CN109810898A - 一种细胞悬浮培养生物反应器及细胞悬浮培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细胞悬浮培养生物反应器及细胞悬浮培养的方法，所述细胞悬浮培养生物反应器包括柔性材质的罐体，所述罐体包括第一腔体和第二腔体，所述第一腔体为柱体或台体，所述第二腔体为倒椎体，所述第一腔体上设有接种口、培养基入口和出气口，所述第二腔体上设有进气口，安装在所述第二腔体内的空气分布装置与所述进气口连接，所述进气口连接通气装置，使得无菌气体经所述通气装置进入所述空气分布装置后，分散成均匀的气泡。本发明通过所述细胞悬浮培养生物反应器，在较小通气比条件下，实现细胞悬浮培养的最佳效果，且体系氧传质系数适宜，剪切力适宜，空气成本低，产品收率高，适合细胞的大规模标准化培养的产业化应用。

Description

一种细胞悬浮培养生物反应器及细胞悬浮培养的方法

技术领域

本发明涉及细胞培养设备领域，尤其是一种细胞悬浮培养生物反应器及细胞悬浮培养的方法。

背景技术

生物反应器是规模化进行细胞悬浮培养的关键设备，以植物细胞培养为例，由于植物来源的天然产品的获取途径现在主要是依靠提取野生植物资源或人工种植资源，然而大部分野生植物资源由于过度采挖而面临资源枯竭的难题。人工种植资源在一定程度上缓解了植物来源的天然产物产量不足问题，但是人工种植来源的产品常存在含量不稳定、重金属超标、农残超标等问题，同时人工种植易造成林地、耕地的占用，环境的破坏问题。因此采用植物细胞悬浮技术，结合生物反应器技术进行天然活性产物的工业化生产，是解决植物来源的天然产物资源短缺的重要途径之一。

目前植物细胞悬浮培养生物反应器是在传统微生物培养生物反应器的基础上发展而来，主要类型有机械搅拌式、气升式、鼓泡式、转鼓式和固定床等。以上生物反应器的构型均为圆柱体结构，研究中发现植物细胞悬浮培养时圆柱体构型生物反应器底部容易沉积较多细胞，尤其植物细胞悬浮培养前期及后期细胞容易出现聚集效应，导致沉积现象严重，直接影响细胞的生长繁殖及次级代谢产物合成，造成细胞单位基质收率和目标产物含量低的问题。虽然搅拌桨在一定程度上可以改善沉积，但是聚集的细胞团对剪切力的敏感度比单细胞高的多，使得大量细胞在悬浮培养期间死亡。气升式和鼓泡式生物反应器为了使聚集的细胞团悬浮，需要足够大的通气比，然而通气比增大的同时气泡破裂造成的剪切力也大大增加，同时伴随泡沫增加，二氧化碳过度逃逸，不利于植物细胞的生长及代谢。固定化培养在一定程度上降低了植物细胞对剪切力的敏感和细胞易分化现象，但是天然产物多属于胞内产物，限制其推广应用。

一次性波浪式生物反应器是近十几年发展起来的较适合动植物细胞悬浮培养的生物反应器，其主要是借助摇动平台的造浪作用增加气液面积达到混合及氧供应的。但是研究中发现，一次性波浪式生物反应器针对易聚集的、颗粒较大的细胞团的悬浮培养效果较差，且装料系数一般只有50％。中国发明专利CN103224882A公开了带有曝气装置的一次性波浪式生物反应器，但是对于易聚集的植物细胞团而言，增加曝气装置的效果并不理想，表现为只在曝气装置的周围很窄范围内有一定的推动作用，若加大通气量，则剪切力和泡沫问题也加大，不利于植物细胞生长繁殖，因此底部平面面积过大对于植物细胞悬浮培养是极不利的。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有的细胞培养过程中，细胞沉积问题和通气造成剪切力过大的问题，提供一种细胞悬浮培养生物反应器及细胞悬浮培养的方法。

