CZ298148B6 - Zarízení na jedno pouzití pro axenické pestování a sklízení bunek a/nebo tkání, baterie takových zarízení a príslusný zpusob - Google Patents

Abstract

Zarízení na jedno pouzití pro axenické pestování a sklízení bunek a/nebo tkání v alespon jednom cyklu obsahuje opetovne vyuzitelné sklízecí prostredky, obsahující vhodné prostredky pro regulaci prutoku pro umoznení sklízení alespon pozadované cásti zivného prostredí, obsahujícího bunky a/nebo tkáne, pro umoznení pouzívání zarízení kontinuálne pro alespon jeden dalsí následující pestovací a/nebo sklízecí cyklus, pricemz nádobka je uzpusobena tak,aby zbytek média, obsahujícího bunky a/nebo tkáne, zbývající z predcházejícího sklízecího cyklu, zustal v nádobce a slouzil jako ockovací látka pro dalsí pestovací a sklízecí cyklus. Baterie zarízeníobsahuje alespon dve uvedená zarízení na jedno pouzití. Vynález se rovnez týká zpusobu axenického pestování a sklízení bunek a/nebo tkání v zarízení na jedno pouzití.

Description

Zařízení na jedno použití pro axenické pěstování a sklízení buněk a/nebo tkání, baterie takových zařízení a příslušný způsob

Oblast techniky

Vynález se týká zařízení na jedno použití pro axenické pěstování a sklízení buněk a/nebo tkání v alespoň jednom cyklu, které obsahuje sterilizovatelnou průhlednou a/nebo průsvitnou netuhou nádobku najedno použití, mající horní konec a spodní konec, přičemž tato nádobka je alespoň částečně naplněna vhodným sterilním biologickým živným prostředím pro pěstování buněk a/nebo tkání, a/nebo axenickou očkovací látkou, a/nebo sterilním vzduchem, a/nebo požadovanými jinými sterilními přísadami.

Zařízení jsou určena k jednomu použití, avšak nicméně mohou být používána nepřetržitě pro celou řadu po sobě následujících pěstovacích a sklízečích cyklů až do té doby, kdy budou tato zařízení určena k likvidaci.

Vynález se dále týká baterie takovýchto zařízení, která může být využita pro pěstování buněk a tkání ve velkém měřítku;

Vynález se rovněž týká způsobu axenického pěstování a sklízení buněk a/nebo tkání v zařízení na jedno použití.

Dosavadní stav techniky

Způsoby pěstování buněk a tkání jsou dostupné již po celou řadu let a jsou z dosavadního stavu techniky velmi dobře a všeobecně známy.

Vyhlídky na využití takovýchto pěstovacích technik jsou výhodné pro získávání druhotných metabolitů, jako například farmaceuticky aktivních sloučenin, různých látek využitelných v kosmetice, hormonů, enzymů, proteinů, antigenů, potravinářských přísad a přírodních pesticidů na základě sklízení pěstovaných buněk nebo tkání. Přestože jsou tyto způsoby potenciálně lukrativní, nejsou nicméně shora uvedené vyhlídky efektivní s použitím průmyslových vícenásobných bioreaktorů, které využívají pomalu rostoucí rostlinné a živočišné kultury, a to zejména z důvodu vysokých kapitálových nákladů.

Z dosavadního stavu techniky známá technika a technologie výroby a pěstování buněčných a/nebo tkáňových kultur v průmyslovém měřítku, určených pro využití ve výrobě shora uvedených materiálů, je založena na skleněných bioreaktorech a na bioreaktorech z nerezové oceli, které představují velmi nákladné kapitálové položky.

Kromě toho tyto typy průmyslových bioreaktorů využívají komplikovaných a nákladných směšovacích technologií, jako jsou například oběžná kola, poháněná prostřednictvím nákladných a složitých sterilních utěsnění; některé nákladné fermentory obsahují mamutí čerpadla velmi složitých konstrukcí.

Úspěšný provoz takovýchto bioreaktorů často vyžaduje zavádění provzdušňovacích technologií, které je nezbytné neustále zlepšovat a zdokonalovat. Kromě toho mají takovéto bioreaktory rozměry, odpovídající jejich špičkové objemové kapacitě, která je požadována pouze občas. Problémy tak vznikají při zvyšování měřítka od poloprovozních kvasných kádí nebo fermentorů až na rozměrné fermentoiy, nebo tehdy, kdy vzniká potřeba zvýšit výrobu nad kapacitu existujících bioreaktorů.

-1 CZ 298148 B6

Alternativou k velkokapacitním reaktorům může být celá řada menších skleněných bioreaktorů nebo bioreaktorů z nerezové oceli Jejichž celková objemová kapacita splňuje příslušné požadavky, přičemž nabízí určitý stupeň pružnosti pro zvýšení nebo snížení celkové kapacity, jde však nicméně o záležitost mnohem nákladnější a dražší, než je opatření jediného velkého bioreaktorů. Kromě toho provozní náklady, týkající se většího počtu skleněných bioreaktorů nebo bioreaktorů z nerezové oceli, jsou rovněž mnohem vyšší, a to v důsledku malé výtěžnosti, která je spjata s nezbytností sterilizace bioreaktorů po každém pěstovacím cyklu.

V důsledku shora uvedeného jsou produkty, získávané z buněk nebo tkání, pěstovaných v takovýchto bíoreaktorech, velmi nákladné a nemohou komerčně soutěžit se srovnatelnými produkty, vyráběnými s pomocí alternativních technik. Ve skutečnosti je známa pouze jedna japonská společnost, která využívá shora uvedených technik pro komerční pěstování buněk a/nebo tkání s využitím bioreaktorů z nerezové oceli. Tato společnost vyrábí Shikonin, což je sloučenina, která je využívána téměř výlučně v Japonsku.

Průmyslové bioreaktory, a zejména velká průmyslová bioreaktorová zařízení, jsou již tradičně stálými nebo téměř stálými součástmi, přičemž není známa žádná koncepce vyřaditelného bioreaktorového zařízení pro řešení shora uvedených problémů, týkajících se produkce buněčných a/nebo tkáňových kultur ve velkém měřítku.

Naopak jsou vyřaditelná fermentorová a bioreaktorová zařízení velmi dobře známa, přičemž jsou zaměřena zejména na velmi malé produkční objemy, jako jsou například malé domácí pivovary nebo laboratorní práce. Takováto bioreaktorová zařízení obvykle obsahují vyřaditelný sáček, který je obvykle rozříznut za účelem pěstování buněk a/nebo tkání, čímž je znehodnocena jakákoliv další využitelnost takovéhoto sáčku.

Jeden takovýto známý vyřaditelný bioreaktor je vyráběn firmou Osmotec, Izrael (Agritech Izrael, vydání č. 11, 1997, str. 19) pro využití v malém měřítku, jako jsou například laboratorní výzkumy. Tento bioreaktor obsahuje kuželovitý sáček, mající vstupní otvor, kterým je přiváděno živné prostředí, vzduch, očkovací látka nebo jiné případné přísady, přičemž má objem pouze o velikosti zhruba 1,5 litru. Je zde prováděno provzdušňování přiváděním velmi malých vzduchových bublinek, které v mnoha případech způsobují poškození buněk, zejména v případě pěstování rostlinných buněčných kultur. Takovéto sáčky jsou určeny zejména pro jediný pěstovací a/nebo sklízeči cyklus, přičemž obsah sáčku je vyjímán odříznutím dna tohoto sáčku. Takovéto sáčky tedy nejsou zaměřeny na ekonomické řešení otázky poskytování průmyslového množství materiálů, které mají být získávány z pěstovaných kultur, jak již bylo shora řečeno.

Vyřaditelnost těchto bioreaktorových zařízení nepředstavuje obecně ekonomickou nevýhodu pro uživatele, neboť nízké kapitálové náklady na tyto položky stojí proti jednoduchosti využití skladování a jiných praktických uplatnění. Ve skutečnosti při nízkých výrobních hladinách, na které jsou takováto zařízení zaměřena je ekonomika těchto zařízení taková, že není vyvolávána žádná motivace na zvýšení komplexnosti těchto zařízení nebo jejich provozu z hlediska jejich nepřetržitého využívání pro více než jeden cyklus pěstování a sklízení.

Kromě toho sterilní podmínky na vnější straně vyřaditelných bioreaktorových zařízení nejsou buď vyžadovány, nebo je jejich dosažení dokonce v mnoha případech nemožné, takže pokud dojde jednou k otevření za účelem sklizně, není z hlediska nákladů efektivní a prakticky ani často možné udržet v otevřeném stavu sterilní prostředí, takže dochází ke znečištění sáčku, uvnitř kterého se může ocitnout jakákoliv znečišťující látka. Takže takováto vyřaditelná zařízení nemají po ukončení jednoho pěstovacího cyklu žádné další využití.

Vyřaditelná bioreaktorová zařízení jsou tak poměrně nenákladná pro taková množství a takové produkční objemy, které jsou obvykle vyžadovány od uživatelů v neprůmyslovém měřítku, přičemž jsou poměrně velmi snadno využitelná pro neprofesionální obsluhu. Ve skutečnosti je to tento aspekt jednoduchosti použití a nízkých ekonomických nákladů, který se vztahuje k nízko-2CZ Z9S148 B6 objemové produkci těchto vyřaditelných zařízení, který představuje hlavní výhodu vyradítelných;

bioreaktorových zařízení.1

Takže vyřaditelná bioreaktorová zařízení, známá z dosavadního stavu techniky, mají velmi málo1 společného s průmyslovými bioreaktoiy, a to jak z konstrukčního hlediska, tak i z hlediska provozního nebo z hlediska ekonomického, přičemž ve skutečnosti nepodněcují k řešení problémů,| spjatých s průmyslovými bioreaktory, tím spíše, že v žádném případě takováto řešení nenavrhují.

'n

Podstata vynálezu

Předmět tohoto vynálezu tak představuje revoluční řešení shora uvedených problémů tím, že poskytuje vyřaditelné bioreaktorové zařízení pro výrobu buněčných a/nebo tkáňových kultur ve velkém měřítku. Zařízení podle tohoto vynálezu, které je vyřaditelné, je charakterizováno tím, že obsahuje opětovně využitelný sklízeči výstup pro umožnění sklízení alespoň části živného prostředí, obsahujícího buňky, a/nebo tkáně, je-li to požadováno, čímž je umožněno, aby bylo zařízení využíváno nepřetržitě projeden nebo více následujících po sobě jdoucích pěstovacích a/nebo sklízečích cyklů.

V průmyslovém prostředí může být sterilita sklízecího výstupu během sklízení a po ukončení sklízení zajištěna do poměrně vysoké míry a relativně nízkými náklady opatřením například sterilního krytu, v němž jsou prováděny veškeré nezbytné spojovací a rozpojovací služby, týkající se daného zařízení. Pokud je případně dané zařízení znečištěno, může být vyřazeno. Takováto zařízení mohou být velmi levně vyráběna, a to dokonce pro produkci objemu kultur až o velikosti 50 litrů nebo více.

Kromě toho je schopnost provádění většího počtu pěstovacích a/nebo sklízečích cyklů ekonomicky velmi lukrativní, neboť snižuje dokonce další efektivní náklady najedno zařízení. Může být rovněž ekonomicky uspořádána celá baterie takovýchto zařízení, přičemž počet zařízení v baterii může být regulován tak, aby velice blízce odpovídal požadované produkci.

Takže přechod od poloprovozních bioreaktorů k produkci· ve velkém měřítku může být rovněž dosažen poměrně jednoduchým a ekonomickým způsobem, a to přidáním více zařízení do předmětné baterie. Kromě toho pak poměrně malý objem produkce v každém zařízení, která jsou spojena bez pevných mísičů, vede k poměrně vyšší výtěžnosti v porovnání s obvyklými bioreaktory z nerezové oceli.

Úkolem tohoto vynálezu je vyvinout zařízení a příslušný způsob pro axenické pěstování a sklízení buněk a/nebo tkání, které nebudou trpět shora uvedenými nedostatky.

Dalším úkolem předmětu tohoto vynálezu je vyvinout takové zařízení, které bude možno ekonomicky průmyslově vyrábět, a které bude možno jednoduše využívat.

