DE3790915C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Mikrovermehrung von Pflanzen mit einem aseptischen Raum sowie sterilisierten Kulturgefäßen.

Es ist bekannt, daß die gewöhnlicherweise definiert als der Biotechnologie zugeordnete Methoden im Vorfeld der angewandten biologischen Forschungen und der damit zusammenhängenden naturwissenschaftlichen Untersuchungen stehen. Die biotechnischen Methoden sind insbesondere wichtig zur Vermehrung von Geweben und Zellelementen, wobei das Vermehren auch zur Untersuchung von Pflanzensystemen angewandt wird.

Das gemeinsame Merkmal der Mikrovermehrungsmethoden zur Vermehrung von Geweben und Zellelementen besteht darin, daß diese unter sterilen Bedingungen, in sterilen Gefäßen, in vitro, um die biologischen Aspekte zu klären, durchgeführt werden.

In den verschiedenen Gebieten der Landwirtschaft wird die Bedeutung der Mikrovermehrungsmethoden in vitro erkannt, welche in vielen Kulturen verwendet werden und deren Entwicklung weltweit beobachtet werden kann.

Obwohl bei den naturwissenschaftlichen Untersuchungen der biologischen Aspekte der Mikrovermehrung in letzter Zeit ein hoher Entwicklungsstand gezeigt wurde, blieben die technischen und technologischen Hintergründe trotzdem ungenügend beachtet. Die biologischen Kenntnisse sind zwar gut fundiert, aber sie werden durch technische Methoden erreicht, die eine Weiterentwicklung benötigen. Bei der praktischen Verwendung der Methoden der Mikrovermehrung ist es ziemlich schwierig, die Vielzahl der Pflanzenarten mit der erforderlichen Sorgfalt zu behandeln, da die Anwendung einer Technologie sehr intensiv und effektiv im Vergleich zur bisher angewandten Fitotechnik ist. Die Wichtigkeit der Mikrovermehrung von Pflanzen besteht darin, daß dadurch eine sehr hohe Anzahl von Pflanzenteilen (bis zu 10⁶) erzeugbar ist, wobei die Pflanzen genetisch gleichartig und frei von Infektionen sein müssen.

Die Methode der Mikrovermehrung von Pflanzen beinhaltet folgende Verfahrensschritte:

• - Vorbereitung eines Kulturbodens,
• - Sterilisation,
• - Transplantation in Gefäßen mittels Handarbeit in einem aseptischen Raum und Verschließen der Gefäße, die mit Pflanzenelementen versehen sind,
• - Inkubation.

Bei den erwähnten Verfahrensschritten werden im allgemeinen dieselben Mittel und Laborausrüstungen verwendet, wie in der Mikrobiologie, z.B. Glasgefäße, die zur Aufnahme eines Kulturbodens vorbereitet sind, wobei der Kulturboden aus zumindest einer Nährstoffkomponente sowie einer Verfestigungskomponente besteht und der Kulturboden aufgewärmt wird. Das Verschließen der Gefäße erfolgt durch einen Stöpsel, der aus Watte besteht, wobei der Wattestöpsel die Respiration der Kulturen im Gefäß gewährleistet, jedoch den Sporen den Weg zum Gefäß abschließt. Der Wattestöpsel ist normalerweise mit einer Aluminiumfolie abgedeckt. Die Transplantation wird in einem Impfkasten vorgenommen, wovon aus die Produkte der unter sterilen Bedingungen durchgeführten Verfahren, dem Zuchtplatz und der Inkubation zugestellt werden.

Das bedeutet, daß einige der Verfahrensschritte unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden und andere, wie die Vorbereitung der Kulturböden, die Einführung derselben in das Gefäß und das Abschließen des Gefäßes unter nichtsterilen Bedingungen erfolgen. Vor der Transplantation ist eine Sterilisation notwendig, wohingegen die Inkubation auch keiner steriler Bedingungen bedarf.

