EP4004182A1 - Bereitstellung von zellkulturen - Google Patents

Bereitstellung von zellkulturen

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Publication number
EP4004182A1
EP4004182A1 EP20734513.3A EP20734513A EP4004182A1 EP 4004182 A1 EP4004182 A1 EP 4004182A1 EP 20734513 A EP20734513 A EP 20734513A EP 4004182 A1 EP4004182 A1 EP 4004182A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
propagator
inlet
cell culture
outlet line
line
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP20734513.3A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Konrad Mueller-Auffermann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Krones AG
Original Assignee
Krones AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Krones AG filed Critical Krones AG
Publication of EP4004182A1 publication Critical patent/EP4004182A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C11/00—Fermentation processes for beer
    • C12C11/003—Fermentation of beerwort
    • C12C11/006—Fermentation tanks therefor
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    • C12C—BEER; PREPARATION OF BEER BY FERMENTATION; PREPARATION OF MALT FOR MAKING BEER; PREPARATION OF HOPS FOR MAKING BEER
    • C12C13/00—Brewing devices, not covered by a single group of C12C1/00 - C12C12/04
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M41/44—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of volume or liquid level

Definitions

  • the present invention relates to the provision of cell cultures including the propagation of the cell cultures in a propagator and the withdrawal of the propagated cell cultures from the propagator.
  • Cell cultures such as yeast are generally propagated (propagated) in propagators, i.e. bioreactors in the form of tanks.
  • the propagators are equipped with circulating devices, such as stirrers, or circulation lines, in order to thoroughly mix the inoculated substrate.
  • the propagators are typically equipped with temperature control devices in order to sterilize the substrate and / or to set a desired temperature during the propagation.
  • the temperature control devices can include heating and / or cooling surfaces and external heat exchangers.
  • a prior art propagation method is illustrated in FIG.
  • a cleaned propagator 1 is filled via a substrate inlet 2 with a substrate, in the example shown in FIG. 1A from below, and filled with a pure cell culture previously grown in the laboratory, for example a yeast culture used for brewing beer, for example with the aid of a so-called Carlsberg Piston 3, inoculated.
  • a circulation pump 4 With the aid of a circulation pump 4, the pure culture is mixed with the substrate, and a gas, such as air, for cell reproduction can optionally be introduced via a gas inlet 5.
  • a gas such as air
  • the dilution of the cells with substrate at this stage is 1:10 to 1: 100.
  • the substrate is again added (see FIG. 1B) for a renewed dilution of usually 1:10 to 1: 100 ⁇ m to prevent product inhibition (by alcohol and CO2) and to cause further growth.
  • the gas supply and circulation can be kept constant or used at intervals. This process is repeated until the desired total amount of cells has been produced.
  • the agitators or circulating devices used have to be specifically designed for the masses received in the propagators, a smaller pre-propagator 1 and a larger main propagator 6 are typically used, with the amount obtained from the pre-propagator being fed into the main propagator 6, in which the above be
  • the process described is carried out in the same way (FIG. 1C).
  • the cell culture obtained in this way (the so-called propagate) can be drawn off from below and, for example, fed to a fermenter for carrying out a fermentation.
  • the conventional multi-stage propagation described in several propagators / assimilators of different sizes is relatively complex.
  • the propagated cell culture is withdrawn for further use, for example in a fermentation process, in an undifferentiated manner without any consideration of the specific properties of the different types of cells in the cell culture.
  • the sedimentation behavior and the flocculation behavior of the cells vary greatly according to the age and size distribution of the cell culture, its genetic variability, vitality and viability.
  • these behaviors are important for subsequent processes that use the preserved cell culture, such as fermentation processes.
  • different sedimentation and flocculation behavior of the yeast cultures used are required depending on the desired type of beer or technology. This is not given sufficient consideration in the conventional process described for producing a cell culture.
  • the object of the present invention is to simplify the provision of a cell culture and to improve it with regard to the differentiation of the cell culture obtained and to be used further.
  • a substrate into a propagator (tank); Inoculating the substrate in the propagator with a first cell culture (for example with a pure culture produced in the laboratory; for example a yeast for beer production);
  • a first cell culture for example with a pure culture produced in the laboratory; for example a yeast for beer production
  • the term “propagator” also includes an assimilator, i.e. a tank for growing and multiplying cell cultures.
  • the second cell culture represents the nth generation of the first cell culture, where n is greater than two.
  • the (target) cell culture obtained by the process is ready for further use, for example in a fermentation process.
  • this (target) cell culture which is provided for further use, such as a fermentation process, can be produced in one and the same propagator. In principle, however, it can also be fed to a further propagator for further propagation.
  • the optional subtraction includes the selection of whether subtraction should be made from the upper area or the lower area of the propagator.
  • the selection can be made via a corresponding distribution station with controllable / regulable valves, via which the supply and discharge of media into and out of the propagator is controlled / regulated (see also detailed description below).
  • Such a selection is not provided in the prior art.
  • the method according to the invention thus enables a (target) cell culture to be made available for further use, which is differentiated according to the sedimentation behavior and flocculation behavior of the cells of the (target) cell culture obtained.
  • the propagation can comprise the following steps carried out one after the other in the order specified: 1) a first propagation of the first cell culture (of the inoculated substrate) in the propagator until a first concentration of cells to substrate is reached (and thus a first propagate is obtained);
  • step 4 If the desired amount of the second cell culture with the desired concentration has already been obtained after the mentioned second propagation, there is no further repetition, i.e. step 4) can then be omitted.
  • the finished propagation, from which the (target) cell culture can then optionally be withdrawn for further processes, is thus produced iteratively from the start cell culture, preferably in one and the same propagator.
  • the propagator can have a first (lower) inlet / outlet with a first opening in one, in particular lower, end area of the propagator and a second (middle) inlet / outlet with a second opening in an area of the propagator that is closer than the first opening is arranged at the center of the propagator.
  • the second opening is therefore further away from the end area than the first opening and is in particular above the cell culture sediment that forms in the propagator.
  • the optional removal of the part of the sedimented portion of the desired amount of the second cell culture through the first opening of the first inlet / outlet and the optional removal of the part of the floating portion of the desired amount of the second cell culture can be done through the second opening of the second inlet. / Rejection.
  • first and second inlet / outlet line can be routed parallel to the longitudinal axis of the propagator so that the second inlet / outlet line extends further into the propagator than the first inlet / outlet line.
  • the first and second inlet / outlet lines can be passed through the floor of the propagator, in which case the second opening is higher than the first opening.
  • the first opening can be in the bottom of the propagator.
  • the second inlet / outlet line can be guided in a tube-in-tube configuration within the first inlet / outlet line, for example concentrically. In the tube-in-tube configuration, one or more further inlet / outlet lines with different height levels of their respective opening can be routed and serve to remove part of the desired amount, in particular part of the floating portion, of the second cell culture.
  • the propagator can also have a third inlet / outlet line with a third opening, which is guided within the first inlet / outlet line and extends further into the propagator than the second inlet / outlet line, and in this case the optional removal of the Part of the floating portion of the desired amount of the second cell culture can be done optionally through the second opening of the second inlet / outlet and / or the third opening of the third inlet / outlet.
  • the contents of the propagator can be circulated at least temporarily in at least one partial area of the propagator.
  • the method can comprise at least a temporary circulation of the inoculated substrate (before the actual propagation) and / or the propagating first cell culture during propagation in the propagator and / or the second cell culture in at least a partial area of the propagator.
  • the at least temporary circulation can take place via a circulation line connected to the propagator (which is located outside the propagator) and with the aid of a circulation pump connected to the circulation line.
  • the at least temporary circulation can take place via at least one of the above-mentioned first inlet / outlet, second inlet / outlet and third inlet / outlet.
  • the at least temporary circulation can at least temporarily, in particular after sedimentation or for sedimentation of the propagating first cell culture in a lower area of the propagator, only in an area between the second opening of the second inlet / outlet line (22) and the third opening the third inlet / outlet line (23) take place, so that in particular the sediment created or created by the sedimentation is essentially not circulated.
  • the method can include the step of supplying zinc and / or copper to the substrate / propagate during and / or after propagation, in particular via a zinc anode and / or copper anode (or electrodes) which is arranged in said circulation line .
  • nutrients and / or growth-promoting substances can be used before and / or during the propagation in a targeted manner, for example via one of the above-mentioned first to third inlet / outlet lines.
