CN109071594A - 具有恒流泵/管道系统的固定床生物反应器 - Google Patents

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Abstract

我们以几种方式改良了可商购的贴壁细胞培养生物反应器，以提高被培养细胞的生产率，同时降低污染风险。我们发现，改良可商购的贴壁细胞培养生物反应器以提供较慢的细胞培养基流动，出人意料并急剧地提高所述被培养的贴壁细胞的生产率。我们还开发了新的取样歧管构造和新的取样方式，以降低污染风险。

Description

具有恒流泵/管道系统的固定床生物反应器
相关申请
本申请主张2016年4月14日提交的美国临时专利提交系列号62/322651的优先权，其内容通过参考并入本文。
政府利益
无。
背景技术
我们通过开发改进的生物反应器改进了商业化规模的贴壁细胞培养，所述改进的生物反应器与现有技术的生物反应器相比提供了～50％的生产率提高，同时也消除了污染源。
可商购的贴壁细胞培养生物反应器包括例如实验室规模的iCELLisTM Nano(可以从Pall Corporation，Cambridge Masachusetts商购)和商业化规模的iCELLisTM 500生物反应器，后者提供体积高达65升的细胞培养基和医药级聚酯微纤维的细胞培养基板，所述基板提供可用于细胞的高达500m2的生长面积。我们通过首先在小规模下确定工艺步骤，然后将这些步骤放大到大规模，改进了这种商业化规模生物反应器的功能。iCELLisTM品牌的生物反应器的制造商Pall Life Science，正推荐再循环或灌注作为补料策略。通过再循环来测试在小规模(NanoTM)下的补料策略，并在晚些时候通过灌注进行优化。
灌注是向生物反应器中的细胞连续进料新鲜培养基并在同时移除等量的废培养基的工艺步骤，其能够使细胞以高细胞密度生长(Vellinga等，2014)。灌注速率可以随着所使用的细胞系类型、由那些细胞生产的多肽产品、所使用的具体细胞培养基和所使用的细胞生长系统而变。废培养基的移除中的一个重要方面是也从细胞培养物中移除(可能有毒的)代谢副产物。这些副产物可能对细胞活性具有负面影响，并且还可能损害生产细胞或宿主细胞的生产率。
用于灌注的选项包括分批灌注和补料分批灌注(其中进行新鲜培养基的补料，但不进行废培养基的移除)。补料分批类型的方法也是一种再循环策略，其中细胞培养基体积仅仅被外部培养基容器放大，并且培养基从培养基储器或容器再循环到所述生物反应器并再次返回，其中不进行废的或用过的培养基的实际移除。
iCELLisTM系列生物反应器的制造商(Pall Life Technologies)将iCELLisTM 500作为适用于灌注补料的设备销售。我们在我们的使用iCELLisTM 500的第一次实验期间非常令人吃惊地发现：正如由制造商所提供的，如果使用标准的iCELLisTM 500管道和设定在可用的最慢泵输出速率的泵系统，所述设备事实上不能灌注。
我们解构了所述可商购的装置并找出了失败原因。所述可商购的装置被制造成出料管与进料管相比具有更大的内直径。这种构造旨在通过确保流入量不可大于流出量来防止不想要的液体培养基溢出。我们令人吃惊地发现，这种构造不利地影响泵效率和被培养细胞的生产率。相反，我们发现出料管最好具有与进料管相比相等或更小的内直径。我们发现，商品化供应的(“常备”)培养基出料管具有过大的内直径提供对于培养基流速来说过大的内部体积空间。这种大的内部管体积允许在管道中形成不合乎需要的空气囊和泡。
此外，所述常备出料管被集成在过于弱的泵系统中，所述泵系统不能从所述生物反应器提供足够的培养基流出。这可能是因为空气泡的形成进而似乎影响了正确的出料泵流量。所述出料泵通过在出料管中产生负压，将培养基牵拉到所述出料管中来工作。然而，与液体培养基不同，空气泡在该负压环境中膨胀，吸收大量负压能量，从而破坏泵工作。
发明内容
我们通过用能够提供适合的(较低的)流体输出速率的更大的蠕动泵改装生物反应器，并用具有较小内直径的替换管道替换出料管道，从而防止在出料管道中形成不合乎需要的空气泡，解决了所述可商购的装置中固有的故障。
我们对制造商做出的另一个建议是制造具有较小管道直径的生物反应器，以改善管道内部的培养基流动。
我们还设计并测试了新的取样歧管构造，其消除了受损的无菌滤器会污染整个制造批次的风险。
附图说明
图1示意性说明了两种不同的灌注方法。
图2示出了将生物反应器容器连接到取样歧管的方式。
图3示出了我们改进的取样歧管版本。
详细描述
我们已实施了在大容量贴壁细胞培养生物反应器例如iCELLisTM500生物反应器中改进培养基进料和出料策略的方式。可商购的大规模生物反应器被设计成将培养基以高速再循环；我们发现，以低速灌注培养基出人意料地提高生产细胞输出。我们的方法是实现所述生物反应器容器的可接受的缓慢和恒定细胞培养基流入和流出的唯一适合的方式。对于感染、转染或转导的生产细胞来说，恒定的培养基流动支持高的病毒生产率，同时避免了培养基的过量使用。
贴壁细胞培养生物反应器容器提供了被培养细胞可以在其上贴壁并生长的基板。该基板被装在含有液体细胞培养基的容器中。
可商购的大容量贴壁细胞培养生物反应器被提供有“进料”和“出料”泵。这些泵分别将细胞培养基泵入和泵出含有所述基板的容器，从而为所述被培养细胞提供新鲜培养基，并移除废培养基及其附属的培养废产物。
实施例1-间歇泵送
泵可以被编程成恒定地运行。以最低速度恒定运行时，现有技术的iCELLisTM 500进料和出料泵每天产生至少约42.3 L的培养基流量(以可能的最慢速率24rpm运行)。所述生物反应器容器的容量为约25升，反应器中的培养基几乎每天被完全更换两次。