Die oben dargestellte Folge von sterilen und nichtsterilen Bedingungen kann bei den Laboruntersuchungen und Forschungen durchgeführt werden, jedoch müssen bei der Massenproduktion andere Erfordernisse erfüllt werden. Deswegen wurden verschiedene Versuche durchgeführt, um die Effektivität der Mikrovermehrung zu verbessern.

Ein wichtiger Schritt dazu bestand darin, die Kulturböden in spezialisierten Fabriken zu präparieren. Eine weitere Entwicklung folgte dem Vorschlag, die Verfestigungskomponenten des Kulturbodens in getrennten Schritten vorzubereiten und diese mit den anderen Komponenten des Bodens vor Anwendung zu vermischen - diese Lösung machte es überflüssig, die Komponenten des Kulturbodens aufzuwärmen. Es ist nur wichtig, die Verfestigungskomponente aufzuwärmen.

Die aus Glas bestehenden Gefäße sind von manchen Instituten durch Gefäße ersetzt worden, die aus lichtdurchlässigem Kunststoff bestehen, und die zum Abschließen angewandten Wattestöpsel konnten mit Stöpseln aus Schaumkunststoff, Kunststoffdeckel oder PVC-Folie ersetzt werden.

Die oben erwähnten Schritte sind per se sehr wichtig, aber alle Verfahrensschritte benötigen Handarbeit, die mit großer Sorgfalt durchzuführen ist, und auf der Basis einer Kenntnis, die von einen hohen Ausbildungsstand zeugt. Dies bedeutet hohe Personalkosten und schränkt die Anwendbarkeit in Fabriken für eine Großproduktion ein.

Aus EP-A2-01 32 414 ist ein Verfahren für die halbautomatische Pflanzengewebekultur-Vermehrung bekannt, bei dem automatisch isoliertes und verdünntes Gewebe in kleine Büschel von segmentförmigem Gewebe aufgeteilt wird und diese aseptisch in eine Trennvorrichtung überführt werden. Dort wird das Gewebe gewaschen, wobei Abkömmlinge von teilweise einheitlicher Größe und teilweise frei von phytotoxischen Zellteilen erhalten werden, die aseptisch in ein Kulturgefäß überführt werden. Aus WO-Al-86/04 919 ist weiterhin ein Verfahren und eine Vorrichtung für die in vitro-Kultur von Pflanzenzellen und -organen bekannt, wobei Pflanzenzellen, Pflanzenorgane und auch ganze Pflanzen steril auf der Oberfläche von auf einer Nährlösung schwimmenden Kugeln vermehrt werden. Die dabei verwendete Vorrichtung enthält alle notwendigen Einrichtungen für die Sterilisation, Beleuchtung, Regulierung der Temperatur und des pH-Wertes, wobei auch die Zuführung von Gas und dgl. vorgesehen ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Anordnung zu schaffen, bei welcher die Effizienz der Mikrovermehrung mit Erfüllung der strengen biologischen Reinheitsbedürfnisse im Vergleich zu den bekannten Lösungen verbessert werden kann.

Die Erfindung basiert auf der Erkenntnis, daß es möglich ist, eine Ausrüstung mit hohem Wirkungsgrad für die Mikrovermehrung von Pflanzen zu erreichen, wenn die Sequenzen der üblichen Verfahrensschritte einer Mikrovermehrung derart geändert werden, daß nach Vorbereitung der Kulturböden die folgenden Schritte unter sterilen Bedingungen ausgeführt werden:

• - Sterilisierung des Bodens,
• - Dosierung der benötigten Komponenten in das Gefäß,
• - Transplantation der Pflanzen und Abschließen des Gefäßes. Die Inkubation benötigt nichtsterile Bedingungen.

Die vorstehende Aufgabe wird durch eine Anordnung zur Mikrovermehrung von Pflanzen gemäß Anspruch 1 gelöst. Die Unteransprüche 2 bis 9 beinhalten bevorzugte Ausbildungsformen.

Bei der erfindungsgemäßen Anordnung ist vorzugsweise die Fördereinheit mit einer Klauenoberfläche ausgebildet, ein flexibles Rohrelement zur Kopplung des Mischkopfes mit zumindest einem der Speiseköpfe angebracht, und unterhalb der Dosiereinheit eine Rutsche vorgesehen.