  • air, oxygen and / or another gas or gas mixture can also be passed into the propagator. This can happen via the above-mentioned circulation line connected to the propagator and an air supply device connected to it.
  • a method for fermenting wort is provided with the step of filling a fermentation tank with the wort and the step of delivering the (target) cell culture provided according to one of the methods described above into the fermentation tank.
  • a retrofit method is then provided for retrofitting a conventional propagator and / or previously otherwise used tanks.
  • the method is a method for retrofitting a propagator and / or previously otherwise used tank, which has an inlet / outlet line at one end area, with a first additional and in particular additionally a second additional inlet / outlet line through the inlet / outlet line in the propagator and / or previously otherwise used tank and connecting the inlet / outlet line, the first additional inlet / outlet line and in particular the second additional inlet / outlet line via a distribution station to a circulation line into which a circulation pump is connected, with the help of which a content of the propagator and / or tanks previously used otherwise can be circulated via the inlet / outlet and / or the first further inlet / outlet and / or in particular the second further inlet / outlet.
  • the distribution station has valves for opening and closing the various inlet and outlet lines.
  • a device for providing a cell culture which comprises a propagator and a control / regulating unit, is also provided, the control / regulating unit being designed to carry out the method according to one of the examples described above.
  • FIG. 1 shows the production of a cell culture according to the prior art.
  • Figure 2 shows a propagator as it can be used in an embodiment of the method according to the invention.
  • FIGS. 3A to 3G serve to illustrate an embodiment of the method according to the invention for providing a cell culture.
  • the present invention relates to a method for providing a (target) cell culture, in which a propagator / assimilator (tank) is used for propagating (multiplying, growing) a cell culture.
  • a propagator / assimilator tunnel
  • An example of a device with such a propagator 10 is shown in FIG.
  • the propagator / assimilator 10 has a conically tapered lower region
  • An inlet / outlet line 12 is passed through the tip of the cone and verbun with a circulation line 13, in which a circulation pump 14 for circulating the contents of the propagator 10 is connected.
  • the circulation pump 14 can be designed to be adjustable in speed and, for example, frequency-controlled.
  • an air supply device 15 is connected to the circulation line 13 in order to be able to direct air (or another gas) into the interior of the propagator 10. The air supply device 15 enables or accelerates the growth of the cells in the propagator 10.
  • a zinc anode to increase the zinc content to improve cell growth and / or a copper anode for desulfurization can be arranged in the circulation line 13.
  • the propagator 10 has an inlet / outlet line 16 provided as an alternative to the circulation line 13, which is higher and in particular above the opening of the inlet / outlet line 12, which is guided through the tip of the cone and can be arranged in the tip itself is in the propagator forming cell culture sediment.
  • the further inlet / outlet line 16 ends laterally in the tank.
  • the further inlet / outlet line 16 can be within the inlet / outlet line passed through the tip of the cone
  • the propagator 10 can also have a temperature control device, in particular for cooling.
  • a (target) cell culture is provided by selectively withdrawing the cell culture produced in the propagator 10 through the inlet / outlet line 12 or the inlet / outlet line 16.
  • a portion of the cell culture that is characterized by deposited cells and, on the other hand, a portion of the cell culture that is characterized by floating cells can be obtained for further use, for example in a fermentation process.
  • a mixture of these cells with different sedimentation and floating or flocculation behavior can also be obtained with a desired mixing ratio. Since the cells are often separated (filtered) before the end product is filled, or fermentation is greatly slowed down if it settles too quickly, the flocculation and sedimentation behavior is an important quality parameter of a cell culture used for fermentation.
  • the propagator 10 can be used for beer production.
  • a “dusty character” ie the highest possible proportion of cells in suspension
  • the aim is to sediment the culture as quickly and completely as possible after fermentation, for example to be able to harvest the yeast from the tank as completely as possible from below and thus also to simplify the diatomaceous earth or membrane filtration that follows after storage.
  • the weaning behavior of the cells is genetically influenced by the strains used, the substrate composition, the cell size, the age distribution as well as the vitality and viability of the culture, which is why the number of reuses and mixing ratios (propagation yeast to harvest yeast) should be coordinated. Furthermore, of course, as many of those yeast cells as possible should be used to make the wort that have the desired settling properties.
  • One embodiment of the method according to the invention for providing a (target) cell culture for example for a fermentation process such as the fermentation of wort, is described below with reference to FIGS. 3A to 3G.
  • a device with a propagator 20 which is characterized in that it has several, in this case three, inlets / outlets (inlets / outlets) 21, 22 and 23.
  • the three inlet / outlet lines 21, 22 and 23 are provided in a tube-in-tube configuration in which the middle inlet / outlet line 22 and the upper inlet / outlet line 23 extend (for example, concentrically) through the lower inlet / Austechnisch 21 extend.
  • the lower inlet / outlet line 21 has an opening at the bottom in the propa- Gator 20, for example in the cone tip
  • the middle inlet / outlet line 22 optionally has a displacement body of suitable geometry (attached to the middle inlet / outlet line 22, for example, in a double cone shape) and an opening above that of the lower inlet / outlet line 21 and the upper inlet / outlet line 23 has an opening above that of the central inlet / outlet line 22.
  • the middle inlet / outlet line 22 extends further into the propagator 20 than the lower inlet / outlet line 21, and the upper inlet / outlet line 23 thus extends further into the propagator 20 than the middle inlet / outlet line 22.
  • inlet / outlet lines can reach into the propagator from above or from the side.
  • the inflow / outflow of media into the propagator 20 or out of the propagator 20 is regulated or controlled via a distribution station 24.
  • the inflow / outflow via the lower inflow / outflow line 21 via a valve system 24a of the distribution station 24 the inflow / outflow via the middle inflow / outflow line 22 via a valve system 24b of the distribution station 24 and the inflow / outflow via the upper inlet / outlet line 23 regulated or controlled via a valve system 24c of the distribution station 24.
  • the propagator 20 can also have a temperature control device, in particular for cooling, wherein an external heat exchanger for heating and / or cooling in the circulation line 25 can also be provided additionally or alternatively.
  • the distribution station 24 connects the inlet / outlet lines 21, 22 and 23 to a circulation line 25 into which a circulation pump 26 is integrated.
  • a zinc anode (electrode) for increasing the zinc content as required and / or a copper anode (electrode) for desulfurization as required can also be arranged in the circulation line 25.
  • the circulation pump 26 can be designed to be adjustable in speed and, for example, frequency-controlled.
  • sampling stations 27, a measuring technology station 28 and a regulation / control station 29 are provided in the circulation line 25 or are connected to it.
  • the measurement technology station 28 can be used, for example, to determine an extract content (a concentration), a cell count (for example using a turbidity measurement or capacitive measurement), a pH value, a fill level, a temperature, a conductance, an oxygen / CO 2 measurement, etc. to serve.
  • an extract content a concentration
  • a cell count for example using a turbidity measurement or capacitive measurement
  • a pH value for example using a turbidity measurement or capacitive measurement
  • a pH value for example using a turbidity measurement or capacitive measurement
  • a fill level for example using a turbidity measurement or capacitive measurement
  • a temperature for example using a turbidity measurement or capacitive measurement
  • a cell count for example using a turbidity measurement or capacitive measurement
  • a pH value for example using a turbidity measurement or capacitive measurement
  • a fill level for example using a turbidity measurement or capacitive measurement
  • a temperature
  • a substrate is introduced into the propagator 20 via a process connection having a valve 30 and the lower inlet / outlet line 21.
  • the substrate can be a wort without foreign organisms, ideally it can be adequately equipped with nutrients and growth substances as well as usable sugars, one temperature of 10-28 ° C at inoculation and between 6-20 ° P original wort. If there is a lack of nutrients and growth substances, these can optionally be added to the substrate, in which case zinc enrichment and / or copper enrichment according to requirements can also be carried out by applying voltage to appropriate electrodes.
  • All the valves 24a, 24b and 24c of the distribution station 24 can be opened in order to keep the flow rate of the introduced substrate low (see FIG. 3A).
  • an open valve position is indicated by a filled valve symbol and a closed valve position by an empty valve symbol.
  • Flow directions of the media are indicated here and below by arrows.
  • the substrate is introduced up to a level which is above the height level of the opening of the central inlet / outlet line 22. In other examples the level can be lower.
