ES2210724T3 - Dispositivo de lavado de celulas y procedimiento asociado. - Google Patents
Dispositivo de lavado de celulas y procedimiento asociado.Info
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Abstract
SE DESVELA UN DISPOSITIVO DE LAVADO DE CELULAS Y UN PROCEDIMIENTO PARA LAVAR CELULAS QUE UTILIZA EL DISPOSITIVO. EL DISPOSITIVO ESTA CONCRETAMENTE DISEÑADO PARA EL TRASLADO ESTERIL DE CELULAS DESDE UN TUBO CENTRIFUGO PRINCIPAL Y PARA MANTENER LAS CELULAS EN UN ENTORNO ESTERIL DURANTE LOS PASOS DE LAVADO POSTERIORES. EL DISPOSITIVO ESTA CONFIGURADO PARA QUE DECANTE UN SUPERNATANTE POR INVERSION SIN PERDIDA APRECIABLE DE POBLACION SELECCIONADA DE CELULAS DE DENSIDAD INFERIOR PROCEDENTES DEL GRANULO DURANTE EL PROCEDIMIENTO DE LAVADO.
Description
Dispositivo de lavado de células y procedimiento
asociado.
La presente invención hace referencia a
dispositivos centrifugables que resultan adecuados para el lavado de
células aisladas. La invención hace referencia asimismo a un método
de lavado para determinadas poblaciones de células raras utilizando
dichos contenedores.
Los progresos en la tecnología de separación de
células han propiciado la aparición de métodos terapéuticos en los
que las células del sujeto pueden ser retiradas de la corriente
sanguínea o de la médula ósea y ser fraccionadas con el fin de
proporcionar tipos específicos de células para su reintroducción en
el sujeto o en un paciente receptor. Por ejemplo, la Patente EEUU
5.840.502 describe unos métodos para enriquecer fracciones celulares
y presenta indicaciones para la utilización de dichas fracciones. El
documento WO 96 / 07097 describe un aparato de separación de células
que aisla las células mediante métodos de densidad.
A la hora de enriquecer una fracción celular
procedente de una suspensión de células, es conveniente en muchas
ocasiones añadir reactivos, tales como anticuerpos de células
específicas o agentes reguladores, a la suspensión de células como
parte del procedimiento de fraccionamiento. Dichos reactivos deben
ser eliminados antes de la reintroducción de células en un paciente.
De forma alternativa o adicional, es conveniente en muchas ocasiones
cambiar las condiciones iónicas de las células antes de la
utilización de dichas células, como, por ejemplo, en las
indicaciones terapéuticas mencionadas con anterioridad.
En la medida en que dichos procedimientos de
fraccionamiento celular se hacen más habituales en los escenarios
clínicos, resulta deseable que se minimice la manipulación y el
manejo de las células, de modo que las células puedan ser procesadas
en un tiempo mínimo y con una exposición mínima a la contaminación
potencial.
Generalmente, las células aisladas son lavadas
bien mediante la resuspensión de las células en el mismo tubo o
bolsa centrífugo en el que fueron originalmente centrifugadas o bien
mediante la transferencia de las células a un contenedor
centrifugable diferente. Las células son resuspendidas en el buffer
de lavado y son centrifugadas de nuevo de acuerdo con una fuerza
centrífuga relativamente reducida (aprox. 1.000 x g.). Las células
forman entonces un pellet blando del que se debe retirar el
sobrenadante del lavado antes de realizar los lavados posteriores o
la resuspensión en el buffer definitivo.
La retirada del sobrenadante se puede realizar
mediante decantación o mediante aspiración suave. La decantación,
aunque es una operación relativamente rápida, a menudo ocasiona la
pérdida de células, empobreciendo de forma diferencial aquellas
células que presentan unos pesos específicos bajos y que se
sedimentan en la parte superior del pellet. Por este motivo,
generalmente la decantación no ha sido considerada como un método
fiable para retirar el sobrenadante de las células, en especial,
cuando dichas células presentan unos pesos específicos bajos.
Por otra parte, la aspiración requiere mucho
trabajo, y salvo que se preste una cuidadosa atención a cada tubo
individual, puede asimismo ocasionar una pérdida selectiva de las
células "más ligeras" del pellet en la solución de lavado
desechada. Además, la aspiración requiere la introducción de una
probeta en el contenedor de células. Este hecho puede permitir la
introducción de contaminación en el contenedor.
Un intento de resolver los problemas mencionados
con anterioridad se describe en la Patente EEUU 5.047.004 (Wells)
que expone una máquina centrífuga automática de decantación en la
que existen unas cestas basculantes que están bloqueadas en un
ángulo ampliado después de la centrifugación, con el fin de efectuar
una decantación por gravedad del fluido situado en la misma. Este
sistema, al tiempo que proporciona una relativa facilidad y
automaticidad al proceso de decantación, expone necesariamente las
células a la contaminación debido a su diseño abierto en su parte
superior. Por otra parte, no existe mecanismo que garantice que las
células "ligeras" que se sedimentan más lentamente son
retenidas en el pellet.
La Patente EEUU 5.474.687 describe un método y un
tubo especializados para enriquecer una fracción ejemplificada de
células raras, las células progenitoras hematopoyéticas CD34+, en un
gradiente de densidad de fase única, mediante la recogida selectiva
de las células "ligeras" que migran a la solución de células -
interfaz del gradiente de densidad. No obstante, dichas células
deben ser convertidas en pellet y lavadas antes de su utilización.
La conversión en pellet y el lavado citados se realizan generalmente
a unas velocidades relativamente reducidas (500 - 1000 x g.) en
tubos centrífugos de preparación que se encuentran comercialmente
disponibles. Utilizando dichos métodos convencionales de lavado, se
ha detectado la existencia de una pérdida diferencial de células
CD34+ durante el procedimiento de lavado, puesto que se trata de
células "ligeras" que tienden a sedimentarse en la parte
superior del pellet formado durante el proceso de lavado.
La presente invención constituye un dispositivo
de lavado de células que supera los problemas que se acaban de
describir. El dispositivo incluye una tapa o cubierta que permite la
transferencia y la manipulación estéril de células. De forma
específica, las células o el medio líquido pueden ser añadidos al
tubo por medio de un puerto estéril que atraviesa la tapa. De forma
adicional, y de conformidad con una característica importante de la
invención, el sobrenadante del lavado puede ser decantado del pellet
de células a través de un puerto superior sin ejercer ningún
trastorno sobre el pellet, obviando la necesidad de aplicar unos
procedimientos cuidadosos para la retirada del sobrenadante. Por
otra parte, el diseño del tubo permite la retención incluso de las
células "más ligeras" presentes en la parte superior del pellet
de células durante el proceso de decantación.
Éstas y otras características de la invención se
describen en las secciones que aparecen a continuación.
La presente invención hace referencia a un
dispositivo de lavado de células. De conformidad con una
característica importante de la invención, el dispositivo está
diseñado y construido para permitir la decantación mediante
inversión del sobrenadante de un pellet de células, sin generar
ninguna pérdida apreciable de células del pellet, y lo que es
importante, sin pérdida selectiva de las células presentes en la
parte superior del pellet de células.
Un aspecto de la invención de dispositivo de
lavado de células incluye las características de la
Figura 1.
Figura 1.
En una materialización específica de la
invención, los puertos de acceso incluyen (i) un puerto para el paso
de líquido adaptado para el paso estéril de líquido hacia el
interior y hacia el exterior del tubo, y (ii) un orificio de
ventilación capaz de proporcionar aire filtrado al interior del
tubo. En otra materialización, el dispositivo incluye un reborde que
rodea el puerto de entrada y el citado orificio de ventilación.
En otra materialización de la invención, el
dispositivo de lavado de células incluye las características de la
3ª reivindicación. El puerto para el paso de líquido puede incluir
un conector "LUER-LOK". De conformidad con una
materialización asociada, el puerto para el paso de líquido puede
estar comunicado a través de un tubo de conducción que se extiende
hasta el interior del tubo. Se puede añadir un tercer puesto a la
tapa del dispositivo. En otra materialización, este puerto adicional
se encuentra adaptado para servir de orificio de ventilación con el
fin de permitir el cultivo de células en el dispositivo, cuando el
dispositivo también incluya un medio de cultivo de células. El
dispositivo puede incluir asimismo un soporte adaptado con el fin de
mantener el tubo en posición vertical.
