DE2659923B1 - Entnahme von durch Umgebungsluft unkontaminierten Probegutes aus unter sterilen Bedingungen arbeitenden Reaktoren - Google Patents

Description

• Das Verfahren der nicht vorveröffentlichten Patentanmeldung p 26 14542.6 betrifft ein Verfahren zur Entnahme von Reaktionsgut aus steril geführten, insbesondere biologischen Prozessen und ist dadurch gekennzeichnet, daß steriles Gas durch ein Drei-Wege-Ventil 1 in einen sterilen Probenahineraum 6 durch das Endstück 2 der Probeentnahmestrecke 3 einströmt, diesen durchströmt und keimfrei hält, danach das sterile Proberöhrchen 4 durch die kreisförmige Öffnung 10 in den Probeentnahmeraum 6 eingeführt wird, danach das Drei-Wege-Ventil 1 so eingestellt wird, daß die sterile Luft die Probeentnahmestrecke 3 zum Reaktor freidrückt und durchströmt, danach das Drei-Wege-Ventil 1 so eingestellt wird, daß das Reaktionsgut durch einen Überdruck im Reaktor über das Endstück 2 in das sterile Proberöhrchen 4 einströmt, hierauf das Probe- röhrchen 4 der Probekammer 8 entnommen wird, danach das Drei-Wege-Ventil 1 so umgestellt wird, daß kein Reaktionsgut mehr einströmt und steriles Gas die Probeentnahmestrecke 3 zum Reaktor hin freidrückt und danach das Drei-Wege-Ventil 1 so umgestellt wird, daß die Reste des Reaktionsgutes im Endstück 2 aus dem Probeentnahmeraum 6 austreten und das sterile Gas den Proberaum 6 über das Endstück 2 wieder durchströmt Dieses Verfahren ist auch dadurch gekennzeichnet, daß der Probenahmeraum 6 ständig und/oder während der Probeentnahme zusätzlich von sterilem Gas durchströmt wird.
• Die Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß diese aus einer zylindrischen Probenahmekammer 8 besteht, die am oberen gewölbten Teil 9 an dessen höchster Stelle das Endstück 2 der Probeentnahmestrecke 3 und an seinem unteren Teil 5 eine kreisförmige, konzentrische Öffnung 10 aufweist, die in das Innere der Probenahmekammer 8 eingewölbt ist und ein gegebenenfalls die Füllhöhe des unteren Teiles 5 für die Aufnahme eines desinfizierenden Körpers oder Flüssigkeit vergrößerndes Zylinderstück 11 tragend ausgebildet ist und daß oberhalb der Probenahmekammer 8 ein wahlweise den Weg für das sterile Gas zum Endstück 2 oder über die Probeentnahmestrecke 3 zum Reaktor öffnendes oder den Weg für das Probegut vom Reaktor über die Probeentnahmestrecke 3 zum Endstück 2 hin öffnendes Drei-Wege-Ventil 1 angeordnet ist Es ist Aufgabe der Erfindung, die Entnahme von Reaktionsgut aus unter sterilen Bedingungen arbeitenden Prozessen so zu vereinfachen und zu verbessern, daß ein repräsentatives Probevolumen schnell und in einfacher Weise aus gut durchmischten Zonen des Prozesses entnommen werden kann, ohne daß die Gefahr der Kontamination des gesamten Prozesses durch äußere Infektionsquellen besteht und daß das Probegut selbst frei von jedweder Kontamination bleibt Die Lösung dieser Aufgabe ist im Patentanspruch 1 definiert Im Patentanspruch 2 ist die Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen, in Anspruch 1 genannten Verfahrens, aufgezeigt Das Verfahren der Erfindung und die Vorrichtung zu seiner Durchführung werden auch durch die Abbildung erläutert.
• Der Ausdruck »Kapsenbergkapsel« ist dem Fachmann geläufig Das Verfahren der Erfindung wird zur Beschreibung beispielsweise wie folgt ausgeführt Zunächst wird die Vorrichtung an einen Reaktor angeschlossen. Hierzu wird beispielsweise die gesamte Vorrichtung zunächst mit einem Sterilluftfilter vor Ventil 13 getrennt im Autokaven bei 121"C im strömenden Dampf sterilisiert Die reaktorseitige Probeentnahmestrecke 3 und der untere Teil 5 sind hierbei beispielsweise mit einer abnehmbaren Sterilabdeckung, wie aus Alufolie, versehen Zum Anschluß an den getrennt sterilisierten Reaktor wird zunächst das Sterilluftfilter an die Preßluftleitung mit Vordruck von 1,5 atü angeschlossen und der Luftstrom auf etwa 1 Ltr/Min eingestellt, wobei die Sterilluft über Ventil 1 über das Mündungsstück in die Probenahmekammer 8 einströmt Anschließend wird die Probeentnahmestrecke, die beispielsweise mit einer Impfnadel versehen ist, durch Anstechen eines Septums in bekannter steriler Arbeitsweise an den Reaktor angeschlossen.
