer berücksichtigt werden. Wenn das Gemisch eine stärkere Trübung als üblich aufweist wird weniger Hefe zur Fermentation verwendet, da die Trübung auf höhere Zellzahlen schließen lässt und die Gärung immer mit ähnlich vielen Zellen erfolgen sollte.
Zur Reinigung wird der Propagator vollständig entleert, und es erfolgt ein herkömmlicher CIP-Prozess, bei dem allerdings immer ein gewisser Teil der Medien im unteren Tankbereich verweilen kann (Sumpf), damit alle Leitungswege (unterer, mittlerer und oberer Zu-/Ablauf 21, 22, 23, die Verteilstation 24 und die Umwälzleitung 25) mit hoher Strömungsgeschwindigkeit durchströmt und somit gereinigt werden können.
Wie oben beschrieben wird es durch das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere ermöglicht, den Prozess von der Beimpfung bis zum Abziehen der fertiggestellten weiterzuverwendenden (Ziel-)Zellkultur in ein und demselben Propagator, beispielsweise in dem in 2 gezeigten Propagator 10 oder den in den 3A bis 3G gezeigten Propagator 20, auszuführen. Die Propagationsgeschwindigkeit kann beispielsweise durch eine geeignete Steuerung/Regelung der Temperatur, Umwälzgeschwindigkeit, Wahl der Umwälzzonen im Propagator 20, Belüftungsraten, etc. geeignet eingestellt werden. Vor oder während der Propagation können dem Medium in dem Propagator noch Nährstoffe und/oder wachstumsfördernde Stoffe über zumindest eine der drei Zu-/Ausleitungen 21, 22, 23 zugegeben werden.
Eine Spannungsanlegung an eine, beispielsweise in der Umwälzleitung 13 befindliche, Zink- und/oder Manganelektrode bewirkt deren beschleunigte Auflösung und Ionisierung, so dass der Gehalt an für die Zellen benötigtem freien Zink/Mangan in der Flüssigkeit ansteigt, und so eine Vitalitätssteigerung der Kultur resultiert.
Bei einer Kupferelektrode werden hingegen Kupferionen ausgelöst, wodurch diese mit schwefligen Verbindungen reagieren können und sich dadurch ein verringerter Schwefelgehalt im Produkt ergibt.

Claims

Verfahren zum Bereitstellen einer Zellkultur mit den Schritten: Füllen eines Substrats in einen Propagator (10, 20); Inokulieren des Substrats in dem Propagator (10, 20) mit einer ersten Zellkultur; Propagieren der ersten Zellkultur in dem Propagator (10, 20), um in dem Propagator (10, 20) eine gewünschte Menge einer zweiten Zellkultur mit einer gewünschten Konzentration zu erhalten, wobei die zweite Zellkultur einen sedimentierten Anteil und einen schwebenden Anteil aufweist; und wahlweises Abziehen zumindest eines Teils des sedimentierten Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur aus einem unteren Bereich des Propagators (10, 20) und/oder zumindest eines Teils des schwebenden Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur aus einem oberen Bereich des Propagators (10, 20).
Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem das Propagieren die folgenden in der angegebenen Reihenfolge hintereinander ausgeführten Schritte umfasst: 1) ein erstes Propagieren der ersten Zellkultur in dem Propagator (10, 20), bis eine erste Konzentration von Zellen zu Substrat erreicht wird; 2) Zugeben weiteren Substrats in den Propagator (10, 20); 3) ein zweites Propagieren in dem Propagator (10, 20), bis eine zweite Konzentration von Zellen zu Substrat erreicht wird, die insbesondere der ersten Konzentration gleich sein kann; und 4) Wiederholen der Schritte 2) und 3) bis die gewünschte Menge der zweiten Zellkultur mit der gewünschten Konzentration von Zellen zu Substrat erhalten wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, in dem der Propagator (10, 20) eine erste Zu-/Ausleitung (21) mit einer ersten Öffnung in einem, insbesondere unteren, Endbereich des Propagators (10, 20) und eine zweite Zu-/Ausleitung (22) mit einer zweiten Öffnung in einem Bereich des Propagators (10, 20), die weiter als die erste Öffnung von dem, insbesondere unteren, Endbereich des Propagators (10, 20) entfernt angeordnet ist, aufweist, und wobei das wahlweise Abziehen des Teils des sedimentierten Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur durch die erste Öffnung der ersten Zu-/Ausleitung (21) und das wahlweise Abziehen des Teils des schwebenden Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur durch die zweite Öffnung der zweiten Zu-/Ausleitung (22) erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 3, in dem die zweite Zu-/Ausleitung (22) innerhalb der ersten Zu-/Ausleitung (21) geführt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der Propagator (20) eine dritte Zu-/Ausleitung (23) mit einer dritten Öffnung aufweist, die innerhalb der ersten Zu-/Ausleitung (21) geführt ist und sich weiter in den Propagator (10, 20) erstreckt als die zweite Zu-/Ausleitung (22), und das wahlweise Abziehen des Teils des schwebenden Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur wahlweise auch durch die dritte Öffnung der dritten Zu-/Ausleitung (23) oder statt durch die zweite Öffnung der zweiten Zu-/Ausleitung (22) durch die dritte Öffnung der dritten Zu-/Ausleitung (23) erfolgt.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin mit zumindest zeitweiligem Umwälzen des inokulierten Substrats und/oder der propagierenden ersten Zellkultur und/oder der zweiten Zellkultur in zumindest einem Teilbereich des Propagators (10, 20).
