JP3615226B2 - 細胞洗浄装置および方法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、単離した細胞を洗浄するのに適当な遠心分離可能装置に関する。本発明はまた、このような容器を用いて、ある種の希少な細胞集団を洗浄する方法に関する。
発明の背景
細胞分離技術の進歩により、数多くの治療方法が生み出されており、これらの方法では、検体の細胞が血流または骨髄から除去され、分別されて、検体または被移植患者へと再導入するための特定の細胞型が提供できる。例えば、特許になった米国特許出願第08/299,467号（1994年８月31日に出願）は、細胞画分を濃縮するための方法、およびこのような画分の使用のための適用症を記述している。
細胞懸濁液から細胞画分を濃縮する際には、多くの場合、この分別操作の一部として、この細胞懸濁液に、試薬（例えば、細胞特異的な抗体または緩衝薬）を添加するのが望ましい。このような試薬は、これらの細胞の患者への再導入前に、除去しなければならない。あるいはまたはそれに加えて、多くの場合、例えば、上で言及した治療適用症では、これらの細胞の使用前に、細胞のイオン状態を変えることが望ましい。
このような細胞分別操作が臨床設定で日常的となるにつれて、最小時間で、潜在的汚染への暴露を最小量にしつつ、細胞を処理できるように、これらの細胞の取扱いおよび操作の数をできるだけ少なくすることが望ましい。
典型的には、単離した細胞は、細胞を同じ遠心管またはバッグ（ここでは、これらの細胞が最初に遠心分離された）に再懸濁するか、または細胞を異なる遠心分離可能容器に移すか、いずれかにより、洗浄される。細胞は、その洗浄緩衝液に再懸濁され、そして比較的に低い遠心力（およそ1000×ｇ）で再遠心される。これらの細胞は、柔軟なペレットを形成し、その洗浄上澄み液は、引き続いた洗浄または最終緩衝液への再懸濁の前に、このペレットから除去しなければならない。
上澄み液の除去は、デカンテーションまたは穏やかな吸引のいずれかにより、行うことができる。デカンテーションは、比較的に迅速な操作であるが、しばしば、細胞損失を生じ、比較的に低い比重の細胞が差別的に枯渇して、そのペレットの頂部に沈降する。この理由のために、デカンテーションは、特に、このような細胞が比較的に低い比重を有するとき、一般に、細胞から上澄み液を除去するための信頼できる手段とは考えられていない。
他方、吸引は労働集約的であり、各個々の管に充分に注意を払わないなら、また、選択的に、そのペレットから廃棄洗浄液への「より軽い」細胞の損失が生じるおそれがある。さらに、吸引には、その細胞容器へのプローブの導入が必要である。これはまた、この容器に汚染物を導入するおそれがある。
前述の問題点を解決する１つの試みは、米国特許第5,047,004号（Wells）に見られ、この特許は、自動デカント遠心機を記述しており、この遠心機では、遠心分離に続いて、揺れているバケットが広い角度で固定されて、その中の流体の重力デカンテーションが行われる。このシステムは、このデカンテーション工程を相対的に容易にし自動化しつつ、その開放頂部設計によって、必然的に、これらの細胞を汚染に晒す。さらに、このペレット中にて、より穏やかに沈降する「軽い」細胞が保持されることを保証するための対策はない。
米国特許第5,474,687号には、細胞溶液−密度勾配界面へと移動する「軽い」細胞を選択的に集めることにより、単一工程の密度勾配で、希少細胞であるCD34⁺造血性始源細胞の典型的な画分を濃縮するための方法および特殊管が記述されている。しかしながら、これらの細胞は、使用前にペレット化し洗浄しなければならない。このようなペレット化および洗浄は、典型的には、市販の分離遠心管にて、比較的に低速（500〜1000×ｇ）で行われる。このような従来の洗浄法を用いると、このCD34⁺細胞は、それらがこの洗浄工程中に形成されるペレットの頂部に沈降する傾向がある「軽い」細胞であるので、この洗浄手順中にて、差別的に失われることが分かった。
本発明は、今ここで記述した問題点を克服する細胞洗浄装置を提供する。この装置は、細胞の無菌移動および取扱いに備えた密封可能キャップまたは蓋を有する管を含む。具体的には、この管には、このキャップを横切る無菌口によって、細胞または液体培地が添加できる。さらに、本発明の重要な特徴によれば、洗浄上澄み液は、この細胞ペレットを乱すことなく、上部口を通って、このペレットからデカントでき、慎重な上澄み液除去操作の必要性がなくなる。さらに、この管の設計は、この細胞ペレットの上部に存在している「より軽い」細胞でさえ、このデカンテーション工程中にて、保持されるようにされる。
この管および方法は、（ｉ）この管へまたはそこからの物質移動の無菌操作のための閉鎖システム、（ii）この管の反転により、このペレットの頂部での細胞の相当なまたは差別的な損失なしに、この細胞上澄み液の完全なデカンテーションを可能にする設計という利点を提供する。本発明のこの後者の特徴は、この洗浄工程中に損失または少なくとも著しく枯渇し得る希少細胞の高収率の回収を促進する。
本発明のこれらの特徴および他の特徴は、以下の部分で記述する。
発明の要旨
１局面では、本発明は、細胞洗浄装置を包含する。本発明の重要な特徴によれば、この装置は、細胞ペレットからの細胞の著しい損失なしに、また、重要なことには、この細胞ペレットの上部に存在している細胞の選択的な損失なしに、その上澄み液の反転により、このペレットからのデカンテーションを可能にするように、設計され構成されている。
