MXPA04008753A - Baculovirus disenados y su uso. - Google Patents

Abstract

Se disena un baculovirus de modo que la capsida exhibe uno o mas peptidos o proteinas heterologas. Tal baculovirus se puede utilizar para suministrar sustancias terapeuticas, y en la genomica funcional.

Description

BACULOVIRUS DISEÑADOS Y SU USO Campo de la Invención Esta invención se relaciona a baculovirus diseñados y su uso, y especialmente a bibliotecas y exhibición de péptido proporcionado en el baculovirus. Antecedentes de la Invención Durante los últimos años, muchos organismos han tenido sus genomas completamente secuenciados . Una secuencia preliminar del genoma humano completo ha sido publicada. Sin embargo, la información de la secuencia como tal, no explica lo que todos los genes hacen, cómo trabajan en las células, cómo las células forman organismos, que les pasa en la enfermedad, como se envejece o como desarrollar un fármaco. Esto es donde entra en juego la genómica funcional, un área de la era post-genómica que trata con el análisis funcional de los genes y sus productos. Entre las técnicas de la genómica funcional, ambos microarreglos de DNA y la proteómica mantienen gran promesa para el estudio de sistemas biológicos complejos. Aunque los microarreglos de DNA permiten el análisis de alto rendimiento del transcriptoma (el complemento de mRNAs transcritos del genoma de una célula en cualquier tiempo) , se pueden presentar genes, ellos pueden ser mutados, pero ellos no son necesariamente transcritos. Algunos mensajeros se transcriben pero no son traducidos y el número de copias de mRNA no necesariamente refleja el número de moléculas de proteina funcionales. La proteómica (el conjunto completo de proteínas codificadas por una célula en cualquier tiempo) se dirige a los problemas que no pueden ser abordados por el análisis de DNA, específicamente, la abundancia relativa del producto de proteína, la modificación de pos-traducción, la localización subcelular, el cambio, la interacción con otras proteínas, así como los aspectos funcionales. Las características observables conferidas por un gen en una biblioteca de expresión permite el descubrimiento de estructuras de lectura abierta funcionales en genomas secuenciados nuevos (biblioteca genómica) así como la caracterización de la función de genes desconocidos (biblioteca genómica o cDNA) . Una biblioteca compatible al mismo tiempo con las células bacterianas y eucarióticas así como con los experimentos in vi tro e in vivo sería una herramienta poderosa en este sentido. Aunque un vector de plásmido podría permitir esto en teoría, la ineficiencia de la transducción de células eucarióticas por el DNA de plásmido, sin mencionar la eficiencia de transferencia de gen moderada de los plásmidos in vivo, disminuye la utilidad de las bibliotecas de. plásmido como herramientas de alto rendimiento de la genómica (análisis automatizado/de alto rendimiento de las proteínas) Los baculovirus se han utilizado por mucho tiempo como biopesticidas y como herramientas para la producción de proteina recombinante eficiente en células de insecto. Ellos generalmente se consideran como seguros, debido a su especificidad de especie naturalmente alta y debido a que no se conocen que se propaguen en cualquier huésped no invertebrado . El virus de polihedrosis nuclear múltiple Autographa californica (AcMNPV) , que contiene un promotor eucariótico apropiado, es capaz de transferir y expresar eficientemente genes objetivo en varios tipos de células mamiferas in vitro. Además, como es reportado en WO-A-01/90390, los baculovirus son capaces de mediar la transferencia de gen in vivo comparable con los adenovirus; ver también Airenne y colaboradores, Gene Ther. 7:1499-1504 (2000) . La facilidad de manipulación y la construcción rápida de baculovirus recombinantes , la falta de citotoxicidad en células mamiferas, aun a una alta multiplicidad de infección, una incapacidad inherente para replicar en células mamiferas y una capacidad grande (no se conoce limite de inserción) para la inserción de secuencias extrañas, son características del baculovirus.' Vp39 es una proteína de cápsida mayor de baculovirus. El baculovirus entra a las células por medio de la endocitosis mediada por receptor. El virus es eficientemente incorporado por muchas líneas de células mamíferas, pero no es capaz de entrar al núcleo en células no permisivas. Previamente se ha sugerido que el bloqueo de una transducción eficiente de células mamíferas no es la falta de penetración del baculovirus en las células mediante la endocitosis mediada por receptor, sino la incapacidad del virus para alcanzar el núcleo (Boyce, PNAS USA 93:2348-2352, 1996; Barsoum, Hum. Gene Ther. 8:2011-201.8, 1997). Hay una suposición general de que el bloqueo de la transducción está en el escape del virus de los endosomas. Se conoce diseñar la glicoproteína de superficie mayor de AcNPV, para la presentación de proteínas heterólogas sobre la, superficie del virus (Boublik y colaboradores, Biotechnology (N.Y.) 13:1079-1084, 1995). La referencia también puede ser hecha a O' Reilly y colaboradores, "Baculovirus expression vectors. A laboratory manual", Oxford University Press, New York, NY (1994) . Para evitar los procesos de purificación en placa laboriosos y consumidores de tiempo, el material genético puede ser introducido en el genoma del baculovirus mediante recombinación homologa en la levadura Saccharomyces cerevisae; ver Patel y colaboradores, Nucleic Acids Res. 20, 97-104, 1992). Este método es rápido (virus recom inante puro dentro de 10-12 días) y asegura que no hay residuo antecedente de virus de origen pero sufre de la necesidad por experiencia en el cultivo de levadura y la incompatibilidad de los vectores de transferencia tradicionales con el sistema. Luckow y colaboradores, J. Virol . 67, 4566-4579, 1993, describe un procedimiento más rápido (virus recombinante puro dentro de 7-10 dias) para la generación de baculovirus recombinantes , que usa la transposición especifica del sitio con Tn7 para insertar genes extraños en el DNA del bácmido (genoma -del virus) propagado en las células de E. coli. Los clones de E. coli que contienen bácmidos recombinantes se seleccionan por color (ß-galactosidasa) y el DNA purificado de una colonia blanca individual se utiliza para transfectar células de insecto. Este sistema es compatible para el aislamiento simultáneo de múltiples virus recombinantes pero sufre del porcentaje relativamente bajo de colonias recombinantes (genomas de baculovirus) obtenido en la transformación. Las pobres características de selección del sistema original se han mejorado mediante un procedimiento de selección sensible a la temperatura, como es descrito por Leusch y colaboradores, Gene 160, 191-194, 1995. Sin embargo, este sistema se ha probado dudoso en el uso. Breve Descripción de la Invención De acuerdo con uri primer aspecto de la presente invención, un método para seleccionar un gen objetivo, comprende las etapas de: (i) generar una biblioteca de genes o fragmentos genómicos clonados en el baculovirus como un vector; (ü) transformar una célula hospedera con el vector; y (iii) detectar la expresión de gen bajo condiciones predeterminadas. Las bibliotecas genómicas o de cDNA baculovirales ofrecen una herramienta poderosa para la genómica al permitir la clasificación funcional de las bibliotecas construidas en células eucarióticas tanto in vitro como in vivo. La adición de un promotor bacteriano en un vector donador de baculovirus también permitirá la clasificación de expresión de las bibliotecas de cDNA en células bacterianas. Las bibliotecas de baculovirus pueden ser construidas a partir de clones de longitud completa validados, adecuados y secuencias de humano y otras fuentes de vertebrados. Esto permitirá la integración de la infección eficiente (células de insecto) y la transducción (células de vertebrado) de células objetivo por los baculovirus y la aplicación a' la fenómica. De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, la cápsida del baculovirus se modifica para exhibir una o más proteínas u otros péptidos heterólogos (este último término es usado generalmente en la presente, para incluir proteínas) . Los baculovirus correspondientemente modificados en genoma representa un aspecto adicional de la invención. Tal baculovirus puede ser usado para transducir células mamíferas y otras células. En particular, ahora se ha mostrado que el mayor bloqueo en la transducción de baculovirus de las células mamíferas no está en el escape del endosoma, sino en el transporte nuclear de la cápsida de virus . También se ha mostrado que nuevas entidades de proteína pueden ser fusionadas al N- o C-terminal de vp39 sin comprometer el título