本发明所述细胞悬浮培养生物反应器，包括柔性材质一体成型的罐体，优选聚酰胺、聚乙烯、乙烯-醋酸乙烯共聚物、乙烯-乙烯醇共聚物等，较现有技术的硬材质而言，柔性材质的罐体易于批量化组装，运输，辐照，接种培养，方便规模工业化生产。另一方面，细胞培养期间容易粘附在罐体侧壁上，采用柔性材料可以按压袋体，粘附细胞易于脱壁重新返回液体中，可以降低前期接种量，同时提升发酵液细胞均一性。

本发明所述细胞悬浮培养生物反应器，由第一腔体和第二腔体组成罐体，其中第一腔体承担主要的细胞培养功能，第二腔体中也容置有部分细胞，其关键在于，通过第二腔体上的倾斜面设计，结合通气干扰，解决现有技术中植物细胞培养因细胞聚集成团而形成沉淀平面的问题。

优选地，第二腔体至少1个倾斜面的倾角为30-70度，更优选为倾角45-60度，此时可以使整个培养周期内细胞处于良好悬浮状态，利于细胞生长繁殖，提高单位基质细胞收率，降低生产成本。

本发明还提供利用所述细胞悬浮培养生物反应器，进行细胞培养的方法，利用所述空气分布装置，进行孔径切换，将通过所述进气口进入所述罐体的气流分散成大小可调节的气泡，可以在培养期间通过微调通气比，配合空气分布装置的孔径切换，通气比控制在0.5vvm以内，优选为0.24-0.36vvm，实现最佳悬浮培养效果，且体系氧传质系数适宜，剪切力适宜。

通气比，单位vvm为英文缩写，全式为air volume/culture volume/min，是指每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值。培养后期，为了满足溶氧量需求，通常需要提高通气比。对于一些细胞而言，当通气比超过0.5vvm以后，气流扰动产生的剪切应力对细胞繁殖产生不利影响，尤其是当通气比较大时，再大幅提升通气比甚至会造成细胞死亡。

空气分布装置的材质优选为塑料、硅胶、不锈钢或钛合金材质中的一种或者几种的组合。

具体方案如下：

一种细胞悬浮培养生物反应器，包括柔性材质的罐体，所述罐体包括相贯通的第一腔体和第二腔体，所述第一腔体位于所述第二腔体上方，所述第一腔体为柱体或台体，所述第二腔体为倒椎体，所述第一腔体上设有接种口、培养基入口和出气口，所述第二腔体上设有进气口，安装在所述第二腔体内的空气分布装置与所述进气口连接，所述进气口连接通气装置，使得无菌气体经所述通气装置进入所述空气分布装置后，分散成均匀的气泡。

进一步的，所述柔性材质为聚酰胺、聚乙烯、乙烯-醋酸乙烯共聚物、乙烯-乙烯醇共聚物中至少一种。

进一步的，所述出气口位于所述第一腔体顶部封盖上，所述出气口通过第一管路连接呼吸器，所述第一管路上设置第一空气调节阀。

进一步的，所述第二腔体至少1个倾斜面的倾角为30-70度，优选为45-60度；所述进气口位于所述第二腔体的所述倾斜面上。

进一步的，所述通气装置包括流量计，所述进气口通过第二管路连接所述流量计，所述第二管路上设置第二空气调节阀。

进一步的，所述空气分布装置包括空气容置箱体，所述空气容置箱体底部密封，所述空气容置箱体的顶部封盖上设有多个均匀分布的孔洞，且所述孔洞至少具有2种不同孔径R1、R2，孔径R1＜孔径R2，所述空气容置箱体的封盖中心安装可旋转的挡板，所述空气容置箱体的侧壁连接所述进气口；

任选的，所述空气分布装置在所述第二腔体内的安装密度为20-60个/平米，优选35-45个/平米。

本发明还提供一种细胞悬浮培养的方法，采用所述细胞悬浮培养生物反应器，包括以下步骤：

步骤1：调整空气分布装置中挡板的位置，使挡板遮盖住孔径为R1的孔洞，露出孔径为R2的孔洞；

步骤2：将待培养的细胞种子通过接种口无菌接入事先经过熏蒸灭菌或者辐照灭菌的细胞悬浮培养生物反应器内，同时将灭菌合格的培养基通过培养基入口接入细胞悬浮培养生物反应器内，之后将无菌空气通过进气口输入细胞悬浮培养生物反应器，无菌空气通过出气口排出，调整细胞悬浮培养生物反应器内的压力，置于恒温室恒温培养，并通过通气装置控制通气比；