Ještě dalším úkolem předmětu tohoto vynálezu je vyvinout takové zařízení, které bude vyřaditelné, avšak které může být nicméně využíváno nepřetržitě v průběhu většího množství po sobě jdoucích následujících cyklů pěstování a sklízení požadovaných buněk a/nebo tkání.

Ještě jiným úkolem tohoto vynálezu je vyvinout takové zařízení, kde je nutno přivádět očkovací látku pouze pro první pěstovací cyklus, přičemž očkovací látku pro následující po sobě jdoucí cykly tvoří část vypěstované kultury, která zůstává v zařízení po ukončení sklizně této kultury v předcházejícím cyklu.

Ještě jiným úkolem předmětu tohoto vynálezu je vyvinout baterii takových zařízení pro pěstování buněk a/nebo tkání v průmyslovém měřítku.

-3CZ zy»148 B6

Předmět vynálezu se tedy týká zařízení najedno použití pro axenické pěstování a sklízení buněk a/nebo tkání v alespoň jednom cyklu, které obsahuje sterilizovatelnou průhlednou a/nebo průsvitnou netuhou nádobku (20) najedno použití mající horní konec (26) a spodní konec (28), přičemž í tato nádobka (20) je alespoň částečně naplněna vhodným sterilním biologickým živným prostře-* dím pro pěstování buněk a/nebo tkání, a/nebo axenickou očkovací látkou, a/nebo sterilním vzduchem, a/nebo požadovanými jinými sterilními přísadami, přičemž nádobka obsahuje:i (i) plynové výstupní prostředky pro odvádění přebytečného vzduchu a/nebo odpadních plynů| z nádobky,*

I (ii) vstupní prostředky pro přivádění očkovací látky a/nebo živného prostředí a/nebo přísad do nádobky, přičemž zařízení dále obsahuje:

(iii) opětovně využitelné sklízeči prostředky, obsahující vhodné prostředky pro regulaci průtoku pro umožnění sklízení alespoň požadované části živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, pro umožnění používání zařízení kontinuálně pro alespoň jeden další následující pěstovací a/nebo sklízeči cyklus, přičemž nádobka je uzpůsobena tak, aby zbytek média, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, zbývající z předcházejícího sklízecího cyklu, zůstal v nádobce a sloužil jako očkovací látka pro další pěstovací a sklízeči cyklus.

Zařízení podle tohoto vynálezu dále s výhodou obsahuje vzduchové vstupní prostředky pro přivádění sterilního vzduchu ve formě bublinek do živného prostředí prostřednictvím prvního vstupního otvoru, přičemž jsou vzduchové vstupní prostředky připojitelné ke vhodnému přívodu vzduchu.

Sklízeči prostředky s výhodou obsahují prostředky pro zabránění znečištění nebo pro podstatné zabránění přívodu znečišťujících látek do nádobky prostřednictvím sklízečích prostředků.

Nádobka je s výhodou vytvořena z nepevného plastického materiálu.

Materiál je s výhodou vybrán ze skupiny, obsahující polyetylén, polykarbonát, kopolymer polyetylénu a nylon, PVC a EVA,

Nádobka může být s výhodou vytvořena navrstvením více než jedné vrstvy uvedených materiálů.

U výhodného provedení je nádobka vytvořena tavným spojením dvou vhodných pásů uvedeného materiálu podél předem stanovených švových svarů.

Vzduchové vstupní prostředky s výhodou obsahují vzduchovou vstupní trubku, probíhající od vstupního otvoru k místu uvnitř nádobky na jejím spodním konci nebo v jeho blízkosti.

Alespoň některé ze vzduchových bublinek mají s výhodou hlavní průměr od 1 do 10 mm.

Alespoň některé ze vzduchových bublinek mají nej výhodněji hlavní průměr 4 mm.

Nádobka s výhodou obsahuje vhodný filtr, uspořádaný v plynových výstupních prostředcích pro podstatné zabránění přístupu znečišťujících látek do nádobky přes tyto plynové výstupní prostředky.

Nádobka dále s výhodou obsahuje vhodný filtr, uspořádaný ve vstupních prostředcích pro přivádění přísad pro podstatné zabránění přístupu znečišťujících látek do nádobky přes tyto vstupní prostředky.

-4CZ 298148 B6

Prostředky pro zabránění znečištění s výhodou obsahují tekutinový sifon ve tvaru písmene U,Ί jehož jedno rameno je asepticky namontováno na vnější výstup sklízečích prostředků pomocí| vhodných aseptických spojovacích prostředků.Ί

Sklízení prostředky jsou s výhodou umístěny u dna spodního konce nádobky,1

Sklízeči prostředky mohou být s výhodou umístěny v blízkosti dna spodního konce nádobky, takže na konci každého sklízecího cyklu zbytek živného prostředí, obsahujícího buňky a/neboJ tkáně, automaticky zůstává u spodního konce nádobky až do úrovně pod hladinou sklízečích1 prostředků.

Zbytek živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, obsahuje od 2,5 do 45 %, s výhodou od 10 do 20 % původního objemu živného prostředí a očkovací látky.

Spodní konec je s výhodou v podstatě konvexní nebo má v podstatě tvar komolého kužele.

Nádobka má s výhodou vnitřní plnitelný objem o velikosti od 5 1 do 50 1.

Zařízení podle tohoto vynálezu dále s výhodou obsahuje vhodné připevňovací prostředky pro jeho připevnění k vhodné nosné konstrukci.

Připevňovací prostředky s výhodou obsahují závěsné oko z materiálu, který je s výhodou integrálně připevněn k hornímu konci nádobky.

V souladu s dalším aspektem předmětu tohoto vynálezu byla dále rovněž vyvinuta baterie zařízení, která obsahuje alespoň dvě shora uvedená zařízení najedno použití.

Zařízení jsou s výhodou uložena na vhodné nosné konstrukci s pomocí připevňovacích prostředků každého ze zařízení.

Plynové výstupní prostředky každého ze zařízení jsou vhodně připojeny ke společnému plynovému výstupnímu potrubí, které případně obsahuje vhodné prostředky pro zabránění znečištění v důsledku proudění do zařízení.

Prostředky pro zabránění znečištění v důsledku proudění do zařízení s výhodou obsahují vhodný filtr.

Vstupní prostředky pro přivádění přísad každého ze zařízení jsou vhodně připojeny ke společnému vstupnímu potrubí pro přivádění přísad, jehož volný konec je případně opatřen vhodnými aseptickými připojovacími prostředky.

Volný konec je s výhodou připojitelný ke vhodnému přívodu živného prostředí a/nebo přísad.

Sklízeči prostředky každého ze zařízení jsou vhodně připojeny ke společnému sklízecímu potrubí, jehož volný konec je případně opatřen vhodnými aseptickými připojovacími prostředky.

Baterie podle tohoto vynálezu dále s výhodou obsahuje prostředky pro zabránění znečištění pro podstatné zamezení vstupu znečišťujících látek do nádobky přes společné sklízeči potrubí.

Prostředky pro zabránění znečištění s výhodou obsahují tekutinový sifon ve tvaru písmene U, jehož jedno rameno je volné a je opatřeno otvorem, přičemž jeho druhý konec je asepticky připojitelný k volnému konci společného sklízecího potrubí prostřednictvím vhodných aseptických připojovacích prostředků.

-5CZ 298148 B6

Volný konec tekutinového sifonu ve tvaru písmene U je s výhodou připojitelný k vhodné přijímací nádrži.

Vzduchové vstupní prostředky každého ze zařízení jsou vhodně připojeny ke společnému vzduchovému vstupnímu potrubí, jehož volný konec je případně opatřen vhodnými aseptickýmii připojovacími prostředky.j

Volný konec je připojitelný ke vhodnému přívodu vzduchu.4

V souladu s ještě dalším aspektem předmětu tohoto vynálezu byl dále rovněž vyvinut způsob axenického pěstování a sklízení buněk a/nebo tkání v zařízení najedno použití, obsahující následující kroky;

a) opatření zařízení, které obsahuje sterilizovatelnou průhlednou a/nebo průsvitnou nepevnou nádobku na jedno použití, mající horní konec a spodní konec, přičemž tato nádobka je alespoň částečně naplněna vhodným sterilním biologickým živným prostředím pro pěstování buněk a/nebo tkání, a/nebo axenickou očkovací látkou, a/nebo sterilním vzduchem, a/nebo jinými sterilními přísadami, přičemž nádobka obsahuje:

(i) plynové výstupní prostředky pro odvádění přebytečného vzduchu a/nebo odpadních plynů z nádobky, (ii) vstupní prostředky pro přivádění přísad pro přivádění očkovací látky a/nebo živného prostředí a/nebo přísad do nádobky, přičemž zařízení dále obsahuje:

(iii) opětovně využitelné sklízeči prostředky, obsahující vhodné prostředky pro regulaci průtoku, pro umožnění sklízení alespoň požadované části živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, přičemž je umožněno kontinuální využívání zařízení pro alespoň jeden další následující pěstovací a/nebo sklízeči cyklus, přičemž nádobka je uzpůsobena tak, aby zbytek média obsahujícího buňky a/nebo tkáně zůstal v nádobce a sloužil jako očkovací látka pro další pěstovací a sklízeči cyklus,

b) přivádění axenické očkovací látky s pomocí sklízečích prostředků,

c) přivádění sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad s pomocí vstupních prostředků pro přivádění přísad,

d) případné osvětlování nádobky s pomocí vnějších světelných prostředků,

e) umožnění růstu buněk a/nebo tkání v živném prostředí až do požadované výtěžnosti,

f) umožnění odvádění přebytečného vzduchu a/nebo odpadních plynů z nádobky kontinuálně s pomocí plynových odváděčích prostředků,

g) kontrola znečištění a/nebo kvality buněk a/nebo tkání, které jsou pěstovány v nádobce: pokud byla zjištěna přítomnost znečišťujících látek, nebo pokud bylo zjištěno, že pěstované buňky a/nebo tkáně mají nízkou kvalitu, zařízení se i se svým obsahem zlikviduje, pokud nebyla zjištěna přítomnost znečišťujících látek, provádí se krok h),

h) sklízení požadované části živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, při ponechání zbytku živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, v nádobce, přičemž tento zbytek živného prostředí slouží jako očkovací látka pro další pěstovací a sklízeči cyklus,

i) přivádění sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad pro další pěstovací a/nebo sklízeči cyklus s pomocí vstupních prostředků pro přivádění přísad,

j) opakování kroků d), e), f), g), h) a i) mnohokrát až do té doby, kdy je v kroku g) zjištěna přítomnost znečišťujících látek nebo kdy je zjištěno, že pěstované buňky a/nebo tkáně mají nízkou kvalitu, na základě čehož se zařízení i se svým obsahem zlikviduje.

-6CZ 298148 B6

Zařízení dále s výhodou obsahuje vzduchové vstupní prostředky pro přivádění sterilního vzduchu ve formě vzduchových bublinek do živného prostředí prostřednictvím prvního vstupního otvoru, připojitelného ke vhodnému sterilnímu přívodu vzduchu, přičemž způsob dále obsahuje krok přiváděni sterilního vzduchu do vzduchových vstupních prostředků během prvního cyklu a během každého následujícího cyklu.

Sterilní vzduch se $ výhodou přivádí kontinuálně v průběhu alespoň jednoho pěstovacího cyklu.

Sterilní vzduch se může s výhodou přivádět v impulzech v průběhu alespoň jednoho pěstovacího cyklu.