viral y la funcionalidad de las proteínas de fusión vp39 sobre la superficie de cápsida de AcMNPV. Además, el virus etiquetado puede ser usado para la transferencia de gen in vivo. El baculovirus construido de esta manera proporciona una herramienta versátil para el análisis en tiempo real de la ruta de transducción de AcMNPV en células mamíferas y animales intactos así como el mecanismo de infección en células de insecto. Los baculovirus modificados en la cápsida también sostienen una gran promesa para la direcció nuclear y subcelular de transgenes y como un nuevo sistema de exhibición de péptido para células eucarióticas . El sistema de exhibición de la cápsida tiene muchas ventajas comparado con un sistema de exhibición de envoltura de gp64. En vp39, nada de porciones estructurales se han reconocido ya sea para la asociación con moléculas dentro de la materia estromática o para el ensamble de cápsida, ni es responsable para la infectividad del virus. Además, la microscopía inmunoelectrónica muestra que vp39 se distribuye aleatoriamente sobre la superficie de la cápsida opuesto a gp64 sobre la envoltura del virus. El sistema de exhibición de la envoltura del baculovirus permite solamente fusiones al extremo N-terminal del gp64, mientras que el vp39 permite la marcación a ambas terminales. Aunque está por mostrarse cómo las proteínas grandes pueden ser exhibidas en la cápsida del baculovirus, los resultados sugieren que por lo menos la proteína de 27 kDa puede ser expresada eficientemente. Debido a que la longitud de la cápsida puede extenderse relativamente de manera libre, es razonable esperar que- vp39 también es compatible con proteínas más grandes, por ejemplo hasta 100 kDa o mayores. La exhibición aleatoria de péptidos o proteínas sobre la cápsida puede permitir el descubrimiento de porciones capaces de transportar la cápsida en el núcleo u otros organelos intracelulares . Esta invención también proporciona un 'método mejorado para la generación de baculovirus recombinantes mediante la transposición mediada por Tn7. El método está basado sobre un vector donador modificado y un esquema de selección mejorado de los bácmidos de baculovirus en E. coli con el gen SacB. Los bácmidos recombinantes pueden ser generados a una frecuencia de =105 por µg de vector donador con un residuo antecedente insignificante. Este sistema fácil de utilizar y eficiente proporciona la base para una generación de alto rendimiento de baculovirus recombinantes asi como una manera más conveniente para producir virus individuales. El esquema de selección introducido también puede ser útil para la construcción de otros vectores mediante la transposición en E. coli. Usos adicionales para el baculovirus modificado . de acuerdo con la invención incluyen cualquier forma de "terapia de cápsida". Asi, las proteínas se pueden utilizar como un sistema para el transporte de péptidos o proteínas directamente al núcleo. En particular, el concepto de terapia mediada por baculovirus incluye la posibilidad de usar la cápsida de baculovirus como una lanzadera para el transporte de proteínas terapéuticas en células como una alternativa a los esquemas de transducción de proteína tradicionales. Los beneficios de la terapia sin una necesidad por la expresión de transgen son evidentes. El sistema de exhibición de cápsida del baculovirus ofrece una herramienta fácil para estudiar los mecanismos de transducción de baculovirus en las células mamíferas así como los mecanismos de infección en las células de insecto. Además,- este sistema proporciona una herramienta novedosa tanto para la expansión de las posibilidades de dirección del baculovirus en el nivel intracelular y para aumentar la exhibición de péptidos y proteínas complejas. Además, la construcción de baculovirus EGFP proporciona una herramienta valiosa para estudiar la entrada en tiempo real y el movimiento intracelular del virus en células, mamíferas así como el rastreo de la biodistribución y transducción in vivo. Un aspecto adicional de la invención es un vector tetra-promotor novedoso (pBVboostFG) que permite la clasificación de bibliotecas que contiene inserto grandes en células bacterianas, de insecto y mamíferas. La clonación de los fragmentos de DNA deseados está basada en el sistema de recombinación específico del sitio eficiente del bacteriófago lambda. Además, el vector es compatible con el sistema de clonación de transposición basado en mini Tn7 mejorado, pBVboost, que permite la producción fácil y rápida de baculovirus recombinantes sin ningún residuo antecedente. El vector contiene los siguientes promotores: ß-actina de pollo, T71ac, plO y pPolh, que puede ser usado para expresar los · insertos clonados en células mamíferas, bacterianas y de insecto. Por medio de la invención, lo genes de prueba avidin de pollo y proteína fluorescente verde incrementada (EGFP) se clonaron fácilmente y de manera efectiva en el nuevo vector y se expresaron en células hospederas . Al usar este vector, es posible clasificar bibliotecas grandes, en la escala de p genomas completos, haciendo de esta manera pBVboostFG una herramienta para la genómica funcional. La clonación de las bibliotecas al vector desarrollado está basada en el sistema de recombinación especifico del sitio eficiente del bacteriófago lambda. Las bibliotecas clonadas se pueden transferir fácilmente a cualquier otro sistema, basado en el mismo esquema de clonación de recombinación. Además, la transducción de los genes clonados también se puede hacer directamente in vivo sin ninguna de las etapas de subclonación adicionales, por medio de la transducción mediada por baculovirus. En contraste a los sistemas basados en adenovirus y retrovirus, un beneficio obtenido al usar baculovirus como un vector que contiene la biblioteca es que no hay limite superior conocido del DNA de inserción que puede ser incorporado en su genoma. Breve Descripción de los Dibujos La Fig. 1 es un mapa del plásmido de exhibición de cápsida pBACcap-1. El plásmido está diseñado para la exhibición de cápsidas del baculovirus mediante la fusión N-terminal o C-terminal de péptidos o proteínas con la protéina de cápsida Ac EV vp39. La Fig. 2 es un mapa de plásmido del vector donador pBVboost. El cásete de expresión de la célula de insecto está compuesto de un sitio de clonación múltiple (MCS, enzimas de restricción única mostrada) flanqueado por el promotor de polihedrina (pPolh) y el sitio de poliadenilación del virus de simio 40 (SV40 pA) . Tn7L y Tn7R, extremos izquierdo y derecho del cásete Tn7; SacB#3, gen de levansucrasa mutado; orí, el origen de replicación ColEl; GENT, gen de gentamicina. La. Fig. 3 es un mapa del vector pBVBoostFG. El vector está diseñado para la construcción eficiente de bibliotecas de expresión de baculovirus mediante el sistema RC del bacteriófago lamda pero incluye también una opción para la construcción de la biblioteca basada en enzima de restricción tradicional. El sistema permite la expresión de genes deseados bajo un sistema universal ( tetra-promotor híbrido) que permite la caracterización simultánea de la actividad' de las estructuras de lectura abierta clonadas en E. coli como biblioteca de plásmido o como una biblioteca baculoviral en células de insecto y mamíferas y animales. La clonación del gen marcador bajo el promotor pPolh puede ser usada para la detección fácil de baculovirus producidos como en el caso de pBVboostFGR o para modificar la biblioteca baculoviral producida por otros medios. La Fig. 4 es una revisión del uso del sistema basado en pBVboostFG para clonar y generar bibliotecas baculovirales universales. Las etapas que son mostradas son como sigue: 1. Clonar con RC la biblioteca deseada en el cásete RC de pBVboostFG. 2. Transformar las células DHlOBacATn? de E.. coli con la biblioteca pBVboostFG recombinante. 3. La selección de gentamicina, tetraciclina y sacarosa resulta en 100% de bácmidos recombinantes . 4. Transferir las colonias y cultivar durante la noche. 5. Extraer los bácmidos recombinantes mediante lisis alcalina y transfectar las células de insecto . 6. Clasificación del virus primario. Titulo ~108 pfu/ml. 7. Transducir en células objetivo deseadas y probar in vivo. La Fig. 5 es una representación esquemática de la estrategia de SES-PCR para construir los casetes de avidin (A) y EGFP (B) para la clonación en pBVboostFG. Las lineas de rayas últimas muestran los sitios attL compatibles con la reacción LR del sistema RC utilizado y la señal ompA bacteriana (en avidin) en oligonucleótidos . (C) Oligonucleótidos para sintetizar las construcciones de avidin y EGFP compatibles con la reacción LR. Las secuencias attL se muestran en cursivas y una secuencia que codifica el péptido de señal ompA esta subrayada.

