DE2626733A1 - Verfahren zum automatischen und fortgesetzten zuechten lebender gewebe oder zellen - Google Patents
Verfahren zum automatischen und fortgesetzten zuechten lebender gewebe oder zellenInfo
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Description
PATENTANWÄLTE ZENZ & HELBER · D 4300 ESSEN 1 · AM RUHRSTEIN 1 · TEL.: (02 01) 4126
Seite 0 131
OLYMPUS OPTICAL CO., LTD. Hatagaya 2-43-2, Shibuya-ku, Tokyo-to, Japan
Verfahren zum automatischen und fortgesetzten Züchten lebender
Gewebe oder Zellen
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum automatischen und fortgesetzten Züchten lebender Gewebe oder Zellen, d.h.
Gewebe oder Zellen eines lebenden Körpers oder Organismus, die mit einer Nährlösung in einem gasdicht abgeschlossenen und
Bakterienfernhaltenden Zuchtbehälter eingesetzt sind.
Die Züchtung von Geweben, insbesondere von Zellen eines lebenden Körpers oder lebenden Organismus hat gegenwärtig eine besondere
Bedeutung auf vielen Gebieten, z.B. auf dem Gebiete der Medizin, der Biologie und angrenzenden Gebieten gefunden.
Neuere Entwicklungen und Fortschritte in der Viren- und Rickettsienforschung haben die Wissenschaft in die Lage versetzt,
verschiedene neue Vakzine zu entwickeln. Diese Vakzine müssen ständig erzeugt werden,um die notwendige Produktmenge
mit stabilen Qualitäten entsprechend dem sozialen Bedarf zur Verfügung zu stellen. Bisher wurden die Vakzine in der Regel
unter Verwendung von Hühnereiern als Zucht- bzw. Kulturbasis hergestellt; aus immunologischen Gründen ist jedoch die Verwendung
von Geweben oder Zellen eines menschlichen Körpers
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als Zucht- bzw. Kulturbasis erwünscht. Bekanntlich kann eine wiederholt mit auf Eierbasis erzeugten Vakzinen geimpfte
Person unter Umständen eine Eierallergie entwickeln, und hierin liegt eines der sozialen Probleme, das die standardisierte
Züchtung einer großen Menge von Geweben oder Zellen des menschlichen Körpers bzw. Organismus erforderlich macht.
Aufgrund der Schwierigkeit der Züchtung einer Subkultur von
menschlichen Geweben oder Zellen aus einer bestehenden Kultur, war man bisher der Auffassung, daß die stabile gezüchtete
"Masse" derartiger Gewebe oder Zellen mit Ausnahme von speziellen Zellen oder Geweben solange nicht gewonnen werden
kann, bis die Technik der Züchtung von Geweben oder Zellen des lebenden Organismus in einem Inkubator oder in einem
Zucht- bzw. Brutkasten, dessen Innenraum in einer besonderen Gasatmosphäre gehalten wird, entwickelt und popularisiert
worden ist. Aufgrund dieser Züchttechnik wurde es möglich, selbst besondere lebende Zellen, wie Leberzellen, Nervenzellen
und Hypophyse-Zellen zu züchten.
Aus den nachfolgend noch genauer angegebenen Gründen ist die herkömmliche Methode zur Züchtung lebender Gewebe oder Zellen
jedoch schwer zu standardisieren. Bei der Zellen- oder Gewebezüchttechnik in einer Gasatmosphäre, die gegenwärtig als die
wirksamste Methode angesehen wird, ist es unvermeidlich notwendig, den die Gewebe oder Zellen enthaltenden Züchtungsbehälter
während des Züchtvorgangs aus dem gasdichtverschlossenen Zuchtkasten herauszunehmen, um die Vermehrungs- bzw. Verviel—
fältigungsbedingungen der Gewebe oder Zellen beobachten zu können. Aufgrund dieser Beobachtungs- bzw. Untersuchungsergebnisse
führt der Züchtungsfachmann sodann die erforderlichen
Handarbeiten zur Gewinnung der Subkultur der Zellen oder Gewebe durch. Daher werden die Zellen oder Gewebe im Ztbhtungsbehälter
für relativ lange Zeiträume während der Untersuchung und Handarbeiten der Luft ausgesetzt, wodurch sich die Züchtung
sumgebung für die Zellen oder Gewebe stark ändern kann.