我们使用可商购的大容量贴壁细胞培养生物反应器容器来培养表达病毒多肽并生产病毒粒子的转染的“生产”细胞。我们发现当细胞培养基以比可商购的装置中可用的最慢泵输出量更慢的速率灌注时，这些生产细胞生产率最高。为了能够获得适用于我们的目的的低的培养基灌注速率，我们将所述泵编程成运行一定的时段，随后是所述泵完全不泵送的时段。
由于这需要改变泵输出，我们在实践中看到由制造商提供的常备iCELLisTM 500生物反应器出料泵不能以控制良好的方式将培养基从所述生物反应器容器移除。因此，我们开始测试能够提供足够低的输出流量的较低输出量的泵的可行性。
实施例2-恒定低速泵送
然后我们调查了在现有技术中使用的可变培养基流量是否可能以某种方式影响细胞培养。为此，我们将伴随iCELLisTM 500生物反应器提供的现有技术的进料泵用能够提供约16.7L/天的较低输出量的替换泵替换。对于25升容量的生物反应器容器来说，这意味着所述容器中的培养基将每31/2至41/2天更换一次，而不是现有技术中典型的几乎每天两次。这将跨过例如100m2基板表面积的流量从至少42.3 L/100m2/天降低到16.7L/100m2/天。这种较低的进料泵速率使我们能够第一次恒定地运行进料泵而不用周期性停止。
在这些运行期间观察到，在整个过程中，由制造商提供的出料泵不能按计划进行培养基从所述生物反应器容器的移除。因此，我们同样将制造商提供的现有技术的出料泵用较低输出量的泵替换。
我们进行了商业化规模的制造运行，使用重组贴壁生产细胞来生产带有转入基因的重组腺病毒(可用于例如基因疗法)，在所述贴壁细胞培养过程中使用了常备iCELLisTM500进料泵和我们自己的较低输出量的出料泵的组合。我们使用了几种转入基因(例如编码干扰素或编码单纯疱疹胸苷激酶的基因)。在生产带有任何种类的转入基因(包括治疗性转入基因和标志物转入基因例如绿色荧光蛋白)或任何其他遗传元件或核苷酸序列的载体(例如含有RNA转入基因、shRNA、IngRNA、eRNA等的病毒载体)中，我们的方法通常是有利的。
我们还进行了三次商业化规模的制造运行，其中我们使用了我们自己的较低输出量的出料泵，并且也将常备iCELLisTM 500高输出量进料泵用较低输出量的泵替换。在这三次运行中的每一次中，我们在所述贴壁生产细胞中收到了显著更高的腺病毒生产。在这三次运行中，每个细胞的病毒粒子生产率与使用现有技术的较高输出量泵的生产率相比提高49.4％。
当我们将所述过程改变成使用较低输出量的泵工作时，我们的每个细胞的病毒生产率令人吃惊地提高49.4％。不打算使我们的专利的法律覆盖范围受到任何科学的因果理论限制，但这种改进可能是由于用新鲜培养基恒定地补料所述生物反应器容器，从而使所述培养基中与被培养细胞相接触的营养物的水平保持稳定。例如，我们已发现，当培养基流动基本上恒定并且慢得足以在所述细胞培养基中维持不超过约1.6克乳酸盐/升培养基的乳酸盐水平时，贴壁细胞的生产率最高。同样地，我们发现当所述培养基中的葡萄糖浓度被维持在约0.5至约1.0克葡萄糖/升培养基之间时，某些贴壁生产细胞的生产率最高。其他贴壁生产细胞在葡萄糖浓度更高(例如至少约2.9克/升)但由于低速且基本上恒定的培养基流动而仍维持在相对恒定浓度下时，生产率最高。或者，这可能是由于缓慢但恒定地从细胞表面冲走了不想要的细胞废产物。或者，这可能是由于避免了在使用现有技术硬件所需的较高速度的培养基流动时置于所述被培养细胞上的物理剪切应力。或者，这种提高可能是由于较慢的培养基流动使每个生产细胞能够有更长时间来生产病毒样粒子。无论原因如何，我们发现较慢、恒定的培养基流动令人吃惊且显著地提高贴壁生产细胞的生产率。
有鉴于悬浮细胞培养(例如可从Sartorius Corp.,Cambridge Massachusetts商购的CultiBag RMTM悬浮细胞培养袋)在细胞表面上提供多少有些恒定的培养基流动，但在本领域中仍然已知悬浮细胞培养比贴壁细胞培养的生产率更低这一事实，这种提高是特别令人吃惊的。
较低输出量的泵也可成功地用于将宿主细胞接种到贴壁生物反应器容器中，用于在细胞生长期间抽取细胞培养基的样品，以及用于在细胞生长结束时收获例如培养基。我们已令人吃惊地发现，使用较低输出量的泵执行这些功能反直觉地使每个这些过程比使用现有技术的高输出量泵更快。
人们可以简单地通过获得可商购的大规模贴壁细胞培养生物反应器容器，将进料和出料管道与伴随所述生物反应器提供的泵断开，并将该管道连接到外部泵，来复制我们的系统。然而，使用外部泵时，操作人员可能失去通过控制所述生物反应器(及其集成泵)的计算机来控制所述外部泵的能力。例如，可商购的大规模贴壁生物反应器通常包括测量所述生物反应器容器中液体细胞培养基的液位的传感器，以监测细胞培养基板是否充分浸没在培养基中。外部泵可能不被由所述生物反应器容器中探测到的液体细胞培养基的液位自动激活的反馈控制回路自动控制。同样地，可商购的大规模贴壁生物反应器通常包括记录泵的运行速度的记录装置。使用外部泵时，输出可能不被自动记录到计算机。人们可以通过在使用前校准所述外部泵并定期手动监测培养基流入和流出所述生物反应器容器，并通过将所有步骤手动记录到分批制造记录，来克服这些缺点。或者，人们可以将所述新的泵连接到生物反应器控制计算机，使得所述低输出量的泵可以被同样地并同时控制和监测，如同所述生物反应器本身一样。
所述泵可以通过软件或通过外部校准，或通过用标称马达速度(RPM)控制或使用天平或重量控制系统来控制。或者，所述泵可以手动控制，或使用自动速度控制或任何其他适合的方式来控制所述泵。具体的控制方法并不重要，只要所述泵能够提供我们令人吃惊地发现对增加贴壁细胞生产有利的始终如一的低流量输出即可。
我们的较低流速对较大面积的贴壁细胞盒(例如500m2的盒)有效。较低的流速也可以被有效地用于较小面积的基板盒，例如66m2的纤维盒。
