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Gebiet der
Erfindung
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Die Erfindung betrifft zentrifugierbare
Vorrichtungen, die zum Waschen isolierter Zellen geeignet sind.
Außerdem
betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Waschen bestimmter seltener
Zellpopulationen unter Verwendung solcher Behälter.
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Hintergrund
der Erfindung
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Fortschritte in der Technologie der
Zelltrennung brachten therapeutische Verfahren hervor, bei denen
Zellen eines Subjekts aus dem Blutstrom oder Knochenmark entnommen
und fraktioniert werden können,
um spezifische Zelltypen zum erneuten Einbringen in das Subjekt
oder eines Empfangspatienten bereitzustellen. Beispielsweise beschreibt
die US-A-5840502 Verfahren zum Anreichern von Zellfraktionen und
Indikationen zur Verwendung solcher Fraktionen. Die WO 96/07097
offenbart eine Zelltrennvorrichtung, die Zellen durch Dichteverfahren isoliert.
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Beim Anreichern einer Zellfraktion
aus einer Zellsuspension ist es vielfach erwünscht, der Zellsuspension Reagenzien,
z. B. zellspezifische Antikörper oder
Puffersubstanzen, als Teil des Fraktionierungsverfahrens zuzugeben.
Solche Reagenzien müssen vor
dem Wiedereinbringen der Zellen in einen Patienten entfernt werden.
Alternativ oder zusätzlich
ist es vielfach erwünscht,
die Ionenzustände
der Zellen vor Gebrauch der Zellen zu ändern, z. B. bei den o. g. therapeutischen
Indikationen.
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Während
solche Zellfraktionierungsverfahren zur klinischen Routine werden,
ist es erwünscht, das
Handhaben und Manipulieren der Zellen zu minimieren, damit Zellen
in minimaler Zeit und mit minimaler Exposition gegenüber potentieller
Kontamination verarbeitet werden können.
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Normalerweise werden isolierte Zellen
gewaschen, indem die Zellen entweder im selben Zentrifugenglas oder
-beutel resuspendiert werden, in dem sie ursprünglich zentrifugiert wurden,
oder indem die Zellen in einen anderen zentrifugierbaren Behälter überführt werden.
Zellen werden im Waschpuffer resuspendiert und bei relativ niedrigen
Zentrifugalkräften
(etwa 1000 × g)
erneut zentrifugiert. Die Zellen bilden ein weiches Pellet, von
dem der Waschüberstand
vor anschließenden
Waschvorgängen oder
Resuspension im Endpuffer entfernt werden muß.
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Entfernen läßt sich Überstand durch Dekantieren
oder durch vorsichtiges Absaugen. Während das Dekantieren ein relativ
schneller Vorgang ist, führt
es oft zu Zellverlust, was jene Zellen differentiell abreichert,
die verhältnismäßig geringe
relative Dichten haben und die sich auf der Oberseite des Pellets absetzen.
Daher gilt das Dekantieren allgemein nicht als zuverlässiger Weg
zum Entfernen von Überständen von
den Zellen, insbesondere wenn solche Zellen verhältnismäßig geringe relative Dichten
haben.
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Andererseits ist das Absaugen arbeitsintensiv,
und wenn nicht jedem einzelnen Glas bzw. Behälter sorgfältige Aufmerksamkeit gewidmet
wird, kann es auch selektiv zum Verlust "leichterer" Zellen aus dem Pellet in die verworfene
Waschlösung
führen. Außerdem muß beim Absaugen
eine Sonde in den Zellbehälter
eingesetzt werden. Damit kann auch Kontamination in den Behälter eingebracht
werden.
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Ein Versuch zur Lösung dieser Probleme findet
sich in der US-A-5047004 (Wells), die eine automatische Dekantierzentrifuge
beschreibt, in der Kippbecher nach dem Zentrifugieren in einem ausgefahrenen
Winkel verriegelt werden, um das Dekantieren des Fluids darin durch
Schwerkraft zu bewirken. Obgleich dieses System das Dekantierverfahren
relativ einfach und automatisierbar macht, setzt es die Zellen wegen
seiner oben offenen Gestaltung zwangsläufig Kontamination aus. Außerdem ist
nicht gewährleistet,
daß die
sich langsamer absetzenden "leichten" Zellen im Pellet
zurückgehalten
werden.
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Die US-A-5474687 beschreibt ein Verfahren und
einen spezialisierten Behälter
bzw. Röhrchen zum
Anreichern einer exemplarischen Fraktion seltener Zellen, hämatopoietischer CD34+-Vorläufer-
bzw. Vorfahrenzellen, in einem einstufigen Dichtegradient durch
selektives Auffangen der "leichten" Zellen, die zur
Zellösungs-Dichtegradient-Grenzfläche wandern.
Allerdings müssen
diese Zellen vor Verwendung pelletiert und gewaschen werden. Normalerweise
erfolgt solches Pelletieren und Waschen bei relativ niedrigen Drehzahlen
(500 bis 1000 × g)
in handelsüblichen
präparativen
Zentrifugengläsern bzw.
Behältern.
Mit solchen herkömmlichen
Waschverfahren wurde festgestellt, daß die CD34+-Zellen während des
Waschverfahrens differentiell verloren gehen, da sie "leichte" Zellen sind, die
sich tendenziell auf der Oberseite des im Waschverfahren gebildeten
Pellets absetzen.
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Die Erfindung stellt eine Zellwaschvorrichtung
bereit, die dieses Problem überwindet.
Die Vorrichtung weist ein Glas bzw. eine Röhre bzw. einen Behälter mit
einer abdichtbaren Kappe oder einem Deckel auf, der für sterile Überführung und
Handhabung von Zellen sorgt. Insbesondere können Zellen oder Flüssigmedium
mittels einer sterilen Öffnung dem
Behälter
zugegeben werden, die die Kappe durchläuft. Zudem kann gemäß einem
wichtigen Merkmal der Erfindung Waschüberstand über eine obere Öffnung vom
Zellpellet abdekantiert werden, ohne das Pellet zu stören, wodurch
sich Verfahren zur sorgfältigen Überstandsentfernung
erübrigen. Weiterhin
ist die Behältergestaltung
so, daß auch "leichtere" Zellen, die im oberen
Abschnitt des Zellpellets vorhanden sind, während des Dekantierverfahrens
zurückgehalten
werden.
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Dieser Behälter und Verfahren bieten die
folgenden Vorteile: (i) ein geschlossenes System zur sterilen Manipulation
bei Überführung von
Materialien in und aus dem Behälter,
(ii) eine Gestaltung, die gründliches
Dekantieren des Zellüberstands
durch Umkehren des Behälters
ohne merklichen oder differentiellen Verlust der Zellen an der Oberseite
des Pellets ermöglicht.
Dieses letztere Merkmal der Erfindung erleichtert die Rückgewinnung
von Zellen mit hoher Ausbeute, die ansonsten während des Waschverfahrens verloren
gehen oder zumindest stark abgereichert werden könnten.