Descripción de Modalidades Preferidas Para dirigir una expresión de alto nivel de genes de la biblioteca de bavulocirus en células de invertebrados, de E. coli y de insecto, un cásete de expresión puede ser construido, basado en un híbrido u otro promotor adecuado que permite la expresión de alto nivel de genes objetivo tanto en células procarióticas como eucarióticas . Un sitio objetivo para, por decir, cre-recombinasa (loxP). se puede incluir en el cásete de expresión, para permitir la construcción fácil de bibliotecas de baculovirus usando la recombinación específica del sitio in vitro (Sauer, . Methods 14:381-392, 1998). Para incrementar adicionalmente las opciones para construir las bibliotecas de baculovirus, los sitios attR y ccdB (y por decir, un marcador de resistencia a cloramfenicol u otro marcador para seleccionar la ligación exitosa del cásete) se pueden incluir en el cásete de expresión. Esto permite la conversión fácil de bibliotecas, compatibles con, por decir, Life Technologies Gibco BRL® Gateway MR Cloning Techology (Life Technologies) , a la biblioteca de baculovirus novedosa. Además de la compatibilidad de cre/lox y Gateway, el cásete de expresión puede permitir la construcción de bibliotecas tradicionales mediante varias enzimas de restricción única disponibles en el vector CS después de las modificaciones tales como aquellas descritas en lo anterior. El cásete de expresión construido puede ser clonado en cualquier sistema de baculovirus o plásmido de baculovirus adecuado que pueda actuar como un vector donador. PFastBac-1 es un plásmido de cadena principal preferido puesto que es compatible con el sistema de expresión de baculovirus Bac-To-BacMR (Gibco BRL) que permite la preparación rápida y fácil de re-baculovirus mediante la transposición especifica al sitio en Escherichia coli. Si se desea, eL cásete también puede ser integrado a cualquier sistema de plásmido/expresión deseado, por ejemplo, en una versión- de sistema de expresión de baculovirus Bac-TO-BacMR que permite la construcción más eficiente y directa de los baculovirus (Leusch y colaboradores, Gene 160:191-194, 1995). El cásete de- expresión también puede ser clonado como parte del genoma de baculovirus y la construcción de la biblioteca luego realizada directamente a éste mediante cre/lox, Gateway o métodos de clonación directa. Todo el trabajo de clonación puede ser realizado usando métodos de biología molecular estándares. Las bibliotecas de baculovirus construidas serán clasificadas para el (los) efecto (s) expresión/fenotipo en cepa(s) de E. coli adecuadas (biblioteca en el formato de plásmido donador) células de insectos y células de vertebrados. Los virus seleccionados o las bibliotecas completas también pueden ser usadas directamente para estudios in vivo. Esto alivia el potencial grande y único de las nuevas bibliotecas de baculovirus; la misma biblioteca puede ser usada para células procarióticas y eucarióticas y en estudios en células (in vitro) y animales [in vivo) . A manera de ejemplo, y para permitir la dirección intracelular del AcMNPV, se ha desarrollado un sistema de exhibición de cápsida del baculovirus. El sistema está basado sobre un vector donador versátil que permite la producción eficiente de proteínas deseadas como la fusión N-o C-terminal a la proteína de cápsida mayor de baculovirus, vp29 (Thiem Y Miller, J. Virol. 63:2008-2018, 1989). Las proteínas de cápsida del baculovirus alternativas que son objetivo potenciales para los péptidos o proteínas incluyen p24 y p80. Una construcción de re-AcMNPV de alto título puede exhibir una alta concentración de una proteína extraña en su cápsida. El virus marcado es una herramienta fácil para estudiar la ruta de transmisión del baculovirus en las células mamíferas a partir de la superficie celular hacia el núcleo y la capacidad de transfección del baculovirus in vivo. El sistema proporciona al mismo tiempo una herramienta poderosa para estudiar los obstáculos de la transducción de AcMNPV de líneas de células no permisibles y una posibilidad para mejorar la dirección nuclear o subcelular mediante la incorporación de secuencias específicas en la proteína vp39. AcMNPV también puede permitir la dirección doble al nivel de la superficie celular mediante la inserción de ligandos o anticuerpos específicos a la envoltura, seguido por la dirección intracelular mediante la modificación de vp39. . Para maximizar la oportunidad para alcanzar una fusión funcional y el ensamble de la cápsida, se construyó un plásmido de transferencia que permite la fusión de identidades deseadas ya sea en N- o C-terminal de la vp39 (Fig. 1). La producción de proteína de fusión es inducida por un promotor de polihedrina más fuerte, por ejemplo, como es descrito por O'Reill y colaboradores, supra. Puesto que la predicción por computadora mostró que vp39 tiene baja complejidad en el C-terminal pero fue restringida en N-terminal, una secuencia enlazadora (por ejemplo, GGGGS) se puede adicionar al N-terminal, para dar la distancia y la flexibilidad para que las proteínas de fusión N-terminales se plieguen correctamente. Una opción para marcar las proteínas de fusión vp39 con un His-tag también puede ser preferida. Por ejemplo, el plásmido pBACcap-1 produce vp39 con His-tag en el N-terminal. Sin embargo, el mismo plásmido o transferencia se puede usar para las fusiones N- o C-terminales con o sin His-tag. El sistema es compatible con la preparación de virus mediada por transporón. Sin embargo, el cásete de expresión en el pBACcap-1 puede ser fácilmente movido a cualquier vector de baculovirus deseado. La presente invención incluye la posibilidad de dirección doble, como una extensión de la dirección convencional que "trabaja principalmente en el tejido o al nivel de la superficie celular. La idea básica de la dirección al tejido es adicionar un ligando especifico sobre la superficie del vector de la transferencia de gen para alcanzar el enlace especifico a las células o tejidos deseados. Es bien conocido que una interacción del ligando-receptor especifica no garantiza la transducción eficiente de la célula objetivo. La incorporación, escape de los endosomas y el transporte del material genético hacia el núcleo también •son requeridos. Aunque la transducción puede ser mejorada mediante la selección de las porciones de dirección a la membrana celular, la ruta de citosol al núcleo permanece difícil de alcanzár. Los virus envueltos mantienen una promesa para una dirección doble eficiente en los niveles de tejido intracelulares . Al modificar la envoltura con una porción de dirección al tejido deseada y la cápsida con una porción de dirección intracelular , se debe alcanzar la transducción eficiente y específica de las células objetivo. La dirección de transcripción con promotores específicos también se puede adicionar a estos vectores,. Un método de la invención, para la generación mejorada de baculovirus recombinantes, involucra incorporar un gen letal en el pl'ásmido donador. El producto de gen letal puede exterminar las células que aun albergan el vector donador mientras que la presión de selección combinada como un resultado de la transposición exitosa del cásete de expresión desde el plásmido donador en el bácmido puede rescatar efectivamente solamente los bácmidos recombinantes . En una modalidad particular, un vector donador pBVboost lleva el gen SacB de Bacillus amyloliquefaciens; ver Tang y colaboradores, Gene 96, 89-93, 1990. SacB codifica la levansucrasa que cataliza la hidrólisis de la sacarosa para generar el producto letal levan. Levan exterminará las células en la presencia de sacarosa. Puede ser efectivo usar un gen mutado, para equilibrar el efecto letal de levan en la presencia de sacarosa con una presión de antibiótico adicional . Se presenta que la clonación de un transgen en pBVboost no afecta el esquema de selección mejorado. Los rendimientos y las características de expresión de estos virus son generalmente similares o idénticos a los virus generados por otros sistemas. Se generan virus de