DE2614542B2

DE2614542B2 -

Info

Publication number: DE2614542B2
Application number: DE2614542A
Authority: DE
Inventors: Karl Dipl.-Chem. Dr. Budapest Albrecht; Hartmut Dipl.-Chem. Dr. Vogelmann; Fritz Prof. Dr. 3300 Braunschweig Wagner
Original assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH 3300 BRAUNSCHWEIG
Current assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH 3300 BRAUNSCHWEIG
Priority date: 1976-04-03
Filing date: 1976-04-03
Publication date: 1978-03-02
Also published as: DE2659923B1; DE2659923C2; DE2614542A1; DE2614542C3

Description

Für steril geführte, insbesondere biologische Prozesse, wie mit mikrowellen, tierischen und pflanzlichen Zellkulturen ist eine Entnahme von Reaktionsgut zur Prozeßüberwachung erforderlich. Hierbei sind besondere Maßnahmen notwendig, um eine Kontamination des Reaktionsguts und gegebenenfalls des Probeguts auszuschließen.

Nach dem Stand der Technik werden zur Entnahme von Reaktionsgut zur Gewährleistung aseptischer Bedingungen üblicherweise dampfsterilisierte Magnetventile in verschiedenartiger Anordnung verwendet (1). Diese Arbeitsweise hat den Nachteil, daß vor und nach der Probenahme jeweils mit Dampf sterilisiert werden muß, und damit das Probegut zwangläufig mit erhitzten Teilen in Berührung kommt. Um die Anwendung von Dampf zu vermeiden, werden verschiedene Anordnungen beschrieben, wobei hier nur zwei der am weitesten entwickelten beschrieben werden.
Eine solche Anordnung verwendet zwei in Serie geschaltete Drei-Wege-Ventile, und Sterilluft (2). Das erste Ventil am Reaktor wird im Ruhestand von steriler Luft zum zweiten Ventil hin durchströmt. Zur Probeentnahme wird das erste Ventil zum Reaktor hin

ίο geöffnet, so daß die Probe über das zweite Ventil wahlweise als Vorlauf verworfen oder in ein Proberöhrchen läuft. Obwohl die Strecke zwischen erstem und zweitem Ventil im Ruhezustand von steriler Luft durchströmt wird, kann über das im nichtsterilen

is Bereich endenden Mündungsstück durch Rückwachstum, beispielsweise Wandwachstum eine Infektion des Reaktorguts eintreten, wobei bekanntlich auch keine dazwischengeschalteten Ventile einen Schutz darstellen. Außerdem muß bei beiden geschilderten Anordnungen stets ein Vorlauf zur Entnahme einer repräsentativen Probe erfolgen.

Die Gefahr des Rückwachstums bei der Probeentnahme verhindert eine Anordnung, bestehend aus einem Drei-Wege-Ventil, dessen Mündungsstück von einer Glocke umgeben ist, an deren unterem Rand sich ein erhitzter Metallring befindet (2). Es ist offensichtlich, daß durch Konvektion der unsterilen umgebenden Luft, die keimtötende Barriere, bestehend aus dem erhitzten Metallring, leicht übersprungen wird.

Keines der beiden zuletzt geschilderten Verfahren schließt damit sicher eine Kontimination des Reaktorguts durch Wand- oder Rückwachstum aus.

Keines der Verfahren gewährleistet, daß das Probegut durch die umgebende unsterile Luft ohne Anwen- dung der in der Mikrobiologie üblichen Flamme frei von Kontamination bleibt, und keines der Verfahren gestattet die Entnahme einer repräsentativen Probe ohne Vorlauf.

Es ist Aufgabe der Erfindung, die Entnahme von Reaktionsgut aus unter sterilen Bedingungen arbeitenden Prozessen so zu vereinfachen und zu verbessern, daß ein repräsentatives Probevolumen schnell und in einfacher Weise aus gut durchmischten Zonen des Prozesses entnommen werden kann, ohne daß die Gefahr der Kontamination des gesamten Prozesses durch äußere Infektionsquellen besteht und daß das Probegut selbst frei von jedweden Kontaminationen bleibt.

