KR20180133487A - 정유량 펌프/튜빙 시스템이 있는 고정층 바이오 리액터 - Google Patents

Abstract

우리는 상업적으로 이용 가능한 접착성 세포 배양 바이오 리액터를 여러 방법으로 변형하여, 배양된 세포의 생산성을 높이고 오염 위험을 줄였다. 우리는 상업적으로 이용 가능한 접착성 세포 배양 바이오 리액터를 변형시켜 보다 느린 세포 배양 배지 흐름을 제공하는 것은 예기치 않게 그리고 현저하게 배양된 접착성 세포의 생산성을 증가시킴을 발견했다. 우리는 또한 새로운 샘플링 매니폴드 구성 및 샘플 채취의 새로운 방식을 개발하여 오염 위험을 줄였다.

Description

정유량 펌프/튜빙 시스템이 있는 고정층 바이오 리액터

관련 출원

이 출원은 2016년 4월 14일자로 출원된 미국 임시 특허 출원 제62/322651호에 우선권을 주장하며, 그 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.

정부 이해관계 (governmentinterest)

없음.

우리는 오염원을 제거하면서, 선행 기술의 바이오 리액터에 비해 생산성을 ~ 50 % 증가시키는 향상된 바이오 리액터를 개발함으로써 상용 규모의 접착성 세포 배양을 개선했다.

상업적으로 이용 가능한 접착성 세포 배양 바이오 리액터는 예를 들어, 실험실 규모의 iCELLis™ 나노 (Pall Corporation, Cambridge Masachusetts에서 상업적으로 입수 가능), 및 최대 74 L의 세포 배양 배지의 체적을 제공하는 상업용 규모의 iCELLis™ 500 바이오 리액터 배지, 및 세포에 사용할 수 있는 최대 500m²의 성장 영역을 제공하고, 의료용 폴리에틸렌 미세섬유의 세포 배양 기질을 포함한다. 우리는 먼저 상용 규모의 바이오 리액터의 기능을 개선하여, 소규모에서 공정 단계를 정의한 다음, 이를 대규모로 확대했다. iCELLis™ 브랜드의 바이오 리액터 제조사인 Pall Life Science는 공급 전략 (feeding strategy)으로 재순환 또는 관류를 권장하고 있었다. 소규모의 공급 전략 (나노™)은 재순환으로 테스트된 후, 관류로 최적화했다.

관류는 바이오 리액터의 세포에 신선한 배지를 계속 공급하는 동시에, 동일한 양의 소비된 배지를 제거하여, 높은 세포 밀도에서 세포 성장을 가능하게 하는 공정 단계이다 (Vellinga et al., 2014). 관류 속도는 사용된 세포주의 유형, 이들 세포에 의해 생성된 폴리펩타이드 생성물, 사용된 특정 세포 배양 배지 및 사용된 세포 성장 시스템에 따라 달라질 수 있다. 소비된 배지를 제거하는 중요한 측면은 세포 배양으로부터 (가능한 독성의) 대사성 부산물을 제거하는 것이다. 이러한 부산물은 세포 생존 능력에 부정적인 영향을 줄 수 있으며, 생산자 또는 숙주 세포의 생산성을 손상시킬 수 있다.

관류 옵션으로는 배치 관류 및 유가식 (fed-batch) 관류 (신선한 배지의 공급이 수행되지만 소비된 배지의 제거는 수행되지 않음)가 있다. 유가식 유형 접근법은 또한 세포 배양 배지가 외부 배지 컨테이너에 의해서만 확대되고, 배지는 배지 저장소 또는 컨테이너에서 바이오 리액터로 재순환되고, 다시 역순환하는 재순환 전략이며, 상기 소비되거나 사용된 배지의 실질적 제거는 행해지지 않았다.

iCELLis™ 라인의 바이오 리액터 (Pall Life Technologies) 제조업자는 iCELLis™ 500을 관류 공급에 적합한 것으로 마케팅한다. 우리는 iCELLis™ 500을 사용한 첫번째 실험에서 매우 놀라운 결과를 얻었다: 제조업자가 제공한 것처럼, 이용가능한 가장 느린 펌프 배출물 속도로 설정된 표준 iCELLis™ 500 튜빙 및 펌프 시스템을 사용하면 장비가 실제로 관류할 수 없다.

우리는 상업적으로 이용 가능한 장치를 해체하고, 실패 이유를 발견했다. 상업적으로 이용 가능한 장치는 피드-인 (feed-in) 튜브보다 더 큰 내부 직경의 피드-아웃(feed-out) 튜브로 제조된다. 이 구성은 인-플로우 (in-flow)가 아웃-플로우 (out-flow)보다 클 수 없음을 보장함으로써, 액체 배지의 원하지 않는 넘침을 방지하기 위한 것이다. 우리는 놀랍게도 이러한 구성이 배양된 세포의 펌프 효율과 생산성에 악영향을 미친다는 것을 발견했다. 오히려, 우리는 피드-아웃 튜브가 피드-인 튜브와 같거나 더 작은 내부 직경을 가지는 것이 최고인 것을 발견했다. 우리는 상업적으로 제공된 ("스톡") 배지 피드-아웃 튜브가 너무 큰 내부 직경을 가지고 있어, 배지 유속에 비해 너무 큰 내부 체적 공간을 제공한다는 것을 발견했다. 이 큰 내부 튜브 체적은 튜빙에서 바람직하지 않은 공기 포켓 및 버블의 형성을 허용한다.

또한, 스톡 피드-아웃 튜브는 바이오 리액터로부터 적절한 배지 흐름을 제공할 수 없는 너무 약한 펌프 시스템에 통합되었다. 이는 공기 방울의 형성이 피드-아웃 펌프 수용량을 올바르게 수정하는데 영향을 미치는 것처럼 보일 수 있기 때문이다. 피드-아웃 펌프는 피드-아웃 튜브에 음압을 생성하여, 배지를 피드-아웃 튜브로 끌어당겨서 작동한다. 액체 배지와는 달리, 기포는 이 음압 환경에서 팽창하여, 음압 에너지의 많은 부분을 흡수하므로, 펌프 작동을 좌절시킨다.