１実施態様では、この細胞洗浄装置は、円筒形側壁および円錐形底部を一般に有する細長遠心管を包含する。本発明の重要な特徴によれば、この円錐形底部は、約50゜と約90゜の間の頂角を形成する。この装置はまた、この管の頂部に密封された蓋を包含し、この蓋は、それを通って液体または気体が流れるように配置し構成した少なくとも２個の連絡口を包含する。
本発明の特定の実施態様では、この連絡口は、（ｉ）この管へまたはそこからの液体の無菌通通過に適合させた液体通過ポート、および（ii）濾過した空気を管の内部へと供給できる通気孔を包含する。１実施態様では、この装置は、この入口および該通気孔を取り囲む隆起部を包含する。
他の実施態様では、この細胞洗浄装置の蓋は、この管を反転位置で保持するとき、この管からの液体をこの液体通過口へと流し込むように適合させた円錐形底部を包含する。この液体通過口は、「LUER−LOK」接続器を包含していてもよい。関連した実施態様によれば、この液体通過口は、この管へと伸長している導管と連絡できる。この装置の蓋には、第三口を追加してもよい。さらに他の実施態様では、この追加口は、この装置内での細胞の培養を補助するための通気孔として役立つように、適合されており、この場合、この装置また、細胞培養物を含む。この装置はまた、この管を逆さ位置で維持するように適合させた支持体を包含できる。
さらに他の関連した実施態様では、この装置の管の低い方の内部は、この管の下部にて、ペレットの保持を促進するように設計され適合されている。保持手段の種々の例が例示されている。このような手段には、この管の下部の内部表面壁上の木目、この下部上の隆起部またはその中の溝の存在、この管の側面から中心の方へと突出しているひれ状部の存在、この管の下部での縦方向仕切りの存在、前述のものの組み合わせなどが挙げられるが、それらに限定されない。
関連した局面では、本発明は、単離した細胞画分から不要媒体を除去するための方法を包含する。典型的には、この細胞画分は、希少細胞画分、すなわち、その初期細胞懸濁液の約１％未満を構成する細胞画分である。本発明の重要な特徴によれば、上記細胞洗浄装置を使用することにより、この管から上澄み液を完全に排水するために、少なくとも１分であって３分間程度にわたって、この洗浄装置を反転することにより、細胞の著しいまたは相当な損失なしに、この管内の細胞ペレットから、洗浄上澄み液が除去できる。重要なことに、この装置は、この細胞ペレットの残りと比較して、「より軽い」細胞（これは、それにより、遠心分離後、このペレットの頂部に残る）の損失を防止する。
この洗浄方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）単離した細胞を含有する懸濁液を、上記遠心分離可能細胞洗浄装置に添加すること；（ii）以下の工程により、これらの細胞を洗浄すること：（ａ）この装置内で上澄み液および細胞ペレットを形成するのに充分な力および充分な期間で、これらの細胞を遠心分離すること；次いで、（ｂ）その管を反転することにより、上澄み液を除去すること；次いで、（ｃ）細胞ペレットを無菌希釈剤に再懸濁させること。前述の工程は、専門家が決定した洗浄プロトコルに従って必要なように、繰り返してもよい。洗浄後の収率を特異的に高める特定の細胞型には、単離したCD34⁺造血性始源細胞および樹枝状細胞が挙げられる。
さらに他の関連した局面では、本発明は、特に、米国特許第5,474,687号および特許になった米国特許出願第08/570,397号により開示された遠心分離可能管を参照して、「細胞トラップ」管で分離された細胞を単離し洗浄する改良方法を包含する。この方法によれば、問題の細胞は、まず、特殊化した細胞トラップ管にて、密度勾配物質画分上部の界面で集められる。この界面およびその中の細胞は、次いで、上記のようにして、本発明に従って、遠心分離可能洗浄管に移動される。細胞はまた、以下の工程により、洗浄される：（ｉ）この管内で上澄み液および細胞ペレットを形成するのに充分な力および充分な期間で遠心分離すること；（ii）この管を反転することにより、上澄み液を除去すること；および（iii）細胞ペレットを無菌希釈剤に再懸濁させること。前述の工程は、特定の選択細胞に特別なプロトコルに従って、必要なら、繰り返してもよい。
CD34⁺造血性始源細胞および樹脂状細胞は、有利には、この特定の設定および手順を用いて、洗浄される。
本発明のこれらの目的および他の目的および特徴は、添付に請求の範囲と関連して、本発明の以下の詳細な説明を読むと、さらに充分に明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の洗浄装置の模式断面図を示す；
図2Aおよび2Bは、本発明の装置で使用する蓋の頂面図および底面図である；
図３は、安定化ひれ状部を有する装置の管部分の細長形の断面図を示す；
図４は、この洗浄装置の代替実施態様を示し、これは、内容物のデカンテーション用の導管を包含する；
図５は、外部ひれ状部を備えた管の底部の模式図を示す；
図6A〜6Hは、本発明の方法に従って細胞を洗浄するためのスキームを示す；
図７は、全細胞（黒棒）およびCD34⁺細胞（白棒）の回収率に対する、頂角の変化の効果を示す；