Die Lösung dieser Autgabe ist im Patentanspruch 1 definiert.

Der Patentanspruch 2 nennt eine vorteilhafte, nicht selbstverständliche Ausgestaltung dieses Verfahrens.

Im Patentanspruch 3 ist die Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen, in Anspruch 1 genannten Verfahrens aufgezeigt.

Selbstverständlich kann ein mit Kapsenbergkapseln

(15) verschlossenes Proberöhrchen verwendet werden, welches zunächst nach Einwickeln in Alufolie einer Wasserdampf- oder Hitzesterilisation unterworfen wird, so daß sämtliche Innen- und Außenteile des Proberöhrchens und der Kapsenbergkapsel (15) geschützt durch die Alufolie steril sind, und daß nun zur Probenahme im Bereich der aus dem unteren Teil (5) der Probenahmekammer (8) ausströmenden Sterilluft die

h5 Alufolie von oben nach unten unter gleichzeitigem Einschieben des verschlossenen Proberöhrchens in die Probenahmekammer abgezogen wird, daß die Kugel

(16) der auf einem Stift (17) sitzenden Kapsenbergkapsel

(15) durch manuelle Manipulation des Proberöhrchens (4) in die seitlich sitzende zweizinkige Gabel (18) der Probenahmekammer eingelegt wird, so daß durch nach unten Ziehen des Proberöhrchens der Kapsenbergkapsel (16) an der Gabel hängenbleibt und das geöffnete Proberöhrchen (8) nun zur Probeentnahme nachdem in Anspruch 1 genannten Verfahren dient, daß hierauf das Proberöhrchen (8) wiederum von unten in die Kapsenbergkapsel (15) der Gabel entnommen wird um Ausfahren unter geringem Anheben der Kugel (16) die Kapsenbergkapsel 15 der Gabel entnommen wird um das verschlossene sterile Probe enthaltende Proberöhrchen der Probeentnahmekammer zu entnehmen.

Weiterhin kann sich selbstverständlich im unteren Teil 5 der Probenahmekammer (8) eine desinfizierende Lösung befinden, welche die gesamte Oberfläche bedeckt, und dadurch gekennzeichnet ist, daß für die ständige Durchströmung des Probeentnahmeraumes (6) ein Gasgemisch mit desinfizierenden Eigenschaften verwendet wird.

Das Verfahren der Erfindung wird zur besseren Erläuterung in seiner einfachsten Ausführung beispielsweise wie folgt ausgeführt. Zunächst wird die Vorrichtung an einen Reaktor angeschlossen. Hierzu wird beispielsweise die gesamte Vorrichtung zunächst zusammen mit einem Sterilluftfilter vor Ventil (13) getrennt im Autoklav bei 121°C im strömenden Dampf sterilisiert. Die reaktorseitige Probeentnahmestrecke (13) und der untere Teil (5) sind hierbei beispielsweise mit einer abnehmbaren Sterilabdeckung, z. B. Alufolie, versehen. Zum Anschluß an den getrennt sterilisierten Reaktor wird zunächst das Sterilluftfilter an die Preßluftleitung (Vordruck 1,5 atü) angeschlossen und der Luftstrom auf ca. 1 Ltr/Min. eingestellt, wobei die Sterilluft über Ventil (1) über das Mündungsstück in die Probenahmekammer einströmt Anschließend wird die Probenahmestrecke, die beispielsweise mit einer Impfnadel versehen ist, durch Anstechen eines Septums in bekannter steriler Arbeitsweise an den Reaktor angeschlossen.

Das Verfahren der Erfindung und die Vorrichtung zu seiner Durchführung wird auch durch die Zeichnung 1 und 2 erläutert.