• Es versteht sich von selbst, daß die gesamte Vorrichtung auch zusammen mit dem Reaktor sterilisiert werden kann, falls dieser selbst in einem Autoklaven sterilisiert wird und daß weitere verschiedene Techniken möglich sind, die Vorrichtung zusammen mit dem Reaktor zu sterilisieren. Anschließend wird das im unteren Teil vorgelegte poröse oder saugfähige Material beispielsweise Glaswatte oder Papier mit eine Lösung von beispielsweise 42% Natriumazid oder 0,1% Quecksilberchlorid in Wasser/Glycerin (50:50 V/V) getränkt In Ruheposition ist die Stellung der Drei-Wege-Ventile 1 und 3 nun so, daß Sterilluft aus dem Sterilluftfilter von der Eintrittsstelle 14 über das Mündungsstück 2 überströmt Zur Vorbereitung der Probenahme werden zunächst die Drei-Wege-Ventile 1 und 13 von der Eintrittsstelle 14 der Sterilluft über Ventil 1 zum Reaktor hin geöffnet, so daß über die Probeentnahmestrecke 3 Sterilluft unter Überdruck in den Reaktor strömt, um diese von eingedrungenem Reaktionsgut freizuspülen. Dadurch soll erreicht werden, daß anschließend eine frische, repräsentative Probe aus dem Reaktor entnommen werden kann. Außerdem kann die Probeentnahmestrecke mit Reaktionsgut mehrmals gespült werden. Hierzu wird das Drei-Wege-Ventil 1 von Reaktor zum Mündungsstück 2 hin geöffnet, so daß Reaktionsgut durch Überdruck im Reaktor bis kurz vor das Drei-Wege-Ventil 1 strömt.
• Hierauf wird die oben beschriebene Prozedur zum Freispülen der Probeentnahmestrecken 3 wiederholt Zur Probeentnahme selbst bleibt das Drei-Wege-Ventil 1 zunächst in der zuletzt beschriebenen Stellung, während das Drei-Wege-Ventil 3 so umgelegt wird, daß die Sterilluft von der Eintrittsstelle 14 vor Sterilluft über Umgehungsstrecke 7 in den Probeentnahmeraum 6 eintritt Nach Umlegen des Drei-Wege-Ventils 1 strömt durch Überdruck im Reaktor Probegut aus dem Mündungsstuck 2, bis das Drei-Wege-Ventil 1 wieder in seine alte Lage gebracht wird, also den Weg von Drei-Wege-Ventil 13 zum Reaktor freigibt. so daß Sterilluft in den Reaktor strömt. Es wird danach das Drei-Wege-Ventil 1 zum Mündungsstück 2 hin geöffnet, so daß im Mündungsstück 2 verbliebenes Probegut durch austretende Sterilluft verworfen wird.
• Zur Entnahme von Proben unter Bedingungen, die eine Kontaminierung des entnommenen Probegutes durch Raumluft oder nichtsterile Teile praktisch vollständig ausschließen, wird ein mit Kapsenbergkapsel 15 verschlossenes Proberöhrchen 4 zunächst mit Alufolie derart eingewickelt, daß diese leicht von oben nach unten abziehbar ist Nach einer Wasserdampfsterilisation oder Hitzesterilisation sind innere und äußere Teile des Proberöhrchens 4 mit der Kapsenbergkapsel 15, geschützt durch die allseitig umgebende Alufolie, vollkommen steril.
• Zur Probeentnahme wird nun das Proberöhrchen 4 soweit in das Zylinderstück 11 der Probenahmekammer 8 eingeschoben, daß die Kapsenbergkapsel von der austretenden Sterilluft umströmt wird.
• Es wird danach von der Kapsenbergkapsel die Alufolie nach unten abgezogen und unter weiterem Abziehen das Proberöhrchen 4 eingeschoben. Es gelangen dadurch nur vollkommen sterile Teile in die Probenahmekammer 8.
• Zur Abnahme und zum Wiederaufsetzen der Kapsenbergkapsel ergeben sich verschiedene Möglichkeiten.
• Es haben sich Kapsenbergkapseln bewährt, die am oberen Ende eine Kugel auf einem Stift sitzend tragen.
• Die Kugel dient dazu, nach Einrasten derselben in eine Gabel 18, die seitlich unter dem oberen Teil 9 der Probenahmekammer 8 angebracht ist, das Proberöhr- chen durch manuelles Herabziehen zu öffnen und nach Probeentnahme aus dem Mündungsstück 2 in vorstehend beschriebener Weise, durch Einschieben wieder zu verschließen.
• Nach leichtem Anheben und seitlichem Ausrücken kann das steril verschlossene Proberöhrchen mit unkontaminiertem Probegut der Probenahmekammer 8 entnommen werden. Es hat sich zur Erleichterung des Einfahrens des Proberöhrchens 4 in die Kapsenbergkapsel 15 bewährt, daß diese durch eine seitliche Rippe 19 mit einer halbkreisförmigen Aussparung zur Aufnahme derselben in einer leicht schrägen Position gehalten wird, wie sie beim Abnehmen der Kapsenbergkapsel entstanden ist Andere Anordnungen, wie auch magnetische Halterung des Verschlusses sind denkbar.
• Neben der Automatisierung durch Anwendung Timergesteuerter Magnetventile (Solenoid) ist auch eine Probeförderung in der Probeentnahmestrecke 3 durch eine peristaltische Pumpe möglich, wie es sich bei hochviskosen, mycelartigen oder flockigen Fluiden empfiehlt Der notwendige Überdruck im Reaktor ist aus arbeitstechnischen Gründen meist vorhanden und ist im übrigen von der Führung der Probeentnahmestrecke 3 abhängig (hydrostatischer Druck).