  • an air supply device 31 an inoculation point 32 for supplying a starting cell culture and a valve 33, which can open a line, which can be connected to a gully, to discard a medium can be found in the circulation line 25 or connected to it.
  • the substrate is inoculated with the culture organism (start cell culture), such as a start yeast cell culture, via the inoculation point 32 and the lower inlet / outlet 21 and the medium obtained in this way, at least at time intervals, is circulated with the aid of the circulating pump 26 and ventilated at least temporarily via the air supply device 31 to enable aerobic cell growth.
  • start cell culture such as a start yeast cell culture
  • the optional displacement body serves as a flow breaker and flow guide to control the flow of the medium during the circulation process in the propagator 20.
  • the inoculation can be done with a so-called Carlsberg flask 34 and / or with an alternatively treated culture (e.g. spray-dried, suction-filtered, solid or liquid-enriched and / or previously frozen culture).
  • an alternatively treated culture e.g. spray-dried, suction-filtered, solid or liquid-enriched and / or previously frozen culture.
  • different valves 24a, 24b, 24c on the pressure side of the circulation pump and thus inlets / outlets 21, 22, 23 can be selected to ensure ideal mixing even when the middle inlet / outlet 22 and / or upper inlet / outlet is not covered 23 to ensure.
  • a desired concentration of cells of the cell culture about 80 to 120 million yeast cells per ml of substrate, has been reached in the course of the first propagation in the propagator 20, further substrate is fed into the propagator 20 via the lower inlet / outlet line 21 (see Fig He Figure 3C), for example, a 1:10 to 1: 100 dilution of the cell culture with substrate to achieve, so that a growth inhibition (for example due to an increased alcohol and CO2 content and a lack of growth substances) can be avoided.
  • circulation and ventilation takes place.
  • the direction of flow can be selected by a suitable control / regulation of the valves 24a, 24b and 24c of the distribution station 24.
  • the process sequence shown in FIGS. 3B and 3C can be repeated until the desired amount of cell culture with the desired concentration of cells in the substrate has been produced in the propagator 20.
  • a circulation is shown as an example, in which the upper inlet / outlet line 23 is used for the inflow of the circulated medium and the entire container contents are thus homogenized.
  • At least the lower area of the propagator 20 should no longer be actively flowed through, i.e. there should be no circulation of the medium in this lower area, so that the cells can settle and accumulate and thus form a sediment S, as shown in FIG. 3E is. If desired, however, a circulation can still take place between the height levels of the openings of the central inlet / outlet line 22 and the upper inlet / outlet line 23 in order to further homogenize there, as is also shown in FIG. 3E. In the process status shown in FIG. 3E, a circulation is shown by way of example, in which the upper inlet / outlet line 23 is used for the inflow of the circulated medium.
  • a portion of this amount can optionally be withdrawn through one or more of the inlet / outlet lines 21, 22 and 23. So floating cells can be drawn off from an upper area of the propagator 20 via the upper inlet / outlet line 23 and / or the middle inlet / outlet line 23, as shown in FIG. 3F. The withdrawal takes place via the valve 30 of the process connection. Desirably, a small portion (about 1 to 10%) of the enriched culture from the cone remains in the tank, which is then used again to inoculate the subsequent batch.
  • the (target) cell culture obtained in this way can be used in a further process, for example fermentation.
  • a (target) yeast cell culture obtained in this way can be used to ferment a beer wort in the context of the production of a type of beer for which a high proportion of yeast cells with a strong tendency to float is desired.
  • the propagated cell culture will be withdrawn from below via the lower inlet / outlet line 21, as shown in FIG. 3G.
  • a comparatively larger residual volume of around 10 to 20% should be retained for the subsequent batch.
  • the (target) cell culture obtained by pulling off from below not only has an increased tendency to sedimentation, but also a higher concentration than that obtained by pulling off via the upper inlet / outlet line 23 and / or the middle inlet / outlet Exit 23 is obtained. In this way, (target) cell cultures with different concentrations can optionally be provided for further processes.
  • the real amount of yeast added can be determined over the transfer time by also taking into account fluctuations in the number of cells (measured for example via the turbidity) in relation to the mass transfer will. If the mixture is more turbid than usual, less yeast is used for fermentation, as the turbidity suggests higher cell numbers and fermentation should always take place with a similar number of cells.
  • the propagator is completely emptied, and a conventional CIP process takes place, in which, however, a certain part of the media can always linger in the lower tank area (sump), so that all lines (lower, middle and upper inlet / outlet 21 , 22, 23, the distribution station 24 and the circulation line 25) flows through at a high flow rate and can thus be cleaned.
  • the method according to the invention makes it possible in particular to carry out the process from inoculation to removal of the finished (target) cell culture to be used in one and the same propagator, for example in the propagator 10 shown in FIGS. 3A to 3G propagator 20 shown.
  • the propagation speed can for example be suitably adjusted by a suitable control / regulation of the temperature, circulation speed, selection of the circulation zones in the propagator 20, ventilation rates, etc.
  • nutrients and / or growth-promoting substances can also be added to the medium in the propagator via at least one of the three inlet / outlet lines 21, 22, 23.
  • An application of voltage to a zinc and / or manganese electrode causes its accelerated dissolution and ionization, so that the content of free zinc / manganese in the liquid required for the cells increases, thus increasing the vitality of the culture .
  • a copper electrode on the other hand, copper ions are released, which means that they can react with sulphurous compounds, resulting in a reduced sulfur content in the product.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bereitstellen einer Zellkultur mit den Schrit- ten: Füllen eines Substrats in einen Propagator, Inokulieren des Substrats in dem Propagator mit einer ersten Zellkultur, Propagieren der Zellkultur in dem Propagator, um in dem Propagator eine gewünschte Menge einer zweiten Zellkultur zu erhalten, wobei die zweite Zellkultur einen sedimentierten Anteil und einen schwebenden Anteil aufweist und wahlweises Abziehen eines Teils des sedimentierten Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur aus einem unteren Bereich des Propagators und/oder eines Teils des schwebenden Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur aus einem oberen Bereich des Propagators.

Description

Bereitstellung von Zellkulturen
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung von Zellkulturen einschließlich der Propaga tion der Zellkulturen in einem Propagator und dem Abziehen der propagierten Zellkulturen aus dem Propagator.
Stand der Technik
Zellkulturen, wie beispielsweise Hefe, werden im Allgemeinen in Propagatoren, also Bioreakto ren in Form von Tanks, vermehrt (propagiert). Üblicherweise sind die Propagatoren mit Um wälzvorrichtungen, wie Rührwerken, oder Umpumpleitungen ausgestattet, um das inokulierte Substrat zu durchmischen. Außerdem sind die Propagatoren typischerweise mit Temperierein richtungen ausgestattet, um das Substrat zu sterilisieren und/oder eine gewünschte Temperatur während der Propagation einzustellen. Die Temperiereinrichtungen können Heiz- und/oder Kühlflächen sowie externe Wärmetauscher umfassen.
Ein Propagationsverfahren des Stands der Technik ist in Figur 1 veranschaulicht. Ein gereinig ter Propagator 1 wird über einen Substrateinlass 2 mit einem Substrat, im in der Figur 1A ge zeigten Beispiel von unten, befüllt und mit einer zuvor im Labor angezüchteten reinen Zellkultur, etwa einer zum Bierbrauen Verwendung findenden Hefekultur, beispielsweise mithilfe eines sogenannten Carlsberg-Kolbens 3, inokuliert. Mithilfe einer Umwälzpumpe 4 wird die Reinkultur mit dem Substrat durchmischt, und es kann wahlweise über einen Gaseinlass 5 ein Gas, wie etwa Luft, zur Zellvermehrung eingeleitet werden. Üblicherweise beträgt die Verdünnung der Zellen mit Substrat in diesem Stadium 1 :10 bis 1 :100. Sobald die gewünschte Konzentration von Zellen im Propagator 1 erreicht worden ist (bei Hefen etwa 80 bis 120 Millionen Zellen pro ml), erfolgt eine erneute Substratzugabe (siehe Figur 1 B) zu einer erneuten Verdünnung von üblicherweise 1 :10 bis 1 :100, um eine Produktinhibition (durch Alkohol und CO2) zu verhindern und weiteres Wachstum zu bewirken. Die Gaszufuhr und Umwälzung können dabei konstant aufrechterhalten oder intervallweise eingesetzt werden. Dieser Vorgang wird wiederholt, bis die gewünschte Gesamtmenge an Zellen hergestellt worden ist. Da die verwendeten Rührwerke beziehungsweise Umwälzvorrichtungen spezifisch auf die in den Propagatoren aufgenommene Massen ausgelegt werden müssen, wird typischerweise ein kleinerer Vorpropagator 1 und ein größerer Hauptpropagator 6 verwendet, wobei die aus dem Vorpropagator erhaltene Menge in den Hauptpropagator 6 geleitet wird, in dem der oben be schriebene Vorgang in gleicher weise ausgeführt wird (Figur 1C). Schließlich kann die so erhal tene Zellkultur (das sogenannte Propagat) von unten abgezogen und beispielsweise einem Fermenter zum Ausführen einer Fermentation zugeführt werden.