我们的系统可用于培养表达病毒多肽的贴壁生产细胞，并因此可用于生产重组病毒或病毒样粒子(在我们随附的法定权利要求书中，我们使用术语“病毒”来涵盖病毒和病毒样粒子两者)。
实施例3-单向取样歧管
生物反应器取样歧管被用于从所述生物反应器容器获取细胞培养基的液体样品，以例如检查pH或测量所述培养基中的葡萄糖、代谢物和细胞废产物(例如乳酸盐)或其他物质。
我们出人意料地发现，作为可商购的iCELLisTM的一部分提供的常备取样歧管易被污染。我们成功地设计了一种用于所述生物反应器的新的取样歧管，用于取消对将培养基泵入所述生物反应器容器和从所述生物反应器容器泵出到取样瓶中的需求。通过这种方式，我们将由取样造成的污染的风险降至最低。
贴壁培养生物反应器的示意图示出在图2中。所述生物反应器包含容器[1]，其含有当以贴壁模式培养时细胞贴壁到其上的细胞培养基板[2]。容器[1]装有液体细胞培养基，其灌溉着所述细胞培养基板[2]。容器[1]具有通气口，其包括具有排气口[4]的空气滤器[3]。排气口[4]能够将过量气体排出所述生物反应器容器，并且滤器[3]过滤流过所述滤器的气体以防止颗粒污染物(例如病毒粒子、真菌孢子)离开或进入所述生物反应器容器。滤器[3]优选地经由通气管[5]被可拆卸地连接到容器[1]。或者，所述滤器可以被集成在容器[1]的主体中，尽管这冒着使液体细胞培养基溅到所述滤器上并堵塞它的风险。优选地，所述通气管具有夹子[6]，其使技术人员能够在需要时关闭所述通气管[5]。
容器[1]还具有取样管[7]，其具有通入到所述液体细胞培养基中并因此能够摄取液体培养基的输入端[7a]。优选地，取样管[7]也具有夹子[8]，其使技术人员能够在需要时关闭所述取样管[7]。取样管[7]具有接头[9]，能够将它连接到取样装置。所述取样装置可以是可拆卸的取样袋或瓶。然而，我们偏好所述取样装置包含能够连接到一对可拆卸的取样袋或瓶的取样歧管[图3]。
取样歧管[图3]被连接[9]到取样管[7]。所述取样歧管包含废液管[10]，其具有输入端[10a]和输出端[10b]，并且取样管[7]输出端[7b]能够连接到可移除的取样容器[11]。取样容器[11]可以是例如袋或瓶。
现有技术的可商购取样歧管是基于下述想法，即最早的大约200ml细胞培养基仅仅是冲洗，它被泵过所述歧管以冲洗歧管的内部。该冲洗培养基通过出口孔离开所述歧管进入到临时储存瓶中。然后将另外的细胞培养基泵过所述歧管并收集样品。在获取所述样品后，将一开始收集在临时储存瓶中的大约200ml细胞培养冲洗培养基从所述瓶泵回到所述歧管中并返回到生物反应器容器[1]中，使得尽可能少的培养基保留在所述取样歧管内部。所述临时储存瓶和管道可以被放空，因为所述现有技术的构造在所述取样瓶中提供了无菌滤器，所述滤器允许环境空气离开和进入所述瓶(当液体分别被泵入和泵出所述瓶时)，所述滤器过滤环境空气中的空气携带的污染物，并因此防止所述细胞培养基的污染。
然而，如果所述滤器的完整性受损，这可能造成重大的污染风险，其在整个制造批次已被污染之前难以检测。使用所述可商购的现有技术构造，我们事实上已招致商业化规模制造批次的污染。在评估失败时观察到，取样瓶中的无菌空气滤器破裂，但仍不清楚它是如何破裂的。
因此，我们设计了一种使用不同取样技术的新的取样歧管。我们已在至少4个商业化规模的制造批次中成功测试了它，并且没有遇到问题。
使用我们的取样歧管，我们消除了对将细胞培养基液体从所述生物反应器容器泵出然后再次泵回的需求。相反，使用我们的取样歧管，当从所述生物反应器容器获取液体时，它从不被再次泵回。这显著降低了污染风险。
我们的取样歧管描述在图3中。我们偏好从可商购的C-flex管道、MasterflexTM管道、夹子和可商购的聚合物管接头制造我们的取样歧管。所述管道可以是未经灭菌的，或者通过例如基于温度或湿度的技术例如高压蒸汽灭菌法或γ射线辐照或基于气体的灭菌法例如乙烯来灭菌。所述管道可以是现成的或者由用户定制。我们仅仅偏好它与可商购的无菌接头相容，因此能够使用任何类型的接头进行分支，并适合于密封和焊接。
我们的取样歧管可以通过MPC接头连接到生物反应器例如iCELLisTM 500生物反应器。当与iCELLis生物反应器一起使用时，我们的取样歧管可以完全替代由Pall LifeSciences作为它们的可商购的启动工具包(Starter Kit)的一部分提供的取样歧管，所述启动工具包与iCELLisTM 500生物反应器一起销售。
在我们的取样歧管中，我们使用一对管来获取一个样品。一个管被用于冲洗歧管内部，另一个管在冲洗后用于获取样品。例如，人们可以使用管[15]来冲洗所述歧管，然后使用管[7]来获取样品。
首先，将一次性使用的取样袋或瓶[11、17、19]无菌附连(我们偏好通过焊接)到取样管[7]。人们可以(并且我们偏好)也将取样袋[19]附连到所述对的第一(冲洗)管线[15]。或者，所述第一管线可以排入到废液瓶等中。
为了使用我们的取样歧管，将液体细胞培养基从生物反应器容器[1]或伴随的培养基储料器泵过所述歧管以冲洗内部。这是为了冲洗所述歧管并使新鲜培养基/液体从容器[1]进入到所述歧管中。这种冲洗培养基经由冲洗管[15]从所述歧管移除，进入冲洗培养基容器[19]中。然后将冲洗管[15]密封或关闭。这可以使用管道夹子[12]来完成(如图示)。或者，所述管道可以用端帽密封[在15b上]或焊接封闭[在15b处]等：密封的方式在这里不是特别重要。随后冲洗管[15]保持与剩余的制造运行密封隔开。在随附的合法权利要求书中，我们将与剩余的制造运行密封隔开称为“永久性”密封，因为在给定制造运行的情形中，它是有效地永久的(即持续到结束)。