우리는 적절한 (더 낮은) 유체 배출물 속도를 제공할 수 있는 더 큰 연동 펌프로 바이오 리액터를 새로 장착하고, 더 작은 내부 직경을 갖는 교체 튜빙으로 피드-아웃 튜빙을 교체함으로써, 상업적으로 이용 가능한 장치에 내재된 결함을 해결했으며, 이는 피드-아웃 튜브에 바람직하지 않은 기포가 형성되는 것을 방지한다.

우리가 제조업자를 위해 만든 또 다른 제안은 튜빙 내부의 배지 흐름을 개선하기 위해 더 작은 튜빙 직경을 갖는 바이오 리액터를 만드는 것이다.

우리는 또한 손상된 무균 필터가 전체 제조 배치를 오염시킬 수 있는 위험을 제거하는 새로운 샘플링 매니폴드 구성을 설계하고 테스트했다.

도 1은 두 가지 다른 관류 방법을 개략적으로 보여준다.
도 2는 샘플링 매니폴드 (manifold)에 바이오 리액터 용기를 연결하는 방법을 보여준다.
도 3은 개선된 샘플링 매니폴드의 버전을 보여준다.

우리는 예를 들어, iCELLis 500 바이오 리액터와 같은, 대용량의 접착성 세포 배양 바이오 리액터에서 배지 피드-인 및 피드-아웃 전략을 개선하는 방법을 구현했다. 상업적으로 이용 가능한 대규모 바이오 리액터는 빠른 속도로 배지를 재순환시키도록 설계되었다. 우리는 느린 속도에서 관류 배지가 예상외의 생산 세포 배출물을 증가시키는 것을 발견했다. 우리의 접근법은 바이오 리액터 용기 안과 밖으로 수용 가능하게 느리고, 일정한 세포 배양 배지 흐름을 달성하는 유일한 방법이다. 일정한 배지 흐름은 감염된, 형질 도입된, 또는 형질 전달된 생산 세포에 높은 바이러스 생산력을 제공하면서, 과도한 배지 사용을 피한다.

접착성 세포 배양 바이오 리액터 용기는 배양된 세포가 접착 및 성장할 수 있는 기질을 제공한다. 상기 기질은 액체 세포 배양 배지를 포함하는 용기에 담겨 있다.

상업적으로 이용 가능한 대용량 접착성 세포 배양 바이오 리액터에는 "피드-인(feed in)"및 "피드-아웃(feed out)" 펌프가 제공된다. 이들 펌프는 각각 기질을 함유하는 컨테이너 안과 밖으로 세포 배양 배지를 펌핑하여, 배양된 세포에 신선한 배양 배지를 제공하고, 소비된 배지 및 부속 배양 폐기물을 제거한다.

실시예 1-간헐적 펌핑

펌프를 지속적으로 작동하도록 프로그래밍할 수 있다. 지속적으로 최소 속도로 작동하는, 선행 iCELLis™ 500 피드-인 및 피드-아웃 펌프는 하루에 적어도 약 42.3 L의 배지 흐름을 생성한다 (가능한 가장 느린 속도, 24 rpm으로 작동). 바이오 리액터 용기의 용량은 약 25 L이며, 리액터 내의 배지는 거의 하루에 2 회 완전하게 교환된다.

우리는 바이러스성 폴리펩타이드를 발현하고 바이러스성 입자를 생산하는 형질 도입된 "생산자" 세포를 배양하기 위해, 상업적으로 이용 가능한 대용량 접착성 세포 배양 바이오 리액터 용기를 사용했다. 우리는 세포 배양 배지가 상업적으로 이용 가능한 장치에서 이용 가능한 가장 느린 펌프 배출물 체적보다 느린 속도로 관류될 때, 이들 생산 세포가 가장 생산적이라는 것을 발견했다. 우리의 목적대로 적절하게 낮은 배지 관류 속도를 얻기 위해, 우리는 펌프가 일정 시간 간격동안 작동하고, 그 다음에 펌프가 펌프하지 않는 간격이 뒤따르도록 프로그램했다.

펌프 배출물을 다양하게 해야 하기 때문에, 제조사가 제공하는 iCELLis™ 500 바이오 리액터 피드-아웃 펌프는 바이오 리액터 용기에서 잘 제어된 방식으로 배지를 제거할 수 없다. 따라서 우리는 적절하게 낮은 배출물 흐름을 제공할 수 있는 저배출물 펌프의 실행 가능성 (viability)을 시험하기로 했다.

실시예 2-일정한 낮은 속도 펌핑

우리는 선행 기술에서 사용된 다양한 배지 흐름이 어떤 식으로든 세포 배양에 영향을 줄 수 있는지 여부를 조사하였다. 이를 위해 iCELLis™ 500 바이오 리액터와 함께 제공되는 선행의 피드-인 펌프를 약 16.7 L/일의 낮은 배출물 체적을 제공할 수 있는 교체용 펌프로 교체했다. 25 L 용량의 바이오 리액터 용기의 경우, 이는 용기 내에서 배지가 선행 기술에서와 같이 일반적으로 거의 하루에 2 회가 아닌, 3 ½ 내지 4 ½ 일마다 한 번씩 교환되는 것을 의미한다. 이는 예를 들어, 100m² 의 기질 표면 영역을 가로지르는 흐름을 적어도 1일 당 100m² 당 42.3L에서 100m² 당 16.7L로 감소시킨다. 이 낮은 피드-인 펌프 속도는 주기적인 정지없이, 피드-인 펌프를 지속적으로 작동시킬 수 있게 한다.

이러한 실행 동안에, 제조업체가 제공한 피드-아웃 펌프는 계획된 공정 전반에 걸쳐 바이오 리액터 용기에서 배지의 제거를 수행할 수 없었다. 따라서 우리는 유사하게 제조사가 제공하는 선행 기술의 피드-아웃 펌프를 저-배출물 펌프로 대체 하였다.