Die beschriebene herkömmliche mehrstufige Propagation in mehreren Propagato- ren/Assimilatoren verschiedener Größe ist jedoch relative aufwendig. Vor allem erfolgt der Ab zug der propagierten Zellkultur zur Weiterverwendung beispielsweise in einem Fermentations prozess undifferenziert ohne jegliche Berücksichtigung der spezifischen Eigenschaften der ver schiedenartigen Zellen der Zellkultur.
Das Sedimentationsverhalten und das Flokkulationsverhalten der Zellen variiert jedoch stark gemäß der Alters- und Größenverteilung der Zellkultur, deren genetischer Variabilität, Vitalität und Viabilität. Diese Verhalten sind aber für nachfolgende Prozesse, die die erhalten Zellkultur verwenden, wie etwa Fermentationsprozesse, von Bedeutung. So werden beispielsweise bei der Vergärung von Bierwürze je nach gewünschter Biersorte oder Technologie unterschiedliche Sedimentationsverhalten und Flokkulationsverhalten der eingesetzten Hefekulturen gefordert. Dieses findet in dem beschriebenen herkömmlichen Prozess zur Herstellung einer Zellkultur keine hinreichende Berücksichtigung.
Es liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, die Bereitstellung einer Zellkultur zu vereinfachen und hinsichtlich der Differenziertheit der erhaltenen und weiter zu verwendenden Zellkultur zu verbessern.
Beschreibung der Erfindung
Die oben genannte Aufgabe wird durch ein Verfahren zum Bereitstellen einer (Ziel-)Zellkultur gelöst. Dieses Verfahren umfasst die Schritte:
Füllen eines Substrats in einen Propagator (Tank); Inokulieren des Substrats in dem Propagator mit einer ersten Zellkultur (beispielsweise mit einer im Labor hergestellte Reinkultur; beispielsweise einer Hefe zur Bierherstellung);
Propagieren der ersten Zellkultur in dem Propagator, um in dem Propagator eine gewünschte Menge einer zweiten Zellkultur mit einer gewünschten Konzentration (von Zellen zu Substrat) zu erhalten, wobei die zweite Zellkultur einen sedimentierten Anteil und einen schwebenden Anteil (an Zellen) aufweist; und wahlweises Abziehen zumindest eines Teils des sedimentierten Anteils der gewünschten Men ge der zweiten Zellkultur aus einem unteren Bereich des Propagators und/oder zumindest eines Teils des schwebenden Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur aus einem obe ren Bereich des Propagators, wodurch die (Ziel-)Zellkultur (als fertig propagierte erste Zellkultur) bereitgestellt wird.
Hier und im Weiteren wird unter dem Begriff„Propagator“ auch ein Assimilator, sprich ein Tank zur Anzucht und Vermehrung von Zellkulturen umfasst. Die zweite Zellkultur stellt die n-te Ge neration der ersten Zellkultur dar, wobei n größer als zwei ist. Die durch das Verfahren erhalte ne (Ziel-)Zellkultur steht zur weiteren Verwendung, etwa in einem Fermentationsprozess, bereit. Im Gegensatz zum Stand der Technik kann diese zur weiteren Verwendung, etwa einem Fer mentationsprozess, bereitgestellte (Ziel-)Zellkultur in ein und demselben Propagator hergestellt werden. Sie kann jedoch auch prinzipiell einem weiteren Propagator zur weiteren Propagation zugeführt werden.
Das wahlweise Abziehen umfasst die Auswahl davon, ob aus dem oberen Bereich oder dem unteren Bereich des Propagators abgezogen werden soll. Die Auswahl kann über eine entspre chende Verteilstation mit steuerbaren/regelbaren Ventilen, über die ein Zuleiten und Ausleiten von Medien in den Propagator hinein beziehungsweise aus diesen heraus gesteuert/geregelt wird, erfolgen (siehe auch detaillierte Beschreibung unten). Eine solche Auswahl wird im Stand der Technik nicht bereitgestellt. Vorteilhafterweise ermöglicht somit das erfindungsgemäße Ver fahren ein nach Sedimentationsverhalten und Flokkationsverhalten der Zellen der erhaltenen (Ziel-)Zellkultur differenziertes Bereitstellen einer zur weiteren Verwendung zur Verfügung ge stellten (Ziel-)Zellkultur.
In einer Weiterbildung kann das Propagieren die folgenden in der angegebenen Reihenfolge hintereinander ausgeführten Schritte umfassen: 1) ein erstes Propagieren der ersten Zellkultur (des inokulierten Substrats) in dem Pro- pagator, bis eine erste Konzentration von Zellen zu Substrat erreicht wird (und somit ein erstes Propagat erhalten wird);
2) Zugeben weiteren Substrats in den Propagator;
3) ein zweites Propagieren in dem Propagator, bis eine zweite Konzentration von Zellen zu Substrat (die gleich der ersten Konzentration sein kann) erreicht wird (und somit ein zweites Propagat erhalten wird); und
4) Wiederholen der Schritte 2) und 3) bis die gewünschte Menge der zweiten Zellkultur (als fertiges Propagat) mit der gewünschten Konzentration von Zellen zu Substrat erhalten wird.
Wenn bereits nach dem genannten zweiten Propagieren die gewünschte Menge der zweiten Zellkultur mit der gewünschten Konzentration erhalten worden ist, wird kein weiteres Mal wie derholt, d.h. Schritt 4) kann dann gegebenenfalls entfallen.
Das fertige Propagat, aus dem dann wahlweise die (Ziel)Zellkultur für weitere Prozesse abge zogen werden kann, wird hierbei also aus der Startzellkultur iterativ, bevorzugt in ein und dem selben Propagator hergestellt.
Der Propagator kann eine erste (untere) Zu-/Ausleitung mit einer ersten Öffnung in einem, ins besondere unteren, Endbereich des Propagators und eine zweite (mittlere) Zu-/Ausleitung mit einer zweiten Öffnung in einem Bereich des Propagators, der näher als die erste Öffnung an dem Zentrum des Propagators angeordnet ist, aufweisen. Die zweite Öffnung ist also weiter vom Endbereich entfernt als die erste Öffnung und befindet sich insbesondere oberhalb des sich in dem Propagator ausbildenden Zellkultursediments. Das wahlweise Abziehen des Teils des sedimentierten Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur durch die erste Öff nung der ersten Zu-/Ausleitung und das wahlweise Abziehen des Teils des schwebenden An teils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur kann durch die zweite Öffnung der zweiten Zu-/Ausleitung erfolgen.
Insbesondere können die erste und zweite Zu-/Ausleitung parallel zur Längsachse des Propa gators geführt sein, sodass sich die zweite Zu-/Ausleitung weiter in den Propagator erstreckt als die erste Zu-/Ausleitung. Die erste und zweite Zu-/Ausleitung können durch den Boden des Propagators geführt sein, in welchem Fall die zweite Öffnung höher als die erste Öffnung liegt. Beispielsweise kann sich die erste Öffnung im Boden des Propagators befinden. Weiterhin kann die die zweite Zu-/Ausleitung in einer Rohr-in-Rohr-Konfiguration innerhalb der ersten Zu- /Ausleitung, beispielsweise konzentrisch, geführt sein. In der Rohr-in-Rohr-Konfiguration kön nen auch eine oder mehrere weitere Zu-/Ausleitungen mit unterschiedlichen Höhenniveaus ih rer jeweiligen Öffnung geführt sein und dem Abziehen eines Teils der gewünschten Menge, insbesondere eines Teils des schwebenden Anteils, der zweiten Zellkultur dienen.