En otras materializaciones asociadas, la parte
interna inferior del tubo del dispositivo está diseñada y adaptada
para promover la retención del pellet en la parte inferior del tubo.
Se ilustran varios ejemplos de medios de retención. Dichos medios
incluyen la texturización de las paredes internas de la superficie
de la parte inferior del tubo, la presencia de rebordes o de ranuras
en la parte inferior, la presencia de aletas que se proyectan desde
los lados hacia el centro del tubo, la presencia de separadores
longitudinales en la parte inferior del tubo, y las combinaciones de
los métodos mencionados.
En un aspecto asociado, se describe un método
para retirar medios no deseados de una fracción aislada de células.
Generalmente, la fracción de células es una fracción de células
raras, es decir, una fracción de células que constituye
aproximadamente el 1% de la suspensión celular inicial. De
conformidad con una característica importante de la invención, al
utilizar el dispositivo de lavado de células descrito con
anterioridad, el sobrenadante del lavado puede ser retirado del
pellet de células del tubo, sin que se produzca pérdida apreciable o
sustancial de células, mediante la inversión del dispositivo de
lavado durante un período mínimo de tiempo de un minuto y máximo de
tres minutos, con el fin de drenar completamente el sobrenadante del
tubo. Y lo que es importante, el dispositivo inhibe la pérdida de
las células que son "ligeras" en comparación con el resto del
pellet de células, y que, por lo tanto, permanecen en la parte
superior del pellet después de la centrifugación.
El método de lavado incluye las siguiente etapas:
(i) la adición de una suspensión que contiene células aisladas a uno
de los dispositivos centrifugables de lavado de células descritos
con anterioridad, (ii) el lavado de las células a través de las
siguientes fases: (a) la centrifugación de las células con una
fuerza suficiente y durante un período de tiempo suficiente con el
fin de formar un sobrenadante y un pellet de células en el
dispositivo, (b) la retirada del sobrenadante mediante la inversión
del tubo, y (c) la resuspensión del pellet de células en un diluente
estéril. Las etapas mencionadas pueden ser repetidas en caso
necesario de conformidad con el protocolo de lavado establecido por
el profesional responsable. Los tipos específicos de células cuya
presencia después del lavado se ve mejorada incluyen las células
dendríticas y las células progenitoras hematopoyéticas CD34+
aisladas.
En otro aspecto asociado, la invención incluye un
método mejorado para aislar y lavar células que han sido separadas
en un tubo de "captación de células"
("Cell-trap tube"), haciendo referencia
específicamente al tubo centrifugable descrito en las Patentes EEUU
5.474.687 y 5.663.051. De conformidad con el método citado, las
células meta son recogidas en primer lugar en un interfaz por encima
de la fracción material del gradiente de densidad en el tubo
especializado de captación de células. El interfaz y las células
situadas en el mismo son entonces transferidos a un tubo de lavado
centrifugable realizado de conformidad con la presente invención,
tal y como se ha descrito con anterioridad. Las células son lavadas
a través de las siguientes etapas: (i) la centrifugación con una
fuerza suficiente y durante un período de tiempo suficiente para
formar un sobrenadante y un pellet de células en el tubo, (ii) la
retirada del sobrenadante mediante la inversión del tubo, y (iii) la
resuspensión del pellet de células en un diluente estéril. Las
etapas mencionadas pueden ser repetidas en función de las
necesidades, de conformidad con el protocolo específico para las
células específicas seleccionadas.
Las células progenitoras y las células
progenitoras hematopoyéticas CD34+ se pueden lavar ventajosamente
utilizando el procedimiento y el dispositivo citados.
Éstos y otros objetos y características de la
invención quedarán más claros una vez leída la siguiente descripción
detallada de la invención junto con los dibujos que se adjuntan a la
misma.
La Figura 1 ilustra una perspectiva transversal
esquemática de un dispositivo de lavado realizado de conformidad con
la invención.
Las Figuras 2 a y 2 b ilustran unas perspectivas
superior e inferior de una tapa del dispositivo realizado de
conformidad con la invención.
La Figura 3 representa una perspectiva de una
forma elongada de la sección del tubo del dispositivo que cuenta con
aletas estabilizadoras.
La Figura 4 muestra una materialización
alternativa del dispositivo de lavado, que incluye un conducto para
la decantación del contenido.
La Figura 5 ilustra una perspectiva esquemática
de la parte inferior del tubo con aletas exteriores.
Las Figuras 6 a - 6 h muestran un esquema del
lavado de células realizado de conformidad con la invención.
La Figura 7 representa los efectos de la
variación del ángulo apical sobre la recuperación de células totales
(columnas sombreadas) y las células CD34+ (columnas en blanco).
Las Figuras 8 a - 8 d muestran diversas
perspectivas de una materialización alternativa del dispositivo de
la invención que incluye una superficie texturizada en la sección
inferior del tubo.
Las Figuras 9 a - 9 c ilustran diversas
perspectivas de una materialización alternativa del dispositivo de
la invención que presenta una característica de secuencias o
rebordes concéntricos en la sección inferior del tubo.
Las Figuras 10 a - 10 d representan diversas
perspectivas de una materialización alternativa del dispositivo de
la invención en la que la superficie interna inferior del tubo forma
unas ranuras que se configuran radialmente desde la región apical
inferior.
Las Figuras 11 a - 11 d muestran diversas
perspectivas de una materialización alternativa de la invención, que
incluye unas aletas longitudinales dispuestas formando una
circunferencia en el interior de la sección inferior del tubo.
Las Figuras 12 a - 12 c ilustran diversas
perspectivas de una materialización alternativa de la invención, que
incluye separadores que forman una pluralidad de compartimentos en
la región apical inferior del tubo.
La presente invención hace referencia a un
dispositivo de lavado de células que consta de un tubo centrifugable
que resulta particularmente adecuado para el lavado de células.
"Células aisladas" hace referencia a las
células que se encuentran sustancialmente enriquecidas de una
suspensión celular; la expresión "sustancialmente enriquecidas"
quiere decir que dichas células aisladas están presentes como una
parte fraccionaria de las células totales en una mezcla celular que
es al menos 1,5 veces superior, y preferentemente al menos dos veces
superior, a la parte fraccionaria que constituyen en relación con la
suspensión celular de la que han sido aisladas.
"Células raras" hace referencia a las
células que constituyen menos de aproximadamente el 1%, o un valor
igual a dicho porcentaje, de las células totales en una mezcla
celular. Los ejemplos de células raras incluyen las células
progenitoras hematopoyéticas CD34+, que constituyen aproximadamente
el 1% de los glóbulos blancos, las células aniquiladoras naturales,
las células dendríticas, los linfocitos T citotóxicos, las células
supresoras naturales, las células mesénquimas y similares. Estos
tipos de células raras son reconocidos y descritos en la literatura
científica, por ejemplo, en Male, D. et al. (ADVANCED IMMUNOLOGY,
Mosby / Times Mirror International Publishers Ltd., Londres, 1996).
Dentro del contexto de la presente invención, el término engloba
asimismo las células tumorales y las células fetales nucleadas
existentes en la sangre con dichos niveles de presencia.
"Ángulo apical" hace referencia al ángulo
formado en el vértice de un tubo realizado de conformidad con la
invención. Dicho ángulo puede ser medido mediante el visionado de la
región apical del tubo de acuerdo con una sección transversal y la
medición del ángulo formado por las paredes adjuntas o las
extensiones de las paredes, en el caso de que las paredes no formen
un ángulo agudo en el vértice.
La Figura 1 muestra un dibujo transversal
esquemático de una materialización del dispositivo de lavado de
células realizado de conformidad con la invención. Tal y como se
ilustra, el dispositivo centrifugable de lavado (10) está formado a
partir de un tubo elongado (12) que presenta una sección superior
cónica (14) y que se encuentra sellado por una tapa ajustada (16).
Aunque la tapa ajustada puede ser acoplada al tubo mediante
cualquier medio que proporcione un sellado a prueba de fugas, tal y
como se ilustra en la Figura 1, la tapa (16) está soldada o unida al
tubo (12).