alto título (~108 pfu/ml) capaces de expresar cantidades grandes de productos de gen deseados en células de insecto o, con un promotor adecuado en células mamíferas. Ver Airenne y colaboradores (2000), supra. Sin embargo, una diferencia sorprendente como es comparado con el método original es que los recombinantes de bácmido _ pueden ser generados a una frecuencia de =105 por g de vector donador con un residuo antecedente e insignificante. Esta frecuencia además puede ser mejorada al optimizar la preparación de células DH10BacATn7 competentes y al optimizar adicionalmente el protocolo de transformación. Una ventaja adicional del sistema pBVboost es que debido al poderoso esquema de selección no hay necesidad para la selección de color (es decir, no se necesita X-Gal costoso e IPTG en las placas) . Esto hace al sistema efectivo en costo. En conclusión, el · uso del nuevo esquema de selección presentado evita las desventajas asociadas con la generación basada en transposición en original de los genomas de baculovirus en E. coli mientras que retiene la producción de virus simple, rápida y conveniente. La adición del gen letal en el plásmido donador junto con una cepa de E. coli, en la cual el attTn7 cromosómico es ocupado, permite la selección eficiente de los bácmidos recombinantes de una manera efectiva en costo. El sistema pBVboost mejorado es compatible con las aplicaciones de alto rendimiento similar a la clasificación de biblioteca de expresión pero mejora también la construcción de virus recombinantes individuales. Como es indicado en' lo anterior, un aspecto de la invención es un vector particular. Para construir un vector que permite la expresión del gen clonado o la biblioteca de cDNA en diferentes sistemas de ..huéspedes al usar solamente el vector individual sin ninguna subclonación individual, cuatro promotores diferentes sé combinaron en el mismo vector. Este cásete tetra-promotor está compuesto de pPolh, CAG (mejorador CMVie+ promotor de ß-actina de pollo) , T7 lac y plO que dirigen el alto nivel de expresión de los genes objetivo en las células de vertebrado, E. coli y las células de insecto infectadas con baculovirus; esto es descrito en más detalle enseguida, y se muestra en la Fig. 3. Un sitio de clonación múltiple que sigue al promotor pPolh permite una opción para modificar las propiedades del baculovirus o para expresar un gen marcador para detectar la síntesis de baculovirus recombinantes como es descrito aquí. Para permitir una clonación de recombinación eficiente de las bibliotecas deseadas (o genes/cDNAs) en el vector, el cásete RC específico del sitio del bacteriófago lambda que contiene los sitios attRl/2, que hace al vector un vector de destino para este sistema de clonación de recombinación, se incluyó en el plásmido. Para permitir adicionalmente la producción rápida y de alto rendimiento de baculovirus recombinantes, usando el cásete RC tetra-promotor, este puede ser clonado como parte de un vector pBVboost que permite la cero generación de residuo de antecedente de baculovirus recombinantes, que la hace adecuada para la clasificación de biblioteca. Un diagrama de flujo que muestra como clonar y generar una biblioteca baculoviral deseada, en la práctica se muestra en la Fig. 4.

Existen varios puntos que hacen a los sistemas basados en pBVboostFG una elección universal como un vector de clasificación de biblioteca. Uno de sus beneficios principales es la adaptabilidad paira muchos sistemas huéspedes alternativos; la biblioteca (o gen individual/cDNA) puede ser expresada en E. coli, células de insecto, células mamiferas y aun en animales intactos in vivo al usar los baculovirus producidos. La última opción es la más importante, debido a que proporciona una transición rápida de la clasificación de biblioteca in vitro a la prueba en animal sin ninguna de las etapas de subclonación adicionales y por lo tanto notablemente facilita la clasificación de genes relacionados con la enfermedad. En este contexto, el tropismo de los baculovirus es uno de los más amplios de los vectores de transferencia de gen viral estudiados. Un segundo poder del sistema depende del esquema de clonación efectivo para generar bibliotecas que contienen baculovirus sin residuo antecedente de tipo silvestre. Este esta basado sobre dos etapas RC consecutivas que incluyen una recombinación especifica del sitio del bacteriófago lambda y un sistema de transposición de mini Tn7 mejorado. El uso de la estrategia RC en la construcción de la biblioteca proporciona varios beneficios sobre los métodos de clonación basados en enzima de rectricción/ligasa convencionales. En primer lugar, la falta de digestiones de la enzima de restricción durante la clonación mejora la fidelidad de la biblioteca de longitud completa debido a que los clones aspirados no serán digeridos de los sitios de restricción que surgen de manera interna. En segundo lugar, el sistema RC del bacteriófago lambda proporciona una eficiencia de clonación mucho mejor que las estrategias basadas en restricción-ligación. Además, el sistema de recombinación especifico del sitio del bacteriófago lambda es reversible, en contraste a muchos otros sistemas de recombinasa especifico del sitio correspondiente. Esta característica significa que cualquier fragmento clonado en el vector novedoso puede ser fácilmente transferido a cualquier otro vector utilizando el mismo sistema y viceversa. La alta eficiencia de clonación combinada con la generación de baculovirus rápida y libre de residuo antecedente produce bibliotecas representativas más fáciles que han sido posibles mediante la recombinación homologa o mediante métodos de clonación convencionales. Debido a que los genomas de baculovirus recombinantes en este sistema son generados en E. coli, no hay necesidad de llevar a cabo purificaciones en placa para aislar clones separados. Esto también facilita la clasificación y generación de bibliotecas anotadas. Una ventaja adicional de utilizar bibliotecas de baculovirus es que insertos de DNA largos pueden ser clasificados, También, las etapas RC usadas en la construcción de la biblioteca permite la transferencia de insertos largos. En contraste, los vectores de transferencia de gen adenovirales y retrovirales recientes pueden incorporar menos que 8 kb de DNA extraño en sus genomas. La construcción de bibliotecas de baculovirus con el sistema basado en pBVboostFG iniciando a partir del poli-A RNA extraído puede ser realizado dentro de una semana (Fig, 4). Después de la clasificación e identificación de los clones candidatos, la amplificación del virus para la prueba in vivo se puede realizar dentro, de 1-2 semanas. La presencia de un segundo promotor baculoviral tal como pPolh en el vector, separado del esquema RC del bacteriófago lambda, permite la clonación de propiedades adicionales en la biblioteca baculoviral generada. Esta característica es ejemplificada por la clonación del marcador fluorescente bajo pPolh para la identificación de los baculovirus recombinantes producidos. Otros procedimientos correspondientes son la formación de seudotipo de la biblioteca de virus o la modificación de la capa o cápsida baculoviral al clonar las proteínas de fusión GP64 o VP39 bajo el promotor pPolh, que puede permitir una dirección más específica y más eficiente de los virus producidos hacia o dentro de los tipos de células específicos. La siguiente Tabla proporciona vectores usados en este estudio. Vector Descripción pBVboost Vector base para otras construcciones, permite la producción de alto rendimiento de baculovirus recombinantes (Airenne y colaboradores) . pBVboostFG Un derivado de pBVboost, compatible con la clonación de recombinación y la expresión universal. pBVboostFGR Un derivado de pBVboostFG, contiene el gen marcador adicional DsRed que es funcional en las células de insecto. pBVboostFG+AVI Un derivado de pBVboostFG para la expresión de ompA-avidin. pBVboostFG+EGFP Un derivado de pBVboostFG para la expresión de EGFP. pBVboostFGR+EGFP Un derivado de. pBVboostFGR para la expresión de EGFP.