우리는 전이 유전자 (예를 들어, 유전자 치료에 유용)를 갖는 재조합 아데노 바이러스를 생산하기 위해 재조합 접착성 생산 세포를 사용하고, 접착성 세포 배양 공정에서 스톡 iCELLis™ 500 피드-인 펌프 및 우리 고유의 저-배출물 피드-아웃 펌프를 조합물을 사용하여, 상용 규모의 제조 작업을 수행했다. 우리의 방법은 일반적으로 임의의 전이 유전자 (치료학적 전이 유전자 및 녹색 형광 단백질과 같은 마커 전이 유전자를 포함), 또는 다른 유전 요소 또는 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, RNA 전이 유전자, shRNA, IngRNA, eRNA 등을 포함하는 바이러스 벡터)을 갖는 벡터를 생산하는데 유리하다.

우리는 또한 우리 고유의 저-배출물 피드-아웃 펌프를 사용하고, 스톡 iCELLis™ 500 고-배출물 피드-인 펌프를 저배출물 펌프를 저-배출물 펌프로 교체하면서, 세 번의 상용 규모의 제조 작업을 수행했다. 우리는 이 세 번의 실험에서 각각 접착성 생산 세포에서 상당히 높은 아데노 바이러스를 생산하였다. 이 세 번의 실험에서, 세포 당 바이러스 입자의 생산성은 종래의 고-배출물 펌프를 사용하는 생산성과 비교하여 49.4 % 증가했다.

저-배출물 펌프를 사용하도록 공정을 변경했을 때, 세포 당 바이러스 생산성은 놀랍게도 49.4 % 증가했다. 임의의 과학적 인과 관계 이론에 구속될 수 있는 특허의 법적 적용 범위를 염두에 두지 않고도, 바이오 리액터 용기에 지속적으로 신선한 배지를 공급함으로써, 배양된 세포와 접촉하는 배지 내의 영양소 수준을 안정적으로 유지할 수 있다. 예를 들어, 우리는 배양 배지 1L 당 약 1.6g 이하의 락테이트 수준을 세포 배양 배지에서 유지하기 충분하도록 배지의 흐름이 실질적으로 일정하고 느릴 때, 접착성 세포의 생산성이 가장 높다는 것을 발견했다. 유사하게, 우리는 배양 배지 내의 글루코스 농도가 배지 1 L당 약 0.5 및 약 1.0 g 사이의 글루코오스로 유지될 때, 특정 접착성 생산 세포가 가장 생산적이라는 것을 발견했다. 다른 접착성 생산 세포는 저속이지만 실질적으로 일정한 배지 흐름으로 인해 상대적으로 일정한 농도로 유지됨에도 불구하고, 높은 글루코오스 농도 (예를 들어, 적어도 약 2.9g/l)가 가장 생산성이 높다. 대안적으로, 이는 세포 표면에서 원하지 않는 세포 폐기 생산물이 느리지만 일정하게 씻겨 나가기 때문일 수 있다. 대안적으로, 이는 종래 기술의 하드웨어에 의해 요구되는 고속의 배지 흐름을 사용할 때, 배양된 세포에 가해지는 물리적 전단 응력 (shear stress)을 회피하기 때문일 수 있다. 대안적으로, 이 증가는 각 생산 세포가 바이러스-유사 입자를 생산하는데 더 많은 시간을 필요로 하도록 하는, 느린 배지 흐름으로 인한 것일 수 있다. 원인 (또는 원인들)이 무엇이든 간에, 우리는 느리고 일정한 배지 흐름이 놀랍게도, 그리고 현저하게 접착성 생산 세포 생산성을 증가시킨다는 것을 발견했다.

이 증가는 현탁 세포 배양 (예, Sartorius Corp., Cambridge Massachusetts에서 상업적으로 입수할 수 있는 CultiBag RM™ 현탁 세포 배양백)이 세포 표면에 더 많거나 적은 일정한 배지 흐름을 제공한다는 사실의 측면에서 특히 놀라우나, 아직 현탁 세포 배양은 접착성 세포 배양보다 생산성이 낮을 수 있다.

저-배출물 펌프는 또한 숙주 세포를 접착성 바이오 리액터 용기에 접종하고, 세포 성장 중에 세포 배양 배지의 샘플을 추출하고, 예를 들어 세포 성장의 종결 시 배양 배지를 수확하는데 성공적으로 사용될 수 있다. 놀랍게도 이러한 기능을 수행하기 위해 저-배출물 펌프를 사용하는 것은 반-직관적으로 각각의 이러한 공정을 종래의 고-배출물 펌프보다 빠르게 만드는 것으로 나타났다.

상업적으로 이용 가능한 대규모 접착성 세포 배양 바이오 리액터 용기를 수득하고, 바이오 리액터와 함께 제공되는 피드-인 및 피드-아웃 튜빙을 분리하고, 그 튜빙을 외부 펌프에 연결함으로써 우리 시스템을 복제할 수 있다. 그러나 외부 펌프를 사용하면 작동자는 바이오 리액터 (및 이의 통합 펌프)를 제어하는 컴퓨터를 통해 외부 펌프를 제어할 수 있는 능력을 잃을 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 대규모 접착성 바이오 리액터는 일반적으로 세포 배양 기질이 배지에 적절하게 잠긴 지 여부를 제어하기 위해, 바이오 리액터 용기 내의 액체 세포 배양 배지의 수준을 측정하는 센서를 포함한다. 외부 펌프는 바이오 리액터 용기에서 감지된 액체 세포 배양 배지 수준에 의해 자동적으로 활성화되는 피드백 제어 루프에 의해 자동적으로 제어되지 않을 수 있다. 유사하게, 상업적으로 이용 가능한 대규모 접착성 바이오 리액터는 일반적으로 펌프의 주행 속도를 기록하는 기록 장치를 포함한다. 외부 펌프를 사용하면, 배출물이 컴퓨터에 자동으로 기록되지 않을 수 있다. 사용하기 전에 외부 펌프를 교정하고, 규칙적으로 바이오 리액터 용기 안과 밖으로 배양액 흐름을 수동으로 모니터링하고, 배치 제조 기록에 수동으로 모든 단계를 기록함으로써 이러한 단점을 극복할 수 있다. 대안적으로, 새로운 펌프를 바이오 리액터 제어 컴퓨터에 연결할 수 있으므로, 바이오 리액터 자체와 마찬가지로 저-배출물 펌프를 유사하게 동시에 통제하고 제어할 수 있다.