Der Propagator kann auch eine dritte Zu-/Ausleitung mit einer dritten Öffnung aufweisen, die innerhalb der ersten Zu-/Ausleitung geführt ist und sich weiter in den Propagator erstreckt als die zweite Zu-/Ausleitung, und in diesem Fall kann das wahlweise Abziehen des Teils des schwebenden Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur wahlweise durch die zwei te Öffnung der zweiten Zu-/Ausleitung und/oder die dritte Öffnung der dritten Zu-/Ausleitung erfolgen.
Vor dem Propagieren und/oder während des Propagierens und/oder nach dem Propagieren kann ein zumindest zeitweilig durchgeführtes Umwälzen des Inhalts des Propagators in zumin dest einem Teilbereich des Propagators erfolgen. So kann das Verfahren ein zumindest zeitwei ligem Umwälzen des inokulierten Substrats (vor dem eigentlichen Propagieren) und/oder der propagierenden ersten Zellkultur während des Propagierens in dem Propagator und/oder der zweiten Zellkultur in zumindest einem Teilbereich des Propagators umfassen.
Das zumindest zeitweilige Umwälzen kann hierbei über eine mit dem Propagator verbundene Umwälzleitung (die sich außerhalb des Propagators befindet) und mithilfe einer in der Umwälz leitung angebundenen Umwälzpumpe erfolgen. Insbesondere kann das zumindest zeitweilige Umwälzen über zumindest eine der oben genannten ersten Zu-/Ausleitung, zweiten Zu- /Ausleitung und dritten Zu-/Ausleitung erfolgen. Hierbei kann das zumindest zeitweilige Umwäl zen zumindest zeitweilig, insbesondere nach einer Sedimentation oder für eine Sedimentation der propagierenden ersten Zellkultur in einem unteren Bereich des Propagators, lediglich in einem Bereich zwischen der zweiten Öffnung der zweiten Zu-/Ausleitung (22) und der dritten Öffnung der dritten Zu-/Ausleitung (23) erfolgen, sodass insbesondere das durch die Sedimen tation entstehende oder entstandene Sediment im Wesentlichen nicht umgewälzt wird.
Außerdem kann das Verfahren den Schritt des Zuführens von Zink und/oder Kupfer zu dem Substrat/Propagat während und/oder nach dem Propagieren, insbesondere über eine Zinkano de und/oder Kupferanode (beziehungsweise Elektroden), die in der genannten Umwälzleitung angeordnet ist, umfassen. Zudem können Nährstoffe und/oder wachstumsfördernden Stoffen vor und/oder während des Propagierens gezielt, beispielsweise über eine der oben genannten ersten bis dritten Zu-/Ausleitungen zugegeben werden. Auch kann vor dem Propagieren und/oder während des Propagierens Luft, Sauerstoff, und/oder ein anderes Gas bzw. Gasge misch in den Propagator geleitet werden. Dieses kann über die oben genannte mit dem Propa- gator verbundene Umwälzleitung und eine an diese angebundene Luftzufuhreinrichtung ge schehen.
Weiterhin wird ein Verfahren zum Vergären einer Bierwürze mit dem Schritt des Füllens eines Fermentationstanks mit der Bierwürze und dem Schritt des Lieferns der gemäß einem der oben beschriebenen Verfahren bereitgestellten (Ziel-)Zellkultur in den Fermentationstank bereitge stellt.
Sodann wird ein Nachrüstverfahren zum Nachrüsten eines herkömmlichen Propagators und/oder zuvor anderweitig genutzten Tanks bereitgestellt. Das Verfahren ist ein Verfahren zum Nachrüsten eines Propagators und/oder zuvor anderweitig genutzten Tanks, der an einem Endbereich eine Zu-/Ausleitung aufweist, mit Führen einer ersten weiteren und insbesondere zusätzlich einer zweiten weiteren Zu-/Ausleitung durch die Zu-/Ausleitung in den Propagator und/oder zuvor anderweitig genutzten Tank und Anschließen der Zu-/Ausleitung, der ersten weiteren Zu-/Ausleitung und insbesondere der zweiten weiteren Zu-/Ausleitung über eine Ver teilstation an eine Umwälzleitung, in die eine Umwälzpumpe angebunden ist, mithilfe derer ein Inhalt des Propagators und/oder zuvor anderweitig genutzten Tanks über die Zu-/Ausleitung, und/oder die erste weitere Zu-/Ausleitung und/oder insbesondere die zweite weitere Zu- /Ausleitung umgewälzt werden kann. Die Verteilstation weist hierbei Ventile zum Öffnen und Schließen der verschiedenen Zu-/Ausleitungen auf.
Es wird auch eine Vorrichtung zum Bereitstellen einer Zellkultur, die einen Propagator und eine Steuerungs-/Regelungseinheit umfasst, bereitgestellt, wobei die Steuerungs-/Regelungseinheit dazu ausgebildet ist, das Verfahren gemäß einem der oben beschriebenen Beispiele auszufüh ren.
Weitere Merkmale und beispielhafte Ausführungsformen sowie Vorteile der vorliegenden Erfin dung werden nachfolgend anhand der Zeichnungen näher erläutert. Es versteht sich, dass die Ausführungsformen nicht den Bereich der vorliegenden Erfindung erschöpfen. Es versteht sich weiterhin, dass einige oder sämtliche der im weiteren beschriebenen Merkmale auch auf ande re Weise miteinander kombiniert werden können.
Figur 1 zeigt die Herstellung einer Zellkultur gemäß dem Stand der Technik. Figur 2 zeigt einen Propagator, wie er in einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver fahrens Verwendung finden kann.
Figuren 3A bis 3G dienen der Veranschaulichung einer Ausführungsform des erfindungsgemä ßen Verfahrens zum Bereitstellen einer Zellkultur.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bereitstellen einer (Ziel-)Zellkultur, in dem ein Propagator/Assimilator (Tank) zum Propagieren (Vermehren, Züchten) einer Zellkultur Ver wendung findet. Ein Beispiel für eine Vorrichtung mit einem solchen Propagator 10 ist in Figur 2 gezeigt. Der Propagator/Assimilator 10 weist einen sich konisch verjüngenden unteren Bereich
11 auf, in dem wahlweise ein Anteil einer propagierten Zellkultur sedimentieren kann. Eine Zu- /Ausleitung 12 ist durch die Spitze des Konus geführt und mit einer Umwälzleitung 13 verbun den, in welche eine Umwälzpumpe 14 zum Umwälzen des Inhalts des Propagators 10 einge bunden ist. Die Umwälzpumpe 14 kann in der Geschwindigkeit regelbar und beispielsweise frequenzgesteuert ausgebildet sein. Weiterhin ist eine Luftzufuhreinrichtung 15 an die Umwälz leitung 13 angebunden, um Luft (oder ein anderes Gas) in das Innere des Propagators 10 leiten zu können. Die Luftzufuhreinrichtung 15 ermöglicht oder beschleunigt das Wachstum der Zellen in dem Propagator 10. In der Umwälzleitung 13 kann eine Zinkanode zur Erhöhung des Zinkge halts zum Verbessern des Zellenwachstums und/oder eine Kupferanode zur Entschwefelung angeordnet sein.
Außerdem weist der Propagator 10 eine zur Umwälzleitung 13 alternativ vorgesehene Zu- /Ausleitung 16 auf, die eine gegenüber der Öffnung der durch die Spitze des Konus geführten Zu-/Ausleitung 12, die in der Spitze selbst angeordnet sein kann, höher und insbesondere oberhalb des sich in dem Propagator ausbildenden Zellkultursediments liegt. In dem in Figur 2 gezeigten Beispiel endet die weitere Zu-/Ausleitung 16 seitlich in dem Tank. Alternativ kann die weitere Zu-/Ausleitung 16 innerhalb der durch die Spitze des Konus geführten Zu-/Ausleitung
12 verlaufen und weiter oberhalb als diese in den Propagator 10 münden (siehe auch die Be schreibung der Figuren 3A bis 3G unten). Der Propagator 10 kann außerdem eine Temperier einrichtung, insbesondere zum Kühlen, aufweisen.