Verfahren gemäß Anspruch 6, in dem das zumindest zeitweilige Umwälzen über eine mit dem Propagator (10, 20) verbundene Umwälzleitung (13, 25) und mithilfe einer in der Umwälzleitung angebundenen Umwälzpumpe (14, 26) erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das zumindest zeitweilige Umwälzen über zumindest eine der ersten Zu-/Ausleitung (21), zweiten Zu-/Ausleitung (22) und dritten Zu-/Ausleitung (23) erfolgt.
Verfahren gemäß Anspruch 8, in dem das zumindest zeitweilige Umwälzen zumindest zeitweilig, insbesondere nach einer Sedimentation oder für eine Sedimentation der propagierenden Zellkultur in einem unteren Bereich des Propagators (10, 20), lediglich in einem Bereich zwischen der zweiten Öffnung der zweiten Zu-/Ausleitung (22) und der dritten Öffnung der dritten Zu-/Ausleitung (23) erfolgt.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin mit Zuführen von Zink, Mangan und/oder Kupfer zu dem Substrat während und/oder nach dem Propagieren, insbesondere über eine Zink-/Mangananode oder -elektrode und/oder Kupferanode oder -elektrode, die insbesondere in der Umwälzleitung (13, 25) angeordnet ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin mit Zuführen von nähr- und/oder wachstumsfördernden Stoffen in den Propagator (10, 20) vor und/oder während des Propagierens.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin mit Zuführen von Luft, Sauerstoff und/oder einem anderen Gas/Gasgemisch in den Propagator (10, 20) vor und/oder während des Propagierens mithilfe einer in eine Umwälzleitung, die mit dem Propagator (10, 20) verbunden ist, angebundenen Gas-/Luftzufuhreinrichtung (31).
Verfahren zum Vergären einer Bierwürze, mit Füllen eines Fermentationstanks mit der Bierwürze und Liefern der gemäß einem der Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche bereitgestellten Zellkultur in den Fermentationstank.
Verfahren zum Nachrüsten eines Propagators und/oder zuvor anderweitig genutzten Tanks, der an einem Endbereich eine Zu-/Ausleitung aufweist, mit Führen einer ersten weiteren und insbesondere zusätzlich einer zweiten weiteren Zu-/Ausleitung durch die Zu-/Ausleitung in den Propagator und/oder zuvor anderweitig genutzten Tank und Anschließen der Zu-/Ausleitung, der ersten weiteren Zu-/Ausleitung und insbesondere der zweiten weiteren Zu-/Ausleitung über eine Verteilstation an eine Umwälzleitung, in die eine Umwälzpumpe angebunden ist, mithilfe derer ein Inhalt des Propagators und/oder zuvor anderweitig genutzten Tanks über die Zu-/Ausleitung, und/oder die erste weitere Zu-/Ausleitung und/oder insbesondere die zweite weitere Zu-/Ausleitung umgewälzt werden kann.
Vorrichtung zum Bereitstellen einer Zellkultur, die einen Propagator (10, 20) und eine Steuerungs-/Regelungseinheit umfasst, wobei die Steuerungs-/Regelungseinheit dazu ausgebildet ist, das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 auszuführen.