• Falls die Probeentnahmevorrichtung über den oberen Verschluß des Reaktors über eine Steigleitung angeschlossen ist, wird der notwendige Überdruck durch kurzzeitiges Drosseln der Abluft erzielt. Bei anaeroben Prozessen oder solchen, die die Verwendung von Luft ausschließen, wird zum Erzielen eines Überdruckes beispielsweise Stickstoff oder Kohlendioxid verwendet.
• Im vorstehenden Beispiel wird die Probenahmekammer 8 beim Freispülen der Probeentnahmestrecke 3 für kurze Zeit nicht von sterilem Gas durchströmt. Dies führt jedoch in der Praxis nicht zu Nachteilen. Dies wird jedoch beispielsweise durch Ersetzen des Drei-Wege-Ventils 13 durch ein T-Verteilerstück und eine Drossel in der Umgehungsstrecke umgangen. Es ist leicht einzusehen, daß auch beide Gasstrecken über getrennte Druckminderer unabhängig mit sterilem Gas bedient werden können, beispielsweise indem zum Freispülen der Probeentnahmestrecke 3 Stickstoff und für die Beschickung des Probeentnahmeraumes 6 Luft verwendet werden.
• Es kann auch der Rest des Probegutes im Endstück 2 noch in das Proberöhrchen selbst überführt werden.
• Die Vorrichtung zur Entnahme von Probegut besteht beispielsweise in ihrer einfachsten Ausführung aus Glas.
• Die Probenahmekammer 8 besteht aus einem zylindrischen Glasrohr. Im oberen gewölbten Teil 9 ist an der höchsten Stelle das Mündungsstück 2 eingeschmolzen, das in den Probeentnahmeraum hineinragt. Seitlich vom Mündungsstück 2 ist das Glasrohr für die Umgehungsstrecke eingeschmolzen. Die Ventile 1 und 13 sind beispielsweise eingeschmolzene Drei-Wege-Glashähne mit konischen Küken. Diese sind mit Silikonfett gefettet und durch Gegenmuttern und Federn in der üblichen Weise gegen Lockerung des Sitzes und Herausfallen gesichert. Der untere Teil 5 der Probenahmekammer 8 ist nach innen gewölbt und trägt ein kreisförmiges konzentrisches Zylinderstück. Es ergibt sich daraus ein ausreichendes Füllvolumen für die Aufnahme des desinfizierenden Körpers. Durch diese Öffnung wird das Proberöhrchen 4 eingeführt, welches eine passende Kapsenbergkapsel 15 trägt, und mit Alufolie ummantelt ist. Die Probeentnahmestrecke vom Ventil 1 zum Reaktor hin besteht wie die Leitung vom Ventil 13 zum Sterilluftfilter hin aus mit Schlauchstellen gesichertem, gewebeummanteltem Silikonschlauch.
• Das Verfahren der Erfindung mit der Vorrichtung zu seiner Durchführung bietet den Vorteil, daß ohne Verwendung von sterilisierendem Heißdampf in einfacher, schneller und arbeitssparender Weise eine Probe ohne Kontamination sowohl für das Probegut wie den Reaktorinhalt aus unter sterilen Bedingungen arbeitenden Reaktoren entnommen werden kann. Der Ort der Probenahme und Standort des Reaktors sind weitgehend voneinander unabhängig, da durch vorhergehendes wiederholtes Freispülen der Probeentnahmestrecke mit Sterilluft stets eine repräsentative Probe geringen Volumens ohne Vorlauf über nicht durch Dampf erhitzte sterile Strecken entnommen wird, und daß damit auch keine Veränderung am Probegut durch erhöhte Temperaturen und andere Einflüsse eintreten.
• Nach dem Verfahren der Erfindung wird insbesondere die Kontaminierung des Reaktorinhaltes durch Rückwachstum infizierender Keime - dies gilt besonders im Vergleich zu Verfahren, die Dampf vermeiden - durch ein im sterilen Bereich mündendes Endstück der Probenahmestrecke verhindert. Zu diesem Zweck dient eine mit steriler Luft durchströmte Probeentnahmekammer. Die Gefahr der Infektion durch Probeentnahme ist dadurch praktisch ausgeschlossen, die eine Quelle von Infektionen überhaupt darstellt. Indem das Proberöhrchen in die Probeentnahmekammer selbst eingeführt und in der sterilen Probeentnahmekammer der Sterilverschluß abgenommen und unter sterilen Bedingungen wieder aufgesetzt wird, ist es möglich geworden, trotz Anschluß der sonst üblichen Flamme eine unkontaminierte Probe zu erhalten.
• Das Verfahren der Erfindung mit der Vorrichtung zu seiner Durchführung läßt sich vorteilhaft auch in explosionsgefährdeten Räumen und bei Prozessen mit leicht brennbaren Substanzen, wie bei solchen, die Alkane oder Knallgas verwenden, anwenden.
• Das Verfahren der Erfindung wird auch vorteilhaft zur Probenahme zum Zwecke mikrobieller Untersuchungen, wie beim Sterilitätstest oder als Inoculum verwendet.
• Das Verfahren der Erfindung mit der Vorrichtung zu seiner Durchführung hat sich bereits in der praktischen Verwendung bewährt.