Erfindungsgemäß wird eine (Ziel-)Zellkultur durch wahlweises Abziehen der in dem Propagator 10 hergestellten Zellkultur durch die Zu-/Ausleitung 12 oder die Zu-/Ausleitung 16 bereitgestellt. So können einerseits ein Anteil der Zellkultur, der sich durch sich ablagernde Zellen auszeich net, und anderseits ein Anteil der Zellkultur, der sich durch schwebende Zellen auszeichnet, zur weiteren Verwendung, beispielsweise in einem Fermentationsprozess, gewonnen werden. Selbstverständlich kann auch eine Mischung dieser Zellen unterschiedlichen Sedimentations und Schwebe beziehungsweise Flokkolationsverhaltens mit einem gewünschten Mischungs verhältnis gewonnen werden. Da vor der Abfüllung des Endproduktes häufig eine Abscheidung (Filtration) der Zellenerfolgt, bzw. die Gärung bei einem zu raschen Absetzen stark verlangsamt wird, ist das Flokkulations- und Sedimentationsverhalten ein wichtiger Qualitätsparameter einer für die Fermentation eingesetzten Zellkultur.
Insbesondere kann der Propagator 10 zur Bierherstellung Verwendung finden. Für bestimmte Biertypen und die darauf abgestimmte Technologie wird beispielsweise ein„staubiger Charak ter“ (d.h. ein möglichst hoher Anteil an Zellen in Schwebe) der Population bevorzugt, um eine homogene Suspension beispielsweise mithilfe einer Zentrifugation zu klären und Bierverluste durch die klassische Hefeernte von unten zu reduzieren. Bei anderen Biertypen hingegen wird eine möglichst rasche und vollständige Sedimentation der Kultur nach der Gärung angestrebt, um beispielsweise die Hefe von unten möglichst vollständig aus dem Tank ernten zu können und dadurch auch die nach der Lagerung anschließende Kieselgur- oder Membranfiltration zu vereinfachen.
Das Absetzverhalten der Zellen wird genetisch von den eingesetzten Stämmen, der Substrat zusammensetzung, der Zellgröße, der Altersverteilung, sowie der Vitalität und Viabilität der Kul tur beeinflusst, weshalb die Anzahl der Wiederverwendungen und Mischungsverhältnisse (Pro pagationshefen zu Erntehefen) aufeinander abgestimmt werden sollten. Weiterhin sollten natür lich möglichst viele von den denjenigen Hefezellen zum Anstellen der Bierwürze verwendet werden, die die gewünschten Absetzeigenschaften aufweisen. Diese oben genannten Bedin gungen können in dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung beispielsweise der in der Figur 2 gezeigten Vorrichtung berücksichtigt werden, wie es im Stand der Technik bisher nicht möglich war.
Eine Ausführungsform des erfindungsmäßen Verfahrens zum Bereitstellen einer (Ziel)Zellkultur, beispielsweise für einen Fermentationsprozess wie die Vergärung von Bierwürze, wird im Wei teren mit Bezug auf die Figuren 3A bis 3G beschrieben.
In dem in den Figuren 3A bis 3G veranschaulichten Verfahren findet eine Vorrichtung mit einem Propagator 20 Verwendung, der sich dadurch auszeichnet, dass er mehrere, in diesem Fall drei, Zu-/Ausleitungen (Zu-/Abläufe) 21 , 22 und 23 aufweist. Die drei Zu-/Ausleitungen 21 , 22 und 23 werden in einer Rohr-in-Rohr-Konfiguration bereitgestellt, in der sich die mittlere Zu- /Ausleitung 22 und die obere Zu-/Ausleitung 23 (beispielsweise konzentrisch) durch die untere Zu-/Ausleitung 21 erstrecken. Die untere Zu-/Ausleitung 21 weist eine Öffnung unten im Propa- gator 20, beispielsweise in der Konusspitze, auf, die mittlere Zu-/Ausleitung 22 weist optional einen Verdrängungskörper geeigneter Geometrie (an der mittleren Zu-/Ausleitung 22 beispiels weise in Doppelkonusform angebracht) und eine Öffnung oberhalb derjenigen der unteren Zu- /Ausleitung 21 auf, und die obere Zu-/Ausleitung 23 weist eine Öffnung oberhalb derjenigen der mittleren Zu-/Ausleitung 22 auf. Die mittlere Zu-/Ausleitung 22 erstreckt sich also weiter in den Propagator 20 hinein als die untere Zu-/Ausleitung 21 , und die obere Zu-/Ausleitung 23 er streckt sich also weiter in den Propagator 20 hinein als die mittlere Zu-/Ausleitung 22. In ande ren Ausführungsformen können Zu-/Ausleitungen von oben oder seitlich in den Propagator rei chen.
Der Zu-/Ablauf von Medien in den Propagator 20 hinein beziehungsweise aus dem Propagator 20 heraus wird über eine Verteilstation 24 geregelt beziehungsweise gesteuert. Hierbei wird der Zu-/Ablauf über die untere Zu-/Ausleitung 21 über ein Ventilsystem 24a der Verteilstation 24, der Zu-/Ablauf über die mittlere Zu-/Ausleitung 22 über ein Ventilsystem 24b der Verteilstation 24 und der Zu-/Ablauf über die obere Zu-/Ausleitung 23 über ein Ventilsystem 24c der Verteil station 24 geregelt beziehungsweise gesteuert. Der Propagator 20 kann außerdem eine Tem periereinrichtung, insbesondere zum Kühlen, aufweisen, wobei ein externer Wärmetauscher zum Erwärmen und/oder Kühlen in der Umwälzleitung 25 ebenfalls zusätzlich oder alternativ vorgesehen werden kann.
Die Verteilstation 24 verbindet die Zu-/Ausleitungen 21 , 22 und 23 mit einer Umwälzleitung 25, in die eine Umwälzpumpe 26 eingebunden ist. In der Umwälzleitung 25 kann außerdem eine Zinkanode (Elektrode) zur bedarfsorientierten Erhöhung des Zinkgehalts und/oder eine Kupfer anode (Elektrode) zur bedarfsorientierten Entschwefelung angeordnet sein. Die Umwälzpumpe 26 kann in der Geschwindigkeit regelbar und beispielsweise frequenzgesteuert ausgebildet sein. Weiterhin sind Probeentnahmestationen 27, eine Messtechnikstation 28 und eine Rege- lung-/Steuerungsstation 29 in der Umwälzleitung 25 vorgesehen beziehungsweise an diese angebunden. Die Messtechnikstation 28 kann beispielsweise zur Bestimmung eines Extraktge halts (einer Konzentration), einer Zellzahl (beispielsweise mithilfe einer Trübungsmessung oder kapazitativen Messung), eines pH-Werts, eines Füllstands, einer Temperatur, eines Leitwerts, einer Sauerstoff/CÖ2 - Messung, etc. dienen.
Ein Substrat wird über eine ein Ventil 30 aufweisende Prozessanbindung und die untere Zu- /Ausleitung 21 in den Propagator 20 eingeleitet.
Das Substrat kann eine Bierwürze ohne Fremdorganismen sein, idealerweise ausreichend mit Nähr- und Wuchsstoffen sowie mit verwertbaren Zuckern ausgestattet sein, eine Temperatur von 10-28°C bei der Inokulation und zwischen 6-20°P Stammwürze haben. Bei Mangel an Nähr- und Wuchsstoffen können diese wahlweise dem Substrat zugeführt werden, wobei erfin dungsgemäß eine Zinkanreicherung und/oder Kupferanreicherung bedarfsorientiert auch mittels Spannungsanlegung auf entsprechende Elektroden erfolgen kann.
Dabei können sämtliche Ventile 24a, 24b und 24c der Verteilstation 24 geöffnet sein, um die Strömungsgeschwindigkeit des eingeleiteten Substrats gering zu halten (siehe Figur 3A). Hier und im Weiteren wird ein geöffneter Ventilstand durch ein ausgefülltes Ventilsymbol und ein geschlossener Ventilstand durch ein leeres Ventilsymbol angezeigt. Strömungsrichtungen der Medien sind hier und im Weiteren durch Pfeile angezeigt. In dem in Figur 3A gezeigten Beispiel wird Substrat bis zu einem Pegel eingeleitet, der oberhalb des Höhenniveaus der Öffnung der mittleren Zu-/Ausleitung 22 liegt. In anderen Beispielen kann der Pegel darunter liegen.
Weiterhin finden sich in der Umwälzleitung 25 beziehungsweise daran angebunden eine Luftzu fuhreinrichtung 31 , eine Inokulationsstelle 32 zur Zuführung einer Start-Zellkultur und ein Ventil 33, das eine Leitung, die mit einem Gully verbunden sein kann, zum Verwerfen eines Mediums öffnen kann.