図8A〜8Dは、本発明の装置の代替実施態様の種々の図を示し、この装置は、その管の底部にて、木目を付けた内面を包含する；
図9A〜9Cは、本発明の装置の代替実施態様の種々の図を示し、この装置は、その管の底部にて、同心状の段または隆起部を特徴とする；
図10A〜10Dは、本発明の装置の代替実施態様の種々の図を示し、ここで、その管の内部下面は、その下部頂点領域から放射状になった溝を形成する；
図11A〜11Dは、本発明の代替実施態様の種々の図を示し、これは、その管の下部の内側に、外周的に配列した縦方向ひれ状部を包含する；そして
図12A〜12Cは、本発明の代替実施態様の種々の図を示し、これは、その管の下部頂点領域にて、複数の隔室を形成する仕切りを包含する。
発明の詳細な説明
本発明は、細胞を洗浄するのに特に適した遠心分離可能管に関する。
1.定義
「単離した細胞」とは、細胞懸濁液から実質的に濃縮した細胞を意味する；「実質的に濃縮した」とは、このような単離した細胞が、細胞混合物内の全細胞の分別部分として存在し、この分別部分が、それらが単離される細胞懸濁液を構成する分別部分よりも、少なくとも1.5倍、好ましくは、少なくとも２倍大きいことを意味する。
「希少細胞」とは、細胞混合物中にて、全細胞の約１％以下を構成する細胞を意味する。希少細胞の例には、CD34⁺造血性始源細胞（これは、白血球の約１％を構成する）、ナチュラルキラー細胞、樹枝状細胞、細胞毒性Ｔリンパ球、ナチュラルサプレッサー細胞、間葉細胞などが挙げられる。これらの希少細胞型は、当該技術分野で認められており、例えば、MaleD.ら（ADVANCED IMMUN OLOGY、Mosby/Times Mirror International Publishers Ltd.、London、1996）に記述されている。本発明の文脈では、この用語はまた、血液中にて、このような多量で存在している腫瘍細胞および有核胎児細胞も包含する。
「頂角」とは、本発明の管の頂点で形成された角度を意味する。このような角度は、この管の頂点領域を断面で眺めて、接合壁、またはこの壁がこの頂部で鋭い角度を形成しない場合にはこの壁の伸長部により形成された角度を測定することにより、測定できる。
II.遠心分離可能洗浄装置
図１は、本発明の遠心分離可能洗浄装置の模式断面図を示す。図示しているように、遠心分離可能洗浄装置10は、円錐形底部領域14を有する細長管12から形成されており、そして取付蓋16により、密封されている。この取付蓋は、図１で図示しているように、漏れ防止シールを与える任意の手段により、この管に取り付けることができ、蓋16は、管12に溶接または接着されている。
管12は、一般に、円筒形状であり、そして生体物質（例えば、細胞懸濁液20中の細胞21）を含有させるための内部領域18を形成する。この管は、繰り返しの高遠心力（約10,000×ｇ）に耐えることができる任意の材料から形成でき、好ましくは、遠心分離の分野で一般的に使用される医用等級プラスチック（例えば、ポリアロマー、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン（「テフロン」）など）から形成される。好ましくは、この材料はまた、この管内で処理する生体物質／細胞に適合性であって毒性ではない医用等級材料である。
管12の側壁22は、それから管が形成される材料に適した厚さを有する;0.5と５ミリメートル（mm）の間の厚さは、医用等級プラスチック（例えば、上で述べたもの）から形成される管について、好ましい。さらに、この材料および厚さは、少なくとも100×ｇ（好ましくは、1,000×ｇ程度）の遠心力に耐えることができなければならない。
この装置の重要な特徴は、管12の下部であり、これは、円錐形底部14を形成する。本発明を支持して行った実験では、洗浄上澄み液は、この管の円錐形底部が一定の頂角（角度（α）24、すなわち、約50゜と90゜の間の角度）を形成するとき、廃棄上澄み液への細胞の相当な損失なしに、この管のデカンテーションにより除去できることが確認された。頂角24がこの範囲内にあるとき、３分間までこの管を反転させることにより、希少細胞タイプの著しい損失なしに、また、本発明の重要な特徴に従って、比較的に低い密度を有する細胞の著しい損失なしに、洗浄上澄み液を除去することが可能である。底部頂点25は、この容器の下部内側部分が鋭い円錐形の角度で終わらないように、平坦にされている。
本発明の他の重要な特徴によれば、遠心洗浄装置10は、管12の頂部26に密封して取り付けた蓋16を包含する。図示しているように、蓋16上のリム28は、この管の頂部26の内部外周に密にはめ込まれて、密封を形成している。例えば、ネジ筋接続または内部シール（例えば、Ｏリング）により、蓋16を管12に密封できる多数の方法があることが分かっている。あるいは、蓋16は、管12の一体化部分として、形成できる。他の密封手段（例えば、接着剤または溶接）もまた、管12の頂部26に蓋16を結合させるのに使用できる。