V souladu s ještě dalším aspektem předmětu tohoto vynálezu byl dále rovněž vyvinut způsob axenického pěstování a sklízení buněk a/nebo tkání v baterii zařízení najedno použití, obsahující následující kroky:

a) opatření baterie zařízení podle nároku 30, a pro alespoň jedno toto zařízení:

b) přivádění axenické očkovací látky do zařízení prostřednictvím společného sklízecího potrubí,

c) přivádění sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad do zařízení prostřednictvím společného vstupního potrubí pro přivádění přísad,

d) případné osvětlování zařízení pomocí vnějších světelných prostředků,

e) umožnění růstu buněk a/nebo tkání v zařízení v živném prostředí až do požadované výtěžnosti,

f) umožnění odvádění přebytečného vzduchu a/nebo odpadních plynů ze zařízení kontinuálně prostřednictvím společného plynového odváděcího potrubí,

g) kontrola znečištění a/nebo kvality pěstovaných buněk a/nebo tkání: pokud byla v zařízení zjištěna přítomnost znečišťujících látek, nebo pokud byla zjištěna nízká kvalita pěstovaných buněk a/nebo tkání, jsou sklízeči prostředky zařízení uzavřeny za účelem zabránění znečištění dalších zařízení v baterii, pokud byly ve všech ze zařízení baterie zjištěny znečišťující látky nebo byla zjištěna nízká kvalita pěstovaných buněk a/nebo tkání, jsou veškerá zařízení a jejich obsahy zlikvidovány; pokud nebyly znečišťující látky zjištěny a kvalita pěstovaných buněk a/nebo tkání je přijatelná, je zařízení považováno za schopné ke sklízení a je prováděn krok

h),

h) pro každé zařízení, schopné ke sklízeči z kroku g), je prováděna sklizeň alespoň požadované části živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně prostřednictvím společného sklízecího potrubí a prostředků pro zabránění znečištění do vhodné přijímací nádrže při ponechání zbytku živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, v nádobce, přičemž druhá část živného prostředí slouží jako očkovací látka pro další pěstovací a/nebo sklízeči cyklus,

i) přivádění sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad pro další pěstovací a/nebo sklízeči cyklus prostřednictvím vstupních prostředků pro přivádění přísad,

j) opakování kroků d), e), f), g), h) a i) mnohokrát až do té doby, kdy je v kroku g) zjištěna přítomnost znečišťujících látek nebo kdy je zjištěno, že pěstované buňky a/nebo tkáně mají nízkou kvalitu pro všechna zařízení z baterie, na základě čehož jsou prostředky pro zabránění znečištění odpojeny od společných sklízečích prostředků a zařízení a jejich obsahy jsou zlikvidovány.

V souladu s ještě dalším aspektem předmětu tohoto vynálezu byl dále rovněž vyvinut způsob axenického pěstování a sklízení buněk a/nebo tkání v baterii zařízení najedno použití, obsahující následující kroky:

a) opatření baterie zařízení podle nároku 33, a pro alespoň jedno toto zařízení,

CZ Ζ9«14» B6

b) přivádění axenické očkovací látky do zařízení prostřednictvím společného sklízecího potrubí,

c) přivádění sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad do zařízení prostřednictvím společného vstupního potrubí pro přivádění přísad,']

d) přivádění sterilního vzduchu do zařízení prostřednictvím společného vzduchového vstupního potrubí,J

e) případné osvětlování zařízení s pomocí vnějších světelných prostředků,í

f) umožnění růstu buněk a/nebo tkání v zařízení v živném prostředí až do požadované výtěž-J nosti,’

g) umožnění odvádění přebytečného vzduchu a/nebo odpadních plynů ze zařízení kontinuálně prostřednictvím společného plynového odváděcího potrubí,

h) kontrola znečištění a/nebo kvality pěstovaných buněk a/nebo tkání: pokud byla v zařízení zjištěna přítomnost znečišťujících látek, nebo pokud bylo zjištěno, že pěstované buňky a/nebo tkáně mají nízkou kvalitu, jsou sklízeči prostředky zařízení uzavřeny za účelem zabránění znečištění dalších zařízení v baterii, pokud byly ve všech ze zařízení baterie zjištěny zne- čišťující látky nebo byla zjištěna nízká kvalita pěstovaných buněk a/nebo tkání, jsou veškerá zařízení a jejich obsahy zlikvidovány, pokud nebyly znečišťující látky zjištěny a kvalita pěstovaných buněk a/nebo tkání je přijatelná, je zařízení považováno za schopné ke sklízení a je prováděn krok i),

i) pro každé zařízení, schopné ke sklízení z kroku h), je prováděna sklizeň alespoň požadované části živného prostředí,, obsahujícího buňky a/nebo tkáně prostřednictvím společného sklízečiho potrubí a prostředků pro zabránění znečištění do vhodné přijímací nádrže při ponechání zbytku živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, v nádobce, přičemž zbytek živného prostředí slouží jako očkovací látka pro další pěstovací a/nebo sklízeči cyklus,

j) přivádění sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad pro další pěstovací a/nebo sklí- zecí cyklus prostřednictvím vstupních prostředků pro přivádění přísad, a

k) opakování kroků d), e), f). g)> h), 0 a j) mnohokrát až do té doby, kdy je v kroku h) zjištěna přítomnost znečišťujících látek nebo kdy je zjištěno, že pěstované buňky a/nebo tkáně mají nízkou kvalitu pro všechna zařízení z baterie, na základě čehož jsou prostředky pro zabránění znečištění odpojeny od společných sklízečích prostředků a zařízení a jejich obsahy jsou zlikvidovány.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález bude v dalším podrobněji vysvětlen na jednotlivých příkladech jeho praktického provedení, jejichž popis bude podán s přihlédnutím k přiloženým výkresům, kde:

obr. la znázorňuje čelní nárysný pohled na hlavní součásti a složky výhodného provedení předmětu tohoto vynálezu;

obr. lb znázorňuje boční pohled v řezu na hlavní součásti a složky výhodného provedení před40 mětu tohoto vynálezu;

obr. 2a znázorňuje čelní nárysný pohled na hlavní součásti a složky druhého výhodného provedení předmětu tohoto vynálezu;

obr. 2b znázorňuje boční pohled v řezu na hlavní součásti a složky druhého výhodného provedení předmětu tohoto vynálezu;

obr. 3 znázorňuje boční pohled v řezu na hlavní součásti a složky třetího výhodného provedení předmětu tohoto vynálezu;

obr. 4 znázorňuje švové linie u výhodného provedení předmětu tohoto vynálezu v čelním nárysném pohledu;

-8CZ 298148 B6 obr. 5 znázorňuje hlavní součásti a složky výhodného provedení baterie podle tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

S přihlédnutím k vyobrazením na obr, 1, obr. 2 a obr. 3, která příslušně znázorňují první, druhé a třetí provedení zařízení podle tohoto vynálezu, pak toto zařízení, které je obecně označeno vztahovou značkou 10, obsahuje průhlednou a/nebo průsvitnou nádobku 20, která má horní konec 26 a spodní konec 28. Tato nádobka 20 má boční stěnu 22, která je s výhodou v podstatě válcovitá, přičemž však může mít i jiné vhodné tvary, takže může být například obdélníkovitá nebo mnohostranná. Uvedený spodní konec 28 je s výhodou vhodně tvarován za účelem minimalizace možnosti usazování. Například u výhodného provedení má tento spodní konec 28 v podstatě tvar komolého kužele, neboje alespoň opatřen směrem vzhůru skloněnými stěnami.

U druhého provedení je spodní konec 28 opatřen jednou směrem vzhůru skloněnou stěnou 29, U třetího provedení je spodní konec 28 v podstatě válcovitý nebo alternativně konvexní. Shora uvedená uspořádání spodního konce 28 ve spojitosti s umístěním vzduchového výstupního otvoru 76 (který bude podrobněji popsán v dalším) v blízkosti spodního konce 28 umožňuje, aby vzduch, přiváděný uvedeným vzduchovým výstupním otvorem 76, uváděl obsah nádobky 20 do mísícího pohybu v blízkosti spodního konce 28, čímž je efektivně zamezováno možnosti usazování v těchto místech. Nicméně může být spodní konec 28 v podstatě zcela plochý u jiných provedení předmětu tohoto vynálezu.

Průhledná a/nebo průsvitná nádobka 20 obsahuje vnitřní plníteIný prostor 30, jehož objem leží obvykle mezi hodnotami 5 až 50 litrů, přičemž však uvedené zařízení 10 může mít alternativně vnitřní plnitelný prostor 30 větší, než 50 litrů, nebo menší, než 5 litrů. Tento vnitřní plnitelný prostor 30 může být naplněn vhodným sterilním živným prostředím 65 pro pěstování biologických buněk a/nebo tkání, a/nebo axenickou očkovací látkou, a/nebo sterilním vzduchem, a/nebo požadovanými jinými sterilními přísadami, jako jsou antibiotika nebo fungicidy, například takové, jakéjsou v dalším popsány.

U shora popsaných provedení je nádobka 20 v podstatě nepevná, neboť je vyrobena s výhodou z nepevného plastického materiálu, vybraného ze skupiny, obsahující například polyetylén, polykarbonát, kopolymer polyetylénu a nylon, PVC a EVA. Popřípadě může být nádobka 20 vyrobena z laminátového vrstveného materiálu, obsahujícího více než jednu vrstvu shora uvedených materiálů.

Jak je znázorněno u třetího provedení předmětu tohoto výnálezu, vyobrazeného na obr. 3, může uvedená nádobka 20 případně obsahovat dvě soustředné vnější steny 24 za účelem zvýšení mechanické pevnosti a za účelem minimalizace rizika kontaminace obsahu nádobky 20 prostřednictvím stěn této nádobky 20.

U výhodného druhého a třetího provedení je uvedené zařízení 10 určeno pro aerobní použití. Proto nádobka 20 dále obsahuje vzduchové vstupní prostředky pro přivádění sterilního vzduchu ve formě vzduchových bublinek 70 do uvedeného živného prostředí 65 prostřednictvím vzduchového vstupního otvoru 72.

U shora uvedených provedení pak tyto vzduchové vstupní prostředky obsahují vstupní potrubí 74, které je připojitelné ke vhodnému zdroji vzduchu (na vyobrazeních neznázoměno), a které se rozprostírá od uvedeného vzduchového vstupního otvoru 72 k místu uvnitř uvedené nádobky 20 ve vzdálenosti dl ode dna spodního konce 28, přičemž tato vzdálenost dl má obvykle velikost kolem 1 cm, přestože může být větší nebo menší, než 1 cm.

Uvedené vstupní potrubí 74 může být vyrobeno ze silikonu nebo z jiného vhodného plastického materiálu, přičemž je s výhodou pružné či ohebné. Vstupní potrubí 74 pak obsahuje vzduchový

-9CZ 298148 B6 výstupní otvor 76 o vhodném průměru, určený k vytváření vzduchových bublinek 70 o požadovaném hlavním průměru. Tyto vzduchové bublinky 70 nejenom provzdušňují živné prostředí 65,j| avšak rovněž slouží k promíchávání obsahu nádobky 20, čímž přispívají k minimalizaci možnosti usazování u spodního konce 28, jak již bylo shora popsáno. Velikost bublinek, dodávaných| vzduchovými vstupními prostředky, se bude měnit v závislosti na využití daného zařízení 10,í přičemž bude ležet v rozmezí od méně, než l mm do více, než 10 mm v průměru..·|

V některých případech, týkajících se zejména pěstování buněk, mohou malé bublinky skutečně| poškozovat buněčné stěny, přičemž hlavní průměr bublinek, který není menší, než 4 mm, v pod-| statě řeší tento potenciální problém. V jiných případech jsou mnohem menší bublinky výhodné, takže je možno na vzduchovém výstupním otvoru využívat rozstřikovače nebo kropítka za účelem snižování velikosti vzduchových bublinek 70. A ještě v jiných případech mohou být optimální vzduchové bublinky 70 o průměru 10 mm nebo dokonce větším. Uvedený vzduchový výstupní otvor 76 může být fixován v příslušné poloze u uvedeného spodního konce 28 prostřednictvím provazu či řetězu (na vyobrazeních neznázoměno) nebo jinými prostředky, známými z dosavadního stavu techniky.

U jiných provedení předmětu tohoto vynálezu je uvedené zařízení 10 určeno pro anaerobní použití, takže neobsahuje uvedené vzduchové přívodní prostředky.

Uvedená nádobka 20 je dále opatřena plynovými výstupními prostředky pro odvádění přebytečného vzduchu a/nebo odpadních plynů z uvedené nádobky 20, Tyto plyny se shromažďují u uvedeného horního konce 26 uvedené nádobky 20. Tyto plynové výstupní prostředky mohou obsahovat potrubí 90, opatřené vstupním otvorem 96 na uvedeném horním konci 26 nebo v jeho blízkosti, a to ve vzdálenosti d4 od dna uvedeného spodního konce 28, přičemž tato vzdálenost d4 má pro výhodné provedení předmětu tohoto vynálezu velikost obvykle 90 cm.