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Diese und weitere Merkmale der Erfindung sind
in den nachfolgenden Abschnitten beschrieben.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die Erfindung betrifft eine Zellwaschvorrichtung.
Gemäß einem
wichtigen Merkmal der Erfindung ist die Vorrichtung so gestaltet
und aufgebaut, daß sie
das Dekantieren von Überstand
von einem Zellpellet durch Umdrehen ohne spürbaren Verlust von Zellen aus
dem Pellet und, was wichtig ist, ohne selektiven Verlust der im
oberen Abschnitt des Zellpellets vorhandenen Zellen ermöglicht.
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In einem Aspekt der Erfindung weist
die Zellwaschvorrichtung die Merkmale nach Anspruch 1 auf.
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In einer speziellen Ausführungsform
der Erfindung weisen die Zugangsöffnungen
auf: (i) eine Flüssigkeitsdurchgangsöffnung,
die zum sterilen Durchgang von Flüssigkeit in und aus dem Behälter geeignet
ist, und (ii) eine Lüftungsöffnung,
die gefilterte Luft in das Innere des Behälters führen kann. In einer Ausführungsform
weist die Vorrichtung einen Steg auf, der die Einlaßöffnung und
die Lüftungsöffnung umschließt.
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In einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung weist die Zellwaschvorrichtung die Merkmale nach Anspruch
9 auf. Die Flüssigkeitsdurchgangsöffnung kann
einen "LUER-LOCK"-Verbinder aufweisen.
Gemäß einer
verwandten Ausführungsform kann
die Flüssigkeitsdurchgangsöffnung mit
einer Schlauchleitung kommunizieren, die sich in den Behälter erstreckt.
Eine dritte Öffnung
kann dem Deckel der Vorrichtung zugefügt sein. In noch einer weiteren Ausführungsform
ist diese zusätzliche Öffnung geeignet,
als Lüftungsöffnung zum
Unterstützen
einer Zellkultur in der Vorrichtung zu dienen, wobei die Vorrichtung
auch Zellkulturmedium aufweist. Die Vorrichtung kann auch eine Stütze aufweisen,
die geeignet ist, den Behälter
in einer aufrechten Position zu halten.
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In weiteren verwandten Ausführungsformen ist
der untere Innenabschnitt des Behälters der Vorrichtung so gestaltet
und angepaßt,
daß er
das Festhalten bzw. Zurückhalten
eines Pellets im unteren Abschnitt des Behälters fördert. Verschiedene Beispiele
für Festhalteeinrichtungen
sind veranschaulicht. Zu solchen Einrichtungen gehören das
Texturieren auf den Innenflächenwänden des
unteren Abschnitts des Behälters,
das Vorhandensein von Stegen auf oder Nuten im unteren Abschnitt, das
Vorhandensein von Rippen, die von den Seiten zur Mitte des Behälters vorstehen,
das Vorhandensein von Längsteilern
im unteren Abschnitt des Behälters
und Kombinationen daraus.
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In einem verwandten Aspekt ist ein
Verfahren zum Entfernen unerwünschter
Medien aus einer isolierten Zellfraktion beschrieben. Normalerweise
ist die Zellfraktion eine seltene Zellfraktion, d. h. eine Fraktion
von Zellen, die unter etwa 1% der Anfangszellsuspension bilden.
Gemäß einem
wichtigen Merkmal der Erfindung kann durch Verwendung der zuvor
beschriebenen Zellwaschvorrichtung Waschüberstand von einem Zellpellet
im Behälter
ohne merklichen oder wesentlichen Verlust von Zellen entfernt werden,
indem die Waschvorrichtung für
eine Zeit von mindestens einer Minute und bis zu drei Minuten umgekehrt
wird, um den Überstand
aus dem Behälter gründlich abzulassen.
Wichtig ist, daß die
Vorrichtung den Verlust von Zellen behindert, die verglichen mit
dem Rest des Zellpellets "leicht" sind und daher nach
Zentrifugieren auf der Oberseite des Pellets verbleiben.
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Das Waschverfahren weist die folgenden Schritte
auf: (i) Zugeben einer isolierte Zellen enthaltenden Suspension
zu einer zuvor beschriebenen zentrifugierbaren Zellwaschvorrichtung,
(ii) Waschen der Zellen durch folgende Schritte: (a) Zentrifugieren der
Zellen mit einer ausreichenden Kraft und für eine ausreichende Zeit, um
einen Überstand
und ein Zellpellet in der Vorrichtung zu bilden, und anschließendes (b)
Entfernen von Überstand
durch Umdrehen des Behälters,
gefolgt von (c) Resuspendieren des Zellpellets in einem sterilen
Verdünner.
Diese Schritte können
je nach dem vom Praktiker bestimmten Waschprotokoll bei Bedarf wiederholt
werden. Zu bestimmten Zelltypen, deren Ausbeuten nach dem Waschen
spezifisch erhöht
sind, gehören
isolierte hämatopoietische
CD34+-Vorläuferzellen
und dendritische Zellen.
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In noch einem verwandten Aspekt weist
die Erfindung ein verbessertes Verfahren zum Isolieren und Waschen
von Zellen auf, die in einem "Zellfallen"-Behälter getrennt
wurden, was sich insbesondere auf den durch die US-A-5474687 und US-A-5663051 offenbarten
zentrifugierbaren Behälter
bezieht. Gemäß diesem
Verfahren werden die interessierenden Zellen zunächst in einer Grenzfläche über einer
Dichtegradientenmaterialfraktion im spezialisierten Zellfallenbehälter gesammelt.
Danach werden die Grenzfläche
und die Zellen darin in einen zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen zentrifugierbaren
Waschbehälter überführt. Zellen
werden durch die folgenden Schritte gewaschen: (i) Zentrifugieren mit
einer ausreichenden Kraft und für
eine ausreichende Zeit, um einen Überstand und ein Zellpellet im
Behälter
zu bilden; (ii) Entfernen des Überstands durch
Umkehren des Behälters;
und (iii) Resuspendieren des Zellpellets in einem sterilen Verdünner. Diese
Schritte können
bei Bedarf je nach einem spezifischen Protokoll für die speziellen
ausgewählten Zellen
wiederholt werden.
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Hämatopoietische
CD34+-Vorläuferzellen und Vorläufer- bzw. Vorfahrenzellen
werden mit Hilfe dieses speziellen Aufbaus und Verfahrensablaufs vorteilhaft
gewaschen.