蓋16は、少なくとも２個の口（入口／出口および排気口）を含む。これらの口は、それぞれ、この管へまたはそこから物質（それぞれ、液体または気体）を通過させるための無菌導管を提供できる。図１で図示した実施態様では、３個のポートが含まれている。口30は、この管へまたはそこから液体を通過させるために無菌連絡を提供することができる入口／出口である。口30は、図示しているように、蓋16の中心に位置している；しかしながら、それは、この蓋のいずれに位置していてもよい。図示しているように、口30は、「LUER−LOK」接続器を包含し、最初の細胞懸濁液および引き続いた洗浄液をこの管に導入するために、使用される。図示しているように、蓋16の下部内面31は、口30の直下の蓋の中心の方へ上方に円錐形となっている。この蓋のこの特徴は、この管を反転したとき、液体を口30の方へ流れ込ませることにより、管からの液体のデカントを促進する。キャップ32は、非移動状態では、この管への汚染物質の導入を防止するために、提供されている。
第二口34は、液体試料を管12からデカントするかまたはそこに添加したとき、それぞれ、この管へまたはそこから空気が流れるのを可能にする通気孔である。口34は、非移動状態は、キャップ36で覆われており、好ましくは、空気流／流体移動条件下にて、空気媒介の汚染物がこの管に入るのを防止するために、エアフィルター（例えば、マイクロフィルター38）を包含できる。
口40は、この管からの液体のデカンテーションを容易にするため、または気体交換排気のために提供できる追加口である。この気体交換の特徴は、本発明の１実施態様に従って、この装置を細胞を培養するのに使用するとき、特に有用である。この実施態様は、単離後で使用前に培養または成長工程を必要とする細胞（例えば、樹脂状細胞または造血性始源CD⁺34細胞）と共に使用するのに、特に有用であり便利である。
図４は、口40と連絡している導管43を図示する洗浄装置の代替実施態様を示し、この導管は、デカンテーションを必要とすることなく、この装置の内容物の除去を容易にする。導管43は、使用者の要求に従って、プラスチック材料または可撓性管材（例えば、テフロン管材）から製造できるか、または金属管であり得、そして長さを変えたものであるか、または可変長であり得る。
細胞培養容器として使用するとき、この遠心分離装置は、好ましくは、細胞成長を促進するのに公知の塗装または処理を施した細胞成長に適当なプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE;テフロン））から形成される。洗浄後、この細胞懸濁液培地は、一般に、生理学的な培地（例えば、細胞成長要件に適当なように補足したイーグル完全培地）となる。この実施態様では、この遠心分離装置は、追加の特徴（例えば、除去可能蓋および／またはスピナー培養用のアダプタ）で適合させてもよい。
図１で示した装置に戻ると、蓋16の下面31は、口40の方への液体流れのための円錐形流れ込み経路を提供するように、上記線に沿って適合できる。キャップ42は、口40を覆って示されているが、この口を使用しないとき、細胞懸濁液20の無菌性の維持を助けるために、この口上に配置されている。
また、蓋16の一部として、軸方向隆起部44が図示されており、これは、蓋16の頂部の一部を取り囲んでいる。軸方向隆起部44は、これら口の追加の無菌遮蔽物に対して、支持を与える。図2Aで図示している１実施態様では、リッジ44は、蓋16のうち、排気口34および試料導入口30を含む部分を囲んでおり、この領域に対する部分的な被覆のための支持を与える。図2Bは、蓋16の下部図を示し、これは、それぞれ、口30、34および40に対応する開口部58、60および62を有する下面31を示している。
図１で図示している管12の下部に戻ると、図示している装置は、それが特別な支持容器を必要とすることなく水平面で配置できるように、この装置に対して安定なベース支持を与えるように設計したベース支持体46を包含する。１実施態様では、このような支持体は、放射状ひれ状部の形状をとる。図３は、この装置の管50の下部の断面図を示し、これは、視覚面で断面で示した放射状に配置したひれ状部52および54とこの装置の後方部分で輪郭で示したフィン56とを有する。ひれ状部は、図示しているように、平坦または凸状のいずれかであり得る。凸状フィンは、渦流ミキサーを用いた混合を高めるために備えられる。
図５は、本発明に従って形成した管の頂点の下部図を示す。下部頂点64は、この管の下部伸長部にて、この管の平坦化部分として示されている；頂点64からは、ひれ状部66、68および70が放射している。
この洗浄装置のさらに別の実施態様を、図８〜12に図示する。これらの実施態様は、一般に、この洗浄工程中にて、この上澄み液からのペレットのより良好および／または効果的な隔離を促進する。
図8Aは、本発明に従って、円錐形底部領域14を有する洗浄装置10を示す。この実施態様によれば、図8Bで示した底部領域14のセグメントの断面図で図示されるように、内面120は木目が付けられている。いずれかの特定の理論に関係づけることなく、このような木目は、この上澄み液の除去中にて、この管内でのこのペレットの保持を改善すると認められる。
このような木目の粗さの程度は、かなり変えることができ、図示しているように、山122のような「山」および谷124のような「谷」の存在により、特徴づけられる。この山−谷深さは、かなりの部分は、約0.8〜約500マイクロメートルの範囲であり得る。このような木目は、当該技術分野（特に、プラスチック成形に関連した技術分野）で公知の多数の方法のいずれかにより、作成できる。例えば、成形管は、木目を付けた金型で鋳造でき、これは、次いで、この管に、木目を付けた凸凹表面を与える。木目を付けた金型を製造する手段は、当該技術分野で周知であるが、一般に、金型を、化学的または物理的手段（例えば、以下で述べるもの）によりエッチングすることを包含する。あるいは、この管の内面は、木目を付けた被覆を与えるように、被覆してもよい。