然后将通往样品容器[11]的取样管出口端[7b]打开[13]。将新鲜的培养基/液体从生物反应器容器[1](例如从所述生物反应器的安装所述贴壁细胞培养基板的部分)泵入到取样管[7]中，然后从它[7b]泵出到取样容器[11]中。尽管我们示出了一个样品容器([11])，但人们可以可选地使用几个样品容器并获取几份物理上分开的样品。然后将取样管[7]关闭[13]。然后可以将取样容器[11]密封并从取样管输出端[7b]取下。在获取样品后，所述一对歧管分支[15、7]保持与剩余时间的制造运行密封隔开。我们偏好将两个管排液以移除残留的培养基，以降低污染风险。
取样袋[11]提供了取样端口，用于将液体从所述取样袋无菌抽出以备测定。因此，可以从一个袋无菌获取几个样品。
为了能够在不同时间顺序取样，我们偏好提供几对取样管。使用它们，可以以与第一次取样相似的方式，使用不同的歧管管对和附连到该第二对管的第二个管的第二个取样袋，进行第二次(或后续的)取样。例如，为了获取第二个样品，人们可以使用管线[10]作为冲洗管并使用管线[16]作为取样管，并且样品被获取在容器[17]中。自从第一次取样后就保留在所述歧管中的培养基/液体，通过将它泵出歧管[10b]来舍弃，优选地泵入到冲洗或废液罐或容器中，直至来自于所述生物反应器基板的新鲜培养基/液体填充所述歧管为止。然后将该第二冲洗管[10]密封或关闭。这可以使用管道夹子[12]来完成(如图示)。或者，所述管道可以用端帽密封或焊接封闭等：密封的方式在这里不是特别重要。随后第二冲洗管[10]保持与剩余的制造运行密封隔开。
然后将第二取样管[16]打开[13]。将新鲜的培养基/液体从生物反应器容器[1](例如从所述生物反应器的安装所述贴壁细胞培养基板的部分)泵入到第二取样管[16]中，然后将它[16b]泵出到第二取样容器[17]中。然后将所述第二对的取样管[16]关闭[13]。然后可以将取样容器[17]密封并取下。在获取样品后，所述一对歧管分支[10、17]保持与剩余时间的制造运行密封隔开。
这种构造可以按照需要重复，提供所需的许多对冲洗和取样管，以便能够进行所需的许多次不同取样。
使用我们的取样端口，此时的缺点是需要建造所述歧管(而不能商购)。另一个缺点可能是为每个制造批次使用几个取样袋。然而，这些缺点被污染制造批次的可能性降低大大抵消，在商业化规模的制造中所述污染造成显著的财务风险。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种贴壁细胞培养生物反应器，其包含用于贴壁细胞培养的基板和能够提供低于约50mL培养基/1,800个细胞/天的细胞培养基恒定速率输出的泵。
2.权利要求1的贴壁细胞培养生物反应器，所述泵能够提供不超过约16.7mL培养基/1,800个细胞/天的最低恒定速率输出。
3.权利要求1的贴壁细胞培养生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约60m2的表面积。
4.权利要求3的贴壁细胞培养生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
5.权利要求1的贴壁细胞培养生物反应器，其被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
6.一种重组多肽，其通过在权利要求1的贴壁细胞生物反应器中培养贴壁生产细胞来生产。
7.权利要求6的重组多肽，其中所述多肽包含病毒。
8.权利要求7的重组多肽，其中所述病毒包含含有非病毒转入基因的病毒衣壳。
9.一种用于在基板上培养贴壁细胞的方法，所述方法包括：
a.获得权利要求1的生物反应器，然后
b.向所述生物反应器添加细胞培养基和细胞，然后
c.在所述基板上以贴壁模式培养所述细胞，同时将所述细胞培养基以低于约50mL培养基/1,800个细胞/天的速率围绕所述细胞进行循环。
10.权利要求9的方法，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
11.权利要求9的方法，所述生物反应器被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
12.一种贴壁细胞生物反应器，其包含含有用于贴壁细胞培养的基板的容器和被构造成能够以一定的泵输出量提供细胞培养基的恒定速率输出的泵，所述泵输出量足以以相对恒定的浓度在所述细胞培养基中维持选自下述的参数：所述培养基中不超过约1.58克/升的乳酸盐浓度；所述培养基中约0.5至1.0克/升的葡萄糖浓度；和所述培养基中不低于约2.89克/升的葡萄糖浓度。
13.权利要求12的贴壁细胞培养生物反应器，其被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
14.权利要求12的贴壁细胞培养生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约60m2的表面积。
15.权利要求14的贴壁细胞培养生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
16.权利要求12的贴壁细胞生物反应器，所述泵被构造成能够以一定的泵输出量提供细胞培养基的恒定速率输出，所述泵输出量足以在所述细胞培养基中维持所述培养基中不超过约1.58克/升的乳酸盐浓度。
17.权利要求12的贴壁细胞生物反应器，所述泵被构造成能够以一定的泵输出量提供细胞培养基的恒定速率输出，所述泵输出量足以在所述细胞培养基中维持所述培养基中约0.5至1.0克/升的葡萄糖浓度。
18.权利要求12的贴壁细胞生物反应器，所述泵被构造成能够以一定的泵输出量提供细胞培养基的恒定速率输出，所述泵输出量足以在所述细胞培养基中维持所述培养基中不低于约2.89克/升的葡萄糖浓度。