Los siguientes Ejemplos ilustran la invención. Ejemplo 1 Vector de Exhibición de Cápsida Para construir un vector de baculovirus general para la exhibición de cápsida, la región correspondiente a los nucleótidos (nt) 469-1506 de vp39 (GenBank: 22978) se amplificó del DNA de bácmido purificado (Luckow y colaboradores, J. Virol. 67, 4566-4579, 1993) mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . El cebador delantero fue 5'-TT GAA AGA TCT GAA TTC ATG CAC CAC CAT CAC CAT CAC GGA TCC GGC GGC GGC GGC TCG GCG GCT AGT GCC CGT GGG T-3' (secuencia especifica para nt 469-486 del gen vp39 en negritas; sitios BhlII, EcoRI, BarnH.1., subrayados; residuo de Histidina 6x y con el codón de inicio en cursiva) ; el cebador trasero fue 5'-TT CTG GGT ACC GCt tta ATG GTG ATG ATG GTG GTG TCT AGA GCt tta ACT AGT GAC GGC TAT TCC TCC ACC-3' (secuencia especifica para nt 1489-1506 del gen vp39 en negritas; los sitios Kpnl, Xbal y Spel subrayados; el residuo de Histidina 6x en cursivas; codón de detención en letras minúsculas) . La PCR se realizó esencialmente como es descrito por Airenne y colaboradores, Gene 144:75-80, 1994, excepto que el templado se ajustó a 58 °C. El fragmento amplificado se digirió con las enzimas BglII y Kpnl y se purificó como es descrito en Airenne y colaboradores, supra . El producto PCR purificado se clonó en el vector pFAastBACl digerido com BamHI+Kpnl (Invitrogen, Carlsbad, USA) . El plásmido resultante se nombró como pBACcap-1. La secuencia de nucleótidos se confirmó mediante secuenciación (ALF; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) . Preparación de Virus que Exhiben EGFP CDNA que codifica EGFP (proteina fluorescente verde incrementada) se amplificó del plásmido pEGFP-Nl (GenBank: U55762, Clontech, 'Palo Alto, USA) mediante PCR y se clonó en el pBACcap-1. Dos conjuntos de cebadores se utilizaron para permitir la fusión de EGFP para ambos de los extremos N- y C-terminales de la vp39. Para la fusión N-terminal, el cebador delantero fue 5'- CGG GAT GAA TTC GTC GCC ACC ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG-3 (secuencia especifica para nt 670-699 de pEFGP-Nl en negritas, sitio EcoRI en cursivas) y el cebador trasero 5'-GCG GCC GGA TCC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3' (secuencia especifica para nt 1375-1395 de pEGFP-Nl en negritas; sitio Bamtil en cursivas) . El fragmento amplificado que correspondió a nt 670-1395 de pEFGP-Nl se clonó en el sitio EcoiRI/BamHI del pBACcap-1 suprimido con Spel/Xbal . El plásmido resultante se nombró pEGFPvp39. Para la versión C-terminal, el cebador delantero fue 5' -GTC GCC ACT AGT GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG-3' (secuencia especifica para nt 682-702 de pEFGP-Nl en negritas; sitio £coRI en cursivas) y el cebador trasero 5'-AGA GTC ACT AGT GCt tta CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC-3' (secuencia especifica para nt 1375-1398 de pEFGP-Nl en negritas; sitio Spel en cursivas; codón de detención en letras minúsculas) . El fragmento amplificado que corresponde a nt 682-1398 de pEGFP-Nl se clonó en el sitio Spel del pBACcap-1. El plásmido resultante se nombró pvp39EGFP. Las secuencias de nucleótidos se confirmaron mediante secuenciación (ALF) . Los virus recombinantes se generaron usando el sistema Bac-To-BacMR de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen) . Los virus se concentraron y se purificaron en gradiente, como es descrito en Airenne y colaboradores, Gene Ther. 7:1499-1504, 2000. El titulo de virus se determinó mediante el ensayo de dilución de punto final sobre las células Sf9. Las pruebas de esterilidad se realizaron para las preparaciones de virus y se analizaron para estar libres de lipopolisacárido y contaminación de micoplasma. Inmunomanchado Las muestras . correspondientes a aproximadamente 60,000 células infectadas o virus de 4 mi de medios de cultivo se cargaron sobre SDS-PAGE al 1.0% bajo condiciones reductoras. El gel se manchó sobre filtró de nitrocelulosa y se inmunomanchó como es descrito por Airenne y colaboradores (1994), supra. Anti-EGFP de conejo policlonal (Molecular Prober, Inc., Eugene, USA) se usó como un anticuerpo primario (1:4000) y suero anti-conejo de cabra como un anticuerpo secundario (1:2000) (Bio-Rad, Hercules, USA). El peso molecular estándar en el SDS-PAGE fue de Bio-Rad. Microscopía Electrónica Para la microscopía inmunoelectroñica, partículas de baculovirus vp39EGFP se unieron a rejillas de metal recubiertas con formwar tratadas con suero de ternero fetal al 5% en PBS, se dejaron reaccionar con anticuerpo anti-GFP (dilusión 1:600, 30 min) y se lavaron con PBS . Las rejillas luego se trataron con proteina A conjugada con oro durante 25 min (5 nm en diámetro, G. Posthuma y J. Slot, Utrecht, The Netherlands) y se lavaron con PBS durante 25 min. La rejilla se fijó con glutaraldehido al 2.5% y se contrastó y se incrustó usando acetato de uranilo al 0.3% en metílcelulosa al 1.5%. La línea de células de hepatoma humano HepG2 y las células de hibridoma aórtica endotelial humano (EAHy926, Dr. Edgell, Univ. N. Carolina, USA) transducidas con el virus se fijaron con glutaraldehido al 2.5% durante 1 h a temperatura ambiente y luego con tetróxido de osmio al 1% durante 1 h a +4°C. Después de la deshidratación, las células de mancharon con acetato de uranilo al 2% durante 30 min a temperatura ambiente, se incrustaron en Epon y se seccionaron para la microscopía electrónica. Las secciones se mancharon con citrato de plomo y acetato de uranilo. Las muestras se examinaron usando un microscopio electrónico JEM-1200 EX (Jeol Ltd., Tokyo, Japón). Inmunofluorescencia y Microscopía Confocal Los cultivos de células EAHY, HepG2, MG63 (osteosarcoma humano) y NHO (osteoblasto humano normal) subconfluentes se infectaron mediante el baculovirus vp39EGFP como sigue: las células primero se lavaron con PBS sobre hielo, el virus se adicionó en DMEM que contiene suero de ternero fetal al 1% usando una multiplicidad .de transducciones de 80-100 pfu por célula, y se incubaron durante 1 h en hielo (oscilando) . El efecto del pH lisosomal sobre la entrada del baculovirus se probó al incubar las células en él medio suplementado con monensin a 0.5 µ?. Las células se lavaron con PBS que contiene BSA al 0.5%. Luego, DMEM (que contiene suero al 10%) se adicionó y las células se incubaron durante varios periodos de tiempo a 37 °C y finalmente se fijaron con paraformaldehido al 4% en PBS durante 20 min. Las células se marcaron con EEA1 (antigeno de endosoma temprano 1; BD Transduction Laboratories, Lexington,' Kentucky) . Los anticuerpos secundarios