El tubo (12) generalmente presenta una forma
cilíndrica y configura un espacio interior (18) que puede contener
materiales biológicos, tales como células (21) en la suspensión
celular (20). El tubo puede estar formado por cualquier material que
sea capaz de resistir fuerzas centrífugas repetidas (hasta
aproximadamente 10.000 x g.), y preferentemente estará formado por
un plástico de grado médico generalmente utilizado en el campo de la
centrifugación, como, por ejemplo, el polialómero, el policarbonato,
el polietileno, el polipropileno, el poliestireno, la polisulfona,
el politetrafluoroetileno ("TEFLÓN") y similares.
Preferentemente, el material deberá contar con un grado médico que
sea compatible y no resulte tóxico para los biomateriales / células
que van a ser procesados en el tubo.
Las paredes laterales (22) del tubo (12)
presentan un espesor que resulta adecuado para el material con el
que está formado el tubo: un espesor de entre 0,5 milímetros y 5
milímetros (mm) resulta preferente para los plásticos de grado
médico, tales como los mencionados con anterioridad. Por otra parte,
el material y el espesor deben ser capaces de resistir unas fuerzas
centrífugas de al menos 100 x g., y preferentemente tan elevadas
como 1.000 x g.
Una característica importante del dispositivo es
que la sección inferior del tubo (12) forma una base cónica (14). En
los experimentos realizados para demostrar la eficacia de la
presente invención, se ha determinado que se puede retirar el
sobrenadante de lavado mediante la decantación del tubo sin que se
produzca pérdida apreciable de células en el sobrenadante desechado,
cuando la base cónica del tubo forma un ángulo apical, representado
como ángulo (\alpha) (24), que se encuentra entre 50º y 90º.
Cuando el ángulo apical (24) se encuentra dentro de esta gama, es
posible retirar el sobrenadante del lavado mediante la inversión del
tubo durante hasta tres minutos, sin pérdida apreciable de tipos de
células raras, y de conformidad con una característica importante de
la invención, sin pérdida apreciable de células con unas densidades
relativamente bajas. El vértice inferior (25) se encuentra aplanado,
de modo que la sección interna inferior del contenedor no termina en
un ángulo cónico agudo.
De conformidad con otra característica importante
de la invención, el dispositivo de lavado centrífugo (10) incluye
una tapa (16) que se puede acoplar de forma hermética a la parte
superior (26) del tubo (12). Tal y como se representa, el reborde
(28) de la tapa (16) se ajusta de forma hermética a la
circunferencia interior de la parte superior (26) del tubo (12) para
conformar un sellado correcto. Se aprecia que existe una serie de
formas en las que la tapa (16) puede ser sellada al tubo (12), como,
por ejemplo mediante una conexión roscada o un sello interior como
una junta tórica. De forma alternativa, la tapa (16) puede ser
moldeada como una parte integrante del tubo (12). Otros medios de
sellado, tales como pegamentos o soldadura, pueden ser utilizados
también para unir la tapa (16) a la parte superior (26) del tubo
(12).
La tapa (16) incluye al menos dos puertos -un
puerto de entrada / salida y un puerto de ventilación-. Cada uno de
estos puertos es capaz de proporcionar un conducto estéril para el
paso de material (líquido o gas, respectivamente) hacia el interior
y hacia el exterior del tubo. En la materialización que se
representa en la Figura 1, se incluyen tres puertos. El puerto (30)
es un puerto de entrada / salida capaz de proporcionar una
comunicación estéril para el paso de líquidos hacia el interior y
hacia el exterior del tubo. El puerto (30), tal y como se ilustra,
está situado en el centro de la tapa (16); no obstante, dicho puerto
puede estar situado en cualquier lugar de la tapa. Tal y como se
muestra, el puerto (30) incluye un conector
"LUER-LOK", y es utilizado para introducir la
suspensión celular original y los posteriores líquidos de lavado en
el tubo. Tal y como se ilustra, la superficie interna inferior (31)
de la tapa (16) presenta una forma cóncava hacia arriba en dirección
al centro de la tapa situado justo debajo del puerto (30). Esta
característica de la tapa facilita la decantación de líquidos desde
el tubo mediante la canalización del líquido hacia el puerto (30)
cuando el tubo se encuentra invertido. Se suministra una cubierta
(32) para impedir la introducción de materiales contaminantes en el
tubo durante situaciones de no transferencia.
El segundo puerto (34) es un orificio de
ventilación que permite el flujo de aire hacia el interior y el
exterior del tubo, a medida que la muestra de líquido es decantada o
añadida al tubo, respectivamente. El puerto (34) está protegido por
una cubierta (36) durante situaciones de no transferencia y
preferiblemente puede incluir un filtro de aire, como, por ejemplo,
un microfiltro (38), con el fin de impedir que la contaminación
transmitida por el aire se introduzca en el tubo en situaciones de
transferencia de flujo / fluido.
El puerto (40) es un puerto adicional que puede
ser suministrado para facilitar la decantación de líquidos desde el
tubo o en calidad de orificio de ventilación para el intercambio de
gases. Dicha característica de intercambio de gases resulta
especialmente útil, cuando el dispositivo es utilizado para el
cultivo de células, de conformidad con una materialización de la
presente invención. Dicha materialización resulta particularmente
útil y conveniente para su utilización con células, tales como las
células dendríticas o las células progenitoras hematopoyéticas
CD34+, que requieren una fase de cultivo o de crecimiento después de
su aislamiento y antes de su utilización.
La Figura 4 muestra una materialización
alternativa del dispositivo de lavado que ilustra un conducto (43)
que comunica con el puerto (40), lo que incrementa la facilidad de
la retirada del contenido del dispositivo, sin la necesidad de
decantación. El conducto (43) puede estar formado por un material
plástico, o por un tubo flexible, como, por ejemplo, un tubo de
TEFLÓN, o puede ser un tubo de metal, y puede variar en longitud o
presentar una longitud variable en función de las necesidades del
usuario.
Cuando sea utilizado como receptáculo para el
cultivo de células, el dispositivo de centrifugación estará formado
preferentemente por un plástico adecuado para el crecimiento
celular, como, por ejemplo, el poliestireno, el policarbonato, el
politetrafluoroetileno (PTFE, TEFLÓN), con los revestimientos o los
tratamientos que se conozca promueven el crecimiento celular. Tras
el lavado, el medio de suspensión celular será generalmente un medio
de cultivo fisiológico, como el medio completo de Earle,
complementado como sea conveniente de acuerdo con los requisitos de
crecimiento celular. En esta materialización, el dispositivo de
centrifugación puede ser adaptado con características adicionales,
tales como la tapa desmontable y / o el adaptador para cultivo
centrífugo.
Volviendo al dispositivo que se muestra en la
Figura 1, la superficie inferior (31) de la tapa (16) puede ser
adaptada de acuerdo con las líneas descritas con anterioridad con el
fin de proporcionar un conducto cóncavo de canalización para el
flujo de líquido hacia el puerto (40). La cubierta (42), que se
muestra protegiendo el puerto (40), está situada sobre el puerto
cuando el puerto no se encuentra en servicio, con el fin de
contribuir al mantenimiento de la esterilidad de la suspensión
celular (20).
Asimismo se muestra como parte de la tapa (16) su
reborde axial (44) que rodea una sección de la parte superior de la
tapa (16). El reborde axial (44) proporciona un soporte adicional
para la protección estéril de los puertos. En una materialización,
que se ilustra en la Figura 2 a, el reborde (44) circunscribe la
parte de la tapa (16) que incluye un puerto de ventilación (34) y un
puerto para la introducción de muestras (30), con el fin de
suministrar un soporte completo para una cobertura parcial de esta
zona. La Figura 2 b representa una perspectiva inferior de la tapa
(16) que muestra una superficie inferior (31) con unas aberturas
(58, 60 y 62) que se corresponden con los puertos (30, 34 y 40,
respectivamente).