Um eine erste Propagation der Zellkultur zu starten, wird, wie es in Figur 3B gezeigt ist, das Substrat mit dem Kulturorganismus (Startzellkultur), wie beispielsweise einer Start- Hefezellenkultur, über die Inokulationsstelle 32 und den unteren Zu-/Ablauf 21 beimpft und das so erhaltene Medium, zumindest in zeitlichen Intervallen, mithilfe der Umwälzpumpe 26 umge wälzt und über die Luftzufuhreinrichtung 31 zum Ermöglichen des aeroben Zellwachstums zu mindest zeitweise belüftet.
Der optionale Verdrängungskörper dient beim Umwälzvorgang im Propagator 20 als Strö mungsbrecher und Strömungslenker der Kontrolle der Strömung des Mediums. Das Impfen kann mit einem sogenannten Carlsbergkolben 34 und/oder mit einer alternativ behandelten Kul tur (z.B. sprühgetrockneten, abgenutschten, fest- oder flüssigangereicherten und/oder zuvor gefrorenen Kultur) erfolgen. Falls gewünscht können unterschiedliche Ventile 24a, 24b, 24c der Druckseite der Umwälzpumpe und somit Zu-/Abläufe 21 , 22, 23 angewählt werden, um eine ideale Durchmischung auch bei nicht bedecktem mittleren Zu-/Ablauf 22 und/oder oberen Zu- /Ablauf 23 zu gewährleisten.
Wenn im Verlauf der ersten Propagation in dem Propagator 20 eine gewünschte Konzentration von Zellen der Zellkultur, etwa 80 bis 120 Millionen Hefezellen pro ml Substrat, erreicht worden ist, wird weiteres Substrat über die untere Zu-/Ausleitung 21 in den Propagator 20 geleitet (sie he Figur 3C), um beispielsweise eine Verdünnung von 1 :10 bis 1 :100 der Zellkultur mit Substrat zu erreichen, sodass eine Wachstumsinhibierung (durch beispielsweise einen erhöhten Alkohol- und CO2 Gehalt und einen Mangel an Wuchsstoffen) vermieden werden kann. Wiederum erfolgt ein Umwälzen und Belüften. Die Strömungsrichtung kann durch eine geeignete Steue rung/Regelung der Ventile 24a, 24b und 24c der Verteilstation 24 gewählt werden.
Die in den Figuren 3B und 3C gezeigte Prozessfolge kann solange wiederholt werden, bis die gewünschte Menge an Zellkultur mit der gewünschten Konzentration an Zellen in dem Substrat in dem Propagator 20 hergestellt worden ist. In dem in Figur 3D gezeigten Verfahrensstand wird beispielhaft eine Umwälzung gezeigt, bei der die obere Zu-/Ausleitung 23 zum Einströmen des umgewälzten Mediums verwendet und somit der gesamte Behälterinhalt homogenisiert wird.
Ab einem gewissen Zeitpunkt sollte zumindest der untere Bereich des Propagators 20 nicht mehr aktiv durchströmt werden, also keine Umwälzung des Mediums in diesem unteren Bereich erfolgen, sodass sich die Zellen absetzen und anreichern und damit eine Sediment S bilden können, wie es in Figur 3E gezeigt ist. Wenn es gewünscht ist, kann jedoch noch eine Umwäl zung zwischen den Höhenniveaus der Öffnungen der mittleren Zu-/Ausleitung 22 und oberen Zu-/Ausleitung 23 erfolgen, um dort weiter zu homogenisieren, wie es ebenfalls in Figur 3E ge zeigt ist. In dem in Figur 3E gezeigten Verfahrensstand wird beispielhaft eine Umwälzung ge zeigt, bei der die obere Zu-/Ausleitung 23 zum Einströmen des umgewälzten Mediums verwen det wird.
Wenn die gewünschte Menge an Zellkultur mit der gewünschten Konzentration an Zellen in dem Substrat in dem Propagator 20 hergestellt worden ist, kann ein wahlweiser Abzug eines Anteils dieser Menge durch eine oder mehrere der Zu-/Ausleitungen 21 , 22 und 23 erfolgen. So können schwebende Zellen aus einem oberen Bereich des Propagators 20 über die obere Zu- /Ausleitung 23 und/oder die mittlere Zu-/Ausleitung 23 abgezogen werden, wie es in Figur 3F gezeigt ist. Der Abzug erfolgt über das Ventil 30 der Prozessanbindung. Wünschenswerter weise verbleibt ein kleiner Teil (etwa 1 bis 10%) der angereicherten Kultur aus dem Konus im Tank, der dann wieder der Inokulation der nachfolgenden Charge dient.
Die so gewonnene (Ziel-)Zellkultur kann in einem weiteren Prozess, beispielsweise einer Fer mentation, Verwendung finden. Beispielsweise kann eine so gewonnene (Ziel-)Hefezellkultur zum Vergären einer Bierwürze im Rahmen der Herstellung einer Biersorte dienen, für die ein hoher Anteil von Hefezellen mit starker Neigung zum Schweben gewünscht ist.
Für einen der Propagation nachfolgenden Prozess, in dem wünschenswerterweise Zellen mit starker Neigung zur Sedimentation Verwendung finden sollen, wird, wie es in Figur 3G gezeigt ist, ein Abzug der propagierten Zellkultur von unten über die untere Zu-/Ausleitung 21 erfolgen. Hierbei sollte ein vergleichsweise größeres Restvolumen von etwa 10 bis 20% für die nachfol gende Charge zurückgehalten werden. Die durch Abziehen von unten erhaltene (Ziel-)Zellkultur weist nicht nur eine verstärkte Neigung zur Sedimentation auf, sondern auch eine höhere Kon zentration als diejenige, die durch Abziehen über die obere Zu-/Ausleitung 23 und/oder die mitt lere Zu-/Ausleitung 23 erhalten wird. So können also auch wahlweise (Ziel-)Zellkultur unter schiedlicher Konzentration weiteren Prozessen bereitgestellt werden.
Beim Transfer der erhaltenen (Ziel-)Zellkultur zu einem weiteren Prozess, beispielsweise zum Anstellen von Bierwürze mit Hefezellen, kann die reale Hefegabemenge über die Transferzeit ermittelt werden, indem auch Schwankungen in der Zellzahl (gemessen beispielsweise über die Trübung) in Bezug zum Massentransfer berücksichtigt werden. Wenn das Gemisch eine stärke re Trübung als üblich aufweist wird weniger Hefe zur Fermentation verwendet, da die Trübung auf höhere Zellzahlen schließen lässt und die Gärung immer mit ähnlich vielen Zellen erfolgen sollte.
Zur Reinigung wird der Propagator vollständig entleert, und es erfolgt ein herkömmlicher CIP- Prozess, bei dem allerdings immer ein gewisser Teil der Medien im unteren Tankbereich ver weilen kann (Sumpf), damit alle Leitungswege (unterer, mittlerer und oberer Zu-/Ablauf 21 , 22, 23, die Verteilstation 24 und die Umwälzleitung 25) mit hoher Strömungsgeschwindigkeit durch strömt und somit gereinigt werden können.
Wie oben beschrieben wird es durch das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere ermög licht, den Prozess von der Beimpfung bis zum Abziehen der fertiggestellten weiterzuverwen denden (Ziel-)Zellkultur in ein und demselben Propagator, beispielsweise in dem in Figur 2 ge zeigten Propagator 10 oder den in den Figuren 3A bis 3G gezeigten Propagator 20, auszufüh ren. Die Propagationsgeschwindigkeit kann beispielsweise durch eine geeignete Steue rung/Regelung der Temperatur, Umwälzgeschwindigkeit, Wahl der Umwälzzonen im Propaga tor 20, Belüftungsraten, etc. geeignet eingestellt werden. Vor oder während der Propagation können dem Medium in dem Propagator noch Nährstoffe und/oder wachstumsfördernde Stoffe über zumindest eine der drei Zu-/Ausleitungen 21 , 22, 23 zugegeben werden.