步骤3：培养前期保持挡板的位置不变，以孔径为R2的孔洞通气，随着细胞培养密度增加，微调通气比，并逐步调整挡板的位置，改变为以孔径为R1的孔洞通气；培养结束后，所有发酵液离心过滤，将滤饼干燥，收获得成品。

进一步的，所述步骤2中恒温培养的温度为20-30℃，通气比为0.12-0.24vvm；

任选的，所述步骤3中微调通气比至0.24-0.36vvm。

进一步的，所述步骤3中，根据肉眼观察细胞浓度变化，或者通过检测细胞悬浮培养生物反应器内的相对空气饱和度及二氧化碳量，逐步调整挡板的位置，改变为以孔径为R1的孔洞通气。

本发明还保护所述细胞悬浮培养生物反应器的用途，用于细胞培养。

有益效果：

本发明采用柔性材质便于规模化运输和生产，罐体包含倒椎体结构，结合通气作用，实现较好的细胞悬浮效果。

再则，本发明所述细胞悬浮培养生物反应器，在出气口连接的第一管路上设置呼吸器，起到袋子内外隔离的作用，有效解决了植物细胞长周期发酵培养过程中容易污染的问题。具体来说，其优势在于：一、防止意外掉压时袋子(罐体)外界杂菌入侵袋内细胞，导致污染，进而发酵失败。二、防止正常培养时污染未及时发现期间杂菌随排气进入培养间环境，导致环境内杂菌数量超标，进而增加交叉污染的概率。

进一步的，通过切换空气分布装置中的不同孔径，来适应细胞在不同培养阶段的溶氧量需求，有效避免传统依靠大范围加大通气比调节溶氧量的方式带来的高剪切应力对细胞的伤害，细胞生长状态佳，生产效率高，单位基质人参细胞收率可以达到15g/l以上的高密度，单位基质合欢细胞收率可以达到10g/l以上的高密度，；同时有效避免因大通气带来的泡沫激增问题，可以使装料系数由现有技术的50％提升到80％以上。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，而非对本发明的限制。

图1是本发明一个实施例1提供的细胞悬浮培养生物反应器结构示意图；

图2是本发明一个实施例1提供的空气分布装置结构示意图。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。在下面的实施例中，如未明确说明，“％”均指重量百分比。

实施例1：

参考图1和图2，一种细胞悬浮培养生物反应器，包括第一腔体1、第二腔体2，第一腔体1位于第二腔体2上方。第一腔体1为圆柱形，第二腔体2为倒锥形，且第二腔体的一条侧边与水平面呈90°夹角，另一条侧边与水平面呈45°夹角(即倾斜面倾角45°)。第一腔体1的底面圆周和第二腔体2的底面圆周重合，两个腔体相贯通，组成细胞悬浮培养生物反应器的罐体。罐体的材质优选为聚酰胺或聚乙烯或乙烯-醋酸乙烯共聚物或乙烯-乙烯醇共聚物。

第一腔体1上设有接种口3、培养基入口5和出气口4，接通过管路连接。其中，优选连接在第一腔体1顶部封盖上，便于接种和加料。为了方便对罐体内部气压的控制和调整，在连接出气口4的管路上设置呼吸器41和第一空气调节阀42，使得罐体内的气体经第一空气调节阀42调整流量后进入呼吸器41。

第二腔体2的倾斜面上设有进气口6，为了方便控制进气流量，在进气管路上设有流量计61和第二空气调节阀62，使得无菌空气经过流量计61后，再经过第二空气调节阀62的调节和控制进入第二腔体2。

为了实现较好的气流扰动效果，尽量减小剪切应力，同时保持细胞悬浮状态，优选在第二腔体2的倾斜面上安装多个空气分布装置7。空气分布装置7连接进气管路，将进入罐体的气流分散成大小适宜的气泡。