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Diese und weitere Aufgaben und Merkmale der
Erfindung gehen aus der folgenden näheren Beschreibung der Erfindung
im Zusammenhang mit den beigefügten
Zeichnungen näher
hervor.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
eine schematische Querschnittansicht einer Waschvorrichtung der
Erfindung;
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2A und 2B zeigen eine Drauf- und
eine Untersicht eines in der Vorrichtung der Erfindung verwendeten
Deckels;
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3 zeigt
eine Schnittansicht einer länglichen
Form des Behälterabschnitts
der Vorrichtung mit Stabilisierungsrippen;
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4 zeigt
eine alternative Ausführungsform
der Waschvorrichtung, die eine Leitung zum Dekantieren von Inhalt
aufweist;
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5 zeigt
eine schematische Ansicht des Bodens eines Behälters mit Außenrippen;
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6A bis 6H zeigen einen Ablauf zum
Waschen von Zellen gemäß dem Verfahren
der Erfindung;
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7 zeigt
die Auswirkungen der Variierung des Spitzenwinkels auf die Rückgewinnung
von Gesamtzellen (schattierte Balken) und CD34+-Zellen (offene
Balken);
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8A bis 8D zeigen verschiedene Ansichten
einer alternativen Ausführungsform
der Vorrichtung der Erfindung, die eine texturierte Innenfläche im Bodenabschnitt
des Behälters
aufweist;
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9A bis 9C zeigen verschiedene Ansichten
einer alternativen Ausführungsform
der Vorrichtung der Erfindung, die konzentrische Stufen oder Stege
im Bodenabschnitt des Behälters
hat;
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10A bis 10D zeigen verschiedene Ansichten
einer alternativen Ausführungsform
der Vorrichtung der Erfindung, in der die untere Innenfläche des
Behälters
Nuten bildet, die sich vom unteren Spitzenbereich radial ausbreiten;
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11A bis 11D zeigen verschiedene Ansichten
einer alternativen Ausführungsform
der Erfindung, die über
den Umfang angeordnete Längsrippen
innerhalb des unteren Abschnitts des Behälters aufweist; und
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12A bis 12C zeigen verschiedene Ansichten
einer alternativen Ausführungsform
der Erfindung, die Teiler aufweist, die mehrere Kammern im unteren
Spitzenbereich des Behälters
bilden.
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Nähere Beschreibung der Erfindung
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Die Erfindung betrifft eine Zellwaschvorrichtung
mit einem zentrifugierbaren Behälter,
der zum Waschen von Zellen besonders geeignet ist.
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I. Begriffsbestimmungen
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"Isolierte
Zellen" bezeichnet
Zellen, die aus einer Zellsuspension im wesentlichen angereichert sind;
unter "wesentlich
angereichert" versteht
man, daß solche
isolierten Zellen als Fraktionsanteil von Gesamtzellen in einer
Zellmischung vorhanden sind, der mindestens 1,5 und vorzugsweise
mindestens zweimal größer als
der Fraktionsanteil ist, den sie in der Zellsuspension bilden, aus
der sie isoliert werden.
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"Seltene
Zellen" bezeichnet
Zellen, die unter oder gleich etwa 1% von Gesamtzellen in einer
Zellmischung bilden. Zu Beispielen für seltene Zellen zählen hämatopoietische
CD34+-Vorläuferzellen, die etwa 1% weißer Blutzellen
bilden, natürliche
Killerzellen, dendritische Zellen, zytotoxische T-Lymphozyten, natürliche Suppressorzellen,
Mesenchymzellen u. ä.
Diese seltenen Zelltypen sind in der Technik anerkannt und z. B.
in Male, D., et al., (ADVANCED IMMUNOLOGY, Mosby/ Times Mirror International Publishers
Ltd., London, 1996) beschrieben. Im Kontext der Erfindung umfaßt dieser
Terminus auch Tumorzellen und kernhaltige fetale Zellen, die mit
solchen Häufigkeitswerten
im Blut vorhanden sind.
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"Spitzenwinkel" bezeichnet den Winkel,
der an der Spitze eines Behälters
der Erfindung gebildet ist. Messen läßt sich ein solcher Winkel
durch Betrachten des Spitzenbereichs des Behälters im Querschnitt und Messen
des Winkels, der durch die vereinigten Wände oder Verlängerungen
der Wände
gebildet ist, falls die Wände
keinen scharfen Winkel an der Spitze bilden.
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II. Zentrifugierbare Zellwaschvorrichtung
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1 zeigt
eine schematische Querschnittzeichnung einer Ausführungsform
einer zentrifugierbaren Waschvorrichtung der Erfindung. Darstellungsgemäß ist eine
zentrifugierbare Waschvorrichtung 10 aus einem länglichen
Behälter 12 mit
einem konischen Bodenbereich 14 gebildet und durch einen
aufgesetzten Deckel 16 abgedichtet. Obwohl der aufgesetzte
Deckel am Behälter
durch jede Einrichtung angebracht sein kann, die eine leckfreie
Dichtung gemäß 1 bildet, ist der Deckel 16 mit
dem Behälter 12 verschweißt oder
verklebt.
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Der Behälter 12 ist allgemein
zylinderförmig und
bildet einen Innenbereich 18 zum Aufnehmen biologischer
Materialien, z. B. Zellen 21 in einer Zellsuspension 20.
Der Behälter
kann aus jedem Material gebildet sein, das wiederholten Zentrifugalkräften (bis
etwa 10.000 × g)
widerstehen kann, und ist vorzugsweise aus einem Kunststoff medizinischer
Güte gebildet,
der auf dem Gebiet der Zentrifugierung verwendet wird, z. B. Polyallomer,
Polycarbonat, Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Polysulfon,
Polytetrafluorethylen ("TEFLON") u. ä. Vorzugsweise
ist das Material auch Material medizinischer Güte, das mit den im Behälter zu
verarbeitenden Biomaterialien/Zellen kompatibel und für diese
nicht toxisch ist.
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Seitenwände 22 des Behälters 12 haben eine
Dicke, die für
das Material geeignet ist, aus dem der Behälter hergestellt ist; eine
Dicke zwischen 0,5 und 5 Millimetern (mm) ist für Behälter bevorzugt, die aus Kunststoffen
medizini scher Güte
hergestellt sind, z. B. den oben erwähnten. Ferner müssen das
Material und die Dicke Zentrifugalkräften von mindestens 100 × g und
vorzugsweise bis 1000 × g
widerstehen können.
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Ein wichtiges Merkmal der Vorrichtung
ist der untere Abschnitt des Behälters 12,
der den konischen Boden 14 bildet. In Experimenten, die
im Rahmen der Erfindung durchgeführt
wurden, stellte man fest, daß ein
Waschüberstand
durch Dekantieren des Behälters
ohne merklichen Verlust von Zellen im verworfenen Überstand
entfernt werden kann, wenn der konische Boden des Behälters einen
als Winkel (α) 24 gezeigten
Spitzenwinkel bildet, der zwischen etwa 50° und 90° liegt. Liegt der Spitzenwinkel 24 in
diesem Bereich, ist es möglich,
Waschüberstand
durch bis zu dreiminütiges
Umkehren des Behälters
ohne spürbaren
Verlust seltener Zelltypen und gemäß einem wichtigen Merkmal der
Erfindung ohne spürbaren Verlust
von Zellen mit relativ geringen Dichten zu entfernen. Eine untere
Spitze 25 ist abgeflacht, so daß der untere Innenabschnitt
des Behälters
nicht in einem scharfen Spitzenwinkel endet.