펌프는 소프트웨어 또는 외부 보정을 통해, 또는 공칭 모터 속도 (RPM)로 제어하거나, 균형 또는 중량 제어 시스템을 사용하여 제어할 수 있다. 대안적으로, 펌프는 수동으로 제어되거나, 자동 속도 제어 또는 펌프를 제어하기 위한 다른 적절한 방법을 가질 수 있다. 펌프가 일관된 저-유량 배출물을 제공할 수 있는 한, 정확한 제어 방법은 중요하지 않다. 놀랍게도 우리는 이것이 증가된 접착성 세포 생산에 유리함을 발견했다.

우리의 낮은 유속은 큰 면적의 접착성 세포 카세트 (예를 들어, 500m² 카세트)에 효과적이다. 66m²의 섬유 카세트와 같은 작은 면적의 기질 카세트에서도 더 낮은 유속을 효과적으로 사용할 수 있다.

우리의 시스템은 바이러스성 폴리펩타이드를 발현하여 재조합 바이러스 또는 바이러스-유사 입자를 생산하는 접착성 생산 세포를 배양하는 데 사용될 수 있다 (우리는 첨부된 법적 청구항에서 "바이러스"라는 용어를 바이러스 및 바이러스-유사 입자를 모두 포함한다).

실시예 3-단일방향 샘플링 매니폴드

바이오 리액터 샘플링 매니폴드는 세포 배양 배지의 액체 샘플을 바이오 리액터 용기로부터 꺼내어, 예를 들어 pH를 확인, 또는 글루코오스, 대사 산물 및 세포 폐기 생산물 (예를 들어, 락테이트) 또는 배지 중 다른 물질을 측정하는 데 사용된다.

우리는 예기치 않게 상업적으로 이용 가능한 iCELLis™의 일부로 제공되는 스톡 샘플링 매니폴드가 오염에 취약하다는 것을 발견했다. 우리는 바이오 리액터 용기를 샘플링 병에 넣거나 뺄 필요가 없는, 바이오 리액터를 위한 새로운 샘플링 매니폴드를 성공적으로 설계했다. 이러한 방법은 샘플링으로 인한 오염의 위험을 최소화한다.

접착성 배양 바이오 리액터의 개략도가 도 2에 나와있다. 바이오 리액터는 접착성 모드에서 배양되었을 때 세포가 접착되는, 세포 배양 기질 [2]을 포함하는 용기 [1]로 구성된다. 용기 [1]는 세포 배양 기질 [2]을 관개하는 액체 세포 배양 배지로 채워져있다. 용기 [1]는 배출 벤트 [4]를 갖는 공기 필터 [3]를 포함하는 벤트를 갖는다. 배출 벤트 [4]는 여분의 기체를 바이오 리액터 용기 밖으로 배출할 수 있으며, 필터 [3]는 필터를 통해 흐르는 기체를 여과하여 미립자 오염 물질 (예를 들어, 바이러스 입자, 진균 포자)이 배출되거나 바이오 리액터 용기에 들어가는 것을 막는다. 필터 [3]는 벤트 튜브 [5]를 통해 용기 [1]에 분리 가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 대안적으로, 필터는 액체 세포 배양 배지가 필터 위로 비산되어 그것을 막을 수 있는 위험이 있음에도 불구하고, 용기 [1]의 몸체에 통합될 수 있다. 바람직하게는 배출 튜브에는 기술자가 원할 때, 벤트 튜브를 닫을 수 있게 하는 클램프 [6]가 있다.

또한, 용기 [1]에는 액체 세포 배양 배지로 통과하여 액체 배지를 흡입할 수 있는, 입력 단부 [7a]을 갖는 샘플링 튜브 [7]가 있다. 바람직하게는, 샘플링 튜브 [7]는 기술자가 원할 때 샘플링 튜브 [7]를 닫을 수 있게 하는, 클램프 [8]를 갖는다. 샘플링 튜브 [7]에는 샘플링 장치에 연결할 수 있는 연결부 [9]가 있다. 샘플링 장치는 분리 가능한 샘플링 백 또는 병일 수 있다. 그러나 우리는 샘플링 장치가 한 쌍의 분리 가능한 샘플링 백 또는 병에 연결될 수 있는 샘플링 매니폴드 [도 3]를 포함하는 것을 선호한다.

샘플링 매니폴드 [도 3]은 샘플링 튜브 [7]에 연결된다 [9]. 샘플링 매니폴드는 입력 단부 [10a] 및 배출 단부 [10b]를 갖는 폐기 튜브 [10], 및 제거 가능한 샘플링 컨테이너 [11]에 연결될 수 있는 샘플링 튜브 [7] 배출 단부 (7b)를 포함한다. 샘플링 컨테이너 [11]는 예를 들어, 백 또는 병일 수 있다.

선행 기술의 상업적으로 이용 가능한 샘플링 매니폴드는 약 200ml의 세포 배양 배지 첫번째 배지가 단지 린스라는 아이디어에 기반한다; 그것은 매니폴드를 통해 펌핑되어 매니폴드의 내부를 헹구어준다. 이 린스 배지는 배출을 통해 매니폴드에서 임시 보관병으로 전달된다. 그 후 추가적인 세포 배양 배지를 매니폴드를 통해 펌핑하고 샘플을 수집한다. 샘플을 수집한 후, 약 200ml의 임시 보관병에 처음 수집된 세포 배양 린스 배지를 병에서 다시 매니폴드 및 바이오 리액터 용기 [1] 내로 펌핑한 다음, 가능한 한 배지만큼 적은 양이 샘플링 매니폴드 안에 남아 있다. 종래의 구성은 샘플링 병에 무균 필터를 제공하기 때문에, 임시 저장병 및 튜빙은 비울 수 있으며, 상기 필터는 주위 공기 중의 오염물을 여과하여, (액체가 각각 병 안과 밖으로 펌핑될 때) 세포 배양 배지의 오염을 방지하여 주의 공기가 배출되어 병에 들어갈 수 있게 한다.