Volviendo a la parte inferior del tubo (12) que
se ilustra en la Figura 1, el dispositivo tal como se muestra
incluye un soporte base (46) diseñado para proporcionar un soporte
básico estable al dispositivo, de modo que pueda ser colocado en una
superficie nivelada sin necesidad de un soporte especial para el
contenedor. En una materialización, dicho soporte presenta la forma
de aletas radiales. La Figura 3 muestra una perspectiva transversal
de la parte inferior del tubo (50) del dispositivo que cuenta con
unas aletas (52 y 54) posicionadas de forma radial y reflejadas de
forma transversal en el plano de visión, así como la aleta (56) que
se ilustra en perfil en la parte posterior del dispositivo. Las
aletas pueden ser bien planas o bien convexas, tal y como se
ilustra. Las aletas convexas proporcionan una mezcla mejorada
utilizando un mezclador vórtex.
La Figura 5 ilustra una perspectiva inferior del
vértice de un tubo realizado de conformidad con la invención. El
vértice inferior (64) se muestra como una sección aplanada del tubo
situada en la parte inferior del tubo, de forma radial con respecto
al vórtice se encuentran localizadas las aletas (66, 68 y 70).
Las materializaciones adicionales de la invención
se representan en las Figuras 8 - 12. Dichas materializaciones
generalmente facilitan un segregación de mayor calidad y / o más
eficaz del pellet con respecto al sobrenadante durante el proceso de
lavado.
La Figura 8 a muestra un dispositivo de lavado
(10) realizado de conformidad con la invención que presenta una
sección inferior cónica (14). De conformidad con esta
materialización, la superficie interna (120) se encuentra
texturizada, tal y como ilustra la perspectiva transversal del
segmento de la sección inferior que se muestra en la Figura 8 b. Sin
comprometerse con ninguna teoría específica, se debe subrayar que
dicha texturización mejora la retención del pellet en el tubo
durante la retirada del sobrenadante.
El grado de rugosidad de dicha texturización
puede variar de manera considerable y se caracteriza por la
presencia de "picos", como por ejemplo, el pico (122), y
"valles", como, por ejemplo, el valle (124), tal y como se
ilustra. La profundidad entre pico y valle puede variar
considerablemente, desde aproximadamente 0,8 a aproximadamente 500
micrometros. Se puede crear la citada texturización mediante
cualquiera de los métodos conocidos en este ámbito técnico, en
especial, en las técnicas relativas a los moldes de plástico.
Por ejemplo, se puede fundir un tubo moldeado en
un molde texturizado, que proporciona entonces al tubo una
superficie texturizada e irregular. Los medios para realizar un
molde texturizado son bien conocidos en este ámbito técnico, pero
generalmente implican el decapado del molde, a través de medios
químicos o físicos, tal y como se debate más adelante. De forma
alternativa, la superficie interna del tubo puede ser revestida para
lograr un revestimiento texturizado.
Los medios de decapado incluyen el bombardeo con
partículas ("bead blasting") de la cavidad del molde, el
maquinado por descarga de electrones de la cavidad del molde y el
decapado químico de la cavidad del molde. Los moldes metálicos
decapados que resultan adecuados para la formación de tubos
texturizados están formados de acuerdo con una serie de métodos,
conocidos en este ámbito técnico, o pueden ser contratados a través
de un proveedor de moldes comerciales, como, por ejemplo, Roehlen
Industries (Walnut, CA). Un medio convencional para crear dicho
molde es el bombardeo con partículas ("Bead blasting") de la
cavidad del molde. Este proceso elimina las pequeñas bolsas de metal
de la superficie del molde mediante el golpeo de la superficie con
partículas a alta velocidad, tales como las partículas de
bicarbonato de sodio (bicarbonato de sosa). Generalmente, el relieve
o la profundidad del decapado viene determinada por las
características de las partículas utilizadas en este proceso; por
ejemplo, el óxido de aluminio puede producir unas profundidades de
decapado del molde de aproximadamente 0,8 - 2 micrometros. También
se puede formar una superficie decapada de molde a través de un
procedimiento de maquinado por descarga de electrones ("Electron
Discharge Machining" - EDM) que elimine las pequeñas bolsas de
metal del molde mediante su bombardeo con arcos eléctricos. Dicho
método de decapado produce un tubo interior caracterizado por
pequeñas protrusiones de alturas correspondientes.
El molde también puede ser decapado por medios de
decapado químico. Generalmente, de conformidad con los métodos
conocidos en las técnicas de moldeo, se coloca una protección sobre
la superficie del molde en la zona a texturizar. El molde es
sumergido entonces en un baño de ácido que elimina el metal de las
zonas no protegidas. Este proceso puede ser utilizado para producir
un modelo de superficie irregular de alta densidad en la superficie
del molde, con unas profundidades de decapado que oscilan entre
aproximadamente 1 micrometro y aproximadamente 4 micrometros. Se
trata de un medio particularmente eficaz y controlado para producir
una textura externa de tubo, de conformidad con la presente
invención.
Las Figuras 8 c y 8 d muestra unas perspectivas
alternativas de las secciones inferiores texturizadas (14) del
dispositivo de lavado.
Las Figuras 9 a - 9 c ilustran otra
materialización del dispositivo de lavado adaptada para facilitar la
retención del pellet y para permitir el procesamiento de cantidades
más elevadas de células en la sección inferior cónica (14) del tubo
(12) durante el proceso de lavado. En esta materialización, la
superficie interna de la sección cónica inferior (14) está equipada
con rebordes o "secuencias" concéntricas, tales como el reborde
(126) que presenta una superficie vertical (128) y una superficie
horizontal (130). Aunque se ilustra como una secuencia convencional
de 90º que presenta una superficie horizontal y vertical con unas
dimensiones aproximadamente iguales, se debe subrayar que se pueden
utilizar otros ángulos y otros ratios de superficie. Las dimensiones
de los rebordes pueden variar; generalmente, de modo que las
superficies vertical y horizontal se extenderán entre
aproximadamente 0,2 y 1,0 milímetros desde la superficie interna del
tubo.
Las Figuras 10 a - 10 d ilustran otra
materialización de la invención, en la que la superficie interna de
la sección cónica inferior (14) forma una pluralidad de ranuras o
muescas, como, por ejemplo, la ranura (132), situadas de forma
radial desde la región central del vértice. La Figura 10 b muestra
una sección transversal de un segmento de la pared lateral (14), tal
y como se indica, que ilustra la ranura (132) formada por las
paredes laterales (134) y opcionalmente la superficie inferior
(136). Se aprecia que las paredes laterales (134) pueden configurar
de forma alternativa una ranura en forma de V. Las Figuras 10 c y 10
d muestran unas perspectivas adicionales de las secciones inferiores
(14) del dispositivo. Dichas ranuras generalmente cuentan con unas
profundidades entre 0,2 y 1,0 milímetros.
Las Figuras 11 a - 11 d muestran otra
materialización del dispositivo en la que la sección inferior (14)
ha sido aumentada con una pluralidad de aletas longitudinales, tales
como la aleta (134), que se encuentran posicionadas y diseñadas para
compartimentar la sección inferior apical interna del tubo. La
Figura 11 b representa una sección transversal de una aleta y las
Figuras 11 c y 11 d muestran perspectivas alternativas de la sección
cónica inferior del tubo.
Las Figuras 12 a 12 c representan otra
materialización de la invención, en la que la sección inferior (14)
se encuentra totalmente compartimentada mediante aletas o
separadores que se extienden a través del diámetro interno del tubo,
como, por ejemplo, el separador (136) que atraviesa la sección
inferior del tubo. Tal y como se ilustra en la Figura, se configuran
cuatro compartimentos mediante dos de los separadores citados
posicionados entre sí en un ángulo de 90º; no obstante, se aprecia
que una serie de separadores, como los separadores radiales que se
proyectan desde la línea central del tubo, o una red de separadores,
puede cumplir la misma función. De nuevo sin comprometerse con
ningún mecanismo subyacente, dicha compartimentación está construida
y diseñada para facilitar la retención del pellet en la sección
inferior del tubo.
Las materializaciones del dispositivo descritas
con anterioridad pueden ser utilizadas ventajosamente para el lavado
de células aisladas a partir de fluidos biológicos, tales como las
utilizadas en el ámbito terapéutico. Una ventaja del dispositivo es
su capacidad para proporcionar una transferencia estéril de líquidos
antes, durante y después del proceso de lavado. Una ventaja no
prevista es su capacidad para proporcionar una elevada capacidad de
recuperación de determinados tipos de células raras. En especial,
tal y como se describe detalladamente más adelante, proporciona una
elevada capacidad de recuperación de células "ligeras" que
residen en la parte superior del pellet de células después de la
centrifugación.