19.一种重组多肽，其通过在权利要求12的贴壁细胞生物反应器中培养贴壁生产细胞来生产。
20.权利要求19的重组多肽，其中所述多肽包含病毒。
21.权利要求20的重组多肽，其中所述病毒包含含有非病毒转入基因的病毒衣壳。
22.一种用于在基板上培养贴壁细胞的方法，所述方法包括：
a.获得权利要求12的生物反应器，然后
b.向所述生物反应器添加细胞培养基和细胞，然后
c.在所述基板上以贴壁模式培养所述细胞，同时将所述细胞培养基以在所述细胞培养基中维持选自下述的参数的速率围绕所述细胞进行循环：所述培养基中不超过约1.58克/升的乳酸盐浓度；所述培养基中约0.5至1.0克/升的葡萄糖浓度；和所述培养基中不低于约2.89克/升的葡萄糖浓度。
23.权利要求22的方法，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约60m2的表面积。
24.权利要求23的方法，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
25.权利要求22的方法，所述生物反应器被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
26.一种贴壁细胞培养生物反应器，其提供用于贴壁细胞生长的基板并被构造成含有细胞培养基并具有能够泵送所述培养基的泵，所述泵被构造成能够以低于约50mL培养基/m2基板面积/天的输出量提供培养基的恒定速率输出。
27.权利要求26的贴壁细胞培养生物反应器，其被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
28.权利要求26的贴壁细胞培养生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约60m2的表面积。
29.权利要求28的贴壁细胞培养生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
30.权利要求26的贴壁细胞培养生物反应器，其中所述泵经由管连接到所述基板，所述管的内直径的尺寸适应于所述泵的流体输出量而不在所述管内形成空气泡。
31.一种重组多肽，其通过在权利要求26的贴壁细胞生物反应器中培养贴壁生产细胞来生产。
32.权利要求31的重组多肽，其中所述多肽包含病毒。
33.权利要求32的重组多肽，其中所述病毒包含含有非病毒转入基因的病毒衣壳。
34.一种用于在基板上培养贴壁细胞的方法，所述方法包括：
a.获得权利要求26的生物反应器，然后
b.向所述生物反应器添加细胞培养基和细胞，然后
c.在所述基板上以贴壁模式培养所述细胞，同时将所述细胞培养基以低于约50mL培养基/m2基板面积/天的速率围绕所述细胞进行循环。
35.权利要求34的方法，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约60m2的表面积。
36.权利要求35的方法，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
37.权利要求34的方法，所述生物反应器被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
38.一种方法，其包括：
a.获得贴壁细胞培养生物反应器，其具有用于贴壁细胞培养的基板和具有输入端和输出端的第一取样管，所述第一取样管的输入端与所述基板连通，由此液体能够从所述基板流入所述第一取样管的输入端，流过所述第一取样管并在所述第一取样管的输出端处离开所述生物反应器；然后
b.向所述生物反应器添加细胞培养基，将细胞接种到所述生物反应器中并培养贴壁于所述基板的细胞，以及
c.使所述细胞培养基流过所述第一取样管，然后
d.从所述第一取样管输出端移除细胞培养基的至少一个被移除部分；然后
e.永久性密封所述第一取样管，而不将所述细胞培养基的被移除部分的材料量返回到所述取样管的输出端中。
39.权利要求38的方法，所述贴壁细胞培养生物反应器还包含具有输入端和输出端的第二取样管，所述输入端与所述基板连通，由此液体能够从所述基板流入所述第二取样管的输入端，流过所述第二取样管并在所述取样管的输出端处离开所述生物反应器；所述方法还包括：
f.使所述细胞培养基流过所述第二取样管，然后
g.从所述第二取样管输出端移除细胞培养基的第二个被移除部分；然后
h.永久性密封所述第二取样管，而不将被移除的细胞培养基的材料量返回到所述第二取样管的输出端中。
40.权利要求38的方法，其中所述生物反应器被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
41.权利要求38的方法，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约60m2的表面积。
42.权利要求39的方法，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
43.权利要求39的方法，其中(b)贴壁于所述基板的细胞表达重组多肽。
44.通过权利要求43的方法生产的重组多肽。
45.权利要求44的重组多肽，其中所述多肽包含病毒。
46.权利要求45的重组多肽，其中所述病毒包含含有非病毒转入基因的病毒衣壳。
47.一种贴壁细胞培养生物反应器，其包含：
a.用于贴壁细胞培养的基板，其与至少两对可关闭的取样管可流动连通，由此细胞培养基能够从所述基板流过每个取样管，并且由此每个取样管可以在细胞培养基从所述基板流过所述取样管之后无菌关闭，以防止更多培养基流过所述取样管；和