Eine Spannungsanlegung an eine, beispielsweise in der Umwälzleitung 13 befindliche, Zink- und/oder Manganelektrode bewirkt deren beschleunigte Auflösung und Ionisierung, so dass der Gehalt an für die Zellen benötigtem freien Zink/Mangan in der Flüssigkeit ansteigt, und so eine Vitalitätssteigerung der Kultur resultiert. Bei einer Kupferelektrode werden hingegen Kupferionen ausgelöst, wodurch diese mit schwefli gen Verbindungen reagieren können und sich dadurch ein verringerter Schwefelgehalt im Pro dukt ergibt.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Bereitstellen einer Zellkultur mit den Schritten:
Füllen eines Substrats in einen Propagator (10, 20);
Inokulieren des Substrats in dem Propagator (10, 20) mit einer ersten Zellkultur;
Propagieren der ersten Zellkultur in dem Propagator (10, 20), um in dem Propagator (10, 20) eine gewünschte Menge einer zweiten Zellkultur mit einer gewünschten Konzentrati on zu erhalten, wobei die zweite Zellkultur einen sedimentierten Anteil und einen schwe benden Anteil aufweist; und wahlweises Abziehen zumindest eines Teils des sedimentierten Anteils der gewünsch ten Menge der zweiten Zellkultur aus einem unteren Bereich des Propagators (10, 20) und/oder zumindest eines Teils des schwebenden Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur aus einem oberen Bereich des Propagators (10, 20).
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , in dem das Propagieren die folgenden in der angegebe nen Reihenfolge hintereinander ausgeführten Schritte umfasst:
1) ein erstes Propagieren der ersten Zellkultur in dem Propagator (10, 20), bis eine ers te Konzentration von Zellen zu Substrat erreicht wird;
2) Zugeben weiteren Substrats in den Propagator (10, 20);
3) ein zweites Propagieren in dem Propagator (10, 20), bis eine zweite Konzentration von Zellen zu Substrat erreicht wird, die insbesondere der ersten Konzentration gleich sein kann; und
4) Wiederholen der Schritte 2) und 3) bis die gewünschte Menge der zweiten Zellkultur mit der gewünschten Konzentration von Zellen zu Substrat erhalten wird.
3. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, in dem der Propagator (10, 20) eine erste Zu-/Ausleitung (21) mit einer ersten Öffnung in einem, insbesondere unteren, Endbereich des Propagators (10, 20) und eine zweite Zu- /Ausleitung (22) mit einer zweiten Öffnung in einem Bereich des Propagators (10, 20), die weiter als die erste Öffnung von dem, insbesondere unteren, Endbereich des Propa gators (10, 20) entfernt angeordnet ist, aufweist, und wobei das wahlweise Abziehen des Teils des sedimentierten Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur durch die erste Öffnung der ersten Zu-/Ausleitung (21) und das wahlweise Abziehen des Teils des schwebenden Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur durch die zweite Öffnung der zweiten Zu-/Ausleitung (22) erfolgt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, in dem die zweite Zu-/Ausleitung (22) innerhalb der ers ten Zu-/Ausleitung (21) geführt ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der Propagator (20) eine dritte Zu-/Ausleitung (23) mit einer dritten Öffnung aufweist, die innerhalb der ersten Zu-/Ausleitung (21) geführt ist und sich weiter in den Propagator (10, 20) erstreckt als die zweite Zu-/Ausleitung (22), und das wahlweise Abziehen des Teils des schwebenden Anteils der gewünschten Menge der zweiten Zellkultur wahlweise auch durch die dritte Öffnung der dritten Zu-/Ausleitung (23) oder statt durch die zweite Öffnung der zweiten Zu-/Ausleitung (22) durch die dritte Öffnung der dritten Zu-/Ausleitung (23) erfolgt.
6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin mit zumindest zeit weiligem Umwälzen des inokulierten Substrats und/oder der propagierenden ersten Zell kultur und/oder der zweiten Zellkultur in zumindest einem Teilbereich des Propagators (10, 20).
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, in dem das zumindest zeitweilige Umwälzen über eine mit dem Propagator (10, 20) verbundene Umwälzleitung (13, 25) und mithilfe einer in der Umwälzleitung angebundenen Umwälzpumpe (14, 26) erfolgt.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das zumindest zeitweilige Umwälzen über zumin dest eine der ersten Zu-/Ausleitung (21), zweiten Zu-/Ausleitung (22) und dritten Zu- /Ausleitung (23) erfolgt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, in dem das zumindest zeitweilige Umwälzen zumindest zeitweilig, insbesondere nach einer Sedimentation oder für eine Sedimentation der pro pagierenden Zellkultur in einem unteren Bereich des Propagators (10, 20), lediglich in einem Bereich zwischen der zweiten Öffnung der zweiten Zu-/Ausleitung (22) und der dritten Öffnung der dritten Zu-/Ausleitung (23) erfolgt.
10. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin mit Zuführen von Zink, Mangan und/oder Kupfer zu dem Substrat während und/oder nach dem Propagie ren, insbesondere über eine Zink-/Mangananode oder -elektrode und/oder Kupferanode oder -elektrode, die insbesondere in der Umwälzleitung (13, 25) angeordnet ist.
11. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin mit Zuführen von nähr- und/oder wachstumsfördernden Stoffen in den Propagator (10, 20) vor und/oder während des Propagierens.
12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin mit Zuführen von Luft, Sauerstoff und/oder einem anderen Gas/Gasgemisch in den Propagator (10, 20) vor und/oder während des Propagierens mithilfe einer in eine Umwälzleitung, die mit dem Propagator (10, 20) verbunden ist, angebundenen Gas-/Luftzufuhreinrichtung (31).
13. Verfahren zum Vergären einer Bierwürze, mit Füllen eines Fermentationstanks mit der Bierwürze und Liefern der gemäß einem der Verfahren gemäß einem der vorhergehen den Ansprüche bereitgestellten Zellkultur in den Fermentationstank.
14. Verfahren zum Nachrüsten eines Propagators und/oder zuvor anderweitig genutzten Tanks, der an einem Endbereich eine Zu-/Ausleitung aufweist, mit Führen einer ersten weiteren und insbesondere zusätzlich einer zweiten weiteren Zu-/Ausleitung durch die Zu-/Ausleitung in den Propagator und/oder zuvor anderweitig genutzten Tank und An schließen der Zu-/Ausleitung, der ersten weiteren Zu-/Ausleitung und insbesondere der zweiten weiteren Zu-/Ausleitung über eine Verteilstation an eine Umwälzleitung, in die eine Umwälzpumpe angebunden ist, mithilfe derer ein Inhalt des Propagators und/oder zuvor anderweitig genutzten Tanks über die Zu-/Ausleitung, und/oder die erste weitere Zu-/Ausleitung und/oder insbesondere die zweite weitere Zu-/Ausleitung umgewälzt werden kann.
15. Vorrichtung zum Bereitstellen einer Zellkultur, die einen Propagator (10, 20) und eine Steuerungs-/Regelungseinheit umfasst, wobei die Steuerungs-/Regelungseinheit dazu ausgebildet ist, das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 auszuführen.
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Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4308459C2 (de) * 1992-12-20 1994-12-15 Puth Hans Edgar Verfahren und Vorrichtung zum Vermehren von Hefe
DE4331409C1 (de) * 1993-09-15 1994-11-10 Bam Apparate Und Maschinenbau Verfahren und Anlage zur Vermehrung von Bierhefe
DE19828688B4 (de) * 1998-01-20 2004-07-15 Anton Steinecker Maschinenfabrik Gmbh Gärprozeß-Steuerung und Gärgefäß
DE102009026366A1 (de) * 2009-08-12 2011-02-17 Technische Universität München Fermentationsbehälter sowie Verfahren und Vorrichtung zur Fermentation
WO2015018423A1 (en) * 2013-08-09 2015-02-12 Inbicon A/S Improved device for discharging pretreated biomass from higher to lower pressure regions
DE102015220315A1 (de) * 2015-10-19 2017-04-20 Krones Ag Fermentationstank und Verfahren
DE102015220313A1 (de) * 2015-10-19 2017-04-20 Krones Ag Fermentationstank mit Verdrängungskörper, insbesondere zur Bierherstellung
DE102015221491A1 (de) * 2015-11-03 2017-05-04 Krones Ag Verfahren und Vorrichtung zum Überwachen eines Fermentationsprozesses
DE102016225881A1 (de) * 2016-12-21 2018-06-21 Krones Ag Verfahren und Vorrichtung zur Heißtrubabscheidung
CN109810898A (zh) * 2019-03-27 2019-05-28 厦门鹭港兆康生物科技有限公司 一种细胞悬浮培养生物反应器及细胞悬浮培养的方法

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