La presente sección describe un método de lavado
de células realizado de conformidad con la presente invención.
Cuando una población de células raras, tales como las células
progenitoras hematopoyéticas CD34+, es lavada de acuerdo con los
métodos descritos en este documento, se produce un pérdida muy
reducida, si la hubiere, de células. Al contrario que cuando se
utilizan los métodos convencionales, y en especial, al emplear tubos
centrífugos que presentan unos ángulos apicales superiores a 90º, se
puede producir una pérdida selectiva de dichas células durante la
decantación. Aunque sin basarse en ninguna teoría específica, se
considera que la citada capacidad para retener las células que
presentan unas densidades más bajas es debida a la gama exclusiva
del ángulo apical que se describe en el presente documento. Tal y
como se ha declarado, dicho ángulo se debe encontrar entre 50º y
90º, y preferentemente entre 60º y 80º.
Las Figuras 6 a - 6 h muestran una representación
esquemática de las etapas implicadas en el aislamiento y el lavado
de células CD34+, utilizando el tubo de lavado de la presente
invención junto con un dispositivo y un método de centrifugación
para captación de células ("Cell-trap"), tal y
como se describen en las Patentes EEUU 5.474.687 y 5.663.051. De
forma sumaria, el tubo de captación de células se encuentra adaptado
para la recogida de células que migran al interfaz que se forma
cuando una solución de células es cargada en un material de
separación por gradiente de densidad. Una característica especial
del tubo es un elemento de constricción que está posicionado y
diseñado para retener el fluido en la sección inferior del
dispositivo, por debajo del elemento de constricción cuando el
dispositivo se encuentra invertido.
Las células progenitoras hematopoyéticas CD34+
son representativas de las células cuyo aislamiento y lavado se ve
particularmente mejorado por la utilización del dispositivo y el
método de lavado de la presente invención, en especial, en
combinación con el tubo de captación de células descrito con
anterioridad, puesto que dichas células constituyen menos del 1% de
una población celular periférica de sangre y presentan unas
densidades "ligeras" en relación con las otras células
presentes en la fracción aislada del interfaz. Dichas células
generalmente migran a la parte superior del pellet durante las
posteriores etapas de lavado, tal y como se describe más
adelante.
De forma sumaria, tal y como se muestra en la
Figura 6 a, el tubo de centrifugación para captación de células (70)
con una parte superior cerrada (72) y unos puertos de entrada (74 y
76) está conectado a un primer depósito (78) que contiene el medio
del gradiente de densidad (80). El medio del gradiente de densidad
puede presentar cualquier composición, pero debe contar con una
densidad bien definida que sea calibrada de acuerdo con el tipo
específico de célula que se va a aislar, tal y como se describe en
la Patente 5.663.051. Tal y como se ha mencionado, con el fin de
aislar las células progenitoras hematopoyéticas CD34+ a partir de
una población de células periféricas de sangre, dicha densidad debe
ser preferentemente de 1,0605 \pm 0,0005 gr. / ml. a 280 mOsm, y
con el fin de aislar las células progenitoras hematopoyéticas CD34+
a partir de una población de células de médula ósea, la densidad
preferente debe ser de 1,0685 \pm 0,0005 gr. / ml. a 280 mOsm. Un
ejemplo de material de gradiente de densidad es una composición
coloidal organosilanizada de sílice, tal y como se describe en la
Patente EEUU 4.927.750, o una composición del tipo citado tratada
mediante la adición de polivinilpirrolidona (PVP) tal y como se
describe en la Patente EEUU 5.483.148. Se debe subrayar que se
pueden utilizar otros materiales, de conformidad con el protocolo
específico aplicado para aislar un tipo específico de célula.
El material del gradiente de densidad (80) es
añadido a la sección inferior del tubo de captación de células (70)
a través del conducto (85) que está conectado al tubo (70) en el
puerto (74) mediante una conexión estéril. El puerto (74) comunica
con la sección inferior del tubo a través del canal (79). El
material del gradiente (81) presente en la sección inferior del tubo
es añadido hasta un nivel que alcanza la parte superior de la
abertura (82) formada por el elemento de constricción (84) en el
tubo. El flujo del material del gradiente es detenido por medio de
una válvula, como, por ejemplo, la válvula (83).
Asimismo se encuentra conectado mediante una
conexión estéril al tubo de captación de células (80) el depósito de
células (86), que se muestra como una "bolsa" para la recogida
estéril de sangre en la Figura. Tal y como ilustra la Figura 6 b, la
mezcla de células (88) que contiene las células (89) fluye a través
del conducto (92) que comunica con el tubo de captación de células
(70) a través del puerto (76) con el fin de llenar o de llenar
parcialmente hasta alcanzar la zona situada por encima del elemento
de constricción (84). Durante ésta y otras adiciones, el tubo (70)
puede ser ventilado mediante la abertura del orificio de ventilación
(77).
La Figura 6 c ilustra una etapa preferente
utilizada para ajustar el nivel del material del gradiente de
densidad en el tubo hasta alcanzar un nivel que se extienda por
encima del elemento de constricción. Tras la adición de la mezcla de
células, tal y como se ha descrito con anterioridad, se transfiere
el material del gradiente adicional desde el depósito (78) hasta el
tubo mediante la abertura de la válvula (83) situada entre el
depósito y el tubo. El material del gradiente fluye a través del
conducto (82) y a través del canal (79) hasta alcanzar la sección
inferior del tubo, con el fin de elevar el nivel del material del
gradiente (81) en el tubo hasta un nivel situado por encima del
elemento de constricción (84).
Después de la adición del material del gradiente
(81) y la mezcla de células (88) al tubo, los depósitos (78 y 86) y
los conductos adjuntos (82 y 92) son separados del tubo (70). La
Figura 6 d muestra que el tubo es entonces sometido a centrifugación
a una velocidad suficiente para hacer que las células presentes en
la mezcla de células se distribuyan en el material del gradiente de
densidad (81) o en el interfaz (96) que se forma entre el material
del gradiente de densidad (81) y el sobrenadante (91), de acuerdo
con las densidades relativas de las diversas células presentes en la
mezcla. La centrifugación a una velocidad de 850 x g. por 30 mm es
generalmente suficiente para este propósito. Durante la
centrifugación, las células que presentan unas densidades
específicas superiores a las del material del gradiente de densidad
sedimentan en el pellet (94), mientras que aquellas células, tales
como las células CD34+, que presentan unas densidades específicas
aproximadamente iguales a las del material del gradiente, se
concentran en la zona de interfaz (96) que se forma entre el
sobrenadante (91) de la muestra y el material del gradiente de
densidad (81).
No se ha constatado que, en las condiciones
específicas descritas en el presente documento, si se utiliza como
mezcla de células una fracción derivada de células mononucleares
periféricas y un material del gradiente de densidad con una densidad
específica de 1,0605 gr. / ml., las células CD34+ se concentran en
la zona de interfaz (96) (Patente EEUU 5.474.687). Debido al diseño
de captación de células del tubo, es posible transferir las células
presentes en las zonas situadas por encima de la abertura (85)
formada por el elemento de constricción (84) mediante la inversión
del tubo (70), tal y como se ilustra en la Figura 6 e, sin que
exista contaminación del producto decantado resultante por parte de
las células presentes en el pellet (94).
Tal y como se ilustra en la Figura 6 e, la
decantación de las células se puede llevar a cabo de forma estéril
mediante la conexión del puerto (76) a un receptáculo estéril,
preferentemente a través de un tubo de conducción, como, por
ejemplo, el conducto (98). De conformidad con el método mejorado que
se describe en el presente documento, el receptáculo estéril es un
tubo de lavado (100), configurado de acuerdo con lo descrito en la
Sección 2ª. Tal y como se muestra, el canal (98) está conectado al
tubo de lavado (98) a través del puerto de entrada (102). Las zonas
del sobrenadante (91) y del interfaz (96) incluyen un drenaje (97)
para las células CD34+ a través del puerto (76) hasta el conducto
(98) y hasta el tubo de lavado (100). El aire presente en el tubo
puede ser ventilado a través del orificio de ventilación (104)
durante el proceso.