b.每对取样管中的至少一个被构造成无菌附连到可拆卸的取样容器。
48.权利要求47的生物反应器，其被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
49.权利要求50的生物反应器，其还包含更多对的可关闭的取样管，所述更多对的取样管中的至少一个被构造成无菌附连到可拆卸的取样容器。
50.权利要求47的生物反应器，其还包含第三对可关闭的取样管，所述第三对取样管中的至少一个被构造成无菌附连到可拆卸的取样容器。
51.权利要求47的生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约60m2的表面积。
52.权利要求51的生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
53.一种重组多肽，其由权利要求47的生物反应器生产。
54.权利要求53的重组多肽，其中所述多肽包含病毒。
55.权利要求54的重组多肽，其中所述病毒包含含有非病毒转入基因的病毒衣壳。
56.一种贴壁细胞培养生物反应器容器，其具有用于贴壁细胞培养的基板和能够提供细胞培养基的恒定速率输出的泵，所述输出足以使所述容器中的细胞培养基每约31/2天更换少于一次。
57.权利要求56的贴壁细胞培养生物反应器，所述泵能够提供细胞培养基的恒定速率输出，所述输出足以使所述容器中的细胞培养基每约41/2天更换少于一次。
58.权利要求56的贴壁细胞培养生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约60m2的表面积。
59.权利要求58的贴壁细胞培养生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
60.权利要求56的贴壁细胞培养生物反应器，其被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
61.一种重组多肽，其通过在权利要求56的贴壁细胞生物反应器中培养贴壁生产细胞来生产。
62.权利要求61的重组多肽，其中所述多肽包含病毒。
63.权利要求62的重组多肽，其中所述病毒包含含有非病毒转入基因的病毒衣壳。
64.一种用于在基板上培养贴壁细胞的方法，所述方法包括：
a.获得权利要求56的生物反应器，然后
b.向所述生物反应器添加细胞培养基和细胞，然后
c.在所述基板上以贴壁模式培养所述细胞，同时将所述细胞培养基以低于约50mL培养基/1,800个细胞/天的速率围绕所述细胞进行循环。
65.权利要求64的方法，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
66.权利要求64的方法，所述生物反应器被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
说明或声明(按照条约第19条的修改)
2017年10月2日的书面意见中正确地指出，ZHANG[0382]教导了在培养细胞的过程中，葡萄糖浓度在一周内从5.4g/L降低到3.0g/L。相反，本申请的发明人发现葡萄糖“维持在相对恒定的浓度”是有利的。参见PCT申请说明书第146-147行。ZHANG[0382]不能预料到本申请的权利要求12，因为ZHANG没有教导维持“相对恒定的浓度”。由于ZHANG没有认识到维持“相对恒定的浓度”对结果是至关重要的，因此ZHANG不能使本发明变得显而易见。
2017年10月2日的书面意见中也正确地指出，ZHANG[0013]教导了将葡萄糖浓度维持在“约0.7g/L至约1.7g/L之间。”审查员正确地指出了ZHANG教导的范围与权利要求12的范围部分重叠。然而，ZHANG没有认识到本申请中限定的低范围对结果是至关重要的。因此，ZHANG无法预料到本发明，参见M.P.E.P.§2131.03(II)，但具有初步显而易见性，参见M.P.E.P.21444.05(I)。申请人谨表示，该初步显而易见性被申请人的实验数据所克服，例如，生产率提高了49.4％，参见PCT申请说明书第133行。
2017年10月2日的书面意见中正确地指出，STARBARD图4的元件10、14、15和16类似于本申请的取样装置。然而，与STARBARD相比，本申请的说明书教导了在取样之前冲洗管线的必要性。参见PCT申请说明书第273-293行。STARBARD没有认识到需要冲洗。因此，STARBARD没有公开超过一对的取样管。申请人在此相应地修改了权利要求。STARBARD无法预料到本发明，因为STARBARD图4的元件16只显示了一对。由于STARBARD没有认识到需要冲洗，因此没有提供做出本申请权利要求中所限定的改进的动机，因此STARBARD不能使本发明变得显而易见。
2017年10月2日的书面意见中正确地指出，GENZYME没有教导本申请权利要求中所限定的缓慢灌注速率。GENZYME没有认识到流速对结果是至关重要要的。实际上，GENZYME明确不鼓励缓慢流动。本申请的权利要求56限定的流动非常缓慢以致需要约31/2天来完全更换培养基，而GENZYME中只需要1天，并且随着细胞的生长，速率增加。
具体修改请参见随附的19条修改权利要求书替换页和修改对照页。

Claims (66)

1.一种贴壁细胞培养生物反应器，其包含用于贴壁细胞培养的基板和能够提供低于约50mL培养基/1,800个细胞/天的细胞培养基恒定速率输出的泵。
2.权利要求1的贴壁细胞培养生物反应器，所述泵能够提供不超过约16.7mL培养基/1,800个细胞/天的最低恒定速率输出。
3.权利要求1的贴壁细胞培养生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约60m2的表面积。