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Dies bedeutet, daß die Züchtbedingungen der Zellen oder Gewebe aufgrund der Untersuchungen und Handarbeiten während
der Züchtung beträchtlich beeinflußt werden. Neben diesen Änderungen der Zuchtbedingungen können die Zellen oder Gewebe
durch die Luft selbst oder durch in der Luft enthaltene Bakterien oder Keime verunreinigt werden. Überdies reicht
die Zahl der zur Durchführung dieser Arbeiten befähigten
Züchtungsfachleute nicht aus, da zur Ausbildung der Bedienungspersonen wenigstens eine zweijährige Ausbildungszeit
erforderlich ist.
Da die Standardisierung der Zellen- oder Gewebezüchtung aus den zuvor angeführten Gründen sehr schwierig ist, werden von
verschiedenen, mit gleichen Untersuchungen befaßten Wissenschaftlern
durchaus gegensätzliche Schlüsse gezogen und Ergebnisse gewonnen.
Die Wissenschaftler müssen sich daher mit der Züchtung bzw.
Kultivierung von Zellen oder Geweben befassen, anstatt sich den ursprünglichen medizinischen oder biologischen Studien
zu widmen. Hierin liegt ein besonderes Arbeitsprobletn für Wissenschaftler auf verschiedenen Gebieten, und es besteht
ein besonderer Bedarf nach Vereinheitlichung, Standardisierung und Automatisierung der Zellen- oder Gewebezüchtung.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Züchten von Geweben oder Zellen lebender Körper bzw.
Organismen zur Verfügung zu stellen, das die Zelle**- oder Gewebezüchtung
vereinheitlicht, standardisiert und automatisiert und mögliche Verunreinigungen durch Luft oder in Luft
enthaltene Bakterien während der Züchtung ausschließt. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sollen insbesondere lebende
Gewebe oder Zellen automatisch und fortgesetzt in großen Mengen gezüchtet werden können.
Zur Lösung dieser Aufgabe wird erfindungsgemäß vorgeschlagen, daß in dem Zuchtbehälter eine Vermehrungsbedingung der Ge-
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webe oder Zellen und die aus der Temperatur, Feuchtigkeit
und Gasatmosphäre im Zuchtbehälter sowie dem pH-Wert der Nährlösung bestehenden Zuchtbedingungen bestimmt bzw. gemessen
werden und nach diesen Meßwerten die Zuchtbedingungen und Arbeiten zum Züchten einer (Sub-)Kultur aus einer bestehenden
Kultur gesteuert werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können lebende Gewebe oder Zellen ohne Gefahr von Verunreinigungen oder Befall
durch Bakterien sehr einfach und wirkungsvoll gezüchtet werden, da die Gewebe oder Zellen während des Züchtvorgangs
nicht der Umgebungsluft ausgesetzt werden. Ferner gelingt
es, die Zuchtbedingungen zu vereinheitlichen oder zu standardisieren, da die Gasatmosphäre, die Temperatur, die
Feuchtigkeit, der pH-Wert der Nährlösung und die erforderlichen Arbeiten bei der Züchtung einer Kultur aus einer bestehenden
Kultur nach denjenigen Meßwerten bzw. Informationen automatisch gesteuert werden, die bei der fortgesetzten
Messung des Zustands der Kultur und der Zuchtbedingungen gewonnen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren macht daher
besonders ausgebildete Fachleute bei der Gewinnung der Subkultur überflüssig.
Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung des Zuchtapparats zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;
und
Fig. 2 ein Prozeßschaubild des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Züchtung von Geweben oder Zellen.