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Gemäß einem weiteren wichtigen
Merkmal der Erfindung weist die Zentrifugenwaschvorrichtung 10 den
Deckel 16 auf, der auf die Oberseite 26 des Behälters 12 abgedichtet
aufgesetzt ist. Darstellungsgemäß paßt sich
ein Rand 28 am Deckel 16 eng in den Innenumfang der Oberseite 26 des
Behälters ein,
um einen dichten Verschluß zu
bilden. Natürlich gibt
es eine Anzahl von Möglichkeiten,
den Deckel 16 am Behälter 12 abzudichten,
z. B. durch eine Schraubverbindung oder eine Innendichtung, z. B.
einen O-Ring. Alternativ kann der Deckel 16 als integraler
Bestandteil des Behälters 12 geformt
sein. Andere Dichtungsmöglichkeiten,
z. B. Kleber oder Schweißen,
können
auch zum Einsatz kommen, um den Deckel 16 mit der Oberseite 26 des
Behälters 12 zu
verbinden.
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Der Deckel 16 weist mindestens
zwei Anschlüsse
bzw. Öffnungen
auf: eine Einlaß-/Auslaßöffnung und
eine Lüftungsöffnung.
Diese Öffnungen können jeweils
eine sterile Leitung zum Durchgang von Material (Flüssigkeit
bzw. Gas) in und aus dem Behälter
bilden. In der Ausführungsform
von 1 sind drei Öffnungen
vorgesehen. Eine Öffnung 30 ist eine
Einlaß-/Auslaßöffnung,
die für
eine sterile Kommunikation zum Durchgang von Flüssigkeiten in und aus dem Behälter sorgen
kann. Darstellungsgemäß liegt
die Öffnung 30 in
der Mitte des Deckels 16; aber sie kann auch an beliebiger
Stelle im Deckel angeordnet sein. Wie gezeigt ist, weist die Öffnung 30 einen "LUER-LOCK"-Verbinder auf und
dient zum Einleiten der Ausgangs- bzw. Originalzellsuspension und
anschließender
Waschflüssigkeiten
in den Behälter.
Darstellungsgemäß ist die
untere Innenfläche 31 des
Deckels 16 zur Mitte des Deckels genau unter der Öffnung 30 konkav
nach oben ausgebildet. Dieses Merkmal des Deckels erleichtert das
Dekantieren von Flüssigkeiten
aus dem Behälter
durch trichterartiges Leiten von Flüssigkeit zur Öffnung 30,
wenn der Behälter
umgedreht ist. Eine Kappe 32 ist vorgesehen, um die Einleitung
kontaminierender Materialien in den Behälter unter Bedingungen zu verhindern, unter
denen keine Überführung erfolgt.
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Eine zweite Öffnung 34 ist eine
Lüftungsöffnung,
durch die Luft in oder aus dem Behälter 12 fließen kann,
wenn eine Flüssigkeitsprobe
aus dem Behälter
dekantiert bzw. ihm zugegeben wird. Die Öffnung 34 ist mit
einer Kappe 36 unter Bedingungen ohne Überführung abgedeckt und kann vorzugsweise
ein Luftfilter aufweisen, z. B. ein Mikrofilter 38, um zu
verhindern, daß Luftschadstoffe
in den Behälter unter
Bedingungen mit Luftströmung/Fluidüberführung eintreten.
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Eine Öffnung 40 ist eine
Zusatzöffnung,
die zum leichteren Dekantieren von Flüssigkeiten aus dem Behälter oder
für eine
Gasaustauschöffnung vorgesehen
sein kann. Von besonderem Nutzen ist dieses Gasaustauschmerkmal,
wenn die Vorrichtung zum Kultivieren von Zellen gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung verwendet wird. Insbesondere nützlich und zweckmäßig ist
diese Ausführungsform
zur Verwendung mit Zellen, z. B. dendritischen Zellen oder hämatopoietischen
CD34+-Vorläuferzellen,
die einen Kultivierungs- oder Wachstumsschritt nach Isolierung und
vor Gebrauch erfordern.
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4 zeigt
eine alternative Ausführungsform
der Waschvorrichtung und veranschaulicht eine Leitung 43 in
Verbindung mit der Öffnung 40,
die das einfache Entfernen von Inhalt aus der Vorrichtung erleichtert,
ohne dekantieren zu müssen.
Die Leitung 43 kann aus einem Kunststoffmaterial oder einem
flexiblen Schlauch hergestellt sein, z. B. einem TEFLON-Schlauch, oder kann
ein Metallrohr sein und kann je nach Bedürfnissen des Benutzers verschiedene
Längen
oder eine variable Länge
haben.
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Beim Einsatz als Zellkulturgefäß ist die
Zentrifugenvorrichtung vorzugsweise aus einem für Zellwachstum geeigneten Kunststoff
hergestellt, z. B. Polystyrol, Polycarbonat, Polytetrafluorethylen (PTFE;
TEFLON), mit solchen Beschichtungen oder Behandlungen, die Zellwachstum
bekanntlich fördern.
Nach Waschen ist das Zellsuspensionsmedium allgemein ein physiologisches
Kulturmedium, z. B. Earlesches Vollmedium, bei Bedarf je nach Zellwachstumsanforderungen
ergänzt.
In dieser Ausführungsform
kann die Zentrifugenvorrichtung mit zusätzlichen Merkmalen versehen
sein, z. B. einem entfernbaren Deckel und/ oder Adapter für Spinnerkultur.
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Mit erneutem Bezug auf die Vorrichtung
von 1 kann die Unterseite 31 des
Deckels 16 gemäß der vorstehenden
Beschreibung so angepaßt
sein, daß sie
einen konkaven Trichterweg zum Flüssigkeitsfluß zur Öffnung 40 bildet.
Eine Kappe 42, die darstellungsgemäß die Öffnung 40 abdeckt,
ist auf der Öffnung
bei Nichtgebrauch der Öffnung
plaziert, um dazu beizutragen, die Sterilität der Zellsuspension 20 zu
wahren.
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Als Teil des Deckels 16 ist
auch ein Axialsteg 44 gezeigt, der einen Abschnitt der
Oberseite des Deckels 16 umschließt. Der Axialsteg 44 bildet
eine Stütze
zum zusätzlichen
sterilen Abschirmen der Öffnungen.
In einer Ausführungsform
gemäß 2A umschreibt der Steg 44 den
Abschnitt des Deckels 16, der die Lüftungsöffnung 34 und Probeneinleitungsöffnung 30 aufweist,
um eine Stütze
für eine Teilabdeckung
für diesen
Bereich zu bilden. 2B zeigt
eine Untersicht auf den Deckel 16 und veranschaulicht die
Unterseite 31 mit Löchern 58, 60 und 62,
die den Öffnungen 30, 34 bzw. 40 entsprechen.