4.权利要求3的贴壁细胞培养生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
5.权利要求1的贴壁细胞培养生物反应器，其被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
6.一种重组多肽，其通过在权利要求1的贴壁细胞生物反应器中培养贴壁生产细胞来生产。
7.权利要求6的重组多肽，其中所述多肽包含病毒。
8.权利要求7的重组多肽，其中所述病毒包含含有非病毒转入基因的病毒衣壳。
9.一种用于在基板上培养贴壁细胞的方法，所述方法包括：
a.获得权利要求1的生物反应器，然后
b.向所述生物反应器添加细胞培养基和细胞，然后
c.在所述基板上以贴壁模式培养所述细胞，同时将所述细胞培养基以低于约50mL培养基/1,800个细胞/天的速率围绕所述细胞进行循环。
10.权利要求9的方法，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
11.权利要求9的方法，所述生物反应器被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
12.一种贴壁细胞生物反应器，其包含含有用于贴壁细胞培养的基板的容器和被构造成能够以一定的泵输出量提供细胞培养基的恒定速率输出的泵，所述泵输出量足以在所述细胞培养基中维持选自下述的参数：所述培养基中不超过约1.58克/升的乳酸盐浓度；所述培养基中约0.5至1.0克/升的葡萄糖浓度；和所述培养基中不低于约2.89克/升的葡萄糖浓度。
13.权利要求12的贴壁细胞培养生物反应器，其被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
14.权利要求12的贴壁细胞培养生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约60m2的表面积。
15.权利要求14的贴壁细胞培养生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
16.权利要求12的贴壁细胞生物反应器，所述泵被构造成能够以一定的泵输出量提供细胞培养基的恒定速率输出，所述泵输出量足以在所述细胞培养基中维持所述培养基中不超过约1.58克/升的乳酸盐浓度。
17.权利要求12的贴壁细胞生物反应器，所述泵被构造成能够以一定的泵输出量提供细胞培养基的恒定速率输出，所述泵输出量足以在所述细胞培养基中维持所述培养基中约0.5至1.0克/升的葡萄糖浓度。
18.权利要求12的贴壁细胞生物反应器，所述泵被构造成能够以一定的泵输出量提供细胞培养基的恒定速率输出，所述泵输出量足以在所述细胞培养基中维持所述培养基中不低于约2.89克/升的葡萄糖浓度。
19.一种重组多肽，其通过在权利要求12的贴壁细胞生物反应器中培养贴壁生产细胞来生产。
20.权利要求19的重组多肽，其中所述多肽包含病毒。
21.权利要求20的重组多肽，其中所述病毒包含含有非病毒转入基因的病毒衣壳。
22.一种用于在基板上培养贴壁细胞的方法，所述方法包括：
a.获得权利要求12的生物反应器，然后
b.向所述生物反应器添加细胞培养基和细胞，然后
c.在所述基板上以贴壁模式培养所述细胞，同时将所述细胞培养基以在所述细胞培养基中维持选自下述的参数的速率围绕所述细胞进行循环：所述培养基中不超过约1.58克/升的乳酸盐浓度；所述培养基中约0.5至1.0克/升的葡萄糖浓度；和所述培养基中不低于约2.89克/升的葡萄糖浓度。
23.权利要求22的方法，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约60m2的表面积。
24.权利要求23的方法，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
25.权利要求22的方法，所述生物反应器被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
26.一种贴壁细胞培养生物反应器，其提供用于贴壁细胞生长的基板并被构造成含有细胞培养基并具有能够泵送所述培养基的泵，所述泵被构造成能够以低于约50mL培养基/m2基板面积/天的输出量提供培养基的恒定速率输出。
27.权利要求26的贴壁细胞培养生物反应器，其被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
28.权利要求26的贴壁细胞培养生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约60m2的表面积。
29.权利要求28的贴壁细胞培养生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
30.权利要求26的贴壁细胞培养生物反应器，其中所述泵经由管连接到所述基板，所述管的内直径的尺寸适应于所述泵的流体输出量而不在所述管内形成空气泡。
31.一种重组多肽，其通过在权利要求26的贴壁细胞生物反应器中培养贴壁生产细胞来生产。
32.权利要求31的重组多肽，其中所述多肽包含病毒。
33.权利要求32的重组多肽，其中所述病毒包含含有非病毒转入基因的病毒衣壳。
34.一种用于在基板上培养贴壁细胞的方法，所述方法包括：
a.获得权利要求26的生物反应器，然后
b.向所述生物反应器添加细胞培养基和细胞，然后
c.在所述基板上以贴壁模式培养所述细胞，同时将所述细胞培养基以低于约50mL培养基/m2基板面积/天的速率围绕所述细胞进行循环。