In Fig. 1 ist schematisch ein Zuchtapparat 10 zum Züchten oder Kultivieren von Zellen oder Geweben eines lebenden
Organismus gezeigt. Der Zuchtapparat 10 weist einen gasdicht abgeschlossenen Zuchtkasten 12 auf, in welchem mehrere Zuchtgefäße
14, z.B. Petrischalen angeordnet sind. Jedes dieser
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Gefäße 14 enthält in der Zeichnung nicht dargestellte lebende Zellen oder Gewebe zusammen mit einer Nährlösung. Im Zuchtkasten
12 sind eine erste Detektoreinrichtung 16 zur Bestimmung der Gasatmosphäre, der Temperatur und der Feuchtigkeit
im Kasten 12, eine zweite Detektoreinrichtung 18 zur Bestimmung des pH-Werts der Nährlösung in jedem Gefäß 14 und
eine dritte Detektoreinrichtung 20 angeordnet, wobei letztere insbesondere aus einem optischen Mikroskop besteht, mit dem
die Vervielfachungs- bzw. Vermehrungsbedingungen der Zellen oder Gewebe in jedem Gefäß 14 bestimmt werden« Die dritte
Detektoreinrichtung 20 ist an einer vorgegebenen Stelle im Zuchtbehälter 12 fest montiert, und jedes der Gefäße 14 wird
nacheinander mit Hilfe einer in der Zeichnung nicht dargestellten Transportvorrichtung an die Stelle bewegt, wo die
Vermehrungsbedingungen der Zellen oder Gewebe in jedem Gefäß 14 bestimmt werden können. Im beschriebenen Falle kann
die Objektivlinse des Mikroskops der Detektoreinrichtung
bei der Messung bzw. Bestimmung in die Nährlösung oder die Gewebe oder Zellen im Gefäß 14 verlegt werden, wie dies in
der japanischen Auslegeschrift Nr. 12 945/1976 beschrieben worden ist. Im Kasten 12 ist außerdem eine Verteilungsvorrichtung 22 angeordnet, die zur Verteilung einer Nährlösung,
einer Pufferlösung und Enzym- bzw. Fermentlösung in jedes Gefäß 14 und zur Abgabe dieser Lösungen aus den Gefäßen
14 in der nachfolgend noch genauer beschriebenen Weise dient. Die ersten, zweiten und dritten Detektoreinrichtungen 16
bis 20 sind jeweils mit Eingangsanschlüssen einer Steuereinrichtung 24 verbunden und so ausgebildet, daß sie die
gemessene bzw. bestimmte Information, d.h. die Meßwerte in Form von elektrischen Signalen an die Steuereinrichtung
24 anlegen. Als Steuereinrichtung 24 kann beispielsweise ein Minicomputer dienen. Ein Temperaturregler 26 und ein Feuchtigkeitsregler
28 sind dem Zuchtkasten 12 zugeordnet und mit den Ausgangsanschlüssen der Steuereinrichtung 24 verbunden
und steuern die Temperatur und die Feuchtigkeit im Zuchtkasten bzw. -behälter 12 entsprechend den von der Steuer-
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einrichtung 24 bezogenen Steuersignalen. Diese wiederum
sind aus den von der ersten Detektoreinrichtung 16 abgeleiteten Meßsignalen entwickelt.
Gasbehälter bzw. -flaschen 30, 32 und 34, die jeweils CO_,
O2 und N2 enthalten, sind über Leitungen 36, 38 und 40
mit dem Zuchtkasten 12 verbunden. Um den Gasstrom in den Zuchtkasten 12 geeignet steuern zu können, sind Steuerventile
42, 44 und 46 in den zugehörigen Leitungen 36, und 40 angeordnet. Jedes Steuerventil 42, 44 und 46 ist
mit einem der Ausgangsanschlüsse der Steuereinrichtung verbunden und wird von dem von der Steuereinrichtung 24
abgegebenen Steuersignal entsprechend dem von den ersten und zweiten Detektoreinrichtungen 16 und 18 abgeleiteten
Meßsignal gesteuert. Insbesondere der pH-Wert der Nährlösung im Gefäß 14 wird von dem Steuerventil42 nach dem Steuersignal
der Steuereinrichtung 24 gesteuert, wobei das Steuersignal
auf dem von der Detektoreinrichtung 18 gewonnenen Meßsignal basiert.