de cabra contra anticuerpos de ratón (Alexa red 546 nm; Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon) se usaron en ' la marcación. Las células se montaron en mowiol y se examinaron con un microscopio de epifluorescencia Axiovdert 100 m SP (y un microscopio confocal (Zeiss LSM510) . Para la visualización de EGFP y Alexa red 546, el multirrastreo para 488 y 546 lineas de láser se usó para evitar la co-localización falsa. La microscopía confocal viva en las células HepG2 y EAHY se realizó como sigue: las células se colocaron sobre cubiertas de vidrio alojadas (Nalge NUNC, Naperville, ¦ Illinois) . Después del enlace del virus sobre hielo, las células se transfirieron al microscopio confocal con una platina de trabajo calentada y el objetivo controlado por Tempcontrol 37-2 (Cari Zeiss, Jena, Alemania) . Las células que fueron positivas para EGFP se exploraron con varios intervalos de tiempo usando el programa en el software LSM510 (versión del programa 2.3; Cari Zeiss, Jena, Alemania) . Inyección In vivo en el Cerebro de Rata Ratas Wistar machos (320-350 g) se anestesiaron intraperitonealmente con una solución (0.150 ml/100 g) que contiene fentanil-fluanisona ( Janssen-Cilag, Hiupnorm©, Buckinghamshire, UK) y midazolame (Roche, Dormicum®, Espoo, Finland) y se colocaron en un aparato estereotáxico (Kopf Instruments) . Un agujero se hizo en las siguientes coordenadas estereotáxicas : 1 mm al satua sagittalis y +1 mm al bregma. 100 µ? de los baculovirus EFGPvp39 o vp39EGDP (0.9 x 1010 pfu/ml) en NaCl 0.9 N se inyectó durante periodos de 4 x 5 min usando una jeringa Hamilton con una aguja de calibre 27 a una profundidad de 3.5 mm. Los animales se sacrificaron con CO2, 7 h después de la transferencia del gen. Las ratas se perfusionaron con PBS mediante la ruta transcardiaca durante 10 min, seguido por la fijación con paraformaldehido al 4%/solución reguladora de fosfato de sodio 0.15 M (pH 7.4) durante 10 min. Los cerebros se removieron y se congelaron rápidamente con isopentano, y se prepararon secciones congeladas gruesas de 40 i . Los cortes se analizaron inmediatamente con la microscopía de fluorescencia (microscopio Olympus AX70, Olympus Optical, Japón) y los datos se colectaron con el software Image-Pro Plus. Caracterización de Virus que Exhiben EGFP Células Sf9 infectadas con los virus de codificación EGFPvp39 o vp39EGFP produjeron las bandas de 67 kDa esperadas en las immunomanchas . Los mismos resultados se obtuvieron de las preparaciones de virus purificadas en gradiente. Los resultados sugirieron que ambas variantes de vp39 se produjeron eficientemente en células de insecto y se incorporaron en partículas de virus. Sin embargo, para confirmar que las proteínas de fusión fueron parte de las cápsidas de virus, el virus vp39EGFP se purificó en gradiente y se incubó con anti-EGFP, se marcó con la proteína A oro y se analizó mediante la microscopía electrónica. Las cápsidas virales mostraron una morfología de forma de varilla típica, y las superficies de las cápsidas no envueltas fueron densamente marcadas con oro. Los viriones intactos no se marcaron. Así, una gran cantidad de EGFP se distribuyó uniformemente alrededor de la cápsida 'del baculovirus recombinante . Para estimar la cantidad del EGFP incorporado por partícula de virus, diluciones en serie de las partículas de virus purificadas se inmunomancharon y se compararon con la cantidad conocida del EGFP purificado. El análisis indicó que aproximadamente 860 moléculas de EGFP se incorporaron por partícula de virus. 590 moléculas de EGFP por cápsida se midieron al comparar la fluorescencia detectada de la preparación de virus de vp39EGFP con el control de EGFP. La alta proporción de incorporación también fue soportada por el SDS-PAGE manchado con Coomassie, de acuerdo con lo cual una alta proporción de la cápsida se hizo de la vp39EGFP. El ensamble de los virus no se afectó por la proteína de fusión, puesto que los títulos de los virus EGFOvp39 y vp39EGFP purificados en gradiente y concentrados (200x) fueron 9.5 x 109 y 8.8 x 109 pfu/ml, respectivamente. Transducción Mediada por Baculovirus La ruta intracelular del virus vp39EGFP fue seguida al inspeccionar las cápsidas marcadas con EGFP y los compartimientos celulares fluorescentemente marcados mediante la microscopía confocal. Las células EAHY, HepG2, MG63 y NHO se transdujeron por varios períodos de tiempo y la colocalización del virus con 1 antígeno de endosoma temprano (EEA1)- se estudió. Las células EAHY, MG63 y NHO se eligieron puesto que se encontraron que ellas son completamente no permisivas para la transducción de baculovirus con el baculovirus LacZ. Nada de células manchadas con azul se detectaron en las placas aun en la presencia de butirato de sodio 10 mM (que aumenta la expresión del gen) mediante el manchado de X-gal con una muy alta multiplicidad de transducción (1000) mientras que la cantidad de células de músculo liso aórtico dé conejo manchadas con azul (RAASMC) estuvieron de acuerdo con los resultados presentados por Airenne y colaboradores (2000), supra. El baculovirus se conoce que entra a las células por medio de la ruta endocitica. Antes de que la cápsida sea suministrada al núcleo, la envoltura de . baculovirus se fusiona con la membrana del endosoma temprano bajo condiciones acidicas moderadas con la ayuda del gp64 viral. Después de 30 min de post-traducción (p.t.), se podría observar que el virus todavía estuvo presente en los endosomas tempranos en ambas de las células HepG2 y EAHY. 4 y 24 h de p.t. el virus no se colocalizó con EEA1 en las células EAHY, sugiriendo que ya ha escapado de los endosomas tempranos. Sin embargo, en estas células, las cápsidas no entran a los núcleos, mientras que las células, HepG2 las cápsidas se observaron en los núcleos como manchas brillantes 4 h de p.t., en las células EAHY el número de núcleos positivos de cápsida (EGFP) fue muy bajo (0.1%) mientras que casi todos los núcleos fueron positivos en las células HepG2 4 h de p.t. (91%) en 24 h de p.t., EGFP no fue por más tiempo claramente distinguido de los núcleos de las células HepG2 , sugiriendo que las cápsidas se han desmontado, mientras que aun estuvieron presentes en el citoplasma en las células EAHY. La marcación fluorescente de los endosomas tempranos de reciclado con rabil y endosomas tardíos y lisomas con anti-CD63 no mostró co-localización con EGFP en 24 h de p.t. en las células EAHY, sugiriendo que la cápsida del virus no estuvo en la ruta endocitica. La microscopía electrónica de las células EAHY en 4 h de p.t. confirmó que las cápsidas de virus estuvieron libres