35.权利要求34的方法，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约60m2的表面积。
36.权利要求35的方法，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
37.权利要求34的方法，所述生物反应器被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
38.一种方法，其包括：
a.获得贴壁细胞培养生物反应器，其具有用于贴壁细胞培养的基板和具有输入端和输出端的第一取样管，所述第一取样管的输入端与所述基板连通，由此液体能够从所述基板流入所述第一取样管的输入端，流过所述第一取样管并在所述第一取样管的输出端处离开所述生物反应器；然后
b.向所述生物反应器添加细胞培养基，将细胞接种到所述生物反应器中并培养贴壁于所述基板的细胞，以及
c.使所述细胞培养基流过所述第一取样管，然后
d.从所述第一取样管输出端移除细胞培养基的至少一个被移除部分；然后
e.永久性密封所述第一取样管，而不将所述细胞培养基的被移除部分的材料量返回到所述取样管的输出端中。
39.权利要求38的方法，所述贴壁细胞培养生物反应器还包含具有输入端和输出端的第二取样管，所述输入端与所述基板连通，由此液体能够从所述基板流入所述第二取样管的输入端，流过所述第二取样管并在所述取样管的输出端处离开所述生物反应器；所述方法还包括：
f.使所述细胞培养基流过所述第二取样管，然后
g.从所述第二取样管输出端移除细胞培养基的第二个被移除部分；然后
h.永久性密封所述第二取样管，而不将被移除的细胞培养基的材料量返回到所述第二取样管的输出端中。
40.权利要求38的方法，其中所述生物反应器被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
41.权利要求38的方法，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约60m2的表面积。
42.权利要求39的方法，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
43.权利要求39的方法，其中(b)贴壁于所述基板的细胞表达重组多肽。
44.通过权利要求43的方法生产的重组多肽。
45.权利要求44的重组多肽，其中所述多肽包含病毒。
46.权利要求45的重组多肽，其中所述病毒包含含有非病毒转入基因的病毒衣壳。
47.一种贴壁细胞培养生物反应器，其包含：
a.用于贴壁细胞培养的基板，其与第一对可关闭的取样管可流动连通，由此细胞培养基能够从所述基板流过每个取样管，并且由此每个取样管可以在细胞培养基从所述基板流过所述取样管之后无菌关闭，以防止更多培养基流过所述取样管；和
b.所述一对取样管中的至少一个被构造成无菌附连到可拆卸的取样容器。
48.权利要求47的生物反应器，其被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
49.权利要求47的生物反应器，其还包含第二对可关闭的取样管，所述第二对取样管中的至少一个被构造成无菌附连到可拆卸的取样容器。
50.权利要求49的生物反应器，其还包含第三对可关闭的取样管，所述第三对取样管中的至少一个被构造成无菌附连到可拆卸的取样容器。
51.权利要求47的生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约60m2的表面积。
52.权利要求51的生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
53.一种重组多肽，其由权利要求47的生物反应器生产。
54.权利要求53的重组多肽，其中所述多肽包含病毒。
55.权利要求54的重组多肽，其中所述病毒包含含有非病毒转入基因的病毒衣壳。
56.一种贴壁细胞培养生物反应器容器，其具有用于贴壁细胞培养的基板和能够提供细胞培养基的恒定速率输出的泵，所述输出足以使所述容器中的细胞培养基每约31/2天更换少于一次。
57.权利要求56的贴壁细胞培养生物反应器，所述泵能够提供细胞培养基的恒定速率输出，所述输出足以使所述容器中的细胞培养基每约41/2天更换少于一次。
58.权利要求56的贴壁细胞培养生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约60m2的表面积。
59.权利要求58的贴壁细胞培养生物反应器，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
60.权利要求56的贴壁细胞培养生物反应器，其被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
61.一种重组多肽，其通过在权利要求56的贴壁细胞生物反应器中培养贴壁生产细胞来生产。
62.权利要求61的重组多肽，其中所述多肽包含病毒。
63.权利要求62的重组多肽，其中所述病毒包含含有非病毒转入基因的病毒衣壳。
64.一种用于在基板上培养贴壁细胞的方法，所述方法包括：
a.获得权利要求56的生物反应器，然后
b.向所述生物反应器添加细胞培养基和细胞，然后
c.在所述基板上以贴壁模式培养所述细胞，同时将所述细胞培养基以低于约50mL培养基/1,800个细胞/天的速率围绕所述细胞进行循环。
65.权利要求64的方法，所述基板为贴壁细胞培养提供至少约400m2的表面积。
66.权利要求64的方法，所述生物反应器被构造成含有至少约20升的细胞培养基。
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