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Mit erneutem Bezug auf den unteren
Abschnitt des Behälters 12 gemäß 1 weist die gezeigte Vorrichtung
eine Basisstütze 46 auf,
die so gestaltet ist, daß sie
eine stabile Basisstütze
für die
Vorrichtung bildet, damit diese auf einer ebenen Oberfläche plaziert
sein kann, ohne daß ein
spezieller Stützbehälter notwendig
ist. In einer Ausführungsform
hat eine solche Stütze
die Form von Radialrippen. 3 zeigt
eine Querschnittansicht des unteren Abschnitts eines Behälters 50 der
Vorrichtung mit radial positionierten Rippen 52 und 54,
die im Querschnitt in der Betrachtungsebene gezeigt sind, und einer
Rippe 56, die am hinteren Abschnitt der Vorrichtung konturiert gezeigt
ist. Wie gezeigt, können
die Rippen flach oder konvex sein. Konvexe Rippen sorgen für verbessertes
Mischen mit Hilfe eines Wirbelmischers.
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5 zeigt
eine Untersicht auf die Spitze eines erfindungsgemäß ausgebildeten
Behälters.
Eine untere Spitze 64 ist als abgeflachter Abschnitt des Behälters an
der unteren Ausdehnung des Behälters gezeigt;
von der Spitze 64 breiten sich Rippen 66, 68 und 70 radial
aus.
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Weitere Ausführungsformen der Waschvorrichtung
sind in 8 bis 12 veranschaulicht. Im wesentlichen
fördern
diese Ausführungsformen
eine bessere und/oder wirksamere Trennung des Pellets vom Überstand
während
des Waschverfahrens.
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8A zeigt
die erfindungsgemäße Waschvorrichtung 10 mit
dem konischen Bodenbereich 14. Gemäß dieser Ausführungsform
ist eine Innenfläche 120 texturiert,
was in der Querschnittansicht eines Segments des Bodenbereichs 14 in 8B gezeigt ist. Ohne sich
auf eine spezielle Theorie festzulegen, beobachtet man, daß solches
Texturieren das Zurückhalten
des Pellets im Glas während
der Entfernung des Überstands
verbessert.
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Der Rauheitsgrad in einer solchen
Texturierung kann erheblich variieren und ist durch das gezeigte
Vorhandensein von "Spitzen", z. B. einer Spitze 122,
und "Tälern", z. B. eines Tals 124,
gekennzeichnet. Die Tiefe zwischen Spitzen und Tälern bzw. Rauhtiefe kann von
etwa 0,8 bis etwa 500 Mikrometern stark variieren. Erzeugen läßt sich
eine solche Texturierung durch eine Anzahl von Verfahren, die in der
Technik bekannt sind, besonders in der Technik von Kunststofformen.
Beispielsweise kann ein Formbehälter
in einer texturierten Form gegossen werden, die dem Behälter dann
eine texturierte, unregelmäßige Oberfläche verleiht.
Wege zur Herstellung einer texturierten Form sind in der Technik
bekannt, beinhalten aber allgemein das Ätzen der Form auf chemischem
oder physikalischem Weg, z. B. gemäß der nachfolgenden Beschreibung.
Alternativ kann die Innenfläche
des Behälters
beschichtet sein, um eine texturierte Beschichtung zu bilden.
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Zu repräsentativen Ätzmöglichkeiten gehören das
Strahlen des Formhohlraums mit Kügelchen, das
Bearbeiten des Formhohlraums durch Elektronenentladung und das chemische Ätzen des
Formhohlraums. Geätzte
Metallformen, die zur Herstellung texturierter Behälter geeignet
sind, werden auf verschiedenen, technisch bekannten Wegen hergestellt
oder können
von einem Formzulieferer im Handel erworben werden, z. B. Roehlen
Industries (Walnut, CA). Ein herkömmlicher Weg zur Herstellung
einer solche Form besteht darin, den Hohlraum der Form "mit Kügelchen
zu strahlen". Dieses
Verfahren entfernt kleine Metalltaschen aus der Formoberfläche, indem
Teilchen mit hoher Geschwindigkeit auf die Oberfläche auftreffen,
z. B. Teilchen aus Natriumbicarbonat (Natron). Allgemein wird das
Relief oder die Ätztiefe
durch die Korngröße der in
diesem Verfahren verwendeten Teilchen bestimmt; beispielsweise kann
Aluminiumoxid Formätztiefen
von etwa 0,8 bis 2 μm
erzeugen. Eine geätzte
Formoberfläche kann
auch durch ein Bearbeitungsverfahren mit Elektronenentladung (EDM-Verfahren)
gebildet werden, das kleine Metalltaschen aus der Form entfernt,
indem sie mit elektrischen Lichtbögen bombardiert wird. Eine
solche geätzte
Form erzeugt eine Behälterinnenseite,
die durch kleine Vorsprünge
mit entsprechenden Höhen
gekennzeichnet ist.
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Auch auf chemischem Weg kann die
Form geätzt
werden. In Übereinstimmung
mit Verfahren, die in der Formgebungstechnik bekannt sind, wird
allgemein eine Maske auf der Formoberfläche im Texturbereich plaziert.
Danach wird die Form in ein Säurebad
getaucht, welches das Metall von den nicht maskierten Flächen entfernt.
Dieses Verfahren kann verwendet werden, ein hochdichtes unregelmäßiges Oberflächenmuster
auf der Formoberfläche
mit Ätztiefen
im Bereich von etwa 1 bis etwa 4 μm
zu erzeugen. Hierbei handelt es sich um eine besonders wirksame
und gesteuerte Möglichkeit
zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Außenbehältertextur.
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8C und 8D zeigen alternative Ansichten der
texturierten unteren Abschnitte 14 der Waschvorrichtung.
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9A bis 9C zeigen eine weitere Ausführungsform
der Waschvorrichtung, die geeignet ist, das Zurückhalten des Pellets zu fördern und
das Verarbeiten einer großen
Anzahl von Zellen im konischen Boden 14 des Behälters 12 im
Waschverfahren zu ermöglichen.
In dieser Ausführungsform
ist die Innenfläche
des konischen Bodens 14 mit konzentrischen Stegen oder "Stufen" versehen, z. B.
einem Steg 126, der eine senkrechte Oberfläche 128 und eine
waagerechte Oberfläche 130 hat.
Obwohl die Darstellung eine herkömmliche
90°-Stufe
mit einer senkrechten und waagerechten Oberfläche zeigt, die etwa gleich
bemessen sind, können
natürlich
andere Winkel und Oberflächenverhältnisse
verwendet werden. Die Maße
der Stege können
variieren; allgemein so, daß sich
die waagerechte und senkrechte Oberfläche zwischen etwa 0,2 und 1,0
Millimeter von der Innenfläche
des Glases erstrecken.