In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Anordnung ist ein mehrstelliges Richtungselement am Ende der Fördereinheit vorgesehen, und eine weitere Fördereinheit, die vorzugsweise mit einer Klauenoberfläche ausgebildet ist, mit dem Richtungselement gekoppelt.

Die Erfindung wird nachstehend anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert, wobei Bezug auf die beiliegende Zeichnung genommen wird. In der Zeichnung zeigen:

Fig. 1 die Seitenansicht der erfindungsgemäßen Anordnung, und

Fig. 2 die Draufsicht nach Fig. 1.

Die erfindungsgemäß vorgeschlagene Anordnung ist eine Laboreinrichtung, die mit einer geschlossenen Außenfläche zur Gewährleistung eines aseptischen Raumes versehen ist. Diese Außenfläche kann beispielsweise durch eine laminare Kabine, einen laminaren Tunnel oder eine laminare Kammer gebildet werden.

Die vorgeschlagene Anordnung benutzt sterilisierte Kulturgefäße, welche aus lichtdurchlässigen oder lichtundurchlässigen Kunststoffmaterialien, wie Polyethylen, Polypropylen oder Polykarbonat bestehen. Diese Gefäße sind vorzugsweise viereckige Gefäße oder Gefäße mit einer anderen Form, wobei diese ineinandergestellt werden können. Die Kulturgefäße sind in einem Speicher 1 ineinander oder in einer Rolle aufgewickelt angeordnet.

Der Ausgang des Speichers 1 ist mit einer Dosiereinheit 2 verbunden, wobei eine Anlage 3 die Sterilität der Kulturgefäße gewährleistet. Die Anlage 3 ist zum Beispiel als eine Untraviolettlampe ausgebildet.

Eine Rutsche 4 verbindet die Dosiereinheit 2 mit einer Fördereinheit 5 zur Weiterleitung der Kulturgefäße an die nachfolgenden Verfahrensschritte. Wenn erforderlich, kann das Ende der Fördereinheit 5 mit einem mehrstelligen Richtungselement 10 zur Selektion der Kulturgefäße gemäß den unterschiedlichen Weiterleitungsrichtungen versehen werden. In diesem Fall ist eine ergänzende Fördereinheit (11) vorgesehen.

Auf der Fördereinheit 5 werden die Kulturgefäße zur Auslaßöffnung eines Mischkopfes 8 zur Aufnahme sterilisierter Nährstoffkomponenten bzw. sterilisierter Verfestigungskomponenten von dem ersten bzw. zweiten Lagerbehälter 61 und 62 mittels zumindest eines Speisekopfes 71, 72 (72 nicht gezeichnet), transportiert. Sowohl der erste als auch der zweite Lagerbehälter 61, 62 sind in entsprechenden Thermostateinheiten 91; 92 angeordnet, um dessen erwünschte Temperatur zu gewährleisten.

Die mit den Komponenten des Kulturbodens gefüllten Kulturgefäße werden an eine Vorrichtung zum sterilen Abschließen der Kulturgefäße weitergeleitet. Dieses kann auf verschiedene Weise verwirklicht werden, wie zum Beispiel mit einer sterilisierten PVC-Folie, die durch einen Heizfaden 14 in Abschnitte der erwünschten Abmessung nach Verlassen der zylindrischen Fördereinrichtung 13 geschnitten wird, oder durch Anbringen von Verschlußdeckeln, die in einer Speichereinheit 15 angeordnet sind, welche Speichereinheit 15 mit einer Anlage 17 zur Aufrechterhaltung der Sterilität der Verschlußdeckel und einer Dosiereinheit (16) zur Weiterleitung der Verschlußdeckel zu den Kulturgefäßen, die verschlossen werden müssen, versehen ist. Gegebenenfalls werden die Verschlußdeckel mittels einer Verschlußvorrichtung 18 auf die Kulturgefäße angepreßt.