代表的なエッチング手段には、この金型空洞のビード吹き付け、金型空洞の放電機械切削および金型空洞の化学エッチングが挙げられる。木目を付けた管を形成するのに適当なエッチングした金属金型は、当該技術分野で公知の多数の方法で製造されるか、または市販の金型業者（例えば、Roehlen Industries（Walnut、CA））に請け負ってできる。このような金型を作成する１つの便利な手段には、この金型の空洞を「ビード吹き付けする」ことがある。この方法は、この金型の表面に高速粒子（例えば、重炭酸ナトリウム（ベーキングソーダ）の粒子）を衝突させることにより、この金型の表面から、金属の小ポケットを取り除く。一般に、エッチングの起伏または深さは、この方法で使用する粒子のグリットにより、決定される；例えば、酸化アルミニウムは、約0.8〜２μｍの深さの金型エッチングを生成できる。エッチングした金型表面はまた、放電機械切削（EDM）法（これは、金型に電気アークを衝突させることにより、それから、金属の小ポケットを取り除く）により、形成できる。このようなエッチングした金型は、対応する高さの小突出部に特徴がある管内部を生じる。
この金型はまた、化学エッチング手段により、エッチングしてもよい。一般に、成形技術分野で周知の方法によれば、木目の領域の金型表面には、マスクが置かれる。この金型は、次いで、マスクされていない領域から金属を除去する酸浴に浸けられる。この方法は、約１〜約４μｍのエッチング深さで、この金型表面にて、非常に密な凸凹表面を生じるように、使用できる。これは、本発明に従って、外部管木目を製造する特に効果的で制御された手段である。
図8Cおよび8Dは、この洗浄装置の木目を付けた底部14の代替図を示す。
図9A〜9Cは、ペレットの保持を促進し、そして洗浄工程中にて、管12の円錐形底部14で、多数の細胞を処理できるように適合させた洗浄装置の他の実施態様を示す。この実施態様では、円錐形底部14の内面は、同心隆起部または「段」（例えば、垂直面128および水平面130を有する隆起部126）を備えている。ほぼ同じ寸法の垂直面および水平面を有する通常の90゜の段として図示しているものの、他の角度および面比は使用できることが分かる。これらの隆起部の寸法は、変えてもよい；一般に、このような水平面および垂直面は、この管の内面から、約0.2ミリメートルと1.0ミリメートルの間で、伸長する。
図10A〜10Dは、本発明の他の実施態様を図示しており、ここで、円錐形底部14の内面は、複数の溝またはスロット（例えば、溝132）を形成し、これは、その中心頂点領域から放射している。図10Bは、図示しているように、側壁14のセグメントの断面を示し、これは、側壁134および必要に応じて下面136により形成された溝132を示している。側壁134は、交互に、Ｖ形溝を形成できることが分かる。図10Cおよび10Dは、この装置の底部14の別の図を示す。このような溝は、一般に、約0.2ミリメートルと1.0ミリメートルの間の深さを有する。
図11（Ａ〜Ｄ）は、この装置の他の実施態様を示し、ここで、下部14は、複数の縦方向フィン（例えば、ひれ状部134）で補強されており、これらのフィンは、この管の下部の内側頂点部分を区画化するように、また、この管の円錐形下面でのペレットの保持を促進するように、配置され設計されている。図11Bは、ひれ状部を横切る断面を示し、そして図11Cおよび11Dは、この管の下部円錐形部分の代替図を示す。
図12（Ａ〜Ｃ）は、本発明の他の実施態様を示し、ここで、下部14は、ひれ状部または仕切り（例えば、この管の下部領域を横断する仕切り136）で完全に区切られており、これらのひれ状部または仕切りは、この管の内径を横切って伸長している。この図で図示しているように、４個の隔室は、互いに90゜の角度で配置された２個のこのような仕切りにより、形成される；しかしながら、連続した仕切り（例えば、この管の中心線から突出している放射状仕切り）、または格子状仕切りは、同じ機能を果たし得ることが分かる。再度、いずれの内在する機構にも束縛することなく、このような区画化は、この管の下部でのペレットの保持を促進するように、構築され設計されている。
上記装置の実施態様は、治療法で使用するような生体流体から単離した細胞を洗浄する際に役立つように、使用できる。この装置の１つの利点は、この細胞洗浄工程前、中および後にて、液体を無菌移動させる性能にある。予期しない利点には、ある種の希少細胞タイプを高収率で回収する性能がある。特に、以下でより詳細に記述するように、それは、「軽い」細胞（これは、遠心分離に続いて、この細胞ペレットの頂部に存在している）を高収率で回収する。
III.細胞を洗浄する方法
この節は、本発明に従って、細胞を洗浄する方法を記述する。CD34⁺造血性始源細胞のような細胞の希少集団を、本明細書中で記述の方法に従って洗浄するとき、細胞の損失は、もしあったとしても、殆どない。従来の方法を使用するときとは、対照的に、特に、90゜より大きい頂角を有する遠心管を使用すると、このような細胞は、デカンテーション中にて、選択的に失われることがある。いずれの特定の理論にも帰するわけではないものの、より小さく浮かびやすい密度を有する細胞を保持するこの性能は、本明細書中で記述の独特の頂角範囲によると考えられている。上で述べたように、このような角度は、約50゜と90゜の間、好ましくは、約60゜と80゜の間であるべきである。