Una vez añadidas las partes del sobrenadante y
del interfaz procedentes del tubo de captación de células (70) al
tubo de lavado (100), el conducto (98) es desconectado del tubo de
lavado. El tubo de lavado (100) es entonces centrifugado hasta
formar un pellet con las células CD34+ meta (107) a partir de la
mezcla de células seleccionada (106), tal y como se ilustra en la
Figura 6 f. La Figura 6 g muestra el tubo de lavado (100) después de
la centrifugación, cuando el pellet resultante (110) contiene
células CD34+ (107) en su parte superior, que está recubierta por el
sobrenadante de lavado (108). La Figura 6 h muestra la retirada del
sobrenadante de lavado (108) no deseado mediante la inversión del
tubo. De conformidad con una característica importante de la
presente invención, el pellet (110), con inclusión de las células
ligeras tales como las células CD34+ (107), permanece en el interior
del tubo de lavado (100) cuando el tubo se invierte durante un
tiempo de hasta tres minutos, produciéndose una pérdida ligera o
nula de células. Con fines de lavado adicional, el pellet de células
(110) puede ser resuspendido en un volumen adecuado de diluente
celular, que debe ser añadido al tubo a través del puerto de entrada
estéril (102). El pellet resuspendido puede entonces ser lavado de
forma adicional, mediante nueva centrifugación y resuspensión, tal y
como se ilustra en las Figuras 5 f - 5 h. Se debe subrayar que, en
función del tipo de células y de la naturaleza del diluente
original, dicho lavado puede variar en relación con su duración, su
repetición, y los elementos constitutivos del buffer. Dichos
factores pueden ser determinados por el profesional cualificado de
acuerdo con el protocolo específico de lavado que dicho profesional
determine como más adecuado para las células que se van a lavar.
El ejemplo 1 describe el lavado de una mezcla de
células enriquecida con células progenitoras hematopoyéticas CD34+
utilizando el método descrito con anterioridad. Este ejemplo
demuestra un aspecto importante de la presente invención, a saber,
que las células raras "ligeras" (por ejemplo, aquellas células
que se sedimentan en la parte superior del pellet de células), tales
como las células CD34+ reseñadas con anterioridad, las cuales en las
condiciones de aislamiento aplicadas de forma general ocupan el
estrato superior del pellet de lavado, son recuperadas de acuerdo
con un porcentaje de al menos el 90% de su cantidad añadida, y
preferentemente con un porcentaje aproximado del 95% de su cantidad
añadida, utilizando el dispositivo y el método de la invención.
El ejemplo 2 describe los experimentos realizados
para demostrar la eficacia de la presente invención, en los que se
realizaron pruebas de verificación de los ángulos apicales del tubo
en relación con su capacidad para retener células CD34+ cuando el
tubo es invertido. Los resultados de dichos experimentos se reseñan
en la Figura 7. Estos experimentos demuestran la importancia de
contar con un ángulo apical de entre aproximadamente 50 y 90 grados,
con el fin de proporcionar una elevada cantidad de tipos de células
raras después del lavado. De forma específica, tal y como se
ilustra, cuando las células son lavadas en tubos que cuentan con
ángulos apicales de 60 grados - 80 grados, se recupera un porcentaje
superior al 95% de las células totales y las células CD34+ después
del lavado y de la decantación del sobrenadante celular mediante la
inversión del tubo de lavado. Con un ángulo apical de 100º, se
produjo una reducción selectiva de células CD34+, que generó
únicamente una recuperación del 30% de dichas células. Con unos
ángulos apicales de 110 y 120 grados, se detectó una reducción de la
recuperación de todos los tipos de células.
Los estudios precedentes ilustran una de las
ventajas conseguidas con la presente invención: la elevada
recuperación (90% - 95%) de células "ligeras" de un pellet de
células cuando se utiliza un tubo de lavado realizado de conformidad
con la invención para lavar las células y el sobrenadante de lavado
es decantado mediante la inversión del tubo.
Los siguientes ejemplos ilustran pero no limitan
de ningún modo la presente invención.
Las células progenitoras hematopoyéticas CD34+
fueron aisladas de acuerdo con lo descrito en la Patente EEUU
5.474.687, utilizando como material del gradiente de densidad una
composición coloidal organosilanizada de sílice (Patente EEUU
4.927.750), ajustado de acuerdo con una densidad de 1,0605
gr. / ml. ("BDS") en un tubo de captación de células de gran magnitud (ACT 300), tal y como el descrito en la Patente EEUU 9.663.051. El procesamiento de la muestra siguió las etapas generales que se describen en las Figuras 5 a - 5 h, tal y como se ha reseñado con anterioridad, de acuerdo con los siguientes detalles: El tubo de separación para captación de células fue llenado justo hasta el nivel de la sección inferior de la abertura formada por el elemento de constricción con BDS. La muestra de sangre fue entonces añadida al contenedor. Entonces se añade el BDS adicional (mediante adición a través del conducto que se extiende hasta la sección inferior del tubo, tal y como se ilustra), con el fin de hacer que el nivel del material del gradiente de densidad alcance un nivel por encima de la abertura de constricción. El tubo fue entonces centrifugado a 850 x g. durante 30 minutos sin frenado. Después de la centrifugación, el dispositivo fue conectado a través de un conducto estéril a un dispositivo de lavado realizado de conformidad con la invención que presenta un ángulo apical de 80º. El conducto estéril fue conectado a un puerto de entrada central de la muestra situado en la tapa del dispositivo de lavado. Se abrió un orificio de ventilación en el dispositivo de lavado, y se decantó el sobrenadante que contenía el interfaz en el dispositivo de lavado. El dispositivo de lavado fue centrifugado a 850 x g. durante 30 minutos sin frenado. El sobrenadante resultante fue vaciado a través de un puerto de salida / decantación situado en la tapa del dispositivo de lavado. Posteriormente, el pellet fue resuspendido en una solución salina regulada de fosfato ("Phosphate Buffered Saline" - PBS) libre de calcio y de magnesio, y el tubo fue centrifugado a 850 x g. durante 15 minutos. El sobrenadante resultante fue decantado tal y como se ha descrito con anterioridad, y el pellet resultante fue resuspendido en un volumen predeterminado de PBS con fines de cuantificación de células. Se aplicaron alícuotas adicionales para el análisis FACS de las células.
gr. / ml. ("BDS") en un tubo de captación de células de gran magnitud (ACT 300), tal y como el descrito en la Patente EEUU 9.663.051. El procesamiento de la muestra siguió las etapas generales que se describen en las Figuras 5 a - 5 h, tal y como se ha reseñado con anterioridad, de acuerdo con los siguientes detalles: El tubo de separación para captación de células fue llenado justo hasta el nivel de la sección inferior de la abertura formada por el elemento de constricción con BDS. La muestra de sangre fue entonces añadida al contenedor. Entonces se añade el BDS adicional (mediante adición a través del conducto que se extiende hasta la sección inferior del tubo, tal y como se ilustra), con el fin de hacer que el nivel del material del gradiente de densidad alcance un nivel por encima de la abertura de constricción. El tubo fue entonces centrifugado a 850 x g. durante 30 minutos sin frenado. Después de la centrifugación, el dispositivo fue conectado a través de un conducto estéril a un dispositivo de lavado realizado de conformidad con la invención que presenta un ángulo apical de 80º. El conducto estéril fue conectado a un puerto de entrada central de la muestra situado en la tapa del dispositivo de lavado. Se abrió un orificio de ventilación en el dispositivo de lavado, y se decantó el sobrenadante que contenía el interfaz en el dispositivo de lavado. El dispositivo de lavado fue centrifugado a 850 x g. durante 30 minutos sin frenado. El sobrenadante resultante fue vaciado a través de un puerto de salida / decantación situado en la tapa del dispositivo de lavado. Posteriormente, el pellet fue resuspendido en una solución salina regulada de fosfato ("Phosphate Buffered Saline" - PBS) libre de calcio y de magnesio, y el tubo fue centrifugado a 850 x g. durante 15 minutos. El sobrenadante resultante fue decantado tal y como se ha descrito con anterioridad, y el pellet resultante fue resuspendido en un volumen predeterminado de PBS con fines de cuantificación de células. Se aplicaron alícuotas adicionales para el análisis FACS de las células.