Es versteht sich von selbst daß die gesamte Vorrichtung auch zusammen mit dem Reaktor sterilisiert werden kann, falls dieser selbst in einem Autoklav sterilisiert wird und daß weitere verschiedene Techniken möglich sind, die Vorrichtung zusam.p.en mit dem Reaktor zu sterilisieren. Anschließend wird das im unteren Teil vorgelegte poröse oder saugfähige Material beispielsweise Glaswatte oder Papier mit einer Lösung von beispielsweise 0,2% Natriumazid oder 0,1 % Quecksilberchlorid in Wasser/Glycerin (50 : 50 V/V) getränkt In Ruheposition ist die Stellung der Drei-Wege-Ventile 1 und 3 nun so, daß Sterilluft aus dem Sterilluftfilter von der Eintrittsstelle 14 über das Mündungsstück 2 ausströmt.

Zur Vorbereitung der Probenahme werden zunächst die Drei-Wege-Ventile 1 und 13 von der Eintrittsstelle 14 der Sterilluft über Ventil 1 zum Reaktor hin geöffnet, bo so daß über die Probeentnahmestrecke 3 Sterilluft unter Überdruck in den Reaktor strömt, um diesen von eingedrungenem Reaktionsgut freizuspülen. Dadurch soll erreicht werden, daß anschließend eine frische, repräsentative Probe aus dem Reaktor entnommen t,^r> werden kann. Außerdem kann die Probeentnahmestrekke mit Reaktionsgut mehrmals gespült werden. Hierzu wird das Drei-Wege-Ventil 1 vom Reaktor zum Mündungsstück 2 hin geöffnet, so daß Keaktionsgut durch Überdruck im Reaktor bis kurz vor das Drei-Wege-Ventil 1 strömt. Hierauf wird die oben beschriebene Prozedur zum Freispülen der Probeentnahmestrecke 3 wiederholt. Zur Probeentnahme selbst bleibt das Drei-Wege-Ventil 1 zunächst in der zuletzt beschriebenen Stellung, während das Drei-Wege-Ventil 3 so umgelegt wird, daß die Sterüluft von der Eintrittsstelle 14 vor Sterilluft über Umgehungsstrecke 7 in den Probennahmeraum 6 eintritt. Nun wird ein getrennt sterilisiertes, mit Kapsenbergkapsel versehenes Proberöhrchen unter das untere Teil 5 der Probenahmekammer 8 in der Art gehalten, daß es seine Öffnung während des Abnehmens des Verschlusses von der aus dem Probenahmeraum ausströmenden Sterilluft umströmt wird.

Im beschriebenen Verfahren wird die Probeentnahmekammer 8 beim Freispülen der Probeentnahmestrekke für kurze Zeit nicht von sterilem Gas durchströmt, was jedoch in der Praxis zu keinen Nachteilen führt. Dies wird jedoch beispielsweise durch Ersetzen des Drei-Wege-Ventils 13 durch ein T-Verteilerstück und eine Drossel in der Umgehungsstrecke umgangen. Es ist leicht einsichtig, daß auch beide Gasstrecken über gelrennte Druckminderer unabhängig mit sterilem Gas bedient werden können, beispielsweise indem zum Freispülen der Probeentnahmestrecke 3 Stickstoff und für die Beschickung des Probenahmeraumes 6 Luft verwendet werden. Eine weitere Verbesserung ist die Entnahme von Proben unter Bedingungen, die auch eine Kontamination des entnommenen Probeguts durch Raumluft oder nichtsterile Teile praktisch vollständig ausschließen. Hierzu wird ein mit Kapsenbergkapsel 15 verschlossenes Proberöhrchen 4 zunächst mit Alufolie derart eingewickelt, daß letztere leicht von oben nach unten abzuziehen ist. Nach einer Wasserdampfsterilisation oder Hitzesterilisation sind innere und äußere Teile des Proberöhrchens mit der Kapsenbergkapsel 15 geschützt durch die allseitig umgebende Alufolie vollkommen steril. Zur Probenahme wird nun das Proberöhrchen so weit in das Zylinderstück 11 der Probenahmekammer 18 eingeschoben, so daß die Kapsenbergkapsel von der austretenden S'ürilluft umströmt wird, hierauf wird von der Kapsenbergkapsel die Alufolie nach unten abgezogen und unter weiterem Abziehen des Proberöhrchens eingeschoben. Dadurch gelangen nur vollkommen sterile Teile in die Probeei.tnahmekammer. Zur Abnahme und Wiederaufsetzen der Kapsenbergkapsel ergeben sich verschiedene Möglichkeiten. Es haben sich Kapsenbergkapseln bewährt, die am oberen Ende eine Kugel auf einem Stift sitzend tragen. Die Kugel dient dazu, daß nach Einrasten derselben in eine Gabel 18, die seitlich unter dem oberen Teil 9 der Probeentnahmekammer angebracht ist, das Proberöhrchen durch manuelles Herabziehen zu öffnen und nach Probenahme durch Einschieben wieder zu verschließen.