図６（Ａ〜Ｈ）は、米国特許第5,474,687号および特許になった米国特許出願第08/570,397号（これらの参考文献の両方の内容は、その全体について、本明細書中で参考として援用されている）で記述のように、「細胞とラップ」遠心分離装置および方法に関連して、本発明の洗浄管を用いたCD34⁺細胞の単離および洗浄に関与している工程の概略的な描写を示す。要約すると、この細胞トラップ管は、細胞溶液を密度勾配分離材料へと装填するときに形成される界面に移動する細胞を集めるように、適合されている。この管の特別な特徴は、この装置を反転したとき、その構成部材の下部の装置底部にて、流体を保持するように配置され構成された狭窄部材にある。
造血性始源CD34⁺細胞は、これらの細胞が、末梢血液細胞集団の１％未満を構成し、また、単離した界面画分中に存在する他の細胞と比較して、「軽い」浮かびやすい密度を有するので、特に、上記細胞トラップ管と組み合わせて、本発明の洗浄装置および方法を使用することにより、その単離および洗浄が特に改良された細胞の代表例である。このような細胞は、典型的には、下記のように、引き続いた洗浄工程中にて、そのペレットの頂部へと移動する。
要約すると、図6Aで示すように、閉鎖頂部72および入口74および76を有する細胞トラップ遠心管70は、密度勾配媒体80を含む第一レザバ78に接続されている。この密度勾配媒体は、任意の組成であり得るが、明確に定義した密度を有し、これは、特許になった米国特許出願第08/570,397号（その内容は、本明細書中で参考として援用されている）で記述のように、単離する特定の細胞タイプに従って、検定される。上で述べたように、末梢血液細胞集団からCD34⁺造血性始源細胞を単離するためには、この密度は、好ましくは、280mOsmで、1.0605±0.0005gr/mlであり、また、骨髄からCD34⁺造血性始源細胞を単離するためには、好ましい密度は、280mOsmで、1.0685±0.0005gr/mlである。１つの代表的な密度勾配材料には、米国特許第4,927,750号（その内容は、本明細書中で参考として援用されている）で記述したように、オルガノシラン化コロイド状シリカ組成物、または米国特許出願第08/570,120号（その内容は、本明細書中で参考として援用されている）で記述のように、ポリビニルピロリドン（PVP）の添加によりさらに処理したこのような組成物がある。特定の細胞タイプを単離するのに使用する特定のプロトコルに従って、他の密度勾配材料もまた使用できことが分かる。
密度勾配材料80は、無菌接続を介して口74で管70に接続された配管85を通って、細胞トラップ管70の下部に添加される。口74は、導管79によって、この管の下部に連絡している。この管の底部に存在している勾配材料81は、この管内の狭窄部材84により形成された開口部82の頂部に伸長するレベルまで、添加される。勾配材料の流れは、バルブ手段（例えば、バルブ83）により、停止される。
また、細胞トラップ管80によって、細胞レザバ86が接続されており、これは、この図では、無菌血液収集「バッグ」として、示されている。図6Bで示すように、細胞89を含む細胞混合物88は、口76によって細胞トラップ管70に連絡している配管92を通って流れて、狭窄部材84の上部の領域で、管70を満たすかまたは部分的に満たす。この添加および他の全ての添加中にて、管70は、通気孔77を開くことにより、排気してもよい。
図6Cは、この狭窄部材のレベルよりも上に伸長したレベルまで、この管中の密度勾配材料のレベルを調節するのに使用される好ましい工程を図示している。この細胞混合物を上記のように添加した後、さらにそれ以上の勾配材料は、レザバ78とこの管との間のバルブ83を開くことにより、レザバから管へと移動される。勾配材料は、管82および導管79を通って、この管の底部へと流れて、狭窄部材84の上のレベルまで、管内の勾配材料81のレベルを上げる。
この管への勾配材料81および細胞混合物88の添加後、レザバ78および86および取付配管82および92は、管70から取り外される。図6Dは、この管が、次いで、この細胞混合物中に存在している種々の細胞の相対密度に従って、この混合物中に存在している細胞を密度勾配材料81または界面96（これは、勾配材料81および上澄み液96の間で形成される）へと分配させるのに充分な速度で、遠心分離にかけられることを示す。この目的には、一般に、850×ｇの速度で30分間の遠心分離が充分である。遠心分離中にて、この密度勾配材料の密度よりも大きい特定密度を有する細胞は、ペレット94へと沈降するのに対して、この勾配材料とほぼ同じ特定密度を有する細胞（例えば、CD34⁺細胞）は、試料上澄み液91と密度勾配材料81との間に形成された界面領域96に集まる。
本明細書中で記述する特定の条件下では、この細胞混合物として末梢単核細胞に由来の画分を使用し、そして1.0605gr/mlの特定密度を有する密度勾配材料を使用すると、CD34⁺細胞が界面領域96に集まることが現在知られている（米国特許第5,474,687号）。この管の細胞トラップ設計のために、図6Eで示しているように、管70の反転により、ペレット94中の細胞により得られるデカント生成物を汚染することなく、狭窄部材84により形成された開口部85の上部の領域に存在している細胞を移動させることが可能である。