Las células fueron aisladas y transferidas a
tubos de lavado que presentaban diferentes ángulos apicales (60º,
80º, 90º, 100º, 120º, tal y como se muestra en la Figura 7),
utilizando los métodos que se detallan en el Ejemplo 1. Para cada
pellet, se cuantificaron las células totales; las CD34+ fueron
cuantificadas de forma adicional mediante Clasificación Celular
Activada por Fluorescencia ("Fluorescent Activated Cell
Sorting" - FACS), de conformidad con los métodos tipificados bien
conocidos en este ámbito técnico, utilizando anticuerpos
monoclónicos anti-CD34+ etiquetados como
ficoeritrina ("Phycoerythrin") (Becton, Mountain View, CA).
Las recuperaciones de las células totales y de
las células CD34+ fueron cuantificadas mediante el recuento del
número de células presentes en los materiales originales y finales y
la comparación de dichas cifras.
Aunque la invención ha sido descrita en
referencia a métodos y materializaciones específicos, se debe
subrayar que se pueden realizar diversos cambios y modificaciones
sin abandonar el ámbito de las reivindicaciones adjuntas.
Claims (11)
1. Un dispositivo de lavado de células que
incluye:
(i) Un tubo centrífugo elongado (12) que presenta
generalmente unas paredes laterales cilíndricas y una pared inferior
cónica, y dicha pared inferior cónica forma un ángulo apical de
entre aproximadamente 50 grados y aproximadamente 90 grados, y una
modificación de la superficie de la pared seleccionada entre el
siguiente grupo:
- (a)
- Una pluralidad de aletas longitudinales que sobresalen hacia el interior desde las citadas paredes laterales.
- (b)
- Una pluralidad de separadores longitudinales que definen una pluralidad de compartimentos.
- (c)
- Una pluralidad de rebordes dispuestos de forma concéntrica.
- (d)
- Una pluralidad de ranuras dispuestas de forma radial desde la zona apical de la citada pared inferior.
- (e)
- Y una texturización de la superficie interna.
(ii) Una tapa (16) sellada a la parte superior de
dicho tubo; y dicha tapa cuenta con al menos dos puertos de
acceso.
2. El dispositivo de lavado de células de la 1ª
reivindicación, cuando la texturización de dicha superficie se
caracteriza por profundidades de pico a valle de entre
aproximadamente 0,8 \mum y 500 \mum.
3. El dispositivo de lavado de células de la 1ª
reivindicación, cuando los citados puertos de acceso situados en
dicha tapa (16) incluyen (i) un puerto para el paso de líquido
adaptado para el paso estéril de líquido hacia el interior y hacia
el exterior de dicho tubo (12), y (ii) un orificio de ventilación
capaz de proporcionar aire filtrado al interior de dicho tubo
(12).
4. El dispositivo de lavado de la 3ª
reivindicación, en el que el puerto de paso de líquido forma una
conexión fluida con un conducto; y dicho conducto se extiende hasta
el tubo citado (12).
5. El dispositivo de lavado de la 3ª
reivindicación, en el que dicha tapa (16) incluye una sección
inferior cóncava adaptada para canalizar el líquido desde dicho tubo
(12) hasta dicho puerto de paso de líquido cuando dicho tubo se
mantiene en posición invertida.
6. El dispositivo de lavado de la 3ª
reivindicación, en el que dicho puerto de paso de líquido incluye de
forma adicional un conector "LUER-LOK" para el
paso de soluciones estériles al citado tubo (12).
7. El dispositivo de lavado de la 3ª
reivindicación, que incluye un tercer puerto situado en dicha tapa
(16); y dicho tercer puerto está adaptado para operar como orificio
de ventilación con el fin realizar el cultivo de células en dicho
dispositivo, así como una cantidad de medio para el cultivo de
células con el fin de contribuir al crecimiento de las células.
8. El dispositivo de lavado de la 3ª
reivindicación, que incluye de forma adicional un reborde que rodea
al menos dicho puerto de paso de líquido y dicho orificio de
ventilación.
9. Un dispositivo de lavado de células que
incluye:
Un tubo centrífugo elongado (12) que presenta
generalmente unas paredes laterales cilíndricas y una pared inferior
cónica, y dicha pared inferior cónica forma un ángulo apical de
entre aproximadamente 50 grados y aproximadamente 90 grados.
Y una tapa (16) sellada a la parte superior de
dicho tubo; y dicha tapa cuenta con al menos dos puertos de
acceso.
Y dicha tapa incluye una sección inferior cóncava
adaptada para canalizar líquido desde dicho tubo (12) hasta uno de
los puertos de acceso citados cuando dicho tubo se mantiene en una
posición invertida.
10. El dispositivo de lavado de células de la 9ª
reivindicación en el que dichos puertos de acceso situados en dicha
tapa (16) incluyen (i) un puerto de paso de líquido adaptado para el
paso estéril de líquido hacia el interior y hacia el exterior de
dicho tubo, y (ii) un orificio de ventilación capaz de proporcionar
aire filtrado al interior de dicho tubo (12).
11. El dispositivo de lavado de la 10ª
reivindicación en el que el puerto de paso de líquido forma una
conexión fluida con un conducto, y dicho conducto se extiende hasta
el tubo citado (12).
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|---|---|---|---|---|
| US20020179544A1 (en) * | 2001-04-27 | 2002-12-05 | Nexell Therapeutics, Inc. | Cell processing and fluid transfer apparatus and method of use |
| US6623959B2 (en) * | 2001-06-13 | 2003-09-23 | Ethicon, Inc. | Devices and methods for cell harvesting |
| US6890291B2 (en) * | 2001-06-25 | 2005-05-10 | Mission Medical, Inc. | Integrated automatic blood collection and processing unit |
| US7037428B1 (en) * | 2002-04-19 | 2006-05-02 | Mission Medical, Inc. | Integrated automatic blood processing unit |
| CN100556546C (zh) * | 2003-02-13 | 2009-11-04 | 贝克顿·迪金森公司 | 在血液收集过程中去除成分的装置及其使用 |
| ITRM20030467A1 (it) * | 2003-10-10 | 2005-04-11 | Advance Holdings Ltd | Contenitore monouso per la centrifugazione ed il trattamento di un materiale biologico fluido. |
| GB2432667A (en) * | 2005-09-06 | 2007-05-30 | Gwernafalau Gyfyngedig | Apparatus and method for the separation of material from biological samples |
| DE102008047068B4 (de) * | 2008-09-12 | 2015-02-26 | Walter Pobitschka | Verfahren und Vorrichtung zur Trennung von Blut unter Einsatz einer Zentrifuge |
| JP2010075066A (ja) * | 2008-09-24 | 2010-04-08 | Olympus Corp | 遠心分離容器 |
| US8177072B2 (en) * | 2008-12-04 | 2012-05-15 | Thermogenesis Corp. | Apparatus and method for separating and isolating components of a biological fluid |
| EP2373974A1 (en) | 2008-12-19 | 2011-10-12 | 3M Innovative Properties Company | System and method for concentrating samples |
| US8647508B2 (en) | 2008-12-19 | 2014-02-11 | 3M Innovative Properties Company | System and method for processing samples |
| JP2010148450A (ja) * | 2008-12-25 | 2010-07-08 | Olympus Corp | 細胞洗浄方法 |
| US8870733B2 (en) | 2010-11-19 | 2014-10-28 | Kensey Nash Corporation | Centrifuge |
| EP2726843B1 (en) | 2011-06-30 | 2016-03-02 | 3M Innovative Properties Company | Systems and methods for detecting an analyte of interest in a sample using filters and microstructured surfaces |
| WO2013003308A1 (en) | 2011-06-30 | 2013-01-03 | 3M Innovative Properties Company | Systems and methods for detecting an analyte of interest in a sample using microstructured surfaces |
| WO2013116041A1 (en) * | 2012-01-31 | 2013-08-08 | Argos Therapeutics, Inc. | Centrifuge vessels suitable for live cell processing and associated systems and methods |