In geöffnetem Zustand wird es nun in die Probenahmekammer 8 so eingeschoben, daß sich das Mündungsstück 2 über dem Proberöhrchen 4 befindet. Nach Umlegen des Drei-Wege-Ventils 1 strömt durch Überdruck im Reaktor Probegut in das Röhrchen, bis das Ürei-Wege-Ventil 1 wieder in seine alte Lage gebracht wird, also den Weg vom Drei-Wege-Ventil 13 zum Reaktor hin freigibt. Das gefüllte Proberöhrchen 4 wird nun aus der Probenahmekammer 8 bis kurz unter deren unteren Teil 5 ausgefahren, so daß es weiterhin von Sterilluft umströmt wird.

Zum sterilen Verschließen des Proberöhrchens 4 kann in dieser Position beispielsweise eine weitere sterile, am unteren Ende mit Alufolie abgedeckte Kapsenbergkapsel aufgesteckt werden, wobei die Alufolie selbst im Bereich der austretenden Sterilluft kurz zuvor abgezogen wird, so daß Kontamination des Probeguts durch Umgebungsluft weitgehendst ausgeschlossen ist.

Anschließend wird zum Freispülen der Probeentnahmestrecke 3 das Drei-Wege-Ventil 13 zum Drei-Wege-Ventil 1 hin geöffnet, so daß Sterilluft in den Reaktor strömt, hierauf das Drei-Wege-Ventil 1 nun zum Mündungsstück 2 hin geöffnet, so daß im Mündungsstück 2 verbliebenes Probegut durch austretende Sterilluft verworfen wird. Es versteht sich von selbst, daß auch die Verwendung unsteriler Proberöhrchen möglich ist oder daß der Rest des Probeguts im Mündungsstück 2 noch in das Proberöhrchen selbst überführt werden kann. Der notwendige Überdruck im Reaktor ist aus arbeitstechnischen Gründen meist ohnehin vorhanden und ist ansonsten vom Ort der Probenahme abhängig (hydrostatischer Druck). Falls die Probeentnahmevorrichtung über den oberen Verschluß des Reaktors über eine Steigleitung angeschlossen ist, wird der notwendige Überdruck durch kurzzeitiges Drosseln der Abluft erzielt. Bei anaeroben Prozessen oder Prozessen, die die Verwendung von Luft ausschließen, wird zum Erzielen eines Überdruckes beispielsweise Stickstoff oder Kohlendioxid verwendet.

Nach leichtem Anheben und seitlichem Ausrücken kann das steril verschlossene Proberöhrchen mit in keiner Weise kontaminiertem Probegut der Probeentnahmekammer entnommen werden. Es hat sich zur Erleichterung des Einfahrens des Proberöhrchens 4 in die Kapsenbergkapsel bewährt, daß diese durch eine seitliche Rippe 19 mit einer halbkreisförmigen Aussparung zur Aufnahme derselben in einer leicht schrägen Position gehalten wird, wie sie beim Abnehmen der Kapsenbergkapsel entstanden ist. Andere Anordnungen, wie auch magnetische Halterung des Verschlusses sind denkbar. Neben der Automatisierung durch Anwendung Timer gesteuerter Magnetventile (Solenoid) ist auch eine Probeförderung in der Probeentnahmestrecke 3 durch eine peristaltische Pumpe möglich, wie es sich bei hochviskosen, mycelartigen oder flockigen Fluiden empfiehlt.