空气分布装置7包括空气容置箱体71和空气管72，空气管72连接空气容置箱体71的侧壁，将无菌空气送入空气容置箱体71内部。空气容置箱体71底部密封，顶部封盖设有多个均匀分布的孔洞，孔径分别为R1、R2，其中小孔73的孔径为R1，大孔74的孔径为R2，小孔73和大孔74各自呈扇形聚集，以空气容置箱体71封盖的中心形成中心对称，且小孔73所形成的扇形与大孔74所形成的扇形彼此相邻。

优选地，10um≤孔径R1＜孔径R2≤1000um，以满足在合适的通气比下实现对溶氧量的调整。

空气容置箱体71封盖中心安装可旋转的挡板75，挡板75包括多个扇形叶片，扇形叶片以封盖的中心形成对称分布，扇形叶片的边缘与封盖的外沿平齐。通过旋转挡板75到特定位置，可进行大孔74通气或者小孔75通气之间的切换。切换控制的方式属于公知技术，在此不赘述。

进一步的，第一腔体1侧壁设有传感器预留口8，用于插入pH计、空气饱和度检测装置或者二氧化碳含量检测装置，如溶解氧测定仪。

本实施例只是示例性的，本发明并不限于此种结构，本领域技术人员应该想到，第二腔体2还可以为其它倒锥形，如倒棱锥，或者具有对称轴的倒圆锥。第二腔体2的倾斜面倾角还可以为其他数值，例如30°，40°，50°，60°，或者70°，倾角不同会影响悬浮状态，根据所培养对象的密度不同可进行调整。

实施例2：

本实施例在实施例1的基础上进一步改进，对空气分布装置7进行优化设计，空气分布装置7采用硅胶材质，100um≤孔径R1＜孔径R2≤500um，且孔径R1：孔径R2＝1：1.5-3.5，例如，孔径R1＝200um，孔径R2＝400um，此时悬浮培养效果佳，氧传质系数适宜，剪切力适宜。

实施例3：

本实施例以人参细胞悬浮培养为例，描述实施例2中细胞悬浮培养生物反应器的使用方法：

将人参细胞愈伤组织无菌接种于灭菌合格的液体培养基中，置于22-25℃，80-120rpm旋转摇床中震荡培养15-25天，将合格的浓粥状人参液体种子通过接种口3无菌接入事先经过熏蒸灭菌或者辐照灭菌的细胞悬浮培养生物反应器罐体内，同时经蠕动泵将灭菌合格的人参细胞液体培养基通过培养基入口5接入罐体内，将无菌空气通过进气口6输入罐体内，同时无菌空气通过出气口4排出罐体，通过第二空气调节阀62调整罐压微正压，置于恒温室，控制培养温度22-25℃，通过流量计61控制通气比在0.12-0.24vvm。

空气分布装置7在罐体灭菌前组装入罐体，并调整在74档位(即挡板75遮盖住小孔73，露出大孔74)。空气分布装置7在倾斜面上的安装密度为20-60个/平米，优选为35-45个/平米。培养前期使用大孔74通气，培养密度增加逐步调整至小孔73通气。培养期间根据肉眼观察细胞浓度变化，或者通过插入传感器预留口8的电极检测的相对空气饱和度及二氧化碳量，进行通气比微调至0.24-0.36vvm，优选为0.25-0.3vvm，并将大孔74逐步调整至小孔73档位。例如，当检测到相对空气饱和度为15-20％时，将大孔74逐步调整至小孔73档位；为了满足大多数细胞生长，体系溶氧量建议维持在30％(体积分数)以上，二氧化碳含量应小于15-20％(体积分数)，否则会产生毒害作用，因此，当检测到二氧化碳含量超过15％(体积分数)时，可以进行档位切换，将大孔74逐步调整至小孔73档位。

整个培养期悬浮20-40天，期间取样检测细胞量，达到15g/l以上即可终止发酵，所有发酵液离心过滤，将滤饼低温真空干燥，收获得成品，计算单位基质细胞得率为15.78g/l。

现有文献中人参细胞培养，通气比一般为0.8-1vvm，本发明在前期控制通气比在0.12-0.24vvm，后期调整为0.24-0.36vvm，以较小的通气比完成培养过程，体系氧传质系数适宜，剪切力适宜，产品收率高。