Die sterile Vereinigung der Kulturgefäße mit der PVC-Folie wird mit einer Wärmeeinheit (19) zum Einblasen aufgewärmter Luft gewährleistet. Die PVC-Verschlußfolie ist in einem Halteelement (12) angeordnet. Die Folie kann selbstverständlich aus einem anderen passenden Material bestehen, wenn dies erforderlich ist.

Die vorgeschlagene Anordnung kann wie folgt angewendet werden:
Vor dem Beginn der Arbeit werden die Anlagen 3 und 17, die hier als Ultraviolettlampen ausgebildet sind, zur Gewährleistung der Sterilität eingesetzt und ggfs. in den antiseptischen Raum der Anordnung geschafft. Der darauffol­ gende Verfahrensschritt besteht darin, die Kulturgefäße im Speicher 1 anzuordnen und den Speisekopf 71 mit dem ersten Lagerbehälter 61, der mit den sterilisierten Nährstoffkomponenten versehen ist, zu verbinden. Die sterilisierten Verfestigungskomponenten in dem zweiten Lagerbehälter 62 müssen bis zum flüssigen Zustand erwärmt werden, und dann kann in dem aseptischen Raum der Speisekopf 72 mit dem zweiten Lagerbehälter 62 verbunden werden. Die Speiseköpfe 71, 72 sollten mit dem Mischkopf 8, z.B. mittels eines flexiblen Rohrelements, angekoppelt werden. Die Lagerbehälter, die in dieser Weise vorbereitet werden, können in die Thermostateinrichtung 91, 92 angeordnet werden, um die erwünschte Temperatur zu gewährleisten. Das Halteelement 12 ist gegebenenfalls mit einer gewickelten PVC-Folie ausgestattet, wobei das freie Ende der Folie an der Oberfläche der zylindrischen Fördereinrichtung 13 in der naheliegenden Umgebung des Heizfadens 14 befestigt werden muß. Wenn angewendet, sollte die Speichereinheit 15 mit Verschlußdeckeln, bestehend aus geeigneten Grundstoffen, die übereinanderliegen, gefüllt werden. Danach wird die Anordnung an eine Steuerungseinheit zur Regulierung der Verfahrensbedingungen angeschlossen.

Die Verfahrensschritte sind wie folgt: Die Dosiereinheit 2 bewegt ein Kulturgefäß zur Austrittsöffnung des Mischkopfes 8. In diesem Verfahrensschritt kann die Rutsche 4 behiflich sein. Der Mischkopf 8 nimmt die benötigten Komponenten in erforderlichen Mengen von dem ersten Lagerbehälter 61 und dem zweiten Lagerbehälter 62 durch die Speiseköpfe 71, 72 auf. In dem Kulturgefäß bewirkt die Verfestigungskomponente eine Verfestigung des Kulturbodens. Die Fördereinheit 5 transportiert die Kulturgefäße zu dem mehrstelligen Richtungselement 10, wo die Transplantation ausgeführt werden kann. Die weitere Fördereinheit 11 transportiert die Kulturgefäße zu den darauffolgenden Verfahrensschritten.

Eine Möglichkeit besteht darin, daß die Transplantation im Kulturgefäß während des Transportes auf der Oberfläche der Fördereinheit 5 ausgeführt werden kann, wobei die Fördereinheit kurz zum Stillstand gebracht wird. In diesem Fall wird das mehrstellige Richtungselement 10 nicht benötigt.

Nach der Transplantation leitet die Fördereinheit 5 oder 11 die Kulturgefäße zur Anlage zum sterilen Abschließen weiter. Gemäß einer Möglichkeit hält das Kulturgefäß unterhalb der zylindrischen Fördereinrichtung 13 an, von wo aus die PVC-Folie auf das Gefäß angepreßt wird. Danach schneidet der Heizfaden 14 die Folie und in einer Wärmebehandlungseinheit 19 unter dem Einfluß einer relativ hohen Temperatur wird die Folie, auf den oberen Teil des Kulturgefäßes gespannt. Auf diese Weise werden die sterilen Bedingungen völlig verwirklicht.