Die Vorrichtung zur Entnahme von Probegut aus unter sterilen Bedingungen arbeitenden Reaktoren besteht in ihrer einfachsten Ausführung aus Glas. Die konstruktiven Merkmale sind in F i g. 2 wiedergegeben. Die Probeentnahmekammer 8 besteht aus einem zylindrischen Glasrohr mit einem Innendurchmesser von 40 mm und einer Höhe von 130 mm, doch sind diese Abmessungen in .sehr weiten Grenzen variierbar. Im oberen gewölbten Teil 9 ist an der höchsten Stelle das Mündungsstück 2 eingeschmolzen, das einen Innendurchmesser von 5 bis b mm besitzt und 15 mm in den Probcnahmeraum hineinragt. Seitlich vom Mündungsstück 2 ist das Glasrohr für die Umgehungsstrecke eingeschmolzen. Die Ventile 1 und 13 sind beispielsweise eingeschmolzene Drci-Wcge-Glashähne mit konischen Küken mit Höhlungen von 3 bis 5 mm und sind mit Silikonfett gefettet und durch Gegenmuttern und Federn in der üblichen Weise gegen Lockerung des Sitzes und Herausfallen gesichelt. Der untere Teil 5 der l'robenahmekamnier 8 isi nach innen gewölbt und trägt ein kreisförmiges konzentrisches Zylinderstück mit einer Höhe von etwa 2^r> mm und einem Innendurchmesser von etwa 25 mm.

Dadurch ergibt sich eine Füllhöhe für die Aufnahme des desinfizierenden Körpers von etwa 10 mm. Durch diese öffnung wird das Proberöhrchen 4 eingeführt, welches einen Außendurchmesser von 16 bis 20 mm und eine Länge von ca. 160 mm besitzt und eine passende Kapsenbergkapsel 15 trägt. Die Probeentnahmestrecke vom Ventil 1 zum Reaktor hin besteht wie die Leitung vom Ventil 13 zum Sterilluftfilter hin aus mit Schlauchschellen gesichertem gewebeummantelten Silikonschlauch mit Innendurchmesser von etwa 8 mm. Falls wie oben beschrieben das Proberöhrchen 4 zusammen mii der Kapsenbergkapsei in den Probenahmeraum eingefahren wird, empfiehlt sich eine modifizierte Anordnung. Der Eintrittsort von Umgehungsstrecke und Mündungsstück werden ausgetauscht, wobei das Mündungsstück leicht angewinkelt ist und zur kreisförmigen öffnung 10 zeigt. Damit wird Raum zur Aufnahme des Kapsenbergverschlusses im gegenüberliegenden Teil der Probenahmekammer gewonnen. Zur Aufnahme der Kugel 16, die auf einem Stift auf der Kapsenbergkapsel 15 sitzt, dient eine im oberen Teil seitlich eingeschmolzene zweizinkige Gabel. Zur Fixierung der Kapsenbergkapsel in der geometrischen Lage, wie sie beim Einfahren des Proberöhrchens und Einsetzen der Kugel in die Gabel entsteht, ist unter der Gabel eine mechanische Vorrichtung vorgesehen. Diese besteht aus einer Rippe mit einer Aufnahme der Kapsenbergkapsel geeigneten halbkreisförmigen Aussparung. Gabel und Rippe bestehen ebenfalls aus Glas oder aus eingeschmolzenen Metallteilen.

Das Verfahren der Erfindung mit der Vorrichtung zu seiner Durchführung bietet den Vorteil, daß ohne Verwendung von sterilisierendem Heißdampf in einfachster, schneller und arbeitssparender Weise eine Probe ohne Kontamination sowohl für das Probegut wie den Reaktorinhalt aus unter sterilen Bedingungen arbeitenden Reaktoren entnommen werden kann. Der Ort der Probenahme und Standort des Reaktors sind voreinander weilgehend unabhängig, da durch vorhergehendes wiederholtes Freispülen der Probeentnahmestrecke mit Sterilluft stets eine repräsentative Probe geringen Volumens (ab 3 ml) ohne Vorlauf über nicht durch Dampf erhitzte sterile Strecken entnommen wird, und daß damit auch keine Veränderungen am Probegut durch erhöhte Temperaturen usw. eintreten.