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10A bis 10D zeigen eine weitere Ausführungsform
der Erfindung, in der die Innenfläche des konischen Bodens 14 mehrere
Nuten oder Schlitze, z. B. eine Nut 132, bildet, die sich
vom mittleren Spitzenbereich radial ausbreiten. 10B stellt einen Querschnitt eines Segments
der Seitenwand 14 dar und zeigt die Nut 132, die
durch Seitenwände 134 und
optional eine Unterseite 136 gebildet ist. Deutlich ist,
daß die
Seitenwände 134 alternativ
eine V-förmige
Nut bilden könnten. 10C und 10D zeigen zusätzliche Ansichten von Bodenabschnitten 14 der Vorrichtung.
Allgemein haben solche Nuten Tiefen zwischen etwa 0,2 und 1,0 Millimetern.
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11A bis 11D zeigen noch eine weitere Ausführungsform
der Vorrichtung, in der der untere Abschnitt 14 mit mehreren
Längsrippen,
z. B. einer Rippe 134, verstärkt ist, die so positioniert
und gestaltet sind, daß sie
den unteren, inneren Spitzenabschnitt des Behälters in Kammern aufteilen
und das Festhalten des Pellets in der konischen Unterseite des Behälters fördern. 11B zeigt einen Querschnitt
durch ei ne Rippe, und 11C und 11D zeigen alternative Ansichten
des unteren konischen Abschnitts des Behälters.
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12A bis 12C zeigen noch eine weitere Ausführungsform
der Vorrichtung, in der der untere Abschnitt 14 vollständig in
Kammern mit Rippen oder Teilern aufgeteilt ist, die sich über den
Innendurchmesser des Behälters
erstrecken, z. B. einem Teiler 136, der den unteren Bereich
des Behälters
durchquert. Darstellungsgemäß sind vier
Kammern durch zwei solche Teiler gebildet, die im 90°-Winkel zueinander
positioniert sind; allerdings ist deutlich, daß eine Reihe von Teilern, z.
B. Radialteiler, die von der Mittellinie des Behälters vorstehen, oder ein Teilergitter,
dieselbe Funktion erfüllen
kann. Ohne sich wiederum auf einen zugrundeliegenden Mechanismus festzulegen,
ist eine solche Kammeraufteilung so aufgebaut und gestaltet, daß sie das
Zurückhalten des
Pellets im unteren Abschnitt des Behälters fördert.
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Die zuvor beschriebenen Ausführungsformen
der Erfindung können
vorteilhaft beim Waschen von Zellen verwendet werden, die aus biologischen Fluiden
isoliert sind, die z. B. in therapeutischen Maßnahmen zum Einsatz kommen.
Ein Vorteil der Vorrichtung ist ihre Fähigkeit, für sterile Überführung von Flüssigkeiten
vor, während
und nach dem Zellwaschverfahren zu sorgen. Ein unerwarteter Vorteil
ist ihre Fähigkeit
zur Rückgewinnung
bestimmter seltener Zelltypen mit hoher Ausbeute. Wie später näher beschrieben
wird, sorgt sie insbesondere für
die Rückgewinnung "leichter" Zellen mit hoher
Ausbeute, die sich nach Zentrifugieren an der Oberseite des Zellpellets
befinden.
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III. Verfahren zum Waschen
von Zellen
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Dieser Teilabschnitt beschreibt ein
erfindungsgemäßes Verfahren
zum Waschen von Zellen. Wird eine seltene Population von Zellen,
z. B. hämatopoietischer
CD34+-Vorläuferzellen, gemäß den hier beschriebenen
Verfahren gewaschen, tritt nur sehr geringer, wenn überhaupt,
Verlust der Zellen auf. Im Gegensatz dazu können beim Gebrauch herkömmlicher
Verfahren und insbesondere beim Einsatz von Zentrifugenröhrchen bzw.
Behältern
mit Spitzenwinkeln über
90° solche
Zellen beim Dekantieren selektiv verloren gehen. Ohne sich auf eine
spezielle Theorie festzulegen, geht man davon aus, daß diese
Fähigkeit
zum Zurückhalten
von Zellen mit geringerer Schwebedichte Folge des hierin beschriebenen
eindeutigen Spitzenwinkelbereichs ist. Wie zuvor erwähnt, sollte
ein solcher Winkel zwischen etwa 50° und 90° und vorzugsweise zwischen etwa
60° und 80° liegen.
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6A bis 6H zeigen eine schematische Darstellung
der Schritte beim Isolieren und Waschen von CD34+-Zellen
mit Hilfe des Waschbehälters
der Erfindung im Zusammenhang mit einer Vorrichtung und einem Verfahren
zum "Zellfallen"-Zentrifugieren, das
in den US-A-5474687 und US-A-5663051 beschrieben ist. Kurz gesagt
ist der Zellfallenbehälter zum
Auffangen von Zellen geeignet, die zur Grenzfläche wandern, die sich bildet,
wenn eine Zellösung
auf ein Dichtegradienten-Trennmaterial gegeben wird. Ein besonderes
Merkmal des Behälters
ist ein Verengungsteil, das so positioniert und aufgebaut ist, daß es Fluid
im Bodenabschnitt der Vorrichtung unter dem Verengungsteil zurückhält, wenn
die Vorrichtung umgedreht ist.
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Hämatopoietische
CD34+-Vorläuferzellen sind für Zellen
repräsentativ,
bei denen das Isolieren und Waschen mittels der Waschvorrichtung
und des Verfahrens der Erfindung insbesondere verbessert ist, insbesondere
in Kombination mit dem zuvor beschriebenen Zellfallenbehälter, da
diese Zellen unter 1% einer peripheren Blutzellenpopulation bilden
und "leichte" Schwebedichten relativ
zu den anderen, in der isolierten Grenzflächenfraktion vorhandenen Zellen
haben. Normalerweise wandern solche Zellen während anschließender Waschschritte
zur Oberseite des Pellets, was nachstehend beschrieben ist.
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Kurz gesagt ist gemäß 6A ein Zellfallen-Zentrifugenbehälter 70 mit
einer geschlossenen Oberseite 72 sowie Eingangsöffnungen 74 und 76 mit
einem ersten Reservoir 78 verbunden, das Dichtegradientenmedium 80 enthält. Das
Dichtegradientenmedium kann jede Zusammensetzung haben, hat aber
eine wohldefinierte Dichte, die gemäß dem speziellen, zu isolierenden
Zelltyp kalibriert ist, was in der US-A-5663051 beschrieben ist.
Wie zuvor erwähnt, beträgt zur Isolierung
hämatopoietischer
CD34+-Vorläuferzellen aus einer peripheren
Blutzellenpopulation diese Dichte vorzugsweise 1,0605 ± 0,0005
g/ml bei 280 mOsm, und zur Isolierung hämatopoietischer CD34+-Vorläuferzellen
aus Knochenmark beträgt
die bevorzugte Dichte 1,0685 ± 0,0005
g/ml bei 280 mOsm. Ein exemplarisches Dichtegradientenmaterial ist
eine organosilanisierte kolloidale Silica-Zusammensetzung gemäß der Beschreibung
in der US-A-4927750 oder eine solche Zusammensetzung, die durch
Zugabe von Polyvinylpyrrolidon (PVP) weiter behandelt wurde, was
in der US-A-5789148 beschrieben ist. Deutlich ist, daß anderes
Dichtegradientenmaterial je nach dem spezifischen Protokoll verwendet
werden kann, das zum Isolieren eines speziellen Zelltyps zum Einsatz
kommt.