Uvedené potrubí 90 může být vyrobeno ze silikonu nebo z jiného vhodného plastického materiálu, přičemž je s výhodou pružné či ohebné. Toto uvedené potrubí 90 je možno připojit k vhodným výstupním prostředkům (na vyobrazeních neznázoměno), a to pomocí známých prostředků. Uvedené výstupní prostředky dále obsahují takové prostředky, jako je například vhodný jednocestný ventil nebo filtr, určený pro podstatné zamezení vstupu znečišťujících látek do uvedené nádobky 20 uvedenými plynovými výstupními prostředky.

Alespoň část horního konce 26 může být vhodně uspořádána tak, aby bylo usnadněno shromažďování odpadních plynů ještě předtím, než budou odvedeny uvedeným vstupním otvorem 96. Takže u výhodného prvního a druhého provedení je horní část horního konce 26 postupně zúžena až na minimální průřezovou plochu v blízkosti umístění vstupního otvoru 96. Alternativně muže být alespoň horní část horního konce 26 vytvořena příslušně ve tvaru komolého kužele nebo může být konvexní.

Uvedená nádobka 20 je dále opatřena aditivními přídavnými vstupními prostředky pro přivádění uvedené očkovací látky a/nebo uvedeného živného prostředí a/nebo uvedených přísad či přídavných látek do uvedené nádobky 20. U shora uvedených provedení předmětu tohoto vynálezu pak uvedené aditivní přídavné vstupní prostředky obsahují vhodné potrubí 80, opatřené výstupním otvorem 86, umístěným s výhodou na uvedeném horním konci 26 nebo v jeho blízkosti, a to ve vzdálenosti d3 ode dna uvedeného spodního konce 28, přičemž vzdálenost d3 má pro výhodné provedení obvykle velikost přibližně 68 cm.

Uvedené potrubí 80 může být vyrobeno ze silikonu nebo z jiného plastického materiálu, přičemž je s výhodou pružné či ohebné. Uvedené potrubí 80 je možno známými prostředky připojit ke vhodnému sterilnímu přívodu uvedené očkovací látky a/nebo uvedeného živného prostředí a/nebo uvedených přísad či přídavných látek.

-10CZ 298148 B6

Uvedené aditivní přídavné vstupní prostředky dále obsahují prostředky pro podstatné zamezení j vstupu znečišťujících látek do uvedené nádobky 20 prostřednictvím těchto aditivních přídavných vstupních prostředků, přičemž v tomto provedení obsahují vhodný jednocestný ventil nebo filtr 84. Obvykle pak hladina obsahu nádobky 20 zůstává pod hladinou uvedeného výstupního otvoru ⁵ 86Uvedená nádobka 20 dále obsahuje opětovně využitelné sklízeči prostředky pro sklízení alespoň požadované první části uvedeného živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, což umožňuje v případě potřeby využívat uvedené zařízení 10 nepřetržitě pro alespoň jeden následující pěstební cyklus. Zbývající druhá část uvedeného živného prostředí, obsahujícího buňky 10 a/nebo tkáně, slouží jako očkovací látka pro další pěstební a sklízeči cyklus, který je opatřen uvedeným živným prostředím a/nebo uvedenými požadovanými přísadami.

Uvedené sklízeči prostředky mohou být rovněž využívány pro přivádění originálního objemu očkovací látky do nádobky 20, stejně jako pro umožnění toho, aby sklízený materiál zde mohl 15 protékat a vytékat ven z nádobky 20, U shora uvedeného provedení předmětu tohoto vynálezu pak sklízeči prostředky obsahují potrubí 50, opatřené vstupním otvorem 52, který je propojen s vnitřním prostorem 30, a výstupním otvorem 56, který' leží na vnější straně uvedené nádobky 20.

Uvedené potrubí 50 může být vyrobeno ze silikonu nebo z jiného vhodného plastického materiálu, přičemž je s výhodou pružné či ohebné. Uvedení potrubí 50 má poměrně velký průměr, obvykle kolem 2 cm, neboť sklízené buňky a/nebo tkáně, které tímto potrubím 50 protékají, mohou obsahovat hrudky buněčných částic, které by mohly užší potrubí ucpat.

Vstupní otvor 52 je s výhodou umístěn v blízkosti spodního konce 28 uvedené nádobky 20, takže je sklízen pouze obsah nádobky 20 nad tímto vstupním otvorem 52. Takže na konci každého sklízeč ího cyklu pak uvedená druhá část živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, zůstává automaticky u uvedeného spodního konce 28 uvedené nádobky 20 až k úrovni pod úrovní 51 uvedeného vstupního otvoru 52, který je umístěn ve vzdálenosti d2 ode dna uvedeného spodního konce 28. Velikost této vzdálenosti d2 je u příkladného výhodného provedení zhruba 25 cm.

Alternativně může být uvedený vstupní otvor 52 umístěn v nejspodnějším bodě uvedené nádobky

20, přičemž pracovník z obsluhy může manuálně zajistit, že vhodná část živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, zůstane v nádobce 20 po ukončení sklizně požadované části živné35 ho prostředí s buňkami a/nebo tkáněmi.

Uvedené sklízeči prostředky dále obsahují prostředky pro řízení průtoku, jako například vhodný ventil 54, a/nebo aseptickou přípojku 55 pro uzavírání nebo pro umožnění průtoku materiálu dovnitř nebo ven z uvedené nádobky 20 prostřednictvím uvedených sklízečích prostředků.

Uvedená aseptická přípojka 55 bývá obvykle vyrobena z nerezové oceli, přičemž z dosavadního stavu techniky je známa celá řada vhodných příkladů.

Uvedené sklízeči prostředky dále s výhodou ještě obsahují prostředky pro zabránění znečištění či kontaminaci za účelem podstatného zamezení přivádění znečišťujících látek do uvedené nádobky 45 20 přes uvedené sklízeči prostředky po ukončení sklizně.

U výhodného druhého a třetího provedení předmětu tohoto vynálezu pak uvedené prostředky pro zamezení znečištění obsahují tekutinový sifon 300. Tento tekutinový sifon 300 má s výhodou v podstatě tvar duté trubice ve tvaru písmene U, jejíž jedno rameno je připevněno k výstupnímu 50 otvoru 56 uvedených sklízečích prostředků, zatímco druhé rameno je opatřeno vnějším otvorem

58. Sklízené buňky nebo tkáně mohou proudit ven ze zařízení 10 přes uvedené sklízeči prostřed- ky, přes tekutinový sifon 300 a přes uvedený vnější otvor 58, za kterým jsou shromažďovány do vhodné přijímací nádrže, jak bude v dalším podrobněji popsáno.

- 11 CZ 298148 B6

Po ukončení sklizně může být do sklízečích prostředků přiváděn vzduch, a to výstupním otvorem 56, což je doprovázeno určitým zpětným prouděním sklízeného materiálu, čímž může potenciálně dojít ke vstupu znečišťujících látek do zařízení 10. Tekutinový sifon 300 ve tvaru duté trubice ve tvaru písmene U řeší tento potenciální problém, neboť zachycuje určitý sklízený materiál, to jest buňky a tkáně, směrem dolů ve směru proudění od výstupního otvoru 56, čímž zabraňuje tomu, aby se do sklízečích prostředků mohl dostat vzduch a případné znečišťující látky.

Čas od času jsou sklízeči prostředky uzavřeny uvedeným ventilem 54, tekutinový sifon 300 ve formě trubice ve tvaru písmene U je odejmut a je obvykle sterilizován pro další využití neboje vyřazen. Tento tekutinový sifon 300 ve formě trubice ve tvaru písmene U může být vyroben z nerezové oceli nebo z jiného vhodného pevného plastického materiálu.

U shora uvedených provedení uvedená zbývající druhá část uvedeného živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, obvykle obsahuje mezi 10 a 20 % původního objemu uvedeného živného prostředí a uvedené očkovací látky, přičemž tato uvedená druhá část může být v případě potřeby větší, než 20 %, a to až do výše 45 % nebo více, nebo může být menší, než 10 %, a to až do výše 2,5 % nebo méně z uvedeného původního objemu.

Uvedené zařízení 10 může případně dále obsahovat připevňovací prostředky pro připevnění tohoto zařízení 10 k přečnívající nosné konstrukci. U shora uvedených provedení může takováto nosná konstrukce obsahovat tyč 100 (viz obr. 1 a obr. 2) nebo prstence (na vyobrazeních neznázoměno). U třetího provedení předmětu tohoto vynálezu mohou uvedené připevňovací prostředky obsahovat hák 25, který je s výhodou integrálně připevněn k uvedenému hornímu konci 26 uvedené nádobky 20.

Alternativně pak, jak je příslušně znázorněno u výhodného prvního a druhého provedení na obr. 1 a na obr. 2, mohou uvedené připevňovací prostředky obsahovat s výhodou pružné a v podstatě válcové závěsné oko 27 z vhodného materiálu, obvykle ze stejného materiálu, jaký byl použit pro nádobku 20, přičemž může být toto závěsné oko 27 provedeno buď integrálně se zařízením JO, nebo může být vhodně připevněno (například tavným svařováním) k hornímu konci 26 zařízení

10.

Uvedená nádobka 20 může být vytvořena tavným spojováním dvou vhodných listů nebo pásů vhodného materiálu, jak bylo již shora řečeno, a to podél předem stanovených švů či svarů.

Jak je vidět na vyobrazení podle obr. 4, mohou být dva pásy 200 materiálu vyříznuty do přibližně podlouhlého obdélníkového tvaru a umístěny vzájemně jeden na druhý. Tyto pásy 200 jsou poté tavným způsobem vzájemně ksobě spojeny, a to způsobem, který je z dosavadního stavu techniky velmi dobře a všeobecně znám, takže vytvářejí švy podél obvodu 205 další strany a podél obvodu 206 delší strany a rovněž podél obvodu jednoho z kratších konců 210, a opět rovnoběžně a směrem dovnitř umístěny vytvářejí šev 220 na horním konci nádobky 20.

Tavné švové svaiy 207 a 208 podél delších stran, umístěné mezi těmito rovnoběžnými krátkými koncovými švy 210 a 220, mohou být odříznuty nebo jinak odstraněny, přičemž zde může být efektivně ponechána smyčka materiálu, vytvářej ící závěsné oko 27.

Spodní konec 28 nádobky 20 je vytvořen tavným spojením zbývajícího krátkého konce pásů podél dvou skloněných švových linií 230 a 240, které se vzájemně sbíhají od švových svarů 205 a 206 delších stran. Popřípadě mohou být dvě skloněné švové linie 230 a 240 spojeny nad vrcholem jiné linie tavného švového svaru 260, přibližně kolmé na švové svary 205 a 206 delší strany.

Ještě před započetím tavného svařování dvou pásů materiálu k sobě mohou být tavně navařeny pevné plastické výstupky 270, 290, 280 a 250 v místech, která odpovídají příslušně uvedeným vzduchovým vstupním prostředkům, vzduchovým výstupním prostředkům, aditivním přídavným

-12CZ 298148 B6 vstupním prostředkům a sklízecím prostředkům. Tyto pevné plastické výstupky 270, 290, 280 a 250 vytvářejí vhodné mechanické připevňovací body pro každý zodpovídajících vstupních a výstupních prostředků.

U všech provedení je zařízení 10 vyrobené z materiálu nebo z materiálů, které jsou biologicky kompatibilní neboli slučitelné, a které umožňují, aby mohla být nádobka 20 před prvním použitím řádně sterilizována.

Tento vynález se rovněž týká baterie zařízení najedno použití pro axenické pěstování a sklízení buněk a/nebo tkání v cyklech, přičemž každé z většího počtu těchto zařízení je konstrukce a provozně podobné uvedenému zařízení 10, tak, jak bylo shora definováno a popsáno.

Jak je znázorněno na vyobrazení podle obr. 5, tak baterie 500 obsahuje větší počet uvedených zařízení 10, která jsou nesena na rámu nebo na rámech (na vyobrazení neznázoměno) prostřednictvím uvedených připevňovacích prostředků. Obvykle může být baterie 500 rozdělena do většího počtu skupin, přičemž každá z těchto skupin obsahuje určitý počet zařízení JO.