Eine andere bevorzugte Lösung besteht darin, die aus Kunststoff bestehenden Verschlußdeckel anzuordnen. In diesem Fall leitet die Dosiereinheit 16 die Deckel weiter zur Oberfläche des Gefäßes, wo sie dann durch die Verschlußvorrichtung 18 auf dem Gefäß angepreßt werden.

Die in dem aseptischen Raum verschlossenen Kulturgefäße werden von den innenliegenden Teilen der Anordnung weggeführt, wobei die Verschlußvorrichtungen Kunststoffdeckel und Folie anbringen, die auch gleichzeitig angebracht werden können. Die Verschlußdeckel sind in diesem Fall mit Perforierungen, wie in den darauffolgenden Verfahrensschritten erforderlich, versehen.

Claims (9)

1. Anordnung zum Mikrovermehren von Pflanzen, mit einem aseptischen Raum sowie sterilisierten Kulturgefäßen, dadurch gekennzeichnet, daß im aseptischen Raum ein Speicher (1) zur Aufnahme einer Dosiereinrichtung (2) zur Weiterleitung der Kulturgefäße, eine Anlage (3) zur Gewährleistung der Sterilität der Kulturgefäße in dem Speicher (1), eine Fördereinheit (5), welche unterhalb der Dosiereinrichtung (2) oder in der Umgebung derselben angeordnet ist, ein erster Lagerbehälter (61) zur Aufnahme steriler Nährstoffkomponenten, ein zweiter Lagerbehälter (62) zur Aufnahme steriler Verfestigungskomponente, zumindest ein Speisekopf (71; 72), welcher mit dem ersten Lagerbehälter (61) und dem zweiten Lagerbehälter (62) verbunden ist, ein Mischkopf (8), welcher mit zumindest einem Speisekopf (71; 72) verbunden und mit einer Ausgangsöffnung versehen ist, eine Thermostateinheit (91; 92) zur Gewährleistung der erwünschten Temperatur des ersten Lagerbehälters (61) und des zweiten Lagerbehälters (62) sowie eine Vorrichtung zum sterilen Abschließen der Kulturgefäße vorgesehen sind.

2. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zum sterilen Abschließen der Kulturgefäße ein Halteelement (12) zur Aufnahme einer oberhalb der Fördereinheit (5) angeordneten Verschlußfolie, eine zylindrische Fördereinrichtung (13) zur Weiterleitung der Verschlußfolie, und einen in der Nähe der zylindrischen Fördereinrichtung (13) liegenden Heizfaden (14) zum Schneiden der Verschlußfolie sowie eine Wärmebehandlungseinheit (19) einschließt.

3. Anordnung nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zum sterilen Abschließen der Kulturgefäße eine Speichereinheit (15) zur Aufnahme von Verschlußdeckeln, eine Dosiereinheit (16) zur Weiterleitung der Verschlußdeckel, und Anlagen (17) zur Gewährleistung der Sterilität der Verschlußdeckel und gegebenenfalls eine Verschlußvorrichtung (18) zur Fixierung der Verschlußdeckel an den Kulturgefäßen einschließt.

4. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Anlagen (3, 17) zur Gewährleistung der Sterilität eine Ultraviolettlampe einschließen.

5. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Thermostateinheit (91, 92) zumindest ein Element der Gruppe, die zumindest einen der Speiseköpfe (71, 72) und den Mischkopf (8) einschließt, umgibt.

6. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fördereinheit (5) mit einer Klauenoberfläche ausgebildet ist.

7. Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein flexibles Rohrelement zur Kopplung des Mischkopfes (8) mit zumindest einem der Speiseköpfe (71, 72) angebracht ist.

8. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß unterhalb der Dosiereinheit (2) eine Rutsche (4) vorgesehen ist.

9. Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein mehrstelliges Richtungselement (10) am Ende der Fördereinheit (5) vorgesehen ist, und daß eine weitere Fördereinheit (11), die mit einer Klauenoberfläche ausgebildet ist, mit dem Richtungselement (10) gekoppelt ist.