实施例4

一种细胞悬浮培养生物反应器，包括第一腔体1、第二腔体2，第一腔体1位于第二腔体2上方。第一腔体1为圆柱形，第二腔体2为倒圆锥形，倒圆锥的侧边与水平面呈60°夹角(即倾斜面倾角60°)。第一腔体1的底面圆周和第二腔体2的底面圆周重合，两个腔体相贯通，组成细胞悬浮培养生物反应器的罐体。罐体的材质优选为聚酰胺或聚乙烯或乙烯-醋酸乙烯共聚物或乙烯-乙烯醇共聚物。

第一腔体1上设有接种口3、培养基入口5和出气口4，接通过管路连接。其中，优选连接在第一腔体1顶部封盖上，便于接种和加料。为了方便对罐体内部气压的控制和调整，在连接出气口4的管路上设置呼吸器41和第一空气调节阀42，使得罐体内的气体经第一空气调节阀42调整流量后进入呼吸器41。

第二腔体2的倾斜面上设有进气口6，为了方便控制进气流量，在进气管路上设有流量计61和第二空气调节阀62，使得无菌空气经过流量计61后，再经过第二空气调节阀62的调节和控制进入第二腔体2。

第二腔体2的倾斜面上安装空气分布装置，空气分布装置为常规多孔空气分布器，孔径为250um，空气分布装置将来自进气口6的无菌空气分散成均匀的气泡。

下面以人参细胞培养为例，描述本实施例所述细胞悬浮培养生物反应器的使用方法：

将人参细胞愈伤组织无菌接种于灭菌合格的液体培养基中，置于22-25℃，80-120rpm旋转摇床中震荡培养15-25天，将合格的浓粥状人参液体种子通过接种口3无菌接入事先经过熏蒸灭菌或者辐照灭菌的细胞悬浮培养生物反应器罐体内，同时经蠕动泵将灭菌合格的人参细胞液体培养基通过培养基入口5接入罐体内，将无菌空气通过进气口6输入罐体内，同时无菌空气通过出气口4排出罐体，通过第二空气调节阀62调整罐压微正压，置于恒温室，控制培养温度22-25℃，通过流量计61控制通气比在0.15-0.20vvm。

培养期间根据肉眼观察细胞浓度变化，或者通过插入传感器预留口8的电极检测的相对空气饱和度及二氧化碳量，进行通气比微调至0.25-0.3vvm，整个培养期悬浮20-40天，期间取样检测细胞量，达到15g/l以上即可终止发酵，所有发酵液离心过滤，将滤饼低温真空干燥，收获得成品，计算单位基质细胞得率为15.14g/l。

实施例5

以下以合欢细胞培养为例，描述使用实施例1中所述细胞悬浮培养生物反应器进行细胞培养的方法：

将合欢细胞愈伤组织无菌接种于灭菌合格的改良MS液体种子培养基中，改良MS液体种子培养基中添加2,4-D1-2mg/L、NAA1-2mg/L、IBA1-2mg/L、水解酪蛋白0.11-0.3％，置于22-25℃，80-120rpm旋转摇床中震荡培养15-25天，将合格的浓粥状合欢液体种子通过接种口3无菌接入事先经过熏蒸灭菌或者辐照灭菌的细胞悬浮培养生物反应器罐体内，同时经蠕动泵将灭菌合格的改良液体培养基通过培养基入口5接入罐体内，改良MS液体发酵培养基中，改良MS液体发酵培养基中添加2,4-D1-2mg/L、NAA1-2mg/L、IBA1-2mg/L、肉桂酸10-30mg/L，将无菌空气通过进气口6输入罐体内，同时无菌空气通过出气口4排出罐体，通过第二空气调节阀62调整罐压微正压，置于恒温室，控制培养温度22-25℃，通过流量计61控制通气比在0.12-0.24vvm。