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Das Dichtegradientenmaterial 80 wird
zum unteren Abschnitt des Zellfallenbehälters 70 über einen
Schlauch 82 zugegeben, der mit dem Behälter 70 an einer Öffnung 74 über eine
sterile Verbindung verbunden ist. Die Öffnung 74 kommuniziert
mit dem unteren Abschnitt des Behälters über eine Leitung 79.
Das im Boden des Behälters
vorhandene Gradientenmaterial wird bis zu einen Pegel zugegeben, der
sich zur Oberseite einer Öffnung 85 erstreckt,
die durch ein Verengungsteil 84 im Behälter gebildet ist. Der Durchfluß von Gradientenmaterial
wird mit Hilfe eines Ventils gestoppt, z. B. eines Ventils 83.
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Mit dem Zellfallenbehälter 70 ist über eine sterile
Verbindung auch ein Zellreservoir 86 verbunden, das als
steriler Blutabnahme-"Beutel" in der Zeichnung
dargestellt ist. Gemäß 6B fließt eine Zellen 89 enthaltende
Mischung 88 durch einen Schlauch 92, der mit dem
Zellfallenbehälter 70 über eine Öffnung 76 kommuniziert,
um den Behälter 70 im
Bereich über
dem Verengungsteil 84 zu füllen oder teilweise zu füllen. Während dieser
und aller anderen Zugaben kann der Behälter 70 durch Öffnen einer Lüftungsöffnung 77 entlüftet werden.
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6C zeigt
einen bevorzugten Schritt, der dazu dient, den Pegel von Dichtegradientenmaterial im
Behälter
auf einen Pegel einzustellen, der sich über dem Pegel des Verengungsteils
erstreckt. Nach beschreibungsgemäßer Zugabe
der Zellmischung wird weiteres Gradientenmaterial vom Reservoir 78 in
den Behälter
durch Öffnen
des Ventils 83 zwischen dem Reservoir und dem Behälter überführt. Gradientenmaterial
fließt durch
den Schlauch 82 und durch die Leitung 79 in den
unteren Abschnitt des Behälters,
um den Pegel des Gradientenmaterials 81 im Behälter auf
einen Pegel über
dem Verengungsteil 84 anzuheben.
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Nach Zugabe des Gradientenmaterials 81 und
der Zellmischung 88 zum Behälter werden die Reservoire 78 und 86 sowie
die angebrachten Schläuche 82 und 92 vom
Behälter 70 getrennt. 6D zeigt, daß der Behälter anschließend mit
einer ausreichenden Geschwindigkeit zentrifugiert wird, die bewirkt,
daß sich
in der Zellmischung vorhandene Zellen in das Dichtegradientenmaterial 81 oder
in eine Grenzfläche 96,
die sich zwischen dem Dichtegradientenmaterial 81 und einem Überstand 96 bildet,
je nach den relativen Dichten der in der Mischung vorhandenen verschiedenen
Zellen verteilen. Allgemein ist 30 min Zentrifugieren mit einer
Geschwindigkeit von 850 × g
dazu ausreichend. Beim Zentrifugieren setzen sich Zellen mit spezifischen Dichten über der
des Dichtegradientenmaterials zum Pellet 94 ab, während sich
jene Zellen, z. B. CD34+-Zellen, mit spezifischen Dichten, die
mit dem Gradientenmaterial etwa identisch sind, am Grenzflächenbereich 96 konzentrieren,
der zwischen dem Probenüberstand 91 und
dem Dichtegradientenmaterial 81 gebildet ist.
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Nun ist bekannt, daß sich unter
den hier beschriebenen spezifischen Bedingungen, bei denen als Zellmischung
eine aus peripheren einkernigen Zellen abgeleitete Fraktion und
ein Dichtegradientenmaterial mit einer spezifischen Dichte von 1,0605 g/ml
verwendet werden, CD34+-Zellen im Grenzflächenbereich 96 konzentrieren
(US-A-5474687). Infolge der Zellfallengestaltung des Behälters ist
es möglich,
Zellen, die in Bereichen über
der durch das Verengungsteil 84 gebildeten Öffnung 85 vorhanden sind,
durch Umdrehen des Behälters 70 gemäß 6E zu überführen, ohne das resultierende
dekantierte Produkt durch Zellen im Pellet 94 zu kontaminieren.
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Mit weiterem Bezug auf 6E kann das Dekantieren
von Zellen auf sterile Weise erreicht werden, indem die Öffnung 76 mit
einem sterilen Behältnis
verbunden wird, vorzugsweise über
eine Leitung, z. B. einen Schlauch 98. Gemäß dem hier
beschriebenen verbesserten Verfahren ist das sterile Behält nis ein
Waschbehälter 100,
der wie im o. g. Teil II konfiguriert ist. Darstellungsgemäß ist der Schlauch 98 mit
dem Waschbehälter 100 über eine Eingangsöffnung 102 verbunden.
Anteile des Überstands 91 und
der Grenzfläche 96,
die CD34+-Zellen 97 enthalten, fließen durch
die Öffnung 76 in
den Schlauch 98 und den Waschbehälter 100 ab. Im Behälter vorhandene
Luft kann während
dieses Verfahrens über
eine Lüftungsöffnung 104 entlüftet werden.
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Nachdem Überstands- und Grenzflächenanteile
aus dem Zellfallenbehälter 70 dem
Waschbehälter 100 zugegeben
wurden, wird der Schlauch 98 vom Waschbehälter gelöst. Danach
wird der Behälter 100 zentrifugiert,
um interessierende CD34+-Zellen 107 aus einer ausgewählten Zellmischung 106 gemäß 6F zu pelletieren. 6G zeigt den Waschbehälter 100 nach
dem Zentrifugieren, wobei ein resultierendes Pellet 110 CD34+-Zellen 107 in seinem oberen Abschnitt
enthält,
worüber
sich Waschüberstand 108 befindet. 6H zeigt die Entfernung
von unerwünschtem
Waschüberstand 108 durch
Umkehren des Behälters.
Gemäß einem
wichtigen Merkmal der Erfindung bleibt das Pellet 110 mit
leichten Zellen, z. B. CD34+-Zellen 107,
im Waschbehälter 100, wenn
der Behälter
bis zu drei Minuten umgedreht wird, mit geringem oder keinerlei
Zellverlust. Zum weiteren Waschen kann das Zellpellet 110 in
einem geeigneten Volumen von Zellverdünner resuspendiert werden,
der dem Behälter über die
sterile Eingangsöffnung 102 zugegeben
wird. Danach kann das resuspendierte Pellet durch Zentrifugieren
und Resuspendieren gemäß 5F bis 5H weiter gewaschen werden. Klar ist,
daß je
nach Zelltyp und Art des ursprünglichen
Verdünners
ein solches Waschen bezüglich
Dauer, Wiederholung und Pufferbestandteilen variiert sein kann.