Ein eine Nährlösung enthaltender Nährlösungstrog 48, ein eine Pufferlösung enthaltender Pufferlösungstrog 50 und
ein eine Enzymlösung enthaltender Enzymlösungstrog 54 sind
jeweils über Leitungen 56, 58 bzw. 60 mit der Verteilungsvorrichtung 22 verbunden. Steuerventile 62, 64 und 66 sind
ähnlich den Ventilen 42, 44 und 46 in den Leitungen 56, bzw. 60 angeordnet und steuern die Zufuhr der entsprechenden
Lösung zur Verteilungsvorrichtung 22. Jedes der Steuerventile 62, 64 und 66 ist mit einem zugehörigen Ausgangsanschluß der
Steuereinrichtung 24 verbunden und wird von der Steuereinrichtung 24 entsprechend dem von der dritten Detektoreinrichtung
20 abgeleiteten Meßsignal gesteuert.
Die lebenden Zellen oder Gewebe werden in jedem der im gasdicht abgeschlossenen Zuchtkasten 12 angeordneten Gefäße
derart gezüchtet, daß sich die Zellen oder Gewebe im Gefäß
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graduell vervielfachen bzw. vermehren. Während der Züchtung werden die Gasatmosphäre, die Temperatur und die Feuchtigkeit
im Zuchtkasten 12 und der pH-Wert der Nährlösung im Gefäß 14 kontinuierlich von den ersten und zweiten Detektoreinrictitungen
16 und 18 gemessen bzw. überwacht. In ähnlicher Weise werden die Vermehrungs- bzw. Vervielfachungsbedingungen der Zellen oder Gewebe in jedem Gefäß 14 fortgesetzt
von der dritten Detektoreinrichtung 20 in der beschriebenen Weise gemessen bzw. überwacht.
Die Steuereinrichtung 24 vergleicht kontinuierlich die aus den Detektoreinrichtungen kommenden Meßsignale mit den Sollwerten in der Steuereinrichtung 24 und erzeugt entsprechend
den Vergleichsergebnissen bzw. Regelabweichungen Steuersignale für den Temperaturregler 26, den Feuchtigkeitsregler 28 und
die Steuerventile 42 bis 46, so daß die Gasatmosphäre, die Temperatur und die Feuchtigkeit innerhalb des Zuchtbehälters
12 und der pH-Wert der Nährlösung in den Gefäßen 14 auf den vorgesehenen günstigsten Sollbedingungen gehalten werden.
Die Steuereinrichtung 24 bestimmt die Vermehrungsbedingungen der Gewebe oder Zellen im Gefäß 14 durch Verarbeitung der
von der Detektoreinrichtung 20 eingegebenen Meßinformationen.
Zu diesem Zweck kann die durch photoelektrische Sortierung der Dichte der Gewebe oder Zellen oder durch Sortierung der
Bilder der Gewebe c.'er Zellen gewonnene Information zur Kennzeichnung
der Dichianuster der Gewebe oder Zellen verarbeitet werden. Wenn die Steuereinrichtung 24 feststellt, daß sich
die Gewebe oder Zellen in einem Gefäß 14 genügend weit vermehrt haben, um in Stücke geteilt zu werden, wird das Gefäß
14 zu einer Stelle nahe der Verteilungsvorrichtung 22 bewegt
und danach das von der Steuereinrichtung 24 entwickelte
Steuersignal an die Verteilungsvorrichtung derart angelegt, daß letztere die Nährlösung aus dem Gefäß 14 absaugt oder
abzieht. Nach dem Abziehen der Nährlösung erzeugt die Steuereinrichtung ein weiteres Steuersignal, das an das Steuerventil
64 angelegt wird, worauf die Pufferlösung im Trog 50 dem
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Gefäß 14 über die Verteilungsvorrichtung 22 zugeführt wird. Die Pufferlösung dient zur Reinigung des Gefäßes 14 in
vorgegebenen Zeiträumen; sie wird von der Verteilungsvorrichtung 22 wieder abgezogen, sobald die Gefäßreinigung
beendet ist. Danach wird das Steuerventil 66 nach Maßgabe eines von der Steuereinrichtung 24 gelieferten Steuersignals
geöffnet, worauf die Enzymlösung über die Verteilungsvorrichtung 22 dem Gefäß 14 zugeführt wird, um die während
der Züchtung an den Innenflächen des Gefäßes 14 zum Haften gebrachten Gewebe oder Zellen vom Gefäß 14 abzulösen.