그러나 필터의 무결성 (integrity)이 손상되면, 전체 제조 배치가 오염될 때까지 감지하기 어려운 주요 오염 위험이 발생할 수 있다. 상업상 이용가능한 선행 기술 구성을 사용하면, 사실상 상업 규모의 제조 배치에 오염이 수반된다. 실패를 평가함에 있어서, 샘플링 병의 무균 공기 필터가 파손되었지만, 어떻게 파손되었는지는 분명하지 않은 것으로 나타났다.

따라서 우리는 다른 샘플링 기술을 사용하여, 새로운 샘플링 매니폴드를 설계했다. 우리는 최소한 4 개의 상용 규모의 제조 배치에서 성공적으로 테스트했으며, 문제가 발생하지 않았다.

샘플링 매니폴드를 사용하면, 세포 배양 배지를 바이오 리액터 용기에서 펌핑하고 다시 넣어줄 필요가 없다. 오히려 우리의 샘플링 매니폴드를 사용하면, 액체가 바이오 리액터 용기에서 추출될 때, 다시 펌핑하여 되돌리지 않는다. 이는 오염 위험을 현저하게 감소시킨다.

우리의 샘플링 매니폴드는 도 3에 도시되어 있다. 우리는 상업적으로 이용 가능한 C-flex 튜빙, Masterflex™ 튜빙, 클램프 및 상업적으로 이용 가능한 폴리머 튜브 연결자로부터 샘플링 매니폴드를 만드는 것을 선호한다. 튜빙은 예를 들어, 비-살균되거나 또는 고압 증기멸균 (autoclaving)과 같은 온도- 또는 습기- 기반한 기술, 또는 에틸렌과 같은 감마선 조사 또는 기체 기반 살균에 의해 살균될 수 있다. 튜빙은 기성품 (ready-made)이거나 사용자에 의해 사용자 맞춤형 (customer-made)으로 만들 수 있다. 우리는 상업적으로 이용 가능한 멸균 연결부와 호환되기를 선호하므로, 어떤 유형의 연결부로도 분지할 수 있으며, 밀봉 및 용접에 적합하다.

샘플링 매니폴드를 MPC-커넥터를 통해 iCELLis™ 500 바이오 리액터와 같은 바이오 리액터를 통해 연결할 수 있다. iCELLis 바이오 리액터와 함께 사용할 경우, 우리의 샘플링 매니폴드는 Pall Life Sciences가 제공하는 샘플링 매니폴드를 iCELLis™ 500 바이오 리액터와 함께 시판되는, 상업적으로 이용가능한 Starter Kit의 일부로 완전히 대체할 수 있다.

우리의 샘플링 매니폴드에서, 우리는 한 쌍의 튜브를 사용하여 하나의 샘플을 수집한다. 하나의 튜브는 매니폴드 내부를 헹구는데 사용되고, 다른 튜브는 헹군 후 샘플을 수집하는 데 사용된다. 예를 들어, 튜브 [15]를 사용하여 매니폴드를 헹구고 튜브 [7]를 사용하여 샘플을 수집할 수 있다.

시작하기 위해, 일회용 샘플링 백 또는 병 [11, 17, 19]은 샘플링 튜브 [7]에 무균적으로 접착된다 (우리는 용접을 통할 것을 선호한다). 샘플링 백 [19]을 제1 (헹굼) 라인의 쌍 [15]에 접착할 수도 있다 (우리는 이를 선호한다). 대안적으로, 제1 라인은 폐기물 병 등으로 배출될 수 있다.

우리의 샘플링 매니폴드를 사용하기 위해, 액체 세포 배양 배지룰 바이오 리액터 용기 [1] 또는 매니폴드를 통해 수반되는 배지 저장소로부터 펌핑하여 내부를 헹구어준다. 이는 매니폴드를 헹구고, 용기 [1]에서 신선한 배지/액체를 매니폴드에 공급하기 위한 것이다. 이 린스 배지를 린스 튜브 [15]를 통해 매니폴드에서 린스 배지 컨테이너 [19]로 제거한다. 여기서 린스 튜브 [15]는 밀봉되거나 닫힌다. 이는 튜브 클램프 [12] (도시된 대로)로 수행할 수 있다. 대안적으로, 튜빙을 말단 캡 (15b 위) 또는 용접되어 닫힌 것 [15b 에] 등으로 밀봉할 수 있다. 여기서 밀봉 방법은 특별히 중요하지 않다. 그 후 린스 튜브 [15]는 나머지 제조 작업을 위해 밀봉된 채로 남아 있다. 첨부된 법적 청구항에서, 제공된 제조 실행의 맥락에서 효율적으로 영구적 (즉, 마지막까지 지속됨)이기 때문에, 나머지 제조 작업을 위해 밀봉하는 것을 "영구적인" 밀봉으로 지칭한다.

샘플 컨테이너 [11]로 가는, 샘플링 튜브 배출 단부 [7b]를 연다 [13]. 신선한 배지/액체를 바이오 리액터 용기 [1] (예를 들어, 접착성 세포 배양 기질을 수용하는 바이오 리액터의 부분으로부터)에서 샘플링 튜브 [7]로 펌핑한 후, 이를 수집하여 [7b] 샘플링 컨테이너 [11]에 넣는다. 우리는 하나의 샘플 컨테이너 [11]를 도시하지만, 여러 개의 샘플 컨테이너를 대안적으로 사용할 수도 있고, 여러 개의 물리적으로 분리된 샘플을 사용할 수 있다. 그 후, 샘플링 튜브 [7]를 닫는다 [13]. 그 후, 샘플링 컨테이너 [11]를 밀봉하고, 샘플링 튜브 배출물 [7b]로부터 제거할 수 있다. 샘플을 수집한 후, 매니폴드 분지의 쌍 [15, 7]은 남은 제조 작업동안 밀봉된 상태로 유지된다. 우리는 오염의 위험을 줄이기 위해 잔류 배지를 제거하도록 튜브 모두를 배수하는 것을 선호한다.