en el citoplasma, además sugiriendo que han escapado de los endosomas tempranos. En las células HepG2, las cápsidas estuvieron presentes en los núcleos de 4 h de P-t., mostrando que las cápsidas intactas se transportaron al núcleo desp.ués de la liberación de los endosomas tempranos. La formación en imagen viva del virus vp39EGFP soportó los resultados de los estudios de colocalización. La microscopía electrónica de las células EAHY confirmó que nada de cápsidas de virus estuvieron presentes en los núcleos en 4 h de p.t. Para averiguar si el bloqueo en la entrada nuclear del baculovirus en las células. EAH también es válida para otras células no permisivas, las células MG63 - (Fig. 4) y NHO se estudiaron mediante el virus vp39EGFP. Los resultados sugieren un bloqueo general en la entrada nuclear en la cápsida de baculovirus en las células no permisivas. La transducción de las células en la presencia de monensina condujeron a un bloqueo en la entrada de cápsida del virus en el citoplasma. La monensina inhibe la acidificación de endosomas temprano y ocasiona la acumulación de la carga en los endosomas tempranos. En las células HepG2 y EAHY, la monensina ocasionó acumulación del virus en los endosqmas tempranos positivos de EEA1 en 4 h de p.t. Los resultados asi sugieren que el virus sigue la misma ruta en las células permisivas y no permisivas. En ambos tipos de células el baculovirus se captó mediante la endocitosis adsortiva, seguido por una fusión dependiente del pH de la envoltura con el endosoma como se ha mostrado previamente que ocurre en células de insecto y mamiferas. Visualización del Virus en el Cerebro de Rata in vivo Para investigar la utilidad de vp39EGFP para los estudios de biodistribución de baculovirus, una alícuota del virus se inyectó en el cerebro de rata. El virus se observó aun claramente en 7 h después de las inyecciones en el cuerpo calloso derecho del cerebro de ratas cerca del sitio de inyección. Así, el baculovirus vp39EGFP se puede utilizar para estudios de biodistribución más detallados in vivo. Ejemplo 2 Cepas bacterianas, plásmidos, lineas de células y DNA viral La cepa de E. coli DH5o¡ (Invitrogen, USA) se utilizó para la propagación de plásmidos. Las células DHlOBac y pFastbacl se obtuvieron de Invitrogen, El vector pDNR-LIB que contiene el gen SacB se adquirió de BD Biosciences Clontech, USA. Construcción del vector donador modificado El vector donador modificado se construyó al reemplazar el gen de resistencia a la ampicilina en el vector pFastbacl con el gen de levansucrasa de Bacillus subtillis (SacB) desde el vector pDNR-LIB. En la práctica, el vector pFastbacl se cortó mediante la enzima de restricción BspHI, y la cadena principal del vector lineal se purificó mediante la electroforesis en gel. El cásete de expresión SacB se obtuvo de pDNR-LIB mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) con los cebadores DNR5' : 5'- GTTATTCATGAGATCTGTCAATGCGAATAGGATATC-3' (secuencia para nt 1263-1282 de pDNR-LIB en negritas, sitios BspHi y BglII subrayados), DNR3' : 5-TTAGGTCATGAACATATACCTGCCGTTCACT-3' secuencia para nt 3149-3179 de pDNR-LIB en negritas; sitio BspHi subrayado) . La PCR se realizó esencialmente como es descrito por Airenne y colaboradores (1994), supra, excepto que el templado se llevó a cabo a 58 °C y EXT DNA polimerasa (Finnzymes, Helsinki, Finlandia) se utilizó para la amplificación. El fragmento amplificado se digirió con BspHi y se purificó como es descrito en Airenn y colaboradores. (1994), supra. El producto de PCR purificado se clonó en un vector pFastbacl digerido con BspHi (Invitrogen, Carlsbad, USA) para la orientación mostrada en la Figura 2. El plásmido resultante se nombró pBVboost. La secuencia de nucleótido del cásete SacB#3 se confirmó mediante la secuenciación de DNA (ALF; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) .

Construcción de attTn7 cromosómico bloqueado de la cepa E. coll Para bloquear el sitio attTn7 reservado en DHlOBac, pBVboost se cortó mediante BseRI/AvrlI. La resistencia a la gentamicina extirpada se sustituyó por el cásete de resistencia a la ampicilina . (ARC) para pFastbacl. El ARC se obtuvo mediante PCR con los cebadores DHlOBacinttn7destroybyamp 3': 5'- CTTGGTCCTAGGATTACCAATGCTTAATCAGTG-3 ' (secuencia para nt 1430-1449 de pFastbacl en negritas; sitio Avrll subrayado) . La PCR se realizó como es descrito en lo anterior. El fragmento amplificado se digirió con BseRi/AvrlI y se purificó como antes. El producto de PCR purificado se clonó en un pBVboost digerido con SseRI/AvrlI. El plásmido resultante se nombró pBVboostAamp . La secuencia de nucleótido del cásete de Ampicilina se confirmó mediante la secuenciación de DNA (ALF; Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) . Las células DHlOBac se transformaron mediante pbVboostAamp . Colores azules individuales se colectaron de las placas LB que contienen 50 g/ml de sulfato de canamicina (Kan) , 10 ug/ml de tetraciclina (Tet) , 50 ug/ml de ampicilina (Amp) , 50 µg/ml de X-gal, IPTG 1 mM y sacarosa al 10% en 5 mi de medio LB. Al siguiente día las colonias se clasificaron para la presencia de Bácmidos intactos mediante PCR como es descrito por Donhue, Focus 17, 101-102, 1995. Las colonias que resultan en bandas de 325 bp {signo de Bácmido intacto) en' la electroforesis en gel se estudiaron adicionalmente para la ausencia de donador de plásmido al correr las muestras de DNA de plásmido purificado (Wizard minipreps; Promega, Madison, USA) en gen. Los clones resultantes se preservaron a -70°C como DH10BacATn7 de E. coli. Preparación de células electro-competentes Para preparar células electro-competentes, colonias individuales de las placas LB (Kan,- Tet para DHlOBac o Kan, Tet y Amp para las células DH10BacATn7 a las concentraciones anteriores) se inocularon en 10 mi de Súper caldo (SB; 30 g de Triptoná, 20 g de Extracto de Levadura, 10 g de ácido 3-N-morfolinopropanosulfónico, 1 1 de agua, pH 7.0) con antibióticos apropiados. Las suspensiones se cultivaron durante la noche a 37 °C sobre un agitador. Un litro de SB con 5 mi de glucosa 2M luego se inoculó con 5 mi de cultivo durante la noche hasta que la densidad óptica del nuevo cultivo alcanzó 0.8-0.9 (aproximadamente 2-4 horas) a 600 nm. El cultivo luego se enfrió sobre hielo durante 15 min y se centrifugó a 1500 g durante 15 min a 4°C. Las células se lavaron con 800, 500, 300, 200 y 100 mi de agua enfriada con hielo/glicerol al 10% y se centrifugaron como antes. Finalmente las células se suspendieron en un volumen total de 3-4 mi de glicerol al 10% y se preservaron alícuotas de 40 µ? a -70°C.