Vom Fachmann können
solche Faktoren gemäß einem
spezifischen Waschprotokoll bestimmt werden, das er für die gewaschenen Zellen
als am besten geeignet betrachtet.
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Beispiel 1 beschreibt das Waschen
einer in hämatopoietischen
CD34+-Vorläuferzellen angereicherten Zellmischung
mit Hilfe des zuvor beschriebenen Verfahrens. Dieses Beispiel demonstriert
einen wichtigen Aspekt der Erfindung, nämlich daß seltene "leichte" Zellen (z. B. jene Zellen, die sich
am O berteil des Zellpellets absetzen), z. B. die zuvor veranschaulichten
CD34+-Zellen, die unter den verwendeten
Isolierbedingungen gewöhnlich
die oberen Schichten des Waschpellets belegen, in einer Ausbeute
von mindestens etwa 90% ihrer Zugabemenge und vorzugsweise in einer
Ausbeute von etwa 95% ihrer Zugabemenge mit der Vorrichtung und
dem Verfahren der Erfindung zurückgewonnen
werden.
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Beispiel 2 beschreibt im Rahmen der
Erfindung durchgeführte
Experimente, in denen Behälterspitzenwinkel
auf die Fähigkeit
geprüft
wurden, CD34+-Zellen beim Umkehren des Behälters festzuhalten.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 7 gezeigt. Diese Experimente weisen die
Wichtigkeit nach, einen Spitzenwinkel zwischen etwa 50° und etwa
90° zu haben,
um für
eine hohe Ausbeute eines seltenen Zelltyps nach einem Waschverfahren zu
sorgen. Wurden darstellungsgemäß Zellen
insbesondere in Behältern
mit Spitzenwinkeln von 60° bis 80° gewaschen,
gewann man über
95% von Gesamt- und CD34+-Zellen nach Waschen
und Dekantieren von Zellüberstand
durch Umkehren des Waschbehälters
zurück.
Bei einem Spitzenwinkel von 100° lag eine
selektive Verarmung von CD34+-Zellen vor,
was zur Rückgewinnung
von nur etwa 30% dieser Zellen führte.
Bei Spitzenwinkeln von 110° und
120° wurde eine
Verarmung aller Zellen beobachtet.
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Die vorstehenden Untersuchungen veranschaulichen
einen der durch die Erfindung erreichten Vorteile, die hohe Rückgewinnung
(90 bis 95%) "leichter" Zellen in einem
Zellpellet, wenn ein Waschbehälter
der Erfindung verwendet wird, um die Zellen zu waschen, und der
Waschüberstand
durch Umdrehen des Glases dekantiert wird.
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Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen
die Erfindung, sollen sie aber keineswegs einschränken.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Waschen isolierter hämatopoietischer
CD34+-Vorläuferzellen
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Es erfolgte die Isolierung hämatopoietischer CD34+-Vorläuferzellen
gemäß der Beschreibung
in der US-A-5474587 unter Verwendung eines organosilanisierten kolloidalen
Silicas als "Dichtegradientenmaterial
(US-A-4927750), das auf eine Dichte von 1,0605 g/ml eingestellt
war ("BDS"), in einem großtechnischen
Zellfallenbehälter
(ACT 300), z. B. gemäß der Beschreibung
in der US-A-5663051. Die Verarbeitung der Probe folgte den zuvor
beschriebenen allgemeinen Schritten von 6A bis 6H mit
den folgenden Einzelheiten: Der Zellfallen-Trennbehälter wurde auf einen Pegel
bis zum unteren Abschnitt des Öffnungsverengungsteils
mit BDS gefüllt.
Danach wurde die Blutprobe dem Behälter zugegeben. Zusätzliches
BDS wurde anschließend
zugegeben (durch Zugabe über
die Rohrleitung, die sich darstellungsgemäß zum Bodenabschnitt des Behälters erstreckt),
um den Pegel von Dichtegradientenmaterial auf einen Pegel über dem
Pegel der Verengungsöffnung
zu heben. Danach wurde das Glas 30 Minuten bei 850 × g ohne
Bremsen zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wurde die Vorrichtung über einen
sterilen Schlauch mit einer Waschvorrichtung der Erfindung verbunden,
die einen Spitzenwinkel von 80° hatte.
Der sterile Schlauch wurde mit einer mittleren Probeneinlaßöffnung im
Deckel der Waschvorrichtung verbunden. Eine Lüftungsöffnung in der Waschvorrichtung
wurde geöffnet,
und der die Grenzfläche enthaltende Überstand
wurde in die Waschvorrichtung dekantiert. Die Waschvorrichtung wurde
30 Minuten ohne Bremsen mit 850 × g zentrifugiert. Der resultierende Überstand
wurde über
eine Dekantier-/Auslaßöffnung im
Deckel der Waschvorrichtung abgegossen. Danach wurde das Pellet
in kalzium- und magnesiumfreier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)
resuspendiert, wonach der Behälter
15 Minuten mit 850 × g
zentrifugiert wurde. Der resultierende Überstand wurde wie zuvor beschrieben
dekantiert, und das resultierende Pellet wurde in einem vorbestimmten
PBS-Volumen zur quantitativen Bestimmung von Zellen resuspendiert.
Zusätzliche
Aliquoten wurden zur FACS-Analyse der Zellen verwendet.
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Beispiel 2
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Auswirkung des Spitzenwinkels
des Zentrifugenglases auf die Zellrückgewinnung
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Zellen wurden isoliert und in Waschbehältern mit
unterschiedlichen Spitzenwinkeln (60°, 80°, 90°, 100°, 120° gemäß 7) überführt, wobei
die in Beispiel 1 näher
aufgeführten Verfahren
zum Einsatz kamen. Für
jedes Pellet wurde der Gesamtzellengehalt quantitativ bestimmt;
CD34+-Zellen wurden ferner durch fluoreszenzaktivierte
Zellsortierung (FACS) nach technisch bekannten Standardverfahren
quantitativ bestimmt, wobei phykoerythrinmarkierte monoklonale Anti-CD34+-Antikörper
(Becton-Dickinson, Mountain View, CA) zum Einsatz kamen.
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Die Rückgewinnungsraten von Gesamtzellen
und CD34+-Zellen wurden durch Zählen der
Anzahl von Zellen im Ausgangs- und
Endmaterial und Vergleichen dieser Zahlen quantifiziert.
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Während
die Erfindung anhand spezifischer Verfahren und Ausführungsformen
beschrieben wurde, wird deutlich sein, daß verschiedene Abwandlungen
und Änderungen
vorgenommen werden können, ohne
vom Schutzumfang der beigefügten
Ansprüche abzuweichen.