U výhodného provedení předmětu tohoto vynálezu jsou uvedené vzduchové vstupní prostředky zařízení 10 v každé skupině spolu vzájemně propojeny. Takže uvedená vzduchová vstupní potrubí 74 každého zařízení 10 příslušné skupiny jsou připojena kc společnému potrubí 174, které má volný konec, který je opatřen aseptickou přípojkou 175. Sterilizovaný vzduch je dodáván vhodným vzduchovým kompresorem 100, opatřeným vhodnými sterilizačními prostředky 110, jako je například jeden nebo několik filtrů. Tento kompresor 100 je opatřen výtlačným potrubím 101, které rhá na svém volném konci aseptickou přípojku 176, která bývá obvykle připojitelná k uvedené aseptické přípojce 175, umístěné na volném konce společného potrubí 174.

Toto spojení je prováděno na počátku každého běhu pěstovacího a/nebo sklízecího cyklu v mobilním sterilním krytu 380, jehož účelem je zabezpečit sterilní podmínky a udržovat tyto sterilní podmínky během spojování. Tento mobilní sterilní kryt 380 poskytuje jednoduchý a poměrně nenákladný systém pro připojování různých obslužných příslušenství, jako je vzduch, tekutiny, očkovací látky a sklízené buňky, ke skupinám zařízení 10 za v podstatě sterilních podmínek.

Obdobně pak na konci každého běhu pěstovacího a/nebo sklízecího cyklu jsou aseptické přípojky 175 a 176 pod mobilním sterilním krytem 380 rozpojeny a použitá zařízení jsou vyřazena, čímž je umožněno, aby aseptická přípojka 175 na kompresorovém konci byla připojena k aseptické přípojce 176 nové skupiny zařízení JO. Sterilizovaný vzduch je obvykle dodáván nepřetržitě, nebo může být alternativně dodáván v předem stanovených impulzech během každého pěstebního cyklu.

U výhodného provedení předmětu tohoto vynálezu je přebytečný vzduch a/nebo odpadní plyny z každého z uvedených zařízení odváděn do atmosféry prostřednictvím společného potrubí 290, které je vhodně připojeno ke každým odpovídajícím prostředkům 90 pro odvádění plynu. Uvedené společné potrubí 290 je opatřeno vhodnými prostředky 210, jako je například jeden nebo více filtrů, a to za účelem zabránění možnosti proudění znečišťujících látek do uvedených zařízení 10. Alternativně může být umožněno, aby každé prostředky 90 pro odvádění plynu každého zařízení 10 mohly být individuálně odvětrány do atmosféry, a to s výhodou přes vhodné filtry, které by měly v podstatě zabránit proudění znečišťujících látek do zařízení 10.

Živná prostředí a'příslušné přísady jsou obsaženy v jedné nebo v několika zásobních nádržích 340. Například mikroskopické prvky, makroskopické prvky a vitaminy mohou být uloženy v různých nádržích, zatímco přísady, jako například antibiotika a fungicidy, mohou být rovněž uloženy v ještě dalších oddělených nádržích.

Čerpací prostředky 345, obsluhující každou nádrž, umožňují, aby byly požadované relativní poměry každé složky živného prostředí a/nebo přísad dodávány v předem stanoveném a řízeném

- 13LZ Zy»L48 B6 průtokovém množství a předem stanovenou a řízenou průtokovou rychlostí do statického mísíce1

350, kterým protéká z vhodného přívodu 360 voda, která je buď destilovaná, nebo je vhodněi filtrována a vyčištěna, přičemž tomuto průtoku vody s výhodou napomáhají vhodné čerpací prostředky 365 (viz obr. 5),j i Nastavením průtokových rychlostí čerpacích prostředků 345 a 365 může být například řízena koncentrace živného prostředí stejně jako koncentrace dostupných přísad, dodávaných do uvede-Ί ných zařízení 10. Živné prostředí a/nebo přísady, smíšené s vodou, mohou být poté dodávány1 z uvedeného statického mísiče 350 za sterilních podmínek přes filtr 310 a přes přívodní napájecí' potrubí 370, které je na svém volném konci 390 opatřeno aseptickou přípojkou 375.

U příkladného provedení předmětu tohoto vynálezu je vstup aditivního přídavného potrubí 80 každého odpovídajícího zařízení 10 ve skupině uvedených zařízení připojen ke společnému potrubí 180. které je na svém volném konci opatřeno společnou aseptickou přípojkou 376. Tato společná aseptická přípojka 376 může být poté připojena v uvedeném mobilním sterilním krytu 380 k aseptické přípojce 375 na volném konci 390 přívodního napájecího potrubí 370 pro přívod živného prostředí a přísad, čímž je umožněno, že do každého zařízení 10 baterie 500 nebo příslušné skupiny bude dodáváno živné prostředí a příslušné přísady.

Na konci životnosti zařízení 10 a ještě před vyřazením těchto zařízení 10 jsou aseptické přípojky 375 a 376 pod sterilním krytem 380 rozpojeny. Aseptická přípojka 375 je poté připravena k připojení k nové aseptické přípojce 376 další sterilizované skupiny nových zařízení 10 baterie 500, která jsou připravena pro absolvování dalšího běhu pěstovacích a/nebo sklízečích cyklů.

Sterilní kryt 380 může být rovněž využit pro připojování nádrže 350 na živné prostředí a/nebo přísady ke každému jednotlivému zařízení 10 z celého počtu skupin těchto zařízení 10 v baterii 500, a to postupně v průběhu užitné životnosti těchto zařízení 10 v uvedených skupinách. Byla-li tedy například jedna skupina zařízení 10 obsloužena živným prostředím a/nebo přísadami, je aseptická přípojka 376 této skupiny dočasně asepticky utěsněna ve sterilním krytu 380, který se poté přesune k další skupině zařízení W, kde je jejich společná aseptická přípojka 376 připojena ke sterilní přípojce 375 přívodního napájecího potrubí 370, čímž je umožněno, aby mohla být tato skupina zařízení 10 obsloužena živným prostředím a/nebo přísadami.

U jiného provedení předmětu tohoto vynálezu může být mobilní sterilní kryt 380 využit ke vzájemnému připojení volného kolonce 390 s výhodou pružného a ohebného přívodního potrubí, připojeného k uvedené statické směšovací nádrži 350, k aditivním přídavným vstupním prostředkům každého zařízení 10 za sebou. Uvedený mobilní sterilní kryt 380 se poté může posunout od jednoho uvedeného zařízení 10 k dalšímu, přičemž je pokaždé uvedený volný konec 390 připojen ke vstupnímu konci odpovídajícího potrubí 80 za účelem umožnění přívodu živného prostředí do každého zařízení 10 za sebou.

Mobilní sterilní kryt 380 společně s aseptickými připojovacími prostředky, vyrobenými s výhodou z nerezové oceli, na uvedeném konci 390 a na vstupu potrubí 80 příslušného odpovídajícího zařízení 10 umožňuje, aby každé zařízení 10 mohlo být snadno připojeno ke konci 390 a následně od tohoto konce 390 snadno odpojeno, čímž je umožněno provádění přívodu živného prostředí za sterilních podmínek. Celá řada dalších případů vhodných spojovacích prostředků pro vzájemné spojování trubek je z dosavadního stavu techniky velmi dobře a všeobecně známa.

Na konci 390 a na potrubí 80 jsou uspořádány vhodné filtry, které jsou určeny k zabránění nebo alespoň k minimalizaci potenciálního možného znečištění obsahu nádobky. Sterilní kryt 380 tak může být automaticky nebo manuálně přemísťován od zařízení 10 k zařízení 10, přičemž u každého dalšího zařízení 10 může pracovník obsluhy připojit toto zařízení 10 k přívodu živného prostředí s využitím mobilního sterilního krytu 380, může naplnit zařízení 10 příslušným vhodným množstvím živného prostředí a/nebo příslušných přísad, a může následně odpojit sterilní kryt 380 od zařízení 10, takže se tento sterilní kryt 380 může přesunout k následujícímu zařízení j_0.

-14UZ 298148 B6

Konec 390 může být pochopitelně přizpůsoben tak, aby obsahoval větší množství připojovacích prostředků 375, než pouze jedinou sterilizovanou aseptickou přípojkou 375, takže může být připojeno více než jedno zařízení 10, a zejména stejné množství těchto zařízení 10, opatřené příslušnými odpovídajícími spojovacími prostředky 376 může být současně připojeno k přívodu živného prostředí prostřednictvím vozíku 380.

Pokaždé před připojením uvedeného konce 390 ke každému zařízení 10 nebo k soupravě či skupině těchto zařízení 10 jsou příslušné odpovídající spojovací prostředky 375 a 376 obvykle autoklávově sterilizovány.

U ještě jiného provedení baterie 500 pak jediné potrubí nebo sada takovýchto potrubí (na vyobrazení neznázoměno) připojuje uvedený statický mísič 350 k uvedenému zařízení 10 nebo k příslušné odpovídající skupině těchto zařízení 10 současně, přičemž dopravníkový systém přepravuje zařízení 10 nebo skupinu těchto zařízení 10 k uvedenému jedinému potrubí nebo sadě takovýchto potrubí nebo naopak. Po naplnění uvedeného zařízení 10 nebo celé skupiny těchto zařízení 10 pak dopravník umožňuje, aby ke statickému mísiči 350 byla připojena další zařízení 10 nebo skupina těchto zařízení JO, a to prostřednictvím uvedeného jediného potrubí nebo prostřednictvím sady takovýchto potrubí.

U výhodného provedení předmětu tohoto vynálezu jsou sklízeči prostředky každého ze zařízení 10 ve skupině spolu vzájemně propojeny. Takže sklízeči potrubí 50 každého uvedeného zařízení 10 je připojeno ke společnému sklízecímu potrubí 154, majícímu volný konec 150, který je opatřen aseptickou přípojkou 155.

Každé z uvedených sklízečích potrubí 50 může být s výhodou opatřeno ventilem 54, jak již bylo shora popsáno, který je určen k uzavření nebo k umožnění průtoku sklízených buněk z každého příslušného odpovídajícího zařízení 10. Takže například bylo-li zjištěno, zeje určitý počet zařízení 10 v určité skupině těchto zařízení 10 znečištěn, zatímco ostatní zařízení znečištěna nejsou, mohou být buňky z těchto neznečištěných zařízení 10 sklizeny bez obav, že by byly znečištěny z jiných zařízení, a to tak dlouho, pokud zůstanou ventily 54 u znečištěných zařízení 10 uzavřeny.

Uvedené společné potrubí je dále s výhodou opatřeno společným uzavíracím ventilem 259. umístěným vzhůru proti proudu do uvedené aseptické přípojky 155. Uvedené prostředky pro zabránění znečištění jsou s výhodou uspořádány pro podstatné zamezování přístupu znečišťujících látek do uvedené nádobky přes uvedené sklízeči prostředky po ukončení sklizně.

U výhodného provedení předmětu tohoto vynálezu jsou uvedené prostředky pro zabránění znečištění tvořeny v podstatě tekutinovým sifonem 400 ve tvaru písmene U, který je na jednom svém rameni opatřen aseptickou přípojkou 156, přičemž je na jeho druhém rameni uspořádán otvor 158, který je propojen s přijímací nádrží 5590. Aseptické přípojky 155 a 156 jsou poté vzájemně spojeny v uvedeném mobilním sterilním krytu 380 za sterilních podmínek.

Sklízení je poté zahájeno otevřením ventilů 54 u všech zařízení 10 ve skupině, která není znečištěna, stejně jako otevřením společného uzavíracího ventilu 259. Buňky ze skupiny budou poté proudit do přijímací nádrže 590, s výhodou působením zemské přitažlivosti, přičemž může být v určitých případech použito i vhodného čerpadla. Po ukončení sklizně mohou být aseptické přípojky 155 a 156 rozpojeny v uvedeném mobilním sterilním krytu 380, který se pak může přesunout k následující skupině zařízení j0. Odpovídající aseptická přípojka 155 této následující skupiny může být poté vzájemně spojena s aseptickou přípojkou 156 tekutinového sifonu 400 ve tvaru písmene U, čímž je umožněno, aby byly sklízeny buňky z této skupiny zařízení j0.