샘플링 백 [11]은 샘플링 백에서 액체를 무균적으로 추출하여 검정하기 위해 사용되는 샘플링 포트를 제공한다. 따라서 여러 개의 샘플을 하나의 백에서 무균적으로 수집할 수 있다.

서로 다른 시간에 순차적인 샘플링을 가능하게 하기 위해, 우리는 여러 쌍의 샘플링 튜브를 제공하는 것을 선호한다. 이와 함께, 제2 (또는 후속) 샘플링은 상이한 쌍의 매니폴드 튜브, 및 제2 튜브 쌍의 제2 튜브에 접착된 제2 샘플링 백을 사용하여 제1과 유사한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 제2 샘플을 수집하기 위해, 라인 [10]을 린스 튜브로 사용하고, 라인 [16]을 샘플링 튜브로 사용하고, 샘플은 컨테이너 [17]에 넣는다. 제1 샘플링 이후로 매니폴드에 남아있는 배지/액체는 매니폴드 [10b] 밖으로 펌핑하여 폐기하거나, 바람직하게는 바이오 리액터 기질의 신선한 배지/액체가 매니폴드를 가득 채울 때까지, 린스 또는 폐기물 용기 또는 컨테이너로 배출한다. 이 제2 린스 튜브 [10]는 밀봉되거나 닫힌다. 이는 튜빙 클램프 [12] (도시된 대로)로 수행될 수 있다. 대안적으로 튜빙을 말단 캡, 용접하여 닫힌 것 등으로 밀봉할 수 있다. 여기서 밀봉 방식은 특별히 중요하지 않는다. 그 후 제2 린스 튜브 [10]는 나머지 제조 작업 동안 밀봉된 상태로 유지된다.

제2 샘플링 튜브 [16]를 연다 [13]. 신선한 배지/액체를 바이오 리액터 용기 [1] (예를 들어, 접착성 세포 배양 기질을 수용하는 바이오 리액터의 부분으로부터)로부터 제2 샘플링 튜브 [16]로 펌핑한 후, 이를 수집하여 [16b] 제2 샘플링 컨테이너 [17]에 넣는다. 그 후, 제2 샘플링 튜브쌍 [16]을 닫는다 [13]. 그 후, 샘플링 용기 [17]를 밀봉하고 제거할 수 있다. 샘플을 수집한 후, 매니폴드 분지의 쌍 [10, 16]은 제조 제조 작업 동안 밀봉된 상태로 유지된다.

이러한 구성은 원하는 만큼 많은 반복되어, 원하는 만큼 많은 다른 샘플링 시간을 가능하게 하기 위하여, 원하는 만큼 린스 및 샘플 튜브의 많은 쌍을 제공할 수 있다.

우리의 샘플링 포트를 사용하면, (현재 매니폴드를 상업적으로 구매 가능하다기 보단) 매니폴드를 구성해야 할 필요가 있다는 단점이 있다. 또 다른 단점은 각각 제조 배치에 대해 여러 샘플링 백을 사용이 될 수 있다. 그러나 이러한 단점은 상업 규모의 제조 공정에서 상당한 재정적 위험을 초래하는, 제조 배치를 오염시킬 가능성을 감소시킴으로써 상쇄되고도 남는다.

Claims (66)