図6Eをさらに参照すると、細胞のデカンテーションは、好ましくは、導管（例えば、配管98）を介して、口76を無菌容器に接続することにより、無菌様式にて行うことができる。本明細書中で記述の改良方法によれば、この無菌容器は、上記II部で記述のように配置した洗浄管100である。図示しているように、配管98は、入口102を通って、洗浄管100に接続する。CD34⁺細胞97を含む上澄み液91および界面96部分は、口76を通って、配管98および洗浄管100へと排出される。この管内に存在している空気は、この工程中にて、排気口104を通って、排気してもよい。
細胞トラップ管70に由来の上澄み液および界面部分を洗浄管100に添加した後、配管98は、この洗浄管から取り外される。管100は、次いで、図6Fで図示しているように、遠心分離されて、選択した細胞混合物106から、問題のCD34⁺細胞107がペレット化される。図6Gは、遠心分離後の洗浄管100を示し、この管では、得られたペレット110は、その上部にCD34⁺細胞107を含み、その上に、洗浄上澄み液108が載っている。図6Hは、この管の反転による不要洗浄上澄み液108の除去を示す。本発明の重要な特徴によれば、ペレット110は、CD34⁺細胞107のような軽い細胞を含むが、洗浄管100を３分間まで反転したとき、殆どまたは全く細胞損失なしに、この管内に残る。それ以上の洗浄のためには、細胞ペレット110は、適当な容量の細胞希釈剤（これは、無菌入口102を通って、この管に添加される）に再懸濁できる。再懸濁したペレットは、次いで、図6F〜6Hで図示しているように、さらに遠心分離および再懸濁することにより、さらに洗浄できる。この細胞型および初期希釈剤の性質に依存して、このような洗浄は、持続、反復および緩衝液成分を変えてもよいことが分かる。このような因子は、熟練した専門家が、洗浄する細胞に最も適すると決定した特定の洗浄プロトコルに従って、この専門家により決定できる。
実施例１は、上記方法を用いて、CD34⁺造血性始源細胞に富んだ細胞混合物の洗浄を記述している。この実施例は、本発明の重要な局面、すなわち、希少な「軽い」細胞（例えば、この細胞ペレットの頂部で沈降する細胞）、例えば、上で説明したCD34⁺細胞が、使用する単離条件下にて、典型的には、この洗浄ペレットの上部層を占めており、本発明の装置および方法を用いて、この添加量の少なくとも約90％の収率、好ましくは、その添加量の約95％の収率で、回収されることを立証している。
実施例２は、本発明を支持して行った実験を記述しており、ここで、その管の頂角は、その管を反転したとき、CD34⁺細胞を保持する性能について、試験された。これらの実験の結果を、図７に示す。これらの実験は、洗浄操作後、高収率の希少細胞タイプを得るためには、約50゜と約90゜の間の頂角を有することの重要性を立証している。具体的には、図示しているように、細胞を、60〜80゜の頂角を有する管内で洗浄したとき、洗浄およびこの洗浄管の反転による細胞上澄み液のデカンテーション後、全CD34⁺細胞の95％より多くが回収された。100゜の頂角では、CD34⁺細胞の選択的な枯渇があり、その結果、これらの細胞の約30％が回収されたにすぎなかった。110゜および120゜の頂角では、全ての細胞の枯渇が認められた。
前述の研究は、本発明の洗浄管を使用して細胞を洗浄し、その洗浄上澄み液をこの管の反転によりデカントしたとき、細胞ペレット中の「軽い」細胞の高い（90〜95％）回収率に関して、本発明により達成される利点の１つを説明している。
以下の実施例では、本発明を説明しているが、いずれの様式でも、本発明を限定する意図はない。
実施例
実施例１
単離したCD34 ⁺ 造血性始源細胞の洗浄
例えば、特許になった米国特許出願第08/570,397号（1995年12月11日に出願）に記述のような大規模細胞トラップ管（ACT 300）にて、密度勾配材料として、1.0605gr/ml（「BDS」）の密度に調節したオルガノシラン化コロイド状シリカ（米国特許第4,927,750号）を用いて、米国特許第5,474,687号（その内容は、本明細書中で参考として援用されている）で記述のようにして、CD34⁺造血性始源細胞を単離した。試料の処理は、以下の詳細と共に、上記の図６（Ａ〜Ｈ）で示す一般工程に従った：この細胞トラップ分離管を、開口狭窄部材のすぐ下部のレベルまで、BDSで満たした。次いで、この容器に、血液試料を添加した。次いで、（図示しているように、この管の底部へと伸長している導管を通した添加により）、追加のBDSを添加して、密度勾配材料のレベルを、この狭窄開口部のレベルのすぐ上にした。次いで、この管を、速度を落とすことなく、850×ｇで30分間にわたって、遠心分離した。遠心分離に続いて、この装置を、無菌配管を介して、80゜の頂角を有する本発明の洗浄装置に接続した。この無菌配管を、この洗浄装置の蓋にある中心試料入口に接続した。この洗浄装置の通気孔を開き、この界面を含む上澄み液を、洗浄装置にデカントした。この洗浄装置を、速度を落とすことなく、850×ｇで30分間にわたって、遠心分離した。得られた上澄み液を、この洗浄装置の蓋にあるデカンテーション／出口を介して、注ぎ出した。その後、このペレットを、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝サリン（PBS）に再懸濁し、この管を、次いで、850×ｇで15分間にわたって、遠心分離した。得られた上澄み液を上記のようにデカントし、得られたペレットを、細胞の定量のための所定容量のPBSで再懸濁した。これらの細胞のFACS分析には、追加のアリコートを使用した。