U jiného provedení předmětu tohoto vynálezu může jediné potrubí nebo sada takovýchto potrubí (na vyobrazeních neznázoměno) spojovat uvedenou společnou přijímací nádrž s uvedeným zařízením 10 nebo s odpovídající skupinou těchto zařízení 10 současně, přičemž dopravníkový

-15CZ 298148 B6 systém přepravuje zařízení 10 nebo skupinu zařízení 10 k jedinému potrubí nebo ksadě takovýchto potrubí nebo naopak. Po ukončení sklizně uvedeného zařízení 10 nebo skupiny těchto zařízení 10 pak dopravník umožní, aby bylo další zařízení 10 nebo skupina takových zařízení 10 připojeno k uvedené společné přijímací nádrži prostřednictvím uvedeného jediného potrubí nebo prostřednictvím sady takovýchto potrubí.

U jiného provedení předmětu tohoto vynálezu může být každé zařízení 10 sklízeno individuálně, přičemž uvedené sklízeči prostředky každého zařízení 10 obsahují uvedené prostředky pro zabránění znečištění, určené k podstatnému zabránění vniknutí znečišťujících látek do uvedené nádobky přes uvedené sklízeči prostředky po ukončení sklizně. U tohoto provedení pak uvedené prostředky pro zabránění znečištění obsahují tekutinový sifon 400 ve tvaru písmene U, který byl již dříve popsán a který je opatřen aseptickou přípojkou 156 na svém jednom rameni, zatímco jeho druhé rameno je opatřeno otvorem 158, který je propojen s přijímací nádrží 590.

Uvedené sklízeči prostředky jsou opatřeny aseptickou přípojkou 55, která může být spojena s aseptickou přípojkou 156 tekutinového sifonu 400 ve tvaru písmene U v uvedeném mobilním sterilním krytu 380 za sterilních podmínek. Sklízení je poté zahájeno otevřením ventilu 54 zařízení 10, přičemž buňky začnou proudit do přijímací nádrže 590 s výhodou působením zemské přitažlivosti, přestože je možno v určitých případech použít vhodného čerpadla.

Po ukončení sklizně mohou být tyto aseptické přípojky 55 a 156 rozpojeny v uvedeném mobilním sterilním krytu 380, který se poté může přesunout k dalšímu zařízení j0. Odpovídající příslušná aseptická přípojka 55 sklízečích prostředků tohoto zařízení může být poté připojena k aseptické přípojce 156 tekutinového sifonu 400 ve tvaru písmene U, čímž je umožněno, aby mohla být prováděna sklizeň tohoto dalšího zařízení 10.

U výhodného provedení předmětu tohoto vynálezu může být uvedených sklízečích prostředků rovněž využito pro počáteční přiváděči očkovací látky při započetí nového běhu pěstovacího a/nebo sklízecího cyklu. Takže očkovací látka může být smíchána se sterilizovaným živným prostředím ve vhodné nádrži, opatřené přívodním potrubím, které má na svém volném konci aseptickou přípojku, která je připojena k uvedené aseptické přípojce 155 společného sklízecího potrubí 154 v mobilním sterilním krytu 380. Poté je umožněno, aby očkovací látka proudila působením zemské přitažlivosti nebo s pomocí vhodného čerpadla do každého ze zařízení 10 ve skupině uvedeným společným sklízecím potrubím 154, načež jsou poté aseptické přípojky v mobilním sterilním krytu 380 rozpojeny.

Alternativně může být uvedená očkovací látka přiváděna do zařízení přes uvedené aditivní přídavné vstupní prostředky, zejména prostřednictvím uvedeného aditivního přídavného společného potrubí 180, a to obdobným způsobem jako tomu bylo u výše popsaného způsobu, týkajícího se sklízečích prostředků a společného sklízecího potrubí 155.

Vynález se rovněž týká způsobu pěstování a sklízení buněk a/nebo tkání v zařízení na vícenásobné použití, přičemž tento způsob zahrnuje následující kroky:

a) opatření uvedeného zařízení JO, které bylo shora definováno;

b) přivádění sterilního vzduchu do uvedené nádobky prostřednictvím uvedených vzduchových přívodních prostředků během každého cyklu, a to buď nepřetržitě, nebo v jednotlivých impulzech;

c) přivádění sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad prostřednictvím aditivních přídavných vstupních prostředků;

d) přivádění axenické očkovací látky prostřednictvím uvedených sklízečích prostředků;

e) případné osvětlování uvedené nádobky pomocí vnějších světelných prostředků;

-16CZ 298148 B6

f) umožnění růstu uvedených buněk a/nebo tkání v uvedeném živném prostředí až do požadované výtěžnosti;

g) nepřetržité umožňování odvádění přebytečného vzduchu a/nebo odpadních plynů z uvedené nádobky prostřednictvím uvedených plynových odváděčích prostředků;

h) kontrola znečištění a/nebo kvality buněk a/nebo tkání, které jsou pěstovány v uvedené nádobce: pokud byla zjištěna přítomnost znečišťujících látek nebo pokud bylo zjištěno, že buňky a/nebo tkáně, které jsou pěstovány, mají nízkou kvalitu, je zařízení ]0 a jeho obsah vyřazeno; pokud nebyly zjištěny znečišťující látky, je prováděn krok i);

i) pěstování alespoň uvedené požadované první části uvedeného živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, při ponechání zbývající uvedené druhé části živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, v uvedené nádobce, přičemž uvedená první část živného prostředí může sloužit jako očkovací látka pro další pěstovací a/nebo sklízeči cyklus;

j) přivádění uvedeného sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad pro další pěstovací a/nebo sklízeči cyklus prostřednictvím uvedených aditivních přídavných přiváděčích prostředků;

k) opakování kroků b), e), f), g), h), i) a j) mnohokrát až do té doby, kdy je v kroku h) zjištěna přítomnost znečišťujících látek nebo kdy je zjištěno, že pěstované buňky a/nebo tkáně mají nízkou kvalitu, na základě čehož je zařízení 10 a jeho obsah vyřazeno.

Vynález se rovněž týká způsobu axenického pěstování a sklízení buněk a/nebo tkání anaerobně v baterii použitelných zařízení, přičemž tento způsob zahrnuje následující kroky:

a) opatření baterie 500 alespoň jedné skupiny uvedených zařízení JO, přičemž tato zařízení ]0 neobsahují vzduchové přiváděči prostředky alespoň pro jedno z uvedených zařízení 10;

b) přivádění axenické očkovací látky do uvedeného zařízení 10 prostřednictvím společného sklízecího potrubí;

c) přivádění sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad do uvedeného zařízení 10 prostřednictvím uvedeného společného aditivního přídavného vstupního potrubí;

d) případné osvětlování uvedeného zařízení 10 pomocí vnějších světelných prostředků;

e) umožnění růstu uvedených buněk a/nebo tkání v uvedeném zařízení 10 v uvedeném živném prostředí až do požadované výtěžnosti;

f) umožnění odvádění přebytečného vzduchu a/nebo odpadních plynů z uvedeného zařízení ,10

g) kontrola znečištění a/nebo kvality buněk a/nebo tkání, které jsou pěstovány v uvedeném zařízení 10: pokud byla v uvedeném zařízení 10 zjištěna přítomnost znečišťujících látek nebo pokud bylo zjištěno, že buňky a/nebo tkáně, které jsou pěstovány, mají nízkou kvalitu, jsou uvedené sklízeči prostředky uvedeného zařízení 10 uzavřeny za účelem zabránění znečištění dalších uvedených zařízení 10 v uvedené oblasti 500; pokud byly ve všech z uvedených zařízení 10 uvedené baterie 500 zjištěny znečišťující látky nebo byla zjištěna nízká kvalita pěstovaných buněk a/nebo tkání, jsou veškerá zařízení 10 a jejich obsahy vyřazeny; pokud nebyly znečišťující látky zjištěny a kvalita pěstovaných buněk a/nebo tkání je přijatelná, je zařízení 10 považováno za schopné ke sklízení a je prováděn krok h);

h) pro každé uvedené zařízení 10, schopné ke sklízení z kroku g), je prováděna sklizeň alespoň požadované první části uvedeného živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně prostřednictvím uvedeného společného sklízecího potrubí a uvedených prostředků pro zabránění znečištění do vhodné přijímací nádrže při ponechání uvedené druhé části živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, v uvedené nádobce, přičemž uvedená druhá část živného prostředí slouží jako očkovací látka pro další pěstování a/nebo sklízeči cyklus;

i) přivádění uvedeného sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad pro další pěstovací a/nebo sklízeči cyklus prostřednictvím uvedených aditivních přídavných přiváděčích prostředků;

j) opakování kroků d), e), f), g)> h) a i) mnohokrát až do té doby, kdy je v kroku g) zjištěna přítomnost znečišťujících látek nebo kdy je zjištěno, že pěstované buňky a/nebo tkáně mají nízkou kvalitu pro všechna uvedená zařízení 10 z uvedené baterie 500, na základě čehož jsou uvedené prostředky pro zabránění znečištění odpojeny od uvedených společných sklízečích prostředků a uvedená zařízení JO a jejich obsahy jsou vyřazeny.

Vynález se rovněž týká způsobu axenického pěstování a sklízení buněk a/nebo tkání aerobně v baterii použitelných zařízení 10, přičemž tento způsob zahrnuje následující kroky:

a) opatření baterie 500 alespoň jedné skupiny uvedených zařízení 10, přičemž tato zařízení 10 obsahují vzduchové přiváděči prostředky, které byly shora popsány, pro alespoň jedno z uvedených zařízení 10;

b) přivádění axenické očkovací látky do uvedeného zařízení 10 prostřednictvím uvedeného společného sklízecího potrubí;

c) přivádění sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad do uvedeného zařízení 10 prostřednictvím uvedeného společného aditivního přídavného vstupního potrubí;

d) přivádění sterilního vzduchu do uvedeného zařízení 10 prostřednictvím společného vzduchového přívodního potrubí;

e) případné osvětlování uvedeného zařízení 10 pomocí vnějších světelných prostředků;

f) umožnění růstu uvedených buněk a/nebo tkání v uvedeném zařízení 10 v uvedeném živném prostředí až do požadované výtěžnosti;

g) umožnění odvádění přebytečného vzduchu a/nebo odpadních plynů z uvedeného zařízení 10 nepřetržitě prostřednictvím uvedeného společného plynového odváděcího potrubí;

h) kontrola znečištění a/nebo kvality buněk a/nebo tkání, které jsou pěstovány v uvedeném zařízení j_0: pokud byla v uvedeném zařízení 10 zjištěna přítomnost znečišťujících látek nebo pokud bylo zjištěno, že buňky a/nebo tkáně, které jsou pěstovány, mají nízkou kvalitu, jsou uvedené sklízeči prostředky uvedeného zařízení 10 uzavřeny za účelem zabránění znečištění dalších uvedených zařízení 10 v uvedené baterii 500; pokud byly ve všech z uvedených zařízení 10 uvedené baterie 500 zjištěny znečišťující látky nebo byla zjištěna nízká kvalita pěstovaných buněk a/nebo tkání, jsou veškerá zařízení 10 a jejich obsahy vyřazeny; pokud nebyly znečišťující látky zjištěny a kvalita pěstovaných buněk a/nebo tkání je přijatelná, je zařízení 10 považováno za schopné ke sklízení a je prováděn krok i);

i) pro každé uvedené zařízení 10, schopné ke sklízení z kroku h), je prováděna sklizeň alespoň požadované první části uvedeného živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně prostřednictvím uvedeného společného sklízecího potrubí a uvedených prostředků pro zabránění znečištění do vhodné přijímací nádrže při ponechání uvedené druhé části živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, v uvedené nádobce, přičemž uvedená druhá část živného prostředí slouží jako očkovací látka pro další pěstovací a/nebo sklízeči cyklus;

j) přivádění uvedeného sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad pro další pěstovací a/nebo sklízeči cyklus prostřednictvím uvedených aditivních přídavných přiváděčích prostředků;

k) opakování kroků d), e), f), g), h), i) aj) mnohokrát až do té doby, kdy je v kroku h) zjištěna přítomnost znečišťujících látek nebo kdy je zjištěno, že pěstované buňky a/nebo tkáně mají nízkou kvalitu pro všechna uvedená zařízení 10 z uvedené baterie 500, na základě čehož jsou uvedené prostředky pro zabránění znečištění odpojeny od uvedených společných sklízečích prostředků a uvedená zařízení 10 a jejich obsahy jsou vyřazeny.