Claims (2)

1. Patentansprüche: 1. Verfahren zur Entnahme von durch Umgebungsluft unkontaminierten Probegutes aus unter sterilen Bedingungen arbeitenden Reaktoren, d adurch gekennzeichnet, daß ein mit einer Kapsenbergkapsel (15) verschlossenes Proberöhrchen (4), das nach Einwickeln in Alufolie einer Wasserdampf- oder Hitzesterilisation unterworfen worden war, zur Probenahme im Bereich der aus dem unteren Teil (5) einer Probenahmekammer (8) ausströmenden Sterilluft die Alufolie von oben nach unten unter gleichzeitigem Einschieben des verschlossenen Proberöhrchens in die Probenahmekammer (8) abgezogen wird, daß die Kugel (16) der auf einem Stift (17) sitzenden Kapsenbergkapsel (15) durch manuelle Manipulation des Proberöhrchens (4) in die seitlich sitzende zweizinkige Gabel (18) der Probenahmekammer (8) eingelegt wird, daß durch Nachuntenziehen des Proberöhrchens (4) die Kapsenbergkapsel (15) an der Gabel hängen bleibt und das geöffnete Proberöhrchen (4) nun zur Probenahme dient, daß hierauf das Proberöhrchen (4) wiederum von unten in die Kapsenbergkapsel (15) eingeführt wird und eingeführt wird und durch seitliches Ausfahren unter geringem Anheben die Kugel (16) der Kapsenbergkapsel (15) der Gabel (18) entnommen wird, um das verschlossene, die sterile Probe enthaltende Probenröhrchen (4) der Probenahmekammer (8) zu entnehmen.
2. 2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, wobei diese aus einer zylinderischen Probenahmekammer (8) besteht, die am oberen gewölbten Teil (9) an dessen höchster Stelle das Endstück (2) der Probeentnahmestrecke (3), sowie an seiner Seite das Ende der Umgehungsstrekke (7) für steriles Gas und an seinem unteren Teil (5) eine kreisförmige, konzentrische Öffnung (10) aufweist, die in das Innere der Probennahmekammer (8) eingewölbt ist und ein gegebenenfalls die Füllhöhe des unteren Teils (5) für die Aufnahme des desinfizierendes Körpers oder Flüssigkeit vergrößerndes Zylinderstück (11) tragend ausgestaltet ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Endstück (2) und die Eintrittsstelle der Umgehungsstrecke (7) im oberen Teil (9) der Probenahmekammer (8) örtlich vertauscht sind, so daß auf der dem Mündungsstück gegenüberliegenden Seite Platz gewonnen ist zur Aufnahme der über einen Stift (17) eine Kugel (16) auf ihrer oberen Stirnseite tragenden Kapsenbergkapsel (15) und daß auf derselben Seite im oberen Teil (9) der Probenahmekammer (8) eine zweigezinkte Gabel (18) zur Aufnahme dieser Kugel (16) angeordnet ist und eine mechanische Vorrichtung (19), um die nach Einführung des Proberöhrchens (4), welches die Kapsenbergkapsel (15) trägt, und nach Einrasten der Kugel (16) in die Gabel (18) entstandene Lage der Kapsenbergkapsel (15) zu fixieren, und daß nach der Probenahme das geöffnete Proberöhrchen (4) durch Drücken der Kugel (16) gegen eine halbkugelförmige, die Kapsenbergkapsel (15) nicht abrutschen lassende Aussparung (20) im oberen Teil (9) der Probenahmekammer (8) wieder in die Kapsenbergkapsel (15) einführbar ist.