Transposición en los bácmidos y la producción de baculovirus recombinantes La transposición se realizó mediante la electrotransformación de 40 µ? de DHlOBac o DH10BacATn7 con el ' vector donador pFastbacl o pBVboost. La electrotransformación se realizó como es descrito por Gibco BRL, usando el sistema BIO-RAD Pulser II (Hercules, USA) . Las células se dejaron recuperar 4 h después de la transformación a 37°C con agitación vigorosa. Los cultivos se colocaron sobre placas LB suplementadas con 7 µg/ml de gentamicina (Gent) y Tet (10 pg/ml) con y sin casarosa al 10%. Las colonias se estudiaron para la presencia de genomas de baculovirus recombinantes mediante PCR como es descrito en lo anterior. Los virus recombinantes se generaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por el sistema Bac-To-Bac (Invitrogen) . Resultados La eficacia de transposición en las células DHlOBac o DH10BacATn7 (en las cuales el sitio attTn7 cromosómico es ocupado) se estudió usando los vectores donadores pFastbacl o pBVboost originales y los resultados se compararon. Como es esperado, el uso del pBVboost dio por resultado un incremento significante en la eficacia de la generación de bácmidos recombinantes en la presencia de sacarosa. Un incremento de arriba de 10 veces en la eficacia de transposición (colonias blancas) se detectó a favor de pBVboost en las células DHlOBac. Además, la transformación de DH10BacATn7 con pBVboost resultó típicamente en 10.0% de colonias blancas como es comparado con solamente 27% en las placas de pFastbacl. La presencia de bácmidos recombinantes en las colonias morfológicamente blancas se probó mediante PCR. Notablemente, el uso de la cepa DH10BacATn7 también produjo un incremento significante en los bácmidos recombinantes con pFastbacl. Ejemplo 3 Construcción de pBVboostFG y pBVboostFGR Para permitir la clonación de recombinación en el vector planeado, el cásete A de clonación Gateway (Invitrogen) se insertó en el vector pTriEx-1.1 modificado (Novagen) . El cásete construido se clonó en el vector pBVboost que permite la generación rápida de baculovirus (Ejemplo 2) y el vector resultante se designó como pBVboostFG (Fig. 3) . Para construir una versión de pBVboostFG que contiene gen marcador, la secuencia de codificación DsRed (del vector pDsRed2-Nl, Clonetech) se subclonó en MCS del pBVboostFG bajo un promotor de polihedro (pPolh) . Este vector fue nombrado pBVboostFGR. Clonación de avidin y EGFP en los vectores pBVboostFG y pBVboostFGR La señal de secreción ompA bacteriana que contiene la construcción de DNA fusionada al cDNA de avidin flanqueado con los sitios attLl (5' ) y attL2 (3' ) requeridos para la clonación de recombinación se obtuvo usando SES-PCR en tres etapas (Fig. 5) . 1 Este producto fue clonado con LR (Invitrogen) en pBVboostFG y el plásmido resultante se nombró pBVboostFG+avi . La construcción EGFP (pEGFP-Nl, Clontech, Palo Alto, USA) se preparó con un procedimiento SES-PCR idéntico en dos etapas, después de lo cual se clonó en pBVboostFG y pBVboostFGR. Los plásmidos resultantes se designaron como pBVboostFG+EGFP y pBVboostFGR+EGFP, respectivamente. Expresión de genes y caracterización de proteínas Las expresiones bacterianas de ompA-avidin y EGFP se llevaron a cabo en la cepa BL21 de E. coli que expresa T7 polimerasa. Para la expresión de un ompA-avidin, las células primero se cultivaron a 37 °C en las condiciones de cultivo de agitación hasta que la densidad óptica alcanzó 0.2 (A595) , después de lo cual la producción de proteina se activó al a.dicionar IPTG a la concentración final de 0.4 mM. La síntesis de avidin se dejó continuar durante la noche a temperatura Las células se fraccionaron en fracciones periplásmicas e insolubles totales, y estas fracciones se sometieron a SDS-PAGE al 15% y se transfirieron sobre filtros de cuentas de nylon. Las proteínas se detectaron mediante el anticuerpo anti-avidin de conejo policlona (1:5000), e IgG-AP Anti-Conejo de Cabra (1:2000) se usó como un anticuerpo secundario (1:2000) . La expresión EGFP se llevó a cabo al crecer bacterias sobre placas LB que contiene IPTG 0.4 m y gentamicina, y el ERGFP producido se detectó directamente de los cultivos bajo luz UV. Los baculovirus recombinantes se construyeron usando los vectores pBVboostFG+EGFP y pBVboost FGR+EGFP como es descrito en lo anterior (Ejemplo 2). Las infecciones baculovirales se realizaron en las células Sf9 (1 x 106 células en cada cavidad de placas de 6 cavidades) durante 3 días. Para probar el cásete de expresión construido en células mamiferas se usaron HepG2 y CHO como lineas de células de prueba para expresar EGFP a través del promotor CAG. La funcionalidad del cásete se probó tanto por la transducción baculoviral como por la transfección (FuGENEMR 6, Roche) usando pBVboostFG+EGFP . En ambas pruebas, 150,000 células se colocaron en cavidades de placas de 6 cavidades y, después de 24 h, las células ya sea que se transíectaron mediante 1-2 \ig de DNA de plásmido o se transdujeron mediante el virus con el MOI 300. Las células se incubaron durante otras 24 h y se formaron en imagen mediante el microscopio de fluorescencia. Clonación de genes de prueba en pBVboostFG y pBVboostFGR La señal de secreción ompA bacteriana se fusionó al gen avidin para transportar el avidin sintetizado al espacio periplásmico de E. coli. Para clonar con RC ompA-avidin y EGFP en pBVboostFG® en una etapa (Fig. 5) , los sitios attL largos requeridos para el sistema de clonación se incluyeron al usar SES-PCR; ver Majumer y colaboradores, Gene 110, 89-94, 1992., Expresión de los genes de prueba avidin y EGFP La expresión de avidin (pBVboostFG+AVI ) fue eficiente en BL21 de E. coli y una proporción notable de proteina celular total estuvo compuesta de avidin después, de la .inducción durante la noche. Parte del avidin se produjo como cuerpos de inclusión insolubles. Los cuerpos de inclusión asi como la muestra de células total ' contuvo también una forma no procesada- de la proteina (es decir, proteina que aun contuvo el péptido de señal) . En contraste, la señal de ompA se segmentó de virtualmente todos los avidins periplásmicos . La funcionalidad del avidin periplásmico se estudió al llevarlo a agarosa de biotina y la fracción total enlazada a agarosa. El EGFP también se produjo exitosamente como una forma funcional en E. coli transformado con el plásmido pBVboostFG+EGFP puesto que fue fácilmente detectado directamente de los cultivos bacterianos que crecen sobre las placas LB. Los baculovirus que codifican EGFP se usaron para infectar las células Sf9. Después de 3 dias de infección, las células se estudiaron en el microscopio fluorescente. En la práctica, todas las células se infectaron.

Correspondientemente, los virus que contuvieron tanto el DsRed como EGFP infectaron las células Sf9 de manera similar. Las células HepG2 y CHO se usaron para mostrar que la construcción de tetra-promotor trabaja también en células martilieras. En este caso, la misma construcción EGFP se usó como con las células Sf9. La construcción fue tanto transducida como baculovirus en células HepG2 y CHO y transfectada como un plásmido (pBVboostFG+EGFP) en las células CHO.

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES 1. Baculovirus, caracterizado porque la cápsida se ha modificado para exhibir uno o más péptidos heterólogos.
2. 2. El baculovirus de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque vp39, p24 o p80 es modificado.
3. 3. El baculovirus de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque vp39 es modificado.
4. 4. El baculovirus de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque vp39 es modificado con una proteína de fusión en el N- y/o C-terminal.
5. 5. El baculovirus de conformidad con cualquier reivindicación precedente, ' caracterizado porque la modificación permite la dirección nuclear o subcelular.
6. 6. Baculovirus, caracterizado porque el genoma se ha modificado para expresar uno o más péptidos heterólogos en su cápsida, como es definido en cualquier reivindicación precedente.
7. 7. El baculovirus de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el vector de baculovirus contiene por lo menos 3 genes.
8. 8. El' baculovirus de conformidad con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, caracterizado porque uno o más - genes heterólogos son de por lo menos 10 kb de largo .
9. 9 . El baculovirus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 , caracterizado porque los genes son genes humanos.
10. 10 . Uso de baculovirus de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque es para el suministro de un péptido en el núcleo de otra célula.
11. 11 . El uso de conformidad con la reivindicación 10 , caracterizado porque la otra célula es una célula de insecto.
12. 12 . El uso de conformidad con la reivindicación 10 , caracterizado porque la otra célula es una célula marnífera..
13. 13 . El uso de conformidad con la reivindicación 10 , caracterizado porque la otra célula es E. coli.
14. 14 . Un método para seleccionar un gen objetivo, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) generar una biblioteca de genes o fragmentos genómicos clonados en baculovirus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 ; (ii) transformar una célula hospedera con el vector; y (iii) detectar la expresión de gen bajo condiciones predeterminadas.
15. 15 . Un método de conformidad con la reivindicación 14 , caracterizado porque las condiciones predeterminadas comprenden un conjunto de condiciones diferentes bajo las cuales la expresión de gen objetivo puede o no puede ser detectada .
16. 16. Un método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque las condiciones diferentes comprenden la dilución limitativa.
17. 17. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado porque la etapa (iii) comprende la identificación de un fenotipo.
18. 18. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado porque la etapa (iii) se repite después de la selección de uno o alguno de los productos de las condiciones predeterminadas.
19. 19. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, caracterizado porque adicionalmente comprende caracterizar el gen expresado bajo las condiciones predeterminadas.