| DE102012013642B4 (de) * | 2012-07-09 | 2020-12-24 | Thermo Electron Led Gmbh | Zentrifugengefäßeinheit |
| EP3660140A1 (en) | 2014-01-31 | 2020-06-03 | DSM IP Assets B.V. | Adipose tissue processing centrifuge and methods of use |
| EP3554668B1 (en) | 2016-12-15 | 2024-06-26 | Beckman Coulter, Inc. | Cell washing device and method |
| US20210387176A1 (en) * | 2020-06-16 | 2021-12-16 | Sani-Tech West, Inc. | Closed fluid receiving and sampling container |
| EP4317940A1 (en) * | 2021-03-31 | 2024-02-07 | Sony Group Corporation | Sample liquid accommodation container, sample liquid stirring device, microparticle sorting kit, and microparticle sorting device |
Family Cites Families (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US928552A (en) | 1908-10-03 | 1909-07-20 | Porter W Shimer | Crucible. |
| US956708A (en) | 1909-10-16 | 1910-05-03 | Aage Jensen | Milk-testing bottle. |
| US1597513A (en) | 1925-08-01 | 1926-08-24 | Kelvinator Corp | Testing |
| GB855788A (en) * | 1957-03-14 | 1960-12-07 | Colin Beckenham Fisher | Improvements in or relating to bottles and other like containers |
| US3407812A (en) | 1965-11-09 | 1968-10-29 | Dade Reagents Inc | Method for performing plasmapheresis in situ |
| US3452924A (en) | 1965-02-03 | 1969-07-01 | Sorvall Inc Ivan | System and method for washing blood and the like |
| US3468474A (en) * | 1966-07-07 | 1969-09-23 | Arvid W Shoblom | Centrifuge accessory |
| US3561672A (en) | 1968-03-18 | 1971-02-09 | Baxter Laboratories Inc | Washing process and centrifuge assembly |
| US3635370A (en) | 1970-08-11 | 1972-01-18 | Sorvall Inc Ivan | Centrifuge tube closure assembly |
| US3674197A (en) | 1970-09-08 | 1972-07-04 | Sorvall Inc Ivan | Washing means for flexible bags in split enclosures |
| US3858795A (en) | 1973-02-08 | 1975-01-07 | Int Equipment Co | Method for washing blood cells |
| US3877634A (en) | 1973-05-25 | 1975-04-15 | Du Pont | Cell washing centrifuge apparatus and system |
| US3897902A (en) | 1974-02-01 | 1975-08-05 | Sindco Corp | Phase separating tube |
| US3914985A (en) | 1974-03-29 | 1975-10-28 | American Hospital Supply Corp | Centrifuging device and method |
| US3976579A (en) | 1975-07-10 | 1976-08-24 | Becton, Dickinson And Company | Novel assembly |
| GB1533272A (en) | 1976-02-13 | 1978-11-22 | Radiochemical Centre Ltd | Centrifuge tube |
| US4114803A (en) | 1976-12-17 | 1978-09-19 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Centrifuge tube enclosure |
| US4179339A (en) | 1977-03-02 | 1979-12-18 | Olympus Optical Company, Ltd. | Liquid feeder for automatic culture apparatus |
| US4487696A (en) | 1978-08-14 | 1984-12-11 | Ferrara Louis T | Blood separator and dispenser |
| US4290300A (en) | 1978-10-18 | 1981-09-22 | Joseph Carver | Sucrose density gradient system |
| US4222513A (en) | 1978-12-12 | 1980-09-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Centrifuge tube seal |
| US4241005A (en) | 1979-02-21 | 1980-12-23 | The Trustees Of Boston University | Process for producing a molecularly oriented film |
| US4268393A (en) | 1980-05-05 | 1981-05-19 | The Institutes Of Medical Sciences | Apparatus for centrifugal separation of platelet-rich plasma |
| US4364903A (en) | 1981-04-02 | 1982-12-21 | Becton, Dickinson And Company | Contamination-free separation device |
| US4426295A (en) | 1981-09-28 | 1984-01-17 | Evans Deborah A | Cell suspension chamber process |
| FR2536671B1 (fr) | 1982-11-26 | 1988-06-10 | Sartorius Gmbh | Appareil de filtrage pour liquides, de type statique a membrane |
| FI833207A0 (fi) * | 1983-09-08 | 1983-09-08 | Farmos Oy | Reaktionskaerl foer immunologiska bestaemningar |
| DE8331431U1 (de) * | 1983-11-02 | 1984-02-23 | Aktieselskabet NUNC, 4000 Roskilde | Roehre fuer die immunologische adsorptionsanalyse |
| US4576185A (en) | 1983-12-05 | 1986-03-18 | Terumo Medical Corporation | Collection device for capillary blood |
| US4620794A (en) | 1984-11-20 | 1986-11-04 | Jule Inc. | Gradient formers |
| US4698311A (en) * | 1985-10-30 | 1987-10-06 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Particle washing and separation method |
| US4690670A (en) | 1986-01-10 | 1987-09-01 | Nielsen Steven T | Centrifuge tube having reusable seal |
| US4927750A (en) | 1986-04-09 | 1990-05-22 | Jeanette Simpson | Cell separation process |
| US4990129A (en) | 1988-08-16 | 1991-02-05 | Nielsen Steven T | Swinging bucket ultracentrifuge rotor, sample tube and adapter |
| US4902270A (en) | 1988-10-03 | 1990-02-20 | Nalge Company | Centrifuge tube |
| US5178602A (en) | 1990-02-07 | 1993-01-12 | Wells John R | Automatic decanting centrifuge |
| US5047004A (en) | 1990-02-07 | 1991-09-10 | Wells John R | Automatic decanting centrifuge |
| US5253551A (en) | 1990-07-12 | 1993-10-19 | Bio-Pias, Inc. | Centrifuge tube and centrifuge tube cap removing and installing tool and method |
| US5282982A (en) | 1991-07-12 | 1994-02-01 | Wells John R | Blood washing method |
| US5234667A (en) * | 1992-02-03 | 1993-08-10 | The Scripps Research Institute | Centrifuge tube for improved pellet retention |
| US5244635A (en) | 1992-06-19 | 1993-09-14 | Cirrus Diagnostics, Inc. | Centrifuge vessel with coaxial waste chamber having cap to prevent waste fluid transfer from the chamber into the vessel |
| US5371600A (en) | 1992-08-12 | 1994-12-06 | Candela Laser Corporation | Fiber optic probe apparatus and method |
| WO1994008721A1 (en) | 1992-10-13 | 1994-04-28 | Haemonetics Corporation | Disposable centrifuge rotor and core |
| US5310527A (en) | 1992-12-14 | 1994-05-10 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Tube for use in a pelleting centrifuge rotor |
| EP0778944B1 (en) * | 1994-08-31 | 1999-11-03 | Dendreon Corporation | Cell separation apparatus and method |
| US5474687A (en) | 1994-08-31 | 1995-12-12 | Activated Cell Therapy, Inc. | Methods for enriching CD34+ human hematopoietic progenitor cells |
| US5840502A (en) | 1994-08-31 | 1998-11-24 | Activated Cell Therapy, Inc. | Methods for enriching specific cell-types by density gradient centrifugation |
| US5663051A (en) * | 1994-08-31 | 1997-09-02 | Activated Cell Therapy, Inc. | Separation apparatus and method |
| US5789148A (en) | 1994-08-31 | 1998-08-04 | Dendreon Corporation | Cell separation composition |
| DE4445030A1 (de) * | 1994-12-16 | 1996-06-27 | Heraeus Instr Gmbh | Zentrifugierbare medizinische Vorrichtung |
-
1998
- 1998-02-13 ES ES98906333T patent/ES2210724T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-13 WO PCT/US1998/002661 patent/WO1998035758A1/en active IP Right Grant
- 1998-02-13 AT AT98906333T patent/ATE253984T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-02-13 NZ NZ337472A patent/NZ337472A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-02-13 CA CA002280129A patent/CA2280129C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-13 EP EP98906333A patent/EP0959989B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-13 DE DE69819689T patent/DE69819689T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-13 AU AU61581/98A patent/AU741086B2/en not_active Expired
- 1998-02-13 JP JP53587498A patent/JP3615226B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-17 US US09/118,326 patent/US6197579B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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