Insbesondere wird die Kontamination des Reaktorinhalts durch Rückwachstum infizierender Keime, besonders im Vergleich zu Verfahren, die Dampf vermeiden, durch ein im sterilen Bereich mündendes Endstück der Probenahmestrecke erreicht. Hierzu dient eine mit steriler Luft durchströmte Probeentnahmekammer. Die Gefahr der Infektion durch Probeentnahme ist hierdurch praktisch ausgeschlossen, die eine Quelle von Infektionen überhaupt darstellt. Indem das (verschlossene) Proberöhrchen in die Probenahmekammer selbst eingeführt und in der sterilen Probenahmekammer 8 selbst der Sterilverschluß (Kapsenbergkapsel) abgenommen und unter sterilen Bedingungen wieder

mi aufgesetzt wird, wird trotz Ausschluß der sonst üblichen Flamme eine unkontaminierte Probe erhalten. Damit läßt sich das Verfahren auch in cxplosionsgcfährdctcn Räumen und bei Prozessen mit leicht brennbaren Reaktandcn (n-Alkanfcrmcnlationcn, Knallgasfcrmen-

i.^r. tationen) anwenden. Mit Vorteil wird dieses Verfahren auch zur Probenahme zwecks mikrobicllcr Untersuchungen, wie Stcrililälslcst oder als Inoculum verwendet.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Entnahme von Reaktionsgut aus steril geführten, insbesondere biologischen Prozessen, dadurch gekennzeichnet, daß steriles Gas durch ein Drei-Wege-Ventil (1) in einen sterilen Probenahmeraum (6) durch das Endstück (2) der Probeentnahmestrecke (3) einströmt, diesen durchströmt und keimfrei hält, danach das sterile Proberöhrchen (4) durch die kreisförmige öffnung (10) in den Probeentnahmeraum (6) eingeführt wird, danach das Drei-Wege-Ventil (1) so eingestellt wird, daß die sterile Luft die Probeentnahmestrecke (3) zum Reaktor freidrückt und durchströmt, danach das Drei-Wege-Ventil (1) so eingestellt wird, daß das Reaktionsgut durch einen Überdruck im Reaktor über das Endstück (2) in das sterile Proberöhrchen (4) einströmt, hierauf das Proberöhrchen (4) der Probenahmekammer (8) entnommen wird, danach das Drei-Wege-Ventil (1) so umgestellt wird, daß kein Reaktionsgut mehr einströmt und steriles Gas die Probeentnahmestrecke (3) zum Reaktor hin freidrückt und danach das Drei-Wege-Ventil (1) so umgestellt wird, daß die Reste des Reaktionsguts im Endstück (2) aus dem Probeentnahmeraum (6) austreten und das sterile Gas den Probenahmeraum (6) über das Endstück (2) wieder durchströmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Probenahmeraum (6) ständig und oder während der Probeentnahme zusätzlich von sterilem Gas, durchströmt wird.

3. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß diese aus einer zylindrischen Probeentnahmekammer (8) besteht, die am oberen gewölbten Teil (9) an dessen höchster Stelle das Endstück (2) der Probeentnahmestrecke (3) und an seinem unteren Teil (5) eine kreisförmige, konzentrische öffnung (10) aufweist, die in das Innere der Probeentnahmekammer (8) eingewölbt ist und ein gegebenenfalls die Füllhöhe des unteren Teils (5) für die Aufnahme eines desinfizierenden Körpers oder Flüssigkeit vergrößerendes Zylinderstück (11) tragend ausgebildet ist und daß oberhalb der Probeentnahmekammer (8) ein wahlweise den Weg für das sterile Gas zum Endstück (2) oder über die Prcbeentnahmestrecke (3) zum Reaktor öffnendes oder den Weg für das Probegut vom Reaktor über die Probeentnahmestrecke (3) zum Endstück (2) hin öffnendes Drei-Wege-Ventil (1) angeordnet ist.