空气分布装置7在罐体灭菌前组装入罐体，并调整在74档位(即挡板75遮盖住小孔73，露出大孔74)。空气分布装置7在倾斜面上的安装密度为30-50个/平米，优选为38-42个/平米。培养前期使用大孔74通气，培养密度增加逐步调整至小孔73通气。培养期间根据肉眼观察细胞浓度变化，或者通过插入传感器预留口8的电极检测的相对空气饱和度及二氧化碳量，进行通气比微调至0.20-0.30vvm，优选为0.24-0.28vvm，并将大孔74逐步调整至小孔73档位，以克服通气比增大带来的不利影响。整个培养期悬浮20-40天，期间取样检测细胞量，达到10g/L以上即可终止发酵，所有发酵液离心过滤，将滤饼低温真空干燥，收获得成品，计算单位基质细胞得率为10.12g/L。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种细胞悬浮培养生物反应器，包括柔性材质的罐体，所述罐体包括相贯通的第一腔体和第二腔体，所述第一腔体位于所述第二腔体上方，所述第一腔体为柱体或台体，所述第二腔体为倒椎体，所述第一腔体上设有接种口、培养基入口和出气口，所述第二腔体上设有进气口，安装在所述第二腔体内的空气分布装置与所述进气口连接，所述进气口连接通气装置，使得无菌气体经所述通气装置进入所述空气分布装置后，分散成均匀的气泡。

2.根据权利要求1所述的细胞悬浮培养生物反应器，其特征在于：所述柔性材质为聚酰胺、聚乙烯、乙烯-醋酸乙烯共聚物、乙烯-乙烯醇共聚物中至少一种。

3.根据权利要求1所述的细胞悬浮培养生物反应器，其特征在于：所述出气口位于所述第一腔体顶部封盖上，所述出气口通过第一管路连接呼吸器，所述第一管路上设置第一空气调节阀。

4.根据权利要求1所述的细胞悬浮培养生物反应器，其特征在于：所述第二腔体至少1个倾斜面的倾角为30-70度，优选为45-60度；所述进气口位于所述第二腔体的所述倾斜面上。

5.根据权利要求1所述的细胞悬浮培养生物反应器，其特征在于：所述通气装置包括流量计，所述进气口通过第二管路连接所述流量计，所述第二管路上设置第二空气调节阀。

6.根据权利要求1所述的细胞悬浮培养生物反应器，其特征在于：所述空气分布装置包括空气容置箱体，所述空气容置箱体底部密封，所述空气容置箱体的顶部封盖上设有多个均匀分布的孔洞，且所述孔洞至少具有2种不同孔径R1、R2，孔径R1＜孔径R2，所述空气容置箱体的封盖中心安装可旋转的挡板，所述空气容置箱体的侧壁连接所述进气口；

任选的，所述空气分布装置在所述第二腔体内的安装密度为20-60个/平米，优选35-45个/平米。

7.一种细胞悬浮培养的方法，采用权利要求6所述细胞悬浮培养生物反应器，包括以下步骤：

步骤1：调整空气分布装置中挡板的位置，使挡板遮盖住孔径为R1的孔洞，露出孔径为R2的孔洞；

步骤2：将待培养的细胞种子通过接种口无菌接入事先经过熏蒸灭菌或者辐照灭菌的细胞悬浮培养生物反应器内，同时将灭菌合格的培养基通过培养基入口接入细胞悬浮培养生物反应器内，之后将无菌空气通过进气口输入细胞悬浮培养生物反应器，无菌空气通过出气口排出，调整细胞悬浮培养生物反应器内的压力，置于恒温室恒温培养，并通过通气装置控制通气比；

步骤3：培养前期保持挡板的位置不变，以孔径为R2的孔洞通气，随着细胞培养密度增加，微调通气比，并逐步调整挡板的位置，改变为以孔径为R1的孔洞通气；培养结束后，所有发酵液离心过滤，将滤饼干燥，收获得成品。

8.根据权利要求7所述细胞悬浮培养的方法，其特征在于：所述步骤2中恒温培养的温度为20-30℃，通气比为0.12-0.24vvm；

任选的，所述步骤3中微调通气比至0.24-0.36vvm。

9.根据权利要求7或8所述细胞悬浮培养的方法，其特征在于：所述步骤3中，根据肉眼观察细胞浓度变化，或者通过检测细胞悬浮培养生物反应器内的相对空气饱和度及二氧化碳量，逐步调整挡板的位置，改变为以孔径为R1的孔洞通气。

10.一种权利要求1-6任一项所述细胞悬浮培养生物反应器的用途，用于细胞培养。