CZ.B&

Systém pro čištění vody obvykle dodává deionizovanou vodu, zbavenou pyrogenů, do nádrže, obsahující koncentrované živné prostředí, přičemž zředěné živné prostředí je poté čerpáno do| uvedeného zařízení 10 prostřednictvím uvedených aditivních přídavných přívodních prostředků.

Do přívodního potrubí a rovněž proti proudu nad uvedenými aditivními přídavnými přívodnímij prostředky bývají obvykle instalovány filtry o velikosti ok 0,2 μπι, a to za účelem minimalizaceí rizika znečištění obsahu nádobky v každém zařízení ]0. Za účelem minimalizace tohoto rizikaί může být alternativně nebo přídavně rovněž využito jednocestného ventilu.j

-i Pro první pěstovací cyklus u každého zařízení 10 je očkovací látka, obvykle vzorek typu buňky,<

kterou je zamýšleno pěstovat v uvedeném zařízení 10. předběžně směšována s živným prostředím nebo s vodou v parou sterilizované nádobce, a je přiváděna do zařízení 10 prostřednictvím sklízečích prostředků. Živné prostředí je poté přiváděno do zařízení 10 prostřednictvím uvedených aditivních přídavných přiváděčích prostředků. Pro následující cykly je přiváděno pouze živné prostředí a/nebo přísady, jak již bylo shora popsáno.

Vzduchový kompresor obvykle dodává v podstatě sterilizovaný vzduch do každého uvedeného zařízení 10 prostřednictvím celé řady filtrů: pres hrubý filtr pro odstraňování hrubších částic, přes vysoušeč a vlhkostní filtr pro odstraňování vlhkosti, a přes jemný filtr obvykle s oky o velikosti 0,2 μτη pro odstraňování znečišťujících látek. S výhodou je možno použít i dalšího filtru, umístěného zejména ve směru proti proudu od uvedených vzduchových přívodních prostředků, čímž se dále snižuje riziko znečištění obsahu nádobky.

Pro každé uvedené zařízení 10 jsou všechny přípojky k nádobce 20, to jest k uvedeným vzduchovým přívodním prostředkům, k uvedeným aditivním přídavným přívodním prostředkům, a zejména rovněž k plynovým výstupním prostředkům a ke sklízecím prostředkům sterilizovány v autoklávu před jejich použitím, přičemž jejich sterilita je udržována během připojování pomocnému vybavení, a to včetně například uvedených vzduchových přívodních prostředků a uvedených výstupních prostředků prováděním spojení ve sterilním krytu, jak již bylo shora popsáno.

Řízení a ovládání teploty je pro každé zařízení 10 s výhodou prováděno vhodnými klimatizačními prostředky. Případné osvětlování zařízení 10 může být prováděno vhodnými fluorescenčními světelnými prostředky, vhodně uspořádanými kolem uvedeného zařízení 10_T pokud je to požadováno pro růst buněk.

V průběhu každého pěstovacího cyklu je u každého zařízení 10 obsah každé příslušné nádobky 20 obvykle provzdušňován a promícháván po dobu zhruba 7 až 14 dnů nebo déle, a to při regulované teplotě a řízených světelných podmínkách.

Na konci pěstovacího cyklu jsou pro každé zařízení 10 odpovídající sklízeči prostředky obvykle připojeny k předem sterilizovanému prostředí prostřednictvím vhodných přípojek, které jsou sterilizovány před a v průběhu spojování, jak již bylo shora popsáno. Poté je prováděna sklizeň, přičemž je ponecháváno mezi zhruba 2,5 do zhruba 45 %, obvykle pak mezi zhruba 10 až zhruba 20 % buněk a/nebo tkání, které slouží jako očkovací látka pro další cyklus.

Sklizené buňky a/nebo tkáně mohou poté být podle požadavku sušeny nebo extrahovány.

Předmět tohoto vynálezu bude nyní podrobněji popsán s odkazy na následující příklady jeho provedení, které však nejsou určeny k omezování rozsahu ochrany tohoto vynálezu.

Příklad: Pěstování buněk Vinca

Byla použita skupina deseti bioreaktorů (z nichž každý je zařízením 10 podle tohoto vynálezu), každý je opatřen nádobkou, vyrobenou z polyetylen-nylon kopolymeru (tloušťka stěny 0,1 mm, průměr 20 cm, výška 1,2 m), opatřenou vstupními otvory 30 mm ve výšce 5 cm (pro vzduchové

-1929314» 86 vstupní prostředky), 25 cm (pro sklízeči prostředky), 68 cm (pro aditivní přídavné přiváděči prostředky) a 90 cm (pro plynové výstupní prostředky) ode dna, a mající efektivní účinný pinitelný objem zhruba 10 litrů. Tyto bioreaktory byly společně s jejich přípojkami sterilizovány pomocí gama záření (2,5 mRad).

Do každého bioreaktorů bylo přivedeno 9 litrů minerálního a vitamínového živného prostředí Schenk & Hildebrandt, 2 mg/1 kyseliny chlorofenoxyacetické, 2 mg/1 kyseliny dichlorofenoxyacetické, 0,2 mg/1 kinetinu, 3 % sacharózy a 900 ml náplňového objemu iniciační očkovací látky linie V24 Catharanthus roseus (Vinca) buněk. Objem vzduchu nad hladinou živného prostředí byl 10 3 1. Bylo prováděno provzdušňování s využitím průtočného objemu 1,5 1/min. sterilního vzduchu, přiváděného přes otvor o průměru 4 mm (vzduchové přívodní prostředky), umístěný ve výšce 1 cm nade dnem nádobky.

Bioreaktory byly uspořádány v místnosti s řízenou teplotou (25 °C), přičemž pěstování probíhalo 15 nepřetržitě po dobu 10 dnů, až se náplňový objem Zvýšil zhruba na 7,5 litru (75 % celkového objemu; zdvojené množství dvou dnů během logaritmické fáze). V tomto bodě časového úseku byly buňky sklizeny odebráním devíti litrů živného prostředí a buněk prostřednictvím sklízečích prostředků, přičemž bylo prostřednictvím aditivních přídavných přívodních prostředků přidáno devět litrů čerstvého sterilního živného prostředí společně s čerstvými sterilními přísadami. 20 Buňky byly opětovně sklízeny po desetidenních intervalech v šesti přídavných cyklech, přičemž po uplynutí této doby byl tento běh ukončen.

Takto byla nashromážděna celková hmotnost 6,5 kilogramů čerstvých buněk (0,5 kilogramu hmotnosti sušiny) za dobu sedmi desetidenních časových ůseků, a to z každého bioreaktorů 25 o kapacitě deset litrů. Tyto buňky měly celkový obsah 0,6 % alkaloidů, to jest stejný, jako výchozí linie.

Přestože bylo ve shora uvedeném popisu popsáno pouze několik provedení, není předmět tohoto vynálezu omezen pouze na tato provedení a je definován toliko rozsahem patentových nároků.

Claims (39)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Zařízení na jedno použití pro axenické pěstování a sklízení buněk a/nebo tkání v alespoň jednom cyklu, které obsahuje sterilizovatelnou průhlednou a/nebo průsvitnou netúhou nádobku (20) najedno použití, mající horní konec (26) a spodní konec (28), přičemž tato nádobka (20) je 40 alespoň částečně naplněna vhodným sterilním biologickým živným prostředím pro pěstování buněk a/nebo tkání, a/nebo axenickou očkovací látkou, a/nebo sterilním vzduchem, a/nebo požadovanými jinými sterilními přísadami, přičemž nádobka obsahuje:

   (i) plynové výstupní prostředky pro odvádění přebytečného vzduchu a/nebo odpadních plynů z nádobky,

   45 (ii) vstupní prostředky pro přivádění očkovací látky a/nebo živného prostředí a/nebo přísad do nádobky, vyznačující se tím, že dále obsahuje:

   (iii) opětovně využitelné sklízeči prostředky, obsahující vhodné prostředky pro regulaci průtoku pro umožnění sklízení alespoň požadované části živného prostředí, obsahujícího buňky 50 a/nebo tkáně, pro umožnění používání zařízení kontinuálně pro alespoň jeden další následu- jící pěstovací a/nebo sklízeči cyklus,

   -20CL 293143 B6 přičemž nádobka je uzpůsobena tak, aby zbytek média, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, zbývající z předcházejícího sklízecího cyklu, zůstal v nádobce a sloužil jako očkovací látka pro další pěstovací a sklízeči cyklus.
2. 2. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje vzduchové vstupní prostředky pro přivádění sterilního vzduchu ve formě bublinek do živného prostředí prostřednictvím prvního vstupního otvoru, přičemž jsou vzduchové vstupní prostředky připojitelné ke vhodnému přívodu vzduchu.
3. 3. Zařízení podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že sklízeči prostředky obsahují prostředky pro zabránění znečištění nebo pro podstatné zabránění přívodu znečišťujících látek do nádobky prostřednictvím sklízečích prostředků.
4. 4. Zařízení podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že nádobka je vytvořena z nepevného plastického materiálu.
5. 5. Zařízení podle nároku 4, vyznačující se tím, že materiál je vybrán ze skupiny, obsahující polyetylén, polykarbonát, kopolymer polyetylénu a nylon, PVC a EVA.
6. 6. Zařízení podle nároku 4 nebo 5, vyznačující se tím, že nádobka je vytvořena navrstvením více než jedné vrstvy uvedených materiálů.
7. 7. Zařízení podle kteréhokoliv z nároků 4 až 6, vyznačující se tím, že nádobka je vytvořena tavným spojením dvou vhodných pásů uvedeného materiálu podél předem stanovených švových svarů.
8. 8. Zařízení podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že vzduchové vstupní prostředky obsahují vzduchovou vstupní trubku, probíhající od vstupního otvoru k místu uvnitř nádobky na jejím spodním konci nebo v jeho blízkosti.
9. 9. Zařízení podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že alespoň některé ze vzduchových bublinek mají hlavní průměr od 1 mm do 10 mm.
10. 10. Zařízení podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že alespoň některé ze vzduchových bublinek mají hlavní průměr 4 mm.
11. 11. Zařízení podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že nádobka obsahuje vhodný filtr, uspořádaný v plynových výstupních prostředcích pro podstatné zabránění přístupu znečišťujících látek do nádobky přes tyto plynové výstupní prostředky.
12. 12. Zařízení podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že nádobka dále obsahuje vhodný filtr, uspořádaný ve vstupních prostředcích pro přivádění přísad pro podstatné zabránění přístupu znečišťujících látek do nádobky přes tyto vstupní prostředky.
13. 13. Zařízení podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že prostředky pro zabránění znečištění obsahují tekutinový sifon ve tvaru písmene U, jehož jedno rameno je asepticky namontováno na vnější výstup sklízečích prostředků pomocí vhodných aseptických spojovacích prostředků.
14. 14. Zařízení podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že sklízeči prostředky jsou umístěny u dna spodního konce nádobky.
15. 15. Zařízení podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že sklízeči prostředky jsou umístěny v blízkosti dna spodního konce nádobky, takže na konci každého sklízecího cyklu zbytek živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, automatic-i ky zůstává u spodního konce nádobky až do úrovně pod hladinou sklízečích prostředků.1
16. 16. Zařízení podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že1 zbytek živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, obsahuje od 2,5 do 45 %, s výhodou| od 10 do 20 % původního objemu živného prostředí a očkovací látky.J
17. 17. Zařízení podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že* spodní konec je v podstatě konvexní.1
18. 18. Zařízení podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že spodní konec má v podstatě tvar komolého kužele.
19. 19. Zařízení podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že nádobka má vnitřní plnitelný objem o velikosti od 5 1 do 50 1.
20. 20. Zařízení podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že dále obsahuje vhodné připevňovací prostředky pro jeho připevnění k vhodné nosné konstrukci.
21. 21. Zařízení podle nároku 20, vyznačující se tím, že připevňovací prostředky obsahují závěsné oko z materiálu, který je s výhodou integrálně připevněn k hornímu konci nádobky.
22. 22. Baterie zařízení, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň dvě zařízení na jedno použití podle kteréhokoliv z předcházejících nároků.
23. 23. Baterie podle nároku 22, vyznačující se tím, že zařízení jsou uložena na vhodné nosné konstrukci s pomocí připevňovacích prostředků každého ze zařízení.
24. 24. Baterie podle nároku 22 nebo 23, vyznačující se tím, že plynové výstupní prostředky každého ze zařízení jsou vhodně připojeny ke společnému plynovému výstupnímu potrubí, které případně obsahuje vhodné prostředky pro zabránění znečištění v důsledku proudění do zařízení.
25. 25. Baterie podle nároku 24, vyznačující se tím, že prostředky pro zabránění znečištění v důsledku proudění do zařízení obsahují vhodný filtr.
26. 26. Baterie podle kteréhokoliv z nároků 22 až 25, vyznačující se tím, že vstupní prostředky pro přivádění přísad každého ze zařízení jsou vhodně připojeny ke společnému vstupnímu potrubí pro přivádění přísad, jehož volný konec je případně opatřen vhodnými aseptickými připojovacími prostředky.
27. 27. Baterie podle nároku 26, vyznačující se tím, že volný konec je připojitelný ke vhodnému přívodu živného prostředí a/nebo přísad.
28. 28. Baterie podle kteréhokoliv z nároků 22 až 27, vyznačující se tím, že sklízeči prostředky každého ze zařízení jsou vhodně připojeny ke společnému sklízecímu potrubí, jehož volný konec je případně opatřen vhodnými aseptickými připojovacími prostředky.
29. 29. Baterie podle nároku 28, vyznačující se tím, že dále obsahuje prostředky pro zabránění znečištění pro podstatné zamezení vstupu znečišťujících látek do nádobky přes společné sklízeči potrubí.
30. 30. Baterie podle nároku 29, vyznačující se tím, že prostředky pro zabránění znečištění obsahují tekutinový sifon ve tvaru písmene U, jehož jedno rameno je volné a je cl zyai4» B6 opatřeno otvorem, přičemž jeho druhý konec je asepticky připojitelný k volnému konci společného sklízecího potrubí prostřednictvím vhodných aseptických připojovacích prostředků,
31. 31. Baterie podle nároku 30, vyznačující se tím, že volný konec tekutinového sifonu ve tvaru písmene U je připojitelný k vhodné přijímací nádrži.
32. 32. Baterie podle kteréhokoliv z nároků 22 až 31, vyznačující se tím, že vzduchové vstupní prostředky každého ze zařízení jsou vhodně připojeny ke společnému vzduchovému vstupnímu potrubí, jehož volný konec je případně opatřen vhodnými aseptickými připojovacími prostředky.
33. 33. Baterie podle nároku 32, vyznačující se tím, že volný konec je připojitelný ke vhodnému přívodu vzduchu.
34. 34. Způsob axenického pěstování a sklízení buněk a/nebo tkání v zařízení na jedno použití, obsahující následující kroky:

    a) opatření zařízení, které obsahuje steřílizovatelnou průhlednou a/nebo průsvitnou nepevnou nádobku na jedno použití, mající horní konec a spodní konec, přičemž tato nádobka je alespoň částečně naplněna vhodným sterilním biologickým živným prostředím pro pěstování buněk a/nebo tkání, a/nebo axenickou očkovací látkou, a/nebo sterilním vzduchem, a/nebo jinými sterilními přísadami, přičemž nádobka obsahuje:

    (i) plynové výstupní prostředky pro odvádění přebytečného vzduchu a/nebo odpadních plynů z nádobky, (ii) vstupní prostředky pro přivádění přísad pro přivádění očkovací látky a/nebo živného prostředí a/nebo přísad do nádobky, vyznačující se tím, že dále obsahuje:

    (iii) opětovně využitelné sklízeči prostředky, obsahující vhodné prostředky pro regulaci průtoku, pro umožnění sklízení alespoň požadované části živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, přičemž je umožněno kontinuální využívání zařízení pro alespoň jeden další následující pěstovací a/nebo sklízeči cyklus, přičemž nádobka je uzpůsobena tak, aby zbytek média obsahujícího buňky a/nebo tkáně zůstal v nádobce a sloužil jako očkovací látka pro další pěstovací a sklízeči cyklus,

    b) přivádění axenické očkovací látky s pomocí sklízečích prostředků, . c) přivádění sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad s pomocí vstupních prostředků pro přivádění přísad,

    d) případné osvětlování nádobky s pomocí vnějších světelných prostředků,

    e) umožnění růstu buněk a/nebo tkání v živném prostředí až do požadované výtěžnosti,

    f) umožnění odvádění přebytečného vzduchu a/nebo odpadních plynů z nádobky kontinuálně s pomocí plynových odváděčích prostředků,

    g) kontrolu znečištění a/nebo kvality buněk a/nebo tkání, které jsou pěstovány v nádobce: pokud byla zjištěna přítomnost znečišťujících látek, nebo pokud bylo zjištěno, že pěstované buňky a/nebo tkáně mají nízkou kvalitu, zařízení se i se svým obsahem zlikviduje, pokud nebyla zjištěna přítomnost znečišťujících látek, provádí se krok h),

    h) sklízení požadované části živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, při ponechání zbytku živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, v nádobce, přičemž tento zbytek živného prostředí slouží jako očkovací látka pro další pěstovací a sklízeči cyklus,

    i) přivádění sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad pro další pěstovací a/nebo sklízeči cyklus s pomocí vstupních prostředků pro přivádění přísad,

    j) opakování kroků d), e), f), g), h) a i) mnohokrát až do té doby, kdy je v kroku g) zjištěna přítomnost znečišťujících látek nebo kdy je zjištěno, že pěstované buňky a/nebo tkáně mají nízkou kvalitu, na základě čehož se zařízení i se svým obsahem zlikviduje.
35. 35. Způsob podle nároku 34, v y z n a č u j í c í se t í m, že zařízení dále obsahuje vzduchové vstupní prostředky pro přivádění sterilního vzduchu ve formě vzduchových bublinek do živného prostředí prostřednictvím prvního vstupního otvoru, připojitelného ke vhodnému sterilnímu přívodu vzduchu, přičemž způsob dále obsahuje krok přivádění sterilního vzduchu do vzduchových vstupních prostředků během prvního cyklu a během každého následujícího cyklu.
36. 36. Způsob podle nároku 35, vyznačující se tím, že sterilní vzduch se přivádí kontinuálně v průběhu alespoň jednoho pěstovacího cyklu.
37. 37. Způsob podle nároku 35, vyznačující se tím, že sterilní vzduch se přivádí v impulzech v průběhu alespoň jednoho pěstovacího cyklu.
38. 38. Způsob axenického pěstování a sklízení buněk a/nebo tkání v baterii zařízení na jedno použití, obsahující následující kroky:

    a) opatření baterie zařízení podle nároku 30, a pro alespoň jedno toto zařízení:

    b) přivádění axenické očkovací látky do zařízení prostřednictvím společného sklízecího potrubí,

    c) přivádění sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad do zařízení prostřednictvím společného vstupního potrubí pro přivádění přísad,

    d) případné osvětlování zařízení pomocí vnějších světelných prostředků,

    e) umožnění růstu buněk a/nebo tkání v zařízení v živném prostředí až do požadované výtěž- nosti, umožnění odvádění přebytečného vzduchu a/nebo odpadních plynů ze zařízení kontinuálně prostřednictvím společného plynového odváděcího potrubí,

    g) kontrolu znečištění a/nebo kvality pěstovaných buněk a/nebo tkání: pokud byla v zařízení zjištěna přítomnost znečišťujících látek, nebo pokud byla zjištěna nízká kvalita pěstovaných buněk a/nebo tkání, jsou sklízeči prostředky zařízení uzavřeny za účelem zabránění znečištění dalších zařízení v baterii, pokud byly ve všech ze zařízení baterie zjištěny znečišťující látky nebo byla zjištěna nízká kvalita pěstovaných buněk a/nebo tkání, jsou veškerá zařízení a jejich obsahy zlikvidovány; pokud nebyly znečišťující látky zjištěny a kvalita pěstovaných buněk a/nebo tkání je přijatelná, je zařízení považováno za schopné ke sklízení a je prováděn krok h),

    h) pro každé zařízení, schopné ke sklízení z kroku g), je prováděna sklizeň alespoň požadované části živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně prostřednictvím společného sklízecího potrubí a prostředků pro zabránění znečištění do vhodné přijímací nádrže při ponechání zbytku živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, v nádobce, přičemž druhá část živného prostředí slouží jako očkovací látka pro další pěstovací a/nebo sklízeči cyklus,

    i) přivádění sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad pro další pěstovací a/nebo sklízeči cyklus prostřednictvím vstupních prostředků pro přivádění přísad,

    j) opakování kroků d), e), f), g), h) a i) mnohokrát až do té doby, kdy je v kroku g) zjištěna přítomnost znečišťujících látek nebo kdy je zjištěno, že pěstované buňky a/nebo tkáně mají nízkou kvalitu pro všechna zařízení z baterie, na základě čehož jsou prostředky pro zabránění znečištění odpojeny od společných sklízečích prostředků a zařízení a jejich obsahy jsou zlikvidovány.
39. 39. Způsob axenického pěstování a sklízení buněk a/nebo tkání v baterii zařízení na jedno použití, obsahující následující kroky:

    a) opatření baterie zařízení podle nároku 33, a pro alespoň jedno toto zařízení:

    b) přivádění axenické očkovací látky do zařízení prostřednictvím společného sklízecího potrubí,

    c) přivádění sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad do zařízení prostřednictvím společného vstupního potrubí pro přivádění přísad,

    d) přivádění sterilního vzduchu do zařízení prostřednictvím společného vzduchového vstupního potrubí,

    e) případné osvětlování zařízení s pomocí vnějších světelných prostředků,

    f) umožnění růstu buněk a/nebo tkání v zařízení v živném prostředí až do požadované výtěžnosti,

    g) umožnění odvádění přebytečného vzduchu a/nebo odpadních plynů ze zařízení kontinuálně prostřednictvím společného plynového odváděcího potrubí,

    h) kontrolu znečištění a/nebo kvality pěstovaných buněk a/nebo tkání: pokud byla v zařízení zjištěna přítomnost znečišťujících látek, nebo pokud bylo zjištěno, že pěstované buňky a/nebo tkáně mají nízkou kvalitu, jsou sklízeči prostředky zařízení uzavřeny za účelem zabránění znečištění dalších zařízení v baterii, pokud byly ve všech ze zařízení baterie zjištěny znečišťující látky nebo byla zjištěna nízká kvalita pěstovaných buněk a/nebo tkání, jsou veškerá zařízení a jejich obsahy zlikvidovány, pokud nebyly znečišťující látky zjištěny a kvalita pěstovaných buněk a/nebo tkání je přijatelná, je zařízení považováno za schopné ke sklízení a je prováděn krok i),

    i) pro každé zařízení, schopné ke sklízení z kroku h), je prováděna sklizeň alespoň požadované části živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně prostřednictvím společného sklízecího potrubí a prostředků pro zabránění znečištění do vhodné přijímací nádrže při ponechání zbytku živného prostředí, obsahujícího buňky a/nebo tkáně, v nádobce, přičemž zbytek živného prostředí slouží jako očkovací látka pro další pěstovací a/nebo sklízeči cyklus,

    j) přivádění sterilního živného prostředí a/nebo sterilních přísad pro další pěstovací a/nebo sklízeči cyklus prostřednictvím vstupních prostředků pro přivádění přísad, a

    k) opakování kroků d), e), f), g), h), i) a j) mnohokrát až do té doby, kdy je v kroku h) zjištěna přítomnost znečišťujících látek nebo kdy je zjištěno, že pěstované buňky a/nebo tkáně mají nízkou kvalitu pro všechna zařízení z baterie, na základě čehož jsou prostředky pro zabránění znečištění odpojeny od společných sklízečích prostředků a zařízení a jejich obsahy jsou zlikvidovány.