1. 접착성 세포 배양을 위한 기질, 및 1일 당 1,800 세포 당 약 50 mL 미만의 세포 배양 배지의 일정 속도의 배출물 (output)을 제공할 수 있는 펌프를 포함하는, 접착성 세포 배양 바이오 리액터.
2. 제1항에 있어서, 상기 펌프는 1일 당 1,800 개의 세포 당 배지의 약 16.7 mL 이하의 최소한 일정 속도의 배출물을 제공할 수 있는, 접착성 세포 배양 바이오 리액터.
3. 제1항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 60 ㎡ 이상인, 접착성 세포 배양 바이오 리액터.
4. 제3항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 400 ㎡ 이상인, 접착성 세포 배양 바이오 리액터.
5. 제1항에 있어서, 적어도 약 20L 이상의 세포 배양 배지를 포함하도록 구성된, 접착성 세포 배양 바이오 리액터.
6. 제1항의 접착성 세포 바이오 리액터에서 접착성 생산 세포를 배양하여 제조된, 재조합 폴리펩타이드.
7. 제6항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 바이러스를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
8. 제7항에 있어서, 상기 바이러스는 비-바이러스성 전이 유전자 (transgene)를 함유하는 바이러스 캡시드를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
9. 기질 상에 접착성 세포를 배양하는 방법으로서,
   a. 제1항의 바이오 리액터를 수득하는 단계, 및
   b. 상기 바이오 리액터 세포 배양 배지 및 세포를 첨가하는 단계, 및
   c. 1일 당 1,800 세포 당 배지의 약 50 mL 미만의 속도로 세포에 대한 상기 세포 배양 배지를 순환시키면서, 기질 상에 접착 모드로 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법
10. 제9항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 400 ㎡ 이상인, 방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 바이오 리액터는 적어도 약 20L의 세포 배양 배지를 포함하도록 구성된, 방법.
12. 접착성 세포 배양을 위한 기질을 함유하는 컨테이너, 및 상기 세포 배양 배지에서 매개변수를 유지하기에 충분한 펌프 배출물 체적에서 세포 배양 배지의 일정 속도의 배출물을 제공할 수 있도록 구성된 펌프를 포함하는 접착성 세포 바이오 리액터로서, 상기 매개변수는 약 1.58g/L 이하의 상기 배지에서의 락테이트 농도; 약 0.5 및 1.0g/L 사이의 상기 배지에서의 글루코오스 농도; 및 약 2.89g/L 이상의 상기 매질에서 글루코오스 농도로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 접착성 세포 바이오 리액터.
13. 제12항에 있어서, 적어도 약 20L 이상의 세포 배양 배지를 포함하도록 구성된, 접착성 세포 배양 바이오 리액터.
14. 제12항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 60 ㎡ 이상인, 접착성 세포 배양 바이오 리액터.
15. 제14항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 400 ㎡ 이상인, 접착성 세포 배양 바이오 리액터.
16. 제12항에 있어서, 상기 펌프는 상기 세포 배양 배지에서 상기 배지 내의 락테이트 농도를 약 1.58g/L 이하로 유지하기에 충분한 펌프 배출물 체적에서 세포 배양 배지의 일정 속도의 배출물을 제공할 수 있도록 구성된, 접착성 세포 바이오 리액터.
17. 제12항에 있어서, 상기 펌프는 상기 세포 배양 배지에서 상기 배지 내의 글루코오스의 농도를 약 0.5 및 1.0g/L 사이로 유지하기에 충분한 펌프 배출물 체적에서 세포 배양 배지의 일정 속도의 배출물을 제공할 수 있도록 구성된, 접착성 세포 바이오 리액터.
18. 제12항에 있어서, 상기 펌프는 상기 세포 배양 배지에서 상기 배지 내의 글루코오스의 농도를 약 2.89g/L 이상으로 유지하기에 충분한 펌프 배출물 체적에서 세포 배양 배지의 일정 속도의 배출물을 제공할 수 있도록 구성된, 접착성 세포 바이오 리액터.
19. 제12항의 접착성 세포 바이오 리액터에서 접착성 생산 세포를 배양하여 제조된, 재조합 폴리펩타이드.
20. 제19항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 바이러스를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
21. 제20항에 있어서, 상기 바이러스는 비-바이러스성 전이 유전자를 함유하는 바이러스 캡시드를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
22. 기질 상에 접착성 세포를 배양하는 방법으로서,
    a. 제12항의 바이오 리액터를 수득하는 단계, 및
    b. 상기 바이오 리액터 세포 배양 배지 및 세포를 첨가하는 단계, 및
    c. 기질 상의 접착 모드에서 세포를 배양하는 단계로, 이와 함께 상기 세포 배양 배지에서 매개변수를 유지할 수 있는 속도로 세포에 대해 상기 세포 배양 배지를 순환시키는 단계를 포함하고, 상기 매개변수는 약 1.58g/L 이하의 상기 배지에서의 락테이트 농도; 약 0.5 및 1.0g/L 사이의 상기 배지에서의 글루코오스 농도; 및 약 2.89g/L 이상의 상기 배지에서의 글루코오스 농도로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 60 ㎡ 이상인, 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 400 ㎡ 이상인, 방법.
25. 제22항에 있어서, 상기 바이오 리액터는 적어도 약 20L 이상의 세포 배양 배지를 포함하도록 구성된, 방법.
26. 접착성 세포 성장을 위한 기질을 제공하고, 세포 배양 배지를 함유하도록 구성되고, 상기 배지를 펌핑할 수 있는 펌프를 갖는 접착성 세포 배양 바이오 리액터로서, 상기 펌프는 1일 당 기질 면적 m² 당 약 50 mL 미만의 배출물 체적에서 일정 속도의 배지를 제공할 수 있도록 구성된, 세포 배양 바이오 리액터.
27. 제26항에 있어서, 적어도 약 20L 이상의 세포 배양 배지를 포함하도록 구성된, 접착성 세포 배양 바이오 리액터.
28. 제26항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 60 ㎡ 이상인, 접착성 세포 배양 바이오 리액터.
29. 제28항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 400 ㎡ 이상인, 접착성 세포 배양 바이오 리액터.
30. 제26항에 있어서, 상기 펌프는 튜브 내부에 기포가 형성되지 않고, 유체의 펌프 배출물 체적을 수용하도록 크기화된 (sized) 내부 직경을 갖는 튜브를 통해 상기 기질과 연결된, 접착성 세포 배양 바이오 리액터.
31. 제26항의 접착성 세포 바이오 리액터에서 접착성 생산 세포를 배양하여 제조된, 재조합 폴리펩타이드.
32. 제31항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 바이러스를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
33. 제32항에 있어서, 바이러스는 비-바이러스성 전이 유전자를 함유하는 바이러스 캡시드를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
34. 기질 상에 접착성 세포를 배양하는 방법으로서,
    a. 제26항의 바이오 리액터를 수득하는 단계, 및
    b. 상기 바이오 리액터 세포 배양 배지 및 세포를 첨가하는 단계, 및