Nach diesen Operationen werden die von den Innenflächen des Gefäßes 14 gelösten Gewebe oder Zellen in einen im Zuchtbehälter
12 befindlichen Zentrifugalseparator eingebracht. Die im Separator von der Enz-rä ösung getrennten Gewebe oder
Zellen werden sodann verdünnt, in Stücke vorgegebener Größe getrennt und in Leergefäße ähnlich den Gefäßen 14 in Fig. 1
zur weiteren Züchtung oder Vermehrung eingesetzt. Diese Operationen, d.h. das Einsetzen der Gewebe oder Zellen in das
Gefäß, das Teilen in Stücke vorgegebener Größe bzw. Menge
und das Einsetzen in den Leerbehälter werden mechanisch oder automatisch durch eine geeignete Vorrichtung (nicht gezeigt)
durchgeführt, die im Zuchtkasten 12 eingebaut ist. Da diese Betätigungsvorrichtung an sich sowie die Transportvorrichtung
zur Bewegung des Gefäßes 14 keinen wesentlichen Teil der vorliegenden Erfindung bildet und da ferner beide Vorrichtungen
entsprechend ihren zugehörigen Funktionen ohne Schwierigkeit konstruiert werden können, sind diese Vorrichtungen
in der Darstellung gemäß Fig. 1 fortgelassen, und es erübrigt sich ein näheres Eingehen auf deren bauliche
Ausgestaltung.
Fig. 2 zeigt schematisch den beschriebenen Prozeß zur Züchtung von Geweben oder Zellen. In dem Prozeßschaubild gemäß
Fig. 2 bezeichnen das Bezugszeichen 80 den Injektionsvorgang
der geteilten Gewebe oder Zellen in einem Zuchtbehälter, das
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Bezugszeichen 82 den Züchtvorgang der Gewebe oder Zellen, das Bezugszeichen 84 den Vorgang der Bestimmung bzw. Messung
der verschiedenen Zuchtbedxngungen und der Vermehrungsbe—
dingung der Gewebe oder Zellen, das Bezugszeichen 86 den Vorgang des Abziehens oder Absaugens der Nährlösung aus
dem Zuchtgefäß, das Bezugszeichen 88 den Vorgang der Pufferlösungsinjektion
in das Zuchtgefäß, das Bezugszeichen 90
den Vorgang des Abziehens der Pufferlösung ms dem Zuchtgefäß, das Bezugszeichen 9.2 den Vorgang der Injektion der
Enzymlösung in das Zuchtgefäß, das Bezugszeichen 94 den Vorgang des Absaugens oder Austragens der Enzymlösung aus dem
Zuchtgefäß und das Bezugszeichen 96 den Vorgang der Nährlösungsinjektion
in ein leeres Zuchtgefäß.
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Claims (1)
- PATENTANWÄLTE ZENZ & HELBER ■ D 4300 ESSEN 1 · AM RUHRSTEIN 1 · TEL.: (02O1) 412687 Seite - 10 - 0 131PatentanspruchVerfahren zum automatischen und fortgesetzten Züchten lebender Gewebe oder Zellen, die mit einer Nährlösung in einem gasdicht abgeschlossenen Zuchtbehälter eingesetzt sind, dadurch, gekennzeichnet , daß in dem Zuchtbehälter eine Vermehrungsbedingung der Gewebe oder Zellen und die aus der Temperatur, Feuchtigkeit und Gasatmosphäre im Zuchtbehälter sowie dem pH-Wert der Nährlösung bestehenden Zuchtbedingungen bestimmt bzw. gemessen werden und nach diesen Meßwerten die Zuchtbedingungen und Arbeiten zum Züchten einer (Sub-)Kultur aus einer bestehenden Kultur gesteuert werden.609852/0968Leerseite
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8235 | Patent refused |