実施例２
細胞回収率に対する遠心管頂角の効果
実施例１で詳述した方法を用いて、細胞を単離し、そして異なる頂角（図７で示すように、60゜、80゜、90゜、100゜、120゜）を有する洗浄管に移した。各ペレットについて、全細胞を定量した;CD34⁺細胞は、フィコエリスリン標識した抗CD34⁺モノクローナル抗体（Becton−Dickinson、Mountain View、CA）を用いて、当該技術分野で周知の標準方法に従って、蛍光活性化細胞仕分け（FACS）により、さらに定量した。
全細胞およびCD34⁺細胞の回収率は、出発物質および最終物質中の細胞数を数えて、これらの数値を比較することにより、定量した。
本発明は、特定の方法および実施態様に関連して記述されているものの、本発明から逸脱することなく、種々の改良および変更を行ってもよいことが分かる。

Claims (17)

1. 細胞洗浄装置であって、該装置は、以下を有する：
   （ｉ）ほぼ円筒形の側壁および円錐形の底壁を有する細長遠心管であって、該円錐形底壁は、５０゜と９０゜間の頂角を形成し、そして以下からなる群から選択される壁表面改良点を有する：
   （ａ）該側壁から内側に突出している複数の縦方向ひれ 状部；
   （ｂ）複数の隔室を規定している複数の縦方向仕切り；
   （ｃ）複数の同心配列隆起部；
   （ｄ）該底壁の頂点領域から放射している複数の溝；および
   （ｅ）0.8μｍと500μｍの間の山−谷深さにより特徴づ けられる凹凸表面；および
   （ii）該管の頂部に配置された蓋であって、該蓋は、少なくとも２個の連絡口を形成する。
2. 前記壁表面改良点が、前記側壁から内側に突出している複数の縦方向ひれ状部を有する、請求項１に記載の細胞洗浄装置。
3. 前記壁表面改良点が、複数の隔室を規定している複数の縦方向仕切りを有する、請求項１に記載の細胞洗浄装置。
4. 前記壁表面改良点が、複数の同心配列隆起 部を有する、請求項１に記載の細胞洗浄装置。
5. 前記壁表面改良点が、前記底壁の頂点領域から放射している複数の溝部を有する、請求項１に記載の細胞洗浄装置。
6. 前記壁表面改良点が、0.8μｍと500μｍの 間の山−谷深さにより特徴づけられる凹凸表面を有する、請求項１に記載の細胞洗浄装置。
7. 前記蓋により形成された前記連絡口が、（ｉ）前記管へまたそこからの液体の無菌通過に適合させた液体通過口、および（ii）濾過した空気を該管の内部へと供給できる通気孔を有する、請求項１に記載の細胞洗浄装置。
8. 前記液体通過口が、導管と流体接続を形成し、該導管が、前記管へと伸長している、請求項７に記載の細胞洗浄装置。
9. 前記蓋が、前記管を反転位置で保持したとき、該管から前記液体通過口へと液体を流し込むように適合させた円錐形底部を有する、請求項７に記載の細胞洗浄装置。
10. 前記液体通過口が、さらに、前記管への無菌溶液の通過のための接続器を有する、請求項７に記載の細胞洗浄装置。
11. さらに、前記蓋により形成された第三口、および細胞の成長を補助するための一定量の細胞培地を有し、該第三口が、前記装置内にて、細胞培養物を補助するための通気孔として役立つように適合されている、請求項７に記載の細胞洗浄装置。
12. さらに、少なくとも前記液体通過口および前記通気孔を取り囲む隆起部を有する、請求項７に記載の細胞洗浄装置。
13. 以下を有する、細胞洗浄装置：
    ほぼ円筒形の側壁および円錐形の底部を有する細長遠心管であって、該円錐形底部は、５０゜と９０゜の間の頂角を形成する；および
    該管の頂部に配置された蓋であって、該蓋は、少なくとも２個の連絡口を形成する；
    ここで、該蓋は、該管を反転位置で保持したとき、該管から該連絡口１つへと液体を流し込むように適合させた円錐形底部を有する。
14. 前記蓋により形成された前記連絡口が、（ｉ）前記管へまたはそこからの液体の無菌通過に適合させた液体通過口、および（ii）濾過した空気を該管の内部へと供給できる通気孔を有する、請求項13に記載の細胞洗浄装置。
15. 前記液体通過口が、導管と流体接続を形成し、該導管が、前記管へと伸長している、請求項14に記載の細胞洗浄装置。
16. 前記蓋の前記円錐形底部が、前記管を反転位置で保持したとき、該管から前記液体通過口へと液体を流し込むように適合されている、請求項14に記載の細胞洗浄装置。
17. 細胞洗浄装置であって、以下：
    ほぼ円筒形の側壁および円錐形の底部を有する細長遠心 管であって、該円錐形底部は、50゜と90゜との間の頂角 を形成する、細長遠心管；および
    該管の頂部に配置された蓋であって、該蓋は、液体通過 口および通気孔を備える少なくとも２つの連絡口を形成 する、蓋、
    を備え、ここで、該液体通過口が、導管と流体接続を形 成し、該導管が該管へと伸長している、細胞洗浄装置。

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