   Für steril geführte, insbesondere biologische Prozesse, wie mit mikrobiellen, tierischen und pflanzlichen Zellkulturen ist eine Entnahme von Reaktionsgut zur Prozeßüberwachung erforderlich. Hierbei sind besondere Maßnahmen notwendig, um eine Kontamination des Reaktionsgutes und gegebenenfalls des Probegutes auszuschließen.

   Nach dem Stand der Technik werden zur Entnahme von Reaktionsgut zur Gewährleistung aseptischer Bedingungen üblicherweise dampfsterilisierte Magnetventile in verschiedenartiger Anordnung verwendet Diese Arbeitsweise hat den Nachteil, daß vor und nach der Probenahme jeweils mit Dampf sterilisiert werden muß und damit das Probegut zwangläufig mit erhitzten Teilen in Berührung kommt. Um die Anwendung von Dampf zu vermeiden, werden verschiedene Anordnungen beschrieben, wobei hier nur zwei der am weitesten entwickelten beschrieben werden.

   Eine solche Anordnung verwendet zwei in Serie geschaltete Drei-Wege-Ventile, und Sterilluft Das erste Ventil am Reaktor wird im Ruhestand von steriler Luft zum zweiten Ventil hin hindurchströmt. Zur Probeentnahme wird das erste Ventil zum Reaktor hin geöffnet, so daß die Probe über das zweite Ventil wahlweise als Vorlauf verworfen oder in ein Proberöhrchen läuft.

   Obwohl die Strecke zwischen erstem und zweitem Ventil im Ruhezustand von steriler Luft durchströmt wird, kann über das im nicht sterilen Bereich endende Mündungsstück durch Rückwachstum, beispielsweise Wandwachstum, eine Infektion des Reaktorgutes eintreten, wobei bekanntlich auch keine dazwischengeschalteten Ventile einen Schutz darstellen. Außerdem muß bei beiden geschilderten Anordnungen stets ein Vorlauf zur Entnahme einer repräsentativen Probe erfolgen.

   Die Gefahr des Rückwachstums bei der Probeentnahme verhindert eine Anordung, bestehend aus einem Drei-Wege-Ventil, dessen Mündungsstück von einer Glocke umgeben ist, an deren unterem Rand sich ein erhitzter Metallring befindet Es ist offensichtlich, daß durch Konvektion der unsterilen umgebenden Luft, die keimtötende Barriere, bestehend aus dem erhitzten Metallring, leicht übersprungen wird.

   Keines der beiden zuletzt geschilderten Verfahren schließt damit sicher eine Kontimination des Reaktorgutes durch Wand- oder Rückwachstum aus.

   Keines der Verfahren gewährleistet, daß das Probegut durch die umgebende unsterile Luft ohne Anwendung der in der Mikrobiologie üblichen Flamme frei von Kontamination bleibt, und keines der Verfahren gestattet die Entnahme einer repräsentativen Probe ohne Vorlauf.