    c. 세포 표면 상에 1일 당 기질 면적 m² 당 배지의 약 50 mL 미만의 속도로 세포 배양 배지를 순환시키면서, 기질 상에 접착 모드로 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
35. 제34항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 60 ㎡ 이상인, 방법.
36. 제35항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 400 ㎡ 이상인, 방법.
37. 제34항에 있어서, 상기 바이오 리액터는 적어도 약 20L 이상의 세포 배양 배지를 포함하도록 구성된, 방법.
38. 방법으로서,
    a. 접착성 세포 배양을 위한 기질, 및 입력 단부 및 배출 단부를 갖는 제1 샘플링 튜브를 갖는 접착성 세포 배양 바이오 리액터를 수득하는 단계로서, 상기 제1 샘플링 튜브의 입력 단부는 상기 기질과 연결되어, 액체가 제1 샘플링 튜브를 통해 상기 기질로부터 상기 제1 샘플링 튜브의 입력 단부로 흐를 수 있고, 상기 제1 샘플링 튜브의 배출 단부에서 상기 바이오 리액터를 나갈 수 있는, 단계; 및
    b. 바이오 리액터에 세포 배양 배지를 첨가하고, 세포를 바이오 리액터에 씨딩 (seeding)하고, 및 기질에 접착된 세포를 배양하는 단계, 및
    c. 제1 샘플링 튜브를 통해 세포 배양 배지를 흐르는 단계, 및
    d. 세포 배양 배지의 적어도 하나 이상의 제거된 부분을 제1 샘플링 튜브 배출 단부로부터 제거하는 단계; 및
    e. 세포 배양 배지의 제거된 부분의 물질 양을 샘플링 튜브의 배출 단부로 돌아가지 않게 하면서, 제1 샘플링 튜브를 영구적으로 밀봉하는 단계를 포함하는, 방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 접착성 세포 배양 바이오 리액터는 입력 단부 및 배출 단부를 갖는 제2 샘플링 튜브를 추가로 포함하고, 상기 입력 단부는 기질과 연결되어 액체가 제2 샘플링 튜브를 통해 상기 기질로부터 제2 샘플링 튜브의 입력 단부로 흐를 수 있고, 상기 제2 샘플링 튜브의 배출 단부에서 상기 바이오 리액터를 나갈 수 있으며, 상기 방법은
    f. 제2 샘플링 튜브를 통해 세포 배양 배지를 흐르는 단계, 및
    g. 세포 배양 배지의 제2 제거된 부분을 제2 샘플링 튜브 배출 단부로부터 제거하는 단계; 및
    h. 세포 배양 배지의 제거된 부분의 물질 양을 샘플링 튜브의 배출 단부로 돌아가게 하지 않으면서, 제2 샘플링 튜브를 영구적으로 밀봉하는 단계를 더 포함하는, 방법.
40. 제38항에 있어서, 상기 바이오 리액터는 적어도 약 20L 이상의 세포 배양 배지를 포함하도록 구성된, 방법.
41. 제38항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 60 ㎡ 이상인, 방법.
42. 제39항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 400 ㎡ 이상인, 방법.
43. 제39항에 있어서, 상기 기질에 접착된 (b) 상기 세포는 재조합 폴리펩타이드를 발현하는, 방법.
44. 제43항의 방법에 의해 제조된 재조합 폴리펩타이드.
45. 제44항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 바이러스를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
46. 제45항에 있어서, 상기 바이러스는 비-바이러스성 전이 유전자를 함유하는 바이러스 캡시드를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
47. 접착성 세포 배양 바이오 리액터로서,
    a. 세포 배양 배지가 기질로부터 각각의 샘플링 튜브를 통해 흐를 수 있고, 세포 배양 배지가 샘플링 튜브를 통해 기질로부터 흐른 후, 샘플링 튜브를 통해 추가적인 배지의 흐름을 막기 위해 각각의 샘플링 튜브가 무균적으로 밀폐될 수 있는, 제1 쌍의 밀폐가능한 샘플링 튜브 쌍과 유동적으로 연결된 접착성 세포 배양을 위한 기질; 및
    b. 분리 가능한 샘플링 컨테이너에 무균적으로 부착되도록 구성되는, 적어도 하나 이상 한 쌍의 샘플링 튜브를 포함하는, 접착성 세포 배양 바이오 리액터.
48. 제47항에 있어서, 적어도 약 20L 이상의 세포 배양 배지를 포함하도록 구성된, 바이오 리액터.
49. 제47항에 있어서, 제2 쌍의 밀폐가능한 샘플링 튜브를 추가로 포함하고, 상기 제2 쌍의 샘플링 튜브 중 적어도 하나 이상은 분리 가능한 샘플링 컨테이너에 무균적으로 부착되도록 구성된, 바이오 리액터.
50. 제49항에 있어서, 제3 쌍의 밀폐가능한 샘플링 튜브를 추가로 포함하고, 상기 제3 쌍의 샘플링 튜브 중 적어도 하나 이상은 분리 가능한 샘플링 컨테이너에 무균적으로 부착되도록 구성된, 바이오 리액터.
51. 제47항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 60 ㎡ 이상인, 바이오 리액터.
52. 제51항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 400 ㎡ 이상인, 바이오 리액터.
53. 제47항의 바이오 리액터에 의해 제조된, 재조합 폴리펩타이드.
54. 제53항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 바이러스를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
55. 제54항에 있어서, 상기 바이러스는 비-바이러스성 전이 유전자를 함유하는 바이러스 캡시드를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
56. 접착성 세포 배양을 위한 기질, 및 약 3 ½일마다 1회 미만으로 용기 내에서 세포 배양 배지를 교환하기에 충분한 세포 배양 배지의 일정 속도의 배출물을 제공할 수 있는 펌프를 갖는, 접착성 세포 배양 바이오 리액터 용기.
57. 제56항에 있어서, 상기 펌프는 약 4 ½일마다 1회 미만으로 용기 내에서 세포 배양 배지를 교환하기에 충분한 세포 배양 배지의 일정 속도의 배출물을 제공할 수 있는, 접착성 세포 배양 바이오 리액터.
58. 제56항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 60 ㎡ 이상인, 접착성 세포 배양 바이오 리액터.
59. 제58항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 400 ㎡ 이상인, 접착성 세포 배양 바이오 리액터.
60. 제56항에 있어서, 적어도 약 20L 이상의 세포 배양 배지를 포함하도록 구성된, 접착성 세포 배양 바이오 리액터.
61. 제56항의 접착성 세포 바이오 리액터에서 접착성 생산 세포를 배양하여 제조된, 재조합 폴리펩타이드.
62. 제61항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 바이러스를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
63. 제62항에 있어서, 상기 바이러스는 비-바이러스성 전이 유전자를 함유하는 바이러스 캡시드를 포함하는, 재조합 폴리펩타이드.
64. 기질 상에 접착성 세포를 배양하는 방법으로서,
    a. 제56항의 바이오 리액터를 수득하는 단계, 및
    b. 상기 바이오 리액터 세포 배양 배지 및 세포를 첨가하는 단계, 및
    c. 1일 당 1,800 세포 당 배지의 약 50 mL 미만의 속도로 세포에 대한 상기 세포 배양 배지를 순환시키면서, 기질 상의 접착 모드로 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
65. 제64항에 있어서, 상기 기질은 접착성 세포 배양을 위한 표면적이 적어도 약 400 ㎡ 이상인, 방법.
66. 제64항에 있어서, 상기 바이오 리액터는 적어도 약 20L의 세포 배양 배지를 